KR20190052855A

KR20190052855A - 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 허혈성 뇌질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190052855A
Application number: KR1020170148637A
Authority: KR
Inventors: 홍진태; 임준형; 최근범; 이경선; 조현석; 최기석; 김서진; 정태근; 유순일; 배성민; 김상정
Original assignee: 대한제당 주식회사
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2019-05-17

Abstract

본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴에 관한 것으로, 구체적으로 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 유용한 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 허혈성 뇌질환 치료용 조성물{The composition comprising a PEGylated Erythropoietin for treating ischemic brain disease}

본 발명은 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 유용한 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

뇌혈관 질환은 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발된 국소적인 신경학적 결손 증상을 의미하는 것으로 2014년을 기준으로 대한민국 사망원인 중 2~ 3위를 차지하고 있는 다발성 질환이다.

뇌혈관 질환 중 하나인 허혈성 뇌질환(뇌경색)은 뇌에 산소와 영양소를 공급하는 혈관이 막히는 등의 병리학적 이상이 생긴 질환의 총칭으로 뇌혈관 질환의 65% 내외를 차지한다. 허혈성 뇌질환으로는 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 파킨슨 병 등이 포함된다.

허혈성 뇌질환을 치료하는 방법으로 뇌조직이 다시 기능을 하도록 혈류를 재공급시키는 방법이 있으며, 재개통 치료법으로 질환의 증상이 발현된 후 4.5 시간 이내에 혈전용해제(tissue plasminogen activator, tPA)를 정맥에 투여하는 방법이 있다. 헐전용해제는 체내 상피세포에서 발현되는 세린계 단백질 분해 효소(Serine protease)의 한 종류로 플라스미노겐을 플라스민으로 분해하여 혈전을 제거한다.

한편, 적혈구 세포의 증식과 성장을 조절하는 에리스로포이에틴은 저산소증 상태에서 신경세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음이 다수의 연구 결과를 통해 밝혀졌다.

특히, 국내등록특허 제10-0774827호에서는 에리스로포이에틴을 말초 투여하여 허헐성 뇌질환으로 인해 손상된 뇌조직의 부위를 감소시키는 결과를 나타내었다. 그러나, 허혈성 뇌질환 환자에 에리스로포이에틴을 투여한 경우 사망률이 높은 부작용이 나타나 안전성을 담보하지 못함이 보고되었다(Stroke, 2009 Dec; 40(12):e657-56).

에리스로포이에틴에 대한 또 다른 연구 결과, 화학적으로 변형된 에리스로포이에틴(Carbamylated EPO, CEPO)이 뇌세포를 보호하는데 효과가 있음이 보고되었다(Science, 2004;305(5681):239-242). 그러나, 단백질의 carbamylation은 자가항체반응을 촉진하여 자가면역질환의 부작용이 나타남이 보고되었다(Autoimmunity reviews, 2014;13:225-230).

따라서, 에리스로포이에틴의 투여로 인한 부작용을 감소하고 외과적 시술 없이 허혈성 뇌질환의 치료 효과를 극대화 할 수 있는 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 단백질 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 페길레이션된 에리스로포이에틴이 낮은 농도에서도 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료 효과를 나타내, 허혈성 뇌질환의 치료제로서 부작용을 감소시킬 수 있는 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

국내등록특허 제10-0774827호

Stroke, 2009 Dec; 40(12):e657-56 Science, 2004;305(5681):239-242 Autoimmunity reviews, 2014;13:225-230

본 발명의 목적은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)를 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 "에리스로포이에틴(EPO)"은 골수에서 적혈구 선구물질의 분화를 자극하고, 적혈구 전구체 상의 수용체와 결합하여 생물학적 활성을 나타내는 당단백질로서, 인간 에리스로포이에틴 또는 재조합 인간 에리스로포이에틴일 수 있다.

본 발명에서, 상기 "에리스로포이에틴"은 "EPO"와 혼용되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 에리스로포이에틴은 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis) 또는 자연발생적 돌연변이(accidentally through mutation) 등에 의해 의도적으로 변형된 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 에리스로포이에틴은 글리코실화를 위한 1 내지 6개의 추가의 부위를 갖는 유사체, 당단백질의 카르복실 말단에 1개 이상의 추가의 아미노산을 갖고 추가의 아미노산이 1 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 유사체, 및 1개 이상의 글리코실화 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 서열번호 1의 천연형 인간 에리스로포이에틴의 아미노산 서열을 가진다.

상기 에리스로포이에틴의 제조 및 정제는 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 방법으로 제조 및 정제할 수 있다. 구체적으로 상기 에리스로포이에틴은 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포 및 동물세포를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용해 생산되는 인간 재조합 에리스로포이에틴일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인간 재조합 에리스로포이에틴은 총 165개의 아미노산으로 구성되며 2개의 이황화 결합이 존재할 수 있다.

본 발명에서 용어 "페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)"은 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체와 결합된 에리스로포이에틴 단백질로서, 구체적으로 상기 결합은 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적으로 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체를 단백질에 페길레이션(Pegylation)시키는데 사용되는 결합일 수 있다.

상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지된 단백질 또는 제조 방법일 수 있고, 예를 들어 EP-A 539,176, EP-A 605,963, EP-A 584,876, WO 92/16555, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 94/28024, WO 95/11924, WO 97/04796, WO 98/324666, 미국특허 제5,359,030호, 미국특허 제4,179,337호, 대한민국 특허 공개공보 제2010-0052730호 및 미국특허 제5,324,650호에 개시된 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)에서의 폴리에틸렌글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있으며, 분자량이 2000 내지 60,000 Da일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)은 에리스로포이에틴 단백질의 아미노기, 카르복실기, 티올기 및 카보하이드레이트를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나의 위치에 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있다.

바람직하게 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태이다.

구체적으로, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 가질 수 있으며, 위 C-말단(C-terminal)에 결합되는 폴리에틸렌글리콜은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 또는 하기 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다:

[화학식 1]

[화학식 2]

여기서 상기 n은 250 내지 2,500 일 수 있다.

상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체를 중합하기 위하여 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시를 사용할 수 있다. 구체적으로, 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시와 에리스로포이에틴과의 결합반응은 수성완충액, 예를 들어 50 mM MES{2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid}에서 일어날 수 있다. 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기와 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시는 zero-length crosslinking 제제인 카보디이미드(carbodiimides), 구체적으로는 EDC{1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide}에 의해 아마이드(amide) 결합을 통해 접합될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 접합된 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 통상적인 정제 과정을 통해서 바람직하게 모노-페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질이 95% 이상일 수 있다.

일반적으로 기존에 알려진 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 N-말단 등에 폴리에틸렌글리콜이 결합되어 있다. 반면 위 바람직한 예에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체가 중합됨으로써 기존에 알려진 페길레이션된 에리스로포이에틴과 대비하여 예컨대 허혈성 뇌졸중 치료에서 현저한 효과를 가진다. 예를 들어, 본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴은 1회 투여만으로도 효과적으로 허혈성 뇌졸중의 치료가 가능한 장점을 가짐으로써 기존에 알려진 변형된 에리스로포이에틴들과 대비하여 우수한 부작용 감소의 효과를 가진다. 특히, 허혈성 뇌졸중으로 인한 장애와 사망을 감소시키는 데는 예방이 중요한데, 본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴은 허혈성 뇌졸중의 우수한 예방 효과까지 나타내 허혈성 뇌졸중의 치료 뿐만 아니라 예방 효과까지 가진다.

상기 목적을 수행하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)"은 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명에서 용어 "허혈성 뇌질환"은 뇌허혈로 인한 질병을 의미하며, 구체적인 예로는 뇌졸중, 예컨대 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병 및 파킨슨병을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 뇌졸중이 유발된 동물 모델에 페길레이션된 에리스로포이에틴을 처리한 결과, 뇌졸중 유발 정도가 감소하고, 운동 능력을 유지하며, 뇌조직의 괴사 부피가 감소함을 확인하였다(도 2 내지 5).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 뇌졸중이 유발된 동물 모델의 뇌조직의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴을 투여한 군에서 염증성 단백질의 발현, STAT5 단백질 , NF-κb관련 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다(도 6 내지 9).

나아가, 본 발명의 일 실시예에서는 페길레이션된 에리스로포이에틴을 투여한 군에서 뇌졸중이 유발된 동물 모델의 뇌조직의 뇌 신경세포의 수가 증가함을 확인하였다(도 16 및 17).

이를 통해, 본 발명의 약학 조성물은 부작용이 없음과 동시에 우수한 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

"약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 허혈성 뇌질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴은 1회 투여만으로도 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다. 다만, 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단일 단위 용량으로서 또는 복수개의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조되거나, 포장되거나 판매될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "단위 용량"은 사전 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 조성물의 독립된 양이다. 활성 성분의 양은 환자에 투여될 활성 성분의 투여량과 일반적으로 동일하거나, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 이러한 투여량의 편리한 분획량이다.

본 발명의 조성물 중의 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 담체, 및 임의의 추가적인 성분의 상대적인 양은 치료 받는 개체의 상태 및 조성물이 투여될 경로에 따라 변화될 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 조성물 및 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 설명서는 본원에 제시된 어느 한 용도에 대한 본 발명의 조성물의 유용성을 인간에 전하는데 이용되는 공개 사항, 기록, 도표 또는 기타 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 또한, 설명서는 예를 들어, 본 발명의 약제 조성물의 적합한 용량을 기술할 수 있다.

약제 조성물의 비경구 투여는 임의의 투여 경로를 포함한다. 이와 같이, 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용 및 조직-관통 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약제 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 근내 또는 흉골내 주사 및 정맥 내, 또는 동맥 내 주입 기법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 말초정맥 주사를 통해 대상체에 투여될 수 있다. 상기 대상체에 투여되는 조성물에 포함되는 페길레이션된 에리스로포이에틴의 투여량은 투여당 1 내지 150 ug일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 투여당 10 내지 70 ug일 수 있고, 보다 구체적으로 투여당 20 내지 40 ug일 수 있다.

비경구 주사에 적합한 조성물은 생리학적으로 허용되는 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션과 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함하거나, 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 등장성 염수, 에탄올, 폴리올 (프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜, 및 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 유 예컨대, 올리브유를 포함하는 트리글리세라이드, 또는 주사가능한 유기 에스테르 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입도를 유지함으로써, 및/또는 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조되거나, 포장되거나 판매될 수 있다. 주사가능한 제형은 단위 투약 형태 예컨대, 앰플, 보존제를 함유하는 다중-용량 컨테이너, 또는 자가-주사 또는 의사에 의한 주사를 위한 1회용 디바이스로 제조되거나, 포장되거나 판매될 수 있다.

비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 에멀젼, 보존제 등을 포함한다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 등장성 제제 예를 들어, 당, 및 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

조성물은 주사가능한 멸균 수성 또는 유성 (에멀션) 현탁액 또는 용액 형태로 제조되거나, 포장되거나 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 당해 기술에 따라 제형화될 수 있으며, 활성 성분 이외에, 본원에 기술된 추가적인 성분 예컨대, 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 멸균 제형은 예를 들어, 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 예컨대, 물 또는 1,3-부탄디올을 사용하여 제조될 수 있다. 기타 적합한 희석제 및 용매는 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 고정유 예컨대, 합성 모노-또는 디-글리세라이드를 포함한다.

상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에 "페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)","허혈성 뇌질환"및 "투여" 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 허혈성 뇌질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 허혈성 뇌질환의 치료에 사용하기 위한 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 상기 페길레이션된 에리스로포이에의 용도를 제공한다.

이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴은 뇌졸중 증상을 개선하는 효과를 나타냄과 동시에 뇌 신경세포의 사멸을 억제함으로써 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 에리스로포이에틴의 C-말단에 PEG가 접합되었음을 확인한 도이다.
도 2는 뇌졸중 유발 동물 모델에 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 결과, 뇌졸중 유발 정도가 감소함을 확인한 그래프이다.
도 3은 뇌졸중 유발 동물 모델에 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 결과, rota-rod 평가에서 vehicle을 투여한 군에 비해 오랜시간 회전봉에서 떨어지지 않음을 확인한 그래프이다.
도 4는 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 괴사 부피를 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군이 Vehicle을 투여한 군에 비해 괴사 부피가 감소함을 육안으로 확인한 도이다.
도 5는 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 괴사 부피를 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군이 Vehicle을 투여한 군에 비해 괴사 부피가 감소함을 확인한 그래프이다.
도 6은 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군에서 염증성 단백질인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cycloxygenase-2), GFAP (Glial fibrillary acidic protein), 및 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule-1)와 세포 사멸 인자인 caspase 3의 발현이 감소함을 확인한 도이다.
도 7은 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군에서 염증성 단백질인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cycloxygenase-2), GFAP (Glial fibrillary acidic protein) 및 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule-1)의 발현이 감소함을 확인한 그래프이다.
도 8은 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군에서 p-STAT5 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 5)의 발현이 증가되고, NF-κB (p50 & p65) 단백질의 발현이 억제됨을 확인한 도이다.
도 9는 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌조직의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 투여한 군에서 p-STAT5 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 5)의 발현을 증가하고, NF-κB (p50 & p65) 단백질의 발현이 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 10은 로테논을 처리한 신경세포의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 함께 처리한 군에서 iNOS, COX-2 및 GFAP의 발현이 농도의존적으로 감소함을 확인한 도이다.
도 11은 로테논을 처리한 신경세포의 단백질 양을 측정한 결과, 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 함께 처리한 군에서 iNOS, COX-2 및 GFAP의 발현이 농도의존적으로 감소함을 확인한 도이다.
도 12는 뇌졸중 유발 동물 모델에 PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직에서 지질 과산화가 감소함을 확인한 그래프이다.
도 13은 뇌졸중 유발 동물 모델에 PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직에서 환원형 글루타치온의 비율이 높음을 확인한 그래프이다.
도 14는 신경세포에 로테논과 PEG-EPO를 함께 처리시 농도의존적으로 과산화수소의 생성이 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 15는 신경세포에 로테논과 PEG-EPO를 함께 처리시 농도의존적으로 세포 사멸이 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 16은 뇌졸중 유발 동물 모델에 PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직에서 cresyl violet으로 염색된 면적이 넓음을 확인한 도이다.
도 17은 뇌졸중 유발 동물 모델에 PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직에서 생존한 신경세포의 수가 증가함을 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : C-말단 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)의 제조

본 발명에서는 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체를 중합하기 위하여 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시를 사용하였다. 상기 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시와 에리스로포이에틴과의 결합반응은 수성완충용액, 예를 들어 50 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)에서 실시하였다. 한편, 에리스로포이에틴의 C-말단을 포함하는 아미노산의 카르복실기와 메톡시-PEG-하이드라자이드 또는 메톡시-PEG-아미노옥시는 zero length crosslinking 제제인 카보디이미드(carbodiimides), 구체적으로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide](EDC)에 의해 아마이드 결합을 통해 접합된다. 상기 과정을 통해 제조된 95% 이상의 모노-PEG-EPO가 함유된 조성물이 제조되었다.

상기 에리스로포이에틴은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에리스포로이에틴을 사용하였고(표 1), 에리스로포이에틴의 C-말단에 40 kDa의 선형 폴리에틸렌글리콜(polyetyleneglycol, PEG)이 결합된 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 취하여 본 실험에 사용하였다.

[표 1]

상기와 같이 제조된 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)이 실제로 에리스로포이에틴의 C-말단에 페길레이션되었는지 확인하기 위해 단백질 분해 효소로 분해한 후 HPLC 분석을 실시하였다. 분석 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 페길레이션되지 않은 에리스로포이에틴의 경우 N-말단과 C-말단의 수준이 유사하게 나타남을 확인하였다. 반면, 페길레이션된 에리스로포이에틴의 경우 C-말단이 N-말단에 비해 현저히 낮은 수준으로 나타남을 확인하였다. C-말단의 수준이 낮은 것은 접합된 PEG에 의해 HPLC의 분석 시 단백질의 C-말단이 검출되지 않기 때문인 것으로, 이를 통해 상기와 같은 제조방법에 의해 PEG가 에리스포로이에틴의 C-말단에 접합됨을 알 수 있었다.

실시예 2: 뇌졸중 유발 동물 모델의 제조 및 페길레이션된 에리스로포이에틴의 투여

나일론 봉합사를 이용해 2시간 동안 중뇌동맥을 폐색시켜 국소적 뇌경색을 유발하는 중뇌동맥 폐색술 (MCAO)을 이용하여 뇌졸중 질환 동물 모델을 제조하였다.

구체적으로, ICR 마우스(8주령, 수컷, 30g)를 아이소플루레인(isoflurane) 혼합기체로 흡입마취를 한 다음 정중경부를 절개하였다. 외경동맥(external carotid artery, ECA)을 노출시킨 후 나일론 봉합사(0.22 mm, Doccol)를 외경동맥으로 삽입하여 내경동맥을 거쳐 중뇌동맥에 삽입시켜 뇌혈류를 차단하였다. 2시간 후 나일론 봉합사를 제거하여 재관류 시켰다.

본 실시예 및 실험예에서는 상기 실시예 1과 같이 제조된, 에리스로포이에틴의 C-말단에 40 kDa의 선형 폴리에틸렌글리콜(polyetyleneglycol, PEG)이 결합된 페길레이션된 에리스로포이에틴(PEG-EPO)을 사용하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2의 중뇌동맥 폐색술을 수행하기 직전 5000 IU/kg의 농도로 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.

실시예 2-1 : 뇌졸중 유발 정도의 행동학적 평가

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델에 대하여 뇌졸중 유발시 발생하는 행동학적 변화를 5 단계로 나누어 측정하였다. 구체적으로 중뇌동맥 폐색술을 수행하여 재관류를 유발한 후 24시간 경과한 뒤 행동학적 평가를 수행하였다. 각 단계는 아래와 같으며, 단계가 높을수록 뇌졸중의 정도가 심한 것으로 평가하였다.

0 단계 : 정상적인 운동기능

1 단계 : 꼬리를 잡고 들어 올렸을 때 상반신이 휘어짐

2 단계 : 보행 시 한쪽 방향으로 돌지만 (Circling) 휴식 시에는 돌지 않음

3 단계 : 보행 시 한쪽 방향으로 돌고, 휴식 시에도 구부려져 있음

4 단계 : 보행 시 한쪽 방향으로 구름 (Rolling)

5 단계 : 한쪽 방향으로 치우쳐 쓰려져 있고, 다른 운동기능을 보이지 않음 (움직임이 없음)

위 기준을 기초로 하여 뇌졸중 유발 동물 모델에 대하여 행동학적 평가를 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, vehicle을 투여한 군에서는 평균 4 단계의 행동학적 평가를 보이는 반면, PEG-EPO를 투여한 군에서는 평균 3 단계의 행동학적 평가를 보여 뇌졸중 유발 정도가 감소함을 확인하였다(도 2).

실시예 2-2 : Rota-rod 평가

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델을 고무표면으로 된 회전봉에 두었다. 상기 회전봉을 10 rpm으로 3분간 회전시켜 실험동물이 떨어지는 시간을 측정하였다. 구체적으로 중뇌동맥 폐색술을 수행하여 재관류를 유발한 후 24시간 경과한 뒤 rota-rod 평가를 수행하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, PEG-EPO를 투여한 군의 동물 모델이 vehicle을 투여한 군에 비해 오랜시간동안 회전봉에서 떨어지지 않음을 확인하였다(도 3). 이를 통해 PEG-EPO를 투여한 군의 동물 모델은 운동 능력을 유지함을 확인하였다.

실시예 2-3: TTC 염색을 이용한 뇌조직 괴사 부피 확인

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델의 재관류 24시간 후 동물 모델을 부검하여 뇌 조직을 적출하였다. 상기 적출된 뇌 조직을 2 mm의 두께로 잘라 뇌 관측 절편을 만든 후 생리식염수(PBS)로 제조한 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TCC) 용액으로 37 ℃에서 차광하여 20분간 염색하였다. 염색된 뇌 조직 절편을 10% 포름알데하이드 용액으로 4 ℃에서 밤새 고정시킨 후 괴사 부위의 부피를 측정하였다.

그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직의 괴사 부피가 Vehicle을 투여한 군에 비해 50% 이상 감소함을 확인하였다(도 4 및 5).

실시예 2-4: PEG-EPO가 뇌조직의 단백질 발현에 미치는 영향

염증성 인자, p-STAT 단백질 및 NF-κB 관련 인자의 발현 변화를 보기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델의 재관류 24시간 후 동물 모델을 부검하여 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 뇌 조직을 lysis buffer (PROPREP; iNtRON)에 용해한 후 4 ℃에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 회수한 다음 Bradford assay 방법을 이용하여 상등액의 단백질 양을 측정하였다. 일정한 양의 단백질을 SDS-PAGE의 각 레인(lane)에 넣고 웨스턴 블럿(Western blot)을 시행하였다.

그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7은 염증성 단백질의 발현 변화를 보여준다. 구체적으로, PEG-EPO를 투여한 군의 뇌조직에서는 대표적인 염증성 단백질인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cycloxygenase-2), GFAP (Glial fibrillary acidic protein) 및 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule-1)의 발현을 감소시켰다. 또한 도 6에서 확인되는 바와 같이 세포사멸을 유도하는 단백질인 caspase-3의 발현 또한 감소시켰다.

또한, p-STAT 단백질 및 NF-κB 관련 인자의 발현 변화를 확인한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에서 확인되는 바와 같이, 페길레이션된 에리스로포이에틴의 투여는 p-STAT5 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 5)의 발현을 증가시켰으며, NF-κB (p50 & p65) 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 8 및 9).

이를 통해, PEG-EPO의 투여가 뇌 신경세포의 사멸과 염증 반응을 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 3: PEG-EPO가 신경세포의 단백질 발현에 미치는 영향

신경세포에서 염증성 인자들의 발현 변화를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 배양 중인 신경세포에 신경세포의 사멸을 유도하는 로테논(rotenone) 100 nM/mL과 페길레이션된 에리스로포이에틴이 각 25, 50 및 100 IU/mL이 포함된 배지를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포를 수거하여 lysis buffer (PROPREP; iNtRON)에 용해한 후 4 ℃에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 회수한 다음 Bradford assay 방법을 이용하여 상등액의 단백질 양을 측정하였다. 일정한 양의 단백질을 SDS-PAGE의 각 레인(lane)에 넣고 웨스턴 블럿(Western blot)을 시행하였다.

그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에서 확인되는 바와 같이, 신경세포의 사멸을 유도하는 로테논을 처리한 세포에서 대표적인 염증성 단백질인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cycloxygenase-2) 및 GFAP (Glial fibrillary acidic protein)의 발현이 급격히 증가하였다. 그러나, PEG-EPO를 로테논과 함께 처리시 iNOS, COX-2 및 GFAP의 발현이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 10 및 11).

실시예 4: PEG-EPO의 항산화 효과 (In vivo)

실시예 4-1: TBARS (Thiobarbituric acid, 티오바르비툴산) assay를 이용한 지질 과산화 확인

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델의 재관류 24시간 후 동물 모델을 부검하여 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 뇌 조직을 lysis buffer (PROPREP; iNtRON)에 용해한 후, 새로운 마이크로 튜브(microcentrifuge tube)에 용해된 조직 100㎕, SDS lysis 버퍼 100㎕를 잘 섞은 후 상온에서 5분간 방치하였다. 5분 후 티오바르비툴산(Thiobarbituric acid, TBA) 용액 250㎕를 첨가하고 95 ℃에서 45 내지 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 형광광도계를 이용하여 발색 정도를 측정하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인되는 바와 같이, PEG-EPO를 투여한 군에서 지질 과산화가 감소함을 확인하였으며, 이를 통해 PEG-EPO가 지질의 과산화를 감소시킴으로써 허혈성 뇌질환에 치료 효과를 보임을 확인하였다(도 12).

실시예 4-2: 산화/환원된 글루타치온의 비율 확인

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델의 재관류 24시간 후 동물 모델을 부검하여 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 뇌 조직 중 박층(stratum)을 분리하여 튜브에 옮긴 후 NP-40 용액을 400㎕를 첨가하여 세포를 용해하였다. 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 상등액 50㎕를 microplate의 웰에 넣은 후 각 웰에 GSH assay mixture (GAM) 50㎕를 첨가하였다. 동일한 상등액을 다른 웰에 50㎕씩 넣고 Total GSH assay mixture (TGAM) 50㎕을 첨가하여 상온에서 10 내지 60분간 반응시킨 후 형광광도계를 이용하여 발색 정도를 측정하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 확인되는 바와 같이, PEG-EPO를 투여한 군에서 환원형 글루타치온의 비율이 높은 것이 확인되며 이는 PEG-EPO의 투여시 뇌 조직에 세포 사멸을 유도하는 활성 산소족(Reactive oxygen species)의 농도가 상대적으로 낮음을 의미한다.(도 13)

실시예 5: 산화적 스트레스가 유도된 신경세포에 대한 PEG-EPO의 영향 확인

배양 중인 신경세포에 로테논 100 nM/mL과 PEG-EPO가 각 25 및 50 IU/mL 포함된 배지를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포 배양액을 회수하여 5분간 원심분리 한 후 상등액을 얻었다. 상등액 50㎕와 ADHP/HRP 용액 50㎕을 잘 섞은 후 상온에서 차광하여 30분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 형광광도계를 이용하여 발색 정도를 측정하였다.

그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에서 확인되는 바와 같이, 신경세포 배양 중 로테논을 배양액에 첨가하면 배양액 내 과산화수소의 농도가 급격히 증가함을 확인하였다. 그러나, 로테논과 PEG-EPO를 동시에 첨가하면 농도의존적으로 배양액 내 과산화수소의 생성이 억제됨을 확인하였다(도 14). 이를 통해 PEG-EPO가 신경 세포에서 항산화 효과를 통해 허혈성 뇌질환에 치료 효과를 보임을 확인하였다.

실시예 6: 산화적 스트레스를 유도한 신경세포에 대한 사멸 억제 효과

배양 중인 신경세포에 로테논 100 nM/mL과 PEG-EPO가 각 25, 50 및 100 IU/mL 포함된 배지를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포 사멸을 특정하기 위해 MTT(Amresco, Solon, OH, USA)를 0.5 mg/mL의 농도로 세포 배양 배지에 첨가한 후 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 DMSO 200㎕을 세포에 첨가하여 형성된 formazan crystal을 용해시켰다. Formazan crystal이 용해된 샘플을 UV 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 발색 정도를 측정하였다.

그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 확인되는 바와 같이, 로테논만을 투여한 군에서는 세포 수가 급격히 감소하였으나, PEG-EPO를 함께한 투여군에서는 농도의존적으로 세포 사멸이 억제됨을 확인하였다(도 15).

실시예 7: 뇌졸중 유발 동물 모델의 뇌 신경세포에 대한 사멸 억제 효과

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 뇌졸중 유발 동물 모델의 재관류 24시간 후 동물 모델을 부검하여 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 뇌 조직을 4% 파라포름알데하이드에 담가 4 ℃에서 24시간 동안 방치한 후 30% 설탕 용액에 옮겨 보관하였다. 고정된 뇌 조직을 마이크로톰(microtome)을 이용하여 25 ㎛ 두께로 슬라이싱(slicing)하였다. Gelatin-coated slide glass에 슬라이싱된 뇌 조직을 올린 후 0.1% cresyl violet으로 10분간 염색하였다. 증류수로 염색된 조직을 워싱한 후 50, 70, 90 및 100% 에탄올로 각 3분간 워싱하였다. 에탄올 워싱이 완료되면 xylene에서 10분간 정치하였다. Xylene을 깨끗이 말린 후 염색된 뇌 조직을 관찰하였다.

그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.

도 16은 뇌 조직의 cresyl violet 염색 결과를 보여준다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, PEG-EPO를 투여한 군에서 cresyl violet으로 염색된 면적이 넓어 조직이 유지됨이 확인하였다(도 16).

또한, 세포 수의 변화를 확인한 결과, PEG-EPO를 투여한 군에서Vehicle 투여군에 비해 세포 수가 높게 유지됨을 확인하였다(도 17).

상기 모든 실시예들의 데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. Student's T-test와 ANOVA를 이용하여 통계학적 유의성을 확인하였으며, 통계학적 유의성은 p < 0.05 이다.

<110> TS Corporation <120> The composition comprising a PEGylated Erythropoietin for treating ischemic brain disease <130> P17-070-DHJ <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> erythropoietin <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims

에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 가지는 페길레이션된 에리스로포이에틴으로서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜이며, n은 250 내지 2,500 이다
[화학식 1]

[화학식 2]

.
페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 갖는, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴은 재조합 인간 에리스로포이에틴인, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 재조합 인간 에리스로포이에틴은 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포 및 동물세포를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용해 생산되는, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)에서의 폴리에틸렌글리콜은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜이며 여기서 n은 250 내지 2,500인, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제2항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)에서 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 2000 내지 60,000 Da인, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병 및 파킨슨 병을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약학 조성물은 비경구 주사용 조성물인 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.