KR20190045213A - 면역-조절 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 반응 조절에 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 Th1 면역 반응 조절에 사용하기 위한 PD-L2의 올리고머 형태를 개시한다. 본 발명의 화합물은 병원성 감염 및 과증식성 장애를 포함하는 다양한 Th1-매개 장애에서 유용성을 확인한다.

Description

면역-조절 화합물
본 발명은 일반적으로 면역 반응 조절에 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 Th1 면역 반응 조절에 사용하기 위한 PD-L2의 올리고머 형태에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 병원성 감염 및 과증식성 장애를 포함하는 다양한 Th1-매개 장애에서 유용성을 확인한다.
예정된 세포 사멸 단백질 1 (Programmed cell death protein 1; PD-1)은 작동체(effector) T 세포에 대한 브레이크로서의 이의 작용을 통해 면역 조절 및 조직 미세환경에서 면역 반응의 감소에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다. PD-1은 면역억제성 CD4+ T 세포 (Treg) 및 소모된 CD8+ T 세포를 포함하여 활성화된 T 세포에서 발현되고, B 세포, 골수성 수지상 세포 (MDCs), 단핵구, 흉선 세포 (thymocytes) 및 자연 살해 (NK) 세포에서도 발현된다. 이러한 광범위한 PD-1 발현은 T 세포 항상성(homeostasis)의 효과적인 면역 및 유지에 필요한 PD-1 신호전달 경로의 넓은 의미를 암시한다 (Gianchecchi et al., Autoimmun. Rev. 12:1091-100, 2013).
중요하게는, PD-1 신호전달 경로는 정상 개체의 중추 및 말초 내성의 유지에 기여한다. 흉선에서, PD-1 및 이의 리간드의 상호 작용은 양성 선별(positive selection)을 억제함으로써 CD4- CD8- 이중 음성 세포의 CD4+　CD8+ 이중 양성 T 세포로의 형질전환을 저해한다 (Keir et al., J. Immunol. 175:7329-7379, 2005). 또한, PD-1 신호전달은 음성 선별을 피하는 자기 반응성(self-reactive) 및 염증성 작동체 T 세포의 저해의 원인이 되어 부수적인 면역-매개 조직 손상을 피한다 (Keir et al., J. Exp. Med. 203:883-895, 2006).
PD-1은 2개의 알려진 리간드를 가진다: 단백질 사멸 리간드 1 (PD-L1; Freeman et al., J. Exp. Med. 192:1027-34, 2000) [인간에서 B7-H1로도 알려짐 (Dong et al., Nat. Med. 5:1365-9, 1999)], 및 단백질 사멸 리간드 2 (PD-L2; Latchman et al., Nat. Immunol. 2:261-8, 2001) [B7-DC로도 알려짐 (Tseng et al., J. Exp. Med. 193:839-46, 2001)]. PD-L1 및 PD-L2의 발현 양상은 완전히 다르다. PD-L1은 다양한 면역 세포 및 비-면역 세포에 의해 구조적으로 발현되며, 강한 염증 신호의 존재 하에 대부분의 정상 조직 세포에서 상향 조절되는 것으로 보인다 (Matzinger et al., Nat. Rev. Immunol. 11:221-230, 2011; Muhlbauer et al., J. Hepatol. 45:520-528, 2006; Pinchuk et al., Gastroenterol. 135:1228-1237, 2008; Stanciu et al, J. Infect. Dis., 193:404-412, 2006). 반대로, PD-L2의 구조적 기저 발현은 PD-L1에 비해 낮으며, PD-L2 발현이 초기에 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 (DCs)와 같은 항원-제시 세포로 제한되는 것으로 생각되었지만 (Latchman et al., Nature Immunol. 2:261-268, 2001; Yamazaki et al., J. Immunol. 169:5538-5545, 2002), 몇몇 군은 최근에 PD-L2 발현이 미세환경 자극에 따라 다양한 다른 면역 세포 및 비-면역 세포에서 유도될 수 있음을 나타내었다 (Kinter et al., J. Immunol. 181:6738-6746, 2008; Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37:2405-2410, 2007; Messal et al., Mol. Immunol. 48:2214-2219, 2011; Lesterhuis et al., Mol. Immunol. 49:1-3, 2011).
PD-1 및 이의 리간드는 악성 세포 및 주변 미세환경 세포에 의해 비정상적으로 발현된다. 종양의 미세환경 내에서, PD-1은 많은 다양한 종양 유형의 종양-침윤 림프구 (TILs)의 대부분에서 고도로 발현되며 국소 작동체 면역 반응을 억제한다. PD-1의 TIL 발현은 신세포암(renal cell carcinoma), 전이성 흑색종, 위암, 유방암, 난소암, 췌장암 및 폐암을 포함하여 몇몇 종양 유형에서 손상된 작동체 기능 (종양 세포에 대한 사이토카인 생성 및 세포독성 효능) 및/또는 좋지 않은 결과와 관련되어 있다 (Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13:1757-1761, 2007; Zhang et al., Mol. Immunol. 7:389-395, 2010; Ahmadzadeh M et al., Blood 114:1537-1544, 2009; Shi et al., Int. J. Cancer 128:887-896, 2011). 유사하게, PD-L2는 인간 종양의 하위세트에서 상향 조절되는 것으로 관찰되었으며, 종종 좋지 않은 결과와 관련되어 있다 (Rozali et al., Clin. Dev. Immunol. 2012:656340, 2012).
종양 미세환경에서의 암-관련 면역 억제에서 이의 잠재적인 역할을 감안할 때, PD-1/PD-리간드 경로를 표적하는 것이 매력적인 치료 전략으로 제안되었다. 이와 관련하여 여러 연구는 PD-1/PD-L1 경로에 대한 차단 항체의 치료 효과를 연구하여, 향상된 종양 억제율을 나타내었다 (Curran et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 107:4275-4280, 2010; Iwai et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:12293-12297, 2002; Pilon-Thomas et al., J. Immunol. 184:3442-3449, 2010; Zhang et al., Blood 114:1545-1552). 그러나, 정의된 치료 전략으로 PD-L2의 차단을 연구한 연구는 거의 없다. 몇 가지 연구에서 PD-L2 차단 전략이 사용되었지만, 이것은 항상 항 PD-L2 전략의 진정한 가치를 추론할 수 없었던 PD-L1의 표적과 함께 사용되었다 (Parekh et al., J. Immunol. 182:2816-1826, 2009; He et al., J. Immunol. 173:4919-4928, 2004).
본 발명은 T 림프구를 포함하여 항원-특이적 면역 작동 세포 (IECs)와 상호 작용하는 항원-제시 세포 (APCs)와 같은 세포 상의 PD-L2 발현이 Th1-관련 장애의 중증도와 역 상관관계가 있고, PD-L2가 Th1 면역을 확립하는데 필요하다는 결정에 부분적으로 근거한다. 또한, 이러한 IEC-상호 작용 세포의 표면 상에서 PD-L2의 클러스터링은 PD-1에 PD-L1의 결합을 저해함으로써 IECs 상의 PD-L1의 면역억제 기능을 저해할 수 있음을 확인하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 2 이상의 올리고머화도를 갖는 PD-L2 올리고머가 PD-1에 결합하기 위해 이량체 PD-L2 보다 상당히 높은 친화도를 가지며, 이러한 '고차 PD-L2 올리고머'가 CD4+ T 세포 기능을 포함하는 IEC 기능에 대한 PD-L1의 억제 효과를 현저히 감소시킬 수 있다는 것도 확인하였다. 이후에 기재되는 바와 같이, 이러한 발견은 Th1 면역을 조절하기 위한 신규한 약제 및 방법에서 실시하기 위해 적응시켰다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 Th1 면역을 자극하거나 또는 향상시키는데 유용한 폴리펩티드 복합체를 제공하며, 상기 복합체는 일반적으로 화학식 (I)로 표시된다:
[화학식 I]
[P] n
여기서:
P는 각 경우에 대해 독립적으로, PD-L2 폴리펩티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 단백질성(proteinaceous) 분자를 나타내고;
n은 2보다 큰 정수를 나타낸다.
적당하게, P는 종양 또는 종양-관련 신생혈관(neovascular) 표적 도메인이 결여되어 있다.
일 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 가용성 부분을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지며, 이의 예시적인 예는 신호 펩티드가 있거나 또는 없는 PD-L2 엑토도메인(ectodomain)을 포함한다. 특정 실시예에서, 단백질성 분자는 PD-L2 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 PD-L2 세포질 도메인 (cytoplasmic domain) 중 하나 또는 둘 모두 결여되어 있다.
적당하게, n은 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7 또는 ≥8 이다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, n은 ≤100, ≤50, ≤30 또는 ≤20 이다. 특정 실시예에서, n은 3 내지 20, 적당하게는 4 내지 16, 보다 적당하게는 8 내지 12의 범위이다.
단백질성 분자는 화학적으로 함께 결합하여 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 개개의 단백질성 분자는 단백질성 분자의 자기-조립을 용이하게 하여 폴리펩티드 복합체를 형성하는 적어도 하나의 올리고머화 도메인을 더 포함할 수 있다. 이들 실시예에서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 일반적으로 PD-L2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 단일 쇄, 키메라 폴리펩티드를 형성한다. 적어도 하나의 올리고머화 도메인이 PD-L2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 실시예에서, 본 발명은 다른 측면에서 단백질성 분자의 자기-조립을 용이하게 하여 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드 복합체를 형성하는 적어도 하나의 올리고머화 도메인에 작동가능하게 연결된, 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 PD-L2 폴리펩티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 단백질성 분자를 제공한다. 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드의 상류 (즉, 아미노-말단) 및/또는 하류 (즉, 카복시-말단)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 올리고머화 도메인이 PD-L2 폴리펩티드의 하류에 작동가능하게 연결된 실시예에서, 단백질성 분자는 화학식 (II)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 II]
PD-L2―L―OMDA
여기서:
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타내고;
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 결합 또는 펩티드 링커이다.
대안적으로, 단백질성 분자는 화학식 (III)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 III]
PD-L2―L―OMDA―L―OMDB
여기서:
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고;
OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 i 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 i+1, i+2, i+3, i+4, i+5, 또는 i+6 이다.
이러한 유형의 예시적인 예에서, i는 2 이고 j는 4 또는 6 이다.
적어도 하나의 올리고머화 도메인이 PD-L2 폴리펩티드의 상류에 작동가능하게 연결된 실시예에서, 단백질성 분자는 화학식 (IV)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 IV]
OMDA―L―PD-L2
여기서:
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 결합 또는 펩티드 링커이고;
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
대안적으로, 단백질성 분자는 화학식 (V)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 V]
OMDB―L―OMDA―L―PD-L2
여기서:
OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고,
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 j 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 j+1, j+2, j+3, j+4, j+5, 또는 j+6 이고;
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
이러한 유형의 예시적인 예에서, j는 2 이고 i는 4 또는 6 이다.
일 실시예에서, 개개의 올리고머화 도메인 (예를 들어, OMDA 또는 OMDB)은 결합 파트너의 존재 하에 이종올리고머로 조립된다. 올리고머화 도메인 및 결합 파트너는 특이적 결합 쌍의 구성원일 수 있으며, 이의 예시적인 예는 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 합텐-항-합텐, 리간드-수용체 및 수용체-공-수용체를 포함한다.
본 발명은 예를 들어 이량체화 도메인 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 도메인, 류신 지퍼 등), 삼량체화 도메인 (예를 들어, 대장균 아스파르테이트 트랜스카바모일라제 (ATCase)의 촉매 하위단위, 박테리오파지 T4 피브리틴(fibritin)의 '폴돈 (foldon)' 삼량체 서열, 목 부위 펩티드, 인간 폐 계면활성제 D 단백질, 올리고머화 꼬인 코일 부착소(oligomerization coiled-coil adhesins), 외막형 바이러스 클래스 I 융합 단백질의 상보적 헵타드(heptad) 반복 영역 등), 사량체화 도메인 (예를 들어, 테트라브라키온의 꼬인 코일 도메인), 오량체화 도메인 (예를 들어, 트립토판 지퍼 또는 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP)의 오량체화 도메인 등) 및 육량체화 도메인 (예를 들어, IgA 항체의 중쇄의 C-말단으로부터의 꼬리조각 (tailpiece))을 포함하여, 임의의 적당한 올리고머화 도메인의 사용을 고려한다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드에 직접 연결된다. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인 및 PD-L2 폴리펩티드는 일반적으로 약 1 내지 약 100 아미노산 잔기 (및 그 사이의 모든 정수 아미노산 잔기), 일반적으로 약 1 내지 약 30 아미노산 잔기 (및 그 사이의 모든 정수 아미노산 잔기), 및 일반적으로 약 1 내지 약 20 아미노산 잔기 (및 그 사이의 모든 정수 아미노산 잔기)로 이루어진, 펩티드 링커에 의해 연결된다. 링커 펩티드는 단백질성 분자의 정제를 용이하게 하는 정제 부분(moiety), 단백질성 분자에 대한 면역 반응을 조절하는 면역-조절 부분, 및 구조적 유연성-부여 부분으로부터 선택된 적어도 하나의 부분을 포함할 수 있다.
단백질성 분자는 합성적으로 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 단백질성 분자가 재조합적으로 제조되는 실시예에서, 본 발명은 다른 측면에서 숙주 세포에서 작동가능한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 단백질성 분자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.
관련된 측면에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 핵산 구조체를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다.
단백질성 분자가 적어도 올리고머화 도메인을 포함하는 실시예에서, 단백질성 분자는 적당한 조건 하에서 (예를 들어, 수용액에서) 자기-조립을 하여 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건 하에서 (예를 들어, 수용액에서) 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 정의된 단백질성 분자들을 혼합시켜 n 하위단위 단백질성 분자의 올리고머를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 폴리펩티드 복합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제를 포함하는 면역-조절 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 조성물은 피험자 또는 생산 동물에서 Th1 면역 반응을 포함하여, 면역 반응을 자극, 유도 또는 증강시키는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 피험자에서 Th1 면역 반응을 포함하여, 면역 반응을 자극, 유도 또는 증강시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 폴리펩티드 복합체 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
관련된 측면에서, 본 발명은 피험자에서 Th1-관련 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 폴리펩티드 복합체 또는 조성물의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 조성물은 피험자가 손상된 Th1 면역을 갖는 것으로 확인된 경우 피험자에게 투여된다. 피험자의 Th1 면역 상태는 임의의 적당한 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 유리한 실시예에서, 피험자의 Th1 면역 상태는 (1) 피험자로부터 얻어진 시료의 Th1 면역 상태 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계로서, Th1 면역 상태 바이오마커 프로파일은 시료에서 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 포함하고, 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커는 시료에서 IEC-상호 작용 세포와 상호 작용하는 세포의 PD-L2, 및 임의로 PD-L1을 포함하는, 단계; 및 (2) 바이오마커 값(들)을 이용하여 지표를 결정하는 단계로서, 지표는 피험자의 Th1 면역 상태를 적어도 부분적으로 나타내는, 단계;를 포함하는 방법에 의해 평가된다. 특정 실시예에서, IEC-상호 작용 세포는 수지상 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 적당하게 선택된 APC이다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, APC는 CD11c-발현 수지상 세포이다. 다른 실시예에서, IEC-상호 작용 세포는 종양 세포이다.
적당하게는, 바이오마커 값(들)은 피험자로부터 얻어진 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커의 농도를 적어도 부분적으로 나타내며, 이러한 유형의 일 실시예에서 바이오마커 값은 Th1 면역 상태 바이오마커의 존재량을 포함한다. 대표적인 예에서, 개개의 바이오마커 값은 세포 표면 (예를 들어, PD-L2+ 수지상 세포, PD-L2+ 종양 세포 등) 상에 Th1 면역 상태 바이오마커를 발현하는 IEC-상호 작용 세포의 백분율을 포함한다. 이러한 유형의 일 실시예에서, Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L2이고 바이오마커 값은 APC (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용의 표면 상의 PD-L2 클러스터링의 측정이다.
피험자의 Th1 면역 상태를 결정할 때, 일 실시예에서 PD-L2의 수준은 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 PD-L2의 대조 수준에 비해 시료에서 감소되며, 이로써 지표는 손상된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다.
다른 실시예에서, 시료 내 PD-L2의 수준은 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 PD-L2의 대조 수준과 거의 동일하며, 따라서 지표는 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다. 또 다른 실시예에서, 시료 내 PD-L2의 수준은 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 PD-L2의 대조 수준에 비해 증가하며, 따라서 지표는 상승된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다. 이들 실시예의 대표적인 예에서, 피험자는 본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 조성물을 투여하지 않는다.
적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커가 PD-L1을 더 포함하는 경우, Th1 면역 상태를 평가하는데 사용되는 지표는 더 신뢰할 수 있고 더 큰 진단력을 갖는다. 따라서, 일 실시예에서, 한 쌍의 Th1 면역 상태 바이오마커로부터의 바이오마커 값을 사용하여 지표를 결정한다. 예를 들어, 일부 바람직한 실시예에서, 바이오마커 쌍은 PD-L2 및 PD-L1 이다. 하나 이상의 Th1 면역 상태 바이오마커가 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 상기 방법은 적당하게는 바이오마커 값에 결합 함수를 적용하는 단계를 더 포함한다. 이와 관련하여, 적당한 결합 함수의 예시적인 예는 부가 모델; 선형 모델; 지지체 벡터 기계(support vector machine); 신경망 모델; 랜덤 포레스트 모델(random forest model); 회귀 모델(regression model); 유전자 알고리즘; 어닐링 알고리즘; 가중치 합(weighted sum); 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model); 및 확률 모델(probabilistic model)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 및 본 명세서의 다른 곳에 기재된 방법은 적당하게 (a) 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 결정하는 단계; (b) 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 상응하는 바이오마커 값을 결정하는 단계; (c) 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 기록된 바이오마커 값을 이용하여 지표를 결정하는 단계로서, 지표는 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 기록된 바이오마커 값의 비를 나타내는, 단계를 포함한다. 이러한 유형의 예시적인 방법에서, 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L2 이고, 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L1 이다. 예로서, 일 실시예에서, 시료로부터 결정된 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커 값의 비 ("시료 Th1 면역 상태 바이오마커 비")는 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 대조 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비에 비해 감소되며, 지표는 손상된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다. 예를 들어, 시료 바이오마커 값 비는 적당하게 대조 바이오마커 값 비 (예를 들어, 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자로부터 얻어진 대조 시료로부터 결정됨)의 약 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이하 (및 그 사이의 모든 정수) 이다.
반대로, 시료 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비가 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 대조 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비에 비해 증가하면, 지표는 상승된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다. 이러한 경우, 시료 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비는 대조 바이오마커 값 비 (예를 들어, 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자로부터 얻어진 대조 시료로부터 결정됨)의 적어도 약 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 120%, 130%, 140% 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% (및 그 사이의 모든 정수) 이다. 다른 실시예에서, 시료 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비가 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 대조 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비와 거의 동일한 경우, 지표는 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정된다. 이러한 경우, 시료 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비는 일반적으로 대조 바이오마커 값 비 (예를 들어, 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자로부터 얻어진 대조 시료로부터 결정됨)의 약 96% 내지 104% (및 그 사이의 모든 정수) 이다. 이들 실시예의 대표적인 예에서, 피험자는 본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 조성물을 투여하지 않는다.
단백질 바이오마커 또는 핵산 바이오마커를 측정하기 위한 임의의 알려진 기법이 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 바이오마커는 유동 세포 계측법, 면역분석법, 질량 분광법, 시퀀싱 플랫폼, 어레이 및 혼성화 플랫폼, 또는 이들의 조합을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명자들의 연구 결과는 바람직하지 않은 Th1 면역 상태를 갖는 질환 및/또는 질병 (본 명세서에서 "Th1-관련 질환" 또는 "Th1-관련 장애"라고도 함)을 진단하는 방법, 및 이러한 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 조성물을 포함하는 치료 요법의 투여 방법을 가능하게 한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 방법을 제공하며, 지표는 Th1-관련 질환 또는 장애의 유무를 진단하는데 사용된다. 일 실시예에서, 질환 또는 장애는 감소되거나 또는 억제된 Th1 면역 상태와 관련이 있으며, 피험자로부터 얻어진 시료 내 PD-L2의 수준이 미리 결정된 임계값 미만일 때 진단된다. 예를 들어, 감소되거나 또는 억제된 Th1 면역 상태와 관련이 있는 질환 또는 장애는 전이성 암을 포함하여 암, 또는 병원성 감염일 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 하기에 정의된다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 사용되어 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)의 관사의 문법적 목적어를 나타낸다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 하나 이상의 관련된 열거 항목의 임의의 모든 가능한 조합, 및 대안 (또는)으로 해석될 때 조합의 부족을 나타내며 포함한다.
또한, 양, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 위치, 길이 등과 같은 측정가능한 값을 나타낼 때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 명시된 양, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 위치, 길이 등의 변이를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "약" 및 "대략"이 기준 폴리펩티드 내의 영역의 장소(location) 또는 위치(position)와 관련하여 사용되는 경우, 이들 용어는 ± 최대 20 아미노산 잔기, ± 최대 15 아미노산 잔기, ± 최대 10 아미노산 잔기, ± 최대 5 아미노산 잔기, ± 최대 4 아미노산 잔기, ± 최대 3 아미노산 잔기, ± 최대 2 아미노산 잔기 또는 심지어 ± 1 아미노산 잔기의 변이를 포함한다.
용어 "동시 투여" 또는 "동시에 투여하는" 또는 "공동-투여" 등은 2 이상의 활성제를 함유하는 단일 조성물의 투여, 또는 별도의 조성물로 각 활성제의 투여 및/또는 유효 결과가 모든 이러한 활성제가 단일 조성물로 투여될 때 얻어지는 효과와 동등한 충분히 짧은 시간 내에 동시적으로(contemporaneously) 또는 동시에 (simultaneously) 또는 순차적으로 별도의 경로에 의해 전달되는 것을 나타낸다. "동시에"는 활성제가 실질적으로 동일한 시간에, 바람직하게는 함께 동일한 제형으로 투여되는 것을 의미한다. "동시적으로"는 활성제가 제 시간에 가깝게 투여되는 것을 의미한다, 예를 들어 하나의 약제는 약 1분 이내에서 약 1일 전후 이내에 투여된다. 임의의 동시적 시간이 유용하다. 그러나, 동시에 투여되지 않을 때, 약제는 약 1분 이내에서 약 8시간 이내 및 적당하게는 약 1시간 미만에서 약 4시간 이내에 투여될 경우가 종종 있을 것이다. 동시적으로 투여될 때, 약제는 피험자의 동일한 부위에서 적당하게 투여된다. 용어 "동일한 부위"는 정확한 장소를 포함하나, 약 0.5 내지 약 15 센티미터 이내, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 센티미터 이내일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "별도로(separately)"는 약제가 일정 간격으로, 예를 들어 약 1일 내지 수주 또는 수개월 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 활성제는 어떤 순서로든 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "순차적으로"는 약제가 순차적으로, 예를 들어 일정 간격으로 또는 분, 시간, 일 또는 주 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 적절한 경우, 활성제는 규칙적인 반복 주기로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보조제(adjuvant)"는, 조성물에서 특정 면역원 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 복합체)과 조합하여 사용될 때, 항체 및 세포 면역 반응 중 하나 또는 둘 모두의 특이도를 강화시키거나 또는 확장시키는 것을 포함하는 결과로 생긴 면역 반응 (예를 들어, Th1 면역 반응)을 증강시키는 화합물을 나타낸다.
용어 "약제(agent)" 또는 "조절제(modulatory agent)"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물을 포함한다. 이 용어는 염, 에스터, 아미드, 전구약물, 활성 대사산물, 유사체 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 명세서에서 구체적으로 언급된 화합물의 약학적으로 허용가능한 성분 및 약리학적 활성 성분도 포함한다. 상기 용어가 사용되는 경우, 이는 활성제 그 자체, 및 약학적으로 허용가능한, 약리학적 활성 염, 에스터, 아미드, 전구약물, 대사산물, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "약제"는 좁게 해석되지는 않으나, 소분자; 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질과 같은 단백질성 분자 및 이들을 포함하는 조성물; 및 RNA, DNA 및 이의 모방체 및 화학적 유사체와 같은 유전학적 분자 및 세포 약제로 확장된다. 용어 "약제"는 본 명세서에서 나타낸 폴리펩티드를 생산 및 분비할 수 있는 세포, 및 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "약제"는 바이러스성 벡터 또는 비-바이러스성 벡터와 같은 벡터, 발현 벡터 및 다양한 세포의 발현 및 분비를 위한 플라스미드를 포함하는 핵산 구조체로 확장된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 및 이의 문법적으로 동등한 표현 (예를 들어, "항원성(antigenic)")은 항체 분자 또는 T-세포 수용체와 같은 특정 체액성(humoral) 또는 세포성 면역의 산물에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 나타낸다. 항원은, 예를 들어 합텐(haptens), 단순 중간 대사산물(simple intermediary metabolite), 당 (예를 들어, 올리고당), 지질 및 호르몬; 및 복합 탄수화물 (예를 들어, 다당류), 인지질 및 단백질과 같은 거대분자를 포함하는 모든 유형의 분자일 수 있다. 항원의 일반적인 범주는 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 진균 항원(fungal antigens), 원충(protozoa) 항원 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환에 관련된 항원, 알러지 및 이식 거부 (graft rejection), 독소 및 기타 잡다한 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"항원-결합 분자"는 표적 항원에 대해 결합 친화도를 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 항원-결합 활성을 나타내는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 비-면역글로불린 유래 단백질 골격으로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 대표적인 항원-결합 분자는 다클론 항체 및 단일클론 항체뿐만 아니라 이들의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타 항체 포함), 및 항체 및 항원 결합/인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 항체는 IgG, IgA 또는 IgM (또는 이의 하위-클래스)과 같은 임의의 클래스의 항체를 포함하며, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 이의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 5개의 주요 클래스의 면역글로불린 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)이 있으며, 이들 중 몇 개는 하위 클래스 (동형(isotypes)), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나뉘어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3-차원 배열은 잘 알려져 있다. 또한, 항원-결합 분자는 이량체 항체, 및 항체의 다가 형태를 포함한다. 일 실시예에서, 항원-결합 분자는 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 반면, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체, 및 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 키메라 항체이다 (참조, 예를 들어, 미국특허 번호 제 4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855). 또한, 비-인간 (예를 들어, 설치류, 바람직하게는 마우스) 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 인간 가변 도메인으로 상보성 결정 영역 (CDRs)을 전이시킴으로써 일반적으로 생산되는 인간화 항체가 고려된다. 그 다음, 인간 항체의 일반적인 잔기는 비-인간 대응물 (counterparts)의 골격 영역에서 치환된다. 인간화 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 비-인간 불변 영역의 면역원성(immunogenicity)과 관련된 잠재적인 문제를 제거한다. 비-인간, 특히 쥣과(murine)의 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반적인 기법은, 예를 들어 Orlandi et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833)에 의해 기재된다. 인간화 단일클론 항체를 생산하는 기법은, 예를 들어 Jones et al. (1986, Nature 321:522), Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285), Sandhu (1992, Crit. Rev. Biotech. 12: 437), Singer et al. (1993, J. Immun. 150: 2844), Sudhir (ed., Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc. 1995), Kelley ("Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 및 Queen et al. (미국특허 번호 제 5,693,762호 (1997))에 의해 기재된다. 인간화 항체는 항체의 항원-결합 영역이 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkeys)를 관심있는 항원으로 면역화하여 생산된 항체로부터 유래된 "영장류화된(primatized)" 항체를 포함한다. 또한, 항원-결합 분자로서 인간화 항체가 고려된다.
용어 "항원 제시 세포"(APCs)는 면역계의 특정 작동 세포(effector cells) (본 명세서에서 "면역 작동 세포" 또는 "IECs"라고도 함)에 의해 인식가능한 펩티드-MHC 복합체의 형태로 하나 이상의 항원을 제시하고, 이에 의해 제시되는 항원 또는 항원들에 대한 면역 반응을 조절 (예를 들어, 자극/향상 또는 감소/내성화 (tolerizing)/아네르기화(anergizing))할 수 있는 세포의 클래스를 나타낸다. 본 발명의 특정 실시예에서, APCs는 CD8+ 및/또는 CD4+ 림프구를 포함하는 T 림프구와 같은 IECs를 활성화시킬 수 있다. in vivo에서 APC로서의 역할을 할 수 있는 세포는, 수지상 세포, 대식세포, 랑게르한스 세포, 단핵구 및 B 세포와 같은 전문적인 APCs뿐만 아니라 활성화된 상피세포, 섬유아세포, 교세포(glial cells), 췌장 베타 세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 비-전문적인 APCs의 예시적인 예도 포함한다. 다양한 세포가 T 세포, 인식을 포함하여 IEC의 세포 표면에 항원을 제시할 수 있다.
용어 "바이오마커"는 일반적으로 특정 생리학적 또는 병태생리학적 상태를 나타내는 위험의 지표를 포함하여, 생리학적 및/또는 병태생리학적 상태의 존재 또는 특성 (예를 들어, 중증도 또는 상태)을 반영하는 측정가능한 특징을 나타낸다. 예를 들어, 바이오마커는 이의 증상을 포함하여, 생리학적 또는 병태생리학적 상태의 발병 전에 피험자로부터 얻어진 시료에 존재할 수 있다. 따라서, 피험자로부터 얻어진 시료에서 바이오마커의 존재는 피험자가 생리학적 또는 병태생리학적 상태 또는 이의 증상을 나타낼 위험이 증가함을 나타내는 것으로 보인다. 대안적으로, 또는 또한, 바이오마커는 개체에서 정상적으로 발현될 수 있으나, 이의 발현은 변화될 수 있다 (즉, 이의 증상을 포함하여, 생리학적 또는 병태생리학적 상태의 발병 전에 증가 (상향조절; 과-발현(over-expressed))되거나 또는 감소 (하향조절, 과소-발현(under-expressed))된다). 따라서, 바이오마커의 수준의 변화는 피험자가 생리학적 또는 병태생리학적 상태 또는 이의 증상을 나타낼 위험이 증가함을 나타내는 것으로 보인다. 대안적으로, 또는 또한, 바이오마커의 수준의 변화는 피험자에서, 특정 생리학적 또는 병태생리학적 상태, 또는 이의 증상의 변화를 반영함으로써, 일정 기간 동안 추적되도록, 생리학적 또는 병태생리학적 상태, 또는 이의 증상의 특성 (예를 들어, 중증도)을 허용한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 피험자에서 이의 유효성 (또는 그 반대)을 평가할 목적으로 치료 요법을 관찰하는데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 바이오마커의 수준에 대한 언급은 하기에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 바이오마커의 농도, 또는 바이오마커의 발현 수준, 또는 바이오마커의 활성을 포함한다.
용어 "바이오마커 값"은 피험자의 적어도 하나의 상응하는 바이오마커에 대해 측정되거나 또는 유도된 값을 나타내며, 일반적으로 피험자로부터 채취한 시료에서 바이오마커의 존재량 또는 농도를 적어도 부분적으로 나타내는 값이다. 따라서, 바이오마커 값은 피험자에 대해 측정된 바이오마커의 값인 측정된 바이오마커 값일 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어 하나 이상의 측정된 바이오마커 값에 함수를 적용함으로써 하나 이상의 측정된 바이오마커 값으로부터 유도된 값인 유도된 바이오마커 값일 수 있다. 바이오마커 값은 값이 결정되는 방법에 따라 임의의 적당한 형태일 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 값은 질량 분석기, 시퀀싱 플랫폼, 어레이 및 혼성화 플랫폼, 면역분석법, 유동 세포 계측법과 같은 고속처리 기술 (high-throughput technologies), 또는 이러한 기술들의 임의의 조합을 이용하여 결정될 수 있다. 하나의 바람직한 예에서, 바이오마커 값은 유동 세포 계측법 등과 같은 기법을 이용하여 정량화된, 단백질 발현 산물 또는 다른 측정가능한 분자의 활성 또는 존재량의 수준에 관한 것이다. 이 경우, 바이오마커 값은 통상의 기술자에 의해 이해되고 하기에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 시료 내의 바이오마커를 발현하는 세포의 백분율 값의 형태일 수 있다.
용어 "바이오마커 프로파일"은 하나 또는 다수의 하나 이상의 유형의 바이오마커 (예를 들어, 폴리펩티드 분자, cDNA 분자 등), 또는 바이오마커(들)의 측정가능한 측면 (예를 들어, 바이오마커 값)과 같은 특징과 함께 이의 징후를 나타낸다. 바이오마커 프로파일은 피험자의 Th1 면역 상태 (예를 들어, 향상된 Th1 면역 상태 또는 감소된 Th1 면역 상태)와 상관관계가 있는 단일 바이오마커 전체 수준, 존재량 또는 양을 포함할 수 있다. 대안적으로, 바이오마커 프로파일은 바이오마커가 예를 들어 폴리펩티드 및 핵산과 같은 동일하거나 또는 상이한 클래스일 수 있는, 적어도 2개의 이러한 바이오마커 또는 이의 징후를 포함할 수 있다. 따라서, 바이오마커 프로파일은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 이상의 바이오마커 또는 이의 징후를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 바이오마커 프로파일은 두어개, 몇개, 수십개 또는 수백개의 바이오마커 또는 이의 징후를 포함한다. 바이오마커 프로파일은 하나 이상의 대조군 또는 내부 표준을 더 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 바이오마커 프로파일은 내부 표준으로서 작용하는, 적어도 하나의 바이오마커 또는 이의 징후를 포함한다. 다른 실시예에서, 바이오마커 프로파일은 하나 이상의 유형의 바이오마커의 징후를 포함한다. 이 문맥에서 본 명세서에서 사용된 용어 "징후"는 단지 바이오마커 프로파일이 바이오마커 분자 실체 그 자체보다는 오히려 바이오마커에 대한 기호, 자료, 약어 또는 다른 유사한 징후를 함유하는 상황을 나타낸다. 또한, 용어 "바이오마커 프로파일"은 본 명세서에서 바이오마커 값 또는 적어도 2개의 바이오마커 값의 조합을 나타내는데 사용되며, 여기서 개개의 바이오마커 값은 하나 이상의 피험자로부터 측정되거나 또는 유래될 수 있는 바이오마커의 값에 상응하고, 조합은 Th1 면역 상태, 이산 질병(discrete condition), 질병의 단계, 하위유형의 질병 또는 이산 질병, 질병의 단계, 하위유형의 질병에 대한 예후의 특징이다. 용어 "프로파일 바이오마커"는 특정 질병, 다른 단계 또는 중증도의 질병, 하위유형의 다른 질병 또는 다른 예후를 용인하거나 또는 배제하는 것과 같은, 임상 평가를 수행하는데 사용될 수 있는 바이오마커 프로파일에 사용하기 위해 확인된 바이오마커의 하위세트를 나타내는데 사용된다. 프로파일 바이오마커의 수는 다양하나, 일반적으로 약 10 이하이다.
용어 "키메라"는, 분자와 관련하여 사용되는 경우, 분자가 2 이상의 상이한 기원 또는 공급원으로부터 유래되거나, 얻어지거나 또는 분리되거나, 또는 이에 기초한 부분을 함유함을 의미한다. 따라서, 폴리펩티드는 상이한 기원의 2 이상의 아미노산 서열을 포함할 때 키메라이며, (1) 사실상 함께 발견되지 않는 폴리펩티드 서열 (즉, 적어도 하나의 아미노산 서열은 적어도 하나의 이의 다른 아미노산 서열에 대해 이종이다), 또는 (2) 원래 인접하지 않은 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "클러스터링" 및 문법적 등가물은 동일한 Th1 면역 상태 바이오마커 (예를 들어, PD-L2)의 2 이상의 가역적 또는 비가역적 연관을 의미한다. 클러스터는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 20 등의 바이오마커로 구성될 수 있다. 2개의 바이오마커의 클러스터를 이량체라고 한다. 3개 이상의 바이오마커의 클러스터는 일반적으로 올리고머라고 불리며, 클러스터의 개별 숫자는 그들 자신의 지정을 갖는다. 예를 들어, 3개의 바이오마커의 클러스터는 삼량체이고, 4개의 바이오마커의 클러스터는 사량체이며, 5개의 바이오마커의 클러스터는 오량체이고, 6개의 바이오마커의 클러스터는 육량체이며, 7개의 바이오마커의 클러스터는 칠량체이고, 8개의 바이오마커의 클러스터는 팔량체이며, 9개의 바이오마커의 클러스터는 구량체(nonamer)이고, 10개의 바이오마커의 클러스터는 십량체(decamer)이며, 12개의 바이오마커의 클러스터는 십이량체(dodecamer)이고, 20개의 바이오마커의 클러스터는 이십량체(eicosamer)이다.
"코딩 서열"은 유전자의 폴리펩티드 산물 또는 유전자의 최종 mRNA 산물 (예를 들어, 스플라이싱 후의 유전자의 mRNA 산물)에 대한 코딩에 기여하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 대조적으로, 용어 "비-코딩 서열"은 유전자의 폴리펩티드 산물 또는 유전자의 최종 mRNA 산물에 대한 코딩에 기여하지 않는 임의의 핵산 서열을 나타낸다.
용어 "꼬인 코일(coiled coil)" 또는 "꼬인 코일 구조"는 본 명세서에서 혼용되어, 2 이상의 α- 나선 (대부분 2-7의 α- 나선)이 밧줄의 가닥처럼 함께 꼬여있는 단백질의 구조적 모티프를 나타낸다 (이량체 및 삼량체가 가장 일반적인 유형임). 많은 꼬인 코일 유형 단백질은 유전자 발현의 조절과 같은 중요한 생물학적 기능, 예를 들어 전사 인자에 관여한다. 꼬인 코일은 항상 그렇지는 않지만 종종, 헵타드 반복(heptad repeat)으로 불리는, 소수성 (h) 및 극성 (p) 아미노산 잔기의 반복 패턴인, hpphppp 또는 hppphpp를 함유한다 (본 명세서에서 하기 참조). 이 반복 패턴을 갖는 서열이 α-나선 2차 구조로 접히면, 소수성 잔기가 좌선성 방식 (left-handed fashion)으로 나선 주위를 부드럽게 감싸는 '줄무늬(stripe)'로서 제시되어 양친매성 구조를 형성한다. 2개의 이러한 나선이 물이 가득찬 환경에서 자신들을 배열하는 가장 유리한 방법은, 친수성 아미노산 사이에 샌드위치된 서로에 대한 소수성 가닥을 감싸는 것이다. 따라서, α-나선의 올리고머화를 위한 열역학적 구동력(thermodynamic driving force)을 제공하는 소수성 표면을 매장한다. 꼬인 코일 계면의 패킹은 매우 단단하다. α- 나선은 평행 또는 역-평행(anti-parallel)일 수 있으며, 일반적으로 좌선성 슈퍼-코일을 채택한다. 비록 불만족스럽지만, 몇몇 우선성(right-handed) 꼬인 코일도 사실상 설계된 단백질에서 관찰되었다. 용어 "꼬인 코일" 또는 "꼬인 코일 구조"는 기술 상식(common general knowledge)에 기초하여 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이에 대해 특별한 언급은 꼬인 코일 구조에 관한 논문, 예를 들어 Cohen and Parry (1990. Proteins 7:1-15); Kohn and Hodges (1998. Trends Biotechnol 16:379- 389); Schneider et al. (1998. Fold Des 3:R29-R40); Harbury et al. (1998. Science 282:1462-1467); Mason and Arndt (2004. Chem­ BioChem 5:170-176); Lupas and Gruber (2005. Adv Protein Chem 70:37-78); Woolfson (2005. Adv Protein Chem 70:79-112); Parry et al. 2008. J Struct Biol 163:258-269); 및 Mcfarlane et al. (2009. Eur J Pharmacol 625:101-107)을 검토하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "동반 진단(companion diagnostic)"은 특정 치료로 치료하거나 또는 치료를 관찰하기 쉬운 피험자를 확인하기 위해 및/또는 피험자 또는 피험자들의 하위-군 또는 다른 군에 대한 유효 투여량을 확인하기 위해 사용되는 진단 방법 및/또는 시약을 나타낸다. 본 명세서의 목적을 위해, 동반 진단은 시약, 예를 들어 시료에서 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은) Th1 면역계 바이오마커의 바이오마커 값을 결정하기 위한 시약을 나타낸다. 동반 진단은 시약 및 시약과 함께 수행되는 검사(들)을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보적" 및 이의 문법적으로 동등한 표현은 서로 혼성화, 올리고머화 (예를 들어, 이량체화, 삼량체화, 사량체화, 오량체화, 육량체화, 칠량체화, 팔량체화, 구량체화, 십량체화, 십일량체 (undecamerize), 십이량체화(dodecamerize)), 상호 작용 또는 그 반대로 복합체를 형성할 수 있는, 2 이상의 구조적 요소 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 소분자 또는 이들의 일부 등)의 특징을 나타낸다. 예를 들어, "폴리펩티드의 상보적 영역"은 함께 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "복합체"는 서로 직접 및/또는 간접적으로 접촉하는 분자 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 등)의 집합체 또는 응집체를 나타낸다. 특정 실시예에서, "접촉", 또는 특히 "직접 접촉"은 2 이상의 분자가 충분히 가까워서 반데르발스 힘, 수소 결합, 이온성 및 소수성 상호 작용 등과 같은 매력적인 비공유 상호 작용이 분자의 상호 작용을 지배한다는 것을 의미한다. 이러한 실시예에서, 분자의 복합체 (예를 들어, 펩티드 및 폴리펩티드)는 복합체가 (예를 들어, 비-응집된 또는 비-복합체화된, 이의 성분 분자의 상태에 비해) 열역학적으로 유리하도록 조건 하에서 형성된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩티드 복합체" 또는 "단백질 복합체"는 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체, 또는 고차(higher order) 올리고머를 나타낸다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체는 PD-L2 폴리펩티드 및 적어도 하나의 올리고머화 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 자기-조립에 의해 형성된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다 (comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 명시된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함하나 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군의 제외가 아니라는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "포함하는" 등의 사용은 열거된 요소가 요구되거나 또는 필수적이지만, 다른 요소는 임의적이며 존재할 수도 있거나 또는 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. "이루어진(consisting of)"은 문구 "이루어진" 다음에 오는 것을 포함하되 이에 한정되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "이루어진"은 열거된 요소가 요구되거나 또는 필수적이며, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. 문구 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 문구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대한 내용에서 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 문구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 요구되거나 또는 필수적이지만, 다른 요소는 임의적이며 이들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있거나 또는 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접합된", "연결된", "융합된" 또는 "융합" 및 이들의 문법적 등가물은, 화학적 결합 또는 재조합 방법 (예를 들어, 유전적 융합에 의한)을 포함하는 모든 방법에 의한 2 이상의 요소 또는 성분 또는 도메인의 결합과 관련하여 혼용된다. 화학적 결합 방법 (예를 들어, 이종이작용성 가교 결합제 이용)은 당해 기술분야에서 알려져 있다. 더욱 상세하게는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, PD-L2 폴리펩티드-올리고머화 도메인 융합체 또는 접합체는 적어도 하나의 올리고머화 도메인에 PD-L2 폴리펩티드의 유전적 또는 화학적 결합을 나타낸다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 글리신-세린 (gly-ser) 링커와 같은 펩티드 링커를 통해, PD-L2 폴리펩티드에 간접적으로 융합된다. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드에 직접 융합된다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 기술분야에서 정의되어 있으며, 이는 일반적으로 하기와 같이 하위-분류될 수 있다:
아미노산 하위-분류
하위-클래스 아미노산
산성 아스파르트산, 글루탐산
염기성 비시클릭(Noncyclic): 아르기닌, 리신; 시클릭: 히스티딘
하전된 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 히스티딘
소(Small) 글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린
극성/중성 아스파라긴, 히스티딘, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌
극성/큰(large) 아스파라긴, 글루타민
소수성 티로신, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판
방향족 트립토판, 티로신, 페닐알라닌
쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 글리신 및 프롤린
또한, 보존적 아미노산 치환은 측쇄에 기초한 분류(groupings)를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로 대체, 아스파르테이트를 글루타메이트로 대체, 트레오닌을 세린으로 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 대체는 결과로 생긴 변이체 폴리펩티드의 특성에 주요한 영향을 미치지 않을 것으로 기대하는 것이 타당하다. 아미노산 변화가 기능성 폴리펩티드를 야기하는지 여부는 이의 활성을 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 보존적 치환은 예시적이고 바람직한 치환의 표제 하에 표 2에 나타내었다. 본 발명의 범위에 속하는 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역에서 펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 이의 효과가 크게 다르지 않은 치환을 선택함으로써 달성된다. 치환이 도입된 후에, 변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝된다.
예시적이고 바람직한 아미노산 치환
원래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala Val, Leu, Ile Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Gln, His, Lys, Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn, His, Lys Asn
Glu Asp, Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala,
Phe, Norleu 		Leu
Leu Norleu, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys Arg, Gln, Asn Arg
Met Leu, Ile, Phe Leu
Phe Leu, Val, Ile, Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Leu
용어 "구조체"는 상이한 공급원으로부터의 하나 이상의 분리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 유전적 분자를 나타낸다. 따라서, 구조체는 상이한 기원의 2 이상의 핵산 서열이 단일 핵산 분자로 모인 키메라 분자이고, (1) 사실상 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열 (즉, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 이의 다른 뉴클레오티드 서열에 대해 이종이다), 또는 (2) 원래 인접하지 않은 기능성 RNA 분자 또는 단백질의 일부를 인코딩하는 서열, 또는 (3) 원래 인접하지 않은 프로모터의 일부를 함유하는 임의의 구조체를 포함한다. 대표적인 구조체는 임의의 재조합 핵산 분자, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자율적으로 복제하는 폴리뉴클레오티드 분자, 파지, 또는 하나 이상의 핵산 분자가 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자율 복제가 가능한 임의의 공급원으로부터 유래된, 선형 또는 원형의 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 구조체는 일반적으로, 예를 들어 표적 핵산 서열 또는 조절제 핵산 서열과 같은 구조체 내에도 함유되는 관심있는 핵산 서열의 직접 발현에 필요한 요소를 포함할 것이다. 이러한 요소는 관심있는 핵산 서열(의 직접 전사를 위해) 작동가능하게 연결되고, 종종 폴리아데닐화 서열도 포함하는 프로모터와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 구조체는 벡터 내에 함유될 수 있다. 구조체의 성분 외에도, 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커, 원핵 및 진핵 기원과 같은 하나 이상의 복제 기원, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및/또는 숙주 세포의 게놈 내로 구조체의 안정한 통합을 용이하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 2 이상의 구조체는 단일 핵산 분자, 예를 들어 단일 벡터 내에 함유될 수 있거나, 또는 2 이상의 별개의 핵산 분자, 예를 들어 2 이상의 별개의 벡터 내에 함유될 수 있다. "발현 구조체"는 적어도 일반적으로 관심있는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 이러한 방법으로, 예를 들어, 발현되는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터가 숙주 세포를 포함하는 유기체 또는 이의 일부에서 발현을 위한 발현 구조체에 제공된다. 본 발명의 실시를 위해, 구조체 및 숙주 세포를 제조하고 사용하기 위한 통상적인 조성물 및 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.
용어 "상관관계(correlating)"는 하나의 유형의 자료와 다른 유형 또는 상태 (예를 들어, Th1 면역 상태) 간의 관계를 결정하는 것을 나타낸다.
"상응하다" 또는 "상응하는"은 기준 아미노산 서열과 실질적인 서열 유사성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 아미노산 서열은 기준 아미노산 서열의 적어도 일부와 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 심지어 최대 100%의 서열 유사성 또는 동일성을 나타낼 것이다.
용어 "올리고머화도(degree of oligomerization)"는 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드 복합체에서 단백질성 분자 단위의 수 (n)를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "진단", "진단하는" 등은 피험자가 질병을 나타낼 가능성, 또는 피험자에서 질병의 존재 또는 특성을 결정하는 것을 포함하도록 본 명세서에서 혼용된다. 또한, 이들 용어들은 진단이 요법의 초기 선택, 요법의 변경 (예를 들어, 용량 또는 투여량 요법의 조절) 등을 포함하는 요법을 안내하는 합리적인 요법의 맥락뿐만 아니라 질환의 중증도 또는 질환의 증상 (episode)을 결정하는 것을 포함한다. "가능성(likelihood)"은 특정 측정된 또는 유래된 바이오마커 값을 갖는 피험자가 실제로 주어진 수학적 모델을 기반으로 한 질병을 갖는지 (또는 갖지 않는지)의 척도를 의미한다. 예를 들어, 증가된 가능성은 상대적이거나 또는 절대적일 수 있으며, 질적으로나 또는 정량적으로 표현될 수도 있다. 예를 들어, 증가된 가능성은 이전의 개체군 연구에 기초하여, 적어도 2개의 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 피험자의 측정된 또는 유래된 바이오마커 값을 결정하고, 피험자를 "증가된 가능성" 카테고리에 배치함으로써 간단히 결정될 수 있다. 또한, 용어 "가능성"은 용어 "확률(probability)"과 본 명세서에서 혼용된다. 용어 "위험"은 미래의 어떤 시점에서 발생하는 특정 사건의 가능성 또는 확률과 관련이 있다. "위험도 계층화(Risk stratification)"는 의사가 환자를 특정 질환을 발병할 수 있는 저, 중, 고 또는 최고 위험으로 분류할 수 있도록 하는 알려진 임상 위험 요인의 배열을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "도메인"은 공통적인 물리화학적 특징, 예를 들어 소수성, 극성, 구형 및 나선형 도메인 또는 리간드-결합, 막 융합, 신호 전달, 세포 침투, 올리고머화 등을 공유하나 이에 한정되지 않는 분자 또는 구조의 일부를 나타낸다. 종종, 도메인은 단백질의 나머지 부분과 독립적으로 이의 3차 구조를 유지하는 능력을 갖는 접힌 단백질 구조를 가진다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전달될 수 있다. 도메인은 영역 또는 이의 일부와 함께 공동-확장될 수 있다; 도메인은 분자의 다른 비-인접 영역을 포함할 수도 있다; 단백질 도메인의 예는 세포 또는 세포외 국소화 도메인 (예를 들어, 신호 펩티드; SP), 면역글로불린 (Ig) 도메인, 엑토도메인, 막관통 (TM) 도메인, 및 세포질 (C) 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인코딩하다", "인코딩하는" 등은 다른 핵산 또는 폴리펩티드를 제공하기 위한 핵산의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 핵산 서열은 전사 및/또는 번역하여 폴리펩티드를 생산할 수 있는 경우 또는 전사 및/또는 번역될 수 있는 형태로 처리하여 폴리펩티드를 생산할 수 있는 경우, 폴리펩티드를 "인코딩한다"라고 말한다. 이러한 핵산 서열은 코딩 서열 또는 코딩 서열과 비-코딩 서열 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "인코딩하다", "인코딩하는" 등은 DNA 분자의 전사에 기인한 RNA 산물, RNA 분자의 번역에 기인한 단백질, DNA 분자를 전사하여 RNA 산물을 형성하고 이후의 RNA 산물의 번역에 기인한 단백질, 또는 DNA 분자를 전사하여 RNA 산물을 형성하고 RNA 산물을 처리하여 처리된 RNA 산물 (예를 들어, mRNA)을 제공하고 이후의 처리된 RNA 산물의 번역에 기인한 단백질을 포함한다.
"엑토도메인"은 세포외 공간 (즉, 세포 외부의 공간)으로 확장되는 세포막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 일반적으로 신호 전달을 야기하는 표면과의 접촉을 시작하는 단백질의 부분이다. 따라서, 본 명세서에서 정의된 PD-L2의 엑토도메인은 세포외 공간 (세포외 도메인)으로 확장되는 PD-L2의 부분을 나타내지만, 상응하는 수용체, 예를 들어 PD-1에 대한 결합을 담당하는 더 짧은 부분 또는 이의 단편도 포함한다. 따라서, 용어 "PD-L2의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 세포외 도메인을 형성하는 PD-L2의 세포외 도메인 또는 수용체 (즉, 수용체 결합 도메인)에 여전히 결합할 수 있는 이의 일부를 나타낸다.
외막형 바이러스(enveloped virus)의 융합 단백질, 또는 융합 단백질의 복합체에 대한 면역 반응을 유도하거나 또는 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 것과 관련하여 "유효량"은, 상기 유도, 치료 또는 예방에 효과적인 단일 용량 또는 연속의 일부로서, 투여를 필요로 하는 개체에게 약제의 양의 투여를 의미한다. 유효량은 치료할 개체의 건강 및 신체 상태, 치료할 개체의 분류군(taxonomic group), 조성물의 제형, 의료 상황의 평가 및 기타 관련 요인에 따라 달라질 것이다. 그 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 들어갈 것으로 예상된다.
용어 "내인성 생산"은 유기체에서 핵산의 발현 및 유기체에서 핵산의 발현 산물의 관련 생산 및/또는 분비를 나타낸다. 특정 실시예에서, 유기체는 다세포 (예를 들어, 척추 동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간과 같은 영장류)이고, 핵산은 다세포 유기체의 세포 또는 조직 내에서 발현된다.
유전자 서열과 관련하여 용어 "발현"은 RNA 전사체 (예를 들어, mRNA, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 등)를 생산하기 위한 유전자의 전사, 및 적당하게, 결과로 생긴 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 나타낸다. 따라서, 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 코딩 서열의 발현은 코딩 서열의 전사 및 번역에 기인한다. 반대로, 비-코딩 서열의 발현은 비-코딩 서열의 전사에 기인한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "융합" 단백질은 원래 결합된 배열로 발견되지 않는 함께 결합된 2 이상의 폴리펩티드를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 나타내며, 일 실시예에서는 폴리펩티드를 나타낸다. 유전자는 기능성 단백질을 생산하는데 사용될 수 있거나 또는 사용되지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 영역 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는 조절 요소)을 모두 포함할 수 있다. 유전자는 "분리될" 수 있으며, 이는 이의 천연 상태의 핵산 분자와 관련하여 일반적으로 발견되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 성분은 다른 세포 물질, 재조합 생산물로부터의 배양 배지, 및/또는 핵산 분자를 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학 물질을 포함한다. 또한, "유전자"에 대한 언급은 본 명세서에서 정의된 인접(contiguous) 핵산 실체를 정의하는 인접 서열, 또는 본 명세서에서 정의된 비-인접 핵산 실체를 정의하는 비-인접 서열을 갖는 유전자에 대한 언급을 이의 범위 내에 포함한다. 특정 실시예에서, 용어 "유전자"는 특정 폴리펩티드, 인트론 및 발현 조절에 관여하는 인접한 5' 및 3' 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 개방 판독틀(open reading frame)을 이의 범위 내에 포함한다. 이와 관련하여, 유전자는 프로모터, 인핸서, 주어진 유전자와 원래 결합된 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호, 또는 이종 조절 서열과 같은 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 유전자 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 이의 단편일 수 있다. 유전자는 염색체외 (extrachromosomal) 유지를 위한 또는 숙주로의 도입을 위한 적당한 벡터로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이종"은 이 서열과 PD-L2 폴리펩티드의 융합 산물이 야생형 PD-L2 폴리펩티드의 전구체 또는 성숙 형태와 다른 서열을 갖는 방식으로 이의 서열이 선택되는 임의의 단백질성 부분을 나타낸다.
용어 "숙주"는 본 발명의 구조체가 도입될 수 있는 진핵 생물 또는 원핵 생물에 상관없이 임의의 유기체 또는 이의 세포를 나타낸다. 특정 실시예에서, 용어 "숙주"는 효모 및 진균과 같은 단세포 진핵 생물, 및 동물과 같은 다세포 진핵 생물을 나타내며, 이들의 비-제한적인 예는 무척추 동물 (예를 들어, 곤충, 자포동물 (cnidarians), 극피동물(echinoderms), 선충류(nematodes) 등); 진핵 기생충 (eukaryotic parasites) (예를 들어, 말라리아 기생충, 예컨대 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 연충류(helminths) 등); 척추 동물 (예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류); 및 포유류 (예를 들어, 설치류, 인간 및 비-인간 영장류와 같은 영장류)를 포함한다. 따라서, 용어 "숙주 세포"는 이러한 진핵 생물의 세포 및 이러한 진핵 생물로부터 유래된 세포주를 적당하게 포함한다. 또한, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 임의의 재조합 벡터(들) 또는 분리된 폴리뉴클레오티드를 수령할 수 있거나 또는 수령한 개체 세포 또는 세포 배양물을 이의 범위 내에 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 부모 세포와 (형태학 또는 전체 DNA 보체(complement)에서) 완전히 동일하지 않을 수도 있다. 숙주 세포는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 in vivo 또는 in vitro에서 형질감염되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 작동 세포" (IECs)는 작동체 부분 수용체(effector moiety receptors), 예를 들어 사이토카인 수용체, 및/또는 이들이 작동체 부분, 예를 들어 사이토카인과의 결합을 통해 이들의 표면 상에서의 Fc 수용체, 및/또는 항체의 Fc 영역을 표시하고, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포의 파괴에 기여하는 림프구를 포함하는 백혈구의 집단을 나타낸다. IECs는 예를 들어 세포독성 효과 또는 식균(phagocytic) 효과를 매개할 수 있다. IECs 세포는 작동체 T 세포, 예를 들어 CD8+ 세포독성 T 세포, CD4+ 도움 T 세포, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포 및 림포카인-활성화 살해(lymphokine-activated killer; LAK) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IECs의 활성은 대식세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, B 세포 및 단핵구와 같은 전문적인 항원 제시 세포를 포함하는 APCs와의 상호 작용을 통해 조절될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성 조성물" 또는 "면역원성 제형"은 척추 동물, 특히 포유류와 같은 동물에게 투여될 때, Th1 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도하는 제제를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "지표(indicator)"는 통상의 기술자가 피험자가 특정 질환으로 고통받고 있는지 여부의 가능성 또는 위험을 추정 및/또는 결정할 수 있는 임의의 정보, 수, 비율, 신호, 징후, 흔적(mark) 또는 메모(note)를 포함하여, 결과 또는 결과의 표시를 나타낸다. 본 발명의 경우에, "지표"는 임의로 다른 임상적 특징과 함께 사용되어 피험자의 Th1 면역 상태를 결정할 수 있다. 이러한 지표가 "결정됨"이란 지표가 100% 정확하다는 것을 의미하는 것은 아니다. 숙련된 임상의는 다른 임상적 징후와 함께 지표를 사용하여 진단을 내릴 수 있다.
"링커"는 2개의 분자를 연결하고 종종 2개의 분자를 원하는 배열로 배치하는 역할을 하는 분자 또는 분자들의 군 (예를 들어, 단량체 또는 고분자)을 의미한다. 특정 실시예에서, "펩티드 링커"는 2개의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 아미노산 서열을 나타내며, 결과로 생긴 폴리펩티드가 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 유지하거나 또는 신호전달 활성을 유지하도록 2개의 하위-결합(sub-binding) (예를 들어, 올리고머화) 도메인의 상호 작용과 양립할 수 있는 스페이서 기능을 제공할 수 있다 (예를 들어, PD-L2 폴리펩티드). 특정 실시예에서, 링커는 약 2 내지 약 35개의 아미노산, 예를 들어, 약 4 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 8 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산으로 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "부분(moiety)"은 분자의 특징적인 화학적, 생물학적 및/또는 의학적 특성을 담당하는 분자내 작용기, 작용기들의 세트, 및/또는 특정 원자 기일 수 있는 분자의 일부를 나타낸다.
"얻어진(obtained)"은 소유하게 되는 것을 의미한다. 이렇게 얻어진 시료는, 예를 들어, 특정 공급원으로부터 분리되거나 또는 유래된 핵산 추출물 또는 폴리펩티드 추출물을 포함한다. 예를 들어, 추출물은 피험자의 생물학적 유체 또는 조직으로부터 직접 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "올리고머화 도메인"은 하나 이상의 다른 단백질 도메인과 직접 또는 다리 분자(bridging molecule)를 통해 우선적으로 상호 작용하거나 또는 결합하는 단백질 도메인을 나타내며, 여기서 다른 단백질 도메인의 상호 작용은 올리고머화 (즉, 동종올리고머(homooligomer) 또는 이종올리고머 (heterooligomer)일 수 있는, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체, 또는 고차 올리고머의 형성)에 실질적으로 기여하거나 또는 효율적으로 촉진시킨다. 이러한 '상보적' 올리고머화 도메인은 이량체화 도메인 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 도메인, 류신 지퍼 등), 삼량체화 도메인 (예를 들어, 대장균 아스파르테이트 트랜스카바모일라제 (ATCase)의 촉매 하위단위, 박테리오파지 T4 피브리틴의 '폴돈(foldon)' 삼량체 서열, 목 부위 펩티드, 인간 폐 계면활성제 D 단백질, 올리고머화 꼬인 코일 부착소 (oligomerization coiled-coil adhesins), 외막형 바이러스 클래스 I 융합 단백질의 상보적 헵타드(heptad) 반복 영역 등), 사량체화 도메인 (예를 들어, 테트라브라키온의 꼬인 코일 도메인), 오량체화 도메인 (예를 들어, 트립토판 지퍼 또는 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP)의 오량체화 도메인 등) 및 육량체화 도메인 (예를 들어, IgA 항체의 중쇄의 C-말단으로부터의 꼬리조각(tailpiece))을 포함하며, 원한다면, 조합하여 사용하여 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체 등과 같은 고차 올리고머를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 결합된"은 이렇게 기재된 성분이 의도된 방법으로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치(uxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 관심있는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 코딩 및/또는 비-코딩 서열)에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)은 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 그 서열의 발현을 허용하기 위해 관심있는 뉴클레오티드 서열에 대한 조절 서열의 위치결정 (positioning) 및/또는 방향결정(orientation)을 나타낸다. 조절 서열은 이들이 이의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 관심있는 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개입하는(intervening) 비-코딩 서열 (예를 들어, 비번역된, 그러나 전사된, 서열)은 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 마찬가지로, PD-L2 폴리펩티드를 적어도 하나의 이종 올리고머화 도메인에 "작동가능하게 연결하는" 것은 PD-L2-올리고머화 도메인(들) 키메라 폴리펩티드의 자기-조립을 허용하여 폴리펩티드 복합체를 형성하는 PD-L2 폴리펩티드에 대한 올리고머화 도메인(들)의 위치결정 및/또는 방향결정을 포함한다.
본 명세서에서 혼용되는 용어 "환자", "피험자", "숙주" 또는 "개체"는, 치료 또는 예방이 필요한 임의의 피험자, 특히 척추 피험자, 더욱 더 특히 포유류 피험자를 나타낸다. 본 발명의 범위에 속하는 적당한 척추 동물은 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원이고, 마카카 속(genus Macaca) (예를 들어, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 및/또는 붉은털 원숭이(rhesus monkeys) (히말라야 원숭이(Macaca mulatta))와 같은 게먹이 원숭이(cynomolgus monkeys)) 및 개코원숭이 (baboon) (차크마개코원숭이(Papio ursinus)) 속의 원숭이의 종, 및 마모셋 (marmosets) (비단마모셋 속(genus Callithrix)의 종), 다람쥐 원숭이(squirrel monkeys) (남미 다람쥐원숭이 속(genus Saimiri)의 종) 및 타마린(tamarins) (타마린 속(genus Saguinus)의 종), 및 침팬지(Pan troglodytes)와 같은 유인원의 종을 포함함), 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫트, 기니아 피그), 토끼류(lagomorphs) (예를 들어, 토끼, 산토끼(hares)), 소류 (예를 들어, 소), 양류 (예를 들어, 양), 염소류 (예를 들어, 염소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개), 고양이류 (예를 들어, 고양이), 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 카나리아와 같은 반려조(companion birds), 사랑앵무 (budgerigars) 등), 해양 포유류 (예를 들어, 돌고래, 고래), 파충류 (예를 들어, 뱀, 개구리, 도마뱀 등), 및 어류를 포함하는 아문 척삭동물문(subphylum Chordata)의 임의의 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 피험자는 외막형 바이러스의 융합 단백질, 또는 융합 단백질의 복합체에 대한 면역 반응을 유도할 필요가 있는 인간이다. 그러나, 상기의 용어는 증상이 존재함을 암시하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 혼용되는 바와 같이, "PD-L2 활성", "PD-L2의 생물학적 활성" 또는 "PD-L2의 기능적 활성"은, 표준 기법에 따라 in vivo 또는 in vitro에서 측정된 바와 같이, PD-L2-반응성 세포 또는 조직 상에서, 또는 PD-L2 폴리펩티드 결합 파트너 상에서의 PD-L2 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 발휘되는 활성을 나타낸다. 일 실시예에서, PD-L2 활성은 PD-L2 결합 파트너와의 결합과 같은 직접 활성이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표적 분자" 또는 "결합 파트너"는 PD-L2 매개 기능이 달성되도록, PD-L2 폴리펩티드가 사실상 결합하거나 또는 상호 작용하는 분자이다. 특정 실시예에서, PD-L2 표적 분자는 PD-1 수용체 및 반발성 유도 분자 b (repulsive guidance molecule b; RGMb)로부터 선택된다. 대안적으로, PD-L2 활성은 PD-L2 폴리펩티드와 천연 결합 파트너, 예를 들어 PD-1 또는 RGMb의 상호 작용에 의해 매개되는 세포 신호전달 활성과 같은 간접 활성이다. PD-L2의 생물학적 활성은 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 PD-L2 폴리펩티드는 하기의 활성 중 하나 이상을 가질 수 있다: 1) 수용체 PD-1 또는 RGMb와 같은 다른 PD-L2 천연 결합 파트너의 활성에 결합 및/또는 조절하는 활성, 2) 세포 내 또는 세포 간 신호전달을 조절하는 활성, 3) 면역 세포, 예를 들어 T 림프구의 활성화를 조절하는 활성, 및 4) 유기체, 예를 들어 인간 또는 다른 영장류와 같은 포유류의 Th1 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 조절하는 활성.
용어 "PD-L2 발현" 및 "PD-L1 발현"은 각각 PD-L2 및 PD-L1의 전사 및/또는 번역 및/또는 활성을 나타낸다. 본 명세서에서 예시된 바와 같이, 몇몇 방법을 이용하여 PD-L2 및 PD-L1 발현의 수준을 결정할 수 있다.
"PD-L2 폴리펩티드"는 PD-L2 분자에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 이 용어는 제한 없이, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 적어도 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이는 하나의 유기체에서 다른 유기체로 존재하고 발생할 수 있는 PD-L2 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이(natural allelic variation)를 더 포함한다. 또한, 글리코실화 또는 다른 번역-후 변형의 정도 및 장소는 선택된 숙주 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 달라질 수 있다. 또한, 용어 "PD-L2 폴리펩티드"는 이들의 전구체 형태의 PD-L2 폴리펩티드 및 이들의 각각의 생체활성 형태를 생산하도록 처리된 것들을 포함하기 위한 것이다. PD-L2 신호 펩티드, IgV 및 IgC 도메인, 엑토도메인, 막관통 도메인 및 세포질 내 도메인을 포함하는, 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드에 대해 화학적으로 변형되고 및/또는 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드에 대해 하나 이상의 아미노산 서열 변경을 함유하고 및/또는 기준 또는 자연적으로-발생하는 전장 또는 전구체 PD-L2 폴리펩티드 또는 이의 도메인에 대해 절단된(truncated) 아미노산 서열을 함유하는 PD-L2 폴리펩티드를 더 포함한다. 대안적으로, 또는 또한, PD-L2 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 PD-L2 폴리펩티드는, 하기와 같은 변경된 (예를 들어, 증가된) 안정성 및 변경된 (예를 들어, 향상된) 생물학적 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는, 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드에 대해 상이한 특성을 나타낼 수 있다: 1) 수용체 PD-1 또는 RGMb와 같은 다른 PD-L2 천연 결합 파트너에 향상된 결합 및/또는 신호전달, 2) 향상된 세포 내 또는 세포 간 신호전달, 3) 면역 세포, 예를 들어 T 림프구의 향상된 활성화, 및 4) 피험자, 예를 들어 인간 또는 다른 영장류와 같은 포유류의 Th1 면역 반응을 포함하는 향상된 면역 반응. 또한, 용어 "PD-L2 폴리펩티드"는 약간 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질성 분자, 예를 들어 N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단 끝을 갖는 폴리펩티드 및/또는 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드에 대해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 또한, PD-L2 폴리펩티드는 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하거나 또는 더 우수한 생체활성을 나타내는 단백질성 분자, 또는, 대안적으로 기준 또는 자연적으로-발생하는 PD-L2 폴리펩티드에 대해 실질적으로 변형되거나 또는 감소된 생체활성을 나타내는 단백질성 분자를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에게 국소 또는 전신 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 대표적인 약학적으로 허용가능한 담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 방부제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향료, 염료, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다 (참조, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 참조로 본 명세서에 포함됨). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분(들)과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약학 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 나타낸다. 용어는 일반적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 어느 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 길이가 적어도 10 염기의 뉴클레오티드의 고분자 형태를 나타낸다. 용어는 단일 가닥 형태 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
"폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 및 "단백질성 분자"는 본 명세서에서 혼용되어 아미노산 잔기의 고분자를 포함하거나 또는 이루어진 분자 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 나타낸다. 따라서, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비-자연적으로 발생하는 아미노산, 예를 들어 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 및 자연적으로 발생하는 아미노산 고분자인 아미노산 고분자에 적용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 사실상 일반적으로 발견되지 않는 형태로 핵산의 조작에 의해 in vitro에서 형성된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 형태일 수 있다. 일반적으로, 이러한 발현 벡터는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함한다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 기법을 이용하여, 즉 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 제조된 폴리펩티드를 의미한다.
직접적으로 또는 간접적으로 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 처리 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 "조절 요소", "조절 서열", "제어 요소", "제어 서열" 등은 본 명세서에서 혼용되어, 코딩 서열 내의 상류에 위치한 뉴클레오티드 서열 (5' 비-코딩 서열) 또는 하류에 위치한 뉴클레오티드 서열 (3' 비-코딩 서열)을 나타낸다. 조절 요소는 인핸서, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, Rep 인식 요소, 유전자 간 영역 (intergenic regions) 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 이들은 천연 및 합성 서열, 및 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "시료"는 피험자로부터 추출, 미처리, 처리, 희석 또는 농축될 수 있는 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 시료는 제한 없이 생물학적 유체, 예를 들어 전혈, 혈청, 적혈구, 백혈구, 혈장, 타액, 소변, 대변 (즉, 분변), 눈물, 땀, 피지, 유두 흡인물(nipple aspirate), 유관 세척물(ductal lavage), 종양 삼출물, 활액(synovial fluid), 복수액(ascitic fluid), 복막액 (peritoneal fluid), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 림프액, 미세침 흡인물(fine needle aspirate), 임의의 다른 체액, 세포 용해물, 세포 분비물, 염증액, 정액 분비물 및 질 분비물을 포함할 수 있다. 시료는 조직 시료 및 생검, 조직 균질액 등을 포함할 수 있다. 유리한 시료는 검출가능한 양으로 본 명세서에서 교시된 임의의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 시료를 포함할 수 있다. 적당하게는, 시료는 피험자로부터 시료의 제거 또는 분리를 가능하게 하는 최소 침습적 방법에 의해 쉽게 얻을 수 있다. 특정 실시예에서, 시료는 혈액, 특히 말초 혈액, 또는 이의 분획물 또는 추출물을 함유한다. 일반적으로, 시료는 림프구, 다형핵 백혈구, 호중구, 단핵구, 망상적혈구(reticulocytes), 호염구 (basophils), 체강소체(coelomocytes), 혈구(hemocytes), 호산구(eosinophils), 거대핵세포(megakaryocytes), 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 또는 이러한 세포의 분획물 (예를 들어, 핵산 또는 단백질 분획물)을 포함하는, 성숙, 미성숙 또는 발달하는 백혈구와 같은 혈액 세포를 포함한다. 특정 실시예에서, 시료는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는 백혈구를 포함한다.
"자기-조립(Self-assembly)"은 서로의 고차 구조의 성분들 (예를 들어, 분자)의 자연적인 인력에 의존하는 고차 구조의 자발적인 조립 과정을 나타낸다. 이것은 일반적으로 분자의 무작위 움직임과 크기, 모양, 조성 또는 화학적 특성에 기초한 결합의 형성을 통해 발생한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성"은 서열이 비교의 창을 통해 뉴클레오티드 단위 또는 아미노산 단위로 동일하다는 정도를 나타낸다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교의 창을 통해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 비교의 창 (즉, 창 크기)을 통해 일치된 위치의 수를 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 발명은 전장 IL-22 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편의 본 발명의 방법 및 시스템에서의 사용을 고려한다. 일반적으로, 전장 IL-22 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편은 상호 작용, 예를 들어, 분자내 또는 분자간 상호 작용에 참여할 수 있다.
"유사성"은 상기 표 1 및 2에서 정의된 바와 같이 동일하거나 또는 보존적 치환을 구성하는 아미노산의 백분율 수를 나타낸다. 유사성은 GAP와 같은 서열 비교 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다 (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395). 이러한 방식으로, 본 명세서에서 인용된 서열과 유사하거나 또는 실질적으로 상이한 길이의 서열은 갭을 정렬에 삽입함으로써 비교될 수 있으며, 이러한 갭은 GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
2 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 기재하는데 사용된 용어는 "기준 서열", "비교 창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 길이가 적어도 12개이지만 빈번하게는 15 내지 18개이고, 종종 적어도 25개의 단량체 단위 (뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함)이다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에서 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부만), 및 (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에서 다른 서열을 포함할 수 있기 때문에, 2 (또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 일반적으로 "비교 창"을 통해 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교함으로써 수행되어 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교한다. "비교 창"은 적어도 약 6개의 인접 위치, 일반적으로 약 50 내지 약 100, 더 일반적으로는 약 100 내지 약 150의 개념적 부분(conceptual segment)을 나타내며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교된다. 비교 창은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여 약 20% 이하의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창의 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 컴퓨터화 된 알고리즘의 시행 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 또는 선택된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 생성된 검사 및 최상의 정렬 (즉, 비교 창을 통해 가장 높은 백분율 상동성을 야기함)에 의해 수행될 수 있다. 참고문헌은 Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389에 의해 개시된 BLAST 계열의 프로그램에 대해서도 언급될 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15의 Unit 19.3에서 확인될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 쇄"는 공유 결합된 아미노산의 단일, 선형 및 인접 배열이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "가용성" 폴리펩티드, 예를 들어 가용성 PD-L2 폴리펩티드는 일반적으로 막-결합되어 있고, 분자에 결합하는 능력을 유지하면서 비-막 결합 상태로 기능하고 이의 막-결합 대응물, 예를 들어 PD-1에 의해 인식되는 비-자연적으로 발생하는 폴리펩티드를 나타낸다.
본 명세서에서 혼용되는 "Th1-관련 질환" 또는 "Th1-관련 장애"는 Th1 면역 반응의 발병과 관련된 질환을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 "Th1 면역 반응"은 Th1 세포의 증식 또는 증가된 분화를 나타낸다. Th1-관련 질환 또는 장애는 (1) 인간, 동물 또는 세포 배양물에서 일반적으로 발견되는 수준을 초과하는 Th1 세포, Th1 사이토카인 및/또는 Th1 항체의 수준; (2) Th1 세포의 증식 또는 분화를 상향조절하는 약제의 투여에 의해 동물에서 실험적으로 모방될 수 있는 질환 또는 질병과 관련된 병리학적 연구 결과; 또는 (3) Th1 세포의 증식 또는 분화를 저해하는 약제로 처리하여 저해되거나 또는 없앨 수 있는 질환 또는 질병의 실험 동물 모델에서 유도된 병리학에 의해 적당하게 확인된다. 대부분의 Th1-관련 질환에서, 3가지 조건 중 적어도 2가지 조건이 충족된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 나타낸다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고, 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"는 포유류, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환에 걸리기 쉬우나 아직 진단받은 적이 없는 피험자에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 저해하는 것, 즉, 이의 발병을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
"벡터"는 폴리뉴클레오티드 분자, 적당하게는 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나 또는 복제될 수 있는 플라스미드, 박테리오파지, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 하나 이상의 고유한 제한 효소 부위를 함유할 수 있으며, 표적 세포 또는 조직 또는 이의 전구 세포 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자율 복제를 할 수 있거나, 또는 복제된 서열이 재현 가능하도록 정의된 숙주 세포의 게놈과 통합할 수 있다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체 복제와 무관한 복제인 염색체-외 실체(entity), 예를 들어, 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드, 염색체-외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체로 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자기-복제(self-replication)를 보증하기 위한 임의의 방법을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 벡터 시스템은 숙주 세포의 게놈에 도입될 총 DNA 또는 트랜스포존을 함께 함유하는, 단일 벡터 또는 플라스미드, 2 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다. 벡터의 선택은 일반적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 양립성에 의존할 것이다. 현재의 경우, 벡터는 바람직하게는 동물, 바람직하게는 포유류 세포에서 작동가능하게 기능적인, 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터이다. 이러한 벡터는 폭스바이러스, 아데노바이러스 또는 효모로부터 유래될 수 있다. 또한, 벡터는 적당한 형질전환체의 선별에 사용될 수 있는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있다. 이러한 내성 유전자의 예는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 항생제 카나마이신 및 G418 (Geneticin®)에 대해 내성을 부여하는 nptII 유전자 및 항생제 하이그로마이신 B에 대해 내성을 부여하는 hph 유전자를 포함한다.
용어 "야생형", "천연" 및 "자연적으로 발생하는"은 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 분리될 때 그 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 나타내기 위해 본 명세서에서 혼용된다. 야생형, 천연 또는 자연적으로 발생하는 유전자 또는 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드)은 개체군에서 가장 빈번하게 관찰되는 것으로서 유전자 또는 유전자 산물의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 임의로 설계된다.
본 명세서에 기재된 각 실시예는 특별히 언급되지 않는 한 각각의 모든 실시예에 대해 준용한다.
2. 폴리펩티드 복합체
본 발명자들은 놀랍게도 APCs (예를 들어, 수지상 세포)와 같은 IEC-상호 작용 세포 상의 PD-L2 발현이 Th1-관련 장애의 중증도와 역 상관관계가 있고 PD-L2가 Th1 면역을 확립하는데 필요하다는 것을 발견하였다. 즉, APCs 상에서의 PD-L2 발현이 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 기준치 (threshold) 아래로 떨어지면 Th1 면역은 손상된다. 또한, 본 발명자들은 APCs의 표면 상에서 PD-L2의 클러스터링이 항원-특이적 IECs, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에서 PD-L1의 면역억제 기능을 저해함으로써 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 저해할 수 있음을 발견하였다. 이로써 본 발명자들은 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하기 위해 PD-L2의 상이한 올리고머의 효과를 비교하였다. 특히, PD-L2의 이량체 형태가 이러한 결합을 차단하는데 효과적이지 않았음을 확인하였다. 그러나, 본 발명자들은 3 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 등)의 올리고머화도를 갖는 고차 PD-L2 올리고머가 PD-1에 대한 결합에 대해 이량체 PD-L2 보다 상당히 높은 친화도를 가지며, 이러한 고차 PD-L2 올리고머가 CD4+ T 세포 기능을 포함하는 IEC 기능에 대한 PD-L1의 억제 효과를 현저히 감소시킬 수 있다는 것도 확인하였다. 따라서, 하기에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명은 Th1 면역 조절 및 Th1-관련 질환의 치료에 사용하기 위해, 3 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 등)의 올리고머화도를 갖는 PD-L2의 올리고머를 제공한다.
따라서, 본 발명은 Th1 면역을 자극하거나 또는 향상시키는데 유용한 폴리펩티드 복합체를 제공하며, 상기 복합체는 일반적으로 화학식 (I)로 표시된다:
[화학식 I]
[P] n
여기서:
P는 각 경우에 대해 독립적으로, PD-L2 폴리펩티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 단백질성 분자를 나타내고;
n은 2보다 큰 정수를 나타낸다.
2.1 PD-L2 폴리펩티드
PD-L2는 막관통 단백질이며, 이의 단량체 형태로 분자의 세포외 도메인을 구성하는 신호 펩티드, IgV 및 IgC 도메인 (본 명세서에서 "엑토도메인"이라고도 함)을 포함하며, IgV-유사 도메인은 전부 또는 부분적으로 PD-1 결합 및 신호전달을 포함하는 다른 기능을 담당한다. 또한, PD-L2는 짧은 세포질 내 도메인 및 단일 막관통 도메인을 함유한다.
PD-L2 단백질의 비-제한적인 예는 하기의 PD-L2 이종상동체(orthologues)로부터 선택될 수 있다:
인간 PD-L2
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI [서열번호: 1];
침팬지 PD-L2
MRWAKRSRYELRERDSMNHERWAKKAASPEVSDQIQNMIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHCERATLLEEQLPLGKALFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPSCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI [서열번호: 2];
마우스 PD-L2
MLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRTWPLHVFIPACTIALIFLAIVIIQRKRI [서열번호: 3]; 또는
서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드.
유용한 PD-L2 폴리펩티드는 생산 세포로부터 분출, 분비 또는 다른 방식으로 추출될 수 있는 적당하게 PD-L2의 단편인 가용성 단편을 포함한다. 일 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 전체 엑토도메인을 포함한다. PD-L2의 엑토도메인은 포유류 PD-L2 또는 이의 활성 단편의 약 20 내지 약 221의 아미노산을 포함한다. 다른 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 IgC 및 IgV 도메인을 포함한다. 또 다른 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 IgV 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2 엑토도메인을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지며, 이의 예시적인 예는 하기를 포함한다:
인간 PD-L2 엑토도메인 + 신호 펩티드
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT [서열번호: 4];
침팬지 PD-L2 엑토도메인 + 신호 펩티드
MRWAKRSRYELRERDSMNHERWAKKAASPEVSDQIQNMIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHCERATLLEEQLPLGKALFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT [서열번호: 5];
마우스 PD-L2 엑토도메인 + 신호 펩티드
MLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRT [서열번호: 6]; 또는
인간 PD-L2 엑토도메인
LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT [서열번호: 7];
침팬지 PD-L2 엑토도메인
LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHCERATLLEEQLPLGKALFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT [서열번호: 8];
마우스 PD-L2 엑토도메인
LFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRT [서열번호: 9]; 또는
서열번호 4 내지 9 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 엑토도메인.
일 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 막관통 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
영장류 서열을 포함하는 다수의 다른 포유류 PD-L2 서열은, 예를 들어 GenPept 데이터베이스 또는 Onlamoon et al. (Immunology 124:277-293, 2008)에 개시된 바와 같이, 당해 기술분야에 알려져 있다.
본 발명의 단백질성 분자는 임의의 적당한 방법에 의해 올리고머화될 수 있다. 예를 들어, 올리고머는 이종이작용성 링커를 사용함으로써 화학적 결합을 통해, 또는 올리고머화 도메인을 단백질성 분자의 PD-L2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결시킴으로써 단백질성 분자 사이에 형성될 수 있다.
2.2 이종이작용성 결합 시약
본 발명의 폴리펩티드 복합체를 생성하기 위한 단백질성 분자와 다른 단백질성 분자의 결합은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 2 이상의 단백질성 분자의 결합은 화학적 결합에 의해 달성되거나 또는 이종이작용성 링커에 의해 촉진될 수 있다. 아미노기와 티올기 사이에 공유 결합을 형성하고 단백질에 티올기를 도입시키는데 사용되는 다수의 이종이작용성 가교 결합 시약은 통상의 기술자에게 알려져 있다 (참조, 예를 들어, the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, 이러한 시약의 제조 및 사용을 기재하고 있고 이러한 시약의 상업적 공급원을 제공한다; 참조, 또한, 예를 들어, Cumber et al. Bioconjugate Chem. 3:397-401, 1992; Thorpe et al. Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Gordon et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:308-312, 1987; Walden et al. J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197, 1986; Carlsson et al. Biochem. J. 173: 723-737, 1978; Mahan et al. Anal. Biochem. 162:163-170, 1987; Wawrzynczak et al. Br. J. Cancer 66:361-366, 1992; Fattom et al. Infection & Immun. 60:584-589, 1992). 이들 시약은 PD-L2 폴리펩티드와 다른 PD-L2 폴리펩티드 사이에 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있으며, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP; 디설파이드 링커); 설포석신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트 (설포-LC-SPDP); 석신이미딜옥시카보닐-α-메틸 벤질 티오설페이트 (SMBT, 장애 디설페이트 링커(hindered disulfate linker)); 석신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트 (LC-SPDP); 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (설포-SMCC); 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)부티레이트 (SPDB; 장애 디설파이드 결합 링커); 설포석신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트 (SAED); 설포석신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트 (SAMCA); 설포석신이미딜-6-[알파-메틸-알파-(2-피리딜디티오)톨루아미도]-헥사노에이트 (설포-LC-SMPT); 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도]부탄 (DPDPB); 4-석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜티오)-톨루엔 (SMPT, 장애 디설페이트 링커); 설포석신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]-헥사노에이트 (설포-LC-SMPT); m-말레이미도벤조일-N-히드록시-석신이미드 에스터 (MBS); m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포-석신이미드 에스터 (설포-MBS); N-석신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB; 티오에테르 링커); 설포석신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (설포-SIAB); 석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB); 설포석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (설포-SMPB); 아지도벤조일 히드라지드 (ABH)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들 링커는 유연성 또는 용해도를 증가시키거나 또는 입체 장애를 제공하거나 또는 제거하는 것과 같은 펩티드 링커와 조합하여 사용될 수 있다. 폴리펩티드 분자를 다른 분자에 결합시키기 위해 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다른 링커가 사용될 수 있다. 일반적인 특성은 결과로 생성된 분자가 PD-1 또는 다른 표적 분자 (예를 들어, 다른 동족체 수용체)에 결합하는 특성이다.
2.3 올리고머화 도메인
3 이상의 PD-L2 폴리펩티드의 상호 작용은 직접적으로 또는 간접적으로 이들이 상호 작용하여 안정한 구조를 형성할 수 있는 임의의 부분 또는 다른 폴리펩티드와의 결합에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들어, 개개의 PD-L2 폴리펩티드 쇄는 올리고머화에 의해 결합되어 본 발명의 단백질성 분자를 형성할 수 있으며, 이로써 폴리펩티드의 올리고머화는 올리고머화 도메인에 의해 매개된다. 일반적으로, 올리고머화 도메인은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 심지어 그 이상의 PD-L2 폴리펩티드-함유 단백질성 분자 간의 안정한 단백질-단백질 상호 작용의 형성을 제공한다. 상이한 올리고머화 도메인이 단백질성 분자의 올리고머화를 허용하기 위해 (즉, 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있는, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체, 또는 고차 올리고머의 형성을 위해) 이들이 우선적으로 서로 상호 작용하거나 또는 결합하도록 '상보적'이어야 한다면, 개개의 PD-L2 폴리펩티드의 올리고머화 도메인(들)은 본 발명의 폴리펩티드 복합체 내의 다른 PD-L2 폴리펩티드의 올리고머화 도메인(들)과 상이할 수 있다.
일반적으로, 올리고머화 도메인은 안정한 단백질-단백질 상호 작용을 형성할 수 있는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 올리고머화 도메인은 면역글로불린 서열 (예를 들어, Fc 도메인; 참조, 예를 들어, 국제특허 공개 번호 WO 93/10151 및 WO 2005/063816; 미국특허 공개 번호 제 2006/0024298호; 미국특허 번호 제 5,457,035호), 류신 지퍼 (예를 들어, 핵 형질전환 단백질 fos 및 jun 또는 원종양유전자(proto-oncogene) c-myc로부터의 또는 질소의 일반 조절(General Control of Nitrogen; GCN4)로부터의 류신 지퍼), 소수성 영역, 친수성 영역, 또는 동종올리고머 또는 이종올리고머의 키메라 분자 사이에 분자간 디설파이드 결합을 형성하는 유리 티올을 통해 상호 작용할 수 있다. 또한, 올리고머화 도메인은 구멍(hole)을 포함하는 아미노산 서열에 상보적인 돌기(protuberance)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 미국특허 번호 제 5,731,168호; 국제특허 공개 번호 WO 98/50431 및 WO 2005/063816; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617-621에 기재되어 있다. 이러한 올리고머화 영역은 입체 상호 작용(steric interactions)이 안정한 상호 작용을 촉진시킬뿐만 아니라, 키메라 단량체의 혼합물로부터 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성도 더 촉진시키도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 돌기는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 돌기와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상성 공동(Compensatory cavities)은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제 2 폴리펩티드의 계면에 임의로 생성된다. 예시적인 올리고머화 도메인은 하기에 기재된다.
예를 들어, 본 명세서에서 제공된 것과 같은 PD-L2 폴리펩티드는 어느 곳에나 결합될 수 있으나, 일반적으로는 이의 N-말단 또는 C-말단을 통해, 적어도 하나의 올리고머화 도메인을 포함하는 올리고머화 모듈의 N-말단 또는 C-말단에 결합하여 키메라 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 결합은 링커를 통해 직접적 또는 간접적일 수 있다. 또한, 키메라 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있거나 또는 공유 또는 비-공유 상호 작용을 통한 화학적 결합에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 올리고머화 도메인을 포함하는 올리고머화 모듈을 함유하는 키메라 폴리펩티드를 제조할 때, PD-L2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 직접적으로 또는 간접적으로 또는 임의로 링커 펩티드를 통해 올리고머화 모듈을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어 핵산 구조체를 형성할 수 있다. 일반적으로, 구조체는 PD-L2 폴리펩티드의 C-말단이 올리고머화 모듈의 N-말단에 결합되는 키메라 폴리펩티드를 인코딩한다. 경우에 따라, 구조체는 PD-L2 폴리펩티드의 N-말단이 올리고머화 도메인의 C-말단에 결합되는 키메라 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
예를 들어, 적어도 하나의 올리고머화 도메인이 PD-L2 폴리펩티드의 하류에 작동가능하게 연결된 실시예에서, 단백질성 분자는 화학식 (II)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 II]
PD-L2―L―OMDA
여기서:
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타내고;
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 결합 또는 펩티드 링커이다.
대안적으로, 단백질성 분자는 화학식 (III)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 III]
PD-L2―L―OMDA―L―OMDB
여기서:
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고,
OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 i 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 i+1, i+2, i+3, i+4, i+5, 또는 i+6 이다.
적어도 하나의 올리고머화 도메인이 PD-L2 폴리펩티드의 상류에 작동가능하게 연결된 실시예에서, 단백질성 분자는 화학식 (IV)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 IV]
OMDA―L―PD-L2
여기서:
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 결합 또는 펩티드 링커이고;
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
대안적으로, 단백질성 분자는 화학식 (V)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다:
[화학식 V]
OMDB―L―OMDA―L―PD-L2
여기서:
OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고,
OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 j 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 j+1, j+2, j+3, j+4, j+5, 또는 j+6 이고;
PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
다수의 올리고머화 도메인은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이의 대표적인 예는 하기를 포함한다:
2.3.1 면역글로불린 도메인
올리고머화 도메인은 부가적인 아미노산 서열의 올리고머화 도메인과 분자간 디설파이드 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 유리 티올 부분을 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 올리고머화 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터의 면역글로불린 분자의 일부를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 부분은 면역글로불린 불변 영역 (Fc)이다. 항체-유래 폴리펩티드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질의 제조는 하기 문헌에 기재되어 있다: 참조, 예를 들어, Ashkenazi et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 10535, 1991; Byrn et al. Nature, 344:667, 1990; 및 Hollenbaugh and Aruffo, (2002) "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins" in Current Protocols in Immunology, Ch. 10, pp. 10.19.1-10.19.11.
일 실시예에서, 올리고머화 도메인은 전장 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 면역글로불린 폴리펩티드는 전장보다 작으며, 즉 중쇄, 경쇄, Fab, Fab2, Fv, 또는 Fc를 함유한다. 일 예에서, PD-L2 폴리펩티드-면역글로불린 키메라 폴리펩티드는 이종올리고머 또는 동종올리고머로서, 특히 사량체로서 조립된다. 다양한 구조의 쇄 또는 기본 단위를 사용하여 이종올리고머 또는 동종올리고머를 조립할 수 있다. 예를 들어, PD-L2 폴리펩티드는 면역글로불린 분자의 전부 또는 일부 (면역글로불린 분자의 C H , C L , VH, 또는 V L 도메인의 전부 또는 일부 포함)에 융합될 수 있다 (참조. 예를 들어, 미국특허 번호 제 5,116,964호). 키메라 PD-L2 폴리펩티드-면역글로불린 폴리펩티드는 적당한 핵산 분자로 형질전환된 포유류 세포에 의해 쉽게 생산되고 분비될 수 있다. 분비된 형태는 PD-L2 폴리펩티드가 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 중쇄 및 경쇄 이종사량체(heterotetramers) (최대 4개 모두 가변 영역 유사체가 치환된 이종사량체 포함)에 존재하는 형태를 포함한다. 일 예에서, 하나 또는 하나 이상의 핵산 융합 분자는 숙주 세포로 형질전환되어 올리고머의 PD-L2 폴리펩티드 부분이 동일하거나 또는 상이한 올리고머를 생산할 수 있다.
Fc 도메인
일반적으로, PD-L2 폴리펩티드 키메라 폴리펩티드의 면역글로불린 부분은 면역글로불린 폴리펩티드의 중쇄, 주로 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 인간 IgG 하위-유형에 대한 중쇄 불변 영역의 예시적인 서열은 하기 서열로부터 선택되고:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호: 10] (IgG1);
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호: 11] (IgG2);
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK [서열번호: 12] (IgG3); 및
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열번호: 13] (IgG4),
여기서, C H1 도메인은 아미노산 1-98에 상응하고, 힌지 영역은 아미노산 99-110에 상응하며, C H2 도메인은 아미노산 111-223에 상응하고, C H3 도메인은 아미노산 224-330에 상응한다.
일 예에서, 면역글로불린 폴리펩티드 키메라 단백질은 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합체는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, C H2 및 C H3 도메인을 보유한다. 예를 들어, IgG1의 전장 Fc 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열의 아미노산 99-330을 포함한다. 인간 IgG1에 대한 예시적인 Fc 서열은 하기와 같으며:
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호: 14],
거의 모든 힌지 서열 및 서열번호: 10에 제시된 C H2 및 C H3 도메인에 대한 완전한 서열을 함유한다.
대안적으로, 인간 IgG1에 대한 Fc 폴리펩티드는
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호: 15]; 및
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열번호: 16]으로부터 선택된다.
인간 IgG1 Fc 이외에, 다른 Fc 영역도 본 명세서에서 제공된 PD-L2 폴리펩티드-올리고머화 모듈 키메라 단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, Fc/Fcγ 수용체 (Fc/FcγR) 상호 작용에 의해 매개되는 면역 작동체 기능이 최소화되어야 하는 경우, 예를 들어 IgG2 또는 IgG4의 Fc와 같은 보체 또는 면역 작동 세포를 불충분하게 모집하는 IgG 동형과의 융합이 고려된다. 또한, Fc 융합체는 항체의 IgG (인간 하위클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 포함), IgA (인간 하위클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE 및 IgM 클래스를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 항체 클래스에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 면역글로불린 서열을 함유할 수 있다. 또한, 링커는 다른 폴리펩티드에 Fc를 공유 결합시키는데 사용되어 Fc 키메라를 생성할 수 있다.
또한, 변형된 Fc 도메인은 PD-L2 폴리펩티드를 갖는 키메라에서의 사용을 위해 본 명세서에서 고려된다. 일 예에서, Fc 영역은 FcR에 대해 변경된 결합을 나타내도록 변형되어 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 작동체 기능보다 변경된 (즉, 어느 정도) 작동체 기능을 나타내야 한다. 따라서, 변형된 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대해 증가된 또는 낮거나 없는 친화도를 포함하나 이에 한정되지 않는 변경된 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 상이한 IgG 하위클래스는 일반적으로 IgG2 및 IgG4 보다 수용체에 실질적으로 더 잘 결합하는 IgG1 및 IgG3과 함께, FcγRs에 대해 상이한 친화도를 가진다. 변형된 Fc 도메인은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 하기 문헌에 기재되어 있다. 참조, 예를 들어, 예시적인 변형에 대해 미국특허 번호 제 5,457,035호; 미국특허 공개 번호 US 2006/0024298호; 및 국제특허 공개 번호 WO 2005/063816.
2.3.2 꼬인 코일 도메인
단백질 올리고머화에 관련된 하나의 공통 구조 모티프는 꼬인-코일 도메인이고, 이러한 도메인은 PD-L2 폴리펩티드 복합체를 제조하기 위한 올리고머화 도메인으로 사용될 수도 있다. 꼬인 α-나선 구조 모티프는 그 자체로 코일을 형성할 수 있으며, 인공 오른손방향(right-handed) 슈퍼 나선이 설계되었지만 2, 3, 4 또는 5 개의 α-나선이 서로 감아서 "꼬인 코일"로 알려진 왼손방향 슈퍼 나선을 형성할 수 있다 (Burkhard et al., Trends Cell Biol 11:82-88, 2001; Section 5.5.2 of Proteins by Creighton (ISBN 0-7167-2317-4); Yu AdV Drug Deliv Rev 54:1113-1129, 2002; Muller et al., Methods Enzymol 328:261-282, 2000; Beck & Brodsky J Struct Biol 122:17-29, 1998; Lupas Trends Biochem Sci 21:375-382, 1996; Adamson et al., Curr Opin Biotechnol 4:428-347, 1993). 꼬인 코일 도메인의 단순성은 정의된 올리고머화 상태를 갖는 키메라 단백질을 설계하기 위한 대중적인 선택이 되었다 (Muller et al., Methods Enzymol 328:261-282, 2000).
꼬인 코일 구조에서, α-나선은 각 나선의 한쪽을 따라 무극 줄무늬 (apolar stripe)를 형성하는 소수성 잔기를 통해 상호 작용하며, 이 줄무늬의 양쪽에 있는 측쇄 사이에 정전기적 상호 작용을 안정화시킬 수도 있다. α-나선의 abcdefg 헵타드 반복 내에서, 무극 줄무늬는 잔기 a 및 d에서 소수성 측쇄에 의해 정의되며, 임의의 정전기적 상호 작용은 주로 잔기 e 및 g에 존재한다. 위치 a는 Leu, Ile 또는 Ala가 가장 빈번하고, 위치 d는 보통 Leu 또는 Ala 이다. 잔기 e 및 g는 종종 Glu 또는 Gln이며, Arg 및 Lys는 또한 위치 g에서 두드러진다. 이들 잔기는 용매와 접촉하기 때문에, 하전된 잔기는 위치 b, c 및 f에서 공통적이다. 이러한 일반적인 헵타드 패턴에는 예외가 있으나, Pro 잔기는 때때로 헵타드 내에서 발견된다. 예로서, 이러한 예외는 일반적으로 F 단백질에서 발생하는 것과 같은 재접힘 및 재배열을 허용하기 위해 올리고머화 도메인의 불안정화를 포함하는 기능적 중요성을 갖는다.
수백 개의 꼬인 코일 도메인 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 다른 꼬인 코일 도메인으로 올리고머화하는 능력을 유지하고 PD-L2 폴리펩티드 내의 다른 도메인의 기능을 파괴하거나 또는 현저히 손상시키지 않는다면, 임의의 적당한 서열은 본 발명의 올리고머화 도메인으로서 사용될 수 있다. 천연 꼬인 코일 도메인을 사용하는 것의 대안으로, 인공 꼬인 코일 도메인이 사용될 수 있다 (Chao et al., J Chromatog B Biomed Sci Appl 715:307-329, 1998; Arndt et al., Structure 10:1235-1248, 2002). 꼬인 코일 도메인의 고도로 반복된 구조로 인해, 도메인은 각 아미노산 잔기의 백본 부분이 그 자신의 변수를 갖는 고유 단위로서 잔기의 각 백본 부분을 처리하기보다는 매개변수화될 수 있기 때문에 컴퓨터 모델링에 특히 적합하다. 도메인 (b)는 류신 지퍼 서열 또는 알라닌 지퍼 서열을 포함할 수 있다 (Liu & Lu J Biol Chem 277:48708-48713, 2002).
꼬인 코일은 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체로 존재하는 것으로 나타났다. 이들은 특히 fos, jun, c-myc, GCN4, 바이러스성 융합 펩티드, SNARE 복합체 및 특정 tRNA 합성 효소와 같은 전사 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 유형의 단백질에서 발견되었다. 매우 긴 꼬인 코일은 트로포미오신(tropomyosin), 중간 필라멘트(intermediate filament) 및 방추극체(spindle-pole-body) 성분과 같은 단백질에서 발견된다. 다른 예는 3개 (트롬보스폰딘(thrombospondins) 1 및 2) 또는 5개 (트롬보스폰딘 3, 4 및 COMP)의 쇄가 연결되어 있는 트롬보스폰딘 및 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (cartilage oligomeric matrix protein; COMP)이다. 분자는 꽃다발(flower bouquet)-유사 외관을 가지며, 이들의 올리고머 구조에 대한 이유는 아마도 C-말단 도메인과 세포 수용체의 다가 상호 작용일 것이다. 효모 전사 활성제(transcriptional activator) GCN4는 기본 영역 류신 지퍼 (bZIP) DNA-결합 모티프를 함유한 30개 이상의 확인된 진핵 단백질 중 1개이다 (Ellenberger et al. (Cell 71: 1223-1237, 1982)). bZIP 이량체는 이의 카복시-말단 34 잔기 위에 평행한 꼬인 코일을 형성하고 DNA 결합 부위의 주요 홈(groove)을 통과하기 위해 이의 아미노 말단으로 점차적으로 갈라지는 한 쌍의 연속 알파 나선이다. 다른 예는 Mr 52,000의 하위단위의 동종삼량체로서 소 기관 연골(bovine tracheal cartilage)로부터 분리된 CMP (마트릴린(matrilin)-1)이며 (Paulsson and Heinegard Biochem J. 197: 367-375, 1981), 여기서 각각의 하위단위는 vWFA1 모듈, 단일 EGF 도메인, vWFA2 모듈 및 5개의 헵타드에 걸친 꼬인 코일 도메인으로 이루어진다 (Kiss et al. J. Biol. Chem. 264:8126-8134, 1989; Hauser and Paulsson J. Biol. Chem. 269: 25747-25753, 1994). 또 다른 예는 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP)이다. 비-콜라겐성 당단백질인 COMP는 연골에서 처음 확인되었다 (Hedbom, et al. J. Biol. Chem. 267:6132-6136, 1992). 단백질은 N-말단 헵타드 반복 부위 (cc), 4개의 표피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인 (EF), 7개의 칼슘-결합 도메인 (T3) 및 C-말단 구형 도메인 (TC)로 이루어지는 5개의 하위단위의 524 kDa 동형오량체이다. 이 도메인 조직에 따르면, COMP는 트롬보스폰틴 계열에 속한다.
특정 실시예에서, 꼬인 코일 올리고머화 도메인은 류신 지퍼이다. 류신 지퍼 도메인에 의해 형성된 이량체는 (abcdefg)n으로 표시되는 헵타드 반복에 의해 안정화되며 (참조, McLachlan and Stewart, J. Mol. Biol. 98:293, 1978), 여기서 잔기 a 및 d는 일반적으로 소수성 잔기이고, d는 류신이며, 나선의 동일한 면에서 정렬한다. 일반적으로 반대로-하전된 잔기는 위치 g 및 e에서 발생한다. 따라서, 2개의 나선 류신 지퍼 도메인으로부터 형성된 평행 꼬인 코일에서, 제 1 나선의 소수성 측쇄에 의해 형성된 "손잡이(knobs)"는 제 2 나선의 측쇄 사이에 형성된 "구멍"에 채워진다.
본 명세서에서 올리고머화 도메인으로 사용하기 위한 예시적인 류신 지퍼는, 류신 지퍼 도메인을 나타내는 2개의 핵 형질전환 단백질인 fos 및 jun 중 어느 하나, 또는 쥣과 원종양유전자인 c-myc의 생성물로부터 유래될 수 있다. 류신 지퍼 도메인은 이러한 단백질에서 생물학적 활성 (DNA 결합)에 필요하다. 핵 종양유전자 fos 및 jun의 생성물은 우선적으로 이종이량체를 형성하는 류신 지퍼 도메인을 함유한다 (O'Shea et al. Science, 245:646, 1989; Turner and Tijian Science, 243:1689, 1989). 예를 들어, 인간 전사 인자 c-jun 및 c-fos의 류신 지퍼 도메인은 1:1 화학량론을 갖는 안정한 이종이량체를 형성하는 것으로 나타났다 (참조, 예를 들어, Busch and Sassone-Corsi, Trends Genetics, 6:36-40, 1990; Gentz et al., Science, 243:1695-1699, 1989). jun-jun 동종이량체도 형성되는 것으로 나타났지만, 이들은 jun-fos 이종이량체보다 약 1000배 덜 안정적이다.
일반적으로, c-jun 또는 c-fos의 류신 지퍼 도메인은 PD-L2 폴리펩티드의 C-말단에서 융합된다. c-jun 및 c-fos 류신 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 각각
RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMN [서열번호: 17]; 및
LTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAA [서열번호: 18]을 포함한다.
또한, 하기에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, PD-L2 폴리펩티드와 류신 지퍼의 결합은 직접적일 수 있거나 또는 IgG의 힌지 영역과 같은 가요성(flexible) 링커 도메인, 또는 글리신, 세린, 트레오닌 또는 알라닌과 같은 작은 아미노산의 다른 폴리펩티드 링커를 다양한 길이 및 조합으로 사용할 수 있다. 경우에 따라, 인코딩된 폴리펩티드의 C-말단으로부터 류신 지퍼의 분리는 예를 들어 트롬빈 절단 부위와 같은 프로테아제 절단 부위를 인코딩하는 서열과의 융합에 의해 수행될 수 있다.
올리고머화 도메인으로 사용하기 위한 또 다른 예시적인 류신 지퍼는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 질소의 일반 조절 (GCN4) 대사에 관여하는 유전자의 계열의 전사 활성화제로서 기능하는 핵 단백질로부터 유래된다. 단백질은 GCN4에 대한 인식 서열을 함유하는 프로모터 서열을 이량체화하고 결합시켜 질소 결핍 시에 전사를 활성화시킬 수 있다. 이러한 도메인은 당해 기술분야에 알려져 있다 (O'Shea et al., Science 243, 534-542, 1989; Harbury et al., Science 262, 1401-1407, 1993). 이량체 복합체를 형성할 수는 GCN4 류신 지퍼의 예시적인 서열은
RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGE [서열번호: 19]; 및
MKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER [서열번호: 20]으로부터 적당하게 선택된다.
GCN4 류신 지퍼 도메인을 나타내는 합성 펩티드의 a 및 d 잔기에서 아미노산 치환 (즉, 서열번호: 16으로 제시된 서열에서 아미노산 치환)은 류신 지퍼 도메인의 올리고머화 특성을 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 위치 a에서의 모든 잔기가 이소류신으로 변하면, 류신 지퍼는 여전히 평행 이량체를 형성한다. 이러한 변화 이외에, 위치 d에서의 모든 류신 잔기도 이소류신으로 변하면, 결과로 생성된 펩티드는 자발적으로 용액에서 삼량체 평행 꼬인 코일을 형성한다. 삼량체를 형성할 수 있는 이러한 GCN4 류신 지퍼 도메인의 예시적인 서열은
RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE [서열번호: 21]; 및
MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK [서열번호: 22]로부터 선택된다.
위치 d에서의 모든 아미노산을 이소류신으로 치환하고 위치 a에서의 모든 아미노산을 류신으로 치환하면, 사량체화되는 펩티드가 생성된다. 사량체를 형성할 수 있는 GCN4의 류신 지퍼 도메인의 대표적인 서열은
RMKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE [서열번호: 23]; 및
MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE [서열번호: 24]로부터 적당하게 선택된다.
올리고머 형성의 기전이 상기 기재된 GCN4 및 서열번호: 16에 제시된 것과 같은 종래의 류신 지퍼 도메인의 기전과 동일하다고 생각되기 때문에, 이러한 치환을 함유하는 펩티드는 여전히 류신 지퍼 도메인이라고 한다.
대안적인 꼬인 코일 도메인은 박테리아성 막관통 단백질에서 얻은 것으로, 삼량체를 형성한다. 막관통 단백질의 적당한 하위세트는 부착소(adhesins) (즉, 다른 세포 또는 표면에 대한 부착을 매개하는 세포-표면 단백질), 특히 (예를 들어, 올리고머화 꼬인 코일 부착소, 또는 '오카(Oca)' 계열에서) 비-섬모성 부착소(non-fimbrial adhesins) 이다. 본 발명에서 사용하기 위한 특정 서열은 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 부착소 YadA, 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis) 부착소 NadA, 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 표면 단백질 UspA2, 및 헤모필루스 인플루엔자 생체군 애집티우스 (Haemophilus influenzae biogroup aegyptius) 등의 HadA 부착소와 같은 기타 부착소로부터의 참조 문헌 24에 개시된 것들을 포함한다 (참조, WO2006/011060의 서열번호 28-31 및 42-58). 또한, 진핵생물 열-충격 전사 인자는 별도로 발현될 수 있으므로 본 발명에 사용될 수 있는 꼬인 코일 삼량체화 도메인을 가진다.
본 발명에 사용될 수 있는 다른 클래스의 올리고머화 도메인은 콜라겐 나선으로 알려진 왼손방향 삼중 나선에서 발견된다 (Section 5.5.3 of Proteins by Creighton (ISBN 0-7167-2317-4)). 이러한 삼중 나선-형성 서열은 1Gly2Xaa3Xaa의 기본 트리펩티드 반복 서열을 포함하며, 여기서 2Xaa는 종종 Pro이고, 3Xaa는 종종 4-히드록시프롤린이다. 이 모티프는 "콜라겐" 나선으로 알려져 있지만, 콜라겐 이외의 많은 단백질에서 발견된다. 따라서, 올리고머화 도메인은 서열 모티프 1Gly2Xaa3Xaa의 다중 반복을 포함하는 서열일 수 있으며, 이 모티프는 접혀 다른 폴리펩티드 쇄에서 상응하는 나선 구조와 올리고머화할 수 있는 나선 구조를 형성한다.
또한, 콜라겐은 다른 클래스의 올리고머화 도메인을 제공한다. Zhang & Chen (J Biol Chem 274:22409-22413, 1999)은 X형 콜라겐의 비-콜라겐성 도메인 1 (NC1)에서 발견되는 모티프를 기재하고, 이 모티프는 삼중 나선이 없는 삼량체 및 고차 올리고머 형성에 사용될 수 있다. 이 삼량체 결합은 분자간 디설파이드 결합없이 매우 내열성이다. 따라서, 올리고머화 도메인은 NC1 서열을 포함할 수 있다.
박테리오파지 T4 단백질 피브리틴의 삼량체화 도메인 (폴돈) (Tao et al., Structure 5:789-798, 1997; Gu the et al. J. Mol. Biol. 337, 905-915, 2004), 특히 폴돈의 C-말단 27 내지 30 잔기 또는 이의 유도체는, PD-L2 폴리펩티드를 올리고머화하는데 사용될 수도 있다. 이 삼량체화 도메인은 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL [서열번호: 25] 또는 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL [서열번호: 26]을 가질 수 있다. 이 도메인의 작은 변형도 예상된다. 이러한 변형은 인접한 도메인 사이에서 디설파이드 다리의 형성을 위해 Asp 9의 Cys로의 치환일 수 있다. 이 도메인의 표면 아미노산의 다른 변형은 소수성, 친수성 또는 이온성 상호 작용 또는 디설파이드 다리와 같은 공유 결합과 같은 인접한 올리고머화 도메인 사이의 계면에서 상호 작용을 최적화하기 위한 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 이 도메인의 표면 아미노산의 또 다른 변형은 작용기에 대한 부착 부위의 생성을 위해 아미노산의 치환 (예를 들어, 시스테인 또는 리신으로)을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 테트라브라키온(tetrabrachion)의 꼬인 코일 도메인의 사량체화 도메인 (Stetefeld et al., Nature Structural Biology 7(9):772-776, 2000) 또는 이의 유도체는, PD-L2 폴리펩티드의 올리고머화에 사용된다. 사량체화 도메인은 적당하게 서열 IINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG [서열번호: 27]을 포함한다. 꼬인 코일의 서열은 3,4-소수성 반복을 갖는 7개 잔기의 헵타드 반복을 특징으로 한다. 잔기가 적은 수의 회전 후에 준-등가 위치(quasi-equivalent positions)를 추정하게 하는 다음 주기성은 3 회전 또는 11 잔기이다. 11-잔기 반복의 존재에 기초하여, 초고온성 고세균(hyperthermophilic archae-bacterium) 스타필로테르무스 마리누스(Staphylothermus marinus)의 표면층 당단백질 테트라브라키온의 C-말단은 오른손방향 꼬인 코일 구조를 형성한다. 이것은 이의 C-말단 끝에서 세포막에 고정되어 있는 70 nm 길이의 사량체의 α-나선 꼬인 코일 줄기를 형성한다.
또한, 본 발명은 PD-L2 폴리펩티드를 올리고머화하기 위한 오량체화 도메인을 고려한다. 이러한 유형의 비-제한적인 도메인은 COMP의 오량체화 도메인 (Malashkevich et al., Science 274:761-765, 1996) 또는 이의 유도체이다. 이 오량체화 도메인은 서열 LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG [서열번호: 28]을 포함할 수 있다. 시스테인이 이 오량체화 도메인의 C-말단에서 분자간 디설파이드 다리를 형성하는 C-말단 CDACG 모티프가 결핍된, 이 서열의 더 짧은 구조체도 또한 예상된다.
대안적으로, 오량체화 도메인은 트립토판 지퍼 (Liu J et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:16156-16161, 2004) 또는 이의 유도체이다. 이 유형의 비-제한적인 오량체화 도메인은 서열 SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDD WARWNQRWDNWAT [서열번호: 29]를 포함한다.
또 다른 유용한 올리고머화 도메인은 IgA 면역글로불린의 중쇄의 C-말단 (알파 꼬리조각(alpha tailpiece; αtp)으로도 알려짐)이며, 육량체를 형성한다. 대표적인 육량체화 αtp 서열은 길이가 18 아미노산이고 인간 IgA 분자로부터 유래된다. 일 실시예에서, 알파 꼬리조각은 PTHVNVSVVMAEVDGTCY [서열번호: 30]이다. 그러나, 원하는 경우, 펩티드는 잔기 5-7 (NVS)에서 1 또는 2 아미노산을 변화시킴으로써 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 위치 5에서의 아스파라긴 (N)은 글루타민 (Q)으로 변할 수 있다. 대안적으로, 위치 7에서의 세린 (S)은 알라닌 (A)로 변할 수 있다. 또한, IgA 불변 영역의 아미노산 잔기 중 몇몇은, 예를 들어 IgA 불변 영역의 약 4개의 아미노산을 포함할 수 있다. 유용한 알파 꼬리조각을 갖는 적당한 IgA 분자는 인간 IgA1, 인간 IgA2, 토끼 IgA 및 마우스 IgA를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 펩티드는 C H2 및 C H3 도메인을 포함하는 단편과 같은 면역글로불린의 불변 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
2.3.3 하위단위 사이의 단백질-단백질 상호 작용
PD-L2 폴리펩티드의 올리고머화에 사용하기 위한 다른 올리고머화 도메인은 올리고머화가 상이한 하위단위 폴리펩티드 사이의 단백질-단백질 상호 작용에 의해 촉진되는 것들이다. 예를 들어, 이러한 올리고머화 도메인은 A 키나제 고정 단백질 (A kinase anchor proteins; AKAP)의 이의 고정 도메인(anchoring domain; AD)을 갖는 cAMP-의존성 단백질 키나제(cAMP-dependent protein kinase; PKA)의 기전으로부터 유래된다. 따라서, 이종올리고머 PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2 폴리펩티드를 PKA의 R 하위단위 서열과 (직접적으로 또는 간접적으로) 융합시켜 생성될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA [서열번호: 31]이다. 이것은 R 하위단위에 의해 영향을 받는 이량체의 자발적인 형성때문에, 동종이량체 분자를 야기한다. 동시에, 다른 PD-L2 폴리펩티드 융합체는 다른 PD-L2 폴리펩티드를 AKAP의 AD 서열에 융합시킴으로써 생성될 수 있고, 예를 들어 서열: QIEYLAKQIVDNAIQQ [서열번호: 32]를 포함한다. 숙주 세포에서 이들 키메라 폴리펩티드 각각에 대한 코딩 서열의 공동-발현(co-expression) 시, 이량체 R 하위단위는 AD 서열에 결합하기 위한 도킹 부위를 제공하여, 이종올리고머 분자를 야기한다. 이러한 결합 결과는 예를 들어 디설파이드 결합과 같은 공유 결합에 의해 더 안정화될 수 있다. 일 예에서, 가요성 링커 잔기는 PD-L2 폴리펩티드와 올리고머화 도메인 사이에 융합될 수 있다. 다른 예에서, PD-L2 폴리펩티드의 융합은 R 하위단위의 아미노 말단 끝에 인접하게 결합된 시스테인 잔기를 함유하는 R 하위단위와의 공유 결합을 용이하게 할 수 있다. 이러한 PKA의 변형된 R 하위단위는 예를 들어 서열: CSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA [서열번호: 33]을 포함할 수 있다. 유사하게, PD-L2 폴리펩티드의 융합은 AD의 아미노-말단 끝 및 카복실-말단 끝 모두에 시스테인 잔기의 결합을 함유하는 AD 하위단위에 대한 것일 수도 있다. 이러한 변형된 AD 하위단위에 대한 대표적인 서열은 서열: CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC [서열번호: 34]를 포함한다.
PD-L2 폴리펩티드 융합체로서 별도로 생성되고 발현되는 2 이상의 폴리펩티드의 단백질-단백질 상호 작용을 촉진시키는 PD-L2 폴리펩티드를 올리고머화하는데 사용될 수 있는 다른 올리고머화 도메인은, 예를 들어 바르나제-바르스타 모듈 (참조, 예를 들어, Deyev et al., Nat. Biotechnol. 21:1486-1492, 2003); 특정 단백질 도메인의 사용 (참조, 예를 들어, Terskikh et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 1663-1668, 1997; and Muller et al., FEBS Lett. 422:259-264, 1998); 특정 펩티드 모티프의 사용 (참조, 예를 들어, de Kruif et al., J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996; and Muller et al., FEBS Lett. 432: 45-49, 1998); 및 향상된 안정성을 위한 디설파이드 다리의 사용 (de Kruif et al., J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996; and Schmiedl et al., Protein Eng. 13:725-734, 2000), 및 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 합텐-항-합텐, 리간드-수용체 및 수용체-공-수용체(receptor-co-receptor)와 같은 특이적 결합 쌍을 포함한다.
2.4 링커
본 발명의 키메라 폴리펩티드는 올리고머화 도메인으로부터 PD-L2 폴리펩티드를 일정한 간격을 두거나 또는 2개의 올리고머화 도메인을 일정한 간격을 두는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 일반적으로 헵타드 반복 서열에 명백하게 할당될 수 없는 임의의 아미노산 잔기를 포함한다. 링커는 예를 들어, 항체 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편 (scFv) 구조체의 생성에서 상이한 기능 단위를 서로 연결하기 위해 단백질 공학 분야에서 자주 사용된다. 이들은 일반적으로 용액에서 구조적으로 유연하며, 적당히 대부분 극성 아미노산 잔기 유형으로 구성되어 있다. 가요성 링커에서 일반적인 (자주 사용되는) 아미노산은 세린 및 글리신이다. 덜 바람직하게는, 가요성 링커는 알라닌, 트레오닌 및 프롤린을 포함할 수도 있다. 따라서, 키메라 폴리펩티드의 개입 링커는 바람직하게는 PD-L2 폴리펩티드와 올리고머화 도메인 또는 2개의 올리고머화 도메인의 완화된 (방해되지 않는) 결합을 보장하기 위해 입체구조가 유연하다. 링커가 PD-L2 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 올리고머화 도메인의 올리고머화 특성에 영향을 미치지 않는다는 의미에서, 링커가 구조적으로 유연한 한, 본 명세서에서 예상된 폴리펩티드에서 사용하기 위한 적당한 링커는 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 일반적으로 아미노산 서열을 결합시키기 위해 당해 기술분야에서 사용되는 임의의 링커일 수 있다.
통상의 기술자는 임의로 제한된 수의 일상 실험을 수행한 후에 최적의 링커를 결정할 수 있을 것이다. 개입 링커는 적당하게는 일반적으로 적어도 1 아미노산 잔기로 이루어지고 일반적으로 2 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열이며, 편의상 약 100 아미노산 잔기인 이유로 비-임계 상한이 선택된다. 특정 실시예에서, 링커는 약 1 내지 약 50 아미노산 잔기, 또는 약 50 내지 약 100 아미노산 잔기, 통상적으로 약 1 내지 약 40 아미노산 잔기, 일반적으로 약 1 내지 약 30 아미노산 잔기로 이루어진다. 특히, 비-제한적인 실시예에서, 링커 서열의 아미노산 잔기의 적어도 50%는 프롤린, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 비-제한적인 실시예에서, 링커 서열의 아미노산 잔기의 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 특히 90%는 프롤린, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 실시예에서, 링커 서열은 필수적으로 극성 아미노산 잔기로 이루어진다; 이러한 특정 실시예에서, 링커 서열의 아미노산 잔기의 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예를 들어 70% 또는 80%, 특히 90% 또는 최대 100%는 글리신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 프롤린, 히스티딘, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 링커 서열은 GG, [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n 을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수이다.
특정 실시예에서, 예시적인 링커는 GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], AAPA [서열번호:43]으로부터 선택될 수 있다.
2.5 기타 부분(Other moieties)
본 발명의 키메라 폴리펩티드는 PD-L2 폴리펩티드-올리고머화 도메인 키메라의 정제를 용이하게 하기 위해 정제 부분을 더 포함할 수 있다. 정제 부분은 일반적으로 친화도 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 회수를 가능하게 하는 아미노산의 신축성(stretch)을 포함한다. 수많은 정제 부분 또는 '태그(tags)'는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이의 예시적인 예는 비오틴 카복실 담체 단백질-태그 (BCCP-tag), Myc-태그 (c-myc-tag), 칼모듈린-태그(Calmodulin-tag), FLAG-태그, HA-태그, His-태그 (헥사히스티딘-태그, His6, 6H), 말토오스 결합 단백질-태그 (MBP-tag), Nus-태그, 셀룰로오스 결합 도메일-태그 (CBD-tag), T7 펩티드-태그 (T7-tag), 유비퀴틴-태그, 키틴-결합 단백질-태그 (CBP-tag), 글루타치온-S-트랜스퍼라제-태그 (GST-tag), 녹색 형광 단백질-태그 (GFP-tag), 폴리글루타메이트-태그, 아밀로이드 베타-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그(Softag) 1, 소프태그 3, 스타필로코컬 단백질 A-태그(Staphylococcal protein A-tag) (단백질 A-태그), 스트렙토코컬 단백질 G-태그(Streptococcal protein G-tag) (단백질 G-태그), 스트렙타비딘-결합 펩티드-태그(Streptavidin-binding peptide-tag) (SBP-tag), 비오틴-태그, 스트렙타비딘-태그 및 V5-태그를 포함한다.
일 실시예에서, PD-L2 폴리펩티드 및/또는 올리고머화 도메인(들)은 임의의 하나 이상의 이들 구성 요소에 대해 피험자에서 면역 반응의 유도 또는 생성을 저해하는 면역-침묵 또는 억제 부분을 포함한다. 면역-침묵 부분은 글리코실화 효소, 특히 글리코실트랜스퍼라제에 의해 특이적으로 인식되고 글리코실화되는 글리코실화 부위일 수 있다. 글리코실화는 N-결합 또는 O-결합일 수 있다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분의 결합을 나타낸다. 트리펩티드 서열 N-X-S 및 N-X-T (여기서, X는 P를 제외한 임의의 아미노산임)는 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 부분의 효소적 결합을 위한 인식 서열이며, 이들 서열은 일반적으로 '글리코실화 부위'라고 한다. O-결합 글리코실화는 히드록시아미노산, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있지만, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스의 결합을 나타낸다.
3. 대표적인 키메라 폴리펩티드 구조체
본 발명의 예시적인 키메라 폴리펩티드는 적당하게 화학식 (VI)로 표시된다:
[화학식 VI]
PD-L2―L―OMDX
여기서:
PD-L2는 서열번호: 1 내지 9 중 어느 하나, 또는 서열번호: 1 내지 9 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되며;
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타내고,
OMDX는 (a) 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 삼량체화 도메인;
(b) 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 사량체화 도메인;
(c) 서열번호: 28 또는 29로부터 선택된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 오량체화 도메인; 및
(d) 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 육량체화 도메인;으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 키메라 폴리펩티드는 적당하게 화학식 (VII)로 표시된다:
[화학식 VII]
PD-L2―L―OMDY―L― OMDZ
여기서:
PD-L2는 서열번호: 1 내지 9 중 어느 하나, 또는 서열번호: 1 내지 9 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되며;
―L―은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타내고,
OMDY는 i 하위단위 OMDY의 올리고머 (OMDY) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, (a) 서열번호: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 또는
AKAP의 PKA―AD 서열의 R 하위단위 서열 (예를 들어, 서열번호: 31 및 32 또는 서열번호: 33 및 34), 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 합텐-항-합텐, 리간드-수용체 및 수용체-공-수용체로부터 적당하게 선택된 특이적 결합 쌍의 구성원인 올리고머화 도메인을 포함하거나 또는 이루어지는,
이량체화 도메인;
(b) 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 삼량체화 도메인;
(c) 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 사량체화 도메인;
(d) 서열번호: 28 또는 29로부터 선택된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 오량체화 도메인; 및
(e) 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 육량체화 도메인;으로부터 적당하게 선택되고;
OMDZ는 j 하위단위 OMDZ의 올리고머 (OMDZ) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 i 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 i+1, i+2, i+3, i+4, i+5, 또는 i+6 이고,
OMDZ는 (a) 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21, 22, 25 및 26 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 삼량체화 도메인;
(b) 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 23, 24 및 27 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수 백분율) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 사량체화 도메인;
(c) 서열번호: 28 또는 29로부터 선택된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 오량체화 도메인; 및
(d) 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 적당하게 포함하거나 또는 이루어지는, 육량체화 도메인;으로부터 적당하게 선택된다.
본 발명의 키메라 폴리펩티드의 비-제한적인 예는 하기에 제시된다:
3.1 인간 PD-L2 엑토도메인-L-GCN4 삼량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE [서열번호: 44],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
GCN4 삼량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 삼량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.2 인간 PD-L2 엑토도메인-L-폴돈 삼량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L― GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL [서열번호: 45],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
폴돈 삼량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 삼량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.3 인간 PD-L2 엑토도메인-L-GCN4 사량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―RMKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE [서열번호: 46],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
GCN4 사량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 사량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.4 인간 PD-L2 엑토도메인-L-테트라브라키온 사량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L― IINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG [서열번호: 47],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
테트라브라키온 사량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 사량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.5 인간 PD-L2 엑토도메인-L-COMP 오량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L― LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG [서열번호: 48],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
COMP 오량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 오량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.6 인간 PD-L2 엑토도메인-L-트립토판 지퍼 오량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L― SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT [서열번호: 49],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
트립토판 지퍼 오량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 오량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.7 인간 PD-L2 엑토도메인-L-αtp 육량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―PTHVNVSVVMAEVDGTCY [서열번호: 50],
여기서:
―L―은 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
αtp 육량체화 도메인은 키메라 폴리펩티드의 육량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.8 인간 PD-L2 엑토도메인-L-Fc 이량체화 도메인-L-폴돈 삼량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK―L―GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL [서열번호: 51],
여기서:
―L―은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
Fc 이량체화 도메인 및 폴돈 삼량체화 도메인의 조합은 키메라 폴리펩티드의 육량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.9 인간 PD-L2 엑토도메인-L-Fc 이량체화 도메인-L-GCN4 사량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK―L―MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE [서열번호: 52],
여기서:
―L―은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
Fc 이량체화 도메인 및 GCN4 사량체화 도메인의 조합은 키메라 폴리펩티드의 팔량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.10 인간 PD-L2 엑토도메인-L-Fc 이량체화 도메인-L-COMP 오량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK―L― LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG [서열번호: 53],
여기서:
―L―은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
Fc 이량체화 도메인 및 COMP 오량체화 도메인의 조합은 키메라 폴리펩티드의 십량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
3.11 인간 PD-L2 엑토도메인-L-Fc 이량체화 도메인-L-αtp 육량체화 도메인
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT―L―DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK―L―PTHVNVSVVMAEVDGTCY [서열번호: 54],
여기서:
―L―은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 [GGSG] n GG, [GGGGS] n , [SSSSG] n , [SSSSG] n , [AAPA] n , [GGGKGGGG] n , [GGGNGGGG] n , [GGGCGGGG] n (여기서, n은 1 내지 10, 적당하게는 1 내지 5, 더 적당하게는 1 내지 3의 정수임), GG, GGGGG [서열번호: 35], GGGGS [서열번호: 36], SSSSG [서열번호: 37], GKSSGSGSESKS [서열번호: 38], GSTSGSGKSSSEGSGSTKG [서열번호: 39], GSTSGSGKPGSGEGSTKG [서열번호: 40], EGKSSGSGSESKEF [서열번호: 41], GGSTSGSGKSSEGKG [서열번호: 42], 및 AAPA [서열번호:43]으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 링커를 나타낸다.
Fc 이량체화 도메인 및 αtp 육량체화 도메인의 조합은 키메라 폴리펩티드의 십이량체로의 자기-조립을 용이하게 한다.
4. 키메라 폴리펩티드의 제조
본 발명의 PD-L2 폴리펩티드-올리고머화 도메인 키메라는 화학적 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 임의의 적당한 방법이 사용될 수 있지만, 키메라 폴리펩티드는 적당한 숙주 세포에서 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 구조체의 발현에 의해 제조된다. 적당한 숙주 세포는, 예를 들어, 곤충 세포 (예를 들어, 이집트 숲모기(Aedes aegypti), 아우토그라파 칼리포니카 (Autographa californica), 누에 나방(Bombyx mori), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 및 트리코프루시아 니(Trichoplusia ni)); 포유류 세포 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 말, 소, 양, 개, 고양이, 및 설치류 (예를 들어, 햄스터)); 조류 세포 (예를 들어, 닭, 오리, 및 거위); 박테리아 (예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtilis), 및 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.)); 효모 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 한세눌라 다형체(Hansenula polymorphs), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피치아 구일레리몬디(Pichia guillerimondii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)); 테트라히메나 세포(Tetrahymena cells) (예를 들어, 테트라히메나 써모필레 (Tetrahymena thermophile); 또는 이들의 조합을 포함한다. 많은 적당한 곤충 세포 및 포유류 세포는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 적당한 곤충 세포는, 예를 들어, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn5 세포, 슈나이더 S2 세포(Schneider S2 cells), 및 하이파이브 세포(High Five cells) (부모 트리코프루시아 니 BTI-TN-5B1-4 세포주 (Invitrogen)로부터 유래된 클론 분리물)을 포함한다. 적당한 포유류 세포는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포 (일반적으로 전단된(sheared) 아데노바이러스 유형 5 DNA에 의해 형질전환된 HEK293 세포), NIH-3T3 세포, 293-T 세포, Vero 세포, HeLa 세포, PERC.6 세포 (ECACC 기탁번호 96022940), Hep G2 세포, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), 태아 레서스 폐 세포(fetal rhesus lung cells) (ATCC CL-160), 마딘-다비 소 신장(Madin-Darby bovine kidney; "MDBK") 세포, 마딘-다비 개 신장 ("MDCK") 세포 (예를 들어, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; 또는 MDCK 33016, DSM ACC 2219), 아기 햄스터 신장(baby hamster kidney; BHK) 세포, 예를 들어 BHK21-F, HKCC 세포 등을 포함한다. 적당한 조류 세포는, 예를 들어, 닭 배아 줄기 세포 (예를 들어, EBx® 세포), 닭 배아 섬유아세포(chicken embryonic fibroblasts), 닭 배아 생식 세포(chicken embryonic germ cells), 오리 세포 (예를 들어, Vaccine 27:4975-4982 (2009) 및 WO2005/042728에 기재된 AGE1.CR 및 AGE1.CR.pIX 세포주 (ProBioGen)), EB66 세포 등을 포함한다.
바큘로바이러스 시스템과 같은 적당한 곤충 세포 발현 시스템은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)에 기재되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 물질 및 방법은, 특히, Invitrogen, San Diego Calif의 키트 형태로 시판된다. 조류 세포 발현 시스템 또한 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 미국특허 번호 제 5,340,740호; 제 5,656,479호; 제 5,830,510호; 제 6,114,168호; 및 제 6,500,668호; 유럽특허 번호 EP 0787180B; 유럽특허 출원 번호 EP03291813.8; WO 03/043415; 및 WO 03/076601에 기재되어 있다. 유사하게, 박테리아 및 포유류 세포 발현 시스템 또한 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London에 기재되어 있다.
본 발명의 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 구조체는 통상적인 방법을 이용하여 적당한 벡터로 제조될 수 있다. 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 다수의 적당한 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적이다. 적당한 벡터는 하기의 것들 중 하나 이상을 포함하는 다수의 구성 요소를 함유할 수 있으나 이에 한정되지 않는다: 복제의 기원; 선별 마커 유전자; 하나 이상의 발현 조절 요소, 예를 들어 전사 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결자(terminator)), 및/또는 하나 이상의 번역 신호; 및 (예를 들어, 포유류 기원의 또는 이종 포유류 또는 비-포유류 종으로부터) 선별된 숙주 세포에서 분비 경로를 표적화하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열. 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 위해, pFastBac (Invitrogen)과 같은 적당한 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 재조합 바큘로바이러스 입자를 제조할 수 있다. 바큘로바이러스 입자는 증폭되고 곤충 세포를 감염시키는데 사용되어 재조합 단백질을 발현한다. 포유류 세포에서의 발현을 위해, 원하는 포유류 숙주 세포 (예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포)에서 구조체의 발현을 유도할 벡터가 사용된다.
키메라 폴리펩티드는 임의의 적당한 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 침전 및 소수성 상호 작용, 이온 교환, 친화도, 킬레이팅 및 크기 배제와 같은 다양한 유형의 크로마토그래피를 포함하는 원하는 단백질을 정제하기 위한 적당한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 적당한 정제 방법은 2 이상의 이들 또는 다른 적당한 방법을 이용하여 만들 수 있다. 원하는 경우, 부문 3.5에 기재된 바와 같이, 키메라 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 정제 부분 또는 "태그"를 포함할 수 있다. 이러한 태그된 폴리펩티드는 편리하게, 예를 들어 킬레이팅 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 조건부 배지(conditioned media)로부터 정제될 수 있다.
5. 키메라 폴리펩티드에 기초한 폴리펩티드 복합체
본 발명의 키메라 폴리펩티드는 적당한 조건 하에서 자기-조립하여 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 폴리펩티드 복합체의 제조 방법을 더 포함하며, 상기 방법은 폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건 하에 (예를 들어, 수용액에서) 본 발명의 키메라 폴리펩티드들을 혼합하는 단계를 포함하고, 이로써 본 명세서에 기재된 바와 같이 3개 이상의 키메라 폴리펩티드를 포함하고 PD-L2의 적어도 하나의 기능적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체가 제조된다. 일반적으로, 키메라 폴리펩티드는 완충 수용액 (예를 들어, pH 약 5 내지 약 9)에서 자기-조립된다. 필요한 경우, 재접힘 및 자기-조립을 용이하게 하기 위해, 우레아, 소량의 유기 용매 또는 키메라 폴리펩티드를 약간 변성시키는 열을 포함함으로써 온화한 변성 조건을 사용할 수 있다.
임의의 적당한 키메라 폴리펩티드의 제조가 상기 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 키메라 폴리펩티드를 함유하는 조건부 세포 배양 배지가 상기 방법에서 사용될 수 있다. 그러나, 상기 방법에서 정제된 키메라 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
6. 조성물
본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체 또는 키메라 폴리펩티드, 또는 키메라 폴리펩티드 또는 복합체가 발현가능한 핵산 구조체, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 조성물을 더 제공한다. 대표적인 조성물은 키메라 폴리펩티드 또는 복합체의 원하는 용도에 따라 선택되는 완충제를 포함할 수 있으며, 또한 의도된 용도에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다. 의도된 용도가 Th1 면역 반응을 포함하여 면역 반응을 조절하는 것이라면, 조성물은 "면역-조절" 또는 "면역조절" 조성물이라고 한다. 이러한 조성물은 예방적 조성물 (즉, Th1-관련 질환 또는 장애의 예방 목적으로 투여되는 조성물) 및 치료적 조성물 (즉, Th1-관련 질환 또는 장애의 치료 목적으로 투여되는 조성물)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 면역조절 조성물은 예방, 개선, 완화 또는 치료 목적으로 수여자(recipient)에게 투여될 수 있다.
통상의 기술자는 의도된 용도에 적합한 당해 기술분야에 알려진 매우 다양한 적당한 완충제를 쉽게 선택할 수 있다. 경우에 따라, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있으며, 다양한 부형제는 당해 기술분야에 알려져 있고 본 명세서에서 상세히 논의될 필요는 없다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 다양한 간행물 [예를 들어, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7.sup.th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3.sup.rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc 포함]에 충분히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사에 의한 투여에 적합한 형태; 경구 섭취에 적합한 제형 (예를 들어, 캡슐, 정제, 당의정(caplets), 엘릭시르); 국소 투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션의 형태; 점안액으로서 전달하기에 적합한 형태; 흡입에 의한, 예를 들어 비강내(intranasal) 흡입 또는 경구 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태; 또는 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 형태일 수 있다.
보조제 또는 생물학적 반응 조절제와 같은 보충 활성 성분도 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있다. 보조제(들)는 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있지만, 반드시 보조제를 포함할 필요는 없다. 이러한 경우, 보조제의 사용으로 인해 발생하는 반응원성(reactogenicity) 문제를 피할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 약학 조성물에서 보조제 활성은 조성물 내 면역원성 성분 (예를 들어, 본 발명의 키메라 폴리펩티드 또는 복합체)에 의해 유도된 면역 반응을 (정량적으로 또는 질적으로) 향상시키는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이는 Th1 면역 반응을 포함하여 면역 반응을 일으키는데 필요한 면역 조절 성분의 용량 또는 수준을 감소시킬 수 있으며, 및/또는 원하는 면역 반응을 일으키는데 필요한 면역조치(immunizations)의 횟수 또는 빈도를 감소시킬 수 있다.
임의의 적당한 보조제가 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 알루미늄-계 보조제가 사용될 수 있다. 적당한 알루미늄-계 보조제는 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 알루미늄-계 보조제의 다른 특정 예는 유럽특허 번호 제 1216053호 및 미국특허 번호 제 6,372,223호에 기재되어 있다. 다른 적당한 보조제는 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 보조제 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 수산화 알루미늄 겔 (명반(alum)) 또는 인산 알루미늄과 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당(acylated sugars); 양이온 또는 음이온으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠 (polyphosphazenes); 생분해성 미소구체(microspheres); 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A; 유럽특허 번호 제 0399843호, 미국특허 번호 제 7,029,678호 및 PCT 공개 번호 WO 2007/006939에 기재된 것을 포함하는 수중유 에멀젼; 및/또는 추가의 사이토카인, 예를 들어 GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7 또는 -12, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 모노포스포릴 지질 A (MPL), 콜레라 독소 (CT) 또는 이의 구성요소 하위단위, 이열성 장독소 (heat labile enterotoxin; LT) 또는 이의 구성요소 하위단위, 지질다당류 (LPS) 및 이의 유도체와 같은 톨-유사 수용체 리간드 보조제 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 및 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A), 플라비바이러스(Flavivirus) NS1 및 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide; MDP)를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 키트로 제공될 수 있다. 키트는 예를 들어, 투여 장치(들), 완충제(들), 및/또는 희석제(들)과 같은 본 발명의 방법을 수행하는데 도움이 되는 추가 성분을 포함할 수 있다. 키트는 다양한 성분을 수용하기 위한 용기 및 본 발명의 방법에서 키트 성분을 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일반적으로, 키트는 본 발명의 면역조절 조성물을 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 동반 진단과 함께 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 복합체는 질환 관련 항원 (예를 들어, 종양 항원 및 병원성 유기체의 항원) 및 항원-결합 분자를 포함하는, 면역-조절제에 대한 면역 반응을 증강시키는데 유용하다.
본 발명은 표적 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 관심있는 표적 항원의 적어도 일부에 상응하는 임의의 항원의 본 발명의 조성물에서의 용도를 고려한다. 이러한 항원은 가용성 형태 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드가 발현가능한 핵산 분자) 또는 전체 세포 또는 약독화(attenuated) 병원체 제제 (예를 들어, 약독화 바이러스 또는 박테리아)의 형태일 수 있거나, 또는 하기에 더 상세히 기재되는 항원-제시 세포에 의해 제시될 수 있다.
6.1 항원
본 발명에서 유용한 표적 항원은, 예를 들어, 단순 중간 대사산물, 당, 지질, 호르몬, 및 복합 탄수화물, 인지질, 핵산, 폴리펩티드 및 펩티드와 같은 거대분자를 포함하는 모든 유형의 생물학적 분자일 수 있다. 표적 항원은 숙주에 의해 생성된 내인성 항원 또는 숙주에 대해 이질적인 외인성 항원으로부터 선택될 수 있다. 적당한 내인성 항원은 암 또는 종양 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암 또는 종양 항원의 비-제한적인 예는 ABL1 원종양유전자, AIDS 관련 암, 청신경초종(acoustic neuroma), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukaemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukaemia), 선양낭성 암종(adenocystic carcinoma), 부신피질암(adrenocortical cancer), 원인불명 골수화생증(agnogenic myeloid metaplasia), 탈모(alopecia), 포상연부육종(alveolar soft-part sarcoma), 항문암(anal cancer), 혈관육종(angiosarcoma), 재생불량성빈혈 (aplastic anaemia), 성상세포종(astrocytoma), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia-telangiectasia), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma) (피부), 방광암, 골암 (bone cancers), 장암(bowel cancer), 뇌간교종(brain stem glioma), 뇌종양 및 중추신경계 종양(brain and CNS tumours), 유방암, CNS 종양, 유암종(carcinoid tumours), 자궁경부암(cervical cancer), 소아 뇌종양(childhood brain tumours), 소아암(childhood cancer), 소아 백혈병(childhood leukaemia), 소아 연조직 육종 (childhood soft tissue sarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 융모막 암종 (choriocarcinoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukaemia), 결장직장암(colorectal cancers), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 융기성 피부섬유육종 (dermatofibrosarcoma-protuberans), 결합조직형성 소원형세포 종양(desmoplastic-small-round-cell-tumour), 관암종(ductal carcinoma), 내분비암(endocrine cancers), 자궁내막암(endometrial cancer), 뇌실막종(ependymoma), 식도암 (oesophageal cancer), 유잉 육종(Ewing's Sarcoma), 간외 담관암(Extra-Hepatic Bile Duct Cancer), 안암(Eye Cancer), 눈: 흑색종, 망막모세포종 (Retinoblastoma), 나팔관암(Fallopian Tube cancer), 판코니 빈혈(Fanconi anaemia), 섬유육종(fibrosarcoma), 담낭암(gall bladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장관암(gastrointestinal cancers), 위장관-유암종(gastrointestinal-carcinoid-tumour), 비뇨생식기암(genitourinary cancers), 생식 세포 종양(germ cell tumours), 임신성 영양막 질환(gestational-trophoblastic-disease), 신경교종(glioma), 부인과 암(gynaecological cancers), 혈액학적 악성종양 (haematological malignancies), 털세포 백혈병(hairy cell leukaemia), 두경부암 (head and neck cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 유전성 유방암 (hereditary breast cancer), 조직구증(histiocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 인간 유두종바이러스(human papillomavirus), 포상기태(hydatidiform mole), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 하인두암(hypopharynx cancer), 안구내 흑색종 (intraocular melanoma), 췌도세포암(islet cell cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암(kidney cancer), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans'-cell-histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈병 (leukaemia), 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 구순암(lip cancer), 지방육종(liposarcoma), 간암, 폐암, 림프부종(lymphedema), 림프종(lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 남성 유방암, 신장의 악성 횡문양 종양(malignant-rhabdoid-tumour-of-kidney), 수모세포종(medulloblastoma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포암(Merkel cell cancer), 중피종(mesothelioma), 전이성 암(metastatic cancer), 구강암(mouth cancer), 다발성 내분비 선종(multiple endocrine neoplasia), 균상식육종(mycosis fungoides), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수종(myeloma), 골수증식성 장애(myeloproliferative disorders), 비암(nasal cancer), 비인두암 (nasopharyngeal cancer), 신장모세포종(nephroblastoma), 신경모세포종 (neuroblastoma), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 니즈메겐 파손 증후군 (Nijmegen breakage syndrome), 비-흑색종 피부암(non-melanoma skin cancer), 비소세포폐암(non-small-cell-lung-cancer; NSCLC), 안구암(ocular cancers), 식도암 (oesophageal cancer), 구강암(oral cavity cancer), 구인두암(oropharynx cancer), 골육종(osteosarcoma), 조루술 난소암(ostomy ovarian cancer), 췌장암, 부비암(paranasal cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 이하선암(parotid gland cancer), 음경암(penile cancer), 말초-신경외배엽-종양(peripheral-neuroectodermal-tumours), 뇌하수체암(pituitary cancer), 진성적혈구증기증 (polycythemia vera), 전립선암, 희귀암 및 관련 장애(rare-cancers-and-associated-disorders), 신세포암(renal cell carcinoma), 망막모세포종 (retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 로트문드-톰슨 증후군 (Rothmund-Thomson syndrome), 침샘암(salivary gland cancer), 육종(sarcoma), 슈반세포종(schwannoma), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암, 소세포폐암 (small cell lung cancer; SCLC), 소장암(small intestine cancer), 연조직 육종 (soft tissue sarcoma), 척수 종양(spinal cord tumours), 편평-세포-암종 (squamous-cell-carcinoma)-(피부), 위암(stomach cancer), 활막 육종(synovial sarcoma), 고환암(testicular cancer), 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 이행세포암(transitional-cell-cancer)-(방광), 이행세포암-(신우/요관 (renal-pelvis-/-ureter)), 영양막암(trophoblastic cancer), 요도암(urethral cancer), 비뇨기계암(urinary system cancer), 유로플라킨(uroplakins), 자궁육종 (uterine sarcoma), 자궁암(uterus cancer), 질암(vaginal cancer), 외음암(vulva cancer), 발덴스트롬-거대글로불린혈증(Waldenstrom's-Macroglobulinemia), 빌름스 종양(Wilms' Tumour)으로부터 선택된 암 또는 종양으로부터의 항원을 포함한다. 특정 실시예에서, 암 또는 종양은 흑색종과 관련이 있다. 흑색종-관련 항원의 예시적인 예는 멜라닌세포 분화 항원(melanocyte differentiation antigen) (예를 들어, gp100, MART, Melan-A/MART-1, TRP-1, Tyros, TRP2, MC1R, MUC1F, MUC1R 또는 이들의 조합) 및 흑색종-특이적 항원 (예를 들어, BAGE, GAGE-1, gp100In4, MAGE-1 (예를 들어, GenBank 등록번호 X54156 및 AA494311), MAGE-3, MAGE4, PRAME, TRP2IN2, NYNSO1a, NYNSO1b, LAGE1, p97 흑색종 항원 (예를 들어, GenBank 등록번호 M12154) p5 단백질, gp75, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), GM2 및 GD2 강글리오사이드(gangliosides), cdc27, p21ras, gp100Pmel117 또는 이들의 조합)을 포함한다. 기타 종양-특이적 항원은 etv6, aml1, 시클로필린 b(cyclophilin b) (급성 림포모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia)); Ig-유전자형(idiotype) (B 세포 림프종); E-카드헤린(cadherin), α-카테닌(catenin), β-카테닌, γ-카테닌, p120ctn (신경교종); p21ras (방광암); p21ras (담도암); MUC 계열, HER2/neu, c-erbB-2 (유방암); p53, p21ras (자궁경부 암종); p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 계열, Cripto-1 단백질, Pim-1 단백질 (대장암(colon carcinoma)); 결장직장 관련 항원 (CRC)-CO17-1A/GA733, APC (결장직장암(colorectal cancer)); 암배아 항원 (carcinoembryonic antigen; CEA) (결장직장암; 융모막 암종); 시클로필린 b (상피세포암); HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질 (위암); α-태아단백질 (fetoprotein) (간세포암); Imp-1, EBNA-1 (호지킨 림프종); CEA, MAGE-3, NY-ESO-1 (폐암); 시클로필린 b (림프 세포-유래 백혈병(lymphoid cell-derived leukemia)); MUC 계열, p21ras (골수종); HER2/neu, c-erbB-2 (비소세포폐 암종); Imp-1, EBNA-1 (비인두암); MUC 계열, HER2/neu, c-erbB-2, MAGE-A4, NY-ESO-1 (난소암); 전립선 특이적 항원 (PSA) 및 이의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질 (전립선암); HER2/neu, c-erbB-2 (신장암); 인간 유두종 바이러스 단백질과 같은 바이러스성 산물 (자궁경부 및 식도의 편평세포암); NY-ESO-1 (고환암); 및 HTLV-1 에피토프 (T 세포 백혈병)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
외래 항원(Foreign antigens)은 병원성 유기체로부터 적당하게 선택된다. 예시적인 병원성 유기체는 바이러스, 박테리아, 진균 기생충, 조류(algae), 및 원충 및 아메바를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바이러스의 예시적인 예는 홍역 (measles), 유행성 이하선염(mumps), 풍진(rubella), 소아마비(poliomyelitis), A형 간염, B형 간염 (예를 들어, GenBank 등록번호 E02707), 및 C형 간염 (예를 들어, GenBank 등록번호 E06890), 및 기타 간염바이러스, 및 인플루엔자, 아데노바이러스 (예를 들어, 유형 4 및 7), 광견병(rabies) (예를 들어, GenBank 등록번호 M34678), 황열병(yellow fever), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) 및 유두종바이러스, 에볼라 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 일본 뇌염(Japanese encephalitis) (예를 들어, GenBank 등록번호 E07883), 뎅기열(dengue) (예를 들어, GenBank 등록번호 M24444), 한타바이러스(hantavirus), 센다이 바이러스 (Sendai virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 오르토믹소바이러스(othromyxoviruses), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 비스나 바이러스(visna virus), 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV) (예를 들어, GenBank 등록번호 U18552)와 같은 기타 포진바이러스(herpesviruses)를 포함하는 질환의 원인이 되는 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 바이러스로부터 유래된 임의의 적당한 항원은 본 발명의 실시에 유용하다. 예를 들어, HIV로부터 유래된 예시적인 레트로바이러스성 항원은 gag, pol, 및 env 유전자의 유전자 산물, Nef 단백질, 역전사 효소 (reverse transcriptase), 및 기타 HIV 성분과 같은 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 간염 바이러스성 항원의 예시적인 예는 B형 간염 바이러스의 S, M, 및 L 단백질, B형 간염 바이러스의 pre-S 항원, 및 기타 간염, 예를 들어, A형, B형 및 C형 간염과 같은 항원, C형 간염 바이러스성 RNA와 같은 바이러스성 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인플루엔자 바이러스성 항원의 예시적인 예는 혈구응집소(hemagglutinin) 및 뉴라미니다제(neuraminidase)와 같은 항원 및 기타 인플루엔자 바이러스성 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 홍역 바이러스성 항원의 예시적인 예는 홍역 바이러스 융합 단백질과 같은 항원 및 기타 홍역 바이러스 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 풍진 바이러스성 항원의 예시적인 예는 단백질 E1 및 E2와 같은 항원 및 기타 풍진 바이러스 성분; VP7sc와 같은 로타바이러스성 항원 및 기타 로타바이러스성 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 시토메갈로바이러스성 항원의 예시적인 예는 외막형 당단백질 B와 같은 항원 및 기타 시토메갈로바이러스성 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 호흡기 세포융합 바이러스성 항원의 비-제한적인 예는 RSV 융합 단백질, M2 단백질과 같은 항원 및 기타 호흡기 세포융합 바이러스성 항원 성분을 포함한다. 단순 포진 바이러스성 항원 (herpes simplex viral antigens)의 예시적인 예는 전초기 단백질 (immediate early proteins), 당단백질 D와 같은 항원 및 기타 단순 포진 바이러스성 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 수두 대상포진(varicella zoster) 바이러스성 항원의 비-제한적인 예는 9PI, gpII와 같은 항원, 및 기타 수두 대상포진 바이러스성 항원 성분을 포함한다. 일본 뇌염 바이러스성 항원의 비-제한적인 예는 단백질 E, M-E, M-E-NS 1, NS 1, NS 1-NS2A, 80%E와 같은 항원, 및 기타 일본 뇌염 바이러스성 항원 성분을 포함한다. 광견병 바이러스성 항원의 대표적인 예는 광견병 당단백질, 광견병 핵단백질(nucleoprotein)과 같은 항원 및 기타 광견병 바이러스성 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유두종바이러스 항원의 예시적인 예는 L1 및 L2 캡시드(capsid) 단백질 및 자궁경부암과 관련된 E6/E7 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바이러스성 항원의 추가 예는, Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. and Knipe, D.M., 1991, Raven Press, New York, 참조.
진균(fungi)의 예시적인 예는 아크레모늄 종(Acremonium spp.), 아스페르길루스 종(Aspergillus spp.), 바시디오볼루스 종(Basidiobolus spp.), 비폴라리스 종(Bipolaris spp.), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 종(Candida spp.), 클라도피알로포라 카리오니(Cladophialophora carrionii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 코니디오볼루스 종 (Conidiobolus spp.), 크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 쿠르불라리아 종 (Curvularia spp.), 에피더모피톤 종(Epidermophyton spp.), 엑소피알라 제안셀메이(Exophiala jeanselmei), 엑세로힐룸 종(Exserohilum spp.), 폰세카에아 콤팍타 (Fonsecaea compacta), 폰세카에아 페드로소이(Fonsecaea pedrosoi), 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사륨 솔라니(Fusarium solani), 게오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 히스토플라스마 캅술라툼 변종 캅술라툼(Histoplasma capsulatum var. capsulatum), 히스토플라스마 캅술라툼 변종 두보이시 (Histoplasma capsulatum var. duboisii), 호르타에아 베르넥키이(Hortaea werneckii), 라카지아 로보이(Lacazia loboi), 라시오디플로디아 테오브로마에 (Lasiodiplodia theobromae), 렙토스패리아 세네갈렌시스(Leptosphaeria senegalensis), 마두렐라 그리세아(Madurella grisea), 마두렐라 마이세토마티스 (Madurella mycetomatis), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 마이크로스포룸 종(Microsporum spp.), 네오테스투디나 로사티(Neotestudina rosatii), 오니코콜라 카나덴시스(Onychocola canadensis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 피알로포라 베루코사(Phialophora verrucosa), 피에드라이아 호르태(Piedraia hortae), 피에드라 이아호르태(Piedra iahortae), 피티리아시스 베르시콜로르(Pityriasis versicolor), 슈달레쉐리아 보이디이 (Pseudallesheria boydii), 피레노카에타 로메로이(Pyrenochaeta romeroi), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 (Scopulariopsis brevicaulis), 스키탈리디움 디미디아툼(Scytalidium dimidiatum), 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii), 트리코피톤 종 (Trichophyton spp.), 트리코스포론 종(Trichosporon spp.), 접합균류 진균 (Zygomycete fungi), 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus) 및 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 진균 항원은 칸디아 진균 항원 성분; 열 충격 단백질 60 (HSP60)과 같은 히스토플라스마 진균 항원 및 기타 히스토플라스마 진균 항원 성분; 협막 다당류(capsular polysaccharides)와 같은 크립토코컬(cryptococcal) 진균 항원 및 크립토코컬 진균 항원 성분; 소구 항원(spherule antigens)과 같은 콕시디오이데스 진균 항원 및 콕시디오이데스 진균 항원 성분; 및 트리코피틴(trichophytin)과 같은 티니아(tinea) 진균 항원 및 기타 콕시디오이데스 진균 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
박테리아의 예시적인 예는 디프테리아 (예를 들어, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)), 백일해(pertussis) (예를 들어, 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), GenBank 등록번호 M35274), 파상풍(tetanus) (예를 들어, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), GenBank 등록번호 M64353), 폐결핵 (예를 들어, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 박테리아성 폐렴 (예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae.)), 콜레라 (예를 들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)), 탄저병(anthrax) (예를 들어, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)), 장티푸스(typhoid), 역병 (plague), 세균성 이질(shigellosis) (예를 들어, 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae)), 보툴리누스 중독(botulism) (예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)), 살모넬라증 (예를 들어, GenBank 등록번호 L03833), 위궤양(peptic ulcers) (예를 들어, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)), 재향군인병(Legionnaire's Disease), 라임병(Lyme disease) (예를 들어, GenBank 등록번호 U59487)를 포함하는 질환의 원인이 되는 박테리아를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 병원성 박테리아는 대장균, 클로스트리디움 페르프린겐스 (Clostridium perfringens), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 박테리아성 항원은 백일해 독소, 섬유상 혈구 응집소(filamentous hemagglutinin), 페르탁틴(pertactin), F M2, FIM3, 아데닐레이트 시클라제 (adenylate cyclase)와 같은 백일해 박테리아성 항원 및 기타 백일해 박테리아성 항원 성분; 디프테리아 독소 또는 변성독소(toxoid)와 같은 디프테리아 박테리아성 항원 및 기타 디프테리아 박테리아성 항원 성분; 파상풍 독소 또는 변성독소와 같은 파상풍 박테리아성 항원 및 기타 파상풍 박테리아성 항원 성분; M 단백질과 같은 스트렙토코컬 박테리아성 항원 및 기타 스트렙토코컬 박테리아성 항원 성분; 지질다당류와 같은 그람-음성 바실리 박테리아성 항원 및 기타 그람-음성 박테리아성 항원 성분; 미콜산(mycolic acid), 열 충격 단백질 65 (HSP65), 30kDa 주요 분비 단백질, 항원 85A와 같은 미코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아성 항원 및 기타 미코박테리아성 항원 성분; 헬리코박터 파이로리 박테리아성 항원 성분, 뉴모리신 (pneumolysin), 협막 다당류와 같은 뉴모코컬(pneumococcal) 박테리아성 항원 및 기타 뉴모코컬 박테리아성 항원 성분; 협막 다당류와 같은 헤모필루스 인플루엔자 박테리아성 항원 및 기타 헤모필루스 인플루엔자 박테리아성 항원 성분; 탄저병 보호 항원과 같은 탄저병 박테리아성 항원 및 기타 탄저병 박테리아성 항원 성분; rompA와 같은 리케차(rickettsiae) 박테리아성 항원 및 기타 리케차 박테리아성 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서에 기재된 박테리아성 항원은 임의의 다른 박테리아성 항원, 미코박테리아성 항원, 미코플라스마성 항원, 리케차성 항원 또는 클라미디아성(chlamydial) 항원을 포함한다.
원충의 예시적인 예는 말라리아 (예를 들어, GenBank 등록번호 X53832), 십이지장충(hookworm), 회선사상충증(onchocerciasis) (예를 들어, GenBank 등록번호 M27807), 주혈흡충병(schistosomiasis) (예를 들어, GenBank 등록번호 LOS 198), 톡소포자충증(toxoplasmosis), 파동편모충증(trypanosomiasis), 리슈만편모충증 (leishmaniasis), 람블편모충증(giardiasis) (GenBank 등록번호 M33641), 아메바증 (amoebiasis), 사상충증(filariasis) (예를 들어, GenBank 등록번호 J03266), 보렐리아증(borreliosis), 및 선모충증(trichinosis)을 포함하는 질환의 원인이 되는 원충을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 원충성 항원은 낭충(merozoite) 표면 항원, 포자소체(sporozoite) 표면 항원, 환상포자소체(circumsporozoite) 항원, 배우자모세포/배우자 (gametocyte/gamete) 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA와 같은 플라스모듐 팔시파룸 및 기타 플라스모디알(plasmodial) 항원 성분; SAG-1, p30과 같은 톡소포자충(toxoplasma) 항원 및 기타 톡소포자충 항원 성분; 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신(paramyosin)과 같은 주혈흡충(schistosoma) 항원, 및 기타 주혈흡충 항원 성분; gp63, 리포포스포글리칸(lipophosphoglycan) 및 이의 관련 단백질과 같은 큰리슈만편모충(leishmania major) 및 기타 리슈만편모충 항원, 및 기타 리슈만편모충성 항원 성분; 및 75-77kDa 항원, 56kDa 항원과 같은 트리파노소마 크루즈 (trypanosoma cruzi) 항원 및 기타 파동편모충성 항원 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 항원으로서 독소 성분을 고려한다. 독소의 예시적인 예는 스타필로코컬 장독소, 독성 충격 증후군 독소; 레트로바이러스성 항원 (예를 들어, HIV로부터 유래된 항원), 스트렙토코컬 항원, 스타필로코컬 장독소-A (SEA), 스타필로코컬 장독소-B (SEB), 스타필로코컬 장독소l-3 (SE1-3), 스타필로코컬 장독소-D (SED), 스타필로코컬 장독소-E (SEE), 및 미코플라스마, 미코박테리움, 및 포진 바이러스로부터 유래된 독소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
표적 항원의 적어도 일부에 상응하는 항원은 천연 공급원으로부터 분리될 수 있거나 또는 당해 기술분야에서 알려진 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 항원은 변형된 면역 반응이 요구되는 세포 집단 또는 조직으로부터 얻어진 항원-제시 세포의 MHC 및 다른 제시 분자로부터 용출될 수 있다. 용출된 펩티드는 당해 기술분야에서 알려진 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 정제될 수 있다 (Rawson et al., 2000, Cancer Res 60(16), 4493-4498). 원하는 경우, 정제된 펩티드는 서열화될 수 있고, 예를 들어 하기에 기재된 표준 단백질 합성 기법을 이용하여 제조된 합성 버전의 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 조(crude) 항원 제제는 변형된 면역 반응이 요구되는 세포 집단 또는 조직의 시료를 분리하고, 시료를 용해시키거나 또는 시료를 아폽토틱 세포의 형성을 야기하는 조건으로 처리함으로써 (예를 들어, 자외선 조사 또는 γ 선 조사, 바이러스성 감염, 사이토카인, 또는 과산화수소, 또는 덱사메타손, 세라미드 화학요법 및 루프론(Lupron) 또는 타목시펜과 같은 항-호르몬제와 같은 약물로 배양한 세포 배양 배지에서 영양분의 세포를 부족하게 함으로써) 제조될 수 있다. 그 다음, 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 용해물 또는 아폽토틱 세포는 가용성 형태 또는 항원-제시 세포와의 접촉에 사용하기 위한 조 항원의 공급원으로 사용될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 복합체 또는 키메라 폴리펩티드 또는 키메라 폴리펩티드가 발현가능한 핵산 구조체 ("면역-조절제")는 암의 치료에 사용된다. 이들 실시예 중 일부에서, 면역-조절제는 종양 세포의 증식, 생존 또는 생존력을 저해하는 적어도 하나의 암 요법과 동시에 투여될 수 있다. 면역-조절제는 암 요법 후에 치료적으로 사용될 수 있거나 또는 요법이 투여되기 전에 또는 요법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 면역-조절제를 사용하는 병용 요법 및 암 요법의 동시 투여를 고려하며, 이의 비-제한적인 예는 방사선요법, 수술, 화학요법, 호르몬 제거 요법, 프로-아폽토시스 요법 및 면역요법을 포함한다.
6.2 방사선요법
방사선요법은 DNA 손상을 유발하는 방사선 및 파동(waves), 예를 들어 γ-조사, X-선, 자외선(UV) 조사, 마이크로파(microwaves), 전자 방출(electronic emissions), 방사성 동위원소 등을 포함한다. 요법은 국소화된 종양 부위에 상기 기재된 형태의 방사선을 조사함으로써 달성될 수 있다. 이들 모든 요인들은 DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구(repair), 및 염색체의 조립 및 유지에 대해 광범위한 DNA 손상에 영향을 미칠 가능성이 가장 크다.
X-선의 투여량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐 (roentgens)의 일일 용량에서 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량까지 이다. 방사성 동위원소의 투여량 범위는 광범위하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 종양 세포(neoplastic cells)에 의한 섭취에 따라 다르다.
방사선요법의 비-제한적인 예는 단일 발사(single shot) 또는 분획화, 고 선량률 근접치료(brachytherapy), 영구적 간질성 근접치료(permanent interstitial brachytherapy), 전신 방사성 동위원소 (예를 들어, 스트론튬 89)의 등각 외부 빔 방사선요법(conformal external beam radiotherapy) (4-8주에 걸쳐 소량으로 주어진 50-100 그레이)을 포함한다. 일 실시예에서, 방사선요법은 방사선 감작제 (radiosensitizing agent)와 함께 투여될 수 있다. 방사선 감작제의 예시적인 예는 에파프록시랄(efaproxiral), 에타니다졸(etanidazole), 플루오솔(fluosol), 미소니다졸(misonidazole), 니모라졸(nimorazole), 테모포르핀(temoporfin) 및 티라파자민(tirapazamine)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
6.3 화학요법
화학요법제는 하기 범주 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
(i) 의학 종양학(medical oncology)에서 사용된, 항증식성/항종양성 약물 및 이의 조합, 예를 들어 알킬화제 (예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드(nitrogen mustard), 멜팔란(melphalan), 클로람부실, 부설판(busulphan) 및 니트로소우레아); 항대사물질(antimetabolites) (예를 들어, 5-플루오로우라실 및 테가푸르(tegafur)와 같은 플루오로피리딘, 랄티트렉세드 (raltitrexed), 메토트렉세이트(methotrexate), 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside) 및 히드록시우레아와 같은 항엽산제(antifolates); 항-종양 항생제 (예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신(mithramycin)과 같은 안트라사이클린(anthracyclines)); 항유사분열제(antimitotic agents) (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신(vindesine) 및 비노렐빈(vinorelbine)과 같은 빈카 알카로이드(Vinca alkaloids) 및 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁소이드 (taxoids)); 및 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitors) (예를 들어, 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)와 같은 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxins), 암사크린(amsacrine), 토포테칸(topotecan) 및 캄포테신 (camptothecin));
(ii) 세포증식 억제제(cytostatic agents), 예를 들어 항에스트로겐 (antiestrogens) (예를 들어, 타목시펜, 토레미펜(toremifene), 랄록시펜 (raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene) 및 이독시펜(idoxifene)), 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (예를 들어, 풀베스트란트(fulvestrant)), 항안드로겐 (예를 들어, 비칼루타미드(bicalutamide), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide) 및 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate)), UH 길항제(antagonists) 또는 LHRH 작용제(agonists) (예를 들어, 고세렐린(goserelin), 류프로렐린 (leuprorelin) 및 부세렐린(buserelin)), 프로게스토겐(progestogens) (예를 들어, 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate)), 아로마타제 저해제(aromatase inhibitors) (예를 들어, 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole), 보로졸(vorozole) 및 엑스메스탄(exemestane)) 및 5α-환원효소(reductase) 저해제 (예를 들어, 피나스테리드(finasteride));
(iii) 암 세포 침범을 저해하는 약제 (예를 들어, 마리마스타트(marimastat)와 같은 메탈로프로테이나제 저해제 및 유로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체 기능의 저해제);
(iv) 성장인자 기능의 저해제, 예를 들어 이러한 저해제는 성장인자 항체, 성장인자 수용체 항체 (예를 들어, 항-erbb2 항체 트라스투주맙(trastuzumab) [Herceptin™] 및 항-erbb1 항체 세툭시맙(cetuximab) [C225]), 파네실 트랜스퍼라제 저해제, MEK 저해제, 티로신 키나제 저해제 및 세린/트레오닌 키나제 저해제를 포함하고; 예를 들어 표피성장인자 계열의 다른 저해제 (예를 들어, N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (게피티닙 (Gefitinib), AZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (에를로티닙(Erlotinib), OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (CI 1033)과 같은 다른 EGFR 계열 티로신 키나제 저해제); 예를 들어 혈소판-유래 성장인자 계열의 저해제; 및 예를 들어 간세포(hepatocyte) 성장인자 계열의 저해제;
(v) 항-혈관신생제(anti-angiogenic agents), 예를 들어 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor)의 효과를 저해하는 항-혈관신생제 (예를 들어, 항-혈관내피 세포 성장인자 항체 베바시주맙(bevacizumab) [Avastin™], 국제특허출원 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354에 개시된 것과 같은 화합물) 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물 (예를 들어, 리노미드 (linomide), 인테그린 αγβ3 기능의 저해제 및 안지오스타틴(angiostatin));
(vi) 혈관 손상제(vascular damaging agents), 예를 들어 콤브레타스타틴 (Combretastatin) A4 및 국제특허출원 WO 99/02166, WO00/40529, WO 00/41669, WO01/92224, WO02/04434 및 WO02/08213에 개시된 화합물;
(vii) 안티센스 요법(antisense therapies), 예를 들어 상기 열거된 표적을 대상으로 하는 것, 예컨대 항-ras 안티센스인 ISIS 2503; 및
(viii) 유전자 요법 방법(gene therapy approaches), 예를 들어 비정상 (aberrant) p53 또는 비정상 GDEPT와 같은 비정상 유전자를 대체하는 방법 (유전자-유도 효소 전구-약물(pro-drug) 요법); 시토신 데아미나제(cytosine deaminase), 티미딘 키나제 또는 박테리아성 니트로환원효소를 이용하는 것과 같은 방법, 및 다중-약물 내성 유전자 요법과 같은 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 내성을 증가시키는 방법 포함.
6.4 면역요법
면역요법 방법은 예를 들어, 인터류킨 2, 인터류킨 4 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)와 같은 사이토카인으로 형질감염시키는 것과 같은 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 ex-vivo 및 in-vivo 방법; T 세포 아네르기를 감소시키는 방법; 사이토카인-형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 이용한 방법; 사이토카인-형질감염된 종양 세포주를 이용한 방법; 및 항-유전자형 항체(anti-idiotypic antibodies)를 이용한 방법을 포함한다. 이러한 방법들은 일반적으로 암세포를 표적하고 파괴하기 위한 면역 작동 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 작동체는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 마커에 특이적인 항체와 같은 항원-결합 분자일 수 있다. 항원-결합 분자는 단독으로 요법의 작동체로서 작용할 수 있거나 또는 다른 세포를 보충하여 실제로 세포 살해를 촉진시킬 수 있다. 또한, 항원-결합 분자는 약물 또는 독소 (화학요법제, 방사성 핵종(radionuclide), 리신(ricin) A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있으며, 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 면역 작동체는 직접적으로 또는 간접적으로 악성 세포 표적과 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 면역 작동 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
이들 실시예 중 일부에서, 항원-결합 분자에 의해 표적된 세포 표면 항원은 적당하게 종양-관련 항원이며, 이의 예시적인 예는 Her2/neu, EGFR, Epcam, VEGFR, FGFR, MUC-I, CA 125, CEA, MAGE, CD20, CD19, CD40, CD33, A3, A33 항체에 특이적인 항원, BrE3 항원, CD1, CD1a, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD21, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD45, CD46, CD52, CD54, CD74, CD79a, CD126, CD138, CD154, B7, Ia, Ii, HMl.24, HLA-DR (예를 들어, HLA-DR10), NCA95, NCA90, HCG 및 하위-단위, CEA (CEACAM5), CEACAM-6, CSAp, EGP-1, EGP-2, Ba 733, KC4 항원, KS-I 항원, KS1-4, Le-Y, MUC2, MUC3, MUC4, PlGF, ED-B 피브로넥틴, NCA 66a-d, PAM-4 항원, PSA, PSMA, RS5, SlOO, TAG-72, TlOl, TAG TRAIL-Rl, TRAIL-R2, p53, 테나신(tenascin), 인슐린 성장인자-1(insulin growth factor-1; IGF-1), Tn 항원 등을 포함한다.
6.5 기타 요법
기타 암 요법의 예는 광선 요법(phototherapy), 냉동 요법(cryotherapy), 독소 요법 또는 프로-아폽토시스 요법을 포함한다. 통상의 기술자는 이 목록이 암 및 다른 증식성 병변(hyperplastic lesions)에 대해 유효한 치료 양식의 유형을 모두 망라하는 것이 아님을 알 것이다.
화학요법 및 방사선 요법이 빠르게 분열하는 세포를 표적하고 및/또는 세포주기 또는 세포 분열(cell division)을 방해한다는 것은 잘 알려져 있다. 이들 치료법은 여러 형태의 암의 치료의 일부분으로 제공되며, 근치적 치료(curative treatment)에 의해 질환의 진행을 늦추거나 또는 질환의 증상을 역전시키는 것을 목표로 한다. 그러나, 이러한 암 치료법은 면역 저하 상태(immunocompromised state)와 뒤이어 일어나는 병원성 감염으로 이어질 수 있으므로, 본 발명은 암 요법에 기인한 면역 저하 상태로부터 발병하거나 또는 발병 위험이 증가하는 감염에 대해 효과적인 폴리펩티드 복합체, 암 요법 및 항-감염제를 모두 사용하는, 병용 요법으로도 확장된다. 항-감염 약물은 바이러스, 박테리아, 효모, 진균, 원충 등과 같은 미생물의 성장을 죽이거나 또는 저해하는 화합물을 제한없이 포함하는 항균제로부터 적당하게 선택되므로, 항생제, 항아메바제(amebicides), 항진균제, 항원충제, 항말라리아제, 항결핵제 및 항바이러스제를 포함한다. 또한, 항-감염 약물은 이들의 범위 내에 구충제(anthelmintics) 및 살선충제(nematocides)를 포함한다. 예시적인 항생제는 퀴놀론 (예를 들어, 아미플록사신(amifloxacin), 시녹사신 (cinoxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 플루메퀸(flumequine), 로메플록사신(lomefloxacin), 날리딕스산 (nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 옥소린산(oxolinic acid), 페플록사신(pefloxacin), 로소사신(rosoxacin), 테마플록사신(temafloxacin), 토수플록사신(tosufloxacin), 스파르플록사신(sparfloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 가티플록사신(gatifloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin); 제미플록사신(gemifloxacin); 및 가레녹사신(garenoxacin)), 테트라사이클린 (tetracyclines), 글리실사이클린(glycylcyclines) 및 옥사졸리딘온 (oxazolidinones) (예를 들어, 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 데메클로사이클린(demeclocycline), 독시사이클린(doxycycline), 리메사이클린 (lymecycline), 메타사이클린(methacycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 테트라사이클린(tetracycline), 티게사이클린 (tigecycline); 리네졸리드(linezolide), 에페로졸리드(eperozolid)), 당펩티드 (glycopeptides), 아미노글리코사이드(aminoglycosides) (예를 들어, 아미카신 (amikacin), 아르베카신(arbekacin), 부티로신(butirosin), 디베카신(dibekacin), 포르티미신(fortimicins), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 메오마이신(meomycin), 네틸마이신(netilmicin), 리보스타마이신(ribostamycin), 시소미신(sisomicin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 토브라마이신(tobramycin)), β-락탐 (예를 들어, 이미페넴(imipenem), 메로페넴 (meropenem), 비아페넴(biapenem), 세파클로르(cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세파만돌(cefamandole), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈 (cefazedone), 세파졸린(cefazolin), 세픽심(cefixime), 세프메녹심(cefmenoxime), 세포디짐(cefodizime), 세포니시드(cefonicid), 세포페라존(cefoperazone), 세포라니드(ceforanide), 세포탁심(cefotaxime), 세포티암(cefotiam), 세프피미졸 (cefpimizole), 세프피라미드(cefpiramide), 세프포독심(cefpodoxime), 세프수로딘 (cefsulodin), 세프타지딤(ceftazidime), 세프테람(cefteram), 세프테졸 (ceftezole), 세프티부텐(ceftibuten), 세프티족심(ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세푸록심(cefuroxime), 세푸조남(cefuzonam), 세파아세트릴 (cephaacetrile), 세파렉신(cephalexin), 세팔로글리신(cephaloglycin), 세팔로리딘(cephaloridine), 세팔로틴(cephalothin), 세파피린(cephapirin), 세프라딘 (cephradine), 세피네타졸(cefinetazole), 세폭시틴(cefoxitin), 세포테탄 (cefotetan), 아즈트레오남(azthreonam), 카루모남(carumonam), 플로모세프 (flomoxef), 목사락탐(moxalactam), 아미디노실린(amidinocillin), 아목시실린 (amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 아즐로실린(azlocillin), 카르베니실린 (carbenicillin), 벤질페니실린(benzylpenicillin), 카르페실린(carfecillin), 클록사실린(cloxacillin), 디클록사실린(dicloxacillin), 메티실린(methicillin), 메즐로실린(mezlocillin), 나프실린(nafcillin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린 G (penicillin G), 피페라실린(piperacillin), 술베니실린(sulbenicillin), 테모실린 (temocillin), 티카르실린(ticarcillin), 세프디토렌(cefditoren), SC004, KY-020, 세프디니르(cefdinir), 세프티부텐(ceftibuten), FK-312, S-1090, CP-0467, BK-218, FK-037, DQ-2556, FK-518, 세포조프란(cefozopran), ME1228, KP-736, CP-6232, Ro 09-1227, OPC-20000, LY206763), 리파마이신(rifamycins), 마크로라이드 (macrolides) (예를 들어, 아지트로마이신(azithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 올레안도마이신(oleandomycin), 로키타마이신(rokitamycin), 로사라미신(rosaramicin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 트로레안도마이신(troleandomycin)), 케토라이드(ketolides) (예를 들어, 텔리트로마이신(telithromycin), 세트리마이신(cethromycin)), 쿠메르마이신(coumermycins), 린코사미드(lincosamides) (예를 들어, 클린다마이신 (clindamycin), 린코마이신(lincomycin)) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함한다.
예시적인 항바이러스제는 아바카비르 설페이트(abacavir sulfate), 아시클로비르 나트륨(acyclovir sodium), 아만타딘 히드로클로라이드(amantadine hydrochloride), 암프레나비르(amprenavir), 시도포비르(cidofovir), 델라비르딘 메실레이트(delavirdine mesylate), 디다노신(didanosine), 에파비렌즈 (efavirenz), 팜시클로비르(famciclovir), 포미비르센 나트륨(fomivirsen sodium), 포스카르네트 나트륨(foscarnet sodium), 간시클로비르(ganciclovir), 인디나비르 설페이트(indinavir sulfate), 라미부딘(lamivudine), 라미부딘/지도부딘 (zidovudine), 넬피나비르 메실레이트(nelfinavir mesylate), 네비라핀 (nevirapine), 오셀타미비르 포스페이트(oseltamivir phosphate), 리바비린 (ribavirin), 리만타딘 히드로클로라이드(rimantadine hydrochloride), 리토나비르 (ritonavir), 사퀴나비르(saquinavir), 사퀴나비르 메실레이트(saquinavir mesylate), 스타부딘(stavudine), 발라시클로비르 히드로클로라이드(valacyclovir hydrochloride), 잘시타빈(zalcitabine), 자나미비르(zanamivir), 및 지도부딘을 포함한다.
항아메바제 또는 항원충제의 비-제한적인 예는 아토바쿠온(atovaquone), 클로로퀸 히드로클로라이드(chloroquine hydrochloride), 클로로퀸 포스페이트 (chloroquine phosphate), 메트로니다졸(metronidazole), 메트로니다졸 히드로클로라이드(metronidazole hydrochloride), 및 펜타미딘 이세티오네이트(pentamidine isethionate)를 포함한다. 구충제는 메벤다졸(mebendazole), 피란텔 파모에이트 (pyrantel pamoate), 알벤다졸(albendazole), 이베르멕틴(ivermectin) 및 티아벤다졸(thiabendazole)로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 예시적인 항진균제는 암포테리신(amphotericin) B, 암포테리신 B 콜레스테릴 설페이트 복합체, 암포테리신 B 지질 복합체, 암포테리신 B 리포소말(liposomal), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 그리세오풀빈 미세크기(griseofulvin microsize), 그리세오풀빈 초미세크기(griseofulvin ultramicrosize), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 니스타틴(nystatin), 및 테르비나핀 히드로클로라이드 (terbinafine hydrochloride)로부터 선택될 수 있다. 항말라리아제의 비-제한적인 예는 클로로퀸 히드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 독시사이클린, 히드록시클로로퀸 설페이트(hydroxychloroquine sulfate), 메플로퀸 히드로클로라이드 (mefloquine hydrochloride), 프리마퀸 포스페이트(primaquine phosphate), 피리메타민(pyrimethamine), 및 피리메타민-설파독신(pyrimethamine with sulfadoxine)을 포함한다. 항결핵제는 클로파지민(clofazimine), 시클로세린(cycloserine), 답손 (dapsone), 에탐부톨 히드로클로라이드(ethambutol hydrochloride), 이소니아지드 (isoniazid), 피라지나미드(pyrazinamide), 리파부틴(rifabutin), 리팜핀 (rifampin), 리파펜틴(rifapentine), 및 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
Th1-관련 질환이 병원성 감염인 다른 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 복합체는 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 항-감염제와 동시에 투여된다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 추가 약제 또는 보조제와 함께 본 발명의 면역-조절제의 공동-투여를 포함한다. 하나 이상의 다른 약제와 함께 면역-조절제의 투여를 포함하는 실시예에서, 병용시 활성제의 투여량은 독자적으로 유효량을 포함할 수 있으며, 추가 약제(들)은 환자에게 치료적 또는 예방적 이점을 더 증가시킬 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로, 면역-조절제 및 추가 약제(들)은 함께 Th1-관련 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 포함할 수 있다. 또한, 유효량은 예를 들어 투여의 시기 및 횟수, 투여 방식, 제형 등을 포함하는 특정 치료 요법의 환경에서 정의될 수 있음을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 면역-조절제 및 임의로 암 요법은 정해놓은 일정(routine schedule)에 따라 투여된다. 대안적으로, 암 요법은 증상이 나타날 때 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "정해놓은 일정"은 예정된 지정 기간을 나타낸다. 일정이 예정되어 있는 한, 정해놓은 일정은 동일하거나 또는 다른 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정해놓은 일정은 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 매월 또는 설정한 일수 또는 주 사이, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 7개월마다, 8개월마다, 9개월마다, 10개월마다, 11개월마다, 12개월마다 등으로 폴리펩티드 복합체의 투여를 포함할 수 있다. 대안적으로, 예정된 정해놓은 일정은 첫주 동안 매일, 뒤이어 수개월 동안 월 단위로, 그 후 3개월마다 폴리펩티드 복합체와 암 요법의 동시 투여를 포함할 수 있다. 특정 날짜의 투여가 적당한 일정에 포함되어 있음을 사전에 결정하는 한, 임의의 특정 조합은 정해놓은 일정에 포함될 것이다.
6.6 투여량 및 투여 경로
조성물은 "유효량", 즉 피험자에서 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 투여된다. 환자에게 투여되는 활성 화합물(들)의 용량은 Th1-관련 질환 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 증상의 감소와 같은 시간 경과에 따른 피험자에서 유익한 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 투여될 약학적으로 활성 화합물(들)의 양 또는 투여 빈도는 치료받을 피험자의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태를 포함하여 치료받을 피험자에 의존할 수 있다. 이와 관련하여, 투여를 위한 활성 화합물(들)의 정확한 양은 의사의 판단에 달려있다. 통상의 기술자는 통상적인 실험에 의해, 원하는 치료 결과를 위해 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 본 명세서에 기재된 면역-조절제의 효과적이고 비-독성인 양을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명의 약학 조성물은 투여 경로 및 수여자의 신체적 특성 (건강 상태 포함)과 양립할 수 있는 방식으로, 및 원하는 효과(들) (즉, 치료적으로 효과적, 면역원성 및/또는 보호적)을 도출해내는 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물의 적당한 투여량은 피험자의 신체적 특성 (예를 들어, 연령, 체중, 성별), 화합물이 단일 약제 또는 보조제 요법으로 사용되는지 여부, 환자의 MHC 제한 유형, 바이러스 감염의 진행 (즉, 병리학적 상태)을 포함하는 다양한 요인들, 및 통상의 기술자에 의해 인식될 수 있는 기타 요인들에 의존할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물의 적당한 투여량을 결정할 때 고려될 수 있는 다양한 일반적인 고려 사항은, 예를 들어 Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Gilman et al., (Eds), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press에 기재되어 있다.
일 실시예에서, 대상 면역-조절제의 "유효량"은, 예를 들어, Th1-관련 질환 또는 장애와 관련된 증상을 감소시키기 위해, 바람직한 예방적 또는 치료적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 이러한 실시예에서, 유효량은 면역-조절제로 처리되지 않은 개체의 증상과 비교할 때, 개체에서 Th1-관련 질환 또는 장애와 관련된 증상을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 그 이상 감소시킨다. 다양한 Th1-관련 질환 또는 장애의 증상 및 이러한 증상의 측정 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 개체에서 종양 크기(tumor burden), 종양의 등급, 병원성 유기체의 수 등을 측정하는 방법은 당해 기술분야에서 표준이다.
일 실시예에서, 대상 면역-조절제의 "유효량"은 Th1 면역 반응을 포함하여 면역 반응을 유도하기 위해 선택된 투여 경로에서 효과적인 양이다. Th1 면역 반응을 포함하여 면역 반응을 측정하는 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예시적인 방법은 고체상 불균질 분석법 (예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법), 용액 상 분석법 (예를 들어, 전기화학발광 분석법), 증폭된 발광 근접 균질 분석법, 유동 세포 계측법, 세포내 사이토카인 염색, 기능성 T-세포 분석법, 기능성 B-세포 분석법, 기능성 단핵구-대식세포 분석법, 수지상 및 망상 내피 세포 분석법, NK 세포 반응의 측정, 면역 세포에 의한 IFN-γ 생성, 조직 또는 생물학적 유체에서 바이러스 RNA/DNA의 정량화 (예를 들어, 혈청 또는 다른 유체 또는 조직/장기(organ)에서의 바이러스 RNA 또는 DNA의 정량화), 산화적 파열 분석법(oxidative burst assays), 세포독성-특이적 세포 용해 분석법, 오량체 결합 분석법, 및 식균 작용 (phagocytosis) 및 아폽토시스 평가를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 (예를 들어, 정맥내)를 포함하여 표준 경로에 의해 수여자에게 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 추가 치료제(들)과 함께 수여자에게 투여될 수 있다. 약학 조성물이 치료제(들)과 동시에 투여되는 실시예에서, 투여는 동시적 또는 순차적일 수 있다 (즉, 약학 조성물 투여 후에 약제(들) 투여 또는 그 반대).
일반적으로, 치료 적용시, 치료는 질환 상태 또는 조건의 지속 기간 동안 이루어질 수 있다. 또한, 개별적인 투여량의 최적의 양 및 간격은 치료되는 질환 상태 또는 조건의 특성 및 정도; 투여의 형태, 경로 및 부위; 치료 받는 특정 개체의 특성에 의해 결정될 것이라는 것은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 최적의 조건은 종래 기법을 이용하여 결정될 수 있다.
많은 경우 (예를 들어, 예방적 적용), 본 발명의 약학 조성물을 수회 또는 다수 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상 투여될 수 있다. 투여는 약 1 내지 약 12주 간격일 수 있으며, 특정 실시예에서는 약 1 내지 약 4주 간격일 수 있다. 주기적인 재-투여는 본 발명의 약학 조성물에 의해 표적화된 특정 병원체 또는 다른 질환-관련 성분에 반복적으로 노출되는 경우에 바람직할 수 있다.
또한, 치료 결정 시험의 종래의 경로를 이용하여 최적의 투여 경로를 확인할 수 있음이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
2 이상의 실재물(entities)이 "함께" 또는 "동시에" 피험자에게 투여되는 경우, 이들은 동시에 단일 조성물로 또는 동시에 별도의 조성물로, 또는 시간적으로 분리하여 별도의 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예는 다수의 별도 용량으로 약학 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 Th1-관련 질환 또는 장애의 예방 및 치료 방법은, 예를 들어 정의된 기간 동안 피험자에게 다수의 별도 용량의 투여를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 감염의 예방 및 치료 방법은 본 발명의 약학 조성물의 시동 용량(priming dose)을 투여하는 단계를 포함한다. 시동 용량 다음에 추가 용량 (booster dose)으로 이어질 수 있다. 촉진제(booster)는 재-접종(re-vaccination)을 목적으로 할 수 있다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물 또는 백신은 적어도 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 투여된다.
7. 치료 방법
본 발명의 면역-조절제는 감소되거나 또는 손상된 Th1 면역 반응과 관련된 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, Th1-관련 질환은 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충에 의한 감염일 수 있다. 바이러스는 레트로바이러스과(Retroviridae) 인간 면역결핍 바이러스, 예를 들어 HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III 라고도 함); 및 기타 분리물 (예를 들어, HIV-LP); 피코르나 바이러스과(Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오 바이러스(polio viruses), A형 간염 바이러스; 장내바이러스(enteroviruses), 인간 콕삭키(Coxsackie) 바이러스, 리노바이러스(rhinoviruses), 에코바이러스(echoviruses)); 칼시바이러스과(Calciviridae) (예를 들어, 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스를 포함하는 위장염 (gastroenteritis)을 야기하는 균주); 토가바이러스과(Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스(equine encephalitis viruses), 풍진 바이러스(rubella viruses)); 플라비바이러스과(Flaviridae) (예를 들어, 뎅기열 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스); 코로나바이러스과(Coronoviridae) (예를 들어, 코로나바이러스); 랍도바이러스과(Rhabdoviradae) (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로바이러스과(Filoviridae) (예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 메타뉴모바이러스(metaneumovirus)); 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가바이러스과(Bungaviridae) (예를 들어, 한탄 바이러스 (Hantaan viruses), 분가 바이러스, 플레보바이러스(phleboviruses) 및 나이로 바이러스(Nairo viruses)); 아레나바이러스과(Arenaviridae) (예를 들어, 출혈열 바이러스(hemorrhagic fever viruses)); 레오바이러스과(Reoviridae) (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스(orbiviurses) 및 로타바이러스(rotaviruses)); 비마바이러스과(Bimaviridae); 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보바이러스과(Parvovirida) (파르보바이러스); 파포바이러스과 (Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마(polyoma) 바이러스); 아데노바이러스과(Adenoviridae) (대부분의 아데노 바이러스); 포진바이러스과(Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 시토메갈로바이러스 (CMV), 포진 바이러스); 폭스바이러스과(poxviridae) (바리올라(variola) 바이러스, VACV, 폭스 바이러스); 및 이리도바이러스과(Iridoviridae) (예를 들어, 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus)); 및 미분류 바이러스 (예를 들어, 해면상 뇌증의 병인체(etiological agents of Spongiform encephalopathies), 델타 간염제 (B형 간염 바이러스의 결손 위성(defective satellite)으로 생각됨), 비-A 및 비-B 간염제 (클래스 1 = 내부로 전달됨; 클래스 2 = 비경구로 전달됨 (즉, C형 간염); 및 아스트로바이러스(astroviruses)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 병원성 감염은 박테리아성 병원체이다. 피험자에서 병원성으로 알려진 박테리아는 병원성 파스튜렐라(Pasteurella) 종 (예를 들어, 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida)), 스타필로코키(Staphylococci) 종 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (A군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아가락티애 (Streptococcus agalactiae) (B군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 (비리단스 군 (viridans group)), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 (혐기성 종(anaerobic sps.)), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)), 나이세리아 (Neisseria) 종 (예를 들어, 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)), 대장균(Escherichia) 종 (예를 들어, 장독소원성(enterotoxigenic) E. coli (ETEC), 장병원성(enteropathogenic) E. coli (EPEC), 장출혈성(enterohemorrhagic) E. coli (EHEC), 및 장침입성 (enteroinvasive) E. coli (EIEC)), 보르데텔라(Bordetella) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 레지오넬라(Legionella) 종 (예를 들어, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 시겔라(Shigella) 종, 비브리오(Vibrio) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 해모필루스(Haemophilus) 종 (예를 들어, 해모필루스 인플루엔자), 부르셀라(Brucella) 종, 프란시셀라(Francisella) 종, 박테리오이데스(Bacterioides) 종, 클로스트리디아(Clostridia) 종 (예를 들어, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)), 미코박테리아(Mycobacteria) 종 (예를 들어, M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 아비움(avium), M. 인트라셀루라레(intracellulare), M. 칸사이(kansaii), M. 고르도나에 (gordonae)), 헬리코박터 파이로리, 보렐리아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 엔테로코쿠스 (Enterococcus) 종, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모닐리포미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israeli)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 병원성 감염은 병원성 진균 및 기생충과 같은 진핵 병원체이다. 적어도 어느 정도 병원성이 있다고 알려진 진균은 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스페르길루스 푸미가타(Aspergillus fumigata), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 및 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이종 항원이 유래될 수 있는 다른 진핵 병원체는 병원성 원충, 연충류, 플라스모듐, 예를 들어, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii); 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루즈(Trypanosoma cruzi); 스키스토소마 해마토비움(Schistosoma haematobium), 스키스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni), 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum); 레이시마니아 도노바니(Leishmania donovani); 지아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis); 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 감소되거나 또는 손상된 Th1 면역 반응과 관련될 수 있는 기타 질환은 임의의 악성 또는 전-악성(pre-malignant) 질병, 증식성 또는 과-증식성 질병, 또는 신체의 임의의 세포 또는 조직의 증식능(proliferative capacity) 또는 행동의 기능적 또는 기타 장애 또는 이상으로부터 발생하거나 또는 유래된 또는 이와 관련된 임의의 질환을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 복합체 및 조성물로 치료될 수 있는 비-제한적인 암은 유방암, 대장암, 폐암 및 전립선암, 혈액 및 림프계의 암 (호지킨병, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 발덴스트롬 질환 포함), 피부암 (악성 흑색종 포함), 소화관 암 (두경부암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 대장 및 직장암, 항문암 포함), 생식기 및 비뇨기계의 암 (신장암, 방광암, 고환암, 전립선암 포함), 여성 암 (유방암, 난소암, 부인과 암 및 융모막 암종 포함) 및 뇌암, 골 유암종, 비인두 종양, 후복막(retroperitoneal) 종양, 갑상선 종양 및 연조직 종양을 포함한다.
8. Th1 면역 상태 바이오마커 및 이의 용도
또한, 본 발명은 수지상 세포와 같은 APCs를 포함하는 IEC-상호 작용 세포 상의 PD-L2 발현이 Th1-관련 질환의 중증도와 역 상관관계에 있고 PD-L2가 Th1 면역을 확립하는데 필요하다는 결정에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명자들은 PD-L2가 피험자에서 상향 조절된 및/또는 향상된 Th1 면역 반응의 신뢰할 수 있는 지표라는 것을 결정하였다. 또한, 이들은 Th1 면역 반응 동안 조절되는 다른 바이오마커를 발견하였다. 이러한 추가적인 바이오마커의 포함은 본 명세서에서 교시된 진단 및 예후 분석법의 진단력 및 신뢰성을 증가시킨다. 이러한 결정에 근거하여, 임의로 다른 Th1 면역 상태 바이오마커와 조합된 PD-L2가 피험자의 Th1 면역 상태를 나타내고, Th1-관련 질환을 앓고있는 피험자에서 Th1 면역 상태 발달을 추적하는데 유용하다는 것을 제안한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 복합체 및 키메라 폴리펩티드에 대한 동반 진단으로서, 피험자의 Th1 면역 상태를 확인하기 위한, 또는 Th1-관련 질환을 가진 피험자에게 예후를 제공하기 위한 방법, 장치, 조성물 및 키트도 제공한다.
8.1 Th1 면역 상태 바이오마커
본 발명자들은 특정 표면 마커가 Th1 면역 반응 동안 인간 및 마우스에서 특이적으로 발현되는 수지상 세포와 같은 APCs를 포함하는 IEC-상호 작용 세포 상에 존재함을 확인하였다. 본 명세서에 제시된 결과는 독특한 생물학적-관련 바이오마커 프로파일이 현저한 정도의 정확도로 피험자의 Th1 면역 상태를 예측한다는 분명한 증거를 제공한다. 종합적으로, 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 IEC-상호 작용 세포 표면 바이오마커, 특히 PD-L2가 Th1 면역 상태를 결정하기 위한 바이오마커로서 기능할 수 있고 잠재적으로 바람직하지 않은 Th1 면역 상태와 관련된 질환으로 고통받는 피험자에 대한 치료 결정을 선별하기 위한 유용한 진단으로서의 역할을 할 수 있다는 확실한 증거를 제공한다. 이와 관련하여, 바람직하지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자가 필요에 따라 피험자에서 Th1 면역 반응을 향상시키거나 또는 감소시키는데 적합한 치료제에 노출될 수 있으므로, 이들 바이오마커에 기초한 본 명세서에 개시된 방법, 장치, 조성물 및 키트는 Th1 면역 상태의 신속하고 저렴한 결정을 가능하게 하는 현장 진단(point-of-care diagnostics)에서 작용할 수 있어 의료 시스템에 대해 상당한 비용 절감을 가져올 수 있음을 제시한다.
본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 피험자의 Th1 면역 상태를 결정하는데 특히 유용한 다수의 바이오 마커가 확인되었다. 이러한 바이오마커는 본 명세서에서 "Th1 면역 상태 바이오마커"라고 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "Th1 면역 상태 바이오마커"는 Th1 면역 반응의 일부로서 변경되거나 또는 이의 발현 수준이 변경되는 피험자의 바이오마커, 일반적으로 피험자의 면역계의 바이오마커를 나타낸다. Th1 면역 상태 바이오마커는 적합하게는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 발현 산물을 포함하는 유전자 발현 산물 (본 명세서에서 상호교환적으로 "Th1 면역 반응 바이오마커 유전자"라고도 함)이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, Th1 면역 상태 바이오마커 유전자의 폴리뉴클레오티드 발현 산물은 본 명세서에서 "Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드"라고 한다. Th1 면역 반응 바이오마커 유전자의 폴리펩티드 발현 산물은 본 명세서에서 "Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드"라고 한다.
본 발명의 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커는 적당하게는 PD-L2를 포함한다. 천연 인간 PD-L2 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시되며, 하기의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
ACGCGGGGTTTTTCTTCTCTTGAATATATCTTAACGCCAAATTTTGAGTGCTTTTTTTGTTACCCATCCTCATATGTCCCAGCTAGAAAGAATCCTGGGTTGGAGCTACTGCATGTTGATTGTTTTGTTTTTCCTTTTGGCTGTTCATTTTGGTGGCTACTATAAGGAAATCTAACACAAACAGCAACTGTTTTTTGTTGTTTACTTTTGCATCTTTACTTGTGGAGCTGTGGCAAGTCCTCATATCAAATACAGAACATGATCTTCCTCCTGCTAATGTTGAGCCTGGAATTGCAGCTTCACCAGATAGCAGCTTTATTCACAGTGACAGTCCCTAAGGAACTGTACATAATAGAGCATGGCAGCAATGTGACCCTGGAATGCAACTTTGACACTGGAAGTCATGTGAACCTTGGAGCAATAACAGCCAGTTTGCAAAAGGTGGAAAATGATACATCCCCACACCGTGAAAGAGCCACTTTGCTGGAGGAGCAGCTGCCCCTAGGGAAGGCCTCGTTCCACATACCTCAAGTCCAAGTGAGGGACGAAGGACAGTACCAATGCATAATCATCTATGGGGTCGCCTGGGACTACAAGTACCTGACTCTGAAAGTCAAAGCTTCCTACAGGAAAATAAACACTCACATCCTAAAGGTTCCAGAAACAGATGAGGTAGAGCTCACCTGCCAGGCTACAGGTTATCCTCTGGCAGAAGTATCCTGGCCAAACGTCAGCGTTCCTGCCAACACCAGCCACTCCAGGACCCCTGAAGGCCTCTACCAGGTCACCAGTGTTCTGCGCCTAAAGCCACCCCCTGGCAGAAACTTCAGCTGTGTGTTCTGGAATACTCACGTGAGGGAACTTACTTTGGCCAGCATTGACCTTCAAAGTCAGATGGAACCCAGGACCCATCCAACTTGGCTGCTTCACATTTTCATCCCCTCCTGCATCATTGCTTTCATTTTCATAGCCACAGTGATAGCCCTAAGAAAACAACTCTGTCAAAAGCTGTATTCTTCAAAAGACACAACAAAAAGACCTGTCACCACAACAAAGAGGGAAGTGAACAGTGCTATCTGAACCTGTGGTCTTGGGAGCCAGGGTGACCTGATATGACATCTAAAGAAGCTTCTGGACTCTGAACAAGAATTCGGTGGCCTGCAGAGCTTGCCATTTGCACTTTTCAAATGCCTTTGGATGACCCAGCACTTTAATCTGAAACCTGCAACAAGACTAGCCAACACCTGGCCATGAAACTTGCCCCTTCACTGATCTGGACTCACCTCTGGAGCCTATGGCTTTAAGCAAGCACTACTGCACTTTACAGAATTACCCCACTGGATCCTGGACCCACAGAATTCCTTCAGGATCCTTCTTGCTGCCAGACTGAAAGCAAAAGGAATTATTTCCCCTCAAGTTTTCTAAGTGATTTCCAAAAGCAGAGGTGTGTGGAAATTTCCAGTAACAGAAACAGATGGGTTGCAATAGAGTTATTTTTTATCTATAGCTTCCTCTGGG [서열번호: 55].
본 발명의 방법에서 임의로 사용될 수 있는 다른 Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L1이다. 천연 인간 PD-L1 아미노산 서열은
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET [서열번호: 56]이고, 하기의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
ATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCATGACCTACTGGCATTTGCTGAACGCATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAA [서열번호: 57].
상기 Th1 면역 상태 바이오마커 중에서, PD-L2 폴리펩티드는 Th1 면역 상태를 검출하기 위해 스스로 강한 진단 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, FACS 분석을 이용하여 APCs와 같은 PD-L2+ IEC-상호 작용 세포의 백분율을 측정함으로써 측정됨). 따라서, 특정 실시예에서, PD-L2 바이오마커는 지표의 결정을 위해 단독으로 또는 다른 Th1 면역 상태 바이오마커와 함께 사용될 수 있다. 적합하게는, 이들 실시예에서, PD-L2 바이오마커 및 임의로 다른 Th1 면역 상태 바이오마커(들) (예를 들어, PD-L1)에 대해 바이오마커 값을 측정하거나 또는 유도하여 지표를 결정한다.
또한, 본 발명자들은 다른 Th1 면역 상태 바이오 마커가 PD-L2 바이오마커와 함께 사용될 때 강한 진단 성능을 갖는다는 것을 확인하였다. 유리한 실시예에서, 지표를 결정하는데 사용될 수 있는 Th1 면역 상태 바이오마커의 쌍이 확인되었다. 따라서, 이 유형의 대표적인 예에서, 및 하기에 상세히 기재되는 바와 같이, 피험자의 Th1 면역 상태를 결정하는데 사용될 수 있는 Th1 면역 상태 바이오마커의 비에 상관관계가 있는 지표가 결정된다.
따라서, 특정 단백질 산물은 본 명세서에서 피험자의 Th1 면역 상태를 결정하기 위한 방법을 제공하는 Th1 면역 반응 바이오마커로서 개시된다. 피험자에서 또는 피험자로부터 얻어진 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커의 수준의 분석을 통한 이들 Th1 면역 상태 바이오마커의 평가는, 피험자에서 Th1 면역 상태를 평가하는데 사용될 수 있는 지표를 결정하기 위한 측정된 또는 유도된 바이오마커 값을 제공한다.
8.2 시료 제조
일반적으로, 시료는 Th1 면역 상태 바이오마커 검출 또는 정량화 전에 처리된다. 예를 들어, 단백질 및/또는 핵산은 분석 전에 시료로부터 추출, 분리 및/또는 정제될 수 있다. 다양한 단백질, DNA 및/또는 mRNA 추출 및 정제 기법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다 처리는 원심 분리, 초원심 분리, 에탄올 침전, 여과, 분획화, 재현탁, 희석, 농축 등을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 교시된 방법은 제한된 처리 없이 또는 함께 미가공(raw) 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청 등과 같은 생물학적 유체)로부터의 분석 (예를 들어, 단백질 바이오마커의 정량화)을 제공한다.
또한, 특정 분획 또는 관심있는 세포 유형의 시료를 정제하거나 또는 농축하기 위하여, Th1 면역 상태 바이오마커 검출 또는 정량화 전에 시료를 처리할 수 있다. 예를 들어, 시료는 APCs 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포, 또는 APCs의 특정 하위세트 (예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포 또는 이들의 조합)에 대해 농축될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 시료는 Th1 면역 상태 바이오마커 검출 또는 정량화 전에 APCs (예를 들어, CD11c+ 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포) 및 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포에 대해 농축된다. 특정 세포 유형의 생물학적 시료를 농축하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 예를 들어 세포 분리를 위한 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 또는 수쿠로오스 구배 용액을 이용한 차등 구배 분리 (differential gradient separation), 다음에 염화 암모늄 또는 남아있는 오염 적혈구의 저장성 용해(hypotonic lysis)에 의해 분리될 수 있다 ("Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds)).
시료 제조 방법은 오염물 및/또는 분석 저해제를 제거한 적당한 완충제에서 시료를 균질화하는 단계, Th1 면역 상태 바이오마커 포획 시약 (예를 들어, 표적 Th1 면역 상태 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 부분에 연결된 자기 비드)을 가하여 표적 바이오마커와 포획 시약과의 결합을 촉진시키는 조건 하에서 배양시켜 표적 바이오마커:포획 시약 복합체를 제조하는 단계, 및 표적 바이오마커-방출 조건 하에서 표적 바이오마커:포획 복합체를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 다수의 Th1 면역 상태 바이오마커는 용액에 다수의 Th1 면역 상태 바이오마커 포획 시약 (예를 들어, 원하는 바이오마커에 특이적인)을 가하여 각 분리 단계에서 분리된다. 예를 들어, 바이오마커가 핵산인 예시적인 실시예에서, 다수의 Th1 면역 상태 바이오마커의 분리를 위해, 상이한 표적 Th1 면역 상태 바이오마커에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 각각 포함하는 다수의 Th1 면역 상태 바이오마커 포획 시약을 시료에 첨가할 수 있다. 상기 방법은 각각의 포획 단계에서 포획된 포획 단계의 수 및 표적 Th1 면역 상태 바이오마커의 수 모두에서 변하는 다수의 실험 설계를 포함하는 것으로 고려된다. 일 실시예에서, 포획 시약은 분리, 정제, 검출 및/또는 정량화하고자 하는 특정 바이오마커와 우선적으로 (예를 들어, 특이적으로 및 선택적으로) 상호 작용하는 분자, 부분(moieties), 물질 또는 조성물이다. 특정 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 원하는 결합 친화도 및/또는 특이도를 갖는 임의의 포획 시약이 본 기술에 사용될 수 있다. 예를 들어, 포획 시약은 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체 또는 수용체), 올리고뉴클레오티드, 핵산 (예를 들어, Th1 면역 상태 바이오마커와 혼성화할 수 있는 핵산), 비타민, 올리고당, 탄수화물, 지질, 또는 소분자와 같은 거대분자, 또는 이들의 복합체일 수 있다. 예시적이고 비-제한적인 예로서, 아비딘 표적 포획 시약은 바이오틴 부분을 포함하는 표적을 분리 및 정제하는데 사용될 수 있고, 항체는 적당한 항원 또는 에피토프를 포함하는 표적을 분리 및 정제하는데 사용될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 분리 및 정제하는데 사용될 수 있다.
표적 Th1 면역 상태 바이오마커에 결합할 수 있거나 또는 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 핵산 (단일-가닥 및 이중-가닥 핵산 포함)이 포획 시약으로 사용될 수 있다. 이러한 핵산의 예는 DNA, RNA, 앱타머, 펩티드 핵산, 및 당, 포스페이트, 또는 뉴클레오시드 염기에 대한 다른 변형을 포함한다. 따라서, 표적을 포획하기 위한 많은 전략이 있으며, 이에 따라 많은 유형의 포획 시약이 통상의 기술자에게 알려져 있다.
또한, Th1 면역 상태 바이오마커 포획 시약은 포획 시약을 위치시키고, 농축시키고, 응집시키는 등의 기능성을 포함할 수 있으므로, 포획 시약에 포획 (예를 들어, 결합, 혼성화 등) 될 때 (예를 들어, 표적:포획 시약 복합체가 형성될 때) 표적 Th1 면역 상태 바이오마커를 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 실시예에서, Th1 면역 상태 바이오마커 (예를 들어, 폴리펩티드)와 상호 작용하는 포획 시약의 일부는 거시적 규모로 사용자에 의한 조작을 허용하는 고체 지지체 (예를 들어, 비드, 표면, 수지, 컬럼 등)에 결합된다. 종종, 고체 지지체는 불균질 용액으로부터 표적:포획 시약 복합체를 분리 및 정제하기 위한 기계적인 방법의 사용을 가능하게 한다. 예를 들어, 비드에 결합될 때, 물리적 이동에 의해 불균질 용액으로부터 비드를 제거함으로써 분리가 달성된다. 비드가 자기 또는 상자성 (paramagnetic)인 실시예에서, 자기장(magnetic field)은 불균질 용액으로부터 포획 시약 (및 따라서 표적 Th1 면역 상태 바이오마커)의 물리적 분리를 달성하는데 사용된다.
8.3 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드의 평가
바이오마커 값을 얻기 위하여, Th1 면역 상태 바이오마커는 당해 기술분야에서 알려진 임의의 적당한 기법을 이용하여 정량화되거나 또는 검출될 수 있다. 특정 실시예에서, Th1 면역 상태 바이오마커는 개개의 Th1 면역 상태 바이오마커의 수준, 존재량 또는 양을 결정하는 시약을 이용하여 정량화된다. 이 유형의 비-제한적인 시약은 단백질-기반 및 핵산-기반의 분석에 사용하기 위한 시약을 포함한다.
Th1 면역 상태 바이오마커 발현은 단백질의 존재의 입증에 의해 또는 바이오마커의 하나 이상의 알려진 기능적 특성에 의해 단백질 발현 수준에서 평가될 수 있다. 예를 들어, PD-L2-특이적 단백질 검출에 사용하기 위한 항-PD-L2 항체는 미국특허 번호 제 7,709,214호; 미국특허 출원 번호 제 2009/296,392호; 및 유럽특허 번호 제 1537878호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 전체 참조로 포함된다. 상기 항체는 천연 및 변성 PD-L2 단백질 모두에 결합하고, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사 면역 측정법 (RIA), 발광 면역분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 면역형광 분석법, 면역조직화학 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 포함하여, 당해 기술분야에 잘 알려진 여러 분석법에 의해 검출될 수 있다.
ELISA 및 RIA는 특정 항원의 검출에 대해 유사한 원리를 따른다. 예시적인 예로서, PD-L2는 일반적으로 125I로 방사성 표지된 PD-L2-특이적 항체에 의해 RIA를 이용하여 측정될 수 있다. ELISA 분석법에서, PD-L2-특이적 항체는 효소에 화학적으로 결합되어 있다. PD-L2-특이적 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정화된다. 그 다음, 비-특이적 결합이 차단되고 비-결합된 항체 및/또는 단백질이 세척에 의해 제거되는 조건 하에, 비-표지된 표본, 예를 들어 생물학적 시료로부터의 단백질 추출물을 고정화 항체와 함께 배양한다. 결합된 PD-L2는 제 2의 PD-L2 특이적 표지된 항체에 의해 검출된다. 항체 결합은 방사성을 측정하여 RIA에서 직접 측정되지만, ELISA 결합에서는 무색 기질을 유색 반응 생성물로 전환시키는 반응에 의해 결합-효소 활성의 함수로 검출된다. 따라서, 분광 광도계로 변화를 쉽게 감지할 수 있다 (Janeway C. A. et al. (1997). "Immunobiology" 3.sup.rd Edition, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc.; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds)). 따라서, 양 분석법 모두 생물학적 시료에서 PD-L2 단백질 함량의 정량화 방법을 제공한다.
또한, 단백질 바이오마커 발현은 발광 면역분석법을 통해 검출될 수 있다. ELISA 및 RIA와 매우 유사하게, 발광 면역분석법에서 시험할 생물학적 시료/단백질 추출물을 고체 지지체 상에 고정화시키고, 특정 표지로 표지된 항-PD-L2 항체로 탐침한다. 표지는 차례로 발광하며, 특정 인식의 표시로서 결합 시에 빛을 방출한다. 발광 표지는 전자기 방사(electromagnetic radiation), 전기화학적 여기 (electrochemical excitation) 또는 화학적 활성화에 의해 활성화 시 빛을 방출하는 물질을 포함하며, 형광 및 인광 물질, 섬광체(scintillators), 및 화학발광 물질을 포함할 수 있다. 표지는 효소, 효소 단편, 효소 기질, 효소 저해제, 조효소 (coenzymes) 또는 촉매와 같은 촉매 반응 시스템의 일부; 형광체(fluorophores), 염료, 화학발광체(chemiluminescers), 발광체 또는 감광제와 같은 색원체 (chromogen) 시스템의 일부; 비-자기(non-magnetic) 또는 자기일 수 있는 분산성 입자, 고체 지지체, 리포솜, 리간드, 수용체, 합텐 방사성 동위원소 등일 수 있으며 (미국특허 번호 제 6,410,696호, 미국특허 번호 제 4,652,533호 및 유럽특허 출원 번호 제 0,345,776호), PD-L2 단백질 발현을 검출하기 위한 추가의 고도로 민감한 방법을 제공한다.
웨스턴 블롯 분석은 생물학적 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드 함량을 평가하는 또 다른 방법이다. APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포의 생물학적 시료로부터의 단백질 추출물을 변성 이온화 환경에서 가용화시키고, 분취량을 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스에 적용한다. 단백질은 아노드(anode) 쪽으로 이동함에 따라 분자 크기 특성에 따라 분리된다. 항원을 니트로 셀룰로오스, PVDF 또는 나일론 막으로 옮긴 다음, 막 차단으로 비-특이적 결합을 최소화한다. 막은 검출가능한 부분에 직접 결합된 항체로 탐침되거나, 또는 차후에 검출가능한 부분을 함유하는 2차 항체로 탐침된다. 일반적으로, 효소 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제는 항체에 결합되며, 색원성 (chromogenic) 기질 또는 발광 기질은 활성을 시각화하는데 사용된다 (Harlow E. et al., (1998) Immunoblotting. In Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 471-510 CSH Laboratory, cold Spring Harbor, N.Y. and Bronstein I. Et al. (1992) Biotechniques 12: 748-753).
전체 시료에서 단백질 바이오마커 함량을 정량화하는 RIA, ELISA, 발광 면역분석법 및 면역블롯팅과는 달리, 정량화가 손상되더라도, 면역형광/면역세포화학을 사용하여 세포-특이적 방식으로 단백질을 검출할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포는 당해 기술분야에 알려진 방법에 의해 분리될 수 있거나 또는 농축될 수 있다. IEC-상호 작용 세포의 분리 또는 농축은 (농축 과정 전의 시료의 백분율에 비해) IEC-상호 작용 세포의 백분율을 증가시키는 과정을 나타낸다. 정제는 농축의 한 예이다. 특정 실시예에서, 농축 과정 전의 시료에 비해, 농축된 시료의 세포의 백분율로서, APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포의 수의 증가는 적어도 25-, 50-, 75-, 100-, 150-, 200-, 250-, 300-, 350-배이고, 적당하게는 100-200 배이다. 특정 실시예에서, 분리를 허용하기 위해, IEC-상호 작용 세포 상의 표면 마커에 대한 항체를 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 분리 과정은 항체 자기 비드 (예를 들어,Miltenyi™ 비드), 친화도 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착된 항체로 "패닝(panning)" 또는 레이저 포획 미세절제(Laser Capture Microdissection)와 같은 임의의 다른 편리한 기법을 이용한 자기 분리를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, IEC-상호 작용 세포는 CD11c에 특이적인 항체 (이 항체는 자기 비드에 접합됨) 및 CD11c+ 세포를 분리하기 위한 자기 세포 분리 장치를 이용하여 적당하게 농축된 수지상 세포이다. 특히 정확한 분리를 제공하는 다른 기법은 FACS를 포함한다. 일단 세포가 슬라이드 위에 놓여지면, 이들은 고정될 수 있고, 세포 특이적 방식으로 Th1 면역 상태 바이오마커를 검출하기 위한 표지된 항체와 같은 표지된 항원-결합 분자로 탐침될 수 있다.
Th1 면역 상태 바이오마커에 특이적인 항체, 예를 들어 항-PD-L2 항체는 플루오레세인(Fluorescein), FITC, 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), Cy3, Cy5, Cy7을 포함하는 형광 마커, 및 기타 형광 마커에 직접 접합될 수 있고, 적당한 여과기가 장착된 형광 현미경으로 관찰될 수 있다. 또한, 항체는 적당한 기질의 첨가 시 검출된 PD-L2 단백질로 세포 위에 착색된 침전물을 제공하는 반응을 개시하는 효소에 접합될 수 있다. 그 다음, 슬라이드를 표준 광학 현미경으로 관찰할 수 있다. 대안적으로, PD-L2에 특이적인 1차 항체는 검출가능한 부분에 접합된 2차 항체에 더 결합될 수 있다. 따라서, 세포 표면 발현을 평가할 수 있으며, 트리톤-X 및 사포닌과 같은 세포 투과 용액의 첨가를 적용하여 세포 세포질 내에 시약 침투를 용이하게 할 수 있다 ("Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes 1-111 Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)).
면역조직화학은 원칙적으로 면역형광 또는 면역세포화학과 매우 유사하지만, 조직 표본은 예를 들어, 세포 현탁액과는 반대로, PD-L2 항체로 탐침된다. 생검 표본을 고정하고 처리한 다음, 임의로 파라핀에 끼워 넣고, 필요한 경우 절편을 만들고, 이후에 헤파라나제 특이적 항체로 탐침된 세포 또는 조직 슬라이드를 제공한다. 대안적으로, 냉동 조직은 후속 항체 탐침과 함께 저온유지장치(cryostat)에서 절편화하여 고정-유도 항원 차폐를 제거할 수 있다. 면역형광 또는 면역세포화학에서와 같이, 항체는 형광 또는 효소-결합된 검출가능한 부분에 결합되며, 면역형광에 대해 기재된 방법에 의해 조직 절편을 탐침하는데 사용되고, 이어서 사용된 검출 방법에 따라 형광 또는 공초점 현미경에 의해 시각화된다. 반응 생성물 침전물의 시각화는, 효소 검출가능한 부분을 이용하는 경우, 반응 생성물이 생성된 후에 표준 광학 현미경으로 관찰될 수 있다 ("Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)).
특정 실시예에서, FACS 분석을 사용하여 Th1 면역 상태 바이오마커 발현 (예를 들어, PD-L2, 및 임의로 PD-L1, 발현)을 평가한다. FACS 장치 및 방법의 일반적인 기재는 미국특허 번호 제 4,172,227호; 제 4,347,935호; 제 4,661,913호; 제 4,667,830호; 제 5,093,234호; 제 5,094,940호; 및 제 5,144,224호에 제공된다. 세포는 FACS 기계로 도입되어 튜브를 통해 FACS 세포로 전달되며, FACS 세포는 단일 세포로 통과한다. 레이저 빔은 FACS 세포로 향하고, 전방 레이저 산란은 광 다이오드(photodiode)에 의해 수집되고, 측면 레이저 산란은 PMT1로 향하는 렌즈를 통해 PMT 튜브로 향한다. 특정 여과기는 다변수(multivariate) 분석을 위해 측면 산란에서 다른 PMT 튜브로 형광을 지시한다. 측면 레이저 산란은 세포 크기 및 입도 (granularity)의 반영이며, 혼합 시료에서 세포 집단을 확인하는데 사용될 수 있다. 형광 항-PD-L2 항체로 표지된 세포는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, PMT 튜브를 통해, 또는 식별을 위한 추가 세포 표면 마커의 통합을 통해, 크기 및 입도를 통한 세포 유형에 대해 확인될 수 있는 레이저 여기 및 수집에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, FACS 분석은 특정 단백질의 세포 표면 발현 (예를 들어, PD-L2, 및 임의로 PD-L1, 발현)의 측정에 사용되며, 따라서 항원-제시 세포 집단에서 세포 표면 바이오마커 발현 (예를 들어, 수지상 세포의 표면에서의 PD-L2, 및 임의로 PD-L1, 발현)의 검출을 탐침하는데 특정 항체가 이용될 수 있다. 표면 PD-L2 단백질 및 임의로 PD-L1을 발현하는 특정 항원-제시 세포 하위유형 (예를 들어, CD11c+ 수지상 세포)은 크기 및 입도 특성에 의해, 또는 대안적으로 추가의 세포 표면 마커 단백질로 공동-염색에 의해 확인될 수 있다.
특정 실시예에서, 다수의 단백질의 동시 검출 및/또는 정량화를 가능하게 하는 단백질-포획 어레이가 사용된다. 예를 들어, 보편적인 단백질 어레이 시스템 (Ge, 2000 Nucleic Acids Res. 28(2):e3)과 같은 여과막의 저-밀도 단백질 어레이는 표준 ELISA 기법 및 스캐닝 전하-결합 소자(scanning charge-coupled device; CCD) 검출기를 이용하여 배열된 항원의 영상화를 가능하게 한다. 임상 분석물의 동시 검출을 가능하게 하는 면역-센서 어레이도 개발되었다. 현재 단백질 어레이를 이용하여 체액, 예를 들어 건강한 피험자 또는 질병에 걸린 피험자의 혈청, 및 약물-치료 전후의 피험자에서의 단백질 발현을 프로파일링 할 수 있다.
예시적인 단백질 포획 어레이는 일반적으로 항체 어레이라고 불리는 공간적으로 설명된 항원-결합 분자를 포함하는 어레이를 포함하며, 이는 단백질체 (proteome) 또는 하위단백질체(subproteome)를 정의하는 수많은 단백질의 광범위한 평행 분석을 용이하게 할 수 있다. 항체 어레이는 특이도 및 허용가능한 배경의 요구되는 특성을 갖는 것으로 나타났으며, 일부는 시판된다 (예를 들어, BD Biosciences, Clontech, Bio-Rad and Sigma). 항체 어레이의 다양한 제조 방법이 보고되었다 (참조, 예를 들어, Lopez et al., 2003 J. Chromatogram. B 787:19-27; Cahill, 2000 Trends in Biotechnology 7:47-51; 미국특허 출원 공개 번호 제 2002/0055186호; 미국특허 출원 공개 번호 제 2003/0003599호; PCT 공개 WO 03/062444; PCT 공개 WO 03/077851; PCT 공개 WO 02/59601; PCT 공개 WO 02/39120; PCT 공개 WO 01/79849; PCT 공개 WO 99/39210). 이러한 어레이의 항원-결합 분자는 세포 또는 세포 집단에 의해 발현된 적어도 단백질의 하위세트를 인식할 수 있으며, 이의 예시적인 예는 성장 인자 수용체, 호르몬 수용체, 신경전달물질 수용체 (neurotransmitter receptors), 카테콜아민(catecholamine) 수용체, 아미노산 유도체 수용체, 사이토카인 수용체, 세포외 기질 수용체, 항체, 렉틴, 사이토카인, 세르핀(serpins), 프로테아제, 키나제, 포스파타제, ras-유사 GTPases, 가수분해효소 (hydrolases), 스테로이드 호르몬 수용체, 전사 인자, 열-충격 전사 인자, DNA-결합 단백질, 징크-핑거 단백질(zinc-finger proteins), 류신-지퍼 단백질(leucine-zipper proteins), 호메오도메인 단백질(homeodomain proteins), 세포내 신호 전달 조절제 및 작동체(intracellular signal transduction modulators and effectors), 아폽토시스-관련 인자, DNA 합성 인자, DNA 복구 인자, DNA 재조합 인자 및 세포-표면 항원을 포함한다.
개개의 공간적으로 구별되는 단백질-포획 약제는 일반적으로 평면 또는 윤곽이 있는 지지체 표면에 부착된다. 일반적인 물리적 지지체는 유리 슬라이드, 실리콘, 마이크로웰, 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막, 및 자기 미세비드 및 기타 미세비드를 포함한다.
또한, 현탁액 내의 입자가 식별을 위해 코딩되어 있다면, 배열의 기초로 사용될 수 있다; 시스템은 미세비드용 색 코딩(color coding) (예를 들어, Luminex, Bio-Rad 및 Nanomics Biosystems로부터 입수 가능함) 및 반도체 나노결정 (예를 들어, QDots™, Quantum Dots로부터 입수 가능함), 및 비드용 바코딩(barcoding) (UltraPlex™, Smartbeads로부터 입수 가능함) 및 다중금속 미세봉(multimetal microrods) (Nanobarcodes™ particles, Surromed로부터 입수 가능함)을 포함한다. 또한, 비드는 반도체 칩 상의 평면 어레이로 조립될 수 있다 (예를 들어, LEAPS technology 및 BioArray Solutions으로부터 입수 가능함). 입자가 사용되는 경우, 개개의 단백질-포획 약제는 일반적으로 개개의 입자에 부착되어 어레이의 공간적 정의 또는 분리를 제공한다. 그 다음, 입자를 별도로, 그러나 동시에, 예를 들어 미세역가 플레이트의 웰에서 또는 별개의 시험관에서 구획화된 방식으로 분석될 수 있다.
작동 시, 펩티드 단편을 형성하기 위해 임의로 단편화된 단백질 시료 (참조, 예를 들어, 미국특허 출원 공개 번호 제 2002/0055186호)는, 단백질 또는 펩티드 결합에 적합한 조건 하에 단백질-포획 어레이로 전달되고, 어레이를 세척하여 어레이로부터 시료의 비-결합된 또는 비-특이적으로 결합된 성분을 제거한다. 그 다음, 어레이의 각 특징에 결합된 단백질 또는 펩티드의 존재 또는 양은 적당한 검출 시스템을 이용하여 검출된다. 어레이의 특징에 결합된 단백질의 양은 어레이의 제 2 특징에 결합된 제 2 단백질의 양에 비례하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 시료 내의 제 2 단백질의 양은 이미 알려져 있거나 또는 변하지 않는 것으로 알려져있다.
특정 실시예에서, Th1 면역 상태 바이오마커는 표적 폴리펩티드와 면역-상호 작용하는 적어도 하나의 항원-결합 분자를 이용하여 수준이 측정되는 표적 폴리펩티드이다. 이들 실시예에서, 표적 폴리펩티드의 측정된 수준은 기준 폴리펩티드의 수준으로 표준화된다. 적당하게는, 항원-결합 분자는 고체 또는 반-고체 지지체 상에 고정화된다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 항원-결합 분자는 항원-결합 분자의 공간 어레이의 일부를 형성한다. 일 실시예에서, 표적 폴리펩티드에 결합된 항원-결합 분자의 수준은 면역분석법에 의해 (예를 들어, ELISA를 이용하여) 측정된다.
시료 내에서의 바이오마커 활성의 부재 또는 존재의 입증은 특정 Th1 면역 상태 바이오마커를 발현하는 IEC-상호 작용 대 비-발현 세포 집단을 구별하는 부가적인 방법이다.
8.4 PD-L2 바이오마커 클러스터링의 평가
또한, 본 발명자들은 IEC-상호 작용 세포의 세포 표면에서의 PD-L2의 클러스터링이 정상 또는 상승된 Th1 면역 반응을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 일 실시예에서, Th1 면역 상태 바이오마커의 바이오마커 값은 APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포의 세포 표면에서의 PD-L2 클러스터링을 분석하여 결정된 바와 같이, PD-L2의 수준 또는 존재량을 나타낸다.
항원-제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)의 세포 표면에서 PD-L2의 클러스터링을 검출하기 위해 널리 이용가능한 다수의 분석법이 있다. 예를 들어, PD-L2 리간드 및/또는 PD-L2-특이적 항체를 표지할 수 있고, 이들 표지를 검출하여 PD-L2의 클러스터링을 시각화할 수 있다. 이러한 유형의 분석법의 하나의 예에서, PD-L2를 포함하는 수지상 세포 또는 종양 세포를 PD-L2-특이적 항체 및 PD-L2-특이적 항체에 결합하는 형광 표지된 2차 항체와 접촉시킨다. 공초점 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여, 2차 항체로부터 방출된 형광을 검출하여 PD-L2의 위치를 확인할 수 있다 (Van Steensel, et al., 1995. J Cell Sci 108: 3003-3011). 다른 예에서, 예를 들어 Kaufmann et al. (2011. J Microsc. 242(1):46-54), Huber et al. (2011. PLoS One. 7(9):e44776), Wang et al. (2014. Biochim Biophys Acta. 1838(4):1191-1198), 및 Sams et al. (2014. J Biomed Opt. 19(1):011021)에 의해 기재된 바와 같이, 세포 표면 상의 PD-L2를 포함하는 세포는 초해상 현미경으로 분석된 세포 표면 PD-L2 및 세포 표면 PD-L2 클러스터링의 표지된 리간드와 접촉된다.
대안적으로, 예를 들어 Bellucci et al. (2014. Methods Mol Biol. 1174:397-405), Barros et al. (2014. Breast Cancer Res Treat. 144(2):273-85) 및 Pacchiana et al. (2014. Histochem Cell Biol. 142(5):593-60)에 의해 기재된 바와 같이, 세포 표면 PD-L2 클러스터링은 인 시츄(in situ) 근접 분석법에 의해 분석된다.
다른 실시예에서, 예를 들어 Wallrabe et al. (2003. Biophys J. 85(1):559-571), Wallrabe et al. (2003. J Biomed Opt. 8(3):339-346) 및 de Heus et al. (2013. Methods Cell Biol. 117:305-321)에 의해 기재된 바와 같이, FRET 및 FRAP 현미경을 사용하여 PD-L2 클러스터링을 분석할 수 있다.
PD-L2 클러스터링을 분석하는 다른 방법은, 예를 들어 Petersen et al. (1998. Faraday Discuss. (111):289-305), Kozer et al. (2013. Mol Biosyst. 9(7):1849-1863), 및 Ciccotosto et al. (2013. Biophys J. 104(5):1056-1064)에 의해 기재된 바와 같은 영상 상관 분광법(image correlation spectroscopy); 예를 들어 Giugni et al. (1987. J Cell Biol. 104(5):1291-1297), 및 Zhang et al. (2011. PLoS One. 6(10):e26805)에 의해 기재된 바와 같은 전기장 분석(electric field analysis); Plowman et al. (2005. Proc Natl Acad Sci USA. 102(43):15500-15505), 및 D'Amico et al. (2008. Micron. 39(1):1-6)에 의해 기재된 바와 같은 전자 현미경(electron microscopy); 예를 들어 Gold et al. (2014. Nat Commun. 5:4129)에 의해 기재된 바와 같은, 전자 저온단층촬영(electron cryotomography); 예를 들어 Wang et al. (2012. Nano Lett. 12(6):3231-3237) 및 Rong et al. (2012. PLoS One. 7(3):e34175)에 의해 기재된 바와 같은, 플라즈몬 결합 현미경 (plasmon coupling microscopy; PCM)과 조합된 나노입자 (NP) 면역 표지; 예를 들어 Miyagawa-Yamaguchi et al. (2014. PLoS One. 9(3):e93054) 및 Kotani et al. (2008. Proc Natl Acad Sci USA. 105(21):7405-7409)에 의해 기재된 바와 같은, 라디칼 공급원의 효소-매개 활성화 (enzyme-mediated activation of radical source, EMARS) 분석; 및 예를 들어 Li et al. (2010. Biophys J. 98(11):2554-2563)에 의해 기재된 바와 같은, 양자점 분석을 포함한다.
PD-L2에 대한 특이도를 갖는 다수의 리간드가 알려져 있으며, 이는 클러스터링 분석에 사용될 수 있다. 이들 중 다수는 본 발명에 따른 치료제로도 유용하다. 예를 들어, PD-L2 폴리펩티드에 결합하는 임의의 적당한 항체는 본 발명의 실시에 사용되는 것으로 고려된다. 이러한 항체의 비-제한적인 예는 상기에 열거되어 있다.
특정 실시예에서, 항체는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. 대안적으로, 또는 또한, 항체는 다가 (예를 들어, 2가) 항체이다.
임의의 PD-L2 리간드는 본 발명의 이들 실시예에서 사용하기에 적합하며, 하기 클래스의 리간드를 포함한다: 단백질, 소 유기분자, 탄수화물 (다당류 포함), 폴리뉴클레오티드, 지질 등. 이러한 리간드의 대표적인 예는 PD-1 폴리펩티드, 갈렉틴-9 폴리펩티드 및 반발 유도 분자(repulsive guidance molecule) b (RGMb)를 포함한다.
8.5 Th1 면역 상태 바이오마커 핵산의 평가
일 실시예에서, 바이오마커 발현은 APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포에서 바이오마커 핵산 전사 수준을 측정함으로써 관찰된다. RNA는 다수의 표준 기법을 통해 생물학적 시료에서 추출될 수 있다 (참조, Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)). RNA 분리를 가능하게 하는 세포 용해를 위한 구아니듐(Guanidium)-기반 방법, 다른 세포 거대분자로부터 RNA를 분리하기 위한 염화 세슘 단계 구배, 및 RNA 침전 및 재현탁은, 오래되고 덜 일반적으로 사용되는 RNA 분리 방법이다 (Glisin, Ve. et al., (1973) Biochemistry 13: 2633). 대안적으로, RNA는 단일 단계 과정으로 분리될 수 있다 (미국특허 번호 제 4,843,155호, 및 Puissant, C. And Houdebine L. M. (1990) Biotechniques 8: 148-149). 단일 단계 과정은 RNA 추출을 위한 구아니듐 이소티오시아네이트(Guanidium isothiocyanate)의 사용 및 다른 세포 단백질 및 DNA로부터의 총 RNA의 분리를 촉진하는 차후의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출을 포함한다. 예를 들어, TRIZOL 시약 (Life Technologies, Gaithersburg, Md.)의 사용을 포함하여, 상기 인용된 원리에 기초한 시판되는 단일-단계 제형이 사용될 수 있다.
Th1 면역 상태 바이오마커 RNA/유전자 발현은 여러 다른 표준 기법을 통해 관찰될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 노던 블롯 및 도트 블롯 분석, 프라이머 확장, RNase 보호, RT-PCR, 인-시츄(in-situ) 혼성화 및 칩 혼성화를 포함한다.
특정 Th1 면역 상태 바이오마커 RNA 서열은 상기한 바와 같이 추출된 블롯팅된 RNA 제제에 표지된 탐침(probes)의 혼성화에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 노던 블롯 분석에서, 분획화된 RNA를 변성 아가로오스 겔 전기영동에 적용시키고, RNA가 크기에 따른 분리를 저해할 수 있는 2차 구조를 취하는 것을 방지한다. RNA를 모세관 이동에 의해 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막 지지체로 옮긴 다음, 바이오마커 서열에 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침으로 탐침할 수 있다 (Alwine, et al. (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350-5354 and Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)).
대안적으로, 미분획화된 RNA를 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막에 고정화시킬 수 있고, 유사하게 슬롯/도트 블롯 분석에 의해 바이오마커-특이적 발현을 탐침할 수 있다. RNA 슬롯/도트 블롯은 수동으로 준비될 수 있고, 또는 대안적으로 농도계 스캐닝(densitometry scanning)에 의한 혼성화 신호의 비교를 용이하게 하는, 다기관 장치(manifold apparatus)를 이용하여 구축될 수 있다 (Chomczynski P. (1992) Anal. Biochem. 201: 134-139).
프라이머 확장은 RNA의 정량화가 달성될 수 있는 또 다른 방법이다. 프라이머 확장은 역전사 효소를 이용하여 프라이머를 확장시킴으로써, 특정 RNA의 5' 말단을 매핑하는데 추가의 이점을 제공한다. 이 경우, 프라이머는 바이오마커 mRNA의 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 (또는 제한 단편)이다. 프라이머는 말단-표지되고, 주형 바이오마커 mRNA에 혼성화될 수 있다. 일단 혼성화되면, 프라이머는 역전사 효소의 첨가 및 주형 바이오마커 mRNA에 상보적인 단일-가닥 DNA에 대한 비표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의해 확장된다. 그 다음, DNA를 시퀀싱 겔 (sequencing gel) 상에서 분석하고, 확장된 프라이머의 길이는 mRNA의 5' 위치를 맵핑하는 역할을 하며, 확장된 산물의 수율은 시료 내의 RNA의 존재량을 반영한다 (Jones et al., (1985) Cell 42: 559-572 and Mierendorf R. C. And Pfeffer, D. (1987). Methods Enzymol. 152: 563-566).
RNase 보호 분석법은 낮은 존재량에서도 바이오마커 RNA를 정량화하는 매우 민감한 방법을 제공한다. 보호 분석법에서, 높은 특이적 활성을 갖는 바이오마커 RNA에 상보적인 리보뉴클레오티드 탐침의 서열-특이적 혼성화가 발생되고, 시료 RNA에 혼성화된다. 그 다음, 혼성화 반응을 리보뉴클레아제로 처리하여 유리 탐침을 제거하고, 시료 RNA의 상동 바이오마커 서열에 혼성화된 어닐링된 탐침의 손상되지 않은 단편을 남긴다. 그 다음, 적당한 크기의 탐침 단편이 시각화될 때 시퀀싱 겔 상에서 전기영동에 의해 단편을 분석한다 (Zinn K. et al., (1983) Cell 34: 865-879 and Melton S. A., et al., (1984). Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056).
RT-PCR은 바이오마커 발현을 분석할 수 있는 또 다른 방법이다. RT-PCR은 바이오마커 mRNA에 상보적인 데옥시뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 역전사 효소를 이용하여 RNA 시료로부터 cDNA를 제조한다. 일단 cDNA가 생성되면, 고온에서 기능하는 DNA 중합효소 및 데옥시뉴클레오티드를 첨가하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 통해 증폭된다. 프라이머 어닐링의 반복 주기를 통해, cDNA 확장을 촉진시키는 옥시뉴클레오티드의 혼입, 가닥 변성, 원하는 서열의 증폭이 일어나고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 검출될 수 있는 적당한 크기의 단편을 생성한다. 최적의 역전사, 혼성화 및 증폭 조건은 사용된 프라이머 및 표적(들)의 서열 조성 및 길이(들), 및 의사에 의해 선택한 실험 방법에 따라 달라질 것이다. 적당한 프라이머 서열 및 혼성화 조건을 선택하기 위해 다양한 지침이 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Volumes 1-3) Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
인-시츄(In-situ) 혼성화는 세포/조직 특이적 바이오마커 RNA 발현을 검출하고 위치화하는데 사용될 수 있다. 표지된 항-센스 RNA 탐침은 세포에서 단독으로 또는 처리된 조직 조각에서 mRNA에 혼성화되어, 현미경 유리 슬라이드 상에 고정되어 있다 (In Situ Hybridization: Medical Applications (eds. G. R. Coulton and J. de Belleroche), Kluwer Academic Publishers, Boston (1992); In Situ Hybridization: In Neurobiology; Advances in Methodology (eds. J. H. Eberwine, K. L. Valentino, and J. D. Barchas), Oxford University Press Inc., England (1994); and In Situ Hybridization: A Practical Approach (ed. D. G. Wilkinson), Oxford University Press Inc., England (1992)). a) 형광-기반 직접 검출 방법, b) 형광 검출 방법과 결합된 디곡시게닌(digoxigenin)-표지된 DNA 탐침 및 비오틴(biotin)-표지된 DNA 탐침의 사용, 및 c) 항체-효소 검출 방법과 결합된 디곡시게닌-표지된 DNA 탐침 및 비오틴-표지된 DNA 탐침의 사용을 포함하여, 표지된 DNA 탐침을 시각화하기 위하여, 다수의 비-동위원소(non-isotopic) 시스템이 개발되었다. 형광-표지된 안티-센스 RNA 탐침이 세포 RNA에 혼성화될 때, 형광 현미경을 이용하여 혼성화된 탐침을 직접 관찰할 수 있다. 핵산 탐침의 직접 형광색소-표지화(fluorochrome-labelling)는 신속한 처리를 가능하게 하고 비-특이적인 배경 신호도 감소시키는 다층 검출 과정 (예를 들어, 항체-기반-시스템)의 필요성을 제거함으로써, 바이오마커 유전자 발현을 확인하는 다양하고 고도로 민감한 방법을 제공한다.
칩 혼성화는 마이크로어레이로 설계된 나일론 여과기, 유리 슬라이드 또는 실리콘 칩 (Schena et al. (1995) Science 270:467-470)과 같은 미립자 고체상으로 이루어질 수 있는 고체 기질에 부착된 바이오마커 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 마이크로어레이는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 유전자 산물 (예를 들어, cDNAs)의 서열에 해당하는 탐침이 바이오마커 유전자 발현을 검출하기 위한 알려진 위치에서 특이적으로 혼성화되거나 또는 결합될 수 있는 표면으로 이루어진다.
혼성화 복합체의 정량화는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 여러 방법 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예를 들어 임의의 방사성 태그, 형광 태그, 생물학적 태그 또는 효소적 태그, 또는 당해 기술분야의 표준 사용의 표지의 검출에 기초한다. 표지는 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 생물학적 시료로부터 유래된 RNA에 적용될 수 있다.
일반적으로, mRNA 정량화는 정확한 mRNA 측정을 가능하게 하기 위해 검정 곡선(calibration curve)과 함께 적당하게 수행된다. 또한, 생물학적 시료로부터 유래된 전사물(들)의 정량화는 바람직하게는 정상 시료와의 비교에 의해 수행되며, 이 시료는 시험된 전사물(들)의 정상 발현 패턴을 특징으로 한다.
8.6 바이오마커 값의 유도
바이오마커 값은 피험자에 대해 직접 측정된 바이오마커의 값인 측정된 바이오마커 값일 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어 하나 이상의 측정된 바이오마커 값에 함수를 적용함으로써 하나 이상의 측정된 바이오마커 값으로부터 유도된 값인 "유도된" 바이오마커 값일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 함수가 적용된 바이오마커는 "유도된 바이오마커"라고 한다.
바이오마커 값은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다수의 방법 중 어느 하나에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 값 결정에 대한 포괄적인 기재는 국제특허 공개 번호 WO　2015/117204에서 확인될 수 있으며, 전체 참조로 본 명세서에 포함된다. 일 예에서, 바이오마커 값을 결정하는 방법은 예를 들어 피험자 또는 피험자로부터 얻은 시료(들)에 대한 시험을 수행함으로써 바이오마커 값을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
그러나, 더 일반적으로, 바이오마커 값을 결정하는 단계는 전자 처리 장치가 이전에 측정되었거나 또는 유도되었던 바이오마커 값을 수신하거나 또는 얻는 단계를 포함한다. 이는 예를 들어, 원격 데이터베이스와 같은 데이터 저장으로부터 바이오마커 값을 검색하는 단계, 입력 장치를 이용하여 수동으로 입력된 바이오마커 값을 얻는 단계 등을 포함할 수 있다. 적당하게는, 지표는 다수의 바이오마커 값의 조합을 이용하여 결정될 수 있으며, 상기 지표는 Th1 면역 상태를 적어도 부분적으로 나타낸다. 상기 방법이 전자 처리 장치를 이용하여 수행된다고 가정하면, 지표의 표시는 임의로 표시되거나 또는 그 반대로 사용자에게 제공된다.
일 실시예에서, 바이오마커 값을 덧셈, 곱셈, 뺄셈 또는 나눗셈으로 바이오마커 값을 조합하여 지표 값을 결정한다. 이 단계는 다수의 바이오마커 값을 하나의 지표 값으로 결합할 수 있도록 수행되어, 지표가 해석되어 피험자의 Th1 면역 상태를 결정하는데 사용되는 보다 유용하고 간단한 기전을 제공한다.
이러한 맥락에서, 상기 기재된 방법 내에서 사용된 바이오마커는 최소한의 수의 바이오마커 (예를 들어, 적어도 하나의 바이오마커)를 포함하는 Th1 면역 상태에 대한 바이오마커 프로파일을 정의할 수 있는 반면, 바이오마커 프로파일이 임상적으로 적절한 결정을 내리는데 사용될 수 있도록 충분한 성능을 유지할 수 있음을 이해할 것이다. 사용된 바이오마커의 수를 최소화하면 진단 또는 예후 검사의 수행과 관련된 비용을 최소화할 수 있으며, 폴리펩티드 바이오마커의 경우, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 및 면역조직화학과 같은 비교적 간단한 기법을 이용하여 시험을 수행할 수 있으며, 시험을 임상 환경에서 신속하게 수행할 수 있게 한다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제공되는 표시는 지표 값의 그래프 또는 영숫자의 표시일 수 있다. 그러나, 대안적으로, 표시는 지표 값을 미리 정의된 기준치 또는 범위와 비교한 결과일 수 있으며, 또는 대안적으로 Th1 면역 상태를 나타낼 수 있다.
또한, 단일 지표 값을 산출하는 것은 임상의 또는 다른 의료 종사자가 시험 결과를 쉽게 해석할 수 있으므로, 임상 환경에서 신뢰할 수 있는 진단을 위해 시험을 사용할 수 있다.
단지 예시로서, 지표-결정 방법은 적당하게는 적어도 하나의 바이오마커 값을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 값은 피험자의 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 측정되거나 또는 유도된 값이며, 피험자로부터 채취한 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커의 농도 또는 존재량을 적어도 부분적으로 나타내며, 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커는 APCs (예를 들어, 수지상 세포) 및 종양 세포를 포함하는 IEC-상호 작용 세포의 PD-L2를 포함한다. 적당하게는, Th1 면역 상태 바이오마커 프로파일은 Th1 면역 상태 바이오마커로서 APCs (예를 들어, 수지상 세포) 또는 종양 세포와 같은 IEC-상호 작용 세포의 PD-L1을 더 포함한다. 바이오마커 값은 일반적으로 피험자의 Th1 면역 상태의 결정에 사용하기 위한 지표를 결정하는데 사용된다. 일 실시예에서, 지표는 한 쌍의 Th1 면역 상태 바이오마커 (예를 들어, PD-L2 및 PD-L1)의 농도의 비를 나타낸다. 따라서, 바이오마커 값이 Th1 면역 상태 바이오마커의 농도를 나타내는 경우, 유도된 바이오마커 값은 일반적으로 (배타적이지는 않지만) 바이오마커 값의 비에 기초할 것이다.
그 다음, 당해 기술분야에 일반적으로 알려지고 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 유도된 바이오마커 값은 지표 값으로서 유도된 바이오마커 값을 이용하거나, 또는 유도된 바이오마커 값을 기준 등과 비교하는 것과 같은 부가적인 처리를 수행함으로써, 지표를 결정하는데 사용된다.
유도된 바이오마커 값은 부가 모델; 선형 모델; 지지체 벡터 기계; 신경망 모델; 랜덤 포레스트 모델; 회귀 모델; 유전자 알고리즘; 어닐링 알고리즘; 가중치 합; 최근접 이웃 모델; 및 확률 모델과 같은 결합 함수를 이용하여 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 바이오마커 값은 PD-L2 및 PD-L1에 대해 측정되거나 또는 유도되며, 지표는 바이오마커 값을 조합하여 결정된다. 일 실시예에서, 지표는 지표 기준과 비교되며, Th1 면역 상태는 비교 결과에 따라 결정된다. 지표 기준은 기준 집단에서 다수의 개체에 대해 결정된 지표로부터 유도될 수 있다. 기준 집단은 일반적으로 상이한 특성을 갖는 개체, 예를 들어 상이한 성별 및/또는 인종 (ethnicities)의 다수의 개체를 포함하며, 상이한 군은 상이한 특성에 기초하여 정의되고, 피험자의 지표는 유사한 특성을 갖는 개체로부터 유도된 지표 기준과 비교된다. 또한, 기준 집단은 다수의 건강한 개체, 향상된 Th1 면역 상태를 갖는 것으로 알려진 다수의 개체, 감소된 또는 결핍된 Th1 면역 상태를 갖는 것으로 알려진 다수의 개체, 암, 적당하게는 전이성 암의 임상 징후를 나타내는 다수의 개체, 또는 병원성 감염 (예를 들어, 말라리아)의 임상 징후를 나타내는 다수의 개체를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 지표-결정 방법은 적당하게는 프로그래밍된 컴퓨터 시스템 등과 같은 적어도 하나의 전자 처리 장치를 이용하여 수행된다. 이 경우, 전자 처리 장치는 일반적으로 측정 또는 다른 정량화 장치로부터 이를 수신하거나, 또는 데이터베이스 등으로부터 이들을 검색함으로써, 적어도 하나의 측정된 바이오마커 값을 얻는다. 그 다음, 처리 장치는 임의의 적당한 방법에 의해, 예를 들어 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커의 농도 비를 나타내는 값을 계산함으로써 지표를 결정한다.
그 다음, 처리 장치는 예를 들어 지표의 기호 또는 영숫자 표시, 지표와 하나 이상의 지표 기준의 비교의 그래프 표시 또는 피험자의 Th1 면역 상태의 영숫자 표시를 생성함으로써 지표의 표시를 생성할 수 있다.
본 발명의 지표-결정 방법은 일반적으로 Th1-관련 질환 (예를 들어, 병원성 감염 또는 암)의 적어도 하나의 임상 징후를 갖는 피험자로부터 시료를 얻는 단계로서, 시료는 하나 이상의 Th1 면역 상태 바이오마커 (예를 들어, PD-L2 및 임의로 PD-L1)를 포함하는, 단계; 및 시료 내의 Th1 면역 상태 바이오마커 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 정량화하거나 또는 평가하여 바이오마커 값을 결정하는 단계를 포함한다. 이는 임의의 적당한 기법을 이용하여 달성될 수 있으며, Th1 면역 상태 바이오마커의 특성에 의존할 것이다. 적당하게는, 개개의 측정되거나 유도된 Th1 면역 상태 바이오마커 값은 각각의 Th1 면역 상태 바이오마커의 수준, 존재량 또는 양 또는 그 수준 또는 양에 적용되는 기능에 해당한다. 예를 들어, 다수의 Th1 면역 상태 바이오마커를 사용하는 본 발명의 지표-결정 방법의 일 실시예에서의 지표가, 폴리펩티드의 농도 비에 기초하는 경우, 이 방법은 일반적으로 면역형광을 포함하여 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 또는 기능성 분석법에 의해 폴리펩티드를 정량화하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 피험자의 Th1 면역 상태는 하나 이상의 Th1 면역 상태 바이오마커 값을 결정함으로써 확립되며, 여기서 개개의 Th1 면역 상태 바이오마커 값은 피험자 또는 피험자로부터 얻은 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 측정되거나 또는 유도된 값을 나타낸다. 이러한 바이오마커를 본 명세서에서 "시료 Th1 면역 상태 바이오마커"라고 한다. 본 발명에 따라, 시료 Th1 면역 상태 바이오마커는 기준 Th1 면역 상태 바이오마커 (본 명세서에서 "상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커"라고도 함)에 상응한다. "상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커"는 예를 들어 서열번호 1 (PD-L2) 및 서열번호 56 (PD-L1)에 제시된 기준 Th1 면역 상태 바이오마커와 구조적으로 및/또는 기능적으로 유사한 Th1 면역 상태 바이오마커를 의미한다. 대표적인 상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커는 기준 Th1 면역 반응 바이오마커 유전자의 대립형질 변이체(allelic variants) (동일한 유전자좌(locus)), 동족체(homologues) (상이한 유전자좌), 및 이종상동체(orthologues) (상이한 유기체)의 발현 산물을 포함한다. 기준 Th1 면역 상태 바이오마커 유전자 및 인코딩된 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드의 핵산 변이체는 뉴클레오티드 치환, 결실, 역위(inversions) 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이(Variation)는 코딩 영역 및 비-코딩 영역 중 하나 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 변이는 보존적 아미노산 치환 및 비-보존적 아미노산 치환을 모두 생성할 수 있다 (인코딩된 산물과 비교하여). 뉴클레오티드 서열의 경우, 보존적 변이체는 유전자 코드의 퇴화 때문에 기준 Th1 면역 상태 폴리펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커는 기준 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적 서열 유사성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 기준 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나에서 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 유사성 또는 동일성을 나타낼 것이다.
일 실시예에서, 서열 간의 서열 유사성 또는 서열 동일성의 계산은 하기와 같이 수행된다:
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 백분율 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다 (예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 비-상동 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 일 실시예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 적어도 30%, 일반적으로는 적어도 40%, 더 일반적으로는 적어도 50%, 60%, 및 더욱 더 일반적으로는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%의 기준 서열의 길이이다. 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 아미노산 서열 비교를 위해, 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치에서 동일하거나 또는 유사한 아미노산 잔기 (즉, 보존적 치환)에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 유사하다.
두 서열 간의 백분율 동일성은 개별 위치에서 서열에 의해 공유되는 동일한 아미노산 잔기의 수의 함수이며, 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 대조적으로, 두 서열 간의 백분율 유사성은 개별 위치에서 서열에 의해 공유되는 동일하고 유사한 아미노산 잔기의 수의 함수이며, 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있다.
서열의 비교 및 서열 간의 백분율 동일성 또는 백분율 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 특정 실시예에서, 아미노산 서열 간의 백분율 동일성 또는 유사성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 이용한, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com 에서 이용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) 알고리즘을 이용하여 결정된다. 특정 실시예에서, 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 이용한, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com 에서 이용 가능)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정된다. 매개변수의 비-제한적인 세트 (및 달리 명시하지 않는 한 사용되어야 하는 매개변수)는 12의 갭 패널티, 4의 갭 확장 페널티(gap extend penalty), 및 5의 프레임이동 갭 패널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 포함한다.
일 실시예에서, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성 또는 유사성은 PAM120 중량 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 이용한, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (1989, Cabios, 4: 11-17)을 이용하여 결정된다.
본 명세서에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하는 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al., (1990, J Mol Biol., 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행되어 본 발명의 53010개의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul et al., (1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402)에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수(default parameter)가 사용될 수 있다.
또한, 상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드는 하기에 기재된 가혹 조건 하에서, 기준 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 보체(complements)와 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "낮은 가혹 조건, 중간 가혹 조건, 높은 가혹 조건, 또는 매우 높은 가혹 조건 하에서 혼성화한다"는 혼성화 및 세척에 대한 조건을 기재한다. "혼성화"는 본 명세서에서 DNA-DNA 혼성체(hybrid) 또는 DNA-RNA 혼성체를 생성하기 위한 상보적인 뉴클레오티드 서열의 쌍을 나타내는 것으로 사용된다. 상보적인 염기 서열은 염기-쌍 규칙에 의해 관련된 서열이다. DNA에서, A는 T와 쌍을 이루고 C는 G와 쌍을 이룬다. RNA에서, U는 A와 쌍을 이루고 C는 G와 쌍을 이룬다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 용어 "정합(match)" 및 "부정합(mismatch)"은 상보적인 핵산 가닥에서 한 쌍의 뉴클레오티드의 혼성화 가능성을 나타낸다. 정합된 뉴클레오티드는 상기한 고전적 A-T 및 G-C 염기쌍과 같이 효율적으로 혼성화 한다. 부정합은 효율적으로 혼성화하지 않는 뉴클레오티드의 다른 조합이다.
혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 Ausubel et al., (1998, supra), Sections 6.3.1-6.3.6에서 확인할 수 있다. 수성 및 비-수성 방법은 이 참고 문헌에 기재되어 있으며, 어느 하나의 방법이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 낮은 가혹 조건의 기준은, 42℃에서 혼성화를 위해 적어도 약 1% v/v 내지 적어도 약 15% v/v 포름아미드 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함하고, 42℃에서 세척을 위해 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함한다. 또한, 낮은 가혹 조건은 65℃에서 혼성화를 위해 1% 소혈청알부민 (BSA), 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO4 (pH 7.2), 7% SDS, 및 실온에서 세척을 위해 (i) 2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40　mM NaHPO4 (pH 7.2), 5% SDS를 포함할 수 있다. 낮은 가혹 조건의 하나의 실시예는 약 45℃에서 6×염화나트륨/시트르산 나트륨(sodium chloride/sodium citrate; SSC)에서 혼성화한 다음, 적어도 50℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척한다 (낮은 가혹 조건 동안 세척 온도는 55℃까지 증가시킬 수 있다). 중간 가혹 조건은 42℃에서 혼성화를 위해 적어도 약 16% v/v 내지 적어도 약 30% v/v 포름아미드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M 염을 포함하고, 55℃에서 세척을 위해 적어도 약 0.1M 내지 적어도 약 0.2M 염을 포함한다. 또한, 중간 가혹 조건은 65℃에서 혼성화를 위해 1% 소혈청알부민 (BSA), 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO4 (pH 7.2), 7% SDS, 및 60-65℃에서 세척을 위해 (i) 2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40　mM NaHPO4 (pH 7.2), 5% SDS를 포함할 수 있다. 중간 가혹 조건의 하나의 실시예는 약 45℃에서 6×SSC에서 혼성화한 다음, 60℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척한다. 높은 가혹 조건은 42℃에서 혼성화를 위해 적어도 약 31% v/v 내지 적어도 약 50% v/v 포름아미드 및 약 0.01M 내지 약 0.15M 염을 포함하고, 55℃에서 세척을 위해 약 0.01M 내지 약 0.02M 염을 포함한다. 또한, 높은 가혹 조건은 65℃에서 혼성화를 위해 1% BSA, 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO4 (pH 7.2), 7% SDS, 및 65℃ 이상의 온도에서 세척을 위해 (i) 2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40　mM NaHPO4 (pH 7.2), 1% SDS를 포함할 수 있다. 높은 가혹 조건의 하나의 실시예는 약 45℃에서 6×SSC에서 혼성화한 다음, 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척한다.
특정 실시예에서, 상응하는 Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드는 매우 높은 가혹 조건 하에서, 개시된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열번호 3 또는 서열번호 4)과 혼성화하는 것이다. 매우 높은 가혹 조건의 하나의 실시예는 65℃에서 0.5 M 인산 나트륨, 7% SDS에서 혼성화한 다음, 65℃에서 0.2×SSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척한다.
기타 가혹 조건은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자는 다양한 인자를 조작하여 혼성화의 특이도를 최적화할 수 있음을 인식할 것이다. 최종 세척의 가혹함의 최적화는 높은 정도의 혼성화를 보장하는 역할을 할 수 있다. 상세한 예는, Ausubel et al., supra at pages 2.10.1 to 2.10.16 및 Sambrook et al. (1989, supra) at sections 1.101 to 1.104 참조.
9. 키트
본 발명의 Th1 면역 상태 바이오마커를 검출하고 정량화하는데 필요한 모든 필수 시약은 키트에서 함께 조립될 수 있다. 일 실시예에서, 키트는 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화를 가능하게 하는 시약을 포함한다. 일 실시예에서, 키트는 (i) 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화 (예를 들어, 존재량 또는 수준의 결정)를 허용하는 시약; 및 (ii) 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화 (예를 들어, 존재량 또는 수준의 결정)를 허용하는 시약을 포함한다. 일 실시예에서, 키트는 (iii) 제 3 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화 (예를 들어, 존재량 또는 수준의 결정)를 허용하는 임의의 시약; 및 (iv) 제 4 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화 (예를 들어, 존재량 또는 수준의 결정)를 허용하는 임의의 시약을 더 포함한다. 적당하게는, Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L2 및 PD-L1 중 하나 또는 둘 모두이다.
본 발명의 내용에서, "키트"는 이들의 수송 및 저장을 허용하기 위해 포장된, 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 상이한 시약을 함유하는 생성물을 의미하는 것으로 이해된다. 키트의 구성 요소를 포장하기에 적합한 물질은 수정 (crystal), 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 봉투 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 키트는 키트에 함유된 상이한 성분의 동시, 순차적 또는 별도의 사용을 위한 설명서를 함유할 수 있다. 설명서는 인쇄물의 형태일 수 있거나 또는 전자 저장 매체 (자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체 (예를 들어, CD-ROM, DVD) 등과 같이 피험자가 설명서를 판독할 수 있도록 설명서를 저장할 수 있는 전자 기술 지원(electronic support) 형태일 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 매체는 설명서를 제공하는 인터넷 주소를 함유할 수 있다.
Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화를 허용하는 시약은 Th1 면역 상태 바이오마커의 정량화를 허용하는 화합물 또는 물질, 또는 화합물들 또는 물질들의 세트를 포함한다. 특정 실시예에서, 화합물, 물질 또는 화합물들 또는 물질들의 세트는 폴리펩티드 (즉, PD-L2 폴리펩티드)의 수준 또는 존재량을 결정할 수 있다.
또한, 키트는 임의로 표지의 검출을 위한 적당한 시약, 양성 대조군 및 음성 대조군, 세척 용액, 블롯팅 막, 미세역가 플레이트, 희석 완충제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질-기반 검출 키트는 (i) Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드 (예를 들어, 양성 대조군으로 사용될 수 있는, PD-L2 폴리펩티드 및 임의로 PD-L1 폴리펩티드), (ii) Th1 면역 상태 바이오마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로 핵산-기반 검출 키트는 (i) Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 양성 대조군으로 사용될 수 있는, PD-L2 폴리뉴클레오티드 및 임의로 PD-L1 폴리뉴클레오티드), (ii) Th1 면역 상태 바이오마커 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 탐침을 포함할 수 있다. 또한, 증폭을 위해 필요한 반응 혼합물을 제공하기 위하여, 다양한 중합효소 (사용된 핵산 증폭 기법에 따라, 역전사 효소, Taq, Sequenase™, DNA 리가제 등), 데옥시뉴클레오티드 및 완충제를 포함하는 핵산 증폭에 적합한 효소가 포함될 수 있다. 또한, 이러한 키트는 일반적으로 각각의 개별 시약 및 효소, 및 각각의 프라이머 또는 탐침에 대해 별개의 용기를 적당한 방법으로 포함할 것이다.
특정 실시예에서, 키트는 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 면역-조절제를 더 포함한다.
또한, 키트는 본 명세서에 기재된 분석법 중 하나를 수행하기 위한 다양한 장치 (예를 들어, 하나 이상) 및 시약 (예를 들어, 하나 이상); 및/또는 이 키트를 이용하여 Th1 면역 상태 바이오마커 유전자의 발현을 정량화하기 위한 인쇄된 설명서를 특징으로 할 수 있다;
검출가능한 표지와 임의로 관련될 수 있는 본 명세서에 기재된 시약은, 실시예 또는 하기에 기재된 분석법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 RT-PCR 또는 Q PCR 기법과 함께 사용하기에 적합한 미세유체역학 카드(microfluidics card), 칩 또는 챔버, 마이크로어레이 또는 키트의 형태로 제시될 수 있다.
10. 진단 방법
지표는 피험자가 바람직하지 않은 Th1 면역 반응 상태와 관련된 질환을 가질 가능성을 결정하는데 사용될 수도 있다. 이 경우, 이는 일반적으로 지표를 적어도 하나의 지표 기준과 비교하고 (지표 기준은 질환을 나타냄), 비교 결과에 따라 가능성을 결정함으로써 달성될 것이다. 본 발명에 따른 진단 및 치료에 유용한 Th1-관련 질환의 비-제한적인 예는, 본 명세서에서 예시된 바와 같이, 감염성 질환 (특히, 바이러스성 감염) 및 증식성 장애 (예를 들어, 전이성 암)을 포함한다.
이러한 유형의 실시예에서, 적어도 하나의 지표 기준은 기준 집단에 대해 결정된 지표의 분포이다. 예를 들어, 만일 피험자가 병원성 감염 (예를 들어, 간염 바이러스, 아스페르길루스와 같은 진균 감염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 말라리아, 장티푸스, 콜레라, 포진 바이러스(herpes viruses), 클라미디아(chlamydia), 및 HPV)의 임상 증상을 나타내면, 동일하거나 또는 유사한 질환을 가진 개체로 이루어진 기준 군을 사용하여 피험자의 지표를 비교할 것이다.
일 실시예에서, 피험자가 질환을 가질 가능성에 대한 결정은 하나 이상의 기준 군의 개체를 사용하여 이루어진다. 예를 들어, 제 1 기준 군은 관심있는 질환을 갖는 것으로 이전에 진단되고 알려진 개체로 이루어지며, 제 2 기준 군은 건강한 상태로 진단된 개체로 이루어진다.
다른 실시예에서, Th1-관련 질환은 임의의 임의의 악성 또는 전-악성 질병을 포함하는 증식성 또는 과증식성 질병, 또는 신체의 임의의 세포 또는 조직의 증식능(proliferative capacity) 또는 행동의 기능적 또는 기타 장애 또는 이상으로부터 발생하거나 또는 유래된 또는 이와 관련된 임의의 질환이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 암이 전이성 암인지의 가능성 여부를 평가하는 단계를 포함하여 암을 진단하는데 사용될 수 있다.
도 1은 세포 표면 상의 바이오마커 발현을 특징으로 하는 FACS 분석으로부터의 그래프 표시 출력이다. DCs 상에서의 PD-L2 발현은 인간에서의 말라리아 기생충혈증(parasitemia)과 역 상관관계가 있다. (A-C) 7명의 건강한 인간 지원자에게 P. 팔시파룸(falciparum)을 접종하고, 감염 전과 감염 후 7일에, CD11c+ DC 발현 (A) PD-L1 및 (B) PD-L2의 백분율에 대해 혈액을 검사하였다. (C) ㎖의 혈액 당 기생충의 수 대 %PD-L2: %PD-L1 DC의 비를 나타내는 플롯. R101 내지 R108은 각 지원자를 나타낸다. p 값은 전체 기울기가 0이라는 귀무가설(null hypothesis)을 시험하고 있다.
도 2는 (A) 최대 40일 동안 관찰된, 비-치사(non-lethal) P. 차바우디 (chabaudi) 또는 P. 요엘리이(yoelii) 17XNL 말라리아로 감염된 마우스에서의 일반적인 감염 경로에 대한 평균 % 기생충혈증, 및 (B) 10일 동안 관찰된, 치사 (lethal) P. 요엘리이(yoelii) YM 또는 P. 베르게이(berghei)로 감염된 마우스에서의 일반적인 감염 경로에 대한 평균 % 기생충혈증을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 SEM (n = 4-8)을 나타낸다.
도 3은 (A) 총 CD11c+ DC 발현 PD-L1의 백분율 및 (B) 감염되지 않은 마우스 및 감염된 마우스 (감염 후 7일)의 PD-L1+　CD11c+ 비장 DCs 상에서 표면 PD-L1-발현의 평균 형광 강도 (Mean Fluorescence Intensity, MFI), (C) 총 CD11c+ DC 발현 PD-L2의 백분율 및 (D) 감염되지 않은 마우스 및 감염된 마우스 (감염 후 7일)의 PD-L2+　CD11c+ 비장 DCs 상에서 표면 PD-L2-발현의 MFI를 나타내는 그래프이다. 산점도(scatter plots)에 대한 막대는 평균값을 나타낸다. 대등한 0일 및 7일 인간 시료 사이의 유의성을 윌콕슨 부호순위 검정(Wilcoxon matched-pairs signed rank test)으로 분석하였다. 여러 군 간의 유의성은 터키의 다중 비교 시험과 함께 일원 분산 분석 (one way ANOVA)을 이용하여 분석하였다. (* p < 0.05; ** p < 0.01; ***　p < 0.001; **** p < 0.0001은 군 간의 비교를 위한 것이다). (A) 및 (C)의 자료는 유사한 결과가 얻어진 합동 독립 실험(pooled independent experiments)을 나타낸다.
도 4는 치사 및 비-치사 말라리아로부터의 DCs 상에서 PD-L1 및 PD-L2 발현 수준을 나타내는 그래프이다. (A)-(E) (A) 감염되지 않은 마우스 및 말라리아 균주 (B) 비-치사 P.　요엘리이 17XNL 또는 (C) 비-치사 P. 차바우디 (D) 치사 P. 요엘리이 YM 또는 (E) 치사 P. 베르게이로 감염된 마우스의 생존 가능한 CD19- CD3- D11c+ DCs 상에서 PD-L1, PD-L2 및 CD8 발현의 유동 세포 계측 프로파일. (F) 도 3B 및 3D에서 사용된 것과 다른 전압 설정을 갖는 다른 유동 세포 계측기에서 측정한, PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 감염되지 않은 마우스 및 감염된 마우스 (감염 후 7 일)의 CD11c+ 비장 DCs의 MFI에 대한 반복 실험. (G) (감염되지 않은 또는 P.　요엘리이 17XNL 및 YM으로 감염 7일째) DCs로부터 분리된 RNA로부터 PD-L1 및 PD-L2의 정량적 RT-PCR 분석. 결과는 3개의 하우스 키핑 유전자 (CxxC1, TBP 및 mRPL13A)의 기하 평균으로 표준화된다. 값은 3번의 독립 실험의 평균 ± SEM으로 나타내고, 감염되지 않은 마우스의 결과와 비교하여 나타낸다.
도 5는 PD-L2가 말라리아 감염으로부터 면역 및 생존을 향상시킴을 나타내는 그래프이다. (A-C) (A) PD-L2 ko 및 야생형 마우스 (n = 4) 또는 (B) 랫트 IgG 또는 항-PD-L2 차단 항체로 처리된 야생형 마우스 (n = 5)에서 P.　요엘리이 17XNL 말라리아의 일반적인 경로에 대한 평균 % 기생충혈증; 및 (C) 랫트 IgG 또는 항-PD-L2 차단 항체로 처리된 야생형 마우스 (n = 5)에서 P. 차바우디 말라리아의 일반적인 경로에 대한 평균 % 기생충혈증 (로그 척도로). 화살표는 기생충이 항-PD-L2-처리된 마우스보다 랫트 IgG-처리된 마우스에서 4일 전에 제거되었음을 나타낸다. 자료는 유사한 결과를 얻은 2개의 독립 실험 중 하나를 나타낸다. 특정 시점에서의 유의성은 양면 꼬리(2-sided tail)를 기반으로 한 비모수 맨-휘트니 U 검정 (non-parametric Mann-Whitney U test)을 이용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM (* p < 0.05; **　p < 0.005)을 나타낸다.
도 6은 P.　요엘리이 17XNL 말라리아 동안 PD-L2가 보호, 증상 및 Th1 면역을 조절함을 나타내는 그래프이다. (A-D) (A)-(B) 야생형 마우스 및 PD-L2 ko 마우스 (n = 5) 또는 (C)-(D) 랫트 IgG 또는 항-PD-L2 차단 항체로 처리된 야생형 마우스 (n = 5)에서 P.　요엘리이 17XNL 말라리아의 일반적인 경로 동안, 도 5A 및 5B에 대한 중복 실험으로부터 기생충혈증 및 임상 증상 점수. (E) 도 2C에 기재된 중복 실험에서 랫트 IgG 또는 항-PD-L2 차단 항체로 처리된 야생형 마우스 (n = 5)에서 P. 차바우디 말라리아의 일반적인 경로 동안 기생충혈증. 화살표는 기생충이 항-PD-L2-처리된 마우스보다 랫트 IgG-처리된 마우스에서 3일 전에 제거되었음을 나타낸다.
도 7은 하기를 나타내는 그래프이다: (A) 유동 세포 계측법에 의해 CD4+ T 세포에서 Tbet 발현을 평가하는데 사용되는 게이팅 전략(gating strategy). (B)-(C) 산점도는 랫트 IgG (n = 7) 또는 항-PD-L2 차단 항체 (n = 7)로 처리된 야생형 마우스에서 또는 14일 동안 P.　요엘리이 17XNL로 감염된 PD-L2 ko 마우스 (n = 3)에서, 비장 당 T 세포의 수를 나타낸다. (B) 비장 당 Tbet-발현 CD4+ CD62Lhi 또는 CD4+ CD62Llo T 세포의 평균 수. (C) 천연 DCs 존재 하에, 기생충 항원 (MSP119)에 반응하여 ELISPOT 배양물에서 IFN-γ를 분비하는 비장 당 CD4+ T 세포의 평균 수. (D) 산점도는 천연 DCs 존재 하에, 기생충 펩티드 (Pb1)에 반응하여 ELISPOT 배양물에서 IFN-γ를 분비하는 14일째에 비장 당 CD8+ T 세포의 수를 나타낸다. 한번 평가된 PD-L2 ko 마우스를 제외하고 2개의 독립 실험으로부터 자료를 모았다. 유의성은 양면 꼬리를 기반으로 한 비모수 맨-휘트니 U 검정을 이용하여 분석하였다 (* p < 005; *** p < 0001).
도 8은 P.　요엘리이 17XNL로 감염된 마우스에서 PD-L2의 차단이 기생충-특이적 CD4+ T 세포의 확장을 저해함을 나타내는 그래프이다. P.　요엘리이 17XNL로 감염되고 랫트 IgG 또는 항-PD-L2 차단 항체로 처리된 야생형 마우스 (n = 7). (A), (B), (C) (A) 0일; (B) 7일; 및 (C) 14일에 비장 당 Tbet-발현 CD4+ CD62Lhi 및 CD4+ CD62Llo T 세포의 수; (D) 천연 DCs의 존재 하에, 기생충 항원 (MSP119)에 반응하여 ELISPOT 배양물에서 인터페론-γ (IFN-γ)를 분비하는 CD4+ T 세포의 수. (E) EdU의 결합에 의해 측정된, 천연 DCs의 존재 하에 기생충 항원 MSP119에 반응하여 배양물에서 증식된 CD4+ T 세포의 수; (F) 및 (G) P.　요엘리이 17XNL-감염된 마우스의 혈청에서 (F) IFN-γ 및 (G) IL-10의 평균 수준. (H) 비장 당 CD25 및 FoxP3를 발현하는 CD4+ T 세포 (조절 T 세포)의 평균 수. 산점도에 대한 막대는 중간값을 나타낸다. 자료는 2개의 합동 독립 실험을 나타낸다. 유의성은 양면 꼬리를 기반으로 한 비모수 맨-휘트니 U 검정을 이용하여 분석하였다 (* p < 0.05; **　p　<　0.01; *** p < 0.001).
도 9는 T 세포 및 면역에 대한 DC-발현된 PD-L1 및 PD-L2의 차별 효과를 나타내는 그래프이다. (A) 야생형; 및 (B) 치사 P.　요엘리이 YM 감염 7일째에 취하고 DC 하위-집단의 마커들 (CD4+; CD8+; B220+ pDC; 및 CD11b+ DC)로 표지된 PD-L1 ko 마우스의 CD19- CD3- CD11c+ DC의 유동 세포 계측 프로파일. (C) PD-L1 발현이 없는 DCs에 의한 치사 말라리아에 대한 보호를 나타내는 생존 곡선. 야생형 및 PD-L1 ko 마우스를 치사량의 104 P. 요엘리이 YM pRBC로 감염시키고, 감염된 (약물-치료된) 마우스로부터 DCs를 분리한 다음, 4마리의 감염되지 않은 마우스 군의 각 마우스로 1 x 107 DCs를 옮겼다 (중복 실험). 24시간 후, 각 마우스를 104 P. 요엘리이 YM pRBC로 감염시키고 50일 동안 1-3일마다 생존을 관찰하였다. (D)-(E) 치사 P. 요엘리이 YM 감염 7일째에 취해진, 야생형 및 PD-L1 ko 마우스로부터의 ~ 1 x 107 DC를 주입한 감염되지 않은 마우스의 기생충혈증의 중복 실험. 24시간 후, 각 주입된 마우스를 104 P. 요엘리이 YM pRBC로 감염시키고, 50일 동안 1-3일마다 관찰하였다. 결과는 평균 ± SEM, n = 4 마우스/군 이다. (I) PD-1 ko 마우스를 나타내는 생존 곡선은 치사 말라리아에 대한 면역이다. 5마리의 야생형 및 PD-1 ko 마우스의 군을 치사 104 P. 요엘리이 YM pRBC로 감염시키고 50일 동안 1-3일마다 생존을 관찰하였다 (중복 실험). (J)-(K) 50일 동안 1-3일마다 관찰된, 야생형 및 104 P. 요엘리이 YM pRBC로 감염된 PD-L1 ko 마우스의 기생충혈증의 중복 실험. 결과는 평균 ± SEM, n = 5 마우스/군 이다. (L)-(P) 36시간 후, PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 DCs로 배양된 CD4+ CD62Llo PD-1+ T 세포 상에서의 CD3 및 ICOS 발현의 유동 세포 계측 분석; 여기서, (L)은 DCs가 없는 T 세포만을 포함하는 음성 대조군이며; (M)은 T 세포 및 DCs를 포함하는 양성 대조군이고; (N) PD-1의 차단; (O) PD-L1의 차단; 및 (P) PD-L2의 차단이다. T 세포 및 DCs 모두 12-14일 동안 P. 요엘리이 17XNL로 감염된 마우스의 비장으로부터 분리되었다. 높은 CD3 또는 ICOS 발현을 결정하는 게이트는 항-PD-L1 배양물에서 발견되는 선명한 이중 피크에 기초하여 선택되었다. (Q) 3개의 독립 실험에서 복제 웰 (n = 3 - 5)에서 높은 CD3 및 ICOS 발현과 함께 CD4+ CD62lo T 세포/웰의 백분율을 나타내는 산점도가 흰색, 연한 파란색 및 어두운 파란색 점으로 나타났다. 오차 막대는 평균을 나타낸다. 유의성은 3개의 실험 중 하나에서 비쌍체 t-검정(unpaired t-test) 일면 꼬리(one-sided tail)을 이용하여 분석하였다 (* p < 0.05; **　p < 0.005; *** p < 0.0005; **** p < 0.0001).
도 10은 전이성 흑색종 환자에서 혈액 DCs 상의 PD-L2 발현이 감소됨을 나타내는 그래프이다. (A-C) 8명의 건강한 인간 지원자, 4명의 비-흑색종 병변이 있는 환자 및 4명의 전이성 흑색종 환자로부터 혈액을 채취하였다. CD11c+ DC 발현 (A) PD-L1 및 (B) PD-L2의 백분율에 대해 이들의 혈액을 검사하였다. (C) 각 군에서 %PD-L2: %PD-L1 DCs의 비를 나타내는 플롯. 각 군과 (C) 사이의 맨-휘트니 검정에 사용된 (A)와 (B)의 P 값은 크루스칼 왈리스Kruskal-Wallis) 다중 비교 검정에 의해 계산되었다.
도 11은 PD-L2의 팔량체 형태가 치사 말라리아로부터 보호함을 나타내는 그래프이다. (A) 평균 % 기생충혈증; (B) 기생충혈증을 가진 마우스의 수를 나타내는 로그-척도; (C) 생존 (감염 후 일수를 나타내는 x-축); (D) 감염 후 3일, 5일 및 7일에 음성 대조군 (인간) IgG 또는 이량체 PD-L2로 처리된 야생형 마우스에서 P. 요엘리이 YM 말라리아의 일반적인 경로에 대한 % 기생충혈증; 및 (E) 3일, 5일 및 7일에 검출가능한 기생충혈증 후에 대조군 (인간) IgG 또는 PD-L2로 처리된 야생형 마우스에서 P. 요엘리이 YM 말라리아의 일반적인 경로에 대한 임상 증상 점수 (감염 후 일수를 나타내는 x-축) (3개의 독립 실험으로부터, 총 n = 12). 생존한 모든 마우스는 휴식을 취하였고 150일 후에, 새로운 연령대의 대조군 마우스 (대조군 Ig-R)와 함께 동일한 용량의 치사 P. 요엘리이 YM 말라리아로 재투여하였다 (추가 PD-L2를 투여하지 않음). (F) P. 요엘리이 YM으로 재투여한 후 20일에 (감염 후 일수를 나타내는 x-축), PD-L2-처리된 마우스로부터 200 μL 혈액을 받은 감염되지 않은 마우스에서의 피크 % 기생충혈증. 이 분석법은 공여자 마우스의 혈액에서 적은 수의 기생충을 검출한다. (G) 임상 증상 점수, (H) 생존 (감염 후 일수를 나타내는 x-축), 및 (I) 감염 후 3일, 5일 및 7일에 대조군 (인간) IgG 또는 PD-L2로 처리된 야생형 마우스에서 P. 베르게이 감염의 일반적인 경로에 대한 평균 % 기생충혈증 (감염 후 일수를 나타내는 x-축) (2개의 독립 실험으로부터, 총 n = 9). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정 (Log-rank (Mantel-Cox) test)을 이용하여 생존의 유의성을 분석하였다.
도 12는 진행성 흑색종에 대한 가용성 십이량체(dodecameric) PD-L2 (sPD-L2)의 보호를 나타내는 그래프이다. 6마리의 C57BL/6 마우스의 군에게 5 x 105 B16.F0 흑색종 세포를 피하 이식하였다. 9일경, 평균 종양 크기가 ~100 mm3 일 때, 9일, 11일 및 13일에 마우스에게 200 ㎍의 인간 IgG 또는 sPD-L2를 투여하고, 1-2일마다 종양 크기를 관찰하였다. 자료는 유사한 결과가 얻어진 2개의 독립 실험 중 하나의 합동 독립 실험을 나타낸다. P 값은 일면 꼬리(1-sided tail)를 기반으로 한 비모수 맨-휘트니 U 검정을 이용하여 결정되었다. (*** p=0.0006은 군 간의 비교를 위한 것이다).
도 13은 sPD-L2에 의한 흑색종에 대한 조기 보호를 나타내는 그래프이다. 6마리의 C57BL/6 마우스의 군에게 1 x 105 B16.F0 흑색종 세포를 피하 이식하였다. 9일경, 평균 종양 크기가 ~100 mm3 일 때, 3일, 9일 및 15일에 마우스에게 200 ㎍의 인간 IgG 또는 sPD-L2를 투여하고, 1-2일마다 종양 크기를 관찰하였다. 자료는 유사한 결과가 얻어진 2개의 독립 실험 중 하나의 합동 독립 실험을 나타낸다. P 값은 일면 꼬리를 기반으로 한 비모수 맨-휘트니 U 검정을 이용하여 결정되었다. (*** p=0.03은 군 간의 비교를 위한 것이다).
본 발명을 용이하게 이해할 수 있고 실질적인 효과를 나타내기 위하여, 특정한 바람직한 실시예를 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 지금 기재할 것이다.
실시예
실시예 1
DCs의 PD-L2 발현은 인간에서의 말라리아 중증도와 역 상관관계가 있다.
PD-L1 및 PD-L2가 말라리아 면역에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 7명의 말라리아-없는 건강한 인간 지원자를 1800 P. 팔시파룸 (falciparum)에 감염된 적혈구 (pRBC)로 감염시키고, 감염 전 및 7일 후에 이들의 혈액을 검사하였다. 본 발명자들은 DCs 상에서의 PD-L1 및 PD-L2가 T 세포에 의한 면역 반응을 하향-조절할 수 있기 때문에 (Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-1266, 2003; Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-1034, 2000), 발병기전(pathogenesis)에서 이들의 중요한 역할 (Wykes and Good, Nat Rev Microbial 6, 864-867, 2008)을 고려하여, CD11c 발현에 의해 정의되는 DCs를 검사하였다. 7명의 지원자 모두에서, 90%의 DCs가 감염 전에 PD-L1을 발현하였으며, 감염 7일까지 이 리간드를 발현하는 DCs의 백분율에는 유의한 변화가 없었다 (도 1A). 이와 반대로, 80%의 DCs는 감염 전에 PD-L2도 발현하였지만, 감염 후 7일에 7명의 개체 중 5명이 유의하게 감소한 (17-57%) 백분율의 PD-L2+ DCs를 나타내었다 (도 1B). 특히, 감염 후 7일에 기생충혈증의 수준과 DCs 상에서의 백분율 PD-L2 대 PD-L1 발현의 비 간에 유의한 역 상관관계가 관찰되었다 (도 1C). 종합적으로, 면역 저해제로서 PD-L2의 일반적으로 인식되는 역할과는 반대로, PD-L2-발현 DCs의 높은 빈도가 관련되어 있음이 P. 팔시파룸으로 감염된 후 더 낮은 기생충혈증을 가진 개체에서 관찰되었다.
물질 및 방법
인간 연구
임상 시험의 수행 방법 (McCarthy et al., PLoS One. 6: e21914, 2011) (ClinicalTrials.gov identifier: NCT02389348) 및 기생충혈증을 정량화하는데 사용되는 PCR 방법 (Rockett et al., Malar. J. 10: 48, 2011)은 다른 곳에서 상세히 기재된다. 각 참가자는 정보에 입각한 동의를 하였다. 실험용 항-말라리아 치료제 OZ439 및 DSM265의 유효성을 평가하기 위하여, 연구에 참여한 19-55세 (중위 연령 (median age), 24세 {사분위수 범위(interquartile range), 21-37})의 8명의 건강한 지원자 중 7명 (n = 4 남성; 및 n = 3 여성)은 임상 시험 내에 내포된(nested) 이 하위-연구(sub-study)에 참여하기 위해 별도로 동의하였다. 이 연구는 QIMR 버그호퍼 의학연구소 (Berghofer Institute for Medical Research) (QIMR)의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았다. 지원자는 2.0 mL의 식염수의 정맥 내 주사를 통해 대략 1800 P. 팔시파룸 pRBCs를 받았다. 치료 시작을 위해 지정된 날인 7일에, 참가자들을 연구 병동에 입원시키고, 연구를 위해 혈액을 모은 후, 시험용 항-말라리아 약물 치료를 실시하였다.
실시예 2
DCs 상에서의 PD-L2 발현은 마우스에서의 말라리아 중증도와 역 상관관계가 있다.
이러한 자료의 생물학적 관련성을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 4개의 말라리아의 마우스 모델을 연구하였다. 이들은 마우스를 감염시키는 팔시파룸의 4개의 상이한 종/균주를 선택하였으며, 각각은 다른 생물학 및 병원성을 나타내었다. WT 마우스가 비-치사(non-lethal) P. 요엘리이(yoelii) 17XNL 또는 P. 차바우디(chabaudi)로 감염되었을 때, 기생충에 대해 1-3일마다 혈액을 검사하였으며, 감염은 다른 속도로 진행되었지만, 두 군 모두 ~ 30일 이내에 감염을 제거하였다 (도 2A). 이와 반대로, P. 요엘리이 YM 또는 P. 베르게이(berghei) ANKA에 감염된 WT 마우스는 중증(severe)이나, 다른 질환 과정을 나타내었다 (도 2B; 표 3 및 4에 따라 관찰됨). P. 베르게이-감염된 RBC는 혈액에서 뇌를 포함한 심부 조직 (deep tissues)으로 격리되어 치사 뇌 질환을 유발하기 때문에, P. 베르게이 기생충혈증은 P. 요엘리이 YM 감염에 비해 낮다. 그러나, 모든 P. 요엘리이 YM 또는 P. 베르게이-감염된 마우스는 임상 점수가 ≥4 일때 10일 이내에 안락사시켜야 했다 (표 3 및 4).
PD-L1 및 PD-L2의 표면 발현을 비장으로부터의 DCs에서 검사하였으며, 이는 기생충 사멸 및 마우스에서 기생충-특이적 면역 반응의 조절의 주요 부위인 것으로 나타났다 (Yadava et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93: 4595-4599, 1996). 감염되지 않은 마우스의 비장에서 대략 70%의 CD11c+ DCs가 PDL1을 발현하였으며, P. 베르게이 및 P. 차바우디-감염된 마우스에서는 이 백분율이 증가하였으나 치사 또는 비-치사 P. 요엘리이 감염에서는 증가하지 않았다 (도 3A). PD-L1-발현 DCs는 감염되지 않은 마우스의 DCs에 비해 모든 4개의 말라리아 감염 후에 PD-L1의 표면 발현 수준 (MFI)의 증가를 나타내었고, 비-치사 P. 차바우디-감염된 마우스는 가장 큰 증가를 나타내었다 (도 3B 및 4A-F). 이와 반대로, 감염되지 않은 마우스의 비장 DCs의 < 5%는 PD-L2를 발현하였다. 이것은 주로 PD-L2를 발현한 인간 혈액 DCs와 상이하였으며, 혈액 및 비장으로부터 이들의 다른 기원을 반영할 가능성이 가장 높다. 또한, 치사 말라리아보다 비-치사 말라리아와 함께 마우스에서 확인된 상당히 높은 백분율로 모든 말라리아 감염 동안 PD-L2+ DCs의 백분율이 증가하였다 (도 3C 및 4A-E). 또한, PD-L2-발현 DCs 상에서의 PD-L2 염색의 MFI는, 감염되지 않은 마우스의 DCs에 비해, P. 베르게이 기생충 이외의 모든 기생충으로 감염된 마우스에서 증가하였다 (도 3D 및 4A-F).
마지막으로, 치사 및 비-치사 P. 요엘리이 말라리아로부터의 CD11c+ DCs는 PD-L1 및 PD-L2 mRNA 수준의 유사한 증가를 나타내었으며 (도 4G), 이는 도 3C에서 언급된 이러한 기생충들 간의 PD-L2의 차이가 전사후 조절 또는 단백질 국소화에 의존함을 시사한다. 주목할 점은, 치사 및 비-치사 P. 요엘리이 감염으로부터의 DCs가 PD-L1 및 PD-L2 발현 및 mRNA의 동일한 표면 수준을 가졌으나, PD-L1+ DCs가 아닌 PD-L2+의 백분율에서는 차이가 있었다.
종합적으로, 모든 감염의 결과는 PD-L2+ DCs의 높은 백분율이 유리한 질환 결과와 상관관계가 있다는 가설과 일치한다.
물질 및 방법
마우스 연구
8-12주령의 특정 병원체-없는 C57BL/6J (wt) 암컷 마우스를 동물 자원 센터 (퍼스, 호주)에서 구입하였다. 마우스를 QIMR 동물 연구 시설에 수용시켰으며, 모든 과정은 QIMR 동물 윤리위원회에 의해 승인되고 관찰되었다. "과학적 목적을 위한 동물의 관리 및 사용에 대한 호주 실행규약(Australian code of practice for the care and use of animals for scientific purposes)" (호주 국립 보건 & 의료 연구 심의회(Australian National Health & Medical Research Council))에 따라 QIMR 동물 윤리 승인 번호 A0209-622M 하에 작업을 수행하였다. C57BL/6 배경에 관한 PD-1 녹아웃 (ko) (Pdcd1 -/- ) 마우스는 Riken BRC를 통해 Dr. T. Honjo에 의해 합법적으로 제공되었다 (Nishimura et al., Science. 291: 319-322, 2001). 이 연구에 사용된 C57BL/6 배경에 관한 PD-L2 ko (Liang et al., Eur. J. Immunol. 36: 58-64, 2006), PD-L1 ko (Liang et al., Eur. J. Immunol. 36: 58-64, 2006) 및 PD-1 ko 마우스는, PCR 시험 및/또는 유동 세포 계측법에 의해 결실된 유전자를 갖는 것으로 확인되었다. 시료 크기는 동일한 기생충을 사용하여, 유사한 분석법으로 이전 연구를 토대로 추정되었다.
여러 군을 대상으로 한 실험의 경우, 모든 마우스를 처음 감염시킨 다음, 무작위로 치료군에 할당하였다. 맹검은 착수하지 않았다.
기생충 감염 및 관찰
3-6 WT 마우스의 코호트(Cohorts)를 이전에 감염된 마우스인 C57BL/6J 마우스로부터 새로 얻은 105 P.　요엘리이 17XNL, 105 P. 차바우디 AS, 104 P.　요엘리이 YM, 또는 104 P. 베르게이 ANKA 기생된 적혈구 (pRBCs)로 정맥 내 감염시켰다. 이러한 기생충 용량은 이전에 같은 시기에 명백한 기생충혈증을 유발하는 것으로 나타났다. 꼬리-끝(Tail-tip) 혈액 필름은 1-2일마다 만들었으며, Quick Dip 변형된 Wright-Giemsa 염색 (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 염색하였고, 기생충혈증에 대해 최대 60일 동안 검사하였다. 기생충혈증이 > 1%인 동안 적어도 300 RBCs를 계수하여 pRBCs의 백분율을 산정하였으며, 다른 시간대에서는 약 10,000개의 세포가 있는 20개의 필드를 평가하였다.
몇몇 도에서 나타낸 평균 백분율 기생충혈증은 군 내의 개별 마우스의 총 RBC의 평균 백분율 pRBC이다. 빈혈, 및 자세 (구부림(hunching)), 활동 부족 및 털 질감(fur texture)을 포함하는 질환의 신체 증상에 대해 마우스를 매일 관찰하였다. 하기 표 3 및 4에 기재된 바와 같이, 마우스가 상당한 고통의 징후를 나타내면 마우스를 안락사시켰다.
기준 등급 0 등급 1 등급 2
체중 감량 < 10% 10 내지 25%
자세 정상 구부림은 휴식 중에만 언급됨 중증 구부림은 움직임을 약화시킴(Severe hunching impairs movement)
활동 정상 경중등도 감소(Mild to moderately decreased) 자극받지 않는 한 움직이지 않음(Stationary unless stimulated)
털 질감 정상 경중등도 파동운동(Mild to moderate ruffling) 중증 파동운동/좋지 않은 털손질(poor grooming)
헤모글로빈 정상 < 50 g/L < 20 g/L
P.　요엘리이 YM 증상은 빈혈 호흡 곤란, 및 혼수상태(coma) 및 경련과 같은 합병증이 있으나 뇌성 말라리아(cerebral malaria)는 없는 혈뇨(haematuria)를 포함한다. 연구에서 기재된 치료법이 마우스를 안락사해야 하는 정도까지 마우스에게 스트레스를 유발하는지 여부를 결정하기 위해, 실험 기간 동안 상기 고통에 대한 기준에 의해 마우스를 매일 관찰한다. 이러한 평가 기준에 의해 누적 점수가 3 이상이거나 또는 체중 감량이 25% 이상이면, 고통스러워하는 마우스를 안락사시킨다.
증상 점수 감염 후 일
주름진 털
(Ruffled fur) 		1 5
구부림 1 5
흔들리는 걸음걸이
(Wobbly gait) 		1 6
사지 마비
(Limb paralysis) 		1 6
경련 1 6-7
혼수상태 1 6-7
P. 베르게이는 치사 뇌 질환을 야기하고, 증상은 보통 감염 후 7일까지 뚜렷하다. 점수는 누적되며, 누적 점수가 4인 마우스는 안락사시킨다. 특히, 주름진 털 및 구부림은 일반적인 임상 징후이며, 다른 증상 (이탤릭체)은 뇌성 말라리아의 증상이다.
유동 세포 계측법
처리된 혈액 또는 비장 세포의 단일-세포 현탁액을 하기에 나타낸 형광체-접합된 항체의 조합으로 표지하였다. 고정가능한 생존능 염료(Fixable Viability Dye) eFluor780 (eBioscience)을 사용하여 죽은 세포를 분석에서 제외하였다. 각 항체의 연속 희석액을 유동 세포 계측법에 의해 사전-시험하여, 주요 분석을 위한 최적 농도를 결정하였다. 비특이적 Fc 결합을 차단하기 위해 항-CD16/32 (클론 2.4G2, BD)를 사용하였다. 별표로 표시된 세포 내 마커를 BD Pharmingen Transcription Factor Buffer Set를 이용하여 세포의 고정화 및 투과화 후에 표지하였다. 자료 수집은 BD LSR Fortessa 유동 세포 계측법 및 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 자료 분석은 FCS express (De Novo Software) 또는 FlowJo (Tree Star)를 사용하여 수행되었다.
마커 항체 클론 접합체 회사
CD11c N418
3.9 		BV421
BV-605 		Biolegend
Biolegend
PD-L1 10F.9G229E.2A3 PE
PE-Cy7 		BD
Biolegend
PD-L2 TY2524F.10C12 APC
알렉사 플루오르
(Alexa Fluor) 647 		BD
Biolegend
PD-1 RMP1-14J43 PE-Cy7 BioXell
eBioscience
CD4 GK1.5 퍼시픽 블루
(Pacific Blue) 		Biolegend
CD62L MEL-14 BV605 Biolegend
실시예 3
PD-L2는 생존 및 기생충 조절에 필요하다.
말라리아 기생충의 조절에 대한 PD-L2의 기여를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 wt 마우스와 비교하여 (C57BL/6J 배경에 관한) PD-L2 ko 마우스 (Liang et al., Eur. J. Immunol. 36: 58-64, 2006)에서 P.　요엘리이 17XNL 감염의 결과를 검사하였다. 모든 wt 마우스는 27일 이내에 감염을 제거하였다 (도 5A).
그러나, PD-L2 ko 마우스는 13일 후에 wt 마우스보다 유의하게 높은 기생충혈증을 나타내었고, 임상 점수 ≥ 4 (도 6B)로 인해 모든 마우스는 사망하거나 또는 19일까지 안락사되어야 했다 (도 5A 및 도 6A). 따라서, PD-L2 발현은 P.　요엘리이 17XNL로의 감염으로부터 기생충 조절 및 생존에 필요하다.
PD-L2가 P.　요엘리이 17XNL 감염에서 살아남기 위해 필요하다는 관찰을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 기생충이 혈액에서 검출될 수 있을 때 단일 클론 항체로 PD-L2를 차단하였다. 이 실험을 위해, wt 마우스를 P.　요엘리이 17XNL로 감염시키고, 감염 후 4일 및 감염 후 14-18일까지 3-4일마다, 항-PD-L2 또는 대조 랫트 IgG를 투여하였다. 랫트 IgG를 받은 모든 wt 마우스는 생존하였고, 32일 이내에 감염을 제거하였다 (도 5B 및 도 6C). 이와 반대로, 기생충 조절의 정도가 항-PD-L2 및 대조 항체 처리군에서 유사하였지만 (도 5B 및 도 6C), 중증의 증상 (도 6D)으로 인해, 19일까지, PD-L2 차단 항체가 투여된 감염된 마우스의 100%가 사망하였거나 또는 안락사하였다. 이것은 13일 후에 유의하게 높은 기생충혈증 보인 PD-L2 ko 마우스와 대조적으로 나타났으며 (도 5A), 이는 항체가 기능을 완전히 저해하지 않았거나 또는 차단하기 전에 4일간의 PD-L2 기능이 면역을 부분적으로 개선시켰음을 시사한다.
또 다른 비-치사 감염에 대한 보호에서 PD-L2의 역할을 더 연구하기 위하여, wt 마우스를 비-치사 P. 차바우디 말라리아로 감염시키고, P.　요엘리이 17XNL 실험에서와 같이 항-PD-L2 또는 랫트 IgG로 처리하였다 (도 5C 및 도 6E). 두 군의 마우스는 생존하였으나 PD-L2의 차단은 급성 감염 동안 (8일, 로그 척도로 기록) 기생충혈증을 유의하게 증가시켰고, 만성 감염 단계 동안 (> 21일) 일반적으로 더 높은 기생충혈증을 유발하였으며, 4일까지 기생충 제거를 지연시켰다 (화살표는 랫트 IgG-처리 마우스에서 기생충 제거를 나타낸다; 도 5C). 종합적으로, 이러한 보호/생존 연구는 PD-L2 발현이 P.　요엘리이 17XNL 말라리아로부터의 비-치사 말라리아의 더 좋은 조절 및 생존을 위해 필요함을 나타내었다.
실시예 4
PD-L2는 마우스에서 기생충-특이적 CD4 + T 세포 반응을 향상시킨다.
본 발명자들은 다음으로 PD-L2가 차단되었을 때 마우스가 비-치사 P.　요엘리이 17XNL의 감염에서 왜 생존하지 못하였는지에 대해 초점을 맞추었다. 따라서, 이들은 상기 차단 실험을 반복하였고, 다중 면역측정법에 의한 평가를 위해 7일 및 14일에 비장을 모았다. 첫째, 말라리아에 대한 보호를 매개하는 것으로 알려진, Th1 CD4+ T 세포의 작동체 기능에 필요한 전사 인자인 Tbet의 발현에 대해 CD4+ T 세포를 검사하였다 (Kumar and Miller, Immunol Lett, 25: 109-114, 1990; Stephens and Langhorne, PLoS Pathog, 6: e1001208, 2010; and Su and Stevenson, J Immunol, 168: 1348-1355, 2002). 또한, 천연 T 세포에서 발견되는 마커인 CD62L의 발현에 대해 T 세포를 평가하였으며, 중추 기억 (CD62Lhi)과 작동체 기억 (CD62Llo) T 세포도 구별한다 (도 7A). 감염되지 않은 마우스와 비교하여 (0일; 도 8A), 랫트 IgG를 투여한 대조 마우스에서는 7일까지 비장 당 Tbet-발현 CD62Lhi CD4+ T 세포의 수가 유의하게 증가하였으나 (도 8B; p < 0.0095), PD-L2 차단 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 8B, p > 0.05). 14일까지, 대조 마우스는 항 PD-L2 항체를 투여한 마우스보다 각각 2.2배 및 3배 이상의 비장 당 Tbet-발현 CD62Lhi 및 CD62Llo CD4+ T 세포를 가졌다 (도 8C). 유사하게, 대조 마우스는 PD-L2 차단 마우스보다, 배양물에서 기생충 항원 MSP119에 대한 반응으로 측정된 바와 같이, 14일에 IFN-γ-분비, 기생충-특이적 CD4+ T 세포의 수가 5배 이상 높았다 (도 8D). in vitro EdU-섭취 분석법은, 대조 마우스가 기생충 항원에 대한 반응에서 증식하는 기생충-특이적 CD4+ T 세포의 수를 더 많이 가짐을 확인하였다 (도 8E). 그러나, 혈청 IFN-γ의 수준은 PD-L2 차단에 의해 유의하게 영향을 받지않았다 (도 8F). 이와 반대로, PD-L2 차단 마우스는 14일까지 대조 마우스보다 2배 이상의 혈청 IL-10을 가졌다 (도 8G). 이러한 결과는 대조 처리된 마우스와 비교하여, PD-L2 차단으로 비장 당 조절 T 세포 (Treg)의 수의 유의한 증가와 상관관계가 있었다 (도 8H).
P.　요엘리이 17XNL-감염된 PD-L2 ko 마우스에 대한 연구도, 감염된 WT 마우스와 비교하여, 14일에 비장 당 Tbet-발현 및 IFN-γ-분비, 기생충-특이적 CD4+ T 세포의 수가 유의하게 낮음을 확인하였다 (도 7B 및 C). 마지막으로, 감염된 wt 마우스에 비해 항-PD-L2 차단 항체를 투여한 감염된 PD-L2 ko 마우스 또는 감염된 마우스에서 14일에 비장 당 IFN-γ-분비, 기생충-특이적 CD8+ T 세포의 유의한 감소는 없었다 (도 7D).
종합적으로, 자료는 PD-L2 발현이 P.　요엘리이 17XNL 말라리아에 대한 효과적인 Th1 CD4+ T 세포 반응에 필요함을 나타내었다. DCs 상에서 PD-L2 대 PD-L1 발현의 높은 비가 낮은 기생충혈증과 관련이 있고 PD-L2의 차단이 감소된 Th1 반응을 야기하였음을 감안하면, PD-L2가 Th1 반응을 저해하는 것으로 보고된 PD-L1 기능을 저해할 수 있다는 가설을 세웠다 (Liang et al., Eur. J. Immunol. 36: 58-64, 2006). 또한, PD-L2 차단은 P.　요엘리이 17XNL로 감염된 마우스에서 사망을 야기하였으나, P. 차바우디 말라리아로 감염된 마우스에서는 사망을 야기하지 않았다. 정렬에서, PD-L1/PD-1-매개 면역 억제는 이전에 P. 차바우디 말라리아 (Horne-Debets et al., Cell. Reports. 5: 1204-1213, 2013) 보다 P.　요엘리이 17XNL (Butler et al., Nat. Immunol. 13: 188-195, 2012)의 급성기(acute phase) 동안 더 크게 나타났다. 따라서, 우리는 PD-L1/PD-1-매개 면역 억제의 PD-L2-매개 저해가 두 감염 간의 PD-L2 차단의 상이한 결과를 설명할 수 있다고 결론지었다.
실시예 5
DCs 상에서 PD-L1 및 PD-L2 공동-발현은 면역을 결정한다.
본 발명자들은 다음으로 DCs에서 PD-L1 발현이 말라리아의 치사율 (lethality)을 담당하는지 여부를 확인하기 위하여, DC-전이 연구를 수행하였다. 이렇게 하기 위하여, wt 및 PD-L1 ko 마우스를 치사 P.　요엘리이 YM 말라리아로 감염시켰으며, 감염 후 7일에 DCs를 분리한 다음 (도 9A 및 9B), 치사 P.　요엘리이 YM 말라리아로 감염시킨 본래의 마우스로 전이하였다. 임상 점수 ≥ 4로 인해 10일 이내에 wt 마우스로부터의 DCs를 투여한 100% 마우스를 안락사해야 했지만, PD-L1 ko 마우스로부터의 DCs를 투여한 모든 마우스는 생존하였고 (도 9C), 감염을 제거하였다 (도 9D 및 9E). 이 전이 연구는 PD-L1이 풍부하지만 PD-L2가 적은 DCs를 투여한 마우스 (참조, 도 3A, C 및 도 4D)는 생존하지 못하였고, PD-L1 ko DCs를 투여한 모든 마우스가 생존하였기 때문에, DCs 상의 PD-L1이 치사율을 매개함을 나타내었다.
그 다음, PD-1 경로가 P.　요엘리이 YM 말라리아의 치사율을 담당하는지 확인하기 위하여, WT 및 PD-1 ko 마우스를 치사 P.　요엘리이 YM으로 감염시켰다. 임상 점수 ≥ 4로 인해 10일까지 WT의 100%를 안락사해야 했지만, 모든 PD-L1 ko 마우스는 생존하였고 (도 9I), 감염을 제거하였으며 (도 9J 및 9K), PD-1/PD-L1 경로가 P.　요엘리이 YM 감염의 치사율을 증가시킴을 확인하였다. 종합적으로, 이 연구들은 PD-1 및 PD-L1이 말라리아의 치사율을 매개하였음을 나타내었다.
PD-L2 발현이 말라리아로부터의 생존과 관련있음을 감안하여, 본 발명자들은 다음으로 DCs 상에서 PD-L1과 PD-L2의 공동-발현이 어떻게 면역을 조절할 수 있는지를 검사하였다. 이전의 연구는 DCs 상의 PD-L1 및 CD8+ OTI T 세포 상의 PD-1 사이의 상호 작용이 리간드-유도된 T 세포 수용체 (TCR) 하향-조절에 기여한다는 것을 나타내었다 (Karwacz et al., EMBO. Mol. Med. 3: 581-592, 2011). DCs 상에서 PD-L1과 PD-L2의 공동-발현이 PD-L1-매개 TCRs의 하향-조절 및 유도성 T 세포 공동-자극제(inducible T-cell co-stimulator; ICOS) 발현을 저해할 수 있는지를 연구하기 위하여, 실험을 수행하였다. 이렇게 하기 위하여, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 기능을 차단하는 항체와 함께 감염된 마우스로부터 정제된 DCs 및 T 세포 (1:5 세포)를 배양하였고, TCR의 성분인 CD3의 높은 발현 및 T 세포 활성화를 나타낼 수 있는 높은 ICOS 발현을 위해 36시간 후에 T 세포를 검사하였다 (도 9L-9P). DC: T 세포 배양물에서 항-PD-1 항체로 T 세포에 대한 PD-1 신호전달의 차단은 CD3 및 ICOS의 발현을 유의하게 증가시켰으며, PD-1 신호가 T 세포에서 이들 분자의 발현을 하향-조절함을 나타내었다 (도 9N 및 9P). PD-L1 신호가 항체로 차단되어 PD-L2만 기능을 유지하면, T 세포는 ICOS 및 CD3의 수준을 유의하게 증가시켰다 (도 9O 및 9P). 이와 반대로, PD-L2가 차단되어 PD-L1 기능을 손상시키지 않으면, CD3 및 ICOS의 유의한 손실이 있었다 (도 9O 및 9P). 종합적으로, 이들 결과는 P. 요엘리이 17XNL-감염된 마우스의 세포와 관련하여, DCs 상에서 PD-L1 발현이 T 세포 활성화를 저해하는 반면, PD-L2는 CD3 및 ICOS 발현을 촉진시키는 것으로 나타났다.
물질 및 방법
DC 전이 연구
CD11c+ DC는 104 P. 요엘리이 YM (치사) pRBC로 감염된 wt 및 PD-L1 ko 마우스의 비장으로부터 얻었다. 감염 후 4일, 마우스를 250 μg 피리메타민 (Pyrimethamine)으로 4일 동안 매일 처리하여 감염을 제거하였다. 7일에, 비장을 분해시키고, Dynal DC 농축 키트를 이용하여 DC를 농축시켰다. 시료를 AutoMACs에서 실행시켜 잔류 Dynal 표지 세포 및 헤모조인(hemozoin)을 제거하였다. DCs를 항-CD11c MACS 비드로 표지하고, AutoMACS에서 분리하여, 고도로 정제된 DCs를 얻었다. 그 다음, 대략 1.5 x 107 DC를 감염되지 않은 마우스에게 정맥 내로 주입하였다. 15시간 이상 동안 마우스를 휴식시킨 후, 이들을 치사량의 P. 요엘리이 YM (104 pRBC)로 감염시켰다. 관찰을 중단한 후 48일 동안 마우스를 추적 관찰하였다.
DC-T 세포 배양
마우스를 105 P. 요엘리이 17XNL pRBC로 감염시키고, 감염 후 14일에, 비장을 분해시키고, TCR에 대한 영향을 최소화하기 위하여 CD90.2 MACS 비드를 이용하여 총 T 세포를 분리하였다. 그 다음, Dynal DC 농축 키트를 이용하여 남아있는 비장 세포로부터 DCs를 분리하였다.
적어도 3 웰(triplicate wells)에서 대략 106 T 세포를 2 x 105 DCs와 함께 배양하였다. 대조 또는 차단 항-PD-1 (RMP1-14), 항-PD-L1 (10F.9G2) 또는 항-PD-L2 (TY25) 항체를 20 μg/ml의 농도로 배양물에 첨가하였다. 36시간 배양 후, 유동 세포 분석법을 위해 세포를 세척하고 표지하였다. CD3 및 ICOS 발현을 생존가능한 CD4+CD62LloPD-1+ T 세포에서 평가하였다.
실시예 6
전이성 암 환자의 DCs 상에서 PD-L2 발현
개념 자료의 추가 증거를 제공하기 위하여, 양성 병변 또는 전이성 흑색종을 가진 환자의 혈액 DCs를 비교하였다. 전이성 질환을 앓고있는 환자에서 PD-L2+ DCs의 유의한 손실이 관찰되었다 (도 10 참조). 건강한 지원자는 약 0.9의 %PD-L2:%PD-L1의 비를 가지며, 전이성 흑색종에서는 이 비가 0.4에서 0.8 사이로 떨어진다. 흥미롭게도, 국소 병변 (즉, 양성 종양) 환자에서, %PD-L2:%PD-L1 비가 0.9와 1.3 사이로 증가한다.
전신성 말라리아 및 암에 대한 결과를 토대로, PD-L1이 아니라 PD-L2는 Th1 면역 반응-관련 전신성 질환의 중증도를 예측하는 것으로 보인다. 종합적으로, 자가 면역 질환 동안 PD-L2 수준이 증가하여 손상된 면역 작동 세포의 확장을 유도 할 것으로 예측된다. 이것은 더 높은 비를 갖는 국소 병변이 있는 환자에 의해 반영된다.
실시예 7
PD-L2 다량체화(Multimerization)는 Th1 면역 상태를 나타낸다.
본 발명자들은 다량체 가용성 PD-L2 (sPD-L2)가 Th1 세포 상의 PD-1에 결합하기 위해 PD-L1을 능가하므로, T 세포 기능에 대한 PD-L1의 억제 효과를 감소시킬 것이라는 가설을 세웠다. 이것을 시험하기 위하여, 인간 IgG의 Fc 부분에 융합된 마우스 PD-L2의 세포외 도메인을 함유하는 플라스미드 구조체를 생성하고 Geneart (Life Technologies; Germany)에 의해 포유류 세포에 형질감염시켰다. 단백질 G 컬럼을 이용하여 배양 상등액으로부터 가용성 이량체 PD-L2 Ig 단백질 (PD-L2)을 정제하였다. 이 단백질은 <0.2EU/mL 내독소(endotoxin)를 갖는 것으로 나타났다. 제조사의 설명서에 따라 EZ-결합-설포-NHS 비오틴으로 이량체 PD-L2를 비오티닐화함으로써 PD-L2를 다량체화하여, 비오티닐화의 수준을 측정하기 위한 키트 (Pierce, US)로 측정된 바와 같이 PD-L2 이량체 당 2-5개의 비오틴 분자를 얻었다. 단백질을 PD-10 컬럼으로 통과시켜 여분의 바이오틴을 제거하였다. 비오티닐화 PD-L2를 스트렙타비딘 (Cedarlane, US)과 4:1 몰비로 혼합하여 주로 팔량체 형태인 다량체 PD-L2 키메라 폴리펩티드를 얻었다. 각 배치의 스트렙타비딘은 바이알에 제공된 양이 구입된 양을 초과하였기 때문에 단백질 분석법에 의해 시험되었다. 각 배치가 상이한 활성 (예를 들어, 6:1)을 가질 수 있기 때문에 각 배치의 스트렙타비딘에 대해 비가 최적화되었다. 낮은 백분율의 천연 SDS-PAGE 겔을 이용한 웨스턴 블롯 연구는 단백질이 약 300-400 kDa 밴드를 갖는 팔량체로 다량체화되었음을 확인하였다.
다음으로, 야생형 마우스를 치사 P. 요엘리이 YM 또는 P. 베르게이로 감염시키고, 3일째에 PD-L2를 투여하였으며, 기생충혈증(들)은 감염 후 5일 및 7일에 측정 가능하였다. P. 요엘리이 YM으로 감염되고 대조군 인간 IgG (대조군 Ig)로 처리된 모든 야생형 마우스는 죽거나 또는 10일 이내에 안락사해야 했다 (도 11A-C).
유사하게, 이량체 PD-L2는 증가된 기생충혈증으로부터 어떠한 보호도 제공하지 못하였다 (도 11D). 이와 반대로, PD-L2로 처리된 P. 요엘리이 YM-감염된 마우스 (n = 12)의 92%는 생존하였고, 증상이 거의 없는 25일에 감염을 제거하였다 (도 11A-E). 생존한 모든 마우스는 150일까지 휴식을 취하였고, 새로운 연령대의 감염되지 않은 대조군 마우스 (대조군 Ig-R)와 함께 동일한 용량의 치사 P. 요엘리이 YM 말라리아로 재투여하였다 (추가 PD-L2를 투여하지 않음; 도 11A). 이전에 PD-L2로 처리된 모든 마우스는 증상이 없는 재-감염에서 생존하였고, 8마리의 마우스 중 4마리 만이 기생충혈증을 나타내었다 (도 11B에서 로그 척도로 나타냄). 재-감염 후 20일 이내에, 이들 마우스에서 감염되지 않은 마우스로 200 μl의 혈액의 전이가 감염을 전이시키지 않았기 때문에, 이들 sPD-L2-처리되고 재-감염된 마우스의 80%는 감염을 완전히 제거하였다 (도 11F). 이와 반대로, 두 번째 세트의 연령대 대조군 마우스는 감염에 굴복하였으며, 재-감염에 사용된 기생충의 치사율을 확인하였다 (도 11C). 종합적으로, 다량체 PD-L2는 P. 요엘리이 YM으로 감염 후에 PD-L1 매개 치사율을 극복할 수 있었다.
마찬가지로, P. 베르게이로 감염된 대조군 마우스의 100%는 8일 이내에 실험적 뇌성 말라리아 증상 (ECM)을 나타내었고 (도 11G), 10일까지 감염에 굴복하였다 (도 11H). sPD-L2로 처리된 P. 베르게이-감염된 마우스의 22%만이 이들의 ECM 점수에서 볼 수 있는 바와 같이 뇌성 말라리아를 나타내었다 (도 11G). 또한, 생존한 마우스는 PD-L2의 마지막 투여 후 굴복하기 13일 전에, 대략 20일 동안 감염을 조절하였다 (도 11H 및 I). 추가 용량은 생존을 개선시키지 않았다 (자료는 표시되지 않음). 요약하면, 다량체 PD-L2의 투여는 치사 감염으로부터 생존을 현저하게 개선시켰고, 특히 뇌성 말라리아의 임상 증상의 중증도를 감소시켰다.
실시예 8
십이량체 PD-L2는 종양에 대한 면역 반응을 향상시킨다.
가용성 키메라 PD-L2 폴리펩티드는 자기-조립하여 십이량체로 설계되었다. 이 키메라 폴리펩티드는 인간 IgG의 Fc 부분 및 C-말단 α-꼬리 조각에 융합된 마우스 PD-L2 (마우스 PD-L2-Fc-αtp)의 세포외 도메인을 함유하고 하기의 아미노산 서열을 가진다:
MLLLLPILNLSLQLHPVAALftvtapkevytvdvgssvslecdfdrrectelegiraslqkvendtslqseratlleeqlplgkalfhipsvqvrdsgqyrclvicgaawdykyltvkvkasymridtrilevpgtgevqltcqargyplaevswqnvsvpantshirtpeglyqvtsvlrlkpqpsrnfscmfwnahmkeltsaiidplsrmepkvprtwplhvfipacDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY [서열번호: 58].
대문자 및 밑줄 친 글자체의 서열은 마우스 PD-L2 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타내며; 소문자 글자체의 서열은 마우스 PD-L2 엑토도메인의 아미노산 서열에 상응하고; 이탤릭체 소문자 글자체의 서열은 마우스 PD-L2 막관통 도메인의 일부의 아미노산 서열을 나타내며; 대문자 글자체의 서열은 인간 IgG1의 Fc 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응하고; 굵은 대문자 글자체의 서열은 IgA 분자의 알파 꼬리 조각 (αtp)의 아미노산 서열을 나타낸다.
키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하는 구조체를 Geneart (Life Technologies; Germany)에 의해 전매(proprietary) 포유류 세포로 형질감염시키고, 단백질 G 컬럼을 이용하여 배양 상등액으로부터 주로 가용성 십이량체 PD-L2-Ig 단백질 (sPD-L2)을 정제한 다음, FPLC 분획화를 통해 단백질의 이량체 형태를 배제하였다. 이 단백질은 <0.2EU/mL 내독소를 갖는 것으로 나타났다.
다음으로, 확립된 B16.F0 및 B16.F10 흑색종 세포주를 실험실에서 각각 5x105 또는 1x105 세포를 피하로 이식한 C57BL/6 마우스에서 성장시켰다.
진행성 흑색종에 대한 sPD-L2의 효과를 확인하기 위하여, B16.F0 종양이 9 일경에 100 mm3 부피에 도달하면, 9, 11 및 13일에 마우스에게 200 μg 인간 IgG 또는 sPD-L2를 투여하고, 1-2일마다 종양 크기를 관찰하였다. 윤리적인 이유로, 종양이 >1000mm3이거나 또는 임의의 궤양 또는 불편함의 증상이 나타나면 마우스를 안락사시켰다. 도 12에 제시된 이 연구의 결과는, sPD-L2가 진행성 흑색종에 대한 면역 반응을 향상시키고 보호한다는 것을 분명히 나타낸다.
sPD-L2의 효과가 초기 종양에서도 연구되었다. 이 실험에서, 종양이 ~50 mm3 부피에 도달하면 3일 경에 B16.F10 세포를 이식하였고, 3, 9 및 15일에 마우스를 200 μg 인간 IgG 또는 sPD-L2로 처리하였다. 이 연구의 결과 (도 13 참조)는, sPD-L2가 흑색종에 대한 조기 보호를 제공한다는 것을 나타내었다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물의 내용은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 참고 문헌의 인용은 이러한 참고 문헌이 본 출원의 "선행 기술"로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 목적은 임의의 일 실시예 또는 특정 특징들의 집합에 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시예들을 기재하는 것이었다. 따라서, 통상의 기술자는 본 발명에 비추어 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시예에서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 변형 및 변화는 첨부된 청구항의 범위 내에 포함하기 위한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Council of The Queensland Institute of Medical Research <120> IMMUNE-MODULATING COMPOUNDS <130> 35252742/VPA <140> PCT/AU2016/050726 <141> 2016-08-11 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser 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ectodomain-L-GCN4 trimerization domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <400> 44 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu 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210 215 220 Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 225 230 235 <210> 51 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human PD-L2 ectodomain-L-Fc dimerization domain-L-foldon trimerization domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (449)..(449) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <400> 51 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp 195 200 205 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Xaa Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Xaa Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr 450 455 460 Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 465 470 475 <210> 52 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human PD-L2 ectodomain-L-Fc dimerization domain-L-GCN4 tetramerization domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (449)..(449) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <400> 52 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp 195 200 205 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Xaa Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Xaa Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu 450 455 460 Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly Glu 465 470 475 480 <210> 53 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human PD-L2 ectodomain-L-Fc dimerization domain-L-COMP pentamerization domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (449)..(449) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <400> 53 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp 195 200 205 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Xaa Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Xaa Leu Ala Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala 450 455 460 Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Lys Gln Ile Thr 465 470 475 480 Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly 485 490 <210> 54 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human PD-L2 ectodomain-L-Fc dimerization domain-L-?tp hexamerization domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (449)..(449) <223> Represents a bond (e.g., peptide bond) or a peptide linker <400> 54 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp 195 200 205 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Xaa Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Xaa Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly 450 455 460 Thr Cys Tyr 465 <210> 55 <211> 1518 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 acgcggggtt tttcttctct tgaatatatc ttaacgccaa attttgagtg ctttttttgt 60 tacccatcct catatgtccc agctagaaag aatcctgggt tggagctact gcatgttgat 120 tgttttgttt ttccttttgg ctgttcattt tggtggctac tataaggaaa tctaacacaa 180 acagcaactg ttttttgttg tttacttttg catctttact tgtggagctg tggcaagtcc 240 tcatatcaaa tacagaacat gatcttcctc ctgctaatgt tgagcctgga attgcagctt 300 caccagatag cagctttatt cacagtgaca gtccctaagg aactgtacat aatagagcat 360 ggcagcaatg tgaccctgga atgcaacttt gacactggaa gtcatgtgaa ccttggagca 420 ataacagcca gtttgcaaaa ggtggaaaat gatacatccc cacaccgtga aagagccact 480 ttgctggagg agcagctgcc cctagggaag gcctcgttcc acatacctca agtccaagtg 540 agggacgaag gacagtacca atgcataatc atctatgggg tcgcctggga ctacaagtac 600 ctgactctga aagtcaaagc ttcctacagg aaaataaaca ctcacatcct aaaggttcca 660 gaaacagatg aggtagagct cacctgccag gctacaggtt atcctctggc agaagtatcc 720 tggccaaacg tcagcgttcc tgccaacacc agccactcca ggacccctga aggcctctac 780 caggtcacca gtgttctgcg cctaaagcca ccccctggca gaaacttcag ctgtgtgttc 840 tggaatactc acgtgaggga acttactttg gccagcattg accttcaaag tcagatggaa 900 cccaggaccc atccaacttg gctgcttcac attttcatcc cctcctgcat cattgctttc 960 attttcatag ccacagtgat agccctaaga aaacaactct gtcaaaagct gtattcttca 1020 aaagacacaa caaaaagacc tgtcaccaca acaaagaggg aagtgaacag tgctatctga 1080 acctgtggtc ttgggagcca gggtgacctg atatgacatc taaagaagct tctggactct 1140 gaacaagaat tcggtggcct gcagagcttg ccatttgcac ttttcaaatg cctttggatg 1200 acccagcact ttaatctgaa acctgcaaca agactagcca acacctggcc atgaaacttg 1260 ccccttcact gatctggact cacctctgga gcctatggct ttaagcaagc actactgcac 1320 tttacagaat taccccactg gatcctggac ccacagaatt ccttcaggat ccttcttgct 1380 gccagactga aagcaaaagg aattatttcc cctcaagttt tctaagtgat ttccaaaagc 1440 agaggtgtgt ggaaatttcc agtaacagaa acagatgggt tgcaatagag ttatttttta 1500 tctatagctt cctctggg 1518 <210> 56 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 57 <211> 873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60 gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120 aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180 gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240 tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300 atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360 gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420 attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480 cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540 accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600 acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660 acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720 ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780 ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840 aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873 <210> 58 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Dodecameric PD-L2 <400> 58 Met Leu Leu Leu Leu Pro Ile Leu Asn Leu Ser Leu Gln Leu His Pro 1 5 10 15 Val Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val 20 25 30 Asp Val Gly Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp Phe Asp Arg Arg Glu 35 40 45 Cys Thr Glu Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Leu Phe His Ile Pro Ser Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Ser Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Met Arg Ile Asp Thr 115 120 125 Arg Ile Leu Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Arg Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Gln Pro Ser Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Met Phe Trp Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp 195 200 205 Pro Leu Ser Arg Met Glu Pro Lys Val Pro Arg Thr Trp Pro Leu His 210 215 220 Val Phe Ile Pro Ala Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser 450 455 460 Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 465 470 475

Claims (56)

  1. 화학식 (I)로 표시되는 폴리펩티드 복합체:
    [화학식 I]
    [P] n
    여기서:
    P는 각 경우에 대해 독립적으로, PD-L2 폴리펩티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 단백질성(proteinaceous) 분자를 나타내고;
    n은 2보다 큰 정수를 나타낸다.
  2. 제 1항에 있어서, P는 종양 또는 종양-관련 신생혈관(neovascular) 표적 도메인이 결여되어 있는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, PD-L2 폴리펩티드는 PD-L2의 가용성 부분을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  4. 제 3항에 있어서, PD-L2의 가용성 부분은 신호 펩티드가 있거나 또는 없는 PD-L2 엑토도메인(ectodomain)인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 분자는 PD-L2 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 PD-L2 세포질 도메인(cytoplasmic domain) 중 하나 또는 둘 모두 결여되어 있는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, n은 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7 또는 ≥8인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, n은 ≤100, ≤50, ≤30 또는 ≤20인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, n은 3 내지 20, 적당하게는 4 내지 16, 보다 적당하게는 8 내지 12의 범위인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 분자는 화학적으로 함께 결합하여 폴리펩티드 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 개개의 단백질성 분자는 단백질성 분자의 자기-조립을 용이하게 하여 폴리펩티드 복합체를 형성하는 적어도 하나의 올리고머화 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  11. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 단일 쇄, 키메라 폴리펩티드를 형성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  12. 단백질성 분자의 자기-조립을 용이하게 하여 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드 복합체를 형성하는 적어도 하나의 올리고머화 도메인에 작동가능하게 연결된, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 정의된 PD-L2 폴리펩티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 단백질성 분자.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드의 상류 (즉, 아미노-말단) 및/또는 하류 (즉, 카복시-말단)에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  14. 제 13항에 있어서, 단백질성 분자는 화학식 (II)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체:
    [화학식 II]
    PD-L2―L―OMDA
    여기서:
    PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타내고;
    OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
    L은 결합 또는 펩티드 링커이다.
  15. 제 13항에 있어서, 단백질성 분자는 화학식 (III)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체:
    [화학식 III]
    PD-L2―L―OMDA―L―OMDB
    여기서:
    OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
    L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고;
    OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 i 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 i+1, i+2, i+3, i+4, i+5, 또는 i+6 이다.
  16. 제 15항에 있어서, i는 2 이고 j는 4 또는 6인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  17. 제 13항에 있어서, 단백질성 분자는 화학식 (IV)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체:
    [화학식 IV]
    OMDA―L―PD-L2
    여기서:
    OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 ≥3 이고, 적당하게는 3, 4, 5, 또는 6이며;
    L은 결합 또는 펩티드 링커이고;
    PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
  18. 제 13항에 있어서, 단백질성 분자는 화학식 (V)로 표시되는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체:
    [화학식 V]
    OMDB―L―OMDA―L―PD-L2
    여기서:
    OMDB는 j 하위단위 OMDB의 올리고머 (OMDB) j 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 j는 ≥2 이고, 적당하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
    L은 각 경우에 대해 독립적으로, 결합 또는 펩티드 링커를 나타내고,
    OMDA는 i 하위단위 OMDA의 올리고머 (OMDA) i 를 형성하는 올리고머화 도메인이며, 여기서 i는 j 보다 더 큰 정수이고, 적당하게는 j+1, j+2, j+3, j+4, j+5, 또는 j+6 이고;
    PD-L2는 PD-L2 폴리펩티드를 나타낸다.
  19. 제 18항에 있어서, j는 2 이고 i는 4 또는 6인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  20. 제 14항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 개개의 올리고머화 도메인 (예를 들어, OMDA 또는 OMDB)은 결합 파트너의 존재 하에 이종올리고머로 조립되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  21. 제 20항에 있어서, 올리고머화 도메인 및 결합 파트너는 특이적 결합 쌍의 구성원일 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  22. 제 21항에 있어서, 특이적 결합 쌍은 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 합텐-항-합텐, 리간드-수용체 및 수용체-공-수용체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  23. 제 10항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 이량체화 도메인 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 도메인, 류신 지퍼 등), 삼량체화 도메인 (예를 들어, 대장균 아스파르테이트 트랜스카바모일라제 (ATCase)의 촉매 하위단위, 박테리오파지 T4 피브리틴(fibritin)의 '폴돈 (foldon)' 삼량체 서열, 목 부위 펩티드, 인간 폐 계면활성제 D 단백질, 올리고머화 꼬인 코일 부착소(oligomerization coiled-coil adhesins), 외막형 바이러스 클래스 I 융합 단백질의 상보적 헵타드(heptad) 반복 영역 등), 사량체화 도메인 (예를 들어, 테트라브라키온의 꼬인 코일 도메인), 오량체화 도메인 (예를 들어, 트립토판 지퍼 또는 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP)의 오량체화 도메인 등) 및 육량체화 도메인 (예를 들어, IgA 항체의 중쇄의 C-말단으로부터의 꼬리조각(tailpiece))으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  24. 제 10항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인은 PD-L2 폴리펩티드에 직접 연결되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  25. 제 10항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 올리고머화 도메인 및 PD-L2 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  26. 제 25항에 있어서, 펩티드 링커는 1 내지 100 아미노산 잔기 (및 그 사이의 모든 정수 아미노산 잔기)로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 펩티드 링커는 단백질성 분자의 정제를 용이하게 하는 정제 부분(moiety), 단백질성 분자에 대한 면역 반응을 조절하는 면역-조절 부분, 및 구조적 유연성-부여 부분으로부터 선택된 적어도 하나의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 복합체.
  28. 숙주 세포에서 작동가능한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 제 10항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 정의된 단백질성 분자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체.
  29. 제 28항의 핵산 구조체를 함유하는 숙주 세포.
  30. 제 29항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포인, 숙주 세포.
  31. 제 29항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포인, 숙주 세포.
  32. 폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건 하에서 (예를 들어, 수용액에서) 제 10항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 정의된 단백질성 분자들을 혼합시켜 n 하위단위 단백질성 분자의 올리고머를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 복합체의 제조 방법으로서,
    n은 일반적으로 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7 또는 ≥8 이며, 적당하게는 n은 ≤100, ≤50, ≤30 또는 ≤20 이고, 바람직하게는 n은 3 내지 20, 적당하게는 4 내지 16, 보다 적당하게는 8 내지 12의 범위인 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드 복합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하는 면역-조절 조성물.
  34. 피험자에서 Th1 면역 반응을 포함하여, 면역 반응을 자극, 유도 또는 증강시키는 방법으로서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 27항 또는 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드 복합체 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 피험자에서 Th1-관련 질환 또는 장애의 치료 방법으로서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 27항 또는 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드 복합체 또는 조성물의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 폴리펩티드 복합체 또는 조성물은 피험자가 손상된 Th1 면역을 갖는 것으로 확인된 경우 피험자에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제 36항에 있어서, (1) 피험자로부터 얻어진 시료의 Th1 면역 상태 바이오마커 프로파일을 결정하는 단계로서, Th1 면역 상태 바이오마커 프로파일은 시료에서 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 포함하고, 적어도 하나의 Th1 면역 상태 바이오마커는 시료에서 면역 작동 세포 (IEC)-상호 작용 세포와 상호 작용하는 세포의 PD-L2, 및 임의로 PD-L1을 포함하는, 단계; 및 (2) 바이오마커 값(들)을 이용하여 지표를 결정하는 단계로서, 지표는 피험자의 Th1 면역 상태를 적어도 부분적으로 나타내는, 단계;를 포함하는, 방법에 의해 피험자의 Th1 면역 상태를 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  38. 제 37항에 있어서, IEC-상호 작용 세포는 수지상 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 적당하게 선택된 항원-제시 세포(APC)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제 38항에 있어서, APC는 CD11c-발현 수지상 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  40. 제 37항에 있어서, IEC-상호 작용 세포는 종양 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  41. 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 값(들)은 피험자로부터 얻어진 시료에서 Th1 면역 상태 바이오마커의 농도를 적어도 부분적으로 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 바이오마커 값은 Th1 면역 상태 바이오마커의 존재량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  43. 제 37항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 개개의 바이오마커 값은 세포 표면 (예를 들어, PD-L2+ 수지상 세포, PD-L2+ 종양 세포 등) 상에 Th1 면역 상태 바이오마커를 발현하는 항원-제시 세포의 백분율을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  44. 제 40항에 있어서, Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L2이고 바이오마커 값은 IEC-상호 작용 세포 (예를 들어, 수지상 세포와 같은 APC, 또는 종양 세포)의 표면 상의 PD-L2 클러스터링의 측정인 것을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제 37항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L2의 수준은 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 PD-L2의 대조 수준에 비해 시료에서 감소되며, 이로써 지표는 손상된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제 37항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 한 쌍의 Th1 면역 상태 바이오마커로부터의 바이오마커 값을 사용하여 지표를 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 한 쌍의 바이오마커는 PD-L2 및 PD-L1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 바이오마커 값에 결합 함수를 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 결합 함수는 부가 모델; 선형 모델; 지지체 벡터 기계 (support vector machine); 신경망 모델; 랜덤 포레스트 모델(random forest model); 회귀 모델(regression model); 유전자 알고리즘; 어닐링 알고리즘; 가중치 합(weighted sum); 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model); 및 확률 모델 (probabilistic model)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  50. 제 37항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (a) 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 결정하는 단계; (b) 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대한 상응하는 바이오마커 값을 결정하는 단계; (c) 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 기록된 바이오마커 값을 이용하여 지표를 결정하는 단계로서, 지표는 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커에 대해 기록된 바이오마커 값의 비를 나타내는, 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 제 1 Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L2 이고, 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커는 PD-L1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제 50항 또는 제 51항에 있어서, 시료로부터 결정된 제 1 및 제 2 Th1 면역 상태 바이오마커 값의 비 ("시료 Th1 면역 상태 바이오마커 비")는 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역의 존재와 상관관계가 있는 대조 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비에 비해 감소되며, 지표는 손상된 Th1 면역을 적어도 부분적으로 나타내는 것으로 결정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 시료 바이오마커 값 비는 적당하게 대조 바이오마커 값 비 (예를 들어, 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자로부터 얻어진 대조 시료로부터 결정됨)의 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이하 (및 그 사이의 모든 정수)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 시료 PD-L2:PD-L1 바이오마커 값 비는 일반적으로 대조 바이오마커 값 비 (예를 들어, 정상 또는 손상되지 않은 Th1 면역 반응을 갖는 피험자로부터 얻어진 대조 시료로부터 결정됨)의 96% 내지 104% (및 그 사이의 모든 정수)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  55. 제 35항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, Th1-관련 질환 또는 장애는 감소되거나 또는 억제된 Th1 면역 상태와 관련이 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  56. 제 55항에 있어서, Th1-관련 질환 또는 장애는 전이성 암을 포함하여 암, 또는 병원성 감염인 것을 특징으로 하는, 방법.
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