KR20190044829A - 파네신 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱케투스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

파네신 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱케투스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파네신을 대량생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주는 이산화탄소를 독립탄소원으로 사용하여 파네신을 대량생산할 수 있는 특징이 있으며, 특히 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주는 빛과 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 탄소원으로 사용하므로 경제적인 효과가 있고, 미생물을 사용하여 대기 중의 이산화탄소를 제거 또는 저감하는데 활용될 수 있으므로 친환경적인 효과가 있다. 또한, 본 발명의 균주는 다른 미생물과 비교하여 성장 속도가 빠르고 이산화탄소 고정력이 뛰어나 식품, 의학, 약학, 바이오연료 및 화학 등 다양한 산업 분야에 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

파네신 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱케투스 균주 및 이의 용도{Transformed synechococcus elongatus strains having improved productivity of farnesene and use thereof}
본 발명은 이산화탄소로부터 파네신을 대량 생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱케투스 균주, 이를 이용한 파네신 생산방법 및 이산화탄소 저감 또는제거 방법에 관한 것이다.
이소프레노이드는 살아있는 유기체에서 중요한 역할을 하는 물질로서 세포의 유동성, 전자 이동 및 기타 대사 작용을 유지하는데 사용된다. 이소프레이드는 40000개 이상의 생산물들로 이루어진 다양한 군을 포함하는데 다수의 천연 이소프레노이드 및 합성 이소프레노이드는 약품, 화장품, 향수, 색소 및 발색제, 살진균제, 방부제, 기능성 식품 및 정밀 화학 중간물질로서 사용된다.
또한, 천연 상태에서 이소프레노이드는 이의 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)와 이성체인 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)의 연속적인 축합 반응에 의해 합성된다. 상기 전구체에 대한 경로로서는 2가지가 알려져 있다. 식물을 제외한 진핵 생물은 일반적으로, 아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)를 IPP로 전환시키기 위해 메발로네이트-의존 경로(MVA)를 이용하는데 이때, 상기 IPP는 추후 DMAPP로 이성체와 된다. 일부 예외도 있지만, 원핵생물은 통상적으로 IPP 및 DMAPP를 생산하기 위해 메발로네이트-독립 경로 또는 데옥시자일룰로스-5-포스페이트경로(MEP)만을 이용한다. 식물은 MVA 경로와 MEP 경로 둘 다를 이용한다.
통상적으로, 이소프레노이드는 천연 공급원 예를 들어 식물, 미생물 및 동물로부터 추출하여 제조되어 왔다. 그러나 추출에는 다수의 심각한 한계점이 있기 때문에 보통 수율이 매우 낮다. 첫째, 대부분의 이소프레노이드는 천연의 환경 하에서는 소량만이 축적된다. 둘째, 공급 유기체는 일반적으로 원하는 이소프레노이드를 상업적으로 유용한 양만큼 생산하는데 필요한 대규모 배양 공정에 적합하지 않다. 셋째, 이소프레노이드 추출을 위해서는 임의의 독성 용매가 필요하고, 이 용매의 취급과 처리 과정에 특별히 주의해야 하므로 이소프레노이드를 상업적으로 생산해 내는데 많은 어려움이 따른다.
또한, 식물로부터 추출되는 이소프레노이드 중 하나의 클래스인 세스퀴테르펜은 중요한 의학적, 산업적 특성을 갖는 것으로 알려져 있으며(Berger, 2009; Dhingra et al., 2000; Muntendam et al., 2009), 파네신(farnesene)은 파르네산(farnesane)으로의 수소화 반응으로 인해 최근 생물연료 전구체로서 개발되고 있으나 (Renneger and McPhee, 2008) 천연적으로 아주 작은 양만 생산된다. 따라서, 대사 공학(metabolic engineering)은 대장균 및 효모로부터 이러한 희박하고 가치 있는 화합물을 대량생산할 수 있는 대안적 경로가 될 수 있을 것으로 예상하고 있으며, 산업적 유용 가치가 큰 파네신을 대량 생산할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 원핵세포인 시아노박테이라의 일종인 시네코코커스 일롱게투스를 대상으로 유전자 조작을 통해 파네신을 대량생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 제조하였고,
상기 형질전환 균주를 이용하여 파네신을 대량생산할 수 있으며, 나아가 이산화탄소를 효과적으로 저감 또는 제거할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 파네신을 대량생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 파네신 합성효소 유전자(AFS)를 포함하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM12133P의 균주일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 도 5의 벡터 지도를 갖는 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 도 6의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터로 더 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 도 7의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터로 더 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 II(Neutral site-II)에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터 또는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 I(Neutral site-I)에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 이산화탄소를 이용하여 파네신을 생산하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 균주 배양은 이산화탄소를 공급하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 소수성 용매(solvent)에 용해된 파네신(farnesene)을 수득하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명의 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소를 제거 또는 저감하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주는 이산화탄소를 독립탄소원으로 사용하여 파네신을 대량생산할 수 있는 특징이 있으며, 특히 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주는 빛과 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 탄소원으로 사용하므로 경제적인 효과가 있고, 미생물을 사용하여 대기 중의 이산화탄소를 제거 또는 저감하는데 활용될 수 있으므로 친환경적인 효과가 있다. 또한, 본 발명의 균주는 다른 미생물과 비교하여 성장 속도가 빠르고 이산화탄소 고정력이 뛰어나 식품, 의학, 약학, 바이오연료 및 화학 등 다양한 분야의 산업에 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 파네신 생산 경로에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 파네신 생산능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 제조를 위해 사용한 재조합 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주로부터 파네신의 생산여부를 GC/MS 분석결과로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주로부터 생산된 파네신의 생산양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터 구조를 나타낸 도이다.
본 발명은 파네신을 대량 생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제공함에 특징이 있다.
시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus)는 시아노박테리아(cyanobacteeria)의 일종이다. 원핵세포인 시아노박테리아는 유전자 조작이 용이하여, 대사경로를 바꾸거나 대사물질을 인위적으로 조절하는데 유리하다. 본 발명자들은 시아노박테리아의 이러한 특성과 합성생물학/대사공학적 기법을 이용하여 파네신을 대량 생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제조하였다.
구체적으로 본 발명에서 제공하는 상기 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주는 파네신 합성효소 유전자(AFS)를 포함하며, 상기 AFS 유전자는 파네실 디포스페이트 (FPP)로부터 파네신 (farnesene)을 생산하는 효소를 코딩하는 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는 AFS 유전자 이외에도 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs)를 더 포함할 수 있다.
상기 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs)는 피루베이트 (pyruvate) 및 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 (D-glyceraldehyde 3-phosphate, G3P)로 부터 1-데옥시-D-크실룰로오스 5-포스페이드 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate, DXP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs) 및 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs) 이외에도 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자와 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자는 아이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)로부터 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.
상기 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자는 디메틸알릴 디포스페이트 로부터 파네실 디포스페이트 (FPP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.
또한 본 발명의 일실시예에 따르면, 파네신 합성효소 유전자(AFS)는 사과 유래의 유전자를 사용하였고, 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs), 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자 및 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자는 대장균 유래의 것을 사용하였다.
나아가 본 발명에 따른 상기 파네신을 대량 생산할 수 있는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주는 파네신 합성효소 유전자(AFS), 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs), 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자 또는 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 야생형 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주(모균주)를 형질전환하여 제조할 수 있다.
상기 재조합 벡터에 포함되는 각 유전자들은 모균주에 형질전환으로 삽입된 후 안정적인 발현을 위해 코돈 최적화된 것이다.
상기 "코돈-최적화(codon-optimized)"는 표적 염기서열(핵산서열)로 형질전환시키는 숙주 세포 내에서 표적 핵산 서열이 제대로 발현되며 나아가 더욱 높은 수준으로 발현시키기 위해 표적 핵산 서열을 선택된 숙주 세포의 코돈 선호도를 반영하도록 변형시키는 것을 의미한다. 예를 들어 본 발명의 상기 AFS, dxs, idi 또는 ispA의 염기서열은 시네코코커스 일롱게투스의 코돈 선호도에 맞게 변형시킬 수 있다. "코돈 선호도"란 유기체에 따라 각 아미노산을 코딩하는데 자주 사용하는 핵산 서열을 의미한다. 다수의 유기체에 대한 코돈 선호도 표를 입수할 수 있는데, 이 표는 본 발명의 서열을 디자인하는데 참고 기준으로서 사용할 수 있다(Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res 10(22) 7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol Evol 13(6) 864-872 참조). 소정의 숙주 미생물의 코돈 중 가장 많이 사용되는 코돈을 사용하면, 일반적으로 번역 가능성이 증가하게 되므로 원하는 서열의 발현 수준도 증가할 수 있다.
본 발명에서 상기 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
또한 본 발명에서 형질전환을 위해 사용한 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 제조를 위해 도 5의 벡터 지도를 갖는 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터, 도 6의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터 및 도 7의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 벡터를 사용하여 시네코코커스 일롱게투스를 형질전환시켰다.
본 발명에 따른 상기 형질전환은 목적하는 유전자(핵산)를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
발명의 일실시예에서는 형질전환을 위한 모균주로서 야생형 시네코코커스 일롱게투스 PCC 7942 균주를 사용하였고, 상기 기술된 재조합 벡터를 이용하여 파네신을 대량생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 제조하였다.
한, 본 발명의 일실시예에서는 상기 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 II(Neutral site-II)에 삽입되도록 하였고, 상기 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터 또는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 I(Neutral site-I)에 삽입되도록 하였다.
기와 같은 방법으로 형질전환된 본 발명에 따른 시네코코커스 일롱게투스 균주는 이산화탄소를 이용하여 파네신을 대량생산할 수 있는 특징이 있다.
이를 확인하기 위해 본 발명자들은 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 이산화탄소가 공급되는 조건 하에서 배양한 다음, 파네신을 수득하여 생산량을 분석한 결과, dxs 유전자, idi 유전자, ispA 유전자 및 AFS 유전자가 모두 삽입된 시네코코커스 일롱게투스 형질전환 균주는 최대 4.6 mg/L의 파네신을 생산함을 확인할 수 있었고(도 4 참조), 이러한 생산량은 종래 기술에 비해 현저하게 증가된 것이다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 상기 균주를 배양하는 단계는, 이산화탄소를 공급하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 소수성 솔벤트에 용해된 파네신을 분리하여 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소수성 솔벤트는 공지의 것이라면 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 상기 소수성 솔벤트 내에 균주가 생산해 낸 파네신이 축적될 수 있다. 본 발명의 시네코코커스 일롱게투스 균주는 생산한 파네신을 세포외로 분비하며, 분비된 파네신이 소수성 솔벤트에 용해되는 것이다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소를 제거 또는 저감하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 균주는 빛과 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 탄소원으로 이용할 수 있어, 대기 중의 이산화탄소를 효과적으로 제거 또는 저감할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
시네코코커스 일롱게투스 균주로부터 파네신을 대량 생산하기 위한 전략
선행 논문을 참고하여 최적화된 MEP 대사 경로에 사용된 dxs, idi, ispA 유전자를 이용하여 파네신에 이르는 새로운 대사경로를 만들었고, 이를 도 1에 모식도로 나타내었다(Choi SY, Lee HJ, Choi J, Kim J, Sim SJ, Um Y, Kim Y, Lee TS, Keasling J, Woo HM (2016) Photosynthetic conversion of CO2 to farnesyl diphosphate-derived phytochemicals (amorpha-4,11-diene and squalene) by engineered cyanobacteria. Biotechnol Biofuels 69:202). 사과 (Malus x domestica)의 파네신 합성효소 (AFS) 유전자의 DNA 시퀀스를 코돈 최적화 과정을 거친 후 Genscriptⓡ에서 시퀀스를 합성 주문 제작하여 하기 실시예에서 사용하였고, 피루베이트 및 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 (G3P)로부터 1-데옥시-D-크실룰로오스 5-포스페이트 (DXP) 를 생산하는 효소 유전자인 dxs, 아이소펜테니 디포스페이트 (IPP)로부터 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 생산하는 효소 유전자인 idi, 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)로부터 파네실 디포스페이트 (FPP)를 생산하는 효소 유전자인 ispA는 대장균으로부터 유래한 것을 사용하였다.
< 실시예 2>
파네신 대량 생산을 위한 재조합 벡터 제조
본 발명자들은 파네신을 대량생산할 수 있는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 제조를 위해 먼저 아래와 같은 재조합 벡터를 제조하였다.
① pSe1Bb1s - dxs 벡터 제조
SyneBrick 벡터인 pSe1Bb1s-gfp(Kim UJ, Lee SM, Um Y, Sim SJ, Woo HM (2017) Development of SyneBrick vectors as a synthetic biology platform for gene expression in Synechococcys elongatus PCC 7942. Front Plant Sci 8:293)의 gfp 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후, 그 자리에 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs) 유전자의 DNA시퀀스(서열번호 1)가 삽입된 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터를 제조하여 도 6에 나타내었다. 피루베이트 (pyruvate) 및 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 (D-glyceraldehyde 3-phosphate, G3P)로부터 1-데옥시-D-크실룰로오스 5-포스페이드 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate, DXP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자인 dxs 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제조하였다.
② pSe1Bb1s - dxs,idi,ispA 벡터 제조
상기 실시예에서 사용한 동일한 SyneBrick 벡터인 pSe1Bb1s-gfp 벡터에서 gfp 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후, 그 자리에 dxs, idi(서열번호 2) 및 ispA(서열번호 3) 유전자의 DNA 시퀀스가 순차적으로 삽입된 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터를 제조하였다(도 7 참조).
여기서 상기 dxs 유전자는 상기 실시예 ①에서 기재된 것과 동일하며, idi 유전자는 아이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 로부터 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자이고, 상기 ispA 유전자는 디메틸알릴 디포스페이트로부터 파네실 디포스페이트 (FPP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자이다.
③ pSe2Bb1k - AFS 벡터 제조
또한 본 발명자들은 pSe2Bb1k-gfp(Chwa JW, Kim UJ, Sim SJ, Um Y, Woo HM (2016) Engineering of a modular and synthetic phosphoketolase pathway for photosynthetic production of acetone from CO2 in Synechococcus elongatus PCC 7942 under light and aerobic condition. Plant Biotech J 14:1768-1776) 벡터의 gfp 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후, 그 자리에 파네신 합성효소 유전자(AFS) 유전자의 DNA 시퀀스(서열번호 4)를 삽입하여 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터를 제조하였다(도 5 참조). 여기서 상기 AFS 유전자는 파네실 디포스페이트 (FPP)로부터 파네신(Farnesene)을 생산하는 효소를 코딩하는 유전자이다.
< 실시예 3>
본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 파네신 대량 생산능을 갖는 시네코코커스 일롱게투스 균주의 제조
상기 실시예 2에서 제작한 총 3개의 재조합 벡터로 야생형 시네코코커스 일롱게투스 PCC 7942 균주를 형질전환하여 MEP 대사경로가 도입된 파네신 대량 생산능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 제조하였는데, 이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 상기 실시예 2에서 제조한 pSe2Bb1k-AFS 벡터를 야생형 시네코코커스 일롱게투스 PCC 7942 균주의 Neutral site-II에 삽입시켜 파네신 생산을 위한 균주를 제조한 후, pSe2Bb1k-AFS 벡터가 도입된 상기 균주에 pSe1Bb1s-dxs 벡터 및 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 벡터가 각각 도입된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 제조하였다(도 2 참조).
이때, pSe1Bb1s-dxs 벡터 및 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 PCC 7942 균주의 Neutral site-I 에 각각 삽입시켰고 상기 형질전환은 Natural transformation 방법을 이용하여 수행하였다.
또한, 본 발명자들은 pSe2Bb1k-AFS 벡터가 도입된 균주를 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 벡터로 형질전환시킨 시네코코커스 일롱게투스 균주를 2017년 10월 18일자로 한국미생물보존센터 기관에 균주 기탁하여 기탁번호 KCCM12133P를 부여받았다.
또한, 본 발명에서 제조한 재조합 벡터로 형질전환이 제대로 되었는지의 여부를 확인하기 위해, 하기와 같은 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 확인한 결과, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환이 되었음을 확인하였다. 형질전환 여부는 하기 프라이머를 이용하여 PCR 산물크기로 확인할 수 있으며, PCR 산물을 이용한 시퀀싱 분석으로 시네코코커스 일롱게투스 chromosome 내에 벡터가 잘 삽입되었음을 확인하였다.
<프라이머 서열>
NSI-forward : AAG CGC TCC GCA TGG ATC TG (서열번호: 5)
NSI-reverse : CAA GGC AGC TTG GAA GGG CG (서열번호: 6)
NSII-forward : GGC TAC GGT TCG TAA TGC CA (서열번호: 7)
NSII-reverse : GAG ATC AGG GCT GTA CTT AC (서열번호: 8)
< 실시예 4>
본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 이산화탄소를 이용한 파네신 생산능 확인
상기 실시예 3에서 제조한 본 발명의 3가지 형질전환 균주들을 배양하여 직접적으로 5% 이산화탄소로부터 파네신을 생산할 수 있는지의 여부를 분석하였다. 이를 위해 먼저 100 mL 배양용기에 10 mM MOPS 버퍼가 포함된 BG-11 배지를 80 mL 첨가하고, 상기 실시예에서 제조한 본 발명의 파네신 생산 형질전환 균주 3가지를 처음 배양 시 OD 0.6으로 희석하여 각각 첨가하였다. 배양 시 spectinomycin 항생제 10 μg/mL 과 kanamycin 항생제 10 μg/mL를 넣어준 뒤 정치배양기에서 30 oC, 100 μE·m-2·s-1, 5% CO2를 연속적으로 공급조건 하로 배양하였다. 24시간 배양 후, 유전자 발현에 필요한 인듀서인 1 mM IPTG 와 생산된 파네신으로부터 세포의 독성을 억제시키는 역할을 하는 20%의 dodecane을 처리하고, 7일 동안 배양 후, 730 nm 파장에서 optical density와 dodecane 층의 파네신 생산량을 측정하였다. 이때 상기 3가지 돌연변이 균주는, (i) pSe2Bb1k-AFS 벡터만 도입된 시네코코커스 일롱게투스 균주, (ii) pSe2Bb1k-AFS 벡터가 도입된 균주에 pSe1Bb1s-dxs 벡터가 도입된 시네코코커스 일롱게투스 균주, (iii) pSe2Bb1k-AFS 벡터가 도입된 균주에 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 벡터가 도입된 시네코코커스 일롱게투스 균주를 말한다.
이후, 본 발명의 형질전환된 균주가 파네신을 생산하는지 여부를 알아보기 위해 dodecane층 100 μl 에 ethyl acetate 900 μL (내부표준물질 5μg/mL caryophyllene 첨가)를 첨가하고 GC-MS 분석을 수행하였다.
분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주가 생산하는 물질이 대조군으로 사용한 베타-파네신 (No. 73492, Sigma-Aldrich) 피크와 정확하게 일치하는 것으로 나타났으며, 본 발명의 균주에서 생산하는 물질이 파네신(알파-파네신)임을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명에서 제조한 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는 이산화탄소로부터 파네신을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명에서 제조한 3가지 형질전환 균주 모두 이산화탄소로부터 파네신을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었고, 특히 dxs 유전자, idi 유전자, ispA 유전자 및 AFS 유전자가 모두 삽입된 시네코코커스 일롱게투스 형질전환 균주는 최대 4.6 mg/L의 파네신을 생산할 수 있어 매우 높은 파네신 생산능을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12133P 20171018
<110> SUNGKYUNKWAN UINVERSITY IDUSTRY COOPERATION <120> Transformed synechococcus elongatus strains having improved productivity of farnesene and use thereof <130> PN1709-362 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dxs DNA sequence <400> 1 atgagctttg atatcgccaa ataccccacc ctggccctgg tggatagcac ccaggaactg 60 cgcctgctgc ccaaagaaag cctgcccaaa ctgtgcgatg aactgcgccg ctacctgctg 120 gatagcgtga gccgcagcag cggccacttt gccagcggcc tgggcaccgt ggaactgacc 180 gtggccctgc actacgtgta caacaccccc tttgatcagc tgatctggga tgtgggccac 240 caggcctacc cccacaaaat cctgaccggc cgccgcgata aaatcggcac catccgccag 300 aaaggcggcc tgcacccctt tccctggcgc ggcgaaagcg aatacgatgt gctgagcgtg 360 ggccacagca gcaccagcat cagcgccggc atcggcatcg ccgtggccgc cgaaaaagaa 420 ggcaaaaacc gccgcaccgt gtgcgtgatc ggcgatggcg ccatcaccgc cggcatggcc 480 tttgaagcca tgaaccacgc cggcgatatc cgccccgata tgctggtgat cctgaacgat 540 aacgaaatga gcatcagcga aaacgtgggc gccctgaaca accacctggc ccagctgctg 600 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360 tttgccgccc gcaccaccag cgccctgcag atcaacgatg atgaagtgat ggattaccag 420 tggtgcgatc tggccgatgt gctgcacggc atcgatgcca ccccctgggc ctttagcccc 480 tggatggtga tgcaggccac caaccgcgaa gcccgcaaac gcctgagcgc ctttacccag 540 ctgaaatag 549 <210> 3 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA DNA sequence <400> 3 atggattttc cccagcagct ggaagcctgc gtgaaacagg ccaaccaggc cctgagccgc 60 tttatcgccc ccctgccctt tcagaacacc cccgtggtgg aaaccatgca gtacggcgcc 120 ctgctgggcg gcaaacgcct gcgccccttt ctggtgtacg ccaccggcca catgtttggc 180 gtgagcacca acaccctgga tgcccccgcc gccgccgtgg aatgcatcca cgcctacagc 240 ctgatccacg atgatctgcc cgccatggat gatgatgatc tgcgccgcgg cctgcccacc 300 tgccacgtga aatttggcga agccaacgcc atcctggccg gcgatgccct gcagaccctg 360 gcctttagca tcctgagcga tgccgatatg cccgaagtga gcgatcgcga tcgcatcagc 420 atgatcagcg aactggccag cgccagcggc atcgccggca tgtgcggcgg ccaggccctg 480 gatctggatg ccgaaggcaa acacgtgccc ctggatgccc tggaacgcat ccaccgccac 540 aaaaccggcg ccctgatccg cgccgccgtg cgcctgggcg ccctgagcgc cggcgataaa 600 ggccgccgcg ccctgcccgt gctggataaa tacgccgaaa gcatcggcct ggcctttcag 660 gtgcaggatg atatcctgga tgtggtgggc gataccgcca ccctgggcaa acgccagggc 720 gccgatcagc agctgggcaa aagcacctac cccgccctgc tgggcctgga acaggcccgc 780 aaaaaagccc gcgatctgat cgatgatgcc cgccagagcc tgaaacagct ggccgaacag 840 agcctggata ccagcgccct ggaagccctg gccgattaca tcatccagcg caacaaatag 900 900 <210> 4 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFS DNA sequence <400> 4 atggaatttc gcgtgcacct gcaggccgat aacgaacaga aaatctttca gaaccagatg 60 aaacccgaac ccgaagccag ctacctgatc aaccagcgcc gcagcgccaa ctacaaaccc 120 aacatctgga aaaacgattt tctggatcag agcctgatca gcaaatacga tggcgatgaa 180 taccgcaaac tgagcgaaaa actgatcgaa gaagtgaaaa tctacatcag cgccgaaacc 240 atggatctgg tggccaaact ggaactgatc gatagcgtgc gcaaactggg cctggccaac 300 ctgtttgaaa aagaaatcaa agaagccctg gatagcatcg ccgccatcga aagcgataac 360 ctgggcaccc gcgatgatct gtacggcacc gccctgcact ttaaaatcct gcgccagcac 420 ggctacaaag tgagccagga tatctttggc cgctttatgg atgaaaaagg caccctggaa 480 aaccaccact ttgcccacct gaaaggcatg ctggaactgt ttgaagccag caacctgggc 540 tttgaaggcg aagatatcct ggatgaagcc aaagccagcc tgaccctggc cctgcgcgat 600 agcggccaca tctgctaccc cgatagcaac ctgagccgcg atgtggtgca cagcctggaa 660 ctgcccagcc accgccgcgt gcagtggttt gatgtgaaat ggcagatcaa cgcctacgaa 720 aaagatatct gccgcgtgaa cgccaccctg ctggaactgg ccaaactgaa ctttaacgtg 780 gtgcaggccc agctgcagaa aaacctgcgc gaagccagcc gctggtgggc caacctgggc 840 atcgccgata acctgaaatt tgcccgcgat cgcctggtgg aatgctttgc ctgcgccgtg 900 ggcgtggcct ttgaacccga acacagcagc tttcgcatct gcctgaccaa agtgatcaac 960 ctggtgctga tcatcgatga tgtgtacgat atctacggca gcgaagaaga actgaaacac 1020 tttaccaacg ccgtggatcg ctgggatagc cgcgaaaccg aacagctgcc cgaatgcatg 1080 aaaatgtgct ttcaggtgct gtacaacacc acctgcgaaa tcgcccgcga aatcgaagaa 1140 gaaaacggct ggaaccaggt gctgccccag ctgaccaaag tgtgggccga tttttgcaaa 1200 gccctgctgg tggaagccga atggtacaac aaaagccaca tccccaccct ggaagaatac 1260 ctgcgcaacg gctgcatcag cagcagcgtg agcgtgctgc tggtgcacag cttttttagc 1320 atcacccacg aaggcaccaa agaaatggcc gattttctgc acaaaaacga agatttgctg 1380 tacaacatca gcctgatcgt gcgcctgaac aacgatctgg gcaccagcgc cgccgaacag 1440 gaacgcggcg atagccccag cagcatcgtg tgctacatgc gcgaagtgaa cgccagcgaa 1500 gaaaccgccc gcaaaaacat caaaggcatg atcgataacg cctggaaaaa agtgaacggc 1560 aaatgcttta ccaccaacca ggtgcccttt ctgagcagct ttatgaacaa cgccaccaac 1620 atggcccgcg tggcccacag cctgtacaaa gatggcgatg gctttggcga tcaggaaaaa 1680 ggcccccgca cccacatcct gagcctgctg tttcagcccc tggtgaacta g 1731 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSI-foward primer <400> 5 aagcgctccg catggatctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSI-reverse primer <400> 6 caaggcagct tggaagggcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSII-forward primer <400> 7 ggctacggtt cgtaatgcca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSII-reverse primer <400> 8 gagatcaggg ctgtacttac 20

Claims (14)

  1. 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 파네신 합성효소 유전자(AFS)를 포함하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 데옥시크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소 유전자(dxs)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 아이소펜테닐-디포스페이트 델타 아이소머라아제(idi) 유전자 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 파네실 디포스페이트 합성 효소(ispA) 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCCM12133P의 균주인 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 도 5의 벡터 지도를 갖는 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 균주는 도 6의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터로 더 형질전환된 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 균주는 도 7의 벡터 지도를 갖는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터로 더 형질전환된 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 pSe2Bb1k-AFS 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 II(Neutral site-II)에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 pSe1Bb1s-dxs 재조합 벡터 또는 pSe1Bb1s-dxs,idi,ispA 재조합 벡터는 야생형 시네코코커스 일롱게투스 균주의 뉴트럴 사이트 I(Neutral site-I)에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 이산화탄소를 이용하여 파네신을 생산하는 것을 특징으로 하는, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주.
  11. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양은 이산화탄소를 공급하는 것을 특징으로 하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    소수성 용매(solvent)에 용해된 파네신(farnesene)을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 파네신(farnesene)을 대량 생산하는 방법.
  14. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소를 제거 또는 저감하는 방법.
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