KR20190043414A - 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 분화 유도용 조성물 - Google Patents
닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 분화 유도용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 분화 유도용 조성물 등에 관한 것으로서, 유추기 닭 골수 유래 골·연골전구세포는 증식능력이 높아 대량배양이 가능하고, 연골세포로 분화를 유도하는 다양한 단백질을 왕성하게 분비하는 질 좋은 골·연골전구세포로써, 본 발명에 따른 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 조성물은 2차골화중심이 생성되지 않은 유추기 닭 골수 유래 골·연골전구세포의 배양액을 이용하여, 저비용 고효율의 연골세포 분화 유도제를 제공할 수 있다. 이에 본 발명은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등의 새로운 연골의 생성 또는 재생이 필요한 연골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 관절 건강을 위한 건강기능식품으로 활용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 분화 유도용 조성물 등에 관한 것이다.
연골은 뼈와 함께 골격을 구성하고 내부 기관들의 보호 역할을 하며, 연골 조직은 연골세포들과 그것을 둘러싼 연골 매트릭스로 이루어진다. 연골은 중간엽-유래의 연골아 세포에 의해 형성되는데, 연골아 세포는 세포 분화와 성장의 과정 동안 주변에 매트릭스를 만들어낸다. 연골 매트릭스의 주요 성분들은 프로테오글라이칸과 콜라겐이다(타입 II, 타입 IX 등). 프로테오글라이칸은 연골조직에 특유한 흡수(팽화) 특성에 관여하고, 콜라겐은 긴장과 전단력에 대항하여 연골의 단단함에 관여하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다. 연골장애로 인한 알려진 병들의 예들은 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 추간판증 또는 반월판 손상을 포함한다.
지금까지 개발된 손상 연골의 치료법으로는 연골성형술(chondroplasty), 골연골이식술(osteochondraltransplantation), 자기유래연골세포 이식술(autolaugous chondrocyte transplantation) 등을 들 수 있다.
상기 연골성형술은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 직접적인 관절 절개가 필요 없어 환자의 고통 및 부담을 줄일 수 있으며, 관절경을 통해 미세한 조직손상을 관찰 즉시 치료할 수 있다는 장점을 지닌다. 그러나 연골성형술에서는 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유 연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.
한편 골연골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다.
최근 시행되기 시작한 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수만큼 배양하고 증식한 후, 이를 연골 손상부위에 골막(periosteum)을 이용하여 공간을 확보하고 배지와 함께 주입하여, 이 세포들의 증식에 의해 손상된 연골 부분을 채우도록 하는 방법이다. 그러나 자가 유래 연골세포 이식술은 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다.
상기 방법을 응용하여 자가 유래 골수(bone marrow), 근육, 피부 등의 중간엽 조직으로부터 연골세포(chondrocyte)의 전구모세포(precursor cell)인 중간엽세포(mesenchymal stem cell; MSC)를 얻고, 체외에서 분화시켜 고분자와 함께 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 보고 된 바 있다. 상기와 같이 성숙된 개체에서 얻은 중간엽세포를 이용하여 연골손상을 치료하는 방법은 자가 유래 연골세포 이식술에 비해, 보다 미분화된 세포를 얻어 체외 배양하므로 세포 증식력이 다소 높아지는 것으로 나타났다. 상기 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들로는 BMP(bone mophogenetic protein), TGF-β(transforming growth factor β), FGF(fibroblast growth factor), IGF-I(insulin-like growth factor), 파라티로이드 호르몬 관련 펩타이드가 알려져 있다. 그러나 상기 분화인자들은 중간엽세포에서 연골세포로의 분화 유도시 원치 않는 다른 세포로의 분화를 유발하는 문제점을 가지고 있다. 즉, TGF-β의 경우 중간엽세포가 비대연골세포로 분화될 위험이 있으며, BMP의 경우 골증식체(osteophyte formation)로 분화될 위험이 있다.
따라서, 기존의 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들에 비해 부작용이 적고, 효과적인 분화 유도용 물질에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
한편, 닭의 유추기는 뼈의 성장속도가 매우 빠른 시기로 연골이 뼈로 대체되는 연골내 골화(endochondral ossification)가 진행되고 있는 골 성장기이다. 이 시기에 닭의 대퇴부 장골은 아직 석회화가 진행되지 않은 초자연골이 다량 존재한다. 연골내 골화는 길쭉하게 생긴 뼈, 즉 장관 골을 형성할 때 나타나는 골 형성 과정으로 지아(limb bud) 내부의 중간엽세포들이 뭉치면서 연골세포로 분화하여 원골 원기(cartilage anlage)가 생성된 후 원기 중앙부의 연골세포가 선택적으로 비대해지고 석회화(calcification)가 일어나 죽게 되는데 여기로 혈관이 자라 들어오면서 따라 들어온 중간엽세포들이 골모세포로 분화(일차 골화중심)하면서 뼈가 생성되게 된다. 이러한 연골내 골화 과정은 일차 골화 중심에서 장관 골 양 끝단으로 진행되며, 연골 원기에서는 연골세포 증식이 지속되어 길이 성장을 하게 된다. 연골 원기 양단에서 별도의 이차 골화 중심이 출현하며, 일차 골화 중심에 의해서 골화되는 간단부(metaphysis)와 이차 골화 중심에 의해서 형성되는 골단부(epiphysis) 사이에 잔존하는 연골을 골단판(epiphyseal plate)이라 하며 성장이 완료될 때까지 지속적으로 연골세포 증식과 연골내 골화가 진행된다.
이러한 골 발생과정에서 골과 연골을 생성할 수 있는 전구세포는 분화가 완료된 골세포 혹은 연골세포의 중간 단계에 위치하는 세포이다. 이 세포의 장점은 분화 방향 조절의 한계가 있는 줄기세포와 달리 연골과 골 양방향으로 분화할 수 있는 분화 방향이 정해져 있으며, 분화 완료된 세포에 비해 증식능력이 높아서 대량배양이 가능하다. 또한, 골과 연골 생성과 관련된 성장인자와 사인토카인 및 다양한 단백질들을 분비하여 그 활성물질을 활용한 연구들이 진행되고 있지만 아직 연구단계에 머물고 있다. 특히, 닭의 골·연골 전구세포 분비물에 대한 연구는 전무한 상태이다.
본 발명자들은 유추기 닭의 장골에서 골·연골전구세포를 대량 배양하여 확보한 세포배양액이 인간 줄기세포의 연골 분화를 유도할 수 있는 사실을 확인하고, 줄기세포의 조골세포로의 분화에 닭의 골·연골 전구세포의 배양 농축액을 사용할 수 있는지 예의 연구한 결과, 지방조직 유래 줄기세포의 연골분화 유도시 닭의 골·연골 전구세포의 배양 농축액을 혼합 처리함으로써 조골세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
더욱이 세계적으로 연간 25억 마리 이상 비인도적 방법으로 살처분되는 폐기자원인 유추기 수컷 병아리의 생산적 활용에 대한 새로운 방법이 요구되고 있는 상황에서 유추기 닭의 세포를 이용하는 기술은 닭 활용측면의 새로운 방향을 제시할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 다분화능(multipotency)를 가지는 줄기세포의 연골세포(chondrocyte)로의 분화를 유도하는 인자를 발굴하고자 예의 연구한 결과, 닭의 장골 유래의 골·연골전구세포 배양액이 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 생성 유도용 조성물 및 상기 배양액을 처리하여 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 유도된 연골세포를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 연골 생성 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 닭은 유추기 닭일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물의 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 닭은 유추기 닭일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계는 줄기세포를 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화 유도된 연골세포의 연골 손상 또는 연골 결손 질환의 치료 용도를 제공한다.
유추기 닭 골수 유래 골·연골전구세포는 증식능력이 높아 대량배양이 가능하고, 연골세포로 분화를 유도하는 다양한 단백질을 왕성하게 분비하는 질 좋은 골·연골전구세포로써, 본 발명에 따른 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 조성물은 2차골화중심이 생성되지 않은 유추기 닭 골수 유래 골·연골전구세포의 배양액을 이용하여, 저비용 고효율의 연골세포 분화 유도제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 골·연골전구세포의 획득을 위하여 살처분되는 유추기 병아리를 이용하므로 경제적이고, 이를 통해 폐기자원으로 여겨지는 수병아리 활용의 새로운 장을 제시할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 농축액, 분말, 젤 등 다양한 제형으로 구현이 가능하고, 그 제형에 따라서 다양한 처치방법을 구현할 수 있으며, 지방조직 유래 줄기세포뿐만 아니라 골수, 치주, 제대혈 등 다양한 성체 조직 유래 줄기세포에도 공통적으로 활용 가능할 것으로 기대된다.
이에 본 발명은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등의 새로운 연골의 생성 또는 재생이 필요한 연골 손상 질환의 치료제, 보조제뿐만 아니라 관절 건강을 위한 건강기능식품으로 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액 제조과정의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 4일령 병아리의 장골을 염색하여 그 상태를 확인한 도면이다.
도 2b는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 형태를 확인한 도면이다.
도 2c는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 유전자 발현을 확인한 도면이다.
도 2d는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 단백질 발현을 확인한 도면이다.
도 2e는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 세포가 골·연골 전구세포임을 확인한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 촬영한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 단백질 발현을 분석하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 4a는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액의 처리에 따라 인간 지방조직 유래 줄기세포가 연골세포로 분화됨을 확인한 도면이다.
도 4b는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액을 연골 분화 유도제로 이용할 수 있음을 확인한 도면이다.
도 5는 연골분화 유무를 확인할 수 있는 단백질 Sox9, Collagen type Ⅰ(Col I), Collagen type Ⅱ(ColⅡ)를 염색하여 나타낸 것이다.
도 2a는 4일령 병아리의 장골을 염색하여 그 상태를 확인한 도면이다.
도 2b는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 형태를 확인한 도면이다.
도 2c는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 유전자 발현을 확인한 도면이다.
도 2d는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포에서 골 및 연골 전구세포 관련 단백질 발현을 확인한 도면이다.
도 2e는 4일령 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 세포가 골·연골 전구세포임을 확인한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 촬영한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 단백질 발현을 분석하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득한 세포의 다분화능을 검증하여 상기 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인한 도면이다.
도 4a는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액의 처리에 따라 인간 지방조직 유래 줄기세포가 연골세포로 분화됨을 확인한 도면이다.
도 4b는 닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액을 연골 분화 유도제로 이용할 수 있음을 확인한 도면이다.
도 5는 연골분화 유무를 확인할 수 있는 단백질 Sox9, Collagen type Ⅰ(Col I), Collagen type Ⅱ(ColⅡ)를 염색하여 나타낸 것이다.
본 발명자들은 다분화능(multipotency)를 가지는 줄기세포의 연골세포(chondrocyte)로의 분화를 유도하는 인자를 발굴하고자 예의 연구한 결과, 닭의 장골 유래의 골·연골전구세포 배양액이 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은, 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 및 연골 생성 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 골·연골전구세포 배양액은 농축된 것일 수 있으며, 상기 배양액이 농축된 “배양농축액”은 진공여과장치를 이용하여 골·연골전구세포를 배양한 배양액에서 세포 및 세포찌꺼기를 여과하고, 상기 여과된 배양액을 필터를 이용하여 2 내지 1000배, 바람직하게는 50 내지 150배 농축하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 “골·연골전구세포 (Osteochondroprogenitor Cell)”란 골 및 연골로 분화능이 있으나, 그 운명이 아직 결정되지 않은 세포로서, 중간엽줄기세포와 골세포로 분화하는 골 전구세포(Osteoprogenitor Cells)의 사이 단계, 또는 연골세포로 분화하는 연골 전구세포(Chondroprogenitor Cells)의 사이 단계의 세포이고, 골수뿐만 아니라 골조직 내에도 존재한다.
본 발명의 일 측면에 따르면 상기 골·연골전구세포는 닭 골수 유래 골·연골전구세포이며, 바람직하게는 4일령 병아리의 장골(대퇴부뼈 및 종아리뼈)로부터 획득된 골·연골전구세포이다
본 발명의 일 실시예에 따르면 부화 후 4일 이내의 병아리의 대퇴부뼈 및 종아리뼈에서 세포를 회수하여(실시예 1-1 참조), 광학현미경으로 관찰한 결과 상기 회수된 세포는 입방형태(small and cuboidal shape)의 형태학적 특성을 갖으며(실시예 1-3 참조), 나아가 상기 회수된 세포의 분화능을 분석한 결과, 상기 회수된 세포가 골세포 및 연골세포로는 분화하지만 지방세포로는 분화되지 않음을 근거로 상기 회수된 세포가 골·연골전구세포임을 확인할 수 있었다(실시예 1-4 참조).
본 발명에서 “줄기세포(stem cell)”란 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 골세포로 분화될 수 있는 중간엽줄기세포일 수 있다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있다. 줄기세포는 전분화능(pluripotency)또는 다분화능 (multipotency)을 가지고 있다.
본 발명에서 “중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포라면 제한되지 아니하며, 일반적으로 중배엽 줄기세포는 방추형(Spindle shape)의 형태학적 특성과 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에 따르면 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 이용하여 연골세포로의 분화가 유도되는 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 상기 중간엽줄기세포가 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 모두 이용될 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 공지의 공급원, 예를 들어, 지방, 골수, 조직, 배아, 혈액, 골수 치주, 제대혈 등으로부터 얻을 수 있는 다양한 성체 조직 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 지방조직에서 단세포 중간엽줄기세포를 분리하여 세포 표현형을 분석하여 CD105(+), CD73(+) CD31(-), CD45(-), HLA-DR(-), CD166(+), CD34(-), CD90(+)의 발현을 확인하고, 골세포, 연골세포, 및 지방세포로의 다분화능을 검증함으로써 상기 분리된 세포가 중간엽줄기세포임을 확인하였다(실시예 2 참조).
이에 본 발명자들은 닭의 골·연골전구세포를 배양하여 상기 세포의 무혈청 배양액을 제조하고 상기 배양액을 농축하여(실시예 1-5 및 1-6 참조), 상기 배양농축액이 중간엽줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 효과가 있음을 실험을 통해 확인하였다(실시예 3-2 및 3-3 참조).
이에 본 발명은 골·연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 줄기세포에 처리함으로써 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. 본 발명의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도는 생체 내 또는 생체 외에서 이루어질 수 있다. 상기 배양액 또는 배양농축액을 줄기세포의 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 즉 일정 시간 동안 상기 배양액 또는 배양농축액을 줄기세포에 접촉시켜 줄기세포가 연골세포로 분화 유도될 수 있기만 하면 된다.
본 발명의 일 구현예로서 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도가 생체 외에서 이루어지는 경우, 줄기세포를 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 포함하는 배양배지에서 배양함으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “배양액”이란 분리된 줄기세포의 시험관 내에서 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 액체 배지에 줄기세포를 일정기간 배양한 후 세포를 제거하고 남은 용액을 의미하며, 배양기간동안 세포로부터 분비된 성장 인자 및 사이토카인 등의 단백질 및 세포 배양시 소모되고 남은 영양성분 등도 모두 포함한다. 상기 배지는 성체줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함하며, 배지 및 배양 조건은 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 줄기세포 배양배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량 원소 성분을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cellculture minimum medium; CCMM)일 수 있으며, 그 비제한적인 예로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgows Minimal essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제 및/또는 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인간혈청알부민(human serum albumin) 등의 혈청 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 10% 우태아혈청 및 1% 항제제가 포함된 DMEM 배지를 줄기세포 배양배지로 하였다.
또한, 본 발명에서 “배양농축액”이란 상기 배양액을 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 원심분리 등)에 의해 수거하여 농축함으로써 획득되는 것을 의미한다. 농축한 배양액은 냉동보관할 수 있고, 필요에 따라 해동시켜 원하는 농도로 희석하여 사용할 수 있으며, 이를 건조한 건조분말을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골·연골전구세포 배양농축액은 골·연골전구세포를 배양한 배양액을 진공여과장치를 이용하여 세포 및 세포찌꺼기를 여과하고, 상기 여과된 배양액을 필터를 이용하여 2 내지 1000배, 바람직하게는 50 내지 150배, 더욱 바람직하게는 100배 농축하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.또한, 본 발명은 상기 방법으로 연골세포로의 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 포함하는 세포치료제를 제공함으로써, 상기 세포치료제를 개체에 투여하여 연골손상 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
또한, 본 발명의 골·연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 연골의 재생 또는 형성이 필요한 질환에 치료에 적용할 수 있다.
이에 본 발명은 골·연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 연골손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 농축액, 분말, 젤 등 다양한 제형으로 구현이 가능하며, 그 제형에 따라 다양한 처치방법을 구현할 수 있다.
본 발명에서 “연골 손상 질환” 또는 “연골 질환”은 그 치료에 있어서 연골의 재생 또는 형성이 필요한 질환을 의미하고, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환으로써, “연골 결손 질환”을 포함하는 의미로 이해될 수 있다. 비제한적인 예로서 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상 등이 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 연골손상 또는 연골 자체 관련 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 골·연골전구세포 배양액 또는 상기 배양액을 농축한 배양농축액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 연골손상 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있으며, 상기 연골손상 또는 연골 자체 관련 질환은 바람직하게는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있다.
본 발명에서 용어, “개체”는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 구체적으로 연골 질환의 치료가 필요한 반려견, 경주마, 인간 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 포함하는 조성물의 처리에 의해 분화 유도된 연골세포로의 분화가 유도된 줄기세포를 세포치료제로서 인간에 투여하는 경우, 상기 줄기세포는 세포치료제를 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 배양액 또는 배양농축액의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 상기 배양액 또는 배양농축액의 골손상 또는 골 자체 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여방법에 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액 이외에 공지된 연골분화유도제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명의 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 연골 관련 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 연골의 재생 또는 형성이 필요한 연골 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 g을 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 골수 내 골·
연골전구세포
분리·배양 및 세포배양농축액 제조
1-1. 유추기 닭의 장골 내
초자연골과
골수에서 골과 연골로 분화할 수 있는
전구세포
회수
부화 후 4일 이내의 병아리의 양쪽 다리에서 대퇴부뼈(femur)와 종아리뼈(tibia) 부분을 회수하여 2회 세정하였다. 뼈에 부착된 근육과 힘줄을 깨끗하게 제거한 후 다시 2회 세정하였다. 모든 세정과정은 1% 항생제와 항균제가 포함된 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS)을 사용하였다. 이후 수술용 가위를 이용하여 뼈 양쪽의 경화된 부분을 제거하고 18 게이지(gauge, G) 주사바늘로 구멍을 내고, 1% 항생제와 2% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 PBS를 18G 주사바늘을 부착한 3㎖ 의료용 주사기에 담아 뼈 끝의 구멍에 밀어 넣어 뼈 내의 매트릭스를 회수하고, 양쪽 방향으로 3회 반복 실시하였다. 대퇴부뼈는 18G 바늘을 사용하였고 종아리뼈는 20G 바늘을 사용하여 회수하였다. 1마리 당 총 4개의 뼈에서 회수한 매트릭스를 14㎖ round bottom 튜브에 모으고 회수할 때 사용한 주사기로 10회 통과시켜 조직을 균질화(homogenization) 하였다. 50㎖ 코니칼 튜브(conical tube)에 100㎛ pore mesh를 걸치고 균질화된 매트릭스를 걸러 회수 당시 유입된 뼛조각이나 살점을 걸러내었다. PBS를 튜브에 채우고 원심분리기를 이용하여 320G에서 4분 동안 원심분리하여 튜브 하단부에 침전된 세포 덩어리인 세포 펠렛(pellet)을 획득하였다. 이어서, 상층액을 제거하고 기본 배지 (F12/DMEM) 5㎖을 넣어 상기 세포 펠렛(pellet)을 풀어 단세포화 하였다.
1-2. 닭의 골·연골
전구세포의
배양
상기 실시예 1-1에서 회수한 세포를 배양용기 1 ㎠ 면적당 3×106 세포의 밀도로 3.151 g/L 의 D-glucose, 365 ㎎/L(2.5mM)의 L-glutamine, 55 ㎎/L(0.5mM)의 sodium pyruvate, 10% FBS, 1% 항생-항균제가 보충된 F12/DMEM 배지에 넣어 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 계대배양은 세포의 컨플루언시(confluency)가 약 80~90% 되었을 때 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 0.25% Trypsin-EDTA를 2분 동안 처리한 후 세포부유액을 회수하여 320G에서 4분 동안 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 세포 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다.
1-3. 닭 골·연골
전구세포의
특성분석
유추기 닭 장골 내부의 형태학적 상태를 분석하기 위하여 헤마토실린-에오신 염색법(hematoxylin-eosin staining; H&E staining)으로 조직학적 염색을 실시하였다. 4일령 병아리의 장골을 4% 파라포름알데하이드 고정액에 담가 24시간 동안 상온에서 고정하였다. 고정한 조직을 수세 후 디칼시피케이션 과정과 투명화 및 탈수화 과정을 거친 후 파라핀에 포매 하였다. 6㎛의 두께로 조직절편을 제작 한 후 60℃ 가열블락(Heating block)에 45분간 놓아 두어 탈파라핀화 하였다. Xylene 5분씩 3회, 100% Ethanol 5분씩 3회, 95% Ethanol 2분씩 2회, 70% Ethanol 2분씩 2회, 증류수로 2분씩 2회 과정을 순차적으로 시행하였다. 수화(hydration) 과정을 마친 조직절편을 1% 헤마톡실린용액 30초, 증류수 세척, 0.25% 염화수소 1초, 증류수 세척, 리튬카보네이트 발색을 순차적으로 진행하여 핵을 염색하였다. 에오신을 2초간 처리하여 세포질을 염색한 뒤 탈수와 투명화 후 봉입(mounting) 하여 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 4일령 병아리의 장골은 총 면적의 60% 이상이 다양한 상태(stage)의 연골세포로 채워져 있으며, 골말단(epiphysis)은 아직 2차 골화중심이 생성되지 않은 초자연골 상태로 유지하고 있음을 확인하였다.
이어서, 상기 실시예 1-1 및 1-2를 통해 회수하여 배양된 세포의 형태를 광학현미경으로 촬영하여 확인하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 닭의 골·연골 전구세포는, 일반적으로 중간엽줄기세포가 방추형의 형태를 갖는 것과 달리, 입방형태(small and cuboidal shape)를 가짐을 확인할 수 있었다.
이어서, 상기 실시예 1-1에서 회수한 세포를 상기 실시예 1-2의 방법으로 5차 계대배양한 후 골과 연골 전구세포 관련 전사인자인 Sox9 , Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2 유전자 발현량과 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ 단백질 발현량 분석을 실시하였다.
구체적으로, 상기 유전자 발현량 분석을 위하여 RNA는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 이용하여 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법으로 추출하고, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Sox9 , Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2, 및 항존유전자인 β-actin 유전자를 대조유전자로 하여 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었고, 상기 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 분석한 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
또한, 상기 단백질 발현량을 분석하기 위하여 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정한 후, PBS로 3회 세정하고, 1% BSA와 10% goat serum 용액으로 블로킹(blocking)을 하였다. 각 단백질에 대한 1차 항체(Sox9-Milipore사 제조, Col1 및 Col2-abcam사 제조)를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 2회 세정하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체 (Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 2회 세정 후 Dapi (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole) 를 1분간 처리하여 핵을 염색하였다. 마운팅 용액으로 마운팅 후 형광현미경을 사용하여 발현 여부를 분석하여 그 결과를 도 2d에 나타내었다.
그 결과, 도 2c 및 도2d에 나타난 바와 같이. 배양된 세포에서 골·연골 전구세포, 골 전구세포, 또는 연골 전구세포의 특징적인 유전자들이 발현되었으며, 특이 단백질인 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ이 발현됨을 확인할 수 있었다.
1-4. 닭 골·연골 전구세포의 분화능 검증
상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포가 다분화능을 가진 골·연골전구세포인지 여부를 분석하기 위하여 골세포, 지방세포, 연골세포로 각기 분화 유도를 수행하였다.
골세포로의 분화는 10-7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2- phosphate, 10 mM β-glycerophosphate, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alizarin Red S (ARS, Sigma제조) 염색을 수행하여 골세포로의 분화여부를 분석하였다.
지방세포로의 분화는 10-6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl1-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 μg/㎖ bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Oil Red O (ORO, Sigma 제조) 염색을 수행하여 지방세포로의 분화여부를 분석하였다.
연골세포로의 분화는 10 ng/㎖ TGF-ß1, 10-7 M dexamethasone, 1% ITS(Insulin-transferrin-sodium selenite), 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 μg/㎖ linoleicacid, 50 μg/㎖ ascorbicacid-2-phosphate, 40 μg/㎖ L-proline, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 F12/DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하여 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 alcian blue 염색을 수행하여 연골세포로의 분화여부를 분석하였다.
그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포는 골세포와 연골세포로 분화되었지만 지방세포로는 분화되지 않음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포가 골과 연골로 분화할 수 있는 능력을 지닌 골·연골 전구세포임을 의미한다.
1-5. 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액 제조
상기 실시예 1-1의 방법으로 회수된 닭의 세포를 5차 계대배양한 세포의 컨플루언시(confluency)가 약 90~100% 되었을 때 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 3.151 g/L 의 D-glucose, 657 ㎎/L(4.5mM)의 L-glutamine, 110 ㎎/ℓ(1mM)의 sodium pyruvate, 1% 항생-항균제가 보충된 무혈청 F12/DMEM 배지를 넣은 후 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하여 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액 제조하였다.
1-6. 골·연골 전구세포 무혈청 배양농축액 제조
닭의 골·연골 전구세포의 배양농축액 제조를 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-5에서 제조한 배양액을 회수하여 일회용 진공여과장치 (0.45㎛ pore size, Corning 제조)에 넣어 여과하여 잔존하는 세포와 세포찌꺼기(debris)를 제거하였다. 상기 여과된 배양액을 ultra-centrifugal filter (3Kda cut off, Amicon사) 를 이용하여 100배 농축하였다. 상기 농축한 배양액의 단백질 농도는 2 ~ 3 ㎎/㎖ 이고, 상기 배양농축액을 500㎍의 용량으로 분주하여 -20℃에 보관하였다. 이하 실시예에서는 상기 배양농축액을 4℃ 냉장고에서 천천히 녹여 사용하였다.
실시예 2. 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 획득 및 그 특성분석
2-1. 지방조직에서 단세포 중간엽줄기세포 분리 및 배양
채취된 내장지방 조직(장막 지방조직, omental adipose tissue)을 1% 항생제-항균제가 담긴 차가운 PBS에 3회 세척하였다. 상기 세척된 조직에 붙어 있는 혈관, 응고된 혈액, 및 결합조직을 포셉과 수술가위로 제거하고 다시 2회 세척하였다. 상기 조직을 100㎖ 유리병에 담아 수술가위를 이용하여 5 mm2 이하로 잘게 자른 후. 0.1% collagenase type I (sigma-aldrich제조)이 첨가된 DMEM 배지를 조직 볼륨의 2배 되도록 첨가하여 37℃ 항온기에서 효소반응이 충분히 일어날 수 있도록 30분간 천천히 교반하였다. 상기 효소반응 후 배지를 걷어 튜브에 모아 얼음 안에 보관하고 새로운 효소 배지를 넣어 상기 과정을 1회 반복하였다. 1, 2차에 회수한 배지를 합하여 100㎛ pore mesh에 거른 후 320G에서 4분간 원심분리 하였다. 순수지방층을 제거하고 단핵구층을 회수하여 2회 세척 후 적혈구 제거를 위하여 적혈구용혈용액(Gibco BRL 제조)에 담가 상온에서 10분간 반응시켰다. 다시 2회 세척 후 세포수와 세포생존율을 측정하고 ㎠ 면적당 1×105 세포의 밀도로 5 ng/㎖ human recombinant basic fibroblast growth factor (hrbFGF, Gibco BRL 제조), 10% FBS, 1% 항생제가 보충된 F12/DMEM 배지에 분주하여, 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 분주 후 3일마다 배지를 교환해주었으며, 컨플루언시가 80~90% 되었을 때 계대배양을 실시하였다. 5 계대배양 후 세포특성을 분석하고 시험에 사용하였다. 도 3a는 5 계대배양 후 세포를 촬영하여 그 형태를 확인한 것이다.
2-2. 세포 표현형 분석
상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포의 특성을 검증하기 위하여 중간엽줄기세포의 마커인 CD105, CD73, CD31, CD45, HLA-DR, CD166, CD34, CD90 발현 여부를 FACS caliber (B&D Bioscience 제조, CellQuest™ Pro)를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, CD31(혈관내피세포), CD34(조혈모세포), CD45(혈구세포), MHC class II(백혈구항원 클래스II) 항원은 음성, CD105, CD73, CD166, CD90 항원은 양성으로 분석되었으며, 분리된 세포가 중간엽줄기세포의 마커를 모두 발현함을 확인하였다.
2-3. 다분화능 분석
상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포의 다분화능 여부를 분석하기 위하여 골세포, 지방세포, 연골세포로 각기 분화 유도를 수행하였다.
골세포로의 분화는 10-7 M dexamethasone, 0.05 mM ascorbate-2- phosphate, 10 mM β-glycerophosphate, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Alizarin Red S (ARS, Sigma제조) 염색을 수행하여 골세포로의 분화여부를 분석하였다.
지방세포로의 분화는 10-6 M dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-siobutyl1-methylxanthine), 0.1 mM indomethacin, 10 μg/㎖ bovine insulin (PH 2.5), 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하며 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 Oil Red O (ORO, Sigma 제조) 염색을 수행하여 지방세포로의 분화여부를 분석하였다.
연골세포로의 분화는 10 ng/㎖ TGF-ß1, 10-7 M dexamethasone, 1% ITS, 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 μg/㎖ linoleicacid, 50 μg/㎖ ascorbicacid-2-phosphate, 40 μg/㎖ L-proline, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 F12/DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교환하여 21일간 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 alcian blue 염색을 수행하여 연골세포로의 분화여부를 분석하였다.
그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2-1에서 분리·배양한 중간엽줄기세포가 골세포, 지방세포, 연골세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 사람 지방조직 유래 중간엽줄기세포 연골분화 유도 시험
상기 실시예 2 에서 확보한 사람 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 대상으로 실시예 1에서 제조된 배양배지 농축액을 100㎍/㎖ 농도로 줄기세포 배양배지(10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지)에 첨가하여 연골세포 분화 유도시험을 시행하였다. 양성대조군은 1X ITS, 1.25 ㎎/㎖ BSA, 5 μg/㎖ linoleic acid, 50 μg/㎖ ascorbic acid-2-phosphate, 10 ng/㎖ TGF-ß1, 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다.
3-1. 연골세포 분화 유도
상기 실시예 2에서 획득한 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 5 계대배양시 2~2.5×105개의 세포를 15㎖ 코니칼 튜브(SPL 제조)에 넣은 후 320G로 1분 동안 원심분리하여 침전시켜 펠렛을 만들었다. 연골세포 분화는 하기 3가지 배지에서 각각 상기 펠렛을 10일간 배양하여 수행하였으며, 배지는 3일에 한번씩 교환하였다. 연골세포로 분화되었는지 여부는 알시안 블루(alician blue) 염색법을 사용하였다.
1) 음성대조군: Non-induction 배양배지(줄기세포 배양배지) 2) 양성대조군: TGF-ß1 기반 연골세포 유도 분화배지 3) 실험군: 상기 실시예 1-6에서 제조한 닭 세포 배양농축액을 100㎍/㎖ 단독 첨가한 연골세포 유도 분화배지.
3-2. Alician blue 염색법을 통한 연골세포 분화 여부 확인
Alician blue는 연골기질의 sulfated glycosaminoglycan, 또는 단백질에 cysteine이 4% 이상 함유된 경우에 푸른색으로 염색되어 연골세포로의 분화 여부를 판정할 수 있다. 상기 실시예 3-1의 방법으로 연골세포 분화 유도 10일 후에 펠렛을 회수하여 DPBS로 3회 세척 후, 4% PFA(paraformaldehyde)에 담가 상온에서 24시간 동안 고정하였다. 고정한 펠렛은 투명화와 탈수화를 거친 후, 파라핀에 포매하였다. 절편기를 이용하여 6㎛의 두께로 세포절편을 제작하여, 제작된 절편을 탈파라핀과 가수과정 후 alician blue 용액에 30분 동안 방치하여 염색하였다. 이때 alician blue 용액은 아세트산 용액에 1%의 농도의 alician blue 분말을 희석하고 1/10 N Hcl을 이용해 pH 2.5을 맞춘 것을 사용하였다. 이후 흐르는 물에 5분 정도 세척 후, 상기 펠렛 절편을 0.1% Nuclear Fast Red Solution 용액에 2분간 처리하였다. Nuclear Fast Red Solution 용액은 증류수에 0.1% Nuclear Fast Red Solution 분말과 5% aluminum sulfate 분말을 교반하여 만든 것을 사용하였다. 이후 흐르는 물에 5분 동안 세척하고 탈수화, 투명화 작업을 거쳐 마운팅하였다. 상기 염색된 세포 펠렛은 광학현미경상에서 alician blue 염색여부를 확인하고 촬영하고, 촬영한 세포 펠렛 사진을 Image J 프로그램을 사용하여 염색된 부분을 정량화 하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 100㎍/㎖ 배양농축액을 단독 처리하였을 때 Alician blue에 의해 염색된 연골기질의 sulfated glycosaminoglycan, 또는 4% 이상 cysteine을 함유한 단백질이 다량 관찰되었는바, 닭 세포 배양 농축액에 의해 줄기세포가 연골세포로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 닭 세포 배양농축액은 인간 지방 유래 줄기세포를 연골로 분화시킬 수 있는 유도제임을 확인할 수 있었다. 상기 결과는, 닭 세포 배양농축액이 기존의 연골분화유도제를 대체하는 새로운 분화 유도용 물질로써 이용될 수 있음을 시사한다.
3-3. 연골관련 단백질인 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ 발현 확인
Sox9, Aggrecan, 및 Collagen type Ⅱ(ColⅡ)는 줄기세포의 연골분화 유무를 확인할 수 있는 단백질로서, 본 발명의 닭 세포 배양농축액이 줄기세포의 연골분화를 유도함을 재확인하기 위하여, 상기 배양농축액을 처리한 줄기세포의 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 방법으로 연골세포 분화 유도 10일 후에 펠렛을 회수하여 DPBS로 3회 세척 후, 4% PFA(paraformaldehyde)에 담가 상온에서 24시간 동안 고정하였다. 고정한 펠렛은 투명화와 탈수화를 거친 후, 파라핀에 포매하였다. 절편기를 이용하여 6㎛의 두께로 세포절편을 제작하여, 제작된 세포절편을 60℃ 가열블락(Heating block)에 45분간 노출시켜 탈파라핀 과정을 수행하였다. 이어서 Xylene에 5분씩 3회, 100% Ethanol 5분씩 3회, 95% Ethanol 2분씩 2회, 70% Ethanol 2분씩 2회, 증류수 2분씩 2회 수세과정을 거치고, 수세과정이 끝난 세포절편을 항원 unmasking 용액 (Vector사 제조)에 처리한 후 100% 메탄올과 30% 과산화수소를 9:1 비율로 혼합하여 10분 동안 처리하였다. 이어서 상기 세포절편을 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 10% goat serum 이 첨가된 PBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)을 하였다. 각 단백질에 대한 1차 항체를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하고 biotinylated anti-IgG를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다시 PBS로 3회 세척 후, streptavidin-HRP를 45분 동안 상온에서 처리하였다. DAB(3,3diaminobenzidine)을 1분 동안 반응시켜 발색하였다. 광학현미경을 통하여 발색여부를 확인하고 단백질 발현여부를 확인하여 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 양성대조군 만큼 닭 세포 배양농축액 단독 처리한 실험군에서 연골분화 관련 단백질인 Sox9, Aggrecan, 및 ColⅡ가 발현함을 확인하였다.
상기 결과에 따라, 닭 골·연골전구세포을 배양하여 얻은 세포배양농축액은 인간의 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 연골 분화를 유도한다는 결과를 도출할 수 있었다. 본 발명은 닭 골·연골세포배양액을 활용한 연골 질환 치료제 또는 보조제로의 개발 가능성이 있으며, 전세계적으로 이슈화되고 있는 폐기자원인 수평아리의 새로운 활용방안을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<220>
<223> primer of humanGAPDH
<400> 10
ttgggcaagt ttgggtttag 20
Claims (12)
- 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 연골 생성 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 닭은 유추기 닭인 것을 특징으로 하는, 연골 생성 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액인 것을 특징으로 하는, 연골 생성 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 연골 생성 유도용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 연골 생성 유도용 조성물.
- 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법으로서, 상기 방법은 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 닭은 유추기의 닭인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액은 농축된 배양농축액인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 줄기세포에 처리하는 단계는 줄기세포를 상기 닭 골수 유래의 골·연골전구세포 배양액을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 분화 유도된 줄기세포 또는 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액 또는 그 배양농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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