KR20190043366A

KR20190043366A - 그라프트 공중합체와 젤라틴 가교물을 포함하는 히알루론산 하이드로젤 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20190043366A
Application number: KR1020170135346A
Authority: KR
Inventors: 노인섭; 다스 디판카르; 김나혜
Original assignee: 서울과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2019-04-26
Also published as: KR101974745B1

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르면, 히알루론산(hyalruronic acid)에 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)가 그라프트 중합된 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer); 및 멀티-아크릴레이트계 젤라틴 가교제(muti-acrylate cross-linker);를 포함하는, 생체적합성, 조직재생 기능의 하이드로젤이 제공된다.

Description

그라프트 공중합체와 젤라틴 가교물을 포함하는 히알루론산 하이드로젤 및 이의 제조방법{HYALURONIC ACID HYDROGEL CROSS-LINKED WITH GEATIN AND GRAFT-POLYMER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 그라프트 공중합체와 젤라틴 가교물을 포함하는 히알루론산 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

하이드로젤(Hydrogel)은 화학적 결합이나 정전기적 인력에 의해 상호작용하는 분자들이 친수성 가교결합된 중합체를 형성하고, 건조중량의 수백배에 해당하는 수분을 흡수하는 물질이다. 이와 같은 하이드로젤은 우수한 생체적합성 및 친수성 특성을 나타내기 때문에 제약, 조직재생공학, 의료기기 및 의학 분야에서 다양한 응용이 가능한 것으로 알려져 있다.

또한, 하이드로젤은 손상된 인체 조직의 치유를 목적으로 하는 조직공학 기질의 제조에 유용한 후보물질로 알려져 있다. 하이드로젤에 의해 형성되는 3차원 구조는 지지체(scaffold)라고도 불리며, 이와 같은 지지체를 다양한 조직공학 재료로 사용하고 있다.

이와 같은 하이드로젤의 소재로 이용할 수 있는 물질 중, 히알루론산을 적용하는 연구가 다수 진행 중에 있다. 히알루론산(Hyaluronic acid)은 살아 있는 유기체 내에서 자연 상태로 존재하는 성분으로, 인체 내 다양한 부위에 분포되어 있다. 히알루론산은 면역에 관한 문제를 발생시키지 않고, 특정세포와의 상호작용이 우수하여 조직공학과 약물전달시스템 등에 이용될 수 있는 우수한 생체적합성을 지니고 있어 하이드로젤의 성분으로 우수한 효능을 나타낼 수 있다.

이와 같은 히알루론산의 다양한 장점에도 불구하고, 이를 단독으로 사용하는 경우 점탄성 특성이나 기계적 물성이 충분하지 못하여 지지체 골격의 강도가 낮고, 과도한 친수성과 세포부착 리간드 특성으로 인해 세포부착성, 세포 분화능 등이 불량한 단점이 있다. 이에 따라, 히알루론산을 화학적으로 개질하여 적용하고자 하는 연구가 다수 진행 중에 있다.

그러나, 현재까지 히알루론산을 포함하는 하이드로젤의 세포부착성, 조직재생성, 점탄성 특성 및 기계적 물성 모두를 만족할 만한 수준까지 구현할 수 있는 결과는 전무한 실정이다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 우수한 점탄성 특성, 세포적합성, 조직재생성 및 기계적 물성을 구현할 수 있는 히알루론산 그라프트 중합체에 젤라틴 가교물을 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)가 그라프트 중합된 그라프트 중합체(graft-polymerized polymer); 및 개질 젤라틴(modified gelatin);을 포함하는, 하이드로젤이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate) 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 개질 젤라틴 가교제는 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin methacrylate)일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 하이드로젤은 다공성 구조를 가질 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 하이드로젤은 pH 의존적 약물방출성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)의 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합물에 중합 개시제를 첨가하여 상기 히알루론산에 상기 아크릴레이트계 단량체가 그라프트 중합된 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 그라프트 공중합체에 개질 젤라틴(modified gelatin)을 첨가하여 히알루론산 - 그라프트 공중합체 - 젤라틴 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는, 하이드로젤의 제조방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 중합 개시제는 라디칼 중합 개시제일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 라디칼 중합 개시제는 과황화칼륨(KPS, Potassium persulfate)일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 개질 젤라틴은 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin methacrylate)일 수 있다.

본 발명의 하이드로젤은 히알루론산과 아크릴레이트계 단량체의 그라프트 공중합체의 가교물 및 개질 젤라틴을 가교제로 포함하는 가교물을 하이드로젤의 성분으로 사용함으로써, 우수한 세포적합성, 조직재생성, 점탄성 특성과 기계적 물성을 구현할 수 있다.

이에 따라, 상기 하이드로젤을 조직공학 지지체, 주사용 젤, 3D 프린팅용 소재, 약물 전달체 등 다양한 분야에 적용할 수 있다. 특히, 상기 하이드로젤은 균일한 형상의 다공성 구조로 이루어져 조직재생성, 약물 방출성과 기계적 물성 조절에 있어서 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 제조방법을 단계적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 하이드로젤 표면의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 적외선(IR) 분광 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 핵자기공명(H¹ NMR) 분광 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 TGA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 DMOG 및 TCN 약물방출 거동을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 하이드로젤의 pH 조건별 팽윤도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤의 레올로지(Rheology) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 하이드로젤의 세포 증식율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 세포 생존성을 나타낸 이미지이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)가 그라프트 중합된 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer); 및 개질 젤라틴(modified gelatin);을 포함하는, 하이드로젤이 제공된다.

상기 히알루론산은 그 자체로 우수한 생체적합성을 나타내는 반면, 조직재생성, 점탄성 특성이나 기계적 물성 등이 취약하기 때문에 아크릴레이트계 단량체와 개질 젤라틴 가교제를 이용하여 이와 같은 물성을 보완할 수 있다.

구체적으로, 상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate) 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)일 수 있고, 바람직하게는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트(2-HEA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아크릴레이트계 단량체는 히알루론산의 측쇄에 그라프트 중합을 유도하여 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 형성할 수 있다. 상기 그라프트 공중합체는 선형 공중합체에 비해 밀집된 분자 구조를 형성함으로써 히알루론산의 점탄성 특성과 기계적 물성을 효과적으로 향상시킬 수 있다.

또한, 상기 그라프트 공중합체는 2개 혹은 그 이상의 불포화 작용기, 예를 들어 아크릴레이트 작용기를 포함하는 개질 젤라틴 가교제에 의해 가교될 수 있다. 구체적으로, 상기 개질 젤라틴 가교제는 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin-methacrylate)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 가교제는 그라프트 공중합체 간 더욱 밀집된 구조를 형성할 수 있도록 연결해주며, 이를 통해 최종 생성물인 그라프트 공중합체와 젤라틴 가교물을 포함하는 하이드로젤은 다공성 구조를 가질 수 있고, 다공성 구조는 가교 정도와 아크릴레이트, 젤라틴 가교물의 함량 등에 따라 다양한 형태를 가질 수 있다. 이와 같은 가교도(degree x-linking), 아크릴레이트, 젤라틴-메타크릴레이트 및 다공성 구조에 따라 상기 하이드로젤은 내부에 약물을 담지할 수 있는 약물 전달체, 조직공학 지지체 등으로 적용될 수 있으며, 그 외에도 3D 프린팅용 소재, 주사용 젤 등으로도 적용될 수 있다.

한편, 상기 하이드로젤은 내부에 약물을 담지하여 생체 내 약물 전달 기능을 수행할 수 있다. 이 때, 상기 하이드로젤은 pH 의존적 약물방출성 및 적용성을 나타낼 수 있다.

구체적으로, 상기 하이드로젤은 pH가 낮은 산성 조건에서는 서방성 약물방출을 나타낼 수 있는 반면, pH가 높은 염기성 조건에서는 속방성 약물방출을 나타낼 수 있다. 즉, 상기 하이드로젤이 적용되는 pH 환경에 따라 약물방출성을 달리 조절할 수 있으므로, 적용 부위의 pH에 따라 하이드로젤을 선택하여 적용할 수 있다. 또한 pH가 다른 조직에 대하여 상응한 조건에 맞는 하이드로젤을 적용하여 조직공학에 적용할 수 있다. 즉, 산성 및 염기성의 주변환경을 가진 조직에 대해서는 팽윤성, 약물방출성을 조절하여 하이드로젤의 적용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 제조방법을 반응 단계에 따라 나타낸 것이다.

도 1과 같이 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)의 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합물에 중합 개시제를 첨가하여 상기 히알루론산에 상기 아크릴계 단량체가 그라프트 중합된 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 그라프트 공중합체에 개질 젤라틴(modified gelatin)를 첨가하는 단계;를 포함하는, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법이 제공된다.

상기 (a) 단계에서는 그라프트 중합에 필요한 단량체인 아크릴레이트계 단량체를 준비한 뒤, 히알루론산과 혼합할 수 있다. 이 때, 상기 히알루론산은 그 자체로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 염의 형태, 예를 들어 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)의 형태로 사용할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate) 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)일 수 있고, 바람직하게는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트(2-HEA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (b) 단계에서는 중합 개시제를 첨가하여 히알루론산의 측쇄(-OH)를 활성화 시킴으로써, 혼합된 단량체들이 히알루론산의 측쇄에 그라프트 중합 반응을 개시할 수 있다. 이 때, 상기 중합 반응이 라디칼 반응으로 진행될 수 있도록 상기 중합 개시제는 라디칼 중합 개시제일 수 있다. 구체적으로, 상기 라디칼 중합 개시제는 과황화칼륨(KPS, Potassium persulfate)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 과산화벤조일 등과 같이 라디칼 중합 반응을 개시할 수 있는 화합물이면 어느 것이든 사용할 수 있다.

상기 중합 개시제는 라디칼 활성을 나타내어 히알루론산 또는 히알루로네이트 측쇄의 양성자를 분리함으로써 히알루론산 라디칼을 생성할 수 있다. 생성된 히알루론산 라디칼은 아크릴레이트계 단량체와 반응하여 히알루론산과 아크릴레이트계 단량체 간의 그라프트 중합 반응(graft polymerization)이 진행될 수 있다.

상기 (c) 단계에서는 그라프트 중합 반응에 의해 생성된 히알루론산과 아크릴레이트계 단량체 간의 그라프트 공중합체에 개질 젤라틴 가교제(modified gelatin cross-linker)를 첨가하여 하이드로젤의 특성을 제조할 수 있다.

이 때, 상기 멀티 아크릴레이트계 가교제는 적절한 가교 반응을 진행시키기 위해 2개 이상의 불포화 작용기, 예를 들어 아크릴레이트 작용기를 포함하는 개질 젤라틴일 수 있고, 구체적으로 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin-methacrylate)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 최종 생성물인 하이드로젤은 히알루론산-아크릴레이트계 단량체에 의하여 형성된 그라프트 공중합체에, 개질 젤라틴-메타크릴레이트 가교제를 이용하여 가교결합시킨 형태로 제조될 수 있다.

상기 생체적합성, 조직재생성의 하이드로젤은 다공성 구조로 이루어질 수 있으며, 이에 따라 내부에 약물을 담지하는 약물 전달체 및 조직공학용 생체재료로 기능할 수 있다. 또한, 상기 하이드로젤은 적절한 점탄성 특성과 기계적 물성 및 조직재생성을 보유하기 때문에 3D 프린팅용 소재, 주사형 젤, 조직공학 지지체 등으로도 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 젤라틴- 메타크릴레이트 ( GelMA ) 제조

젤라틴-메타크릴레이트를 합성하기 위해, 2구짜리 둥근바닥 플라스크(100㎖)에 1g 젤라틴(from bovine skin, Sigma Aldrich, USA)과 50㎖ PBS(pH 7.6)(2% w/v)를 넣고 60℃의 oil bath 에서 400rpm으로 마그네틱 스터링 바(stirring bar)를 이용하여 pH 7.6에서 젤라틴 용액을 제조하였다.

준비된 젤라틴용액에 메타크릴산 무수물(MA, methacrylic anhydride, Sigma Aldrich, USA)을 부피에 따라 각각 1㎖, 2㎖, 3㎖ 또는 4㎖ 첨가하여 3시간 동안 반응을 진행시켜 젤라틴-메타크릴레이트(GelMA)를 합성하였다.

획득한 젤라틴-메타크릴레이트 합성물을 3개의 멤브레인 튜브(molecular-porous membrane tubing; molecular weight cut off 6~8KD; Spectrum Laboratories, USA)에 넣은 다음, 5L 증류수에서 4일 동안 투석(dialysis)하여 투석샘플을 수득하였다.

수득한 투석샘플을 폴리스티렌 튜브(50㎖)에 넣은 다음, 4일 동안 동결건조기에서 건조시키고, 건조물의 질량을 측정하여 각 샘플의 제조를 확인하였다. 각 제조예에 사용된 반응물의 실험조건을 하기 표 1에 나타내었다.

구분	젤라틴 함량 (g)	메타크릴산 무수물 함량 (㎖)	무수물/Gelatin
제조예 1	1	1	1㎖/1g (1㎖/g)
제조예 2	1	2	2㎖/1g (2㎖/g)
제조예 3	1	3	3㎖/1g (3㎖/g)
제조예 4	1	4	4㎖/1g (4㎖/g)

실시예 : 생체적합성 하이드로젤 제조

도 1의 방법에 따라 하이드로젤을 제조하기 위해, 75℃ oil bath (1L)에서 히알루론산(HA, 한미약품, 한국) 용액(0.42% w/v)이 포함된 3구짜리 둥근바닥 플라스크(100㎖)에 20~30분이 경과한 뒤, 플라스크에 KPS(Potassium peroxodisulfate, Sigma Aldrich, USA) 0.0025g 와 2-하이드록시에틸 아크릴레이트(2-HEA, Sigma Aldrich, USA) 3㎖를 플라스크에 첨가하여 히알루론산에 2-HEA단량체가 그라프트 중합되도록 반응을 유도하였다.

이후, 상기 제조예 1~4에서 합성한 젤라틴-메타크릴레이트(GelMA)를 각각 첨가하여 HA-p(2-HEA)-GelMA 하이드로젤을 합성하였다.

생성된 합성물을 3개의 molecular weight cut off 6~8 KD 멤브레인 튜브에 넣고, 5 L 증류수에서 투석(dialysis)을 진행하여 하이드로젤을 수득하였다. 각각의 실시예는 상기 제조예 1~3 중 하나의 GelMA를 선택하여 제조하였으며, 구체적인 제조 조건은 아래 표 2에 나타내었다.

구분	HA 함량 (g)	KPS 함량 (g)	2-HEA 함량 (㎖)	GelMA 함량 (g)	GelMA 종류
실시예 1	0.5	0.0025	3	0.25	제조예 1
실시예 2	0.5	0.0025	3	0.25	제조예 2
실시예 3	0.5	0.0025	3	0.25	제조예 3

실험예 1: 형태학적 분석

상기 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 하이드로젤 각각의 미세 구조를 확인하기 위해, 각 하이드로젤의 주사전자현미경(FE-SEM, Joel, Korea) 이미지를 관찰하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 각 실시예에 따른 하이드로젤의 표면 이미지를 나타낸 것이다.

도 2를 참고하면, 각각의 하이드로젤이 다공성 구조로 이루어져 있으며, 아크릴레이트 단량체와 가교제 개질에 사용되는 젤라틴-메타크릴레이트의 함량에 따라 그 구조를 조절할 수 있음을 알 수 있다. 젤라틴-메타크릴레이트의 농도가 낮은 경우에는 다공구조가 균일하지 않았으며(실시예 1), 젤라틴-메타크릴레이트의 농도가 높을수록 다공구조가 균일해졌다(실시예 3). 이와 같은 다공성 구조의 하이드로젤은 약물 담지체 등으로 적용될 수 있으며, 그 구조 제어에 따라 젤의 기계적 물성, 약물의 방출성 또한 조절할 수 있음을 시사한다.

실험예 2: 적외선(IR) 분광 분석

상기 실시예 3에 따라 제조된 하이드로젤의 화학적 구조를 확인하기 위해 ATR-FTIR 분광기(Travel IR, Smiths Detection, USA)를 이용하여 스펙트럼을 분석한 결과를 히알루론산(HA), 2-하이드록시에틸 아크릴레이트(2-HEA), 젤라틴-메타크릴레이트(GelMA)의 ATR-FTIR 스펙트럼과 함께 도 3에 나타내었다.

도 3을 참고하면, GelMA(e)는 3071㎝^-1(Gelatin), 2937 ㎝^-1(Gelatin 및 MA)에서의 신호(peak)가 모두 확인되어 Gelatin, MA모두를 포함하는 화합물이라는 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 3의 하이드로젤(f)은 3429㎝^-1(2-HEA), 및 2886(HA, p(2-HEA), GelMA)에서의 신호(peak)가 모두 확인되어 HA, 2-HEA 및 GelMA모두를 포함하는 화합물이라는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3: 핵자기공명(NMR) 분광 분석

상기 실시예 3에 따라 제조된 하이드로젤의 화학적 구조를 확인하기 위해 H¹ NMR 분광기(DD2 700, Agilent Technologies-Korea, USA)를 이용하여 스펙트럼 분석을 수행하였고, 그 결과를 제조예 1~4에 따라 제조된 젤라틴-메타크릴레이트(GelMA)의 H¹ NMR 스펙트럼과 함께 도 4에 나타내었다.

도4는 상기 제조예 1 및 2에 따라 제조된 젤라틴-메타크릴레이트 및 상기 실시예 3에 따라 제조된 하이드로젤의 H¹ NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 4를 참고하면, 제조예 1 및 2에 따른 GelMA는 추가한 MA의 양이 증가함에 따라 GelMA의 이중결합이 더 많이 생겼음을 5~6ppm의 신호(peak)가 증가하는 것으로 확인할 수 있다. 상기 실시예 3에 따른 하이드로젤은 제조예 3의 젤라틴-메타크릴레이트와 유사한 화학적 구조를 포함하고 있음을 알 수 있다.

실험예 4: 열중량 ( thermogravimetric analysis; TGA ) 분석

상기 실시예 3에 따라 제조된 하이드로젤의 열적 거동 특성을 확인하기 위해, 열중량분석기(DTG-60, Shimadzu, Japan)를 이용하여 질소 분위기 하에서 5℃/분의 스캔 속도로 TGA 분석을 실시하였고, 그 결과를 히알루론산(HA) 및 젤라틴(Gelatin)의 TGA 분석 결과와 함께 도 5에 나타내었다.

도 5을 참고하면, 상기 실시예 3의 하이드로젤은 화학적 결합으로 인해 분자 내의 가교결합이 더욱 견고하게 형성되어, 히알루론산이나 젤라틴에 비해 상대적으로 높은 온도에서 열적 거동과 분해가 일어나는 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: 약물 방출성 평가

상기 실시예 1에 따라 제조된 하이드로젤의 약물 방출성을 평가하기 위해, 농도별 DMOG(dimethyloxalyglycine) 약물과 TCN(tetracycline) 약물을 각각 2ml HA-p(2-HEA)-GelMA 젤 샘플에 섞은 후 4일 동안 동결건조한 다음, 100㎖ 버퍼 용액(pH 7.0 및 7.4)에서 14일 동안 37℃ 조건에서 약물이 방출되도록 유도하였으며, 얻어진 샘플용액 내의 약물 양을 UV-Vis 분광기(BioMATE 3, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 결과값은 각 약물마다 3회의 반복실험 후 평균값으로 나타내었다.

실험예 6: 팽윤도 평가

상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 하이드로젤의 수분에 대한 특성을 확인하기 위해, 팽윤도(swelling)를 평가하였다. 하이드로젤의 팽윤도 특성에 따라 내부에 담지된 물질, 예를 들어 약물의 방출 특성이 달라질 수 있으므로 이에 대한 간접적 지표로 활용할 수 있다.

미리 칭량한 0.6g의 건조된 하이드로젤을 37℃에서 16시간 동안 50㎖의 희석된 완충 용액(pH 2.5 및 7.0)에 담지하였다. 1시간마다 하이드로젤을 배지에서 꺼내어 세척한 뒤, 무게가 평형에 도달할 때까지 하이드로젤의 무게를 칭량하였다. 팽윤도(%)는 하기 수학식 1에 따라 산출하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 결과값은 각 실시예마다 3회의 반복실험 후 평균값으로 나타내었다.

[수학식 1]

팽윤도(%) = [(침지 후 시편의 중량 - 침지 전 시편의 중량) / 침지 전 시편의 중량] × 100(%)

실험예 7: 레올로지 (Rheology) 분석

상기 실시예 2에 따라 제조된 하이드로젤의 유변학적 특성을 확인하기 위해, Rotational rheometer(TA Instrument Ltd., DHR-1)를 이용하여 37℃ 온도 하에서 전단 저장 모듈러스(shear storage modulus; G')와 전단 손실 모듈러스(shear loss modulus; G") 특성분석을 수행하였다.

측정 갭 및 시편의 규격은 각각 1.0㎜ 및 25㎜ 플레이트에 합성된 HA-p(2-HEA)-PEG 하이드로젤 샘플을 첨가하여 젤 샘플에 진동 토크(torque oscillation)를 제공하면서 샘플의 젤 특성을 분석하였다. 최소 진동 토크(minimum torque oscillation)은 10 nM-m으로 설정하였고, 전단 속도는 0.1 내지 1,300/sec의 범위로 설정하였다. 응력 스윕(stress sweep) 측정을 위해, 주파수와 진동 응력(oscillation stress)은 각각 1 Hz와 1~1,000 Pa로 설정하였다. 사용된 최소 및 최대 토크는 10 nN-m 및 150 mN-m이었다. 주파수 스윕(frequency sweep) 측정의 경우, 토크 분해능(resolution)과 변형률(strain)은 각각 0.1 nN-m 및 1%로 하였으며, 주파수를 0.1~10 Hz로 설정하였다. 분석 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8을 참고하면, 프리퀀시 범위에서 전단 저장 모듈러스(G')와 전단 손실 모듈러스(G") 값이 증가함을 확인할 수 있고(a), 전단 저장 모듈러스(G')와 전단 손실 모듈러스(G")가 중첩되어 젤 형성을 확인할 수 있으며(b), 전단속도에 따라 전단 점도는 감소(c)하는 것을 확인함으로써 하이드로젤의 특성을 관찰할 수 있다.

실험예 8: 세포 적합성 분석

상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 하이드로젤에 대해 골세포를 로딩하여 in vitro 세포배양을 7일 동안 진행하였고, CCK 분석키트와 live and dead assay 키트를 사용하여 세포적합성을 1일, 3일, 7일차에서 세포증식율 및 세포생존성을 분석하였다. 그 결과, 세포증식율이 시간에 따라 3배 이상 증가하고(도 9), 7일차에 실시예1(a), 실시예2(b)에 로딩된 세포들이 모두 생존하고 뻗어가고(spreading) 있어, 조직재생 가능성이 있음을 형광현미경(도 10)으로 확인하였다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)가 그라프트 중합된 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer); 및
개질 젤라틴(modified gelatin);을 포함하는, 하이드로젤.
제1항에 있어서,
상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate) 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)인, 하이드로젤.
제1항에 있어서,
상기 개질 젤라틴은 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin-methacrylate)인, 하이드로젤.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤은 다공성 구조를 갖는, 하이드로젤.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤은 pH 의존적 약물방출성을 나타내는, 하이드로젤.
(a) 히알루론산(hyalruronic acid) 및 아크릴레이트계 단량체(acrylate monomer)의 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 중합 개시제를 첨가하여 상기 히알루론산에 상기 아크릴레이트계 단량체가 그라프트 중합된 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 그라프트 공중합체에 개질 젤라틴(modified gelatin)을 첨가하는 단계;를 포함하는, 하이드로젤의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate) 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)인, 하이드로젤의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 중합 개시제는 라디칼 중합 개시제인, 하이드로젤의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 라디칼 중합 개시제는 과황화칼륨(KPS, Potassium persulfate)인, 하이드로젤의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 개질 젤라틴은 젤라틴-메타크릴레이트(gelatin-methacrylate)인, 하이드로젤의 제조방법.