KR20190035035A - 효소처리 로얄젤리의 신규 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소처리 로얄젤리의 새로운 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상을 효과적으로 치료, 예방, 개선 및/또는 억제할 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 효소처리 로얄젤리에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소처리 로얄젤리의 새로운 용도에 관한 것이다.
일반적으로 ‘피로’란 작업을 할 때 작업능률이 저하되는 상태, 항상성의 혼란이 일어나는 상태, 또는 대뇌피질의 제지작용이 일어나는 상태 등으로써, 육체적, 정신적 활동을 하기 위한 능력의 감소라고 정의할 수 있다. 피로라는 신호가 오면 신체는 휴식을 취하고 회복할 수 있는 시간이 필요하나, 바쁜 현대사회에서는 이와 같은 피로와 피로회복의 순환을 제대로 지키는 것이 어려운 실정이며, 이로 인한 피로 축적은 자칫 만성피로를 유발하고, 소화성 궤양, 고혈압, 당뇨병 등의 질병을 유발할 수도 있다. 그리고 암, 뇌졸중, 심장질환은 현대인의 주요 3대 사망원인으로, 과로는 이들의 주요 원인이 되고 있는 실정이다.
피로 혹은 스트레스가 쌓였다고 표현하는 것은 심신의 기능이 원활히 이루어지지 않는 경우를 말한다. 주로 피로의 경우, 근 수축 활동에 요구되는 힘을 충분히 발휘하지 못하는 상태, 즉 운동수행능력이 감소된 상태라고 할 수 있으며, 육체적인 피로와는 대조적으로 스트레스는 정신적인 과부하로 인해 오는 신체리듬의 불균형으로 이해할 수 있다. 따라서 넓은 의미의 피로는 정신적 피로 및 육체적 피로를 모두 포함하는 개념으로, 육체적 또는 정신적 활동을 하기 위한 능력의 감소라고 할 수 있다.
스트레스를 유발하는 원인과 그 신체의 변화는 다양하지만, 공통적으로는 교감신경계인 시상하부-뇌하수체-부신계(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA축)의 기능을 항진시켜 호르몬 분비를 유발하여 부신의 기능항진과 비장의 기능저하를 일으키고, 그 결과 스트레스에 의한 모든 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 스트레스가 부가되면 비장은 면역기능의 감퇴로 인하여 무게가 현저히 줄어들며, 부신피질자극호르몬에 의하여 부신의 기능이 항진되어 무게가 증가되고, 지질 감소 현상이 일어나며 코르티졸(Cortisol)의 분비가 촉진된다.
이와 같은 스트레스는 정신적 피로를 유발하는 원인이 되거나 그 자체일 수 있으며, 우울증의 원인이 될 수 있다.
우울증, 즉 우울장애는 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 말한다. 분명한 원인에 대해서는 아직 명확하지 않으나 다른 정신 질환과 같이 다양한 생화학적, 유전적 그리고 환경적 요인이 우울증을 야기할 수 있다. 그 중에서도 생화학적 요인으로는 신경전달 물질들이 우울증 발생에 역할을 하는 것으로 보인다. 신경전달물질이란 신경 세포에서 분비되는 신호 물질로, 한 뉴런(neuron)에서 다른 뉴런으로 정보를 전달하는 역할을 한다. 대표적인 예로 히스타민, 세로토닌, 도파민 등이 있다. 호르몬 불균형도 하나의 원인이 될 수 있다.
한편, 로얄젤리(Royal jelly)는 꿀과 화분을 일벌들이 소화 흡수한 뒤, 인두부를 경유해서 만들어진 물질로, 봉군 내 어린 유충 및 여왕벌 유충의 먹이로 사용된다. 로얄젤리는 신맛이 강하고 향이 있는 하얀 젤리 모양을 하고 있으며, 단백질이 풍부하고 특히 지방산 10-HDA(10-hydroxy-2-decenoic acid)를 포함하는 것 외에 비타민 및 판토텐산 등이 함유되어 있다. 식품공전에서는 로얄젤리 원료 및 제품 기준 규격으로 10-HDA 함량을 기준으로 삼고 있다.
이와 같은 로얄젤리는 각질 박리 촉진 효과 등이 알려져 있는 유용한 물질로(대한민국 공개특허 제10-2004-0036494호 참조), 관련 기술개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 효소처리 로얄젤리의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 상기에 언급된 과제로 제한되지 않으며 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 효소처리 로얄젤리가 피로 및/또는 우울증 등에 효과를 나타냄을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 효소처리 로얄젤리의 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 치료, 예방, 개선 및/또는 억제를 위한 의약 및/또는 식품 용도를 제공한다.
치료 또는 개선은 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상과 관련된 증상의 경감, 회복 등을 포괄하는 의미이고, 예방은 질병 이전 단계에서 질병으로 발전되는 것의 억제를 포괄하는 의미이다.
피로는 육체적 피로 또는 정신적 피로를 포함하며, 보다 바람직하게는 정신적 피로일 수 있다.
상기 치료, 예방, 개선 및/또는 억제는 상기 효소처리 로얄젤리에 의한 세포사멸인자 발현 억제, 세포내신호전달인자 발현 억제, 또는 신경영양인자 발현 유도 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
상기 세포사멸인자는 caspase-3 또는 PARP(poly-ADP ribose polymerase) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 caspase-3는 cleaved capase-3를 포함한다.
상기 PARP는 cleaved PARP를 포함한다.
상기 세포내신호전달인자는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(Jun N-terminal kinase), 또는 p38 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 ERK는 p-ERK를 포함한다.
상기 JNK는 p-JNK를 포함한다.
상기 p38은 p-p38을 포함한다.
상기 신경영양인자는 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) 또는 GDNF (Glial cell-derived neurotrophic factor)중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 치료, 예방, 개선 및/또는 억제는 상기 효소처리 로얄젤리에 의한 혈 중 코르티코스테론의 생성 억제에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 치료, 예방, 개선 및/또는 억제는 상기 효소처리 로얄젤리에 의한 뇌조직 중 세로토닌 증가, 도파민 증가, 노르에피네프린 증가, 모노아민옥시데이즈의 감소, 또는 5-하이드록시인돌초산 감소 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
일 구체예로, 본 발명은 효소처리 로얄젤리를 유효성분으로 포함하는 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 효소처리 로얄젤리는 로얄젤리를 단백분해효소로 처리한 것으로, 상기 단백분해효소는 엔도및엑소형 단백분해효소, 엑소형 단백분해효소, 및 엔도형 단백분해효소를 포함한다.
상기 엔도및엑소형 단백분해효소는 진균성(fungal) 엔도및엑소형 단백분해효소이고, 상기 엑소형 단백분해효소는 진균성 엑소형 단백분해효소이며, 상기 엔도형 단백분해효소는 세균성(bacterial) 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소 또는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소일 수 있다.
상기 아미노펩티다아제와 카르복시펩티다아제 혼합효소는 진균에서 유래된 아미노펩티다아제와 카르복시펩티다아제 혼합효소일 수 있다.
상기 진균성 엑소형 단백분해효소는 류신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 메탈로엔도펩티다아제(metalloendopeptidase) 또는 세린프로테아제(serineprotease) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 메탈로엔도펩티다아제는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 세린프로테아제는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 메탈로엔도펩티다아제는 바실로라이신(bacillolysin)일 수 있다.
상기 세린프로테아제는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 진균성 엑소형 단백분해효소는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 중성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 상기 단백분해효소는 1 내지 10 중량부일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 상기 단백분해효소는 3 중량부일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소 100 중량부에 대하여, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소 100 중량부이고, 상기 진균성 엑소형 단백분해효소 100 중량부일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어질 수 있다.
상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 상기 용매는 1000 중량부일 수 있다.
상기 용매는 물일 수 있다.
상기 처리는 상기 로얄젤리를 상기 단백분해효소와 가압조건 0.5 내지 1 atm, 보다 바람직하게는 0.5 atm에서 접촉시키는 접촉단계를 포함할 수 있다.
상기 접촉은 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 실시하는 것일 수 있다.
상기 접촉은 4차처리온도 섭씨 55도에서 처리하는 4차 처리단계를 더 포함하여 실시하는 것일 수 있다.
상기 효소처리 로얄젤리는 상기 단백분해효소가 불활성화된 불활성화 효소처리 로얄젤리일 수 있다.
상기 불활성화는 가열처리에 의한 것일 수 있다.
상기 가열처리는 15분간, 섭씨 90도로 상기 단백분해효소를 가열하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어지고, 상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 상기 용매는 1000 중량부이고, 상기 불활성화는 가열처리에 의한 것으로, 상기 가열처리는 15분간 섭씨 90도로 상기 단백분해효소를 가열처리하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어지며, 상기 불활성화 효소처리 로얄젤리는 불활성화 후 후처리될 수 있다. 상기 후처리는 상기 불활성화 효소처리 로얄젤리를 농축하여 농축물을 얻는 농축단계; 및 상기 농축물을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 동결건조단계를 포함할 수 있다.
상기 용매는 물일 수 있다.
상기 농축은 감압농축일 수 있다.
상기 감압농축은 섭씨 45 내지 65도에서 실시하는 것일 수 있다.
상기 감압농축은 100 내지 300 mbar의 압력으로 실시하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 상기 용매는 1000 중량부이고, 상기 감압농축은 섭씨 60도에서, 110mbar의 압력으로 실시하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.1~99 중량% 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 효소처리 로얄젤리를 유효성분으로 포함하는 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 개선 또는 억제용 식품 조성물을 제공한다.
별도의 언급이 없는 한 상기 식품 조성물은 본 발명의 약학조성물에서 언급된 사항이 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다. 상기 '개선'은 '치료'에 포함되며, 상태 또는 증세가 호전되는 것을 의미한다.
상기 식품조성물은 음료를 포함하는 식품에 다양하게 포함될 수 있고, 음료, 껌, 차, 건강기능식품 등의 형태일 수 있으며, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 상기 건강기능식품이라 함은 대한민국 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다. 이하 같다)한 식품을 말하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 케톤류, 글리신, 구연산나트륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다. 또한, 상기 식품조성물은 식품첨가제 등을 포함하는 의미이다.
상기 유효성분은 피로 및/또는 우울증의 예방, 개선 및/또는 억제를 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 상기 유효성분을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 분말상태로 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 유효성분을 조성물 총량 중 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 포함될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로써 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만, 유효성분 100 중량부에 대하여 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한 효소처리 로얄젤리의 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 효소처리 로얄젤리의 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 상기 투여되는 효소처리 로얄젤리는 유효량의 효소처리 로얄젤리일 수 있다.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 약학 조성물, 식품조성물, 방법, 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 각각 동일하게 적용된다.
상기 효소처리 로얄젤리 또는 상기 조성물은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구(직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막, 뇌혈관 내 주사 등)로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및/또는 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제 및 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등일 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및/또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되거나, 용도 또는 방법 중 사용되는 효소처리 로얄젤리는 성인 기준으로 1일 1 ~ 10000 mg/kg의 용량으로 사용가능하다. 투여는 하루에 한번 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 피로 또는 우울과 같은 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 효소처리 로얄젤리는 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등의 첨가제를 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은, 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 식품학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 상기 유효성분 및 상기 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 상기 식품학적으로 허용되는 첨가제로 이루어질 수 있다.
본 발명에 의해 피로 또는 우울증을 효과적으로 치료, 예방, 개선 및/또는 억제할 수 있다.
도 1은 효소처리 로얄젤리가 C2C12 세포 생존력에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포 생존력에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 산화 스트레스 회복능에 미치는 영향을 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 SOD(Superoxide dismutase) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 CAT(catalase) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 GSH(Glutathione) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(d), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 NO(Nitric Oxide) 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(e) 및 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 ROS(Reactive oxygen species) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(f)이다.
도 4는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 사멸에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 신호전달에 중추적 역할을 하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 염증에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 산화 스트레스에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(d) 및 효소처리 로얄젤리가 신경세포의 생존과 성장에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(e)이다.
도 5는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델의 부동시간에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 LDH 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 글루코스 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(a)와 효소처리 로얄젤리가 피로 또는 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 CK 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(b)이다.
도 8은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 코르티코스테론 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 세로토닌 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 도파민 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 노르에피네프린 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 모노아민옥시데이즈 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(d) 및 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 5-하이드록시인돌초산 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(e)이다.
도 2는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포 생존력에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 산화 스트레스 회복능에 미치는 영향을 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 SOD(Superoxide dismutase) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 CAT(catalase) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 GSH(Glutathione) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(d), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 NO(Nitric Oxide) 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(e) 및 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 ROS(Reactive oxygen species) 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(f)이다.
도 4는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 사멸에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 신호전달에 중추적 역할을 하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 염증에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 산화 스트레스에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(d) 및 효소처리 로얄젤리가 신경세포의 생존과 성장에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(e)이다.
도 5는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델의 부동시간에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 LDH 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 글루코스 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(a)와 효소처리 로얄젤리가 피로 또는 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 CK 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(b)이다.
도 8은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 코르티코스테론 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 세로토닌 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 도파민 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 노르에피네프린 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 모노아민옥시데이즈 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(d) 및 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 5-하이드록시인돌초산 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프(e)이다.
이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
이하, 실시예 및 실험예에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 최상급을 사용하였으며, Sigma-aldrich사 등에서 구입한 것을 사용하였다. 이하의 실험결과에 대해서는 필요시, 평균과 표준편차를 구하였고, 통계적인 유의성을 검정하였다.
본 발명의 일 실시예에 포함되는 유효성분인 효소처리 로얄젤리는 로얄젤리를 단백분해효소(protease 또는 peptidase)로 처리한 것이다. 이 때, 단백분해효소는 엔도및엑소형 단백분해효소, 엑소형 단백분해효소, 및 엔도형 단백분해효소, 보다 바람직하게는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 엔도형 단백분해효소를 포함하여 이루어진다. 이 때, 엔도및엑소형 단백분해효소는 엔도펩티다제와 엑소펩티다제 활성을 모두 갖는 단백분해효소로, 엔도펩티다제와 엑소펩티다제가 혼합되거나 컴플렉스 상태일 수 있다. 이와 달리, 엑소형 단백분해효소는 엑소펩티다제 활성만을 나타내는 것이고, 엔도형 단백분해효소는 엔도펩티다제 활성만을 나타내는 것이다.
보다 바람직하게는, 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소 또는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 예를 들어, 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소일 수 있으며, 시판예는 Probeef 2000P, Sumizyme FP-G 등일 수 있다. 아미노펩티다아제와 카르복시펩티다아제 혼합효소는 진균에서 유래된 것일 수 있으며, 이와 같은 진균은 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)일 수 있다. 시판예는 아스페르질루스 오리자에로부터 유래된 아미노펩티다아제와 카르복시펩티다아제 혼합효소를 포함한다.
또한, 진균성 엑소형 단백분해효소는 예를 들어, 류신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)일 수 있으며, 시판예는 Prozyme 2000P 등일 수 있다. 류신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)는 진균에서 유래된 것일 수 있으며, 이와 같은 진균은 아스페르질루스 오리자에일 수 있다. 시판예는 아스페르질루스 오리자에로부터 유래된 류신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)를 포함한다.
또한, 세균성 엔도형 단백분해효소는 예를 들어, 메탈로엔도펩티다아제(metalloendopeptidase) 또는 세린프로테아제(serineprotease)일 수 있다. 메탈로엔도펩티다아제는 예를 들어, 바실로라이신(bacillolysin)일 수 있으며, 시판예는 Alphalase NP 등일 수 있다. 또한, 세린프로테아제는 예를 들어, 서브틸리신(subtilisin)일 수 있으며, 시판예는 Foodpro alkaline protease 등일 수 있다. 이와 같은 메탈로엔도펩티다아제는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소의 일 종일 수 있다. 또한, 세린프로테아제는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소의 일 종일 수 있다.
세균은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)일 수 있다.
즉, 세균성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 또는 바실러스 리케니포르미스로부터 유래된 것일 수 있다.
보다 바람직하게는, 세균성 중성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 유래된 것(예, 바실로라이신)일 수 있다.
또한, 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 리케니포르미스로부터 유래된 것(예, 서브틸리신)일 수 있다.
이 때, '로부터 유래된'은 '배양액으로부터 얻어진'을 포함하는 의미이다.
상기 로얄젤리 100 중량부에 대하여 단백분해효소는 1 내지 10 중량부일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 중량부일 수 있다. 이와 같은 범위 미만에서 효소활성이 불충분할 염려가 있고, 초과시 효소량대비분해율이 감소할 염려가 있다. 이 때, 로얄젤리 100 중량부에 대하여 단백분해효소 3 중량부는 중량기준으로 로얄젤리 100에 대하여, 단백분해효소 3의 비율임을 의미한다. 이하, '중량부' 역시 이와 동일한 방식으로 해석될 수 있다.
또한, 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소 100 중량부에 대하여, 세균성 엔도형 단백분해효소는 100 중량부이고, 진균성 엑소형 단백분해효소는 100 중량부일 수 있다.
단백분해효소로 처리시, 처리는 용매 중에서 이루어질 수 있으며, 로얄젤리 100 중량부에 대하여 용매는 500 내지 1000 중량부, 보다 바람직하게는 1000 중량부일 수 있다. 이 때, 용매는 물일 수 있다.
또한, 로얄젤리 단백분해효소 처리는 로얄젤리를 단백분해효소와 가압조건 0.5 내지 1 atm, 보다 바람직하게는 0.5 atm에서 접촉시키는 접촉단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 범위 미만이나 초과 시 유리아미노산 함량이 불충분하거나 활성이 불충분할 염려가 있다.
이와 같은 접촉은 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 실시하는 것일 수 있다. 또한, 이와 같은 접촉은 4차처리온도 섭씨 55도에서 처리하는 4차 처리단계를 더 포함하여 실시하는 것일 수 있다. 1차 처리단계 이후 2차 처리단계를 실시하고, 2차 처리단계 이후 3차 처리단계를 실시한다. 4차 처리단계는 3차 처리단계 이후 실시한다.
보다 바람직하게는, 1차처리온도는 섭씨 55도이고, 2차처리온도는 섭씨 45도이며, 3차처리온도는 섭씨 50도일 수 있다.
이 때, 1차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하고, 상기 2차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하며, 상기 3차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하는 것일 수 있다.
또한, 4차처리는 총 처리시간 24시간에서 1차, 2차, 및 3차 처리시간을 뺀 나머지 시간 동안 실시하는 것일 수 있다.
이와 같은 온도 조건의 범위 미만이나 초과시 유리아미노산함량이 불충분하거나 활성이 불충분할 염려가 있다.
효소처리 로얄젤리는 단백분해효소가 불활성된 불활성화효소처리 로얄젤리일 수도 있다. 즉, 과잉의 단백분해효소를 가열 등의 방법에 의해 불활성화시킨 상태일 수 있는 것이다. 불활성화는 가열에 의할 수 있으며, 가열은 예를 들어, 바람직하게는 섭씨 70 내지 90도에서 실시할 수 있다. 또한, 가열 시간은 바람직하게는 15 내지 30분일 수 있다. 즉, 불활성화는 15 내지 30분간, 섭씨 70 내지 90도로 가열처리하여 이루어지는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 로얄젤리 100 중량부에 대하여 용매 1000 중량부일 때, 15분간 섭씨 90도로 가열할 수 있다.
또한, 효소처리 로얄젤리는 후처리될 수 있다. 효소처리 로얄젤리는 용매(예, 물 등) 중에서 처리된 것일 수 있다. 후처리는 효소처리 로얄젤리를 가열건조, 분무건조, 동결건조하거나, 농축후가열건조, 농축후분무건조, 농축후동결건조하는 것에 의할 수 있다. 농축후동결건조의 경우, 구체적으로 농축단계; 및 동결건조단계를 포함하여 실시할 수 있다.
농축단계는 효소처리 로얄젤리를 농축하여 농축물을 얻는 단계로, 농축은 감압농축 등일 수 있다. 감압농축은 예를 들어, 섭씨 40 내지 65도에서 실시하는 것일 수 있다. 또한, 감압농축은 100 내지 300 mbar, 바람직하게는 110 내지 300 mbar의 압력에서 실시하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 로얄젤리 100 중량부에 대하여 용매 1000 중량부일 때, 섭씨 60도에서, 110mbar의 압력으로 실시할 수 있다.
동결건조단계는 농축물을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 단계로, 동결건조기 등으로 실시할 수 있다. 동결건조는 예를 들어, 동결건조기로 특정 조건(선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)에서 실시할 수 있다.
이하, 실시예에서는 세포를 이용하여 효소처리 로얄젤리가 피로 또는 우울증에 효과를 나타냄을 확인하였으며, 피로 또는 우울증이 유도된 동물모델을 이용하여 효소처리 로얄젤리가 피로 또는 우울증에 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실시예 1> 세포를 이용한 효소처리 로얄젤리의 용도 확인
1-1. 효소처리 로얄젤리 제조
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말{10-HDA(10-hydroxy-2-decenoic acid) 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD} 100 중량부에 대하여 정제수 1000 중량부를 가하여 혼합한 후, 단백분해효소{㈜비전바이오켐(대한민국)에서 구입; 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소 (Probeef 2000P), 진균성 엑소형 단백분해효소(Prozyme 2000P) 및 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소(Foodpro Alkaline protease)}를 함께 혼합하였다. 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100 중량부에 대하여 각각 1 중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 0.5 atm 가압조건과 섭씨 55도 3시간 1차처리 후, 섭씨 45도에서 3시간 2차처리 후, 섭씨 50도에서 3시간 3차처리 후, 섭씨 55도에서 15시간 4차 처리하는 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 열처리물을 농축탱크에 넣고 60±5℃에서 110mbar로 감압농축한 후, 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여, 분말형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다.
1-2. C2C12 세포 배양
골격근세포주 C2C12는 한국생명공학연구원에서 입수하였으며, 10% 소 태아혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린(Penicillin, P/S)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 2회 이상의 계대배양을 거쳐 세포를 안정화 시켰다.
1-3. PC12 세포 배양
부신 수질의 크롬친화세포종에서 유래된 세포주이며 NGF(nerve growth factor, 신경성장인자)를 처리하면 신경세포로 최종 분화하는 PC12는 ATCC에서 구입하여 사용하였으며, 10% FBS 및 1% P/S가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. PC12를 well plate에 Poly-L-ornithine solution(Sigma, Saint Louis, MO, USA)로 코팅을 충분히 해준 뒤, 세포를 분주하였다. 세포 부착 후, 1% FBS, 1% P/S, 50 ng/ml NGF-7S(nerve growth factor-7S)를 첨가한 RPMI-1640 배지에서 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 3일에 한번 동일한 조건의 배지로 갈아주었다.
1-4. C2C12 세포 생존력 분석
효소처리 로얄젤리의 세포 생존에 대한 영향을 분석하기 위하여, MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} assay를 이용하여 실험을 수행하였다. 1-2.과 같이 배양된 C2C12를 24-well 배양접시에 RPMI-1640 배지를 사용하여 5x104cell/well의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양기에 배양한 후, 배양배지를 바꿔준 후 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS(phosphate buffer saline)에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 후 20ug/ml MTT 완충액을 첨가하여 3시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하고 200uL DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 가하여 10분간 실온에서 반응 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
이 실험 과정은 기준시료 및 샘플을 세 세트로 실험하였다. 세포 생존율을 하기 식으로 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
세포 생존율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100
도 1은 효소처리 로얄젤리가 C2C12 세포 생존력에 미치는 영향을 나타낸 그래프로, 효소처리 로얄젤리의 농도에 따른 세포 생존력을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고, y축은 세포 생존율(Cell viability)을 대조군 대비 백분율(% of Vehicle)로 나타낸 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 효소처리 로얄젤리는 고농도에서도 세포 생존력에 영향을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 따라서 효소처리 로얄젤리는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않아 의약 내지 식품으로 사용가능함을 알 수 있다.
1-5. PC12 세포 생존력 분석
효소처리 로얄젤리의 세포 생존력에 대한 영향을 분석하기 위하여 MTT assay를 이용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12를 24-well 배양접시에 RPMI-1640 배지를 사용하여 5x105cell/well의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양기에 배양한 후, 배양배지를 바꿔준 후 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 후 20ug/ml MTT 완충액을 첨가하여 3시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하고 200uL DMSO를 가하여 10분간 실온에서 반응 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
이 실험 과정은 기준시료 및 샘플을 세 세트로 실험하였다. 세포 생존율을 하기 식으로 계산하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
세포 생존율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100
도 2는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포 생존력에 미치는 영향을 나타낸 그래프로, 효소처리 로얄젤리의 농도에 따른 세포 생존력을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고 y축은 세포 생존율(Cell viability)을 대조군 대비 백분율(% of Vehicle)로 나타낸 것이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 효소처리 로얄젤리는 PC12세포에 대하여도, 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 따라서 효소처리 로얄젤리는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않아 의약 내지 식품으로 사용가능함을 알 수 있다.
1-6. 효소처리 로얄젤리에 의한 PC12 세포의 산화 스트레스 회복능 분석
효소처리 로얄젤리의 산화 스트레스 회복능을 분석하기 위하여 MTT assay를 이용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12세포를 24-well 배양접시에 RPMI-1640 배지를 사용하여 5x105cell/well의 농도로 접종하고, 4시간 동안 배양하여 부착시킨 후, 500uM H2O2와 1-1.과 같이 제조한 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 배양 후, 250 ug/mL MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 제거하고 200ul의 DMSO를 가하여 10분간 실온에서 반응시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 3(a)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(a)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 산화 스트레스 회복능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고, y축은 세포 생존율(Cell viability)을 대조군 대비 백분율(% of Vehicle)로 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, # p<0.05, ##p<0.01; 음성대조군과 비교)
도 3(a)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 회복능이 증가됨을 확인하였다. 산화스트레스는 만성피로증후군, 우울증의 발생과 관련이 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 산화스트레스 회복능을 증가시킴으로써, 피로 또는 우울증에 효과를 나타낼 수 있다.
1-7. SOD(Superoxide dismutase) 활성 분석
효소처리 로얄젤리가 PC12세포에서 SOD 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Superoxide Dismutase Assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12를 RPMI-1640 배지를 사용하여 10cm2의 dish에 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후, 500 uM H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 배양하였다. 이 후, 모은 세포와 혼합한 버퍼액 10 ul에 radical detector 200 ul, Xanthine Oxidase 20 ul을 넣고 30분 동안 실온에서 잘 섞어준 뒤, 440 - 460 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 3(b)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(b)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 SOD 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고, y축은 SOD활성(U/ul)을 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, # p<0.05; 음성대조군과 비교)
도 3(b)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 SOD 활성이 증가됨을 확인하였다.
1-8. CAT (Catalase, 카탈라아제) 활성 분석
효소처리 로얄젤리가 PC12세포에서 CAT 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Catalase Assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12를 RPMI-1640 배지를 사용하여 10cm2의 dish에 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후, 500 uM H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 모은 세포와 혼합한 버퍼액 20ul에 assay buffer 100ul, methanol 30 ul, Hydrogen peroxide 20 ul를 넣고 상온에서 20분간 반응 후, Catalase potassium periodate 10 ul을 넣고 5분 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 3(c)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(c)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 CAT 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고, y축은 CAT활성(uM/min)을 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, ##p<0.01; 음성대조군과 비교)
도 3(c)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 CAT 활성이 증가됨을 확인하였다.
1-9. GSH (Glutathione, 글루타티온) 활성 분석
효소처리 로얄젤리가 PC12세포에서 GSH 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Glutathione Assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12를 RPMI-1640 배지를 사용하여 10cm2의 dish에 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후, 500 uM H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 모은 세포와 혼합한 버퍼액 50 ul에 MES buffer, cofactor mixture, enzyme mix, DTNB{5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)}를 혼합한 reaction buffer 150 ul을 넣고 암실에서 가볍게 섞어준 후, 30분 이내로 405 - 414 nm 범위의 11 horic acid를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 3(d)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(d)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 GSH 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고 y축은 GSH활성(uM)을 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, ##p<0.01; 음성대조군과 비교)
도 3(d)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도 시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 GSH 활성이 증가됨을 확인하였다.
1-10. NO(Nitric oxide) 생성량 분석
효소처리 로얄젤리가 PC12세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, Griess reagent system(Promega, Madison, WI)을 사용하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12를 RPMI-1640 배지를 사용하여 96-well plate에 1x104cell/well이 되도록 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후, 500ul H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 100 ul에 동량의 Griess reagent {0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine, 1% sulfanilamide, 5% phosphoric acid}를 혼합하여 실온에서 10분간 반응 후, 550nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 3(e)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(e)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고 y축은 NO 생성량{NO production(uM)}을 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, # p<0.05, ##p<0.01, ### p<0.001; 음성대조군과 비교)
도 3(e)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도 시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소됨을 확인하였다.
1-11. Reactive oxygen species (ROS) 활성 분석
효소처리 로얄젤리가 PC12세포에서 ROS 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 실험을 수행하였다. 1-3.과 같이 배양된 PC12 세포를 RPMI-1640 배지를 사용하여 96-well plate에 1x104 cell/well이 되도록 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후, 500 uM H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, PBS:2’7’-Dichlorofluorescein diacetate(DCFDA) = 5000:1로 희석시킨 용액을 배지와 동량으로 처리하여 20분 동안 배양한 뒤 형광을 측정하고, 그 결과를 도 3(f)에 나타내었다. 대조군(Vehicle)은 효소처리 로얄젤리와 H2O2 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 음성대조군(Control)은 효소처리 로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였고, 동결건조 로얄젤리 처리군(RJ)은 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조 로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리 로얄젤리 처리군과 동일하게 준비하였다.
도 3(f)는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 ROS 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. x축은 대조군과 실험군을 나타낸 것으로, vehicle은 대조군, Control은 음성 대조군, ERJ는 효소처리 로얄젤리(25, 50, 100 또는 200ug/ml)를 처리한 실험군, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 나타낸 것이고 y축은 ROS의 활성을 대조군 대비 백분율(% of Vehicle)로 나타낸 것이다.(***p < 0.001; 대조군과 비교, # p<0.05, ##p<0.01; 음성대조군과 비교)
도 3(f)에 나타난 바와 같이, H2O2로 산화 스트레스 유도 시, 효소처리 로얄젤리에 의해, 농도 의존적으로 ROS 활성이 감소됨을 확인하였다.
1-12. 세포에서 세포사멸관련인자, 세포내신호전달관련인자, 염증관련인자, 산화스트레스반응인자 및 신경영양인자의 발현 분석
효소처리 로얄젤리가 특정 단백질 발현을 억제하는지 확인하고자, 웨스턴 블롯을 이용하여, PC12세포에서 세포사멸관련인자{caspase-3, PARP(poly-ADP ribose polymerase)}, 세포내신호전달관련인자{ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(Jun N-terminal kinase) p38}, 염증관련인자{NF-kb(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), iNOS(inducible NO synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), IkB-α, IL-1β}, 산화스트레스반응인자{Nrf-2(Nuclear respiratory factor), HO-1(heme oxygenase 1)}, 신경영양인자{BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell-derived neurotrophic factor)}의 발현을 확인하였다.
PC12 세포가 dish에 70% 정도 차면, 500 μM H2O2와 1-1.과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 PBS에 녹여, 다양한 농도(25, 50, 100 또는 200ug/ml)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 스크래퍼를 이용하여 세포를 긁어낸 후, 용해 완충액을 넣어 균질화한 후, 원심분리기를 이용하여 상층액을 얻었다. 이를 10% SDS-폴리아크릴 아미드겔에 로딩하였다. 로딩 후, 막에 블롯팅을 하였다. 막을 0.1% tween-20이 첨가된 1M tris-buffer (TBS, pH 7.2)에 세척 후, 5% 탈지유가 첨가된 TBS-T에서 2시간 동안 고정하였다. TBS-T로 세척 후 1차 항체(caspase-3, PARP, ERK, JNK, p38, COX-2, iNOS, NF-kB p65, IkB-α, IL-1β, Nrf-2, HO-1, BDNF, GDNF가 표지된 1차 항체; Santacruz, Cell signaling에서 입수)를 5% 탈지유가 첨가된 TBS-T에 1:2500의 비율로 희석하여 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 방치한 후, TBS-T로 세척하여 1차 항체를 제거하고 2차 항체(Goat anti-mouse IgG)를 1:2000의 비율로 희석하여 1시간 동안 처리하였다. 이후, 단백질 밴드를 강화된 화학발광 (enbanced chemiluminesence, ECL) 시스템을 사용하여 가시화하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 필요에 따라, 효소처리 로얄젤리 대신 동결건조로얄젤리(100ug/ml)를 처리한 것을 제외하고 효소처리로얄젤리 처리군과 동일하게 처리하거나, 효소처리로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리로얄젤리 처리군과 동일하게 처리하거나, H2O2와 효소처리로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리로얄젤리 처리군과 동일하게 처리하거나, NGF, H2O2, 및 효소처리로얄젤리 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 효소처리로얄젤리 처리군과 동일하게 처리하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 사멸에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(a), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 신호전달에 중추적 역할을 하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(b), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 염증에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(c), 효소처리 로얄젤리가 PC12 세포에서의 세포 내 산화 스트레스에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(d) 및 효소처리 로얄젤리가 신경세포의 생존과 성장에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프(e)이다.
도 4의 각각의 레인은 NGF와 H2O2의 투여여부, ERJ와 RJ의 투여량에 따라 구분된다. NGF는 신경생장인자(nerve growth factor)를 의미하고, ERJ는 효소처리 로얄젤리 처리군을 의미하고, RJ는 동결건조 로얄젤리 처리군을 의미한다. β-actin 은 loading control로써 균일한 밴드 굵기를 통해 동일한 양의 단백질을 로딩했음을 나타낸다. Cleaved caspase-3는 caspase-3의 Cleavage가 일어난 상태이며, Cleaved PARP는 PARP의 Cleavage가 일어난 상태이다. p-ERK는 ERK의 인산화형이고, p-p38은 p38의 인산화형이고, p-JNK는 JNK의 인산화형이고, p-IkB-α는 IkB-α의 인산화형이다.
도 4(a)에 나타낸 바와 같이, 외부로부터 세포에 충격이 가해졌을 때 활성화되어 세포사멸에 관여한다고 알려진 Cleaved caspase-3, caspase-3, Cleaved PARP, PARP의 발현량을 확인한 결과, 효소처리 로얄젤리의 농도 의존적으로 각각의 발현량이 감소됨을 확인하였다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 외부 스트레스 등에 의한 신경세포 사멸을 억제한다. 이와 같은 결과로부터, 외부 스트레스 등에 의한 정신적 피로 내지 그로 인한 우울증 등에 효소처리 로얄젤리가 효과적임을 알 수 있다.
또한, 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, 세포 내 신호 전달에 중추적 역할을 하여 세포가 사멸되는 과정에서 발현이 증가된다고 알려진 효소(p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, JNK)의 발현량을 확인한 결과, 효소처리 로얄젤리의 농도 의존적으로 각각의 발현량이 감소됨을 확인하였다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 외부 스트레스 등에 의한 신경세포 사멸을 억제함을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 외부 스트레스 등에 의한 정신적 피로 내지 그로 인한 우울증 등에 효소처리 로얄젤리가 효과적임을 알 수 있다.
또한, 도 4(c)에 나타낸 바와 같이, 체내에서 염증이 유발되었을 때 발현된다고 알려진 염증 발현 인자(NF-kB, COX-2, iNOS, p-IkBα, IkBα, IL-1β)를 확인한 결과, 효소처리 로얄젤리의 농도 의존적으로 각각의 발현량이 감소됨을 확인하였다.
또한, 도 4(d)에 나타낸 바와 같이, 세포 내에서 산화 스트레스 자극을 받았을 때 분비되는 Nrf-2, HO-1의 발현량을 확인한 결과, 효소처리 로얄젤리의 농도 의존적으로 각각의 발현량이 증가됨을 확인하였다.
또한, 도 4(e)에 나타낸 바와 같이, 신경 세포의 생존과 성장에 관여하는 신경영양인자(BDNF, GDNF)의 발현량을 확인한 결과, 효소처리 로얄젤리 농도 200 ug/ml 처리시 약간 증가됨을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리는 신경세포의 생존과 성장에 효과적임을 알 수 있다. 결국, 효소처리 로얄젤리는 정신적 피로에 특히 관련성이 큰 신경세포의 생존과 성장에 효과를 나타내므로, 정신적 피로 내지 그로 인한 우울증 등에 특히 효과적임을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 효소처리 로얄젤리는 피로회복 및/또는 우울증의 치료, 예방, 개선 및/또는 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 2> 동물모델을 이용한 효소처리 로얄젤리의 용도 확인
2-1. 효소처리 로얄젤리 제조
실시예 1-1.과 동일한 방법으로 효소처리 로얄젤리를 준비하였다.
2-2. 피로 또는 우울증이 유도된 동물모델 구축
구속 스트레스로 인한 피로 또는 우울증이 유도된 실험적 모델을 구축하기 위하여 SD rat 웅성 마우스(200~250g, 5주령)를 다물사이언스 (대전, 한국)에서 구입하여 1주 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 일정한 습도(50±10%), 일정한 온도(22±2℃) 및 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에 1주간 적응시켰다. 그룹은 대조군, 구속스트레스만을 유도한 음성대조군, 구속스트레스와 함께 2-1과 같이 제조된 효소처리 로얄젤리를 처리한 효소처리 로얄젤리 처리군(50, 100, 200, 400 mg/kg) 및 구속스트레스와 함께 동결건조 로얄젤리를 처리한 동결건조 로얄젤리 처리군(100 mg/kg) 으로 나누었다. 모든 군은 통계학적 유의성을 산출하기 위해 각 그룹 당 8마리로 4개의 cage 각각에 2마리의 렛트를 사육하였다. 음성대조군, 효소처리 로얄젤리 처리군(50, 100, 200, 400 mg/kg) 및 동결건조 로얄젤리 처리군(100 mg/kg)은 7일간 매일 오전 10시에 시료를 강제투여한 뒤 30분 후에 (주)정도피앤피로부터 구매한 rat stress cage에 가두어 일정시간 (10 내지 30분) 구속 스트레스에 노출시켰다. 효소처리 로얄젤리 또는 동결건조 로얄젤리는 증류수로 용해시킨 후, 하루 한 번씩 경구 투여를 7일간 하였으며, 대조군과 음성대조군은 증류수를 각각 경구투여 하였다. 6일째 되는 날 우울증 유발의 확인을 위하여 원형 플라스틱 수조에 수온 23℃의 미온수를 가득 채우고 예비실험 (Pre-swim)으로 강제수영 15분 진행 하였고, 24시간 뒤인 실험 7일째에 본실험 (Post-swim)인 강제수영을 5분간 진행하였다. test session 동안 다음의 동물의 행동이 나타나는 시간을 측정하였다. 강제수영 검사는 동물이 발버둥치지 않고 물위에 떠 있는 행동으로 수면 밖으로 머리를 내놓는 데 필요한 움직임 이외에 아무 움직임이 없는 상태인 부동성의 증가를 절망행동의 지표로 삼았다(immobility behavior). 본 실험 직후, 렛트를 단두로 희생하여 혈액과 뇌 조직을 채취하였다. 강제 수영 중 각 실험군 별로 부동(immobilization)시간을 측정하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델의 부동시간에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 강제 수영 중 각 실험군 별로 부동시간을 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군) 및 ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군)를 나타내고 y축은 부동시간(immobilization time)을 나타낸다.
도 5에 나타난 바와 같이, 음성대조군이 대조군에 비해 부동시간이 길어진 것으로부터 구속스트레스로 인한 피로 또는 우울증이 제대로 유도되었다고 볼 수 있다. 또한, 효소처리 로얄젤리 처리군은 농도 의존적으로 부동시간이 짧아지는 것으로부터, 효소처리 로얄젤리가 구속스트레스로 인한 피로 또는 우울증에 농도 의존적으로 효과가 있음을 알 수 있다.
2-3. 혈청 분리
2-2.에서 얻은 혈액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 혈청을 분리하였다.
2-4. 혈중 LDH(Lactate dehydrogenase) 농도 분석
LDH는 육체적 피로관련 지표로 이용된다. LDH는 근육활동 중 무산소해당계에 의해 ATP를 생산하는 필수 효소로써 피루브산과 젖산의 반응을 촉매하는 효소로 주로 적혈구와 근세포에 존재한다. 심한 육체운동에 의한 직접적인 세포막의 파괴 및 조직괴사, 스트레스에 의한 지질과산화 등에 의하여 세포막 투과성이 증가되면 세포질 내의 LDH가 혈중으로 방출되며, 혈중 LDH의 농도는 근 손상의 지표로도 사용된다.
2-3.에서 분리한 혈청을 이용하여 혈중 LDH 농도를 측정하였다. 혈중 LDH 농도 측정은 LDH cytotoxicity detection kit(Takara Bio, Tokyo, Japan)로 실시하였다. 적당히 희석된 혈청을 sample로 하여 sample 100 ul에 reaction mixture 100 ul를 넣고 37℃에서 30분간 반응 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 LDH 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고 y축은 LDH의 농도를 대조군 대비 백분율(% of Vehicle)로 나타낸 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 혈중 LDH 농도의 그룹간 차이가 크지 않은 것으로부터, 육체적 피로에 영향을 주지 않는 범위에서 정신적 피로 및 우울증 실험을 진행했음을 확인할 수 있었다.
2-5. 혈중 glucose(글루코스) 농도 분석
혈당(blood glucose)는 육체적 피로관련 지표로 이용된다. 혈중 글루코스 농도가 감소하고, 산소의 부족으로 인하여 당 생성과정이 저해될 경우 젖산 생성의 증가로 인하여 피로감을 느끼게 되고, 지구력 운동 수행 능력이 저해된다.
2-3.에서 분리한 혈청을 이용하여 혈중 glucose 농도를 측정하였다. 혈중 glucose 농도측정은 glucose assay kit(Asan Pharmaceutical Co, Seoul, Korea)로 실시하였다. 적당히 희석된 혈청을 sample로 하여 sample 20 ul에 효소시약 3 ml을 첨가한 후, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 500 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 7(a)에 나타내었다.
도 7(a)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 glucose 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고 y축은 glucose의 농도를 나타낸다.
도 7(a)에 나타난 바와 같이, 혈중 glucose 농도의 그룹간 차이가 크지 않은 것으로부터, 육체적 피로에 영향을 주지 않는 범위에서 정신적 피로 및 우울증 실험을 진행했음을 확인할 수 있었다.
2-6. 혈중 CK(Creatine kinase) 농도 분석
CK는 육체적 피로관련 지표로 이용된다. CK는 크레아틴과 ATP에 의하여 크레아틴인산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 근육에 많이 존재하고 인체 세포가 직접적으로 사용하는 에너지원인 ATP를 생성한다. 또한 근조직이 손상되면 세포막 투과성이 증가하고, CK가 세포 간질액으로 이동하여 혈중 농도가 높아진다. 혈중 CK 농도는 근 손상을 평가하는 지표로도 사용된다.
2-3.에서 분리한 혈청을 이용하여 혈중 CK 농도를 측정하였다. 혈중 CK 농도측정은 Creatine Colorimetric assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)로 실시하였다. 적당히 희석된 혈청을 sample로 하여 sample 15 ul에 creatine reaction buffer 100 ul, color reagent 100 ul를 넣고 1분, 7분 뒤 490 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 7(b)에 나타내었다.
도 7(b)는 효소처리 로얄젤리가 피로 또는 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 CK 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 CK의 농도를 나타낸다.
도 7(b)에 나타난 바와 같이, 혈중 CK 농도의 그룹간 차이가 크지 않은 것으로부터, 육체적 피로에 영향을 주지 않는 범위에서 정신적 피로 및 우울증 실험을 진행했음을 확인할 수 있었다.
2-7. 혈중 코르티코스테론(Corticosterone) 농도 분석
코르티코스테론은 정신적 피로관련 지표로 이용된다. 코르티코스테론은 스트레스 시 뇌하수체 전엽에서 부신피질 자극 호르몬(ACTH, adrenocorticotropic hormone) 분비를 증가시킴으로써 부신피질의 당질코르티코이드 분비가 증가한다. 이는 기관과 물리적 변화를 일으키며, 항상성 유지를 저해시킨다.
2-3.에서 분리한 혈청을 이용하여 혈중 코르티코스테론 농도를 측정하였다. 혈중 코르티코스테론 농도측정은 corticosterone ELISA kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)로 실시하였다. 적당히 희석된 혈청을 sample로 하여 sample 50 ul에 tracer와 antiserum을 각각 50 ul를 넣고 플라스틱 필름으로 잘 덮은 후, 4℃에서 24시간 반응 후, 5회 세척을 진행하였다. 이 후, Ellman’s reagent를 200 ul를 넣고 차광하여 섞어주면서 100분 반응 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 혈중 코르티코스테론 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 코르티코스테론의 농도를 나타낸다.(* p < 0.05; 대조군과 비교, # p < 0.05, ### p < 0.001; 음성 대조군과 비교)
도 8에 나타난 바와 같이, 혈중 코르티코스테론의 농도가 효소처리 로얄젤리에 용량 의존적으로 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다. 따라서, 효소처리 로얄젤리가 피로, 특히 스트레스로 인한 정신적 피로에 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
2-8. 뇌조직 분리
2-2에서 적출한 렛트의 뇌를 적출한 직후 5℃ 이하의 생리식염수에 뇌조직을 담궈 혈액을 제거한 뒤 액체질소 또는 드라이아이스를 이용하여 급속 냉각하여 70℃에 얼린 후, 특정 뇌부분 (해마, 선조체, 흑질)을 분리하여 실험에 사용하였다.
렛트의 뇌를 적출하여 얻은 특정 시료에 200 내지 500 ul의 extraction buffer {50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 0.1% protease inhibitor, 0.1% phosphatase inhibitor}를 넣어 균질화한 후, 15분 간격으로 3번 vortex-spindown 하고, 15000 rpm, 4℃에서 15분씩 3회 원심분리 하여 상등액을 취하여 단백질 농도를 측정한 다음 실험을 진행하였다.
2-9. 세로토닌(Serotonin) 농도 분석
세로토닌은 정신적 피로관련 지표로 이용된다. 세로토닌은 5-히드록시트립타민(hydroxytryptamin,5-HIT)이라고 불리며, 뇌간의 정중선에 따라 위치한 봉선 핵을 갖고 있는 뉴런에 의해 신경전달물질로써 사용된다.
세로토닌이 부족하면 우울증이나 불안증을 유발하기 쉬운 것으로 알려져 있다.
2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 이용하여 세로토닌 농도를 측정하였다. 세로토닌 농도는 ELISA kit(Enzo Life Sciences Inc, MI, USA)을 이용하여 실험을 진행하였다. 2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 sample로 하여 sample 100 ul를 넣고, antibody 50 ul를 넣은 후 실온에서 2시간 반응하였다. 3회 세척 후, 200 ul의 substrate solution을 넣고 실온에서 1시간 반응하였으며, 이후 50 ul의 stop solution을 넣고 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 9(a)에 나타내었다.
도 9(a)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 세로토닌 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 세로토닌의 농도를 나타낸다.(** p < 0.01; 대조군과 비교, # p < 0.05; 음성 대조군과 비교)
도 9(a)에 나타난 바와 같이, 세로토닌 호르몬 농도는 효소처리 로얄젤리에용량 의존적으로 유의성 있게 증가함을 확인하였다. 특히 동일 농도에서 동결건조 로얄젤리에 비해 효소처리 로얄젤리에서 더 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리가 뇌조직에서 세로토닌 농도를 증가시킴을 알 수 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 뇌조직 중 세로토닌 증가에 의해 피로 특히 정신적 피로 내지 우울증에 효과적임을 알 수 있다.
2-10. 도파민(Dopamin) 농도 분석
도파민은 정신적 피로관련 지표로 이용된다. 도파민은 신경전달물질의 하나로 노르에피네프린과 에피네프린의 전구물질이다. 운동 중 도파민은 심리적 각성상태를 유지시켜줌으로써 중추피로를 억제한다. 즉, 신체적 운동 시 도파민 신경전달의 감소는 피로를 유발시킨다.
도파민 분비 조절에 이상이 발생하면 사람에게 다양한 질환이 발생한다. 도파민의 분비가 줄어들거나 재흡수 되어 부족할 경우 우울증을 일으키는 경우가 대부분이며, 우울증이 만성화되는 경우 정신 분열증(schizophrenia)의 증상도 같이 나타나기도 한다.
2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 이용하여 도파민 농도를 측정하였다. 도파민 농도 분석은 ELISA kit(Geneway, Beijing, China)를 이용하여 실험을 진행하였다. 2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 sample로 하여 sample 100 ul를 넣고, COMT Enzyme solution(Catechol- O -methyltransferase Enzyme solution) 75 ul, 도파민 antiserum 50 ul를 넣은 후 실온에서 2시간 반응하였다. 6회 세척 후, 100 ul의 Enzyme conjugate를 넣고 실온에서 1시간 반응하였다. 6회 세척 후, 200 ul substrate solution을 넣고 실온에서 40분 반응 후, 50 ul의 pNPP stop solution(para-nitrophenyl phosphate stop solution)을 넣고 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 9(b)에 나타내었다.
도 9(b)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 도파민 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 뇌조직 중 도파민의 농도를 나타낸다.(* p < 0.05; 대조군과 비교, # p < 0.05, ## p < 0.01; 음성 대조군과 비교)
도 9(b)에 나타난 바와 같이, 도파민 호르몬 농도는 효소처리 로얄젤리에 용량 의존적으로 유의성 있게 증가함을 확인하였다. 특히 동일 농도에서 동결건조 로얄젤리에 비해 효소처리 로얄젤리에서 더욱 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리가 뇌조직에서 도파민 농도를 증가시킴을 알 수 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 뇌조직 중 도파민 증가에 의해 피로 특히 정신적 피로 내지 우울증에 효과적임을 알 수 있다.
2-11. 노르에피네프린(Norepinephrine) 농도 분석
노르에피네프린은 노르아드레날린(Noradrenaline)이라고도 한다. 노르에피네프린은 에너지와 흥미, 동기 부여 등의 뇌 기능과 연관이 있는데, 연구에 따르면 우울증이 있는 사람들은 이 물질들이 부족하다는 것이 조사 결과 나타났다.
2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 이용하여 노르에피네프린 농도를 측정하였다. 노르에피네프린 농도 분석은 Noradrenaline/Norepinephrine (NA/NE) ELISA kit(Mybiosource, San Diego, CA)을 이용하여 실험을 진행하였다. 2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 sample로 하여 sample 50 ul를 넣고, biotin-detection antibody working solution 50 ul를 넣고 잘 섞은 후, 37℃에서 45분간 반응하였다. 3회 세척 후, 200 ul의 SABR working solution을 넣고 37℃에서 30분간 반응한 뒤, 3회 세척 후, 90 ul의 TMB substrate를 넣고 37℃의 암실조건에서 15 내지 20분 반응하였다. 이후 50 ul의 stop solution을 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 9(c)에 나타내었다.
도 9(c)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 노르에피네프린 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 노르에피네프린의 농도를 나타낸다.(*** p < 0.001; 대조군과 비교, # p < 0.05, ### p < 0.001; 음성 대조군과 비교)
도 9(c)에 나타난 바와 같이, 노르에피네프린 호르몬 농도는 효소처리 로얄젤리에 용량 의존적으로 유의성 있게 증가함을 확인하였다. 특히 동일 농도에서 동결건조 로얄젤리에 비해 효소처리 로얄젤리에서 더 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리가 뇌조직에서 노르에피네프린 농도를 증가시킴을 알 수 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 뇌조직 중 노르에피네프린 증가에 의해 피로 특히 정신적 피로 내지 우울증에 효과적임을 알 수 있다.
2-12. MAO(Monoamine oxidase, 모노아민옥시데이즈) 농도 분석
MAO는 아드레날린, 도파민, 세로토닌 등의 아민을 산화적으로 탈아미노시켜 모노아민성 신경전달물질을 분해하는 효소이다. 따라서 MAO의 농도가 감소하면 신경전달물질의 분해가 감소되어 우울증에 효과가 있음을 알 수 있다.
2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 이용하여 MAO 농도를 측정하였다. MAO 농도 측정은 ELISA kit(Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 실험을 진행하였다. 2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 sample로 하여 sample 45 ul에 DW를 5 ul 넣고, 10분 뒤에 assay buffer, p-Tyramine, HRP Enzyme(Horseradish peroxidase), Dye reagent가 적절한 비율로 혼합된 reaction mix 50 ul를 넣고 530 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 9(d)에 나타내었다.
도 9(d)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 MAO 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고, y축은 MAO의 농도를 나타낸다.(*** p < 0.001; 대조군과 비교, ### p < 0.001; 음성 대조군과 비교)
도 9(d)에 나타난 바와 같이, MAO 호르몬 농도는 용량 의존적으로 유의성 있게 감소함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리가 뇌조직에서 MAO 농도를 감소시킴을 알 수 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 뇌조직 중 MAO 농도 감소에 의해 피로 특히 정신적 피로 내지 우울증에 효과적임을 알 수 있다.
2-13. 5-HIAA(5-hydroxyindoleacetic acid, 5-하이드록시인돌초산) 농도 분석
세로토닌의 대사물질인 5-HIAA의 농도가 중추 세로토닌 활성도의 지표로이용될 수 있다. 따라서, 5-HIAA의 농도가 감소하는 것은 세로토닌의 활성이 높아지는 것과 유사한 의미를 나타내므로 우울증에 효과가 있음을 나타낸다.
2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 이용하여 5-HIAA 농도를 측정하였다. 5-HIAA 농도 분석은 ELISA kit(Mybiosource, San Diego, CA)을 이용하여 실험을 진행하였다. 2-8.에서 얻은 단백질 희석액을 sample로 하여 sample 50 ul과 conjugate 50 ul를 넣은 후, 37℃에서 1시간 동안 반응 하였다. 3회 세척 후, 50 ul HRP-avidin을 넣고 37℃에서 30분간 반응한 뒤, 3회 세척 후, substrate A와 B를 각각 50 ul씩 넣고 37℃에서 15분간 반응 하였다. 이 후, 50 ul의 stop solution을 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 9(e)에 나타내었다.
도 9(e)는 효소처리 로얄젤리가 피로 내지 우울증이 유도된 동물모델에서 뇌조직 내 5-HIAA 농도에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 vehicle(대조군), control(음성대조군), ERJ(효소처리 로얄젤리 처리군) 및 RJ(동결건조 로얄젤리 처리군)를 나타내고 y축은 뇌조직중 5-HIAA의 농도를 나타낸다.(* p < 0.05; 대조군과 비교, # p < 0.05; 음성 대조군과 비교)
도 9(e)에 나타난 바와 같이, 5-HIAA 호르몬 농도는 용량 의존적으로 유의성 있게 감소함을 확인하였다. 특히 동일 농도에서 동결건조 로얄젤리에 비해 효소처리 로얄젤리에서 더 감소함을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리가 뇌조직에서 5-HIAA 농도를 감소시킴을 알 수 있다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 뇌조직 중 5-HIAA 농도 감소에 의해 피로 특히 정신적 피로 내지 우울증에 효과적임을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 유효성분인 효소처리 로얄젤리는 피로 및/또는 우울증 치료, 예방, 개선 및/또는 억제가 가능함을 알 수 있다.
또한, 이와 같은 치료, 예방, 개선 및/또는 억제는 세포사멸인자 발현 억제, 세포내신호전달인자 발현 억제, 신경영양인자 발현 유도, 혈 중 코르티코스테론의 생성 억제, 뇌조직 중 세로토닌 증가, 도파민 증가, 노르에피네프린 증가, MAO의 감소, 및/또는 5-HIAA 감소 등에 의할 수 있다.
<제조예 1> 약학 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
20 mg
유당
100 mg
탈크
10 mg
상기 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
10 mg
옥수수전분
100 mg
유당
100 mg
스테아린산 마그네슘
2 mg
상기 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
10 mg
결정성 셀룰로오스
3 mg
락토오스
14.8 mg
마그네슘 스테아레이트
0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
10 mg
만니톨
180 mg
주사용 멸균 증류수
2974 mg
Na2HPO42H2O
26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
20 mg
이성화당
10 g
만니톨
5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 상기 함량으로 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가하여 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 식품 제제
2-1. 건강식품의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트
70 ug
비타민 E
1.0 mg
비타민 B1
0.13 mg
비타민 B2
0.15 mg
비타민 B6
0.5 mg
비타민 B12
0.2 ug
비타민 C
10 mg
비오틴
10 ug
니코틴산아미드
1.7 mg
엽산
50 ug
판토텐산 칼슘
0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철
1.75 mg
산화아연
0.82 mg
탄산마그네슘
25.3 mg
제1인산칼륨
15 mg
제2인산칼슘
55 mg
구연산칼륨
90 mg
탄산칼슘
100 mg
염화마그네슘
24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2-2. 건강음료의 제조
실시예 1-1.과 같은 방법으로 제조한 효소처리 로얄젤리
100 mg
비타민 C
15 g
비타민 E(분말)
100 g
젖산철
19.75 g
산화아연
3.5 g
니코틴산아미드
3.5 g
비타민 A
0.2 g
비타민 B1
0.25 g
비타민 B2
0.3 g
물 적량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
Claims (8)
- 로얄젤리를 단백분해효소로 처리한 효소처리 로얄젤리를 유효성분으로 포함하고, 상기 단백분해효소는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 엔도형 단백분해효소를 포함하는, 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소 또는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소 중에서 선택된 하나 이상인 약학조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소인 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 피로는 정신적 피로인 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은, 상기 유효성분에 의한 세포사멸인자 발현 억제, 세포내신호전달인자 발현 억제, 또는 신경영양인자 발현 유도 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것인 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은, 상기 유효성분에 의한 혈 중 코르티코스테론의 생성 억제에 의한 것인 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은, 상기 유효성분에 의한 뇌조직 중 세로토닌 증가, 도파민 증가, 노르에피네프린 증가, 모노아민옥시데이즈 감소, 또는 5-하이드록시인돌초산 감소 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것인 약학 조성물.
- 로얄젤리를 단백분해효소로 처리한 효소처리 로얄젤리를 유효성분으로 포함하고, 상기 단백분해효소는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 엔도형 단백분해효소를 포함하는, 피로 또는 우울증 중에서 선택된 하나 이상의 개선 또는 억제용 식품조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020170123781A KR20190035035A (ko) | 2017-09-25 | 2017-09-25 | 효소처리 로얄젤리의 신규 용도 |
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| KR (1) | KR20190035035A (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210073184A (ko) * | 2019-12-10 | 2021-06-18 | 임재웅 | 로열젤리 펩타이드를 포함하는 식품 조성물 및 상기 조성물의 제조 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040036494A (ko) | 2002-10-26 | 2004-04-30 | (주)바이오나노텍 | 로얄제리를 주성분으로 하는 100% 천연 성분의 각질 박리 촉진용 조성물 |
-
2017
- 2017-09-25 KR KR1020170123781A patent/KR20190035035A/ko not_active Application Discontinuation
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| KR20220149650A (ko) * | 2019-12-10 | 2022-11-08 | 임재웅 | 로열젤리 펩타이드를 포함하는 식품 조성물 및 상기 조성물의 제조 방법 |
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