KR20190031573A - 수지상 세포들의 형질주입 및 그 방법들(transfection of dendritic cells and methods therefor) - Google Patents
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Abstract
하나 이상의 네오에피토프들(neoepitope) 및 종양 관련 항원(tumor associated antigen)들이 생성되거나, 수지상 세포(dendritic cell)들로 전달되는 면역요법 방법들 및 조성물들이 고려되고, 이렇게 변형되는 수지상 세포들은 환자의 면역 컴피턴트 세포(immune competent cell)들로, 바람직하게는 자극 신호들의 존재 하에서 공-배양(co-cultured)된다. 세포들은 바람직하게는 면역 체크포인트 억제 치료(immune checkpoint inhibition treatment)를 받고 있는 환자에게 수혈된다.
Description
본 발명의 기술 분야는 면역요법 조성물들 및 방법들로, 특히 생체 외 컴포넌트들을 가지는 암 백신 제제들 및 방법들에 관한 것이다.
이하의 기술들은 본 발명의 이해에 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 정보가 현재 청구된 발명과 관련이 있거나 또는 선행 기술이거나, 또는 명시적으로 또는 암시적으로 참조되는 임의의 간행물이 선행기술임을 인정하는 것은 아니다.
본 명세서에서 식별되는 모든 특허 출원들 및 간행물들은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로써 통합되는 것으로 표시되는 것과 같은 정도로 참조로써 통합된다. 통합되는 참조에서의 용어의 사용 또는 정의가 본 명세서에서 제공되는 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 제공되는 그 용어의 정의가 적용되고 그리고 참조에서의 그 용어의 정의는 적용되지 않는다.
암 백신들은 최근 몇 년 동안 많은 가능성을 보였지만, 재조합 항원의 낮은 제시(presentation) 및 바이러스성 운송수단(viral vehicle)의 면역원성(immunogenicity)을 포함하는, 다양한 인자들에 의해 종종 제한된다. 또한, 종종 바이러스성 운송수단들의 전신 전달(systemic delivery)으로 인해, 면역 시스템에서의 다양한 컴포넌트들의 전반적인(pervasive) 트레이닝이 종종 이루어지지 않거나, 제대로 이루어지지 않는다. 또한, 항원 제시가 적어도 어느 정도 이루어지는 경우에도, 면역 체크포인트 억제제가 효과적인 치료에 추가적인 장애물을 야기한다.
종양 항원들의 전신 전달과 관련된 몇몇의 어려움들을 극복하기위해, 암 특이적 항원들을 사용하여 특정 항원 제시 세포들의 인 비트로(in vitro) 자극을 트리거링(trigger)하기 위해 다양한 노력들이 시도되었다. 이렇게 펄스화된 항원 제시 세포들은 치료 조성물로서 환자에게 수혈된다(예를 들어, Nature Reviews|Cancer 2012 Vol. 12 p.265-277 참조). 다른 접근법으로, 수지상 세포들은 TLR 작동제들의 존재 하에 성숙한 수지상 세포들을 생성하기 위해 NK 세포들과 함께 배양되었다(Experimental & Molecular Medicine (2010), 42(6), p407-419 참조). 적어도 개념적으로 매력적이긴 하지만, 다양한 단점들이 남아있다. 그 외에도, 펄스화된 수지상 세포들은 종종 자가면역(autoimmunity)을 발생시키는 내재적 위험을 가져오는 종양 세포들에 노출되거나, 또는 견딜 수 있는 면역성을 이끌어 내는 잠재력이 자주 부족한 NK 세포들과 결합된다.
따라서, 면역 반응을 생성하기 위한 수많은 방법들 및 조성물이 본 기술분야에 공지되었지만, 이들 모두 또는 거의 모든 것들이 다양한 단점을 가진다. 결과적으로, 면역요법(immunotherapy)을 위한 개선된 조성물들 및 방법들에 대한 수요가 존재한다.
본 출원은 2016년 08월 02에 출원된 미국 가출원 번호 제62/370208호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 주제는 환자의 면역 컴피턴트 세포(immune competent cell)(예를 들어, NK 세포들, CD4+ T-세포들)들이 상기 환자의 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 이전에 형질주입되거나, 또는 상기 환자의 상기 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 이전에 형질주입되는 다양한 항원-제시 세포들(예를 들어, 수지상 세포들)과 공-배양되는(co-cultured) 환자의 면역학적 종양 치료의 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 이렇게 생성된 세포군은 상기 환자의 상기 종양의 종양-관련 에피토프들에 대한 특정 면역 반응성을 가지고 그리고 치료 모달리티(therapeutic modality)로서 적합하다.
본 발명의 주제의 일 양상에서, 본 발명자들은 이전에 형질주입된 항원-제시 세포들에 노출된 복수의 면역 컴피턴트 세포들을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 고려한다.
가장 바람직하게는, 상기 항원-제시 세포들은 상기 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프로 또는 상기 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질주입되고, 그리고 상기 면역 컴피턴트 세포들은 상기 종양을 가지는 상기 환자로부터 획득된다.
따라서, 본 발명자들은 또한 종양을 가지는 환자로부터 면역 컴피턴트 세포들을 생체 외(ex vivo)에서 활성화시키는 방법을 고려한다. 이러한 방법들은 일반적으로 복수의 면역 컴피턴트 세포들을 환자로부터 획득하는 단계, 및 상기 환자의 상기 종양을 적어도 하나의 종양-관련 에피토프로 또는 상기 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 복수의 항원-제시 세포들을 생체 외에서 형질주입하는 추가적인 단계를 포함할 것이다. 또 다른 단계에서, 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 상기 면역 컴피턴트 세포들을 활성화시키기에 충분한 시간동안 상기 복수의 형질주입된 항원-제시 세포들과 함께 공-배양된다.
따라서, 본 발명의 주제의 또다른 양상에서, 본 발명자는 또한 복수의 형질주입된 항원-제시 세포들 및 복수의 면역 컴피턴트 세포들과 함께 수혈하기 위한 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다. 상이한 관점에서, 본 발명자는 또한 환자의 종양의 치료를 위해 약학적 조성물을 제형하기 위한 복수의 면역 컴피턴트 세포들 및 형질주입된 항원-제시 세포들의 용도를 고려한다. 항원-제시 세포들은 일반적으로 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프로 또는 상기 환자의 상기 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터로 이전에 형질주입되는 세포들이고, 여기서 상기 면역 컴피턴트 세포들은 상기 종양을 가지는 상기 환자로부터 이전에 획득된다.
본 발명의 주제를 제한하는 것은 아니지만, 면역 컴피턴트 세포들은 상기 환자의 전혈의 백혈구 파편이거나 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 적합한 면역 컴피턴트 세포들은 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, NK 세포, 마이크로파지 (macrophage), 단핵구(monocyte), 및 B-세포 중 적어도 하나에서 부양되는 백혈구의 집합일 수 있다. 유사하게는, 상기 항원 세포들은 환자로부터 유래되고, 그리고 가장 바람직하게는 수지상 세포들인 것이 고려된다.
몇몇의 실시예들에서, 상기 항원-제시 세포들은 상기 환자의 상기 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프로 형질주입되고, 반면에 다른 실시예들에서, 상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 종양-관련 에피토프들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질주입된다. 바람직하게는, 상기 종양-관련 에피토프들은 종양 네오에피토프, 종양-특이적 항원, 및/또는 종양 관련 항원을 포함할 것이고, 그리고 원하는 경우 HLA-매칭 종양-관련 에피토프이다. 또한, 상기 종양-관련 에피토프는 MHC-I 및/또는 MHC-II 발현을 위한 종양-관련 에피토프를 타겟팅하는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 더 포함할 수 있다. 물론, 상기 항원-제시 세포들은 상기 환자의 상기 종양의 적어도 두개의 별개인 종양-관련 에피토프들로 형질주입될 수 있거나 또는 상기 핵산은 상기 환자의 상기 종양의 적어도 두개의 별개인 종양 관련 에피토프들을 인코딩한다는 것이 이해되어야 한다.
면역 반응을 향상시키기 위해, 상기 항원-제시 세포들은 하나 이상의 면역 자극 분자들로 추가적으로 형질주입되거나 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 면역 자극 세포, 특히 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)(예를 들어, B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A)를 추가적으로 인코딩한다. 마찬가지로, 상기 항원-제시 세포들은 또한 하나 이상의 체크포인트 억제제로 형질주입되거나 노출될 수 있고, 또는 상기 핵산은 하나 이상의 체크포인트 억제제(예를 들어, CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD 279)에 바인딩되는 폴리펩타이드(polypeptide))들을 추가적으로 인코딩할 수 있다.
추가적으로 고려되는 양상들에서, 상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스성 벡터(adenoviral vector)이고, 선택적으로 결실 또는 비-기능성 E2b 유전자를 가진다. 상이한 관점으로 보면, 상기 바이러스성 벡터는 대응하는 야생-형(wild-type) 바이러스성 벡터에 비해 감소된 면역원성(immunogenicity)을 가진다.
원하는 경우, 상기 면역 컴피턴트 세포들은 또한 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-15 과작동제(IL-15 SUPERAGONIST))의 존재 하에서 상기 혈질주입된 항원-제시 세포들에 노출될 수 있다. 또한, 면역 체크포인트 억제제는 복수의 면역 컴피턴트 세포들을 투여하는 단계 이전에 상기 환자에게 투여될 수 있고, 및/또는 상기 면역 컴피턴트 세포들은 상기 형질주입된 항원-제시 세포들과 함께 투여되는 것이 고려된다. 원하는 경우, 환자의 상기 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프를 인코딩하는 상기 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터가 상기 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양상들 및 장점들이 바람직한 실시예들의 이하의 상세한 설명으로부터 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 주제는 면역요법을 위한 다양한 조성물들, 방법들, 및 용도들에 관한 것으로, 특히 종양을 가지는 환자의 하나 이상의 유형들의 면역 컴피턴트 세포들이 상기 환자의 상기 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프들로 이전에 형질주입되거나 또는 노출되는, 또는 상기 환자의 상기 종양의 하나 이상의 종양 관련 또는 종양 특이적 에피토프들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 이전에 형질주입되는 수지상 세포들에 생체 외에서 노출되는 세포-기반 조성물들, 방법들 및 용도들에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 상기 면역 반응은 특정 종양(및, 심지어 종양 서브집단(tumor sub-population))에 특이적으로 지향될 수 있고, 상기 면역 컴피턴트 세포들은 거부반응을 일으키지 않을 것이다. 또한, 상기 수지상 세포들의 활성화 및 상기 수지상 세포들에 의한 면역 컴피턴트 세포들의 명령은 면역 자극 세포들, 특히 IL-15 (또는 IL-15 과작동제)에 대한 세포 컴파운드의 노출에 의해 더 향상될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 주제의 고려되는 일 양상에서, 결장암(colon cancer)으로 진단된 환자의 면역 컴피턴트 세포들이 분리되며, 이는 일반적으로 전혈의 백혈구 파편의 형태로 분리된다(예를 들어, 버피 코트(buffy coat)로 분리됨). 이러한 파편들, 또는 다른 환자의 샘플(예를 들어, 피부 또는 비장(spleen))로부터, 수지상 세포들이 분리된다. 대안적으로, 수지상 세포들은 또한 특정 성장 인자(예를 들어, GM-CSF)에 반응하여 전구 세포(progenitor cell)들로부터 유래될 수 있다. 분리의 유형에 관계없이, 수지상 세포들은 환자의 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프들로 또는 환자의 종양의 하나 이상의 종양-관련 에피토프들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터(바람직하게는 바이러스성 벡터)로 형질주입되는 것이 고려된다. 형질주입은 바람직하게는 공지된 형질주입 제제 또는 기계적인 유도되는 형질주입을 사용하여 수행된다. 보다 바람직하게는, 이하에서 보다 상세하게 더 논의되는 바와 같이, 종양-관련 에피토프들은 환자의 종양에 특이적인 네오에피토프들을 포함하거나 이들일 수 있다. 결과적으로, 이렇게 형질주입되는 수지상 세포들은 MHC-I/MHC-II 시스템을 통해 종양 에피토프들을 제시한다.
유리하게는, 종양 에피토프들을 제시하는 수지상 세포들은, 바람직하게는 이는 면역 자극 사이토카인 (예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-15 과작동제(superagonist))의 존재 하에서 이전에 분리된 면역 컴피턴트 세포들(또는 백혈구 파편)과 생체 외 접촉된다. 수지상 세포들에 의한 종양-관련 에피토프들의 제시의 결과로, 면역 컴피턴트 세포들은 활성화될 것이고 따라서 이렇게 활성화되는 면역 컴피턴트 세포들은 환자에게, 일반적으로 수지상 세포들과 함께 수혈될 수 있다. 그러나, 활성화되는 면역 컴피턴트 세포들로부터 다른 컴포넌트들을 제거하는 것이 필요하다고 여겨지지 않으며, 그리고 공-배양되는 세포들은 환자에게 직접적으로 투여될 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 또한, 이렇게 획득되는 면역 치료 조성물은 환자로부터 유래될 수 있고, 거부반응이 관찰되지 않아야 한다는 점이 이해되어야 한다. 또한, 면역 자극 사이토카인들로의 자극은 생체 외 단계로 제한되고 따라서 이는 전신 투여의 다른 바람직하지않은 부작용을 일으키지 않아야 한다. 환자의 면역 반응을 추가적으로 보강하기 위해, 환자는 활성화되는 면역 컴피턴트 세포들의 투여 전 및/또는 동안 하나 이상의 체크포인트 억제제(예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab))으로 치료를 받는 것이 고려된다.
물론, 본 명세서에서 나타나는 방법들 및 조성물들은 결장암으로 진단된 환자들로 제한되지 않으며, 실제로 다른 적합한 항원에 대해 불완전하거나, 억제되거나, 또는 부족한 면역 반응에 관련되는 모든 조건들이 고려된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 고려되는 다른 질병들은 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간암(liver cancer), 위암(gastric cancer), 폐암(lung cancer) 교모세포종(glioblastoma), 흑색종(melanoma), 림프종(lymphoma)을 포함하여 다양한 다른 고형 및 혈액-매개 암(solid and blood borne cancer)들을 포함한다.
마찬가지로, 고려되는 암으로 진단된 환자의 면역 컴피턴트 세포들은 환자의 전혈의 백혈구 파편/버피 코트로 제한되지 않고, 하나 이상의 CD4+ T-세포들, CD8+ T-세포들, NK 세포들, 마이크로파지(macrophage)들, 단핵구(monocyte)들, 및 B-세포들에서 부양되는 파편들을 포함할 수 있다. 물론, 이러한 세포들은 비교적 고순도(예를 들어, 적어도 80%, 보다 일반적으로 적어도 90%, 보다 일반적으로 적어도 95%)로 분리될 수 있다. 그러나, 덜 바람직한 양상들에서, 면역 컴피턴트 세포들은 또한 전혈 샘플로서 제공될 수 있다. 또한, 면역 컴피턴트 세포들은 HLA-매칭되는(HLA-matched) 비-환자인 기증자로부터 제공될 수 있고, 여기서 HLA-매치는 마이크로비드 어레이(microbeads arrays)들 상의 PCR-SSO 분석과 같은 표준 방법들에 의한 하나 이상(일반적으로 전체)의 HLA-A, B, C, DRB1/B3/b4, 및 DQB1 유전좌위(locus)들에 대한 적어도 4자리 매치(4 digit match)이다. 마찬가지로, 면역 컴피턴트 세포들은 또한 감소된 항원성(antigenicity)을 가지도록 유전적으로 변형되고 그리고 동종일 수 있다.
보다 일반적으로, 면역 컴피턴트 세포들의 개수는 약 106 내지 1010개의 세포들의 범위, 또는 106 내지 108개의 세포들의 범위, 또는 107 내지 109개의 세포들의 범위, 또는 108 내지 1010개의 세포들의 범위, 또는 더 많을 수 있다. 면역 컴피턴트 세포들의 종류에 따라, 면역 컴피턴트 세포들은 특정 비율(예를 들어, NK 세포들에 대해 약 10:1 비율인 CD4+ T-세포들 및 CD8+ T-세포)을 이루도록 조합되는, 개수로 늘어나도록 배양되거나, 특정 종류의 면역 컴피턴트 세포들이 특정 방식의 항원 제시를 조정(예를 들어 항원 제시가 MHC-II을 향하는 경우 부양되는 CD8+, 또는 항원 제시가 MHC-II을 향하는 경우 부양되는 CD4+)하도록 부양될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 환자의 면역 컴피턴트 세포들은 CD4+ T-세포들, CD8+ T-세포들, NK 세포들, 단핵구들, 마이크로파지들, 및 B-세포들 중 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 전체를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
선택되는 면역 컴피턴트 세포들, 및 특히 소진되는(exhausted) T-세포들은, 일반적으로 T-세포 소진의 표면 마커들에 기초하여 FACS 분리 또는 자성 비드 분리를 이용하여 면역 컴피턴트 세포들로부터 제거되는 것이 또한 추가적으로 고려된다. 예를 들어, 적합한 소진 마커들은 CD160, 2B4, LAG3, PD1, TIM3 등을 포함한다. 이러한 고갈(depletion)은 수지상 세포들에 의해 제시되는 항원들에 대하여 활성화된 T-세포들의 전체 집단을 유리하게 증가시킬 수 있다. 또한, 소진되는 T-세포들은, 예를 들어, PD-L1, TIM3, LAG3, 또는 CTLA4에 대한 항체 또는 IL21과 같은 다양한 컴파운드들을 사용하여 수지상 또는 다른 항원 제시 세포들과 접촉하기 전에 활성화될 수도 있다.
마찬가지로, 면역 컴피턴트 세포들은 수지상 또는 다른 항원 제시 세포들과 접촉하기 전에 하나 이상의 면역 자극 컴파운드 또는 조성물들에 노출될 수 있고, 그리고 적합한 면역 자극 컴파운드 또는 조성물들은 다양한 사이토카인들 및 케모카인(chemokine)들을 포함하고, 특히 IL-1, IL-2, IL-15, 및 IL-21을 포함한다. 예를 들어, 면역 컴피턴트 세포들은 IL-2 또는 IL-15(예를 들어, T-세포들이 면역 컴피턴트들의 부분인 경우), 또는 TNF-알파(예를 들어, 마이크로파지들이 면역 컴피턴트 세포들의 부분인 경우) 또는 인터페론-감마(Interferon-gamma)(예를 들어, NK 세포들이 면역 컴피턴트 세포들의 부분인 경우)에 노출될 수 있고, 이는 면역 컴피턴트 세포들의 활성화를 더 자극하기 위함이다. 특히, 이러한 인 비트로에서의 면역 자극은 생체 내에서 적어도 문제가 되는 조건(예를 들어, IL-2가 활용되는 경우 혈관 누수 증후군(vascular leak syndrome)으로 인한)에서 수행될 수 있다. 원하는 경우, 면역 자극 컴파운드 또는 조성물들은 수지상 또는 다른 항원 제시 세포들과 면역 컴피턴트 세포들을 접촉시키기 전에 제거될 수 있다.
유사하게는, 적합한 항원-제시 세포들은 수지상 세포들로 제한될 필요는 없고, 수많은 대안적인 전문적 및 비-전문적 항원-제시 세포들(및 모든 이들의 혼합물들)이 또한 적합하다고 여겨지는 것이 이해될 것이다. 따라서, 적합한 항원-제시 세포들은 수지상 세포들, 마이크로파지들, B-세포들, 등을 포함한다. 그러나, 수지상 세포들이 일반적으로 바람직하다는 것이 주목된다. 가장 일반적으로, 수지상 세포들은 동일한 환자로부터, 예를 들어 혈액, 비장, 또는 피부로부터 분리될 수 있다(예를 들어, Curr Protoc Immunol. 2001 May; Chapter 7: Unit 7.32, or J Immunol Methods. 2001 Jun 1;252(1-2):93-104 참조). 그러나, 대안적인 양상들에서, 수지상 세포들은 또한 적합한 인자(예를 들어, GM-CSF, 알파 TNF, 또는 다양한 다른 사이토카인들)들을 사용하여 환자의 전구 세포들로부터 유래될 수 있고, 이는 본 기술분야에서 널리 공지되어 있다(예를 들어, Front Microbiol. 2013; 4: 292 참조).
항원-제시 세포들을 획득하는 방식에 관계없이, 이러한 항원-제시 세포들은 면역 컴피턴트 세포들(이는 면역 자극 컴파운드들 또는 조성물들에 노출되었거나 아닐 수 있음)과 항원-제시 세포들을 접촉시키기 전에 자극되거나 아니면 활성화될 수 있다. 이러한 자극 또는 활성화는 항원 제시 세포들이 하나 이상의 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)들의 증가된 발현(미자극 또는 비-활성화된 세포들에 비해)을 가지는 것이 바람직한 경우 특히 유리하다. 예를 들어, 항원-제시 세포들은 TLR 리간드들(예를 들어, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7/8, TLR9, TLR13, 등), NLR 리간드들(예를 들어, NOD1, NOD2, 등), RLR 리간드들(예를 들어, 5′ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 등.), CLR 리간드들(예를 들어, HKCA, 리케난(lichenan), 베타 글루칸 펩타이드(beta glucan peptide), 등), 및/또는 STING 리간드들(예를 들어, 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, c-di-AMP, 등과 같은 고리형 디뉴클레오타이드(cyclic dinucleotide)들)들과 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor)들의 하나 이상의 리간드들에 노출될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 항원-제시 세포들의 인 비트로에서의 자극은 자극이 역효과 또는 자가면역 반응들을 트리거링하거나, 또는 환자에게 유독할 수 있는 조건들 하에서 수행될 수 있는 경우 특히 유리하다는 것이 특히 이해되어야 한다.
가장 일반적으로, 항원 제시 세포들의 개수는 약 106 내지 1010개의 세포들의 범위, 또는 106 내지 108개의 세포들의 범위, 또는 107 내지 109개의 세포들의 범위, 또는 108 내지 1010개의 세포들의 범위, 또는 더 많을 수 있다. 또한, 항원 제시 세포들의 종류에 따라, 항원 제시 세포들은 특정 비율(예를 들어, 마이크로파지들에 대해 약 10:1 비율인 수지상 세포들)을 이루도록 조합되는, 개수로 늘어나도록 배양되거나, 특정 종류의 항원 제시 세포들이 특정 방식의 종양-관련 에피토프(예를 들어 환자 및 종양 특이적 네오에피토프, 암 관련 항원, 또는 암 특이적 항원)으로의 형질주입 또는 노출을 조정하도록 부양될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 환자의 항원 제시 세포들은 수지상 세포들, 마이크로파지들, 및 B-세포들 중 하나, 또는 둘, 또는 전체를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 물론, 수지상 세포들은 또한 특이적 기원(origin)(예를 들어, 피부, 말초혈액(peripheral blood), 비장, 등)일 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
면역 컴피턴트 세포들에 대한 항원 제시 세포들(이전에 종양 관련 항원을 인코딩하는 핵산으로 형질주입되거나 또는 종양 관련 항원에 노출된)의 적합한 비율들에 관하여, 적합한 비율들은 일반적으로 104:1 (항원 제시 세포 대 면역 컴피턴트 세포들) 내지 1:104 (항원 제시 세포 대 면역 컴피턴트 세포들) 사이, 또는 103:1 내지 1:103 사이, 또는 102:1 내지 1:102 사이, 또는 10:1 내지 1:10 사이일 수 있다. 조합되는 경우, 상기 세포들은 이하에서 보다 상세하게 더 논의되는 바와 같이 면역 자극 컴파운드들 및 조성물들에 추가적으로 노출될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
고려되는 종양 관련 에피토프들에 관하여, 종양 관련 에피토프들은 종양 및 환자 특이적 네오에피토프들이거나, 이하에서 보다 상세하게 더 논의되는 바와 같이 암 관련 항원들(예를 들어, CEA, MUC1, 등), 및/또는 암 특이적 항원들(예를 들어, HER2, PSMA, 등)일 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 면역 컴피턴트 세포들의 특이성은 네오에피토프들을 이용하여 특이적 종양 또는 하위-클론 집단(sub-clonal population)에 대해 미세 조정될 수 있거나, 또는 면역 컴피턴트 세포들이 종양의 광범위한 세포의 집단에 대해 훈련될 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 종양 관련 에피토프들은 일반적으로 더 큰 폴리펩타이드의 일부이거나 또는 가능한 적합한 비-면역원성 산재 스페이서(non-immunogenic interspersed spacer)들로 사슬연결되는(concatenated), 7 내지 50개 사이의 아미노산들의 길이를 가지는 에피토프들일 수 있다. 예를 들어, 상기 에피토프가 MHC-I를 통한 제시를 목적으로 하는 경우, 상기 에피토프의 일반적인 길이는 아미노산 7 내지 15개 사이일 수 있다.
보다 바람직하게는, 종양 관련 에피토프들은 항원 제시 세포 내로 형질주입되는 RNA 또는 발현 벡터 상에 인코딩될 것이다. 특히 바람직한 양상들에서, 발현 벡터는 바이러스성 벡터, 그리고 가장 바람직하게는 아데노바이러스성(adenoviral) 벡터이다. RNA가 세포를 형질주입하는데 사용되는 경우, 상기 RNA는 모노-시스트론성(mono-cistronic), 바이-시스트론성(bi-cistronic), 또는 폴리-시스트론성(poly-cistronic)일 수 있다. 이러한 경우, 발현 벡터 또는 RNA는 공지된 형질주입 방법들을 사용하여 효모 또는 박테리아로 전달될 수 있다. 그러나, 적합한 종양 관련 에피토프들은 재조합 단백질들, 또는 박테리아성 백신, 또는 효모 백신 제제들로 항원 제시 세포에 부가될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 세포질 내로 종양 관련 에피토프들을 밀어넣는(force) 형질주입(예를 들어, 소노포레이션(sonoporation), 리포펙션(lipofection), 탄도 전달(ballistic transfer), 등)을 통해 또는 세포 표면과의 접촉을 통해 종양 관련 에피토피들이 항원 제시 세포들과 직접적으로 접촉할 수 있다. 따라서, 항원-제시 세포들 및 종양-관련 에피토프들과 함께 사용되는 용어 “형질주입되는(transfected)”은 항원-제시 세포들 내로 종양-관련 에피토프들의 수송(passage)을 허용하거나 강요하기 위한 항원-제시 세포들의 조작 (예를 들어, 소노포레이션, 압력 매개 형질주입(pressure mediated transfection), 화학적 형질주입(chemical transfection)) 및 종양-관련 에피토프들로 하여금 항원-제시 세포 내로 흡수되도록 허용하는 조건들 하에서 종양-관련 에피토프들로 항원-제시 세포들의 노출을 포함하는 것을 의미한다.
종양 관련 에피토프들의 특이적 서열에 관해, 암 연관된(예를 들어, CEA, MUC-1, 등), 암의 종류에 특이적(예를 들어, PSA, HER2, 등), 및/또는 환자 및 종양-특이적인 임의의 에피토프들이 본 명세서에서의 용도에 적합하고, 특히 바람직한 서열들은 환자- 및 종양-특이적 네이에피토프들을 포함한다. 상기 에피토프들은 건강한 대조군(예를 들어, 동일한 환자의 비-질병 조직으로부터)를 넘어(above) 발현되고, 그리고 상기 에피토프들은 환자의 MHC-I 및/또는 MHC-II 복합체의 개별적인 바인딩 모티프(motif)들에 바인딩하는 이러한 예측되는 것들을 포함한다.
예를 들어, 네오에피토프들은 종양 생검(또는 림프 생검 또는 전이 부위의 생검) 및 매칭되는 정상 조직(즉, 동일한 환자로부터의 비-질병 조직)의 전체 게놈 분석에 의해 제 1 단계에서 환자 종양으로부터 식별될 수 있고, 이는 바람직하게는 동일한 환자의 종양 및 매칭되는 정상 조직으로부터의 오믹스 정보(omics information)의 위치 가이드 동기화 정렬(location guided synchronous alignment)을 통해 이루어진다. 이렇게 식별되는 네오에피토프들은 네오에피토프들의 항원 제시의 확률을 증가시키도록 환자의 HLA 유형에 매칭하기 위해 추가적으로 필터링될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이하에서 더 논의되는 바와 같이, 이러한 매칭은 인 실리코(in silico)에서 이루어질 수 있다. 가장 일반적으로, 환자-특이적 에피토프들은 환자에게 고유하나(unique), 적어도 몇몇의 케이스들에서 종양 유형-특이적 네오에피토프들(예를 들어, Her-2, PSA, 브라큐리(brachyury)) 또는 암-관련 네오에피토프들(예를 들어, CEA, MUC-1, CYPB1)을 포함할 수도 있다. 따라서, 아데노바이러스성 핵산 구조체(adenoviral nucleic acid construct)(또는 다른 전달을 위한 핵산 구조체)이 적어도 하나의 환자-특이적 네오에피토프를 인코딩하거나, 그리고 보다 일반적으로 적어도 두개 또는 세개 이상의 네오에피토프들 및/또는 종양 유형-특이적 네오에피토프들 및/또는 암-관련 네오에피토프들을 인코딩하는 재조합 세그먼트들을 포함할 것이라는 것이 이해되어야 한다. 선택되는 네오에피토프들의 개수가 재조합 핵산들에 대한 바이러스 수용량(viral capacity)보다 크거나 또는 RNA에 대한 실질적인 제한들을 초과하는 경우, 다중 및 별개의 네오에피토프들은 다중 및 별개의 RNA 또는 재조합 바이러스들을 통해 전달될 수 있다.
하나 이상의 네오에피토프들을 식별하기 위해 환자로부터 오믹스 정보를 획득하는 단계에 관해, 오믹스 데이터는 표준 조직 프로세싱 프로토콜 및 시퀀싱 프로토콜들을 따라 환자 생검 샘플들로부터 획득되는 것이 고려된다. 본 발명의 주제를 제한하는 것은 아니지만, 상기 데이터는 환자 매칭 종양 데이터(예를 들어 종양 대 동일한 환자의 정상)이고, 그리고 데이터 포맷은 SAM, BAM, GAR, 또는 VCF 포맷인 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 비-매칭 또는 매칭 대 다른 참조(예를 이전 동일한 환자의 정상 또는 이전 동일 환자의 종양, 또는 호모 스테티쿠스(homo statisticus))는 또한 본 명세서의 용도에 적합한 것으로 여겨진다. 따라서, 오믹스 데이터는 '신선한(fresh)' 오믹스 데이터 또는 이전 프로시져로부터(또는 심지어 상이한 환자로부터) 획득되었던 오믹스 데이터일 수 있다.
참조 서열(예를 들어 매칭된 정상)의 성질에 관계없이, 참조 서열은 복수의 에피토프들을 연산하는데 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 가장 일반적으로, 에피토프들은 2 내지 50 개 사이의 아미노산들의 길이, 보다 일반적으로 5 내지 30개 사이의 아미노산들, 및 가장 일반적으로 9 내지 15개 사이의 아미노산들을 가지도록 연산되고, 이는 중앙에 위치하거나 또는 MHC에 그 바인딩을 향상시키는 방식으로 위치하는 변경된 아미노산을 이용한다. 예를 들어, 에피토프가 MHC-I 복합체에 의해 제시되는 경우, 일반적인 에피토프의 길이는 아미노산들의 약 8 내지 11개일 것이고, 반면에 MHC-II를 통한 제시를 위한 일반적인 에피토프의 길이는 약 13 내지 17개의 아미노산들의 길이를 가질 것이다. 이렇게 연산되는 에피토프들 및 네오에피토프들은 이하에서 보다 상세하게 더 기술되는 바와 같이 환자-특이적 HLA-유형(MHC-I 및 MHC-II)에 대한 이들의 친화성(affinity)에 대해 인 실리코에서 분석된다. 이러한 네오에피토프들에 대한 HLA 친화성의 지식(knowledge)은 적어도 두개의 항목의 중요한 정보를 제공한다는 것이 인식되어야 한다: (a) 면역요법에 적합하지 않는 에피토프들의 결실이 인식되고 그리고 면역요법이 조정되어 결실된 에피토프들을 타겟팅하지 않음, 및 (b) 면역요법에 적합한 네오에피토프의 생성이 인식되고 그리고 면역요법이 그에 따라 조정되어 상기 네오에피토프를 타겟팅함.
일반적으로 네오에피토프에 관해, 네오에피토프들은 고유하고 종양 특이적인 항원들을 생성하는 종양 세포들에서 랜덤한 변이들을 특징으로 할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 고-스루풋 게놈 시퀀싱(high-throughput genome sequencing)은 분석이 동일한 환자의 매칭된 정상 조직을 고려하는 경우 환자 특이적 네오에피토프들의 신속하고 특이적인 식별을 허용할 수 있다. 특히, 본 출원인의 공동계류 중인 국제출원 WO 2016/164833에 개시되는 바와 같이, 매우 적은 네오에피토프들이 면역 반응을 이끌어 내는데 필요한 것으로 나타나고 그리고 결과적으로 암 면역요법들의 생산(manufacture)를 위한 유일한(unique) 기회를 제공한다. 또한, 이하에서 더 기술되는 바와 같이, 네오에피토프의 선택은 또한 네오에피토프의 하위-세포내 위치(sub-cellular location) 및 발현 레벨의 조사에 의해 더욱 유도된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 네오에피토프가 매칭되는 정상에 비해 약하게 발현되거나(예를 들어, 매칭되는 정상 발현에 20% 이하) 또는 발현되지 않는 경우, 네오에피토프는 적합한 에피토프들의 선택으로부터 제거될 수 있다. 마찬가지로, 네오에피토프들이 핵 단백질로 식별되는 경우, 네오에피토프는 적합한 네오에피토프들의 선택으로부터 제거될 수 있다. 또한 네오에피토프들에 대한 긍정적인 선택은 네오에피토프의 부분적인 세포외 또는 막 횡단 제시(presence) 및/또는 매칭되는 정상에 비해 적어도 50%의 발현 레벨을 요구할 수 있다. 발현 레벨들은 본 기술분야에 공지된 수많은 방식들로 측정될 수 있고, 적합한 방식들은 qPCR, qLCR, 및 다른 정량적 하이브리드 기술(quantitative hybridization technique)들을 포함한다.
게놈 분석은 임의의 개수의 분석 방법들에 의해 수행될 수 있고, 그러나 특히 바람직한 분석 방법들은 종양 및 매칭되는 정상 샘플의 양쪽 모두의 엑솜 시퀀싱 및 WGS(전체 게놈 시퀀싱)을 포함한다. 마찬가지로, 시퀀스 데이터의 연산 방식은 수많은 방식들로 수행될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 방법들로, 분석은 예를 들어, BAM 파일들 및 BAM 서버들을 이용하여 US 2012/0059670A1 및 US 2012/0066001A1에 개시되는 바와 같이 종양 및 정상 샘플들의 위치-가이드 동기화 정렬에 의해 인 실리코에서 수행된다.
서버들, 인터페이스들, 시스템들, 데이터베이스들, 에이전트들, 피어들, 엔진들, 컨트롤러들 또는 다른 유형의 개별적으로 또는 집합적으로 동작하는 컴퓨팅 디바이스들을 포함하여, 임의의 적합한 컴퓨팅 디바이스들의 조합들을 포함하도록 컴퓨터를 조작하는 임의의 언어가 판독되어야 한다는 것이 주목되어야 한다. 누구든 컴퓨팅 디바이스들이 유형의, 비-일시적인 컴퓨터 판독가능 저장 매체(예를 들어, 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, RAM, 플래쉬, 롬, 등) 상에 저장되는 소프트웨어 명령들을 실행하도록 구성되는 프로세서를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 소프트웨어 명령들은 바람직하게는 개시되는 장치에 대해 이하에 논의되는 역할들, 책임들, 또는 다른 기능을 제공하도록 컴퓨팅 디바이스를 구성한다. 또한, 개시되는 기술들은 프로세서로 하여금 컴퓨터-기반 알고리즘들, 프로세스들, 방법들, 또는 다른 명령들의 실행과 관련되는 개시되는 단계들을 실행하도록 하는 소프트웨어 명령들을 저장하는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품으로 구현될 수 있다. 특히 바람직한 실시예들에서, 다양한 서버들, 시스템들, 데이터베이스들, 또는 인터페이스들은 가능한 HTTP, HTTPS, AES, 공개-개인 키 교환들, 웹 서비스 API들, 공지된 금융 거래 프로토콜들, 또는 다른 전자 정보 교환 방법들에 기초하여, 표준화된 프로토콜들 또는 알고리즘들을 이용하여 데이터를 교환할 수 있다. 디바이스들 간의 데이터 교환들은 패킷-교환 네트워크, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 다른 유형의 패킷 교환 네트워크: 회로 스위칭 네트워크; 셀 스위칭 네트워크; 또는 다른 유형의 네트워크를 통해 실행될 수 있다.
발현 레벨의 식별은 본 기술분야에 공지된 모든 방식들로 수행될 수 있고, 그리고 바람직한 방법들은 정량적 RNA(hnRNA 또는 mRNA) 분석 및/또는 정량적 프로테오믹스(proteomics) 분석을 포함한다. 가장 일반적으로, 네오에피토프들 및 에피토프들의 내포(inclusion)에 대한 스레스홀드 레벨은 매칭되는 정상에 비교하여 적어도 20%, 그리고 가장 일반적으로 적어도 50%로, 따라서 (네오)에피토프가 면역 시스템에서 적어도 잠재적으로 '가시적인(visible)'인 것을 보장한다. 따라서, 오믹스 분석은 또한 유전자 발현(전사체 분석(transcriptomic analysis)의 분석을 포함하여 변이를 가지는 유전자에 대한 발현의 레벨을 식별하는데 도움이 되는 것이 바람직하다. 상이한 관점으로 볼 때, 전사체 분석은 종양 및 환자 특이적 변이를 가지는 유전자들을 식별하고 정량화하는데 적합할 수 있다(단독으로 또는 게놈 분석과 함께). 본 기술분야에 공지된 수많은 방법의 전사체 분석이 있고, 모든 공지된 방법들은 본 명세서에서의 용도에 적합한 것으로 여겨진다. 상기를 고려하면, 따라서 종양 및 매칭되는 정상 조직으로부터의 RNA 및 DNA를 포함하는 환자 샘플은 특이적 변이들을 식별하고 그리고 이러한 변이들을 정량화하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 제시되는 교시와 함께 사용에 적합한 추가적인 에피토프들, 네오에피토프들, 방법들, 및 시스템들은 국제 출원 WO 2016/172722에 개시된다.
결과적으로, 환자 및 암 특이적 네오에피토프들은 환자 및 종양 유형에 고유한 잠재적인 에피토프들을 궁극적으로 예측하는 배타적인 인 실리코에서의 환경에서 식별될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 이렇게 인식되고 그리고 선택되는 네오에피토프들은 식별되는 환자 HLA-유형에 대해 인 실리코에서 추가적으로 필터링된다. 이러한 HLA-매칭은 특이적 항원 제시 세포들의 MHC-II 복합체 및 유핵 세포(nucleated cells)들의 MHC-I 복합체에 대한 네오에피토프들의 강한 바인딩을 보장하는 것으로 생각된다. 두 항원 제시 시스템들을 타겟팅하는 것은 특히 면역 시스템의 세포성 및 체액성 분지(branch) 양쪽 모두에 관련되는 치료학적으로 효과적이고 그리고 내구성있는 면역 반응성을 생성하는 것으로 생각된다.
MHC-I 및 MHC-II 양쪽 모두에 대한 HLA 결정은 본 기술분야에 널리 공지된 ?-케미스트리(wet-chemistry)에서의 다양한 방법들을 이용하여 수행될 수 있고, 이러한 모든 방법들이 본 명세서에서의 용도에 적합한 거승로 여겨진다. 그러나, 특히 바람직한 방법들에서, HLA-유형은 이하에서 보다 상세하게 나타나는 바와 같이 대부분 또는 모든 공지된 및/또는 통상적인 HLA-유형들을 포함하는 참조 서열을 이용하여 인 실리코에서 오믹스 데이터로부터 예측될 수도 있다. 즉, 환자의 HLA-유형이 확인되고(인 실리코에서 또는 ? 케미스트리를 사용하여), 그리고 HLA-유형에 대한 구조적 솔루션이 데이터베이스로부터 획득되거나 또는 연산되며, 이는 HLA 구조적 솔루션에 대한 네오에피토프의 바인딩 친화성을 결정하는데 인 실리코에서 도킹 모델(docking model)로 사용된다. 바인딩 친화성들의 결정을 위한 적합한 시스템들은 NetMHC 플랫폼(예를 들어, Nucleic Acids Res. 2008 Jul 1; 36(Web Server issue): W509-W512. 참조), HLAMatchmaker (http://www. epitopes.net/downloads.html), 및 IEDB 분석 리소스 (http://tools.immuneepitope.org/ mhcii/)를 포함한다. 이전에 결정된 HLA-유형에 대해 고 친화성을 가지는 네오에피토프들(예를 들어, MHC-I에 대해 100 nM 미만, 또는 75 nM 미만, 또는 50 nM; MHC-II에 대해 500 nM, 300 nM, 100 nM)이 선택된다. 가장 높은 친화성의 연산에 있어서, 네오에피토프들에 대한 변형들은 HLA-유형에 대해 바이러스성으로 발현되는 네오에피토프의 바인딩을 더 증가시키기 위해 에피토프에 대해 N- 및/또는 C-말단 변형을 부가함으로서 구현될 수 있다. 따라서, 네오에피토프들은 특정 HLA-유형에 더욱 매칭하도록 더 변형되거나 또는 식별됨으로써 고유(native)해질 수 있다.
환자의 HLA-유형의 인 실리코에서의 예측에 대해, 오믹스 데이터는 엣지들이 K-mer들이 발견되는 입력 소스(예를 들어, 참조, 정상 샘플, 및/또는 종양 샘플, 상이한 시점 및 나이로 채취된 샘플들, 상이한 환자 및 대상 그룹들로부터의 샘플들)를 식별하는 “컬러들(colors)”을 가지는 k-mer들(k=15)이고, 각각의 엣지는 인접한 엣지들에 연결되는 색칠된 드 브루이진 그래프(De Bruijin graph)를 분석될 수 있다. 예시적인 시스템들 및 방법들은 국제 출원 WO 2017/035392에서 기술된다.
따라서, 연산 분석은 HLA에 네오에피토프들을 도킹하고 그리고 최적의 바인더들을 결정함(예를 들어, 최저 KD(예를 들어 50nm 미만))으로서 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 환자 및 종양에 진정(genuine)인 특이적 네오에피토프들을 식별할 뿐만 아니라 세포 상에 발현될 가능성이 가장 높고 이에 치료 효과로서 면역 반응을 가장 잘 이끌어 낼 이러한 네오에피토프들을 식별한다. 물론, 이와 같이 식별되는 HLA-매칭 네오에피토프들은 네오에피토프(들)을 인코딩하는 RNA의 생성 또는 바이러스 내로 페이로드(payload)로서 에피토프를 인코딩하는 핵산의 내포 이전에 인 비트로에서 생화학적으로 검증될 수 있다.
가장 바람직하게는, 재조합 핵산(들)은 에피토프들이 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시 경로로 유도되는 배열에서의 암 관련 또는 암- 특이적 에피토프들, 또는 환자-특이적 네오에피토프들을 인코딩한다. 의도되는 MHC-시스템에 대해 이렇게 식별되고 발현되는 네오에피토프들을 라우팅하는 것과 관련하여, MHC-I 제시 펩타이드들은 소포체 세망(endoplasmatic reticulum)을 통한 전달 및 프로테아좀 프로세싱을 통해 세포질로부터 발생할 것이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, MHC-I 제시를 위한 에피토프들의 발현(expression)은 이하에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 일반적으로 세포질로 유도된다. 또한, MHC-II 제시 펩타이드들은 세포막으로의 전달 이전에 산성 프로테아제(acidic protease)(예를 들어, 레구메인(legumain), 카텝신 L(cathepsin L) 및 카텝신 S(cathepsin S))들에 의한 처리 및 분해(degradation)를 통해 엔도솜 및 리소좀 구역에서 일반적으로 발생할 것이다. 따라서, MHC-II 제시를 위한 에피토프들의 발현은 이하에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 엔도좀 및 리소좀 구역으로 유도될 것이다.
가장 바람직한 양상들에서, 신호 펩타이드들은 엔도좀 및 리소좀 구역으로의 수송(trafficking)을 위해, 또는 세포질 공간에서의 잔류(retention)를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드가 엔도좀 및 리소좀 구역으로 방출되는 경우 타겟팅 전서열(presequence)들 및 내부 타겟팅 펩타이드들이 활용될 수 있다. 타게팅 펩타이드들의 전서열들은 바람직하게는 N-말단에 부가되고 그리고 6 내지 136개의 사이의 염기성 및 소수성 아미노산들을 포함한다. 퍼옥시좀(peroxisomal) 타겟팅의 경우, 타겟팅 서열은 C-말단에 있을 수 있다. 다른 신호(예를 들어, 신호 패치(signal patch)들)이 사용되어 펩타이드 서열에서 분리되고 그리고 적절한 펩타이드 폴딩시 기능을 수행할 수 있는 서열 엘리먼트들을 포함할 수 있다. 또한, 글리코실화(glycosylation)들 같은 단백질 변형들은 타겟팅을 유도할 수 있다. 다른 적합한 타겟팅 신호들 중에서, 본 발명자는 N-말단 근처에 위치하는 노나펩타이드(nonapeptide)인 퍼옥시좀 타겟팅 신호 2(PTS2), C-말단 트리펩타이드, 퍼옥시좀 타겟팅 신호 1(PTS 1)을 고려한다. 또한, 엔도좀들 및 리소좀들에 대한 단백질들의 분류는 단백질들의 세포질 도메인들 내의 신호들에 의해 매개될 수도 있으며, 일반적으로 짧은, 선형 서열들을 포함한다. 몇몇의 신호들은 티로신(tyrosine)-기반 분류 신호라고 지칭되며 NPXY 또는 YXXØ 일치 모티브(consensus motif)들을 만족한다. 디레우신(dileucine)-기반 신호들로 알려진 다른 신호들은 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 일치 모티프들에 적합하다. 이러한 모든 신호들은 세포질 막들의 표면과 관련된 주변의 단백질 외피(protein coat) 컴포넌트들에 의해 인식된다. YXXØ 및 [DE]XXXL[LI] 신호들은 어댑터 단백질(adaptor protein, AP) 복합체들 AP-1, AP-2, AP-3 및 AP-4에 의해 특징적인 미세 특이성으로 인식되는 반면, DXXLL 신호들은 GGA들로 알려진 다른 어댑터들의 계열에 의해 인식된다. 또한 공포성 단백질 분류(vacuolar protein sorting) 및 엔도좀 기능과 관련되어 있는 FYVE 도메인이 부가될 수도 있다. 또 다른 추가적인 양상들에서, 엔도좀 구역들은 인간 CD1 꼬리 서열들을 사용하여 타겟팅될 수도 있다 (예를 들어, Immunology, 122, 522-531 참조).
세포질 구역으로의 수송 및 잔류는 필수적으로 하나 이상의 특정 서열 엘리먼트들을 요구하지 않을 수 있다. 그러나, 적어도 몇몇 양상들에서, 막-고정(membrane-anchored) 단백질 또는 막-고정 단백질의 막 고정 도메인을 포함하는 N- 또는 C- 말단 세포질 잔류 신호들이 부가될 수 있다. 예를 들어, 막-고정 단백질은 SNAP-25, 신탁신(syntaxin), 시냅트레빈(synaptrevin), 시냅토태그민(synaptotagmin), 소포 관련 막 단백질들 (vesicle associated membrane proteins, VAMPs), 시냅스 소포 당단백질들 (synaptic vesicle glycoproteins, SV2), 고 친화성 콜린 수송체(high affinity choline transporter)들, 뉴렉신(Neurexin)들, 전압의존성 칼슘 채널(voltage-gated calcium channel)들, 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 및 노치(NOTCH)를 포함한다.
또 다른 고려되는 양상에서, 단백질 턴오버(protein turnover)는 네오에피토프 또는 재조합 항원의 N-말단 아미노산의 적절한 선택에 의해 추가적으로 촉진될 수 있으며, N-말단 아미노산은 불안정화 아미노산(destabilizing amino acid)인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 적합한 N-말단 아미노산들은 특히 Arg, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp 및 Tyr을 포함하고, 또한 어느 정도 Asn, Asp, Gln 및 Glu를 포함한다. 이러한 아미노산들은 MHC-II 제시 경로들 뿐만 아니라 MHC- I에 대해 타겟팅되는 펩타이드들에 부가될 수 있다. 결과적으로, 적합한 신호 서열들로 적합한 구역으로 펩타이드들을 어드레싱하고, 그리고 불안정화 N-말단 아미노산들로 펩타이드들을 선택적으로 변형시키는 것은 항원 캐스케이딩(cascading) 및 에피토프 확산을 증가시키는데 도움을 줄 것이다.
또 다른 고려되는 양상들에서, 다양한 네오에피토프들이 수많은 방식들로 배열될 수 있고, 그리고 전사 또는 번역 유닛은 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site)들을 더 포함할 수 있는, 일반적으로 짧은 링커(linker)(예를 들어, 4 내지 20개 사이의 아미노산들을 가지는 플랙서블 링커들)들에 의해 분리되는 다중 에피토프들의 연쇄적 배열(concatemeric arrangement)을 가질 수 있다. 이러한 연쇄물(concatemer)들은 1 내지 20 개의 네오에피토프들(일반적으로 바이러스를 통해 전달될 수 있는 재조합 핵산의 크기로 제한됨)을 가질 수 있고, 연쇄물들은 MHC-I 및 MHC-II에 대한 전달을 위해 동일하거나, 또는 상이할 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
따라서, 다양한 펩타이드들이 특정 세포 구역들로 라우팅될 수 있어 MHC-I 및/또는 MHC-II를 통해 우선적이거나(preferential) 또는 특이적이기도 한 제시를 달성한다는 것이 이해되어야 한다. 상이한 관점으로 볼 때, 종양 관련 항원들 및 네오에피토프들은 양쪽의 제시 경로를 통해, 또는 선택적으로 동시 또는 이후의 치료 회차에서 하나 또는 다른 경로로 통해 제시될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
결과적으로, (네오)항원들은 수지상 세포들(및 다른 항원 제시 세포들)의 MHC-I 및/또는 MHC-II 경로를 통해 제시되므로, 환자에 대한 활성화된 면역 컴피턴트 세포들의 투여 이후 면역 시스템을 통한 프로세싱은 환자의 CD8+ 및 CD4+ 세포 양쪽 모두에서 계속적 자극을 일으키고, 이는 훈련된 NK 세포들 및 대응하는 기억 세포들 뿐만 아니라 IgG1의 형성에 대해 훈련된 B-세포들의 형성을 유도할 것이다. 또한, IgG1 분자들은 또한 NK 세포들에 의한 종양 특이적 작용을 가능하게 할 것이라는 것이 주목되어야 한다.
본 발명의 주제를 제한하는 것은 아니지만, 네오에피토프 서열들은 키메릭 단백질(chimeric protein)으로 번역될 수 있거나 또는 않는, 단일 전사 유닛, 또는 탠덤 꼬마유전자(tandem minigene)(예를 들어, aa12-네오에피토프12-aa12)로 구성되는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 에피토프들은 이미 위에서 논의된 바와 같이 N- 및/또는 C-말단 펩타이드들을 가지는 하이브리드 서열로서, 또는 개별적으로 또는 연쇄적으로, 단량체, 다량체로서 발현될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 가장 일반적으로, 바이러스 및/또는 숙주 코돈 선호(host codon preference)를 수용하기 위해 적절한 코돈의 사용을 이용하여 핵산 서열이 역-번역되는 것이 바람직하다. 그러나 대체적인 코돈의 사용 또는 비-매칭되는 코돈의 사용도 적합한 것으로 여겨질 수도 있다.
또한, 바이러스성 전달 운송수단(viral delivery vehicle)(또는 다른 발현 구조체)은 또한 형질주입된 수지상 세포(또는 다른 항원 제시)와 면역 컴피턴트 세포들(예를 들어, T 세포들, NK 세포들, 등) 사이의 상호 작용을 향상시키기 위해 적어도 하나, 보다 일반적으로 적어도 두개, 보다 일반적으로 적어도 세개, 가장 일반적으로 적어도 네 개의 동시-자극 분자(co-stimulatory molecule)들을 인코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 적절한 공동-자극 분자들은 특히 B7.1 (CD80) 및/또는 B7.2(CD86)와 함께 ICAM-1(CD54), ICOS-L 및 LFA-3(CD58)을 포함한다. 추가적으로 고려되는 공동-자극 분자는 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L 및 TL1A를 포함한다. 또한, 공동-자극 분자들의 발현은 바람직하게는 항원들 및/또는 네오에피토프들이 하나 이상의 공동-자극 분자와 함께 제시되도록 조정될 것이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 공동-자극 분자들은 다중 전사물(multi transcript)로부터, 또는 내부 리보솜 진입 부위 또는 2A 서열을 이용하여 단일 전사물로부터 생성되는 것이 일반적으로 고려된다. 대안적으로, 공동-자극 분자들은 별도의 RNA 구조체들 통해 전달될 수도 있다.
또한, 필수적이진 않지만, 바이러스성 벡터(viral vector)(또는 다른 발현 구조체, 바람직하게는 RNA)가 또한 체크포인트 수용체(checkpoin receptor)에 바인딩하는 하나 이상의 폴리펩타이드 리간드들을 인코딩하는 서열 부분을 포함할 수 있다. 가장 일반적으로, 바인딩은 수용체를 통해 적어도 신호를 감소시키거나 억제할 것이고, 특히 고려되는 수용체들은 CTLA-4(특히 CD8+ 세포들에 대한) PD-1(특히 CD4+ 세포들에 대한)을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 바인더들은 항체 프래그먼트들 및 특히 scFv 뿐만 아니라, 수용체들에 특이적으로 바인딩하는 소분자 펩타이드 리간드들을 포함할 수 있다. 또, (폴리)펩타이드 분자들의 발현은 바람직하게는 항원들 및/또는 네오에피토프가 하나 이상의 (폴리)펩타이드 분자들과 함께 제시되도록 조정될 것이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, (폴리)펩타이드 분자들은 다중 전사물로부터, 또는 내부 리보솜 진입 부위 또는 2A 서열을 이용하여 단일 전사물로부터 생성되는 것이 일반적으로 고려된다. 대안적으로, 이미 상술한 바와 같이, 면역 체크포인트 억제제들은 활성화된 면역 컴피턴트 세포들의 투여 전 또는 중에 환자에게 투여될 수 있다.
추가적으로 고려되는 양상들에서, 발현 벡터 또는 RNA는 또한 면역 반응에 대한 향상을 제공하고 상호작용하는 것으로 알려진 기능적으로 관련된 단백질을 인코딩(포함)할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터 또는 RNA는 CD27 및 CD70, CD40 및 CD40L, OX40L 및 OX40, GITRL 및 GITR, IL-2 및 CD122, CD137 및 TRAF2, 및/또는 ICOSL 및 ICOS를 인코딩하는 세그먼트들을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 적합한 발현 벡터들 및 RNA는 또한 면역 반응에 대한 추가적인 향상을 제공하기 위해 억제 시스템들과 상호 작용하는 리간드들을 인코딩(포함)할 수 있다. 예를 들어, 적합한(자연 발생 또는 조작된) 리간드들은 T-세포 활성화의 CD276/B7-H3 억제를 억제하는 리간드, T-세포 활성화의 B7-H4/VTCN1 억제를 억제하는 리간드, T-세포 활성화의 CD272/HVEM 억제를 억제하는 리간드, T-세포 활성화의 LAG3 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, MHC-II, 등), T-세포 활성화의 PD-1 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, PD-L1) , T-세포 활성화의 CTLA-4 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, 생물학적, 가용성 CD28, 등), T- 세포 활성화의 TIM-3 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, 갈랙틴-9(galectin-9), 생물학적, 항체, 등) T-세포 활성화의 비스타(VISTA) 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, 항체, 등) 및/또는 NK세포들의 MIC 억제를 억제하는 리간드(예를 들어, 항체, 생물학적, 등)를 포함한다.
가장 일반적으로, 재조합 유전자들의 발현은 구성적으로(constitutively) 활성 조절 서열(active regulatory sequence)들로부터 유도된다. 그러나, 본 발명의 주제의 다른 양상들에서, 조절 서열들은 바람직하게는 합성 유도자(synthetic inducer)들 또는 암성 조직(cancerous tissue)에 내인성인(endogenous) 하나 이상의 조절 신호들을 사용하는 선택적인 방식으로, 유도성(inducible)일 수 있다. 대부분의 경우, 전사체는 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 또는 2A 서열 (절단 가능한 2A-유사 펩타이드 서열)을 포함하여, 공동-자극 분자들 및 사이토카인들의 조정된 발현을 다시 허용하는 것이 더 바람직하다.
수지상 또는 다른 항원 제시 세포들의 형질주입에 관해서, 재조합 핵산들은 네이키드 또는 복합 DNA(예를 들어, 리포펙션을 사용하여)로 투여될 수 있지만, 재조합 핵산은 재조합 RNA 또는 바이러스성 게놈 일부인 것이 일반적으로 바람직하다. 이렇게 유전적으로 변형된 바이러스는 인 비트로에서 수지상 세포들을 감염시키는데 사용될 수 있으며, 이는 바이러스성 운송수단의 면역원성에 대한 잠재적 문제들을 현저하게 감소시킬 것이다. 재조합 바이러스들에 관련하여, 재조합 바이러스들을 제조하는 모든 공지된 방식들이 본 명세서에의 용도에 적합하다고 여겨지지만, 특히 바람직한 바이러스들은 아데노바이러스들, 아데노-관련 바이러스들, 알파바이러스(alphaviruse)들, 헤르페스 바이러스(herpes viruse)들, 렌티바이러스(lentiviruse)들, 등을 포함하는 치료에서 이미 자리잡은 것들이다. 다른 적절한 선택들 중에서, 아데노바이러스들이 특히 바람직하다. 또한, 상기 바이러스는 일반적으로 선택된 바이러스성 단백질(예를 들어, E1, E3 단백질들)의 타겟팅된 결실에 의해 달성되는, 복제 결핍 및 비-면역원성 바이러스(replication deficient and non-immunogenic virus)인 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 바람직한 성질들은 E2b 유전자 기능을 결실시킴으로써 더욱 향상될 수 있으며, 최근 보고된 바와 같이(예를 들어, J Virol. 1998 Feb; 72(2): 926- 933) 유전적으로 변형된 인간 293 세포들을 사용하여 고 역가(titer)들의 재조합 바이러스들이 달성될 수 있다. 가장 일반적으로, 바람직한 핵산 서열들은 본 기술분야에 널리 공지된 적합한 조절 엘리먼트들의 제어 하에 있다.
따라서, 위의 관점에서, 제시되는 조성물들 및 방법들은 하나 또는 다른(또는 양쪽 모두) MHC 시스템들에 대해 특이적으로 바이러스성으로 발현되는 항원들을 유도하기에 적합할 뿐만 아니라, 체크포인트 억제제들의 막 결합 제시 또는 분비(secretion)를 통해, 그리고 다양한 공동-자극 분자들(예를 들어, ICAM-1(CD54), ICOS-L, LFA-3(CD58) 및 적어도 하나의 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86))의 내포를 통해 CD8+ 및/또는 CD4+ 세포들 상에 증가된 자극 효과를 제공할 것이라는 것이 이해되어야 한다.
또한, 고려되는 네오에피토프들에 관해, 네오에피토프들은 항원 제시 세포들에 의해 필수적으로 발현될 필요는 없지만, 적어도 몇몇(또는 전체)의 네오에피토프들은 폴리펩타이드로서 또는 개별적인 펩타이드들로서 항원 제시 세포들 내로 전달될 수도 있다. 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 폴리펩타이드들은 박테리아 및/또는 효모 발현 시스템과 같은 재조합 발현 시스템에서 생성된 펩타이드들, 또는 합성 펩타이드들일 수 있다. 따라서, 적합한 펩타이드들은 '최소' 펩타이드(즉, MHC-I 또는 MHC-II에 의한 제시 및 바인딩에 필요한 잔기(residue)들의 수를 초과하지 않는 길이를 가짐)이거나, 또는 N- 및/또는 C- 말단에서 부가적인 서열 부분들을 가질 수 있다. 예를 들어, 부가적인 아미노산들은 MHC-I 또는 MHC-II에 대한 친화성을 증가시키기 위해, 또는 TAP 시스템 또는 프로테아좀에서의 라우팅 또는 프로세싱을 트리거링 또는 용이하게 하기 위해 존재한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 부가적인 서열 부분들은 또한 없거나 낮은 면역원성 및 강직 2차 구조들을 가지는 스페이서 엘리먼트(spacer element)들일 수 있다. 예를 들어, 고려되는 스페이서 부분들은 적어도 2 개의 공유 결합된 네오에피토프 사이에 유용할 수 있다. 또한, 부가적인 서열 부분들은 기능적인 역할도 가질 수 있고, 특히 고려되는 기능적인 역할들은 검출 가능성(detectability)(예를 들어, GFP 부분을 통한), 정제 능력(예를 들어, 아비딘 부분을 통한), 또는 신호 기능을 포함한다.
수지상 세포들 또는 다른 항원 제시 세포들이 항원 펩타이드들에 노출되거나 또는 발현하도록 유전적으로 변형되는 경우, 항원 펩타이드들에 대한 노출 또는 유적적 변형은 면역 컴피턴트 세포들과 수지상 세포들 또는 다른 항원 발현 세포들을 접촉시키기 전에 수행될 수 있다. 대안적으로,수지상 세포들 또는 다른 항원 제시 세포들이 면역 컴피턴트 세포들과 접촉하는 동안 유전적 변형 및 노출이 수행될 수도 있다.
추가적으로 고려되는 양상들에서, 노출되거나 또는 형질주입되는 항원 제시 세포(예를 들어, 환자로부터의)들은 항원 제시 세포들에 의해 면역 컴피턴트 세포들의 활성화 또는 명령을 허용하기에 충분한 시간 동안 환자의 면역 컴피턴트 세포들과 함게 인 비트로에서 배양되고, 일반적으로 적어도 2 시간, 보다 일반적으로 적어도 4시간, 및 가장 일반적으로 적어도 8시간이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "공-배양(co-culturing)"및 "배양(incubating)"이라는 용어들은 동의어로 사용되며, 세포들이 세포 분열도 포함할 수 있는 가시적인 상태로 유지되는 프로세스를 나타낸다. 가장 일반적으로, 면역 컴피턴트 세포들에 대한 항원 제시 세포들(예를 들어, 이전에 종양 관련 항원에 노출되거나 또는 종양 관련 항원을 인코딩하는 핵산으로 형질주입된)의 적합한 비율들은 일반적으로 104:1 (항원 제시 세포 대 면역 컴피턴트 세포들) 내지 1:104 (항원 제시 세포 대 면역 컴피턴트 세포들) 사이, 또는 103:1 내지 1:103 사이, 또는 102:1 내지 1:102 사이, 또는 10:1 내지 1:10 사이일 수 있다. 그러나, 보다 덜 바람직한 양상들에서, 노출되거나 형질주입되는 항원 제시 세포(예를 들어, 환자로부터의)들은 생체 내에서 환자의 면역 컴피턴트 세포들과 함께 배양될 수도 있다.
또한 추가적으로 고려되는 양상들에서, 분리된 수지상 세포들(다른 분리된 항원 제시 세포들) 대신, 환자의 벌크(bulk)의 백혈구(WHC)들이 발현을 위해 네오에피토프들을 인코딩하는 핵산들로 형질주입되거나 또는 네오에피토프들로 배양될 수 있다. 이러한 접근법은 벌크의 WHC들에서 항원 제시 세포들에 의해 바람직한 MHC/네오에피토프 복합체들의 생성을 일으키는 것이 예상된다. 따라서, 환자의 마이크로파지들, 수지상 세포들 및 B-세포들은 NK 세포들 및 T 세포들에 명령하여 이들이 질병 조직을 타겟팅하도록 의도되는 특성들을 가지도록 한다.
또한, 형질주입된 항원 제시 세포들 및 면역력 컴피턴트 세포의 혼합은 하나 이상의 면역 자극 사이토카인들의 존재 하에 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 적합한 사이토카인들은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 및 특히 변형된 IL-15(예를 들어, Altor Bioscience의 IL-15 과작동제(IL-15 superagonis))를 포함한다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 형질주입된 항원 제시 세포들 및 면역력 컴피턴트 세포의 혼합은 TLR 리간드들(예를 들어, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7/8, TLR9, TLR13, 등), NLR 리간드들(예를 들어, NOD1, NOD2, 등), RLR 리간드들(예를 들어, 5′ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 등.), CLR 리간드들(예를 들어, HKCA, 리케난(lichenan), 베타 글루칸 펩타이드(beta glucan peptide), 등), 및/또는 STING 리간드들(예를 들어, 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, c-di-AMP, 등과 같은 고리형 디뉴클레오타이드(cyclic dinucleotide)들)들과 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor)들의 하나 이상의 리간드들의 존재하에서 수행될 수 있다.
형질주입되는 항원 제시 세포들 및 면역 컴피턴트 세포들의 혼합물이 환자에게 투여 전 하나 이상의 컴포넌트들을 제거하기 위해 프로세싱될 수 있다는 것이 추가적으로 고려된다. 예를 들어, 혼합물은 면역 자극 사이토카인들, 패턴 인식 리간드들, 및/또는 수지상 또는 다른 항원 제시 세포들 중 하나 이상을 제거하기 위해 프로세싱될 수 있다. 결과적으로, 세포-함유 수혈 조성물은, 가능한 하나 이상의 네오에피토프들, 및/또는 하나 이상의 네오에피토프 펩타이드들을 인코딩하는 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 바이러스성 전달 운송수단(예를 들어, 아데노바이러스) 또는 발현 벡터와 추가적으로 함께, 환자로부터의 컴피턴트 세포들 및/또는 형질주입되는 항원 제시 세포들을 일반적으로 포함할 것이라는 것이 주목되어야 한다. 또한, 수혈 조성물은 면역 자극 사이토카인들 및/또는 체크 포인트 억제제들을 포함할 수도 있다. 또한, 형질주입되는 항원 제시 세포들 및 면역 컴피턴트 세포들의 혼합물의 프로세싱은 소진된 T-세포들을 제거하는 단계 또는 소진된 T-세포들을 활성화시키는 단계를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 혼합물은 PD-L1, TIM3, LAG3, CTLA4, 또는 CD244에 대해, 또는 IL21과 함께 유효양의 항체들과 접촉될 수 있다.
원하는 경우, 수혈 조성물은 이종성(heterologous) NK 세포들, 및 특히 낮은 억제를 나타내도록 유전적으로 변형되는 NK 세포들을 포함할 수도 있다. 물론, 고려되는 NK 세포들은 수혈 조성물의 투여 전 또는 후에 환자에게 투여될 수도 있다.
예를 들어, 유전적으로 변형되는 NK 세포는 이러한 세포들을 구성적으로 활성화되도록 렌더링(render)할 적어도 하나의 킬러세포 면역그로블린-유사 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)의 감소되거나 또는 중단되는 발현을 가지도록 변형되는 NK-92 변형체(NK-92 derivative)일 수 있다. 물론, 하나 이상의 KIR들은 결실될 수 있거나, 또는 이들의 발현이 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, 및 KIR3DS1을 포함하여, 억제(예를 들어, miRNA, siRNA, 등을 통해)될 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 이러한 변형되는 세포들은 본 기술분야에서 널리 알려진 프로토콜들을 사용하여 제조될 수있다. 대안적으로, 이러한 세포들은 aNK 세포들(활성화된 자연 킬러세포들)로서 NantKwest로부터 상업적으로 획득될 수도 있다.
본 발명의 주제의 또 다른 바람직한 양상에서, 유전적으로 조작되는 NK 세포는 또한 고-친화성 Fcγ 수용체(CD16)를 발현하도록 변형되는 NK-92 변형체일 수 있다. Fcγ 수용체의 고-친화성 변이체(variant)들에 대한 서열들은 본 기술분야에 널리 알려져 있으며, 생성 및 발현의 모든 방식들이 본 명세서에서의 용도에 적합한 것으로 여겨진다. 이러한 수용체의 발현은 본 명세서에서 고려되는 치료에 대한 반응으로 환자에 의해 생성되는 항체들을 사용하여 종양 세포들을 특이적으로 타겟팅하도록 허용하는 것으로 신뢰되고, 이는 환자의 종양 세포들(예를 들어, 네오에피토프들), 특정 종양 유형(예를 들어, her2neu, PSA, PSMA, 등)에 특이적이거나, 또는 암(예를 들어, CEA-CAM)과 관련된다. 유리하게는, 이러한 세포들은 haNK 세포들(고-친화성 자연 킬러 세포들)로서 NantKwest로부터 획득될 수 있다.
대안적으로, 유전적으로 조작되는 NK 세포들은 또한 키메라성 T-세포 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 특히 바람직한 양상들에서, 키메라성 T-세포 수용체는 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원 및/또는 암 네오에피토프에 대한 바인딩 특이성을 가지는 scFv 부분 또는 다른 엑토도메인(ectodomain)을 가질 것이다. 이전과 마찬가지로, 이러한 세포들은 taNK 세포들(타겟-활성화 자연 킬러 세포)로 NantKwest로부터 상업적으로 획득되어 원하는대로 변형될 수 있다. 세포들이 암 관련 항원 또는 네오에피토프에 대한 친화성을 가지도록 조작된 키메라성 T-세포 수용체를 가지는 경우, 공지된 암 관련 항원들 및 네오에피토프들이 용도에 적합한 것으로 고려된다. 예를 들어, 종양 관련 항원들은 CEA, MUC-1, CYPB1, PSA, Her-2, PSA, 브라큐리(brachyury), 등을 포함한다.
또한, 상술한 바와 같이, 세포 함유 수혈 조성물의 예방적 또는 치료적 투여는 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제들과 함께 공동-투여에 의해 동반될 수 있다는 것이 고려되고, 특히 여기서 재조합 바이러스 또는 RNA는 체크포인트 수용체들을 타겟팅하는 폴리펩타이드들을 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하지 않는다. 예를 들어, 특히 바람직한 체크포인트 억제제들은 현재 이용 가능한 억제제(예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab))들을 포함한다.
물론 고려되는 조성물들 및 방법들은 단일 치료 건에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 조성물들은 시간이 지나감에 따라 반복적으로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 반복되는 투여는 환자가 예상되는 새롭게 발생되는 네오에피토프들에 대해 검사(surveyed)되는 경우 특히 유용하다. 이러한 새롭게 식별되는 네오에피토프들은 면역 시스템에 의한 공격을 회피하려는 종양의 시도에 적응하거나 또는 환자의 질병을 좀 더 수용(suit)하도록 고려되는 치료 조성물들을 변형하는 것이 적용될 수 있다.
이하의 청구범위를 통해 그리고 본 명세서의 기술에 사용되는 바와 같이, “하나의(a)” “하나의(an)” 및 “상기(the)”의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “에서(in)”의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 “에서(in)” 및 “상에(on)”를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 용여 “커플링되는(coupled to)”는 직접 결합(두 엘리먼트들이 서로 접촉하면서 서로 결합) 및 간접 결합(적어도 하나의 추가적인 엘리먼트가 두 엘리먼트 사이에 위치) 양쪽 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어들 “에 커플링되는(coupled to)” 및 “과 커플링되는(coupled with)”는 동일하게 사용된다. 마지막으로, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서에 기재되는 모든 범위들은 그들의 종단점들을 포함하는 것으로 해석되어야 하고, 그리고 개방형 범위들은 상업적으로 실용적인 값들을 가지도록 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 값들의 목록들은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 중간값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
이미 기술된 것들 이외의 수많은 변형들이 본 명세서에서의 발명의 개념들에 벗어나지 않고 가능하다는 것이 본 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구범위를 제외하고 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구항들 양쪽의 해석에 있어서, 모든 용어들은 문맥에 따라 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어들 “포함하다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”은 참조되는 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계들이 명시적으로 참조되지 않는 다른 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계들과 함께 결합되거나, 또는 활용될 수 있다는 것을 나타내는, 비-배타적인 방식으로 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계들을 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구항들이 A, B, C .. 및 N으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 어떤 것을 지칭하는 경우, 문장은 그룹으로부터 A 더하기 N, 또는 B 더하기 N 등이 아닌 오직 하나의 엘리먼트를 요구하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (65)
- 종양을 가지는 환자로부터의 면역 컴피턴트 세포(immune competent cell)를 생체 외(ex vivo)에서 활성화시키는 방법으로서,
복수의 면역 컴피턴트 세포들을 상기 환자로부터 획득하는 단계;
적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프(patient-specific tumor neoepitope) 또는 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터(expression vector)로 복수의 항원-제시 세포들을 생체 외에서 형질주입하는 단계; 및
상기 면역 컴피턴트 세포들을 활성화시키기 위한시간 동안 상기 복수의 형질주입된 항원-제시 세포들과 함께 상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들을 공-배양하는(co-culturing) 단계;
를 포함하는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 상기 환자의 전혈의 백혈구 파편인,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, NK 세포, 마이크로파지(macrophage), 단핵구(monocyte), 및 B-세포 중 적어도 하나에서 부양되는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 환자로부터 유래되는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 수지상 세포(dendritic cell)들인,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 상기 발현 벡터로 형질주입되는,
방법.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 HLA-매칭 환자-특이적 종양 네오에피토프인,
방법.
- 제 6항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 상기 환자-특이적 종양 네오에피토프로 하여금 MHC-I 또는 MHC- II 제시(presentation)를 타겟팅하도록 하는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 더 포함하는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되거나 또는 상기 핵산은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 면역 자극 분자로 추가적으로 형질주입되거나 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 면역 자극 분자를 추가적으로 인코딩하는,
방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 면역 자극 분자는 공동-자극 분자인,
방법.
- 제 12 항에 있어서,
상기 공동-자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A인,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 체크포인트 억제제로 추가적으로 형질주입되거나 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)를 추가적으로 인코딩하는,
방법.
- 제 14 항에 있어서,
상기 체크포인트 억제제는 CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD 279)에 바인딩되는 폴리펩타이드(polypeptide)인,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터인,
방법.
- 제 16 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성(adenoviral vector) 벡터인,
방법.
- 제 16 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 대응하는 야생-형(wild-type) 바이러스성 벡터에 비해 감소된 면역원성(immunogenicity)을 가지는,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 공-배양하는 단계는 사이토카인의 존재 하에서 수행되는,
방법.
- 제 19 항에 있어서,
사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-15 과작동제(IL-15 SUPERAGONIST)인,
방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 면역 컴피턴트 세포들을 활성화시키기 위한 시간은 2 시간 내지 24시간 사이인,
방법.
- 약학적 조성물로서,
복수의 형질주입된 항원-제시 세포들 및 복수의 면역 컴피턴트 세포들과 함께 수혈하기 위한 약학적으로 수용가능한 캐리어;
를 포함하고,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프로 또는 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질주입되고; 그리고
상기 면역 컴피턴트 세포들은 종양을 가지는 환자로부터 획득되는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 상기 환자의 전혈의 백혈구 파편인,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 CD4+ T-세포, a CD8+ T-세포, NK 세포, 마이크로파지(macrophage), 단핵구(monocyte), 및 B-세포 중 적어도 하나에서 부양되는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 환자로부터 유래되는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 수지상 세포인,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 상기 발현 벡터로 형질주입되는,
약학적 조성물.
- 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 HLA-매칭 환자-특이적 종양 네오에피토프인,
약학적 조성물.
- 제 27항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 상기 환자-특이적 종양 네오에피토프로 하여금 MHC-I 또는 MHC- II 제시를 타겟팅하도록 하는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 더 포함하는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되거나 또는 상기 핵산은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 면역 자극 분자로 형질주입되거나 또는 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 면역 자극 분자를 추가적으로 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 32 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 면역 자극 분자는 공동-자극 분자인,
약학적 조성물.
- 제 33 항에 있어서,
상기 공동-자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A인,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 체크포인트 억제제로 추가적으로 형질주입되거나 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)를 추가적으로 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 35 항에 있어서,
상기 체크포인트 억제제는 CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD 279)에 바인딩되는 폴리펩타이드(polypeptide)인,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터인,
약학적 조성물.
- 제 37 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성(adenoviral vector) 벡터인,
약학적 조성물.
- 제 37 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 대응하는 야생-형(wild-type) 바이러스성 벡터에 비해 감소된 면역원성(immunogenicity)을 가지는,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
사이토카인을 더 포함하는,
약학적 조성물.
- 제 40 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-15 과작동제(IL-15 SUPERAGONIST)인,
약학적 조성물.
- 제 22 항에 있어서,
면역 체크포인트 억제제를 더 포함하는,
약학적 조성물.
- 환자의 종양을 치료하기 위한 용도를 가지는 복수의 면역 컴피턴트 세포들 및 형질주입된 항원-제시 세포들을 포함하는 약학적 조성물로서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 형질주입된 항원-제시 세포들에 생체 외에서 노출되고;
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프, 또는 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 RNA로 형질주입되고; 그리고
상기 면역 컴피턴트 세포들은 상기 종양을 가지는 상기 환자로부터 유래되는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 상기 환자의 전혈의 백혈구 파편인,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, NK 세포, 마이크로파지(macrophage), 단핵구(monocyte), 및 B-세포 중 적어도 하나에서 부양되는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 환자로부터 유래되는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 수지상 세포들인,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는 상기 발현 벡터로 형질주입되는,
약학적 조성물.
- 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 HLA-매칭 환자-특이적 종양 네오에피토프인,
약학적 조성물.
- 제 48항 또는 제 49 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 환자-특이적 종양 네오에피토프는 상기 환자-특이적 종양 네오에피토프로 하여금 MHC-I 또는 MHC- II 제시를 타겟팅하도록 하는 타겟팅 서열을 더 포함하는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프로 형질주입되거나 또는 상기 핵산은 적어도 두개의 별개인 환자-특이적 종양 네오에피토프를 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 면역 자극 분자로 형질주입되거나 또는 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 면역 자극 분자를 추가적으로 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 53 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 면역 자극 분자는 공동-자극 분자인,
약학적 조성물.
- 제 54 항에 있어서,
상기 공동-자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A인,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 항원-제시 세포들은 적어도 하나의 체크포인트 억제제로 추가적으로 형질주입되거나 노출되고, 또는 상기 핵산은 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 추가적으로 인코딩하는,
약학적 조성물.
- 제 56 항에 있어서,
상기 체크포인트 억제제는 CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD 279)에 바인딩되는 폴리펩타이드(polypeptide)인,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터인,
약학적 조성물.
- 제 58 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성(adenoviral vector) 벡터인,
약학적 조성물.
- 제 59 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 대응하는 야생-형 바이러스성 벡터에 비해 감소된 면역원성을 가지는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 사이토카인의 존재 하에서 형질주입되는 항원-제시 세포들에 노출되는,
약학적 조성물.
- 제 61 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-15 과작동제인,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들을 투여하는 단계 이전에 면역 체크포인트 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계;
를 더 포함하는,
약학적 조성물.
- 제 43 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 상기 형질주입된 항원-제시 세포들과 함께 투여되는,
약학적 조성물.
- 제 64 항에 있어서,
상기 복수의 면역 컴피턴트 세포들은 수혈(transfusion)을 통해 투여되고, 그리고
상기 용도는 상기 환자의 상기 종양의 적어도 하나의 종양-관련 네오에피토프를 인코딩하는 상기 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 제공하는 단계를 더 포함하는,
약학적 조성물.
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