KR20190025485A - 칸나비스 사티바 (cannabis sativa)로부터 칸나비크로메닉산 신타아제 - Google Patents

칸나비스 사티바 (cannabis sativa)로부터 칸나비크로메닉산 신타아제 Download PDF

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조나단 이. 파지
제이슨 엠. 스타우트
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내션얼 리서치 카운슬 오브 캐나다
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Abstract

대마초로부터 핵산 분자가 단리되고 특징화되었고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 핵산의 발현 또는 과다발현은 칸나비노이드 화합물의 수준을 변경한다. 이들 폴리펩티드는 칸나비노이드 화합물을 생산하기 위해 생체내에서 또는 시험관내에서 이용될 수 있다.

Description

칸나비스 사티바 (CANNABIS SATIVA)로부터 칸나비크로메닉산 신타아제{CANNABICHROMENIC ACID SYNTHASE FROM CANNABIS SATIVA}
관련된 출원
이것은 2014년 6월 27일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/018,128의 우선권에 근거하여 35 U.S.C. § 119의 혜택을 주장하는 특허 협력 조약 출원이고, 상기 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
분야
본 발명은 대마초로부터 칸나비크로메닉산 신타아제 (CBCAS) 효소, 효소 CBCAS 기초된 시약을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 그리고 칸나비노이드를 생산하고 및/또는 칸나비노이드 생산을 변경하기 위한 방법에 관계한다.
도입
칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) L. (대마초, 대마, 마리화나)은 가장 오래되고 가장 다능한 순치된 식물 중에서 하나인데, 이것은 현재, 약용, 식품, 미용 및 산업 산물의 공급원으로서 용도를 발견한다. 이것은 또한, 항정신성 칸나비노이드 (가령, △9-테트라히드로칸나비놀, THC)의 함량으로 인해, 불법 약물로서 이의 이용에 대해 널리 공지된다. 포유류 칸나비노이드 수용체를 통해 행동하는 식물-유래된 칸나비노이드 및 다른 약물은 제약학적 약물로서 탐구되고 있고 및/또는 다양한 질환, 예를 들면, 만성 통증, 다발성 경화증에서 신경병성 통증, 식욕부진, 메스꺼움, 암/AIDS 쇠약 및 경련성의 치료에 이용되고 있다 (Ware et al., 2010; Pertwee, 2005).
대마초로부터 80여개의 칸나비노이드가 알려져 있다 (Elsohly and Slade, 2005). 주요 산성 칸나비노이드는 △9-테트라히드로칸나비놀산 (THCA), 칸나비디올산 (CBDA) 및 칸나비크로메닉산 (CBCA)이다. 열 또는 연장된 저장은 산성 칸나비노이드의 탈카르복실화를 야기한다 (가령, THCA는 THC를 형성하고, CBDA는 칸나비디올 (CBD)을 형성하고, 그리고 CBCA는 칸나비크로멘 (CBC)을 형성한다).
칸나비노이드 생합성 경로는 분자 및 효소 수준에서 점점 더 이해되고 있다. 첫 번째 효소는 헥사노일-CoA 합성효소이다 (Stout et al., 2013). 헥사노일-CoA는 2가지 효소, 테트라케티드 신타아제 및 올리베톨릭산 시클라아제를 수반하는 반응에 대한 기질로서 이용되는데, 이들 효소는 올리베톨릭산을 합성하기 위해 함께 기능한다 (Gagne et al, 2012). 올리베톨릭산은 방향족 프레닐전달효소 효소에 의해 게라닐화되어 칸나비게롤릭산 (CBGA) (Fellermeier and Zenk, 1998)을 형성하는데, 이것은 옥시도시클라아제 효소에 의해 THCA, CBDA 또는 CBCA로 전환되는 분기점 중간물이다. THCA 신타아제 및 CBDA 신타아제는 클로닝되고 특징화되었다 (Sirikantaramas et al., 2005; Taura et al., 2007). CBCA 신타아제를 인코딩하는 유전자는 보고되지 않았다.
칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) 유전체 서열은 van Bakel et al. (2011)에서 보고되었다. 하지만 CBCA 신타아제에 대한 어떤 서열도 확인되지 않았다.
유전자 증거는 비록 THCA 신타아제 및 CBDA 신타아제가 동일한 좌위에서 대립형질일 수도 있지만, CBCA 신타아제가 이들 다른 효소와 관련성이 없다는 것을 암시한다 (de Meijer et al., 2009, de Meijer et al., 2003).
Kojoma et al (2006)은 "약물 유형" 및 "섬유 유형" 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa)에서 THCA 신타아제 유전자에서 DNA 다형성을 보고하였다.
칸나비노이드는 귀중한 식물-유래된 자연 산물이다. 칸나비노이드 생합성의 효소를 인코딩하는 유전자는 극히 낮은 수준의 THC 및 다른 칸나비노이드를 내포하는 대마초 품종의 물질대사 가공에서 유용할 것이다. 이런 유전자는 또한, 칸나비노이드-기초된 약제의 생산을 위한 특정한 대마초 품종의 창출, 칸나비노이드의 형성에서 단계를 촉매작용하는 효소의 생산, 또는 다른 생물체, 예를 들면, 세균 또는 효모에서 칸나비노이드 생합성의 재구성에 유용한 것으로 입증될 수 있다.
요약
한 양상에서, 다음을 포함하는 단리된 및/또는 정제된 핵산 분자가 제공된다: i) 서열 번호: 1 또는 5에 최소한 96%, 96% 이상 또는 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; ii) 서열 번호: 1, 5 또는 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 서열 동일성을 갖고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; iii) i) 또는 ii)의 보체: 또는 i), ii) 또는 iii)의 15개 이상, 최소한 15개 또는 약 15개의 인접한 뉴클레오티드의 단편.
또한, 다른 양상에서, 서열 번호: 1, 5 또는 8 또는 9의 단편 또는 이의 보체에 최소한 96%, 96% 이상 또는 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 및 프로브가 제공된다.
다른 양상은 임의선택적으로, 대마초 이외에 생물체에서 발현을 위해 최적화된 코돈 사용빈도에서, 서열 번호: 2 또는 6에 최소한 95%, 95% 이상 또는 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 서열 번호: 2 또는 6에 최소한 95%, 95% 이상 또는 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 및/또는 정제된 폴리펩티드가 제공된다.
또한, 다른 양상에서 이종성 신호 서열 또는 태그에 연결된 본원에서 설명된 핵산 분자가 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 이종성 신호 서열 또는 태그에 연결된, 서열 번호: 2 또는 6에 최소한 95%, 95% 이상 또는 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 다른 양상에서 본원에서 서열 번호: 2 또는 6에서 설명된 아미노산 서열 또는 이의 단편의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
다른 양상은 세포 또는 생물체에서 발현에 적합한 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 다음을 포함하는 핵산 분자를 포함한다: i) 서열 번호: 1 또는 5 또는 이의 보체에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는 ii) 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 서열 동일성을 갖고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.
세포 또는 생물체에서 발현에 적합한 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 다음을 포함하는 벡터 구조체 역시 제공된다: i) 서열 번호: 1 또는 5 또는 이의 보체에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는 ii) 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 서열 동일성을 갖고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.
다른 양상은 서열 번호: 1 또는 5에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 서열 동일성을 갖고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열 번호: 2 또는 6에 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 발현하는 핵산을 포함하는 세포 또는 생물체를 포함한다.
추가 양상은 본원에서 설명된 단리된 핵산, 단리된 폴리펩티드, 벡터 구조체, 세포 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 포함한다.
추가의 양상에서, 생물체, 세포 또는 조직에서 칸나비노이드 화합물의 수준을 변경하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 생물체, 세포 또는 조직에서 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 발현하거나 또는 과다발현하는 것을 포함한다.
다른 양상에서, 생물체, 세포 또는 조직에서 칸나비노이드 화합물의 수준을 변경하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터 구조체 또는 이의 단편을 도입하여, 생물체, 세포 또는 조직에서 CBCAS의 발현을 침묵시키고 및/또는 감소시키는 것을 포함한다.
칸나비크로메닉산 신타아제, 그리고 이러한 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 여기에서 확인되고 특징화되었다. 상기 뉴클레오티드 서열은 선별 또는 유전공학을 통해, 칸나비노이드 화합물 또는 이들의 혼합물을 과다생산하거나 또는 불충분하게 생산하는 대마초 식물을 창출하는데 이용될 수 있다. 서열 번호: 1 및 5의 뉴클레오티드 서열의 단편을 포함하는 프라이머 및 프로브 (가령, 길이에서 최소한 15개 뉴클레오티드)가 칸나비크로메닉산 신타아제에서 돌연변이체 또는 변이체를 확인하는데 이용될 수 있다. 이러한 칸나비크로메닉산 신타아제 뉴클레오티드 서열은 또한, 다른 식물에서 또는 미생물 (가령, 효모, 세균, 균류) 또는 다른 원핵 또는 진핵 생물체에서 칸나비노이드 생합성을 정교하게 설계하기 위해 단독으로, 또는 칸나비노이드 합성 경로에서 다른 효소를 인코딩하는 핵산 분자와 합동으로 발현될 수 있다. 이에 더하여, 대마초에서 이러한 유전자의 발현을 녹아웃하는 것이 칸나비노이드 생합성을 차단하고, 따라서 칸나비노이드의 생산을 감소시키는데 이용될 수 있었다.
추가 특질은 다음의 상세한 설명의 과정에서 설명되거나 또는 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명이 더욱 명확하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 이의 구체예가 이제부터, 첨부 도면에 관하여 실례로서 상세하게 설명될 것이다:
도면 1은 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa)에서 주요 칸나비노이드 유형을 야기하는 제안된 경로를 묘사한다. 약어: THCA 신타아제는 △9-테트라히드로칸나비놀산 신타아제이고, CBDA 신타아제는 칸나비디올산 신타아제이고, 그리고 CBCA 신타아제는 칸나비크로메닉산 신타아제이다.
도면 2는 진정한 칸나비노이드 표준 및 CBCAS 반응 산물의 HPLC 크로마토그램을 묘사한다. A. CBGA 표준 (체류 시간 6.8 분). B. CBCA 표준 (체류 시간 9.9 분). 삽도는 CBCA 표준의 자외선 스펙트럼이다. C. 재조합 효소가 CBCA (체류 시간 9.9 분)를 생산한다는 것을 보여주는 CBCAS 반응의 산물. 삽도는 이러한 반응에 의해 생산된 CBCA의 자외선 스펙트럼이다. D. 끓여진 효소 반응물. CBCA는 이러한 반응에 의해 전혀 생산되지 않았다.
도면 3은 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현된 SDS-PAGE 겔 또는 정제된 재조합 CBCAS를 묘사한다. 패널 A는 단백질 사다리이다. 패널 B는 정제된 CBCAS를 보여준다. 패널 C는 Endo Hf로 탈당화된 정제된 CBCAS를 보여준다. 위쪽 띠는 Endo Hf (70 kDa)를 보여주고, 아래쪽 띠는 탈당화된 CBCAS (63 kDa)를 보여준다. 패널 D는 Endo Hf 단독을 보여준다.
도면 4는 CBCAS 활성을 위한 최적 조건을 묘사한다. 패널 A는 CBCA 생산에 대한 완충액 및 완충액 pH의 효과를 보여준다. 값은 생산된 CBCA의 분율 (CBCA A265 nm / (CBGA A265 nm + CBCA A265 nm) * 100)로서 표현된다. 패널 B는 CBCA 생산에 대한 배양 온도의 효과를 보여준다. 패널 C는 CBCA 생산에 대한 첨가제의 효과를 보여준다.
상세한 설명
CBCA 신타아제 (CBCAS)를 인코딩하는, 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa)로부터 폴리뉴클레오티드, 그리고 인코딩된 폴리펩티드가 본원에서 설명된다. 식물 육종, 돌연변이유발 또는 유전공학을 통하는 것을 비롯하여 상기 CBCAS를 이용하는 방법뿐만 아니라 재조합 세포, 그리고 재조합 생물체, 예를 들면, 재조합 식물, 예를 들면, 증강된 CBCA 함량을 갖는 대마초 식물뿐만 아니라 무세포 시스템을 만들기 위한 방법이 설명된다. 게다가, 임의선택적으로, 대마초 세포 또는 식물의 CBCA 생합성을 차단하고 및/또는 CBCA 생합성 및 CBCA 함량을 감소시키기 위해, 예로서 대마초 세포 및/또는 식물에서 CBCAS를 비활성화시키거나 또는 침묵시키는 방법이 설명된다. 일부 구체예는 칸나비노이드 경로에서 다른 효소를 인코딩하는 핵산과 합동으로 상기 CBCA의 이용을 설명한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 대마초 유전체 서열 (van Bakel et al., 2011)은 BLAST 분석을 이용하여 THCA 신타아제에 높은 유사성을 갖는 유전자에 대해 분석되었고, THCA 신타아제에 96% 뉴클레오티드 유사성을 갖는 유전자의 확인으로 이어졌다. 차후 생화학적 특징화에 근거하여, 확인된 유전자는 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) 칸나비크로메닉산 신타아제 (CBCAS)로 명명되었다.
CBCAS cDNA의 서열은 서열 번호: 1에서 제공된다. 서열 번호: 1은 뉴클레오티드 1 내지 84에 의해 코딩되는 예측된 신호 서열을 포함한다.
CBCAS의 개방 해독틀의 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호: 2에서 제공된다. 서열 번호: 2는 아미노산 1-28에서 발견되는 예측된 신호 서열을 포함한다. 서열 번호: 6은 예측된 신호 서열을 포함하지 않는다.
한 구체예는 서열 번호: 2 또는 6 또는 이의 단편에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
한 구체예에서, 단리된 또는 정제된 핵산은 서열 번호: 5에서 보여지는 바와 같이, 신호 서열, 예를 들면, 서열 번호: 1의 뉴클레오티드 4-84를 인코딩하는 뉴클레오티드 중에서 전부 또는 일부가 결실된다.
5' 코돈 ATG (및 또는 추가 코돈, 임의선택적으로 1-50개 추가 코돈, 임의선택적으로 27개 추가 코돈)는 예로서, 5' 이종성 모이어티, 예를 들면, 태그 또는 신호 서열, 예를 들면, 알파 교배 인자 신호 서열을 인코딩하는 서열을 도입하기 위해, 다른 핵산 서열로 대체될 수 있다.
한 구체예에서, 단리되거나 또는 정제된 폴리펩티드는 서열 번호: 6에서 보여지는 바와 같이, 신호 서열, 예를 들면, 서열 번호: 2의 아미노산 1-28 중에서 전부 또는 일부, 또는 아미노산 2-28 중에서 전부 또는 일부가 결실된다.
5' 메티오닌 및/또는 5' 단부에서 추가 아미노산 (가령, 최대 50개 추가 아미노산)은 다른 아미노산 서열, 예를 들면, 5' 이종성 모이어티, 예를 들면, 태그 또는 신호 서열, 예를 들면, 알파 교배 인자 신호 서열로 대체될 수 있다.
다른 신호 서열은 예로서, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 α-아밀라아제 신호 서열, 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori)로부터 글루코아밀라아제 신호 서열, 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터 혈청 알부민 신호 서열, 클루이베로미세스 막시아누스 (Kluyveromyces maxianus)로부터 이놀리나아제 신호 서열, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 전화효소 신호 서열, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 킬러 단백질 신호 서열, 또는 닭 (Gallus gallus)으로부터 라이소자임 신호 서열을 포함할 수 있다.
CBCAS의 신호 서열은 또한, 아르기닌 잔기를 부가하거나 또는 아미노산을 아르기닌 잔기로 대체함으로써 돌연변이될 수 있다.
서열 번호: 8 및 9는 각각, 대장균 (E. coli) 및 효모에 대해 최적화되는 코돈 최적화된 핵산 서열을 제공한다. 따라서, 한 구체예에서, 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 코돈 최적화된 서열은 서열 번호: 1과 약 78% 및 79% 서열 동일성을 공유하고 서열 번호: 2를 인코딩한다. 한 구체예에서, 최적화된 서열은 상응하는 예측된 신호 서열 뉴클레오티드 중에서 전부 또는 일부가 결실된다. 한 구체예에서, 신호 서열은 다른 신호 서열로 대체되거나 또는 결실되고 메티오닌 개시 코돈으로 대체된다.
일부 구체예는 서열 번호: 1, 5, 8 및/또는 9에 최소한 또는 약 78%, 최소한 또는 약 80%, 최소한 또는 약 81%, 최소한 또는 약 82%, 최소한 또는 약 83%, 최소한 또는 약 84%, 최소한 또는 약 85%, 최소한 또는 약 86%, 최소한 또는 약 87%, 최소한 또는 약 88%, 최소한 또는 약 89%, 최소한 또는 약 90%, 최소한 또는 약 91%, 최소한 또는 약 92%, 최소한 또는 약 93%, 최소한 또는 약 94%, 최소한 또는 약 95%, 최소한 또는 약 96%, 최소한 또는 약 97%, 최소한 또는 약 98% 또는 최소한 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 단리되거나 또는 정제된 핵산 분자에 관계한다. 일정한 구체예에서, 단리되거나 또는 정제된 핵산 분자는 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 코돈 축중성 서열이다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는다.
서열 번호: 1, 5, 8 및 9의 단편을 비롯한 상기 서열의 단편, 그리고 거기에 최소한 또는 약 78% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 서열 또한 예기된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 최소 및/또는 최대 또는 약 15, 최소 및/또는 최대 또는 약 20, 최소 및/또는 최대 또는 약 25, 최소 및/또는 최대 또는 약 30, 최소 및/또는 최대 또는 약 40, 최소 및/또는 최대 또는 약 50, 최소 및/또는 최대 또는 약 60, 최소 및/또는 최대 또는 약 70, 최소 및/또는 최대 또는 약 80, 최소 및/또는 최대 또는 약 90, 최소 및/또는 최대 또는 약 100, 최소 및/또는 최대 또는 약 200, 최소 및/또는 최대 또는 약 300, 최소 또는 최대 또는 약 400, 최소 및/또는 최대 또는 약 500, 최소 및/또는 최대 또는 약 600, 최소 및/또는 최대 또는 약 700, 최소 및/또는 최대 또는 약 800, 최소 및/또는 최대 또는 약 900, 최소 및/또는 최대 또는 약 1000, 최소 및/또는 최대 또는 약 1100, 최소 및/또는 최대 또는 약 1200, 최소 및/또는 최대 또는 약 1300, 최소 및/또는 최대 또는 약 1400 또는 최소 및/또는 최대 또는 약 1500개의 인접한 뉴클레오티드, 또는 거기에 최소한 또는 약 78% 또는 그 이상, 예를 들면, 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 가령, 핵산 분자는 15개의 인접한 뉴클레오티드로부터 1500개까지의 인접한 뉴클레오티드 또는 그들 사이에 임의의 범위 또는 숫자의 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 개시된 서열에 혼성화하는 핵산 분자가 더욱 포함된다. 혼성화 조건은 서열 번호: 1 또는 5에서 핵산 분자와 최소한 약 96% 또는 약 97% 서열 동일성이 있으면 혼성화가 발생할 것이라는 점에서 엄격할 수 있다. 엄격한 조건은 공지된 서던 혼성화를 위해 이용된 것들, 예를 들면, 예로서, 50% 포름아미드, 5x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 구연산염), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 황산염, 그리고 20 mg/mL 변성된, 전단된 연어 정자 DNA를 갖는 용액에서 42℃에서 하룻밤 동안 배양, 그 이후에 약 65℃에서 0.1x SSC에서 혼성화 서포트의 세척을 포함할 수 있다. 다른 공지된 혼성화 조건은 널리 공지되어 있고, 그리고 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)에서 설명된다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 핵산 서열에서 변화가 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 반드시 변경하는 것은 아니다. 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키는, 특정한 핵산 서열에서 뉴클레오티드의 정체에서 변화가 이들 유전자의 감소된 또는 증강된 유용성을 유발할 수 있고, 그리고 일부 적용 (가령, 안티센스, 동시억제, 또는 RNAi)에서, 부분적인 서열이 이용될 수 있다는 것은 당업자에 의해 인지될 것이다. 뉴클레오티드 서열이 변화되거나 또는 단축될 수 있는 방식은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 변경된 서열의 유용성을 시험하는 방식 역시 그러하다. 일정한 구체예에서, 유용성은 예로서, 전통적인 가스 크로마토그래피에 의해 쉽게 시험될 수 있다. 핵산 서열의 이와 같은 모든 변이는 이런 이유로, 본 발명의 일부로서 포함된다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 앞서 설명된 핵산 분자의 길이는 의도된 용도에 의존할 것이다. 가령, 의도된 용도가 예로서, PCR 증폭을 위한 또는 라이브러리를 선별검사하기 위한 프라이머 또는 프로브이면, 핵산 분자의 길이는 전장 서열보다 작을 것이다, 예를 들면, 예로서, 약 15 내지 약 50개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 및/또는 이의 보체의 최소한 약 15개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 또는 이의 보체의 최소한 약 17개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 또는 이의 보체의 최소한 약 19개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 또는 이의 보체의 최소한 약 21개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 또는 이의 보체의 최소한 약 23개 뉴클레오티드, 임의선택적으로 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9 및/또는 이의 보체의 최소한 약 25개 뉴클레오티드의 단편일 것이다. 이들 구체예에서, 이들 프라이머 또는 프로브는 핵산 서열의 고도로 보존된 영역과 실제적으로 동일할 수 있거나 또는 DNA 서열의 5' 또는 3' 단부와 실제적으로 동일할 수 있다. 일부 경우에, 이들 프라이머 또는 프로브는 '실제적으로 동일'하지만 서열 인식에서 유연성을 여전히 제공하기 위해, 일부 위치에서 보편적인 염기를 이용할 수 있다. 흥미롭게도, 적합한 프라이머 및 프로브 혼성화 조건은 당분야에서 널리 공지된다.
한 구체예에서, 핵산 분자는 프라이머로서 이용될 수 있고, 그리고 예로서, 서열 번호: 3 또는 4의 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 핵산은 이종성 모이어티, 예를 들면, 독특한 꼬리, 정제 태그 또는 검출가능한 라벨에 접합되고 및/또는 이를 포함한다.
독특한 꼬리는 특정한 핵산 서열일 수 있다.
핵산은 예로서, 단부 표지화될 수 있거나 (5' 또는 3') 또는 라벨이 합성 동안 무작위로 통합될 수 있다.
다른 구체예에서 i) 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 최소한 약 15개 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 (가령, 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 단편), 또는 15개 뉴클레오티드를 포함하고 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98% 또는 최소한 약 99% 동일성을 갖는 핵산 및 ii) 이종성 모이어티를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 효소 활성을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 구체예에서, 이종성 모이어티는 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 핵산이고, 그리고 폴리뉴클레오티드 분자는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구체예는 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98% 또는 최소한 약 99% 동일성을 갖는 단리되거나 또는 정제된 폴리펩티드에 관계한다.
서열 번호: 2 또는 6의 단편 또한 예기된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호: 2 또는 6의 최소 및/또는 최대 또는 약 5, 최소 및/또는 최대 또는 약 10, 최소 및/또는 최대 또는 약 15, 최소 및/또는 최대 또는 약 20, 최소 및/또는 최대 또는 약 25, 최소 및/또는 최대 또는 약 30, 최소 및/또는 최대 또는 약 40, 최소 및/또는 최대 또는 약 50, 최소 및/또는 최대 또는 약 60, 최소 및/또는 최대 또는 약 70, 최소 및/또는 최대 또는 약 80, 최소 및/또는 최대 또는 약 90, 최소 및/또는 최대 또는 약 100, 최소 및/또는 최대 또는 약 150, 최소 및/또는 최대 또는 약 200, 최소 및/또는 최대 또는 약 250, 최소 및/또는 최대 또는 약 300, 최소 및/또는 최대 또는 약 350, 최소 및/또는 최대 또는 약 400, 최소 및/또는 최대 또는 약 450, 최소 및/또는 최대 또는 약 500개의 인접한 아미노산을 포함한다.
한 구체예에서, 단편은 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98% 또는 최소한 약 99% 동일성을 갖는다.
한 구체예에서, 단리된 폴리펩티드는 대마초 생산된 CBCAS와 비교하여, 차별적으로 당화되고, 비당화되고 (가령, N 및/또는 O-연결된 당화를 결여하고) 및/또는 탈당화된다. 가령, 단리된 폴리펩티드는 화학적 또는 효소적 방법, 예를 들면, Endo Hf 또는 탈당화 효소 믹스로 처리를 이용하여 탈당화될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 예로서, 효모 또는 다른 발현 시스템에서 발현으로 인해 차별적으로 당화된다.
다른 구체예는 i) 서열 번호: 2 또는 6의 최소한 5개 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 최소한 96%, 96% 이상 또는 약 96%, 최소한 97%, 97% 이상 또는 약 97%, 최소한 98%, 98% 이상 또는 약 98%, 또는 최소한 99%, 99% 이상 또는 약 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 ii) 이종성 모이어티를 포함하는 단리되거나 또는 정제된 복합 폴리펩티드에 관계한다.
한 구체예에서, 이종성 모이어티는 이종성 폴리펩티드이고, 그리고 복합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 가령, 이종성 폴리펩티드는 신호 서열, 예를 들면, 알파 교배 인자 신호 서열일 수 있다.
한 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 서열 번호: 2 또는 6 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드를 연결하는 펩티드 링커를 임의선택적으로 포함한다.
한 구체예에서, 이종성 모이어티는 검출가능한 라벨 또는 태그이다.
검출가능한 라벨은 바람직하게는, 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생산할 수 있다. 가령, 라벨은 방사선비투과성이거나 또는 방사성동위원소, 예를 들면, 3H, 14C, 32P (예로서, 방사성 인산염 포함), 35S, 123I, 125I, 131I; 비오틴, 형광 (형광단) 또는 화학발광 (발색단) 화합물, 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시안산염, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예를 들면, 알칼리 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제 또는 양고추냉이 과산화효소; 영상 작용제; 또는 금속 이온일 수 있다.
다른 구체예에서, 검출가능한 신호는 예로서, 이차 항체를 이용하여 간접적으로 검출가능하다.
한 구체예에서, 태그는 His 태그, HA 태그, FLAG 태그, AviTag, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, Myc 태그, S-태그, SBP 태그, strep-태그, V5-태그, GFP-태그, GST-태그, 그리고 티오레독신-태그에서 선택된다.
다른 양상은 예로서, 서열 번호: 2 또는 6에서 보여지는 바와 같이, CBCAS에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
양상에서, 항체는 정제되거나 또는 단리된 항체이다. "정제된" 또는 "단리된"은 소정의 항체 또는 이의 단편이 자연으로부터 이전되거나 (혈액 혈청으로부터 단리되거나) 또는 합성된 (재조합 수단에 의해 생산된) 것인지에 상관없이, 순도가 증가되었다는 것으로 의미되고, 여기서 "순도"는 "절대적 순도"가 아닌 상대적 용어이다. 특정 양상에서, 정제된 항체는 이것이 자연적으로 연관되거나 또는 합성 이후에 연관되는 다른 성분이 60% 없거나, 바람직하게는 최소한 약 75% 없거나, 그리고 더욱 바람직하게는 최소한 약 90% 없다.
본 발명의 추가 양상은 본원에서 설명된 핵산, 구조체, 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편 및/또는 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 조성물은 예로서, 적합한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 가령, 조성물이 항체 또는 이의 단편을 포함하는 경우에, 적합한 담체는 단백질, 예를 들면, BSA일 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 임의선택적으로 적합한 담체, 희석제 또는 첨가제와 합동으로, 본원에서 설명된 단리된 핵산, 단리된 구조체, 단리된 폴리펩티드, 단리된 항체 또는 이의 단편 및/또는 단리된 세포를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 예로서, 본원에서 설명된 재조합 세포 또는 재조합 생물체의 정제된 추출물, 예를 들면, 증가된 수준의 하나 또는 그 이상의 칸나비노이드 및/또는 CBCAS를 포함하는 재조합 식물 추출물이다. 한 구체예에서, 재조합 식물 추출물은 증가된 수준의 하나 또는 그 이상의 칸나비노이드, 예를 들면, CBCA 또는 CBC를 포함한다. 따라서, 한 양상은 본원에서 설명된 방법 또는 시스템에 따라 생산된 칸나비노이드, 또는 칸나비노이드, 예를 들면, CBCA 또는 CBC를 포함하는 조성물을 포함한다.
한 구체예에서, 정제된 추출물은 재조합 생물체 배양액, 예를 들면, 재조합 효모 세포 배양액의 배양 상층액을 포함하고, 여기서 CBCAS가 배양 상층액 내로 분비된다.
다른 양상에서 재조합 생물체 또는 세포, 예를 들면, 재조합 효모 세포를 포함하는 발효 시스템이 또한 제공된다. 상기 시스템은 칸나비노이드 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소, 또는 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하는 세포와 합동으로 CBGA 및/또는 다른 기질을 포함할 수 있다.
일부 구체예는 이종성 모이어티를 임의선택적으로 포함하는, 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 또는 더욱 임의선택적으로 최소한 96%, 96% 이상 또는 약 96% 서열 동일성을 갖는 단리되거나 또는 정제된 핵산 분자를 내포하는 구조체 또는 시험관내 발현 시스템에 관계한다. 따라서, 센스 또는 안티센스 방향에서 서열 또는 부분적인 서열, 또는 이의 보체의 세포 내로의 도입을 위한, 이런 서열 또는 이의 단편을 포함하는 구조체 또는 시험관내 발현 시스템을 제조하기 위한 방법이 제공된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "벡터"는 핵산 (종종 재조합)을 숙주 세포 내로 전달하는데 이용되는 핵산을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, '구조체'는 전달 벡터 및 관심되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인위적으로 창출된 핵산, 예를 들면, 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 관심되는 폴리뉴클레오티드는 구조체를 생산하기 위해 관심되는 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
한 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 가능한 발현 벡터는 이러한 벡터가 이용된 숙주 세포와 양립하기만 하면, 코스미드, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스 (가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관된 바이러스)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 벡터는 "숙주 세포의 형질전환에 적합"한데, 이것은 발현 벡터가 본 출원의 핵산 분자 및 발현에 이용되는 숙주 세포의 기초에서 선별된 조절 서열을 내포한다는 것을 의미하고, 상기 조절 서열은 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된다는 것은 핵산이 상기 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 구체예에서, 단리된 및/또는 정제된 핵산 분자, 또는 이들 단리된 및/또는 정제된 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 구조체 또는 시험관내 발현 시스템은 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하고 및/또는 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 수준을 조정하는 유전자도입 또는 재조합 생물체 또는 재조합 세포 (가령, 임의선택적으로 재조합 생물체의 세포)를 창출하는데 이용될 수 있다.
이런 이유로, 한 구체예는 서열 번호: 1 및 5의 최소한 15개의 인접한 뉴클레오티드 및 임의선택적으로, 서열 번호: 1 또는 5에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 핵산 분자 및/또는 상기 단리된 및/또는 정제된 핵산 분자를 포함하는 구조체를 포함하는 재조합 생물체, 또는 상기 생물체의 숙주 세포 또는 생식 조직 (가령, 종자)에 관계한다.
한 구체예에서, 재조합 생물체, 세포 및/또는 생식 조직은 상기 폴리펩티드 서열의 최소 및/또는 최대 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 또는 약 250개 아미노산 및 임의선택적으로, 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현한다.
재조합 발현 벡터는 또한, 폴리펩티드를 인코딩하는 관심되는 핵산이 벡터 내로 인프레임 도입될 때, 융합 폴리펩티드를 생산하는 이종성 폴리펩티드 (가령, 융합 모이어티)를 인코딩하는 핵산 서열을 내포할 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 재조합 단백질의 증가된 발현; 재조합 단백질의 증가된 용해도; 및/또는 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 표적 재조합 단백질의 정제에서 보조를 제공할 수 있다. 가령, 단백질분해 개열 부위가 융합 폴리펩티드의 정제 다음에, 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 허용하기 위해, 표적 재조합 단백질 사이에 부가될 수 있다. 전형적인 융합 발현 벡터는 pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMal (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 포함하는데, 이들은 글루타티온 S-전달효소 (GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 재조합 단백질에 각각 융합한다.
바람직하게는, 재조합 생물체는 재조합 식물, 재조합 다세포 미생물 또는 재조합 곤충이다. 식물은 바람직하게는, 대마초 (Cannabis) 속, 예를 들면, 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) L., 칸나비스 인디카 램 (Cannabis indica Lam.) 및 칸나비스 루데랄리스 자니쉬 (Cannabis ruderalis Janisch), 특히 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa)이다. 미생물은 바람직하게는, 세균 (가령, 대장균 (Escherichia coli)) 또는 효모 (가령, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris))이다. 단세포인 미생물은 생물체, 또는 숙주 세포를 비롯한 세포인 것으로 고려될 수 있다. 곤충은 바람직하게는, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)이다.
CBCAS 뉴클레오티드 서열을 내포하는 대마초 식물은 공지된 식물 형질전환 방법, 예를 들면, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질전환, 입자 충격에 의한 형질전환, 화분 튜브 또는 원형질체 형질전환을 통해 창출될 수 있다. 이들 방법론적 접근법에서, 관심되는 유전자는 표적 생물체의 유전체 내로 통합된다. 가령, 대마의 조직 배양 및 아그로박테리움 (Agrobacterium) 매개된 형질전환은 Feeney and Punja, 2003에서 설명된다.
재조합 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 원핵 및/또는 진핵 세포는 예로서, 전기천공 또는 염화칼슘-매개된 형질전환에 의해 핵산으로 형질전환될 수 있다. 가령, 핵산은 전통적인 기술, 예를 들면, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동침전, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포펙틴, 바이러스 매개된 방법, 전기천공 또는 현미주입을 통해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환하고 형질감염시키기 위한 적합한 방법은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), 그리고 다른 실험실 교재에서 발견될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 매우 다양한 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함한다. 가령, 본 발명의 핵산 및 단백질은 식물 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 식물 세포는 바람직하게는 대마초 (Cannabis) 속, 예를 들면, 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) L., 칸나비스 인디카 램 (Cannabis indica Lam.) 및 칸나비스 루데랄리스 자니쉬 (Cannabis ruderalis Janisch), 특히 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa)이다. 미생물은 바람직하게는 세균 (가령, 대장균 (Escherichia coli)) 또는 효모 (가령, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris))이다. 곤충 세포는 바람직하게는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포이다.
따라서 한 구체예는 재조합 세포를 포함하고, 그리고 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 재조합 식물 세포이다. 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 재조합 효모 세포이다.
다른 적합한 숙주 세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)에서 발견될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 단백질은 원핵 세포, 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli)에서 발현될 수 있다 (Zhang et al., Science 303(5656): 371-3 (2004)). 이에 더하여, 슈도모나스 (Pseudomonas)-기초된 발현 시스템, 예를 들면, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)가 이용될 수 있다 (US 특허 출원 공개 번호 US 2005/0186666).
따라서, 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포 또한 본원에서 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 증가된 수준의 칸나비크로메닉산 신타아제를 유발한다.
본원에서 설명된 재조합 생물체, 세포 및 생식 조직은 변경된 수준의 칸나비노이드 화합물을 가질 수 있다. 도면 1에 관하여, 핵산 분자의 발현 또는 과다발현은 칸나비크로메닉산 신타아제 효소의 발현 또는 과다발현을 유발할 것이고, 이것은 차례로, 칸나비노이드 화합물, 예를 들면, 칸나비크로메닉산 및 칸나비크로멘의 증가된 생산을 유발할 수 있는 것으로 당업자에 의해 인지될 것이다. 생물체, 세포 또는 조직에서 칸나비크로메닉산 신타아제의 침묵은 칸나비크로메닉산 신타아제의 과소발현을 유발할 것이고, 이것은 더욱 많은 양의 칸나비게롤릭산, 칸나비게롤, △9-테트라히드로칸나비놀산, △9-테트라히드로칸나비놀, 칸나비디올산 및 칸나비디올 또는 메틸 또는 프로필 측쇄를 갖는 이들 화합물의 변이체의 축적을 유발할 수 있다. 생식 조직은 단리된 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 종자, 배아 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다.
핵산 분자의 발현 또는 과다발현은 칸나비노이드 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 다른 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 다른 핵산의 발현 또는 과다발현과 합동으로 행위될 수 있다. 다른 핵산의 일부 실례는 다음을 포함한다: 헥사노일-CoA 합성효소, 테트라케티드 신타아제, 올리베톨릭산 시클라아제, THCA 신타아제, CBDA 신타아제 및/또는 방향족 프레닐전달효소 (가령, CsPT1)를 인코딩하는 핵산.
유사한 또는 동일한 조건 하에 성장된 동일한 품종에 대한 정상적인 수준의 효소를 갖는 대조와 비교하여, 본 발명의 칸나비크로메닉산 신타아제 효소의 발현 또는 과다발현은 증가된 수준, 예를 들면, 약 1- 약 20%, 약 2- 약 20%, 약 5- 약 20%, 약 10- 약 20%, 약 15- 약 20%, 약 1- 약 15%, 약 1- 약 10%, 약 2- 약 15%, 약 2- 약 10%, 약 5- 약 15%, 또는 약 10- 약 15% (w/w)의 칸나비노이드 화합물을 유발할 것이다.
따라서, 다른 양상은 생물체, 세포 또는 조직에서 칸나비노이드 화합물의수준을 변경하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 생물체, 세포 또는 조직에서 CBCAS의 발현을 침묵시키고 및/또는 감소시키기 위해, 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 단편을 이용하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, CBCA 및 CBC는 CBGA를 생산하는 세포 또는 생물체에서, 또는 CBCA 및/또는 CBC를 생산하는 세포 및 생물체에서 변경되고 및/또는 생산될 수 있고, CBCA 및/또는 CBC의 생산은 CBCAS를 발현하는 재조합 세포를 만듦으로써 증가될 수 있다.
다른 양상은 CBCA를 생산하는 시험관내 방법을 포함하고, 상기 방법은 CBCA 및/또는 CBC를 생산하는데 적합한 조건 하에 적합한 시간 동안 용액에서 또는 고정된 상태에서 CBGA를 CBCAS와 접촉시키고; 그리고 CBCA 및/또는 CBC를 단리하고 및/또는 정제하는 것을 포함한다.
접촉시키는 것은 예로서, CBGA 중에서 최소한 약 10%, 최소한 약 20%, 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 최소한 약 50%, 최소한 약 60%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 100%를 CBCA로 전환하는데 적합한 조건 하에 적합한 기간 동안 용액에서 및/또는 고정된 상태에서 CBGA를 재조합 CBCAS와 혼합함으로써 달성될 수 있다.
용액은 MES, 구연산염 또는 인산염 완충액을 임의선택적으로 포함하고, 상기 용액의 pH는 임의선택적으로, 약 pH 4 및 약 pH 6.5 사이이거나, 또는 임의선택적으로 약 pH 4, 약 pH 4.5, 약 pH 5, 약 pH 5.5, 약 pH 6, 또는 약 pH 6.5이다.
시험관내 검정은 임의선택적으로, 35℃ 및 50℃ 사이의 온도에서, 또는 그들 사이의 임의의 온도 (가령, 약 35℃ 및 약 50℃ 사이에 임의의 0.1℃ 증분), 임의선택적으로 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃ 또는 약 50℃에서 수행된다.
CBCAS는 예로서, 비드 또는 칼럼 수지에 고정되고, 그리고 예로서, 시험관내 시스템에서 이용될 수 있다.
CBCA의 탈카르복실화된 산물인 칸나비크로멘 (CBC)은 마리화나의 정신활성에 유의미하게 기여하지 않지만 생쥐 사분염색체 모형에서 높은 농도에서 THC-유사 활성을 보여준다 (DeLong et al., 2011). 이에 더하여, CBC는 진통 (Davis and Hatoum, 1983) 및 항노시셉틴 (Maione et al., 2011)을 비롯한 다양한 약리학적 및 생물학적 효과를 유발하는 것으로 보고되었고, 그리고 항염증성 (DeLong et al. 2011; Wirth et al., 1980; Izzo et al. 2012), 항진균성 (Elsohly and Turne, 1982), 항균성 (Elsohly and Turner, 1982) 및 항종양 (Ligresti et al. 2006) 활성을 소유한다.
추가 양상은 CBCA 및/또는 CBC를 생산하는 방법 및/또는 CBCA 및/또는 CBC의 생산을 증가시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9를 포함하는 핵산, 또는 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 임의선택적으로 최소한 또는 약 78% 또는 더욱 임의선택적으로 96% 서열 동일성을 갖고, CBCAS 활성을 유지하는 이의 단편을 포함하는 벡터를 CBGA를 생산하는 세포 또는 생물체 내로 도입하여 재조합 세포 또는 재조합 생물체를 생산하는 단계;
ii) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 재조합 세포를 배양하고 및/또는 재조합 생물체를 성장시키는 단계; 그리고 임의선택적으로
iii) CBCA 및/또는 CBC를 단리하고 및/또는 정제하는 단계.
재조합 세포는 일시적으로 발현하고, 유도적으로 발현하고 및/또는 안정되게 발현할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 CBCA를 가열하고 및/또는 저장하여 CBC를 생산하는 것을 포함한다. CBCA를 저장하고 및/또는 가열하는 것은 CBC로의 탈카르복실화를 증가시킨다. 가령, THCA 및 CBDA의 열 탈카르복실화는 > 94℃ 온도에서 발생하는 것으로 나타났다 (Veress et al 1990). 따라서 한 구체예에서, CBCA는 임의선택적으로, 최소한 또는 약 20 분, 최소한 또는 약 30 분, 최소한 또는 약 40 분, 최소한 또는 약 50 분 또는 최소한 또는 약 60 분 또는 그 이상 동안 최소한 약 94℃까지 가열된다. 다른 구체예에서, CBCA는 임의선택적으로, 최소한 또는 약 10 분, 최소한 또는 약 20 분, 최소한 또는 약 30 분, 최소한 또는 약 40 분, 최소한 또는 약 50 분 또는 최소한 또는 약 60 분 또는 그 이상 동안 최소한 약 105℃까지 가열된다. 다른 구체예에서 CBCA는 임의선택적으로, 최소한 또는 약 10 분, 최소한 또는 약 15 분, 최소한 또는 약 20 분, 최소한 또는 약 25 분, 최소한 또는 약 30 분, 최소한 또는 약 35 분, 최소한 또는 약 40 분, 최소한 또는 약 45 분, 최소한 또는 약 50 분 동안 최소한 약 120℃까지 가열된다. 또 다른 구체예에서 CBCA는 임의선택적으로, 최소한 또는 약 5 분, 최소한 또는 약 10 분, 최소한 또는 약 15 분, 최소한 또는 약 20 분, 또는 최소한 또는 약 25 분 동안 최소한 약 140℃까지 가열된다. 다른 구체예에서 온도는 약 94℃ 및 약 150℃ 사이에 임의의 0.1℃ 증분이고, 그리고 가열 시간은 약 3 분 및 약 90 분 사이에 임의의 1 분 증분이다.
한 구체예에서, 중성 및 산성 칸나비노이드는 단리되고 및/또는 정제된다. 한 구체예에서, 중성 칸나비노이드는 단리되고 및/또는 정제된다. 한 구체예에서, 산성 칸나비노이드는 단리되고 및/또는 정제된다.
다른 양상은 CBC를 생산하는 방법 및/또는 CBC 생산을 증가시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9의 전부 또는 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 CBGA를 생산하는 세포 또는 생물체 내로 도입하여 재조합 세포 또는 재조합 생물체를 생산하는 단계, 여기서 상기 단편은 CBCAS 활성을 갖고, 서열 번호: 1, 5, 8 또는 9에 임의선택적으로 최소한 약 96% 동일성을 갖고;
ii) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 재조합 세포를 배양하고 및/또는 재조합 생물체를 성장시키는 단계;
iii) CBCA를 단리하는 단계; 그리고
iv) CBCA를 가열하고 및/또는 저장하여 CBC를 생산하는 단계.
한 구체예에서, 세포는 식물 세포이다. 한 구체예에서, 식물 세포는 대마초 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 비-대마초 세포이다.
대마초 식물에서 칸나비노이드의 증강된 생산 또는 칸나비노이드의 감소/제거는 교배 및 선별뿐만 아니라 칸나비노이드 생합성 경로의 효소를 인코딩하는 유전자, 예를 들면, 본 발명에서 CBCA 신타아제 유전자를 이용한 유전공학을 통해 달성될 수 있었다. 이에 더하여, 칸나비노이드를 야기하는 생합성 경로는 대마초 식물에 대한 필요 없이 칸나비노이드를 생산하기 위해, 세균, 효모, 균류 또는 다른 이종성 생물체로, 또는 시험관내 생체촉매에 의해 이전될 수 있다.
한 구체예에서, 생물체는 식물이다. 한 구체예에서, 식물은 대마초 식물이다.
핵산 단리 및 클로닝은 충분히 확립된다. 유사하게, 단리된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 전통적인 기술에 의해 세포 내로 형질전환될 수 있다. 핵산 분자는 세포 및/또는 생물체 내로 형질전환될 수 있다. 당분야에서 공지된 바와 같이, 유전자, 벡터 및 구조체가 세포 및/또는 생물체 내로 도입될 수 있는 다수의 방식이 있고, 그리고 형질전환 및 조직 배양 기술의 조합이 재조합 세포 및/또는 생물체를 창출하기 위한 효과적인 전략으로서 성공적으로 통합되었다. 본원에서 이용될 수 있는 이들 방법은 다른 문헌에서 설명되었고 (Potrykus, 1991; Vasil, 1994; Walden and Wingender, 1995; Songstad et al., 1995), 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 널리 공지되고, 그리고 일반적인 기술 문헌, 예를 들면, Pouwels et al., (1986)에서 설명된다. 특히 적합한 벡터는 Ti 플라스미드 벡터를 포함한다. 가령, 당업자는 진공 침윤 (Bechtold, et al.. 1993) 또는 상처 접종 (Katavic et al., 1994)에 의한 아라비돕시스 (Arabidopsis)의 아그로박테리움 (Agrobacterium) 매개된 형질전환에 더하여, 아그로박테리움 (Agrobacterium) Ti-플라스미드 매개된 형질전환 (가령, 배축 (DeBlock et al., 1989) 또는 자엽 엽병 (Moloney et al., 1989) 상처 감염), 입자 충격/바이오리스틱 방법 (Sanford et al., 1987; Nehra. et al., 1994; Becker et al., 1994) 또는 폴리에틸렌 글리콜-보조된, 원형질체 형질전환 (Rhodes et al., 1988; Shimamoto et al., 1989) 방법을 이용하여 다른 식물 종을 형질전환하는 것이 동등하게 가능하다는 것을 분명히 인지할 것이다.
한 구체예에서, 재조합 세포 또는 생물체는 유전자도입 세포 또는 유전자도입 생물체이다. 한 구체예에서, 재조합 세포 또는 생물체는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 에피솜을 포함한다.
재조합 발현 벡터는 본원에서 개시된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 내포하는 것에 더하여, 삽입된 핵산 분자의 전사 및 번역을 위한 조절 서열을 내포할 수 있다.
적합한 조절 서열은 세균, 진균, 바이러스, 포유류, 또는 곤충 유전자를 비롯한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다 (가령, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명된 조절 서열 참조). 적절한 조절 서열의 선별은 아래에 논의된 바와 같이 선택된 숙주 세포에 의존하고, 그리고 당업자에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 이런 조절 서열의 실례는 번역 개시 신호를 비롯하여, 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가적으로, 선택된 숙주 세포 및 이용된 벡터에 따라, 다른 서열, 예를 들면, 복제 기점, 추가 DNA 제한 부위, 인핸서, 그리고 전사의 유도성을 부여하는 서열이 발현 벡터 내로 통합될 수 있다.
당업자에게 또한 명확하고, 그리고 다른 문헌 (Meyer, 1995; Datla et al., 1997)에서 설명된 바와 같이, 특정 발달 단계까지, 또는 특정 외부 자극 (가령, 열 충격)에 대한 응답으로, 구조성 프로모터 (가령, CaMV35S에 근거된 것들)를 이용하거나, 또는 유전자 발현을 특정 세포, 조직 (가령, 발달하는 종자 태반엽에서 도입유전자의 발현을 위한 나핀 프로모터), 장기 (가령, 뿌리, 잎)로 표적화할 수 있는 프로모터를 이용함으로써 도입유전자 발현의 임의의 의도된 상향조절 또는 하향조절을 주동하는 프로모터를 활용하는 것이 가능하다.
본원에서 이용을 위한 프로모터는 유도적, 구조적, 또는 조직 특이적이거나 또는 이런 특징의 다양한 조합을 가질 수 있다. 유용한 프로모터는 구조성 프로모터, 예를 들면, 카네이션 윤문 바이러스 (CERV), 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 또는 더욱 구체적으로, 2개의 CaMV 35S 프로모터를 나란히 포함하는 이중 증강된 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 ("이중 35S" 프로모터로서 지칭됨)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 프로모터는 단자엽 식물에서 활성인 프로모터, 예를 들면, APX, SCP1, PGD1, R1G1B, 또는 EIF5 프로모터이다. 일정한 환경에서는 구조성 프로모터 대신에 조직 특이적 또는 발달적으로 조절된 프로모터를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 조직 특이적 프로모터는 다른 조직에서 발현에 영향을 주지 않으면서 일정한 조직에서 과다발현을 허용한다.
프로모터 및 종결 조절 영역은 숙주 세포에서 기능적일 것이고, 그리고 상기 세포 및 유전자에 이종성 (즉, 자연발생 아님) 또는 상동성 (식물 숙주 종으로부터 유래됨)일 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 프로모터는 전술된다.
종결 조절 영역은 프로모터가 획득되었던 유전자의 3' 영역으로부터 또는 다른 유전자로부터 유래될 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 종결 영역은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 신타아제 종결인자 (Tnos), 아그로박테리움 투메파키엔스 (A. tumefaciens) 만노파인 신타아제 종결인자 (Tmas) 및 CaMV 35S 종결인자 (T35S)를 포함한다. 본원에서 이용을 위한 특히 바람직한 종결 영역은 완두콩 리불로오스 비스인산염 카르복실라아제 작은 아단위 종결 영역 (TrbcS) 또는 Tnos 종결 영역을 포함한다. 이런 유전자 구조체는 적절하게는, 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 의한 숙주 식물 내로 형질전환에 의한 활성에 대해 선별검사되고, 그리고 변경된 칸나비노이드 수준에 대해 선별검사될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 구조체는 또한, 본 출원의 재조합 분자로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 용이하게 하는 선별가능 마커 유전자를 내포할 수 있다. 선별가능 마커 유전자의 실례는 일정한 약물에 내성을 부여하는 단백질, 예를 들면, G418 및 히그로마이신, β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸전달효소, 개똥벌레 루시페라아제, 또는 면역글로불린 또는 이의 부분, 예를 들면, 면역글로불린, 임의선택적으로 IgG의 Fc 부분을 인코딩하는 유전자이다. 선별가능 마커 유전자의 전사는 선별가능 마커 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸전달효소, 또는 개똥벌레 루시페라아제의 농도에서 변화에 의해 모니터링된다. 만약 선별가능 마커 유전자가 항생제 내성, 예를 들면, 네오마이신 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하면, 형질전환체 세포는 G418로 선별될 수 있다. 선별가능 마커 유전자를 통합한 세포는 생존할 것이고, 반면 다른 세포는 죽는다. 이것은 본 출원의 재조합 발현 구조체의 발현을 가시화하고 검정하고, 그리고 특히, 발현 및 표현형에 대한 돌연변이의 효과를 결정하는 것을 가능하게 만든다. 선별가능 마커는 관심되는 핵산으로부터 별개의 벡터 상에 도입될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
상기 핵산 분자 또는 이들의 단편은 칸나비노이드 화합물을 자연적으로 생산하는 생물체에서 칸나비노이드 생합성을 차단하는데 이용될 수 있다. 본원에서 개시된 핵산 분자를 이용한 침묵은 당분야에서 전반적으로 공지된 다수의 방식, 예를 들면, RNA 간섭 (RNAi) 기술, 인공 마이크로RNA 기술, 바이러스-유도된 유전자 침묵 (VIGS) 기술, 안티센스 기술, 센스 동시억제 기술 및 표적화된 돌연변이유발 기술에서 달성될 수 있다.
RNAi 기술은 RNA 간섭 (RNAi) 플라스미드 구조체를 이용한 안정된 형질전환을 수반한다 (Helliwell and Waterhouse, 2005). 이런 플라스미드는 반전된 반복 구조에서 침묵되는 표적 유전자의 단편으로 구성된다. 반전된 반복은 스페이서, 종종 인트론에 의해 분리된다. 적합한 프로모터, 예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터에 의해 주동된 RNAi 구조체는 식물 유전체 내로 통합되고, 그리고 도입유전자의 차후 전사는 그 자체로 되접어 꺾여 이중 가닥 헤어핀 RNA를 형성하는 RNA 분자를 야기한다. 이러한 이중 가닥 RNA 구조는 식물에 의해 인식되고, 그리고 짧은 간섭 RNA (siRNA)로 불리는 작은 RNA (약 21개 뉴클레오티드 길이)로 절단된다. siRNA는 단백질 복합체 (RISC)와 연관되는데, 이것은 표적 유전자에 대한 mRNA의 직접적인 분해까지 나아간다.
인공 마이크로RNA (amiRNA) 기술은 식물 및 다른 진핵생물에서 내인성 유전자를 침묵시키는 기능을 하는 마이크로RNA (miRNA) 경로를 활용한다 (Schwab et al, 2006; Alvarez et al, 2006). 이러한 방법에서, 침묵되는 유전자의 약 21개 뉴클레오티드 길이 단편이 프리(pre)-miRNA 유전자 내로 도입되어 프리(pre)-amiRNA 구조체를 형성한다. 프리(pre)-miRNA 구조체는 당업자에게 명확한 형질전환 방법을 이용하여 생물체 유전체 내로 이전된다. 프리(pre)-amiRNA의 전사 후, 처리는 21개 뉴클레오티드 amiRNA 서열과 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 유전자를 표적으로 하는 amiRNA를 산출한다.
RNAi 침묵 기술에서, 2가지 인자가 단편의 길이의 선택에 영향을 줄 수 있다. 단편이 더욱 짧을수록 덜 빈번하게 효과적인 침묵이 달성될 것이지만, 매우 긴 헤어핀은 세균 숙주 균주에서 재조합의 기회를 증가시킨다. 침묵의 유용성은 또한, 유전자 의존성인 것으로 보이고, 그리고 표적 mRNA의 접근성 또는 유전자가 활성인 세포에서 표적 mRNA 및 hpRNA의 상대적 존재비를 반영할 수 있었다. 약 100 및 약 800 bp 사이에, 바람직하게는 약 300 및 약 600 bp 사이에 단편 길이가 일반적으로, 획득되는 침묵의 효율을 최대화하는데 적합하다. 다른 고려 사항은 표적화되는 유전자의 부분이다. 5' UTR, 코딩 영역, 그리고 3' UTR 단편은 동등하게 우수한 결과에서 이용될 수 있다. 침묵의 기전이 서열 상동성에 의존하기 때문에, 관련된 mRNA 서열의 교차-침묵에 대한 잠재력이 있다. 이것이 바람직하지 않은 경우에, 다른 서열, 예를 들면, 5' 또는 3' UTR에 낮은 서열 유사성을 갖는 영역이 선택되어야 한다. 교차-상동성 침묵을 방지하기 위한 규칙은 구조체 및 비표적 유전자 서열 사이에 약 20여 개 염기의 서열 동일성의 블록을 갖지 않는 서열을 이용하는 것인 것 같다. 이들 동일한 원리 중에서 다수가 amiRNA를 설계하기 위한 표적 영역의 선별에 적용된다.
바이러스-유도된 유전자 침묵 (VIGS) 기술은 식물의 내인성 항바이러스성 방어를 활용하는 RNAi 기술의 변이이다. 숙주 DNA의 단편을 내포하는 재조합 VIGS 바이러스로 식물의 감염은 표적 유전자에 대한 전사후 유전자 침묵을 야기한다. 한 구체예에서, 담배 래틀 바이러스 (TRV) 기초된 VIGS 시스템이 이용될 수 있다.
안티센스 기술은 관심되는 유전자에 의해 생산된 전령 RNA (mRNA)에 결합할 안티센스 올리고뉴클레오티드를 식물 내로 도입하는 것을 수반한다. "안티센스" 올리고뉴클레오티드는 "센스" 서열로 불리는 유전자의 전령 RNA (mRNA)에 상보적인 염기 서열을 갖는다. mRNA의 센스 분절의 활성은 안티센스 mRNA 분절에 의해 차단되고, 따라서 유전자 발현을 효과적으로 비활성화시킨다. 식물에서 유전자 침묵에 안티센스의 적용은 Stam et al., 2000에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
센스 동시억제 기술은 고도로 발현된 센스 도입유전자를 식물 내로 도입하여, 도입유전자 및 내인성 유전자 둘 모두의 감소된 발현을 유발하는 것을 수반한다 (Depicker et al., 1997). 이러한 효과는 도입유전자 및 내인성 유전자 사이에 서열 동일성에 의존한다.
표적화된 돌연변이유발 기술, 예를 들면, TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) 및 빠른-중성자 충격을 이용한 "유전자 결실 (delete-a-gene)"이 생물체에서 유전자 기능을 녹아웃하는데 이용될 수 있다 (Henikoff et al., 2004; Li et al., 2001). TILLING은 생식질 또는 개별 세포를 돌연변이원으로 처리하여 점 돌연변이를 유발하는 것을 수반하고, 이들 점 돌연변이는 이후, 단일-뉴클레오티드 돌연변이 검출을 위한 민감한 방법을 이용하여 관심되는 유전자에서 발견된다. 원하는 돌연변이 (가령, 관심되는 유전자 산물의 비활성화를 유발하는 돌연변이)의 검출은 예로서, 염기서열결정 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 관심되는 유전자로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 제조될 수 있고, 그리고 PCR이 돌연변이화된 개체군 내에 생물체로부터 관심되는 유전자의 영역을 증폭하는데 이용될 수 있다. 증폭된 돌연변이 유전자는 돌연변이 유전자 및 야생형 유전자 사이에 부정합을 찾기 위해 야생형 유전자에 어닐링될 수 있다. 검출된 차이는 돌연변이 유전자를 가진 생물체로 역으로 추적될 수 있고, 따라서 어떤 돌연변이화된 생물체가 원하는 발현 (가령, 관심되는 유전자의 침묵)을 가질 것인지를 드러낸다. 이들 생물체는 이후, 원하는 발현을 갖는 개체군을 생산하기 위해 선별적으로 교배될 수 있다. TILLING은 표적화된 유전자의 감소된 발현을 전시하는, 미스센스 및 녹아웃 돌연변이를 포함하는 대립형질 계열을 제공할 수 있다. TILLING은 도입유전자의 도입을 수반하지 않는 유전자 녹아웃에 대한 가능한 접근법으로서 권유되고, 그리고 이런 이유로, 수요자에게 더욱 허용될 수 있다. 빠른-중성자 충격은 TILLING과 유사한 방식으로 PCR을 이용하여 또한 검출될 수 있는 생물체 유전체에서 돌연변이, 다시 말하면, 결실을 유도한다.
용어:
본 발명의 다양한 구체예의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정한 용어의 다음의 설명이 제공된다:
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 그리고 이것이 이용되는 맥락에 따라 얼마간 변할 것이다. 상기 용어가 이용되는 맥락을 고려하여 당업자에게 명확하지 않은 상기 용어의 이용이 있으면, "약"은 특정 용어의 최대 플러스 또는 마이너스 10%를 의미할 것이다.
항체: 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "항체"는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 그리고 키메라 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 항체는 재조합 공급원으로부터 유래되고 및/또는 유전자도입 동물에서 생산될 수 있다.
항체 결합 단편: 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "항체 결합 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이합체, 미니바디, 디아바디, 그리고 이들의 다합체 및 이중특이적 항체 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 전통적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있다. 가령, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 산출될 수 있다. 결과의 F(ab')2 단편은 Fab' 단편을 생산하기 위해 이황화 다리가 환원되도록 처리될 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성을 야기할 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이합체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 다른 단편은 또한, 재조합 기술에 의해 합성될 수 있다.
항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 그 이상으로 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 칸나비크로메닉산 신타아제 및/또는 고체 지지체 물질의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
항체는 조류 및 포유동물 (가령, 인간, 뮤린, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말, 또는 닭)을 비롯한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다.
항체는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 단리된 선천적 또는 재조합 폴리펩티드가 항체를 제조하는데 활용될 수 있다. 가령, 단일클론 항체의 제조에 대해 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods, 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci., 80:2026-2030; 그리고 Cole et al. (1984) Mol Cell Biol., 62:109-120; 단일클론 Fab 단편의 제조에 대해 Huse et al. (1989) Science, 246:1275-1281; 그리고, 항체를 확인하기 위한 파지미드 또는 B-림프구 면역글로불린 라이브러리의 제조에 대해 Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, N.J.를 참조한다.
코돈 축중성: 본 발명은 당업자에 의해 이해되고 표 1에서 예시된 바와 같은 코돈 사용빈도의 축중성을 아우르는 것으로 인지될 것이다. 코돈 최적화된 서열은 실시예 8에서 제공된다.
코돈 축중성
아미노산 코돈
Ala/A GCT, GCC, GCA, GCG
Arg/R CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Asn/N AAT, AAC
Asp/D GAT, GAC
Cys/C TGT, TGC
Gln/Q CAA, CAG
Glu/E GAA, GAG
Gly/G GGT, GGC, GGA, GGG
His/H CAT, CAC
Ile/I ATT, ATC, ATA
Leu/L TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG
Lys/K AAA, AAG
Met/M ATG
Phe/F TTT, TTC
Pro/P CCT, CCC, CCA, CCG
Ser/S TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
Thr/T ACT, ACC, ACA, ACG
Trp/W TGG
Tyr/Y TAT, TAC
Val/V GTT, GTC, GTA, GTG
시작 ATG
중지 TAG, TGA, TAA
보존성 치환: 게다가, 보존성 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 교란하지 않으면서 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 만들어질 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 보존성 아미노산 치환은 유사한 소수성, 극성 및 R-사슬 길이를 갖는 아미노산을 서로 대체함으로써 당업자에 의해 달성된다. 추가적으로, 상이한 종으로부터 동종 단백질의 정렬된 서열을 비교함에 의해, 보존성 아미노산 치환은 인코딩된 단백질의 기본 기능을 변경하지 않으면서 종 사이에 돌연변이된 아미노산 잔기를 위치결정함으로써 확인될 수 있다. 표 2는 보존성 치환의 예시적인 목록을 제공한다.
보존성 치환
아미노산의 유형 치환가능 아미노산
친수성 Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr
술프하이드릴 Cys
지방족 Val, Ile, Leu, Met
염기성 Lys, Arg, His
방향족 Phe, Tyr, Trp
상보성 뉴클레오티드 서열: 서열의 "상보성 뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드가 본 발명의 서열의 것들에 상보적이고, 그리고 방향이 역전되는 임의의 핵산 분자 (역평행 서열)를 의미하는 것으로 이해된다.
서열 상동성의 정도 또는 백분율: 용어 "서열 상동성의 정도 또는 백분율"은 최적 정렬 후 두 서열 사이에 서열 동일성의 정도 또는 백분율을 지칭한다. 서열 동일성의 백분율 (또는 동일성의 정도)은 비교 윈도우 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내에 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위해, 참조 서열 (이것은 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 양쪽 서열에서 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 발생하는 위치의 숫자를 결정하여 정합된 위치의 숫자를 산출하고, 정합된 위치의 숫자를 비교의 윈도우 내에 위치의 총수로 나누고, 그리고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
융합 분자: 용어 "융합 분자"는 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 (서열 번호: 2 또는 6)의 세포외 도메인 또는 도메인들로부터 유래된 펩티드 서열을 융합 상대에 연결한 것을 지칭하고, 그리고 공유 또는 비공유 연쇄를 통한 직접적인 또는 간접적인 연쇄일 수 있다. 융합 상대는 칸나비크로메닉산 신타아제로부터 유래된 펩티드 서열 (서열 번호: 2 또는 6)의 N 말단 또는 C 말단에 연결될 수 있다.
상동성 단리되고 및/또는 정제된 서열: "상동성 단리되고 및/또는 정제된 서열"은 뉴클레오티드 서열의 염기, 또는 폴리펩티드 서열의 아미노산과 최소한 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 또는 약 99.7%의 동일성 백분율을 갖는 단리되고 및/또는 정제된 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 백분율은 전적으로 통계학적이고, 그리고 이들 두 뉴클레오티드 서열 사이의 차이를 무작위로 및 그들의 전체 길이에 걸쳐 분배하는 것이 가능하다. 서열 동일성은 예로서, 단일 및 복수의 서열 정렬을 수행하도록 설계된 컴퓨터 프로그램에 의해 결정될 수 있다. 본 발명은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 코돈 사용빈도의 축중성을 아우르는 것으로 인지될 것이다. 게다가, 보존성 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 교란하지 않으면서 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 만들어질 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 보존성 치환은 유사한 소수성, 극성 및 R-사슬 길이를 갖는 아미노산을 서로 대체함으로써 당업자에 의해 달성된다. 추가적으로, 상이한 종으로부터 동종 단백질의 정렬된 서열을 비교함에 의해, 보존성 치환은 인코딩된 단백질의 기본 기능을 변경하지 않으면서 종 사이에 돌연변이된 아미노산 잔기를 위치결정함으로써 확인될 수 있다.
증가, 감소, 조정, 변경 또는 기타 유사한 것: 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이런 용어는 증가, 감소, 조정 또는 변경을 유발하는 변형이 없는 점을 제외하고 유사한 조건 하에 성장된 유사한 품종과의 비교를 지칭한다. 일부 경우에, 이것은 형질전환되지 않은 대조, 모의 형질전환된 대조, 또는 벡터-형질전환된 대조일 수 있다.
단리된: 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, "단리된"은 예로서, 바이러스, 단백질, 당단백질, 펩티드 유도체 또는 단편 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 그들의 선천적 환경으로부터 "단리된" 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 가령, 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "단리된 핵산 분자"는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실제적으로 없는 핵산을 지칭한다. 단리된 핵산은 또한, 상기 핵산이 유래되는 핵산의 측면에 자연적으로 접하는 서열 (즉, 상기 핵산의 5' 및 3' 단부에서 위치된 서열)이 실제적으로 없다.
시험관내 발현 시스템: 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "시험관내 발현 시스템"은 재조합 단백질 발현을 위한 시약 및 성분 (가령, 키트에서) 및/또는 상기 시약 및 성분을 포함하는 용액을 지칭하는 것으로 이해되고, 여기서 시험관내 발현 시스템은 무세포이고, 그리고 임의선택적으로 용액에서 전체 세포의 번역 적격성 추출물 및/또는 다른 번역 기계 시약 또는 성분을 임의선택적으로 포함하고, 상기 시약 및 성분은 보조인자 및 뉴클레오티드, 그리고 관심되는 특이적 유전자 주형으로 임의선택적으로 보충된 RNA 중합효소, 하나 또는 그 이상의 조절 단백질 인자, 하나 또는 그 이상의 전사 인자, 리보솜, 그리고 tRNA를 임의선택적으로 포함한다. 비정상적으로 발생하는 아미노산을 임의선택적으로 이용하는 화학 기초된 발현 시스템 역시 포함된다.
한 구체예에서, 시험관내 발현 시스템은 임의선택적으로 5' T7 프로모터와 함께, 이것의 하류에 단리된 폴리뉴클레오티드가 도입되는 벡터를 포함한다.
폴리뉴클레오티드, 또는 핵산 분자: "폴리뉴클레오티드, 또는 핵산 분자"는 단위체성 및 이합체성 (이른바 나란히) 형태에서 이중 가닥 또는 단일 가닥 및 이들의 전사 산물뿐만 아니라 상보성 핵산 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분자는 자연발생 염기, 당 및 당간 (중추) 연쇄로 구성되는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단위체의 서열을 포함한다. 상기 용어는 또한, 비자연발생 단위체 또는 이들의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 데옥시리보핵산 서열 (DNA) 또는 리보핵산 서열 (RNA)일 수 있고, 그리고 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 비롯한 자연발생 염기를 포함할 수 있다. 이들 서열은 또한, 변형된 염기를 내포할 수도 있다. 이런 변형된 염기의 실례는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 그리고 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한다. 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 cDNA이다.
단백질 또는 폴리펩티드: "단백질 또는 폴리펩티드"는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 잔기의 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 출원의 맥락 내에서, 본 발명의 폴리펩티드는 한 구체예에서, 일차 단백질의 다양한 구조적 형태를 포함한다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 산성 또는 염기성 염의 형태 또는 중성 형태일 수 있다. 이에 더하여, 개별 아미노산 잔기는 산화 또는 환원에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드는 또한, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 실제적으로 동일한 기능을 갖는, 예를 들면, 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는, 본원에서 설명된 바와 같은 단백질 및 폴리펩티드의 절두, 유사체 및 동족체를 포함할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 아래에 설명된 바와 같이 최대 상응을 위해 정렬될 때 이들 두 서열 내에 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 서열이 동일하면 "동일성" 인 것으로 일컬어진다. 2개 (또는 그 이상) 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 비교는 2개의 최적으로 정렬된 서열의 서열을 분절 또는 "비교 윈도우" 위에서 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith and Waterman, Ad. App. Math 2: 482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 그리고 TFASTA)에 의해, 또는 시각적 검사에 의해 수행될 수 있다.
상기 제공된 서열 동일성의 정의는 당업자에 의해 이용될 정의이다. 상기 정의는 그것만으로, 임의의 알고리즘의 도움을 필요로 하지 않고, 상기 알고리즘은 서열 동일성의 계산보다는 서열의 최적 정렬을 달성하는 데에만 도움이 된다.
상기 제공된 정의로부터, 2개의 비교된 서열 사이에 서열 동일성에 대한 충분히 규정된 단지 하나의 값만 있다는 결론이 나오는데, 상기 값은 최고 또는 최적 정렬에 대해 획득된 값에 상응한다.
이의 단편: 본원에서 이용된 바와 같이, "부분"과 교체가능하게 이용되는 용어 "이의 단편"은 관심되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 최대 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 25, 약 50, 약 100, 약 250 또는 약 500개의 인접한 잔기를 포함하는, 예를 들면, 서열 번호: 1의 최대 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 250, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 또는 약 1500개의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 서열 번호: 2의 최대 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 250, 약 300, 약 400, 또는 약 500개의 아미노산을 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
엄격한 혼성화: 엄격한 조건 하에 뉴클레오티드 서열과의 혼성화는 두 단편 사이에 상보성 핵산 분자의 혼성화의 유지를 허용하는 그와 같은 방식으로 선택된 온도 및 이온 강도의 조건 하에 혼성화를 의미하는 것으로 이해된다. 다른 생물체, 예를 들면, 식물로부터 획득된 본원에서 설명된 CBCAS 유전자의 동족체는 이들 동족체를 포함하는 적절한 라이브러리를 선별검사함으로써 획득될 수 있고, 여기서 선별검사는 본원에서 개시된 특정한 CBCAS 유전자의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 부분 또는 프로브로 수행되고, 또는 서열 정렬 검색 프로그램, 예를 들면, BLAST, FASTA를 이용한 서열 상동성 검색에 의해 확인될 수 있다.
용어 "형질전환된", "형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"은 당분야에서 공지된 많은 가능한 기술 중에서 한 가지에 의해, 핵산 (가령, 구조체)의 세포 내로의 도입을 포괄하는 것으로 의도된다.
단일 가닥 핵산 분자는 시토신 (C)과 염기쌍을 형성하는 구아닌 (G)의 능력 및 티민 (T) 또는 우리딘 (U)과 염기쌍을 형성하는 아데닌 (A)의 능력에 근거하여, 다른 핵산 분자의 전부 또는 일부와 염기쌍을 형성 (혼성화)하여 이중 나선 (이중 가닥 핵산 분자)을 형성할 수 있을 때, 다른 단일 가닥 핵산 분자에 상보적이다.
본 발명의 범위를 이해함에 있어서, 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "포함하는" 및 이의 유도체는 언급된 특질, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재를 명시하지만, 다른 언급되지 않은 특질, 요소, 성분, 군, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하지 않는 개방형 용어인 것으로 의도된다. 전술한 내용은 또한, 유사한 의미를 갖는 단어, 예를 들면, 용어 "내포하는", "갖는" 및 이들의 유도체에도 적용된다. 최종적으로, 본원에서 이용된 바와 같은 정도의 용어, 예를 들면, "실제적으로", "약" 및 "대략"은 최종 결과가 유의미하게 변하지 않도록, 수식된 용어의 편차의 합리적인 양을 의미한다. 정도의 이들 용어는 수식된 용어의 최소한 ± 10%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 하는데, 이러한 편차는 상기 용어가 수식하는 단어의 의미를 무효화시키지 않을 것이다.
본 발명의 범위를 이해함에 있어서, 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "구성되는" 및 이의 유도체는 언급된 특질, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재를 명시하고, 그리고 또한, 다른 언급되지 않은 특질, 요소, 성분, 군, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하는 폐쇄형 용어인 것으로 의도된다.
본원에서 종결점에 의한 수치 범위의 열거는 상기 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분율을 포함한다 (가령, 약 1 내지 약 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 그리고 5를 포함한다). 모든 숫자 및 이들의 분율은 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 추정되는 것으로 또한 이해된다. 게다가, 단수 관사 ("a," "an," 및 "the")는 문맥에서 명확하게 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 이해된다.
게다가, 특정 섹션에서 설명된 정의 및 구체예는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이들이 적합한 것으로 설명된 본원에서 다른 구체예에 적용가능한 것으로 의도된다. 가령, 다음의 단락에서, 본 발명의 상이한 양상이 더욱 상세하게 규정된다. 이렇게 규정된 각 양상은 명확하게 반대로 지시되지 않으면, 임의의 다른 양상 또는 양상들과 합동될 수 있다. 특히, 바람직하거나 또는 유리한 것으로 지시된 임의의 특질은 바람직하거나 또는 유리한 것으로 지시된 임의의 다른 특질 또는 특질들과 합동될 수 있다. 상기 개시는 본 출원을 전반적으로 설명한다. 더욱 완전한 이해는 다음의 특정한 실시예를 참조함으로써 획득될 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 설명되고, 그리고 본 출원의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 형태에서 변화 및 등가물의 치환은 상황에 따라 방편이 암시되거나 또는 만들어질 수도 있다는 것으로 예기된다. 비록 특정한 용어가 본원에서 이용되긴 했지만, 이런 용어는 서술적 의미에서 의도되고 제한을 목적으로 하지 않는다.
US 특허를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 본원에서 참조된 모든 공개적으로 가용한 문서는 명백하게 참조로서 편입된다.
다음의 무제한적 실시예는 본 발명을 예증한다.
실시예:
실시예 1: 대마초 유전체에서 CBCA 신타아제의 확인
대마초 유전체 서열 (van Bakel et al., 2011)은 BLAST 분석을 이용하여 THCA 신타아제에 높은 유사성을 갖는 유전자에 대해 분석되었다. 이것은 THCA 신타아제에 96% 뉴클레오티드 유사성을 갖는 유전자의 확인으로 이어졌다. 차후 생화학적 특징화에 근거하여, 이들 저자는 이러한 유전자를 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) 칸나비크로메닉산 신타아제 (CBCAS)로 명명하였다.
칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) 칸나비크로메닉산 신타아제 (CBCAS) - 1635 bp의 cDNA 서열은 서열 번호: 1에서 제공된다. 밑줄 표시된 서열은 서열 번호:5에서 결실된 서열에 관계한다. 서열 번호: 1은 전체 서열을 포함하거나 또는 밑줄 표시된 서열에서 3의 복제물 및/또는 코딩 프레임을 유지하기 위한 첫 번째 ATG가 결실될 수 있다.
ATGAATTGCTCAACATTCTCCTTTTGGTTTGTTTGCAAAATAATATTTTTCTTTCTCTCATTCAATATCCAAATTTCAATAGCTAATTGATAGATCAGCTGGGAAGAAGACGGCTTTCTCAATTAAGTTAGACTATGTTAAGAAACTAATACCTGAAACTGCAATGGTCAAAATTTTGGAAAAATTATATGAAGAAGAGGTAGGAGTTGGGATGTATGTGTTGTACCCTTACGGTGGTATAATGGATGAGATTTCAGAATCAGCAATTCCATTCCCTCATCGAGCTGGAATAATGTATGAACTTTGGTACACTGCTACCTGGGAGAAGCAAGAAGATAACGAAAAGCATATAAACTGGGTTCGAAGTGTTTATAATTTCACAACTCCTTATGTGTCCCAAAATCCAAGATTGGCGTATCTCAATTATAGGGACCTTGATTTAGGAAAAACTAATCCTGAGAGTCCTAATAATTACACACAAGCACGTATTTGGGGTGAAAAGTATTTTGGTAAAAATTTTAACAGGTTAGTTAAGGTGAAAACCAAAGCTGATCCCAATAATTTTTTTAGAAACGAACAAAGTATCCCACCTCTTCCACCGCGTCATCAT
칸나비스 사티바 (Cannabis sativa) 칸나비크로메닉산 신타아제 (CBCAS) - 545 aa의 개방 해독 형태의 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호: 2에서 제공된다 (그리고, 첫 28개 아미노산 중에서 전부 또는 일부를 포함할 수 있다).
MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIANPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHDQLY
MSVLNSTIQNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLS
YISQVPFAIVDLRNMHTVKVDIHSQTAWVEAGATLGEVYYWINEMNENFSFPGGYCPTVG
VGGHFSGGGYGALMRNYGLAADNIIDAHLVNVDGKVLDRKSMGEDLFWAIRGGGGENFGI
IAACKIKLVVVPSKATIFSVKKNMEIHGLVKLFNKWQNIAYKYDKDLMLTTHFRTRNITD
NHGKNKTTVHGYFSSIFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCKELSWIDTTIFYSGVVNY
NTANFKKEILLDRSAGKKTAFSIKLDYVKKLIPETAMVKILEKLYEEEVGVGMYVLYPYG
GIMDEISESAIPFPHRAGIMYELWYTATWEKQEDNEKHINWVRSVYNFTTPYVSQNPRLA
YLNYRDLDLGKTNPESPNNYTQARIWGEKYFGKNFNRLVKVKTKADPNNFFRNEQSIPPL
PPRHH
실시예 2: CBCAS의 클로닝 및 발현
CBCAS는 프라이머 5'-CTGCAGGAATGAATTGCTCAACATTCTCCT-3' (서열 번호: 3) 및 5'-AAGCTTTCATGGTACCCCATGATGACGCGGTGGAAGA-3' (서열 번호: 4)을 이용하여 대마초 유전체 DNA 단편으로부터 증폭되었다. 50 μL 반응물은 100 ng의 주형, 0.2 μM의 각 프라이머, Pfu Ultrall DNA 중합효소, 1x Pfu 반응 완충액 및 0.4 μM dNTP를 내포하였다. 주기 조건은 20 초 동안 95℃, 20 초 동안 55℃, 그리고 2 분 동안 75℃이었다. 산물은 정제되고, Taq 중합효소로 A-꼬리 잘리고, 그리고 pCR8/GW/TOPO 진입 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝되었다. 개별 집락은 단리되고, 스펙티노마이신으로 보충된 LB 배지에서 성장되고, 플라스미드 DNA가 Qiagen QiaPrep 키트를 이용하여 단리되고 생어 염기서열결정에 의해 실증되었다. CBCAS ORF는 Pstl 및 Kpnl을 이용하여 절제되고, 겔 전기이동에 의해 단리되고, 그리고 동일한 제한 효소로 절단되고 탈인산화된 lPICzαC (Invitrogen) 내로 클로닝되었다. 선천적 N 말단 분비 신호를 포함하는 전체 CBCA 신타아제 코딩 서열이 피치아 (Pichia) 발현 벡터의 작제에서 이용되었다.
상기 효소는 피치아 (Pichia) 세포로부터 단백질 분비를 담보하기 위한 벡터 인코딩된 알파-인자 신호 펩티드와의 N 말단 융합 산물로서 발현되었다. lPICzαC:CBCAS는 전기천공에 의해 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주 X33 (Invitrogen) 내로 형질전환되었다. 플레오마이신-내성 집락이 선택되고 최소 메탄올 평판 위에 줄무늬가 넣어지고, 이들 평판으로부터 단일 집락이 선발되고 50 mL의 변형된 BMGY 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 50 mP HEPES pH 6, 1.34% 효모 질소 염기, 4x10-5% 비오틴, 1% 글리세롤)를 접종하는데 이용되었고, 상기 배지는 2 일 동안 성장되었다. 이러한 배양액 중에서 대략 20 mL가 400 mL의 변형된 BMMY 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 50 mM HEPES pH 7, 1.34% 효모 질소 염기, 4x10-5% 비오틴, 1% 메탄올, 0.0001% 리보플라빈)를 1의 근사 초기 OD600까지 접종하는데 이용되었다. 배양액은 90 RPM에서 진탕하면서 20℃에서 4 일 동안 성장되었다. 메탄올이 1%의 최종 농도까지 24 시간 마다 첨가되었다. 4 일 후, 이들 세포는 원심분리 (20 분 동안 13k g)에 의해 배지로부터 제거되었고, 그리고 투명해진 배지는 2 μm 필터에 통과되고 얼음 위에서 보관되었다. 100 mL가 5 CV의 10 mM 인산나트륨 pH 7로 미리 평형화된 수산화인회석 카트리지 (BioRad Bio-Scale Mini CHT 유형 1, 40 μm 배지)에 90 mL h-1로 통과되었다. 2개의 카트리지가 병렬적으로 그와 같이 처리되었다. 이들 카트리지는 5 칼럼 용적의 10 mM 인산나트륨 pH 7로 세척되고, 그리고 이후, 일련의 FLCP 시스템 (
Figure pct00001
kta, Amersham Biosciences)에서 설치되었다. 단백질은 1.75 mL 분-1의 유속에서 20 칼럼 용적에서 10mM 인산나트륨 pH 7 내지 100% 500 mM 인산나트륨 pH 7의 선형 구배로 카트리지로부터 용리되었다. 5 mL 분획물이 수집되었다. 수산화인회석 카트리지를 재-평형시킨 후, 나머지 배지는 상기와 같이 처리되었고, 그리고 분획물은 이후 모아지고 CBCAS 활성에 대해 시험되었다.
실시예 3: CBCAS 검정
배지를 이용한 반응은 10 μmols CBGA를 500 μL의 투명해진 배양 배지에서 14 시간 동안 배양함으로써 수행되었다. 수산화인회석 분획물을 이용한 반응은 10 nmol의 CBGA와 함께 14 시간 동안 배양된 100 μL의 분획물로 수행되었다. 완결된 반응물은 한 방울의 4 N HCl로 산성화되고 400 μL의 아세토니트릴로 2회 추출되었다. 원심분리 후, 유기 상은 모아지고 증발 건조되었다. 산물은 20 μL의 50% 메탄올에서 재현탁되었고, 이 중에서 10 μL가 LCMS에 의해 분석되었다. 산물은 이성분 용매 시스템 (용매 A: 10% 아세토니트릴, 0.05% 포름산; 용매 B: 99.95% 아세토니트릴, 0.05% 포름산) 및 Ascnetis C18 5 cm x 2.1 mm 2.7 μm 칼럼 (Sigma)을 이용한 Waters Alliance HPLC로 분리되었다. 초기 조건: 0.25 mL/분에서 55% A. 0에서부터 8 분까지 5% A로 램프, 2.5 분 동안 5% A에서 유지, 2 분에 걸쳐 초기 조건으로 복귀, 그리고 초기 조건에서 7 분 동안 평형화. 자외선 스펙트럼은 200-350 nm에서 광다이오드 어레이 검출을 이용하여 획득되었다.
도면 2에서 보여지는 바와 같이, 재조합 CBCAS는 CBGA로부터 CBCA의 형성을 촉매작용하였다. 도면 3에서 보여지는 바와 같이, 재조합 CBCAS는 엔도글리코실라아제 (Endo Hf)로 처리 후 63 kDa의 겉보기 질량을 갖는다. 도면 4에서 보여지는 바와 같이, 재조합 CBCAS는 5.5의 pH 최적, 40도의 온도 최적을 갖고, 그리고 높은 농도의 DMSO 및 Triton X-100에 의해 저해된다.
pH 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 그리고 7에 대한 활성이 시험되었다. 하나 또는 그 이상의 완충액에서 pH 4 및 pH 6.5 사이에 활성이 있었다. 최대 활성은 pH 5 및 5.5에서 관찰되었다. 온도 35, 40, 45, 그리고 50 ℃에 대한 활성이 시험되었고, 최대 활성이 40 ℃에서 관찰되었다.
본 유전자는 대마초로부터 CBCAS 효소를 인코딩한다. 이러한 유전자는 재조합 식물의 교배, 표적화된 돌연변이유발, 또는 유전공학을 통해, 증강된 칸나비노이드 생산을 갖는 대마초 식물을 창출하는데 이용될 수 있었다. 이에 더하여, 대마초에서 이러한 유전자를 비활성화시거나 또는 침묵시키는 것이 칸나비노이드 생합성을 차단하고, 따라서 대마초 식물 (가령, 산업적 대마)에서 칸나비노이드, 예를 들면, CBC의 전구체인 CBCA의 생산을 감소시키는데 이용될 수 있었다. 이러한 유전자는 다른 식물에서 또는 미생물에서 칸나비노이드 생합성을 정교하게 설계하기 위해, 칸나비노이드 경로에서 다른 효소를 인코딩하는 유전자와 합동으로 이용될 수 있었다.
실시예 4
예측된 신호 서열을 결여하고 개시 코돈/개시 메티오닌을 포함하는 재조합 서열
서열 번호: 5
ATG------------------------------------------------------------------------------------CCTCAAGAAAAC TGGGAAGAAGACGGCTTTCTCAATTAAGTTAGACTATGTTAAGAAACTAATACCTGAAACTGCAATGGTCAAAATTTTGGAAAAATTATATGAAGAAGAGGTAGGAGTTGGGATGTATGTGTTGTACCCTTACGGTGGTATAATGGATGAGATTTCAGAATCAGCAATTCCATTCCCTCATCGAGCTGGAATAATGTATGAACTTTGGTACACTGCTACCTGGGAGAAGCAAGAAGATAACGAAAAGCATATAAACTGGGTTCGAAGTGTTTATAATTTCACAACTCCTTATGTGTCCCAAAATCCAAGATTGGCGTATCTCAATTATAGGGACCTTGATTTAGGAAAAACTAATCCTGAGAGTCCTAATAATTACACACAAGCACGTATTTGGGGTGAAAAGTATTTTGGTAAAAATTTTAACAGGTTAGTTAAGGTGAAAACCAAAGCTGATCCCAATAATTTTTTTAGAAACGAACAAAGTATCCCACCTCTTCCACCGCGTCATCAT
서열 번호: 6 - 점선은 결실된 서열을 나타낸다
M---------------------------NPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHDQLY
MSVLNSTIQNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLS
YISQVPFAIVDLRNMHTVKVDIHSQTAWVEAGATLGEVYYWINEMNENFSFPGGYCPTVG
VGGHFSGGGYGALMRNYGLAADNIIDAHLVNVDGKVLDRKSMGEDLFWAIRGGGGENFGI
IAACKIKLVVVPSKATIFSVKKNMEIHGLVKLFNKWQNIAYKYDKDLMLTTHFRTRNITD
NHGKNKTTVHGYFSSIFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCKELSWIDTTIFYSGVVNY
NTANFKKEILLDRSAGKKTAFSIKLDYVKKLIPETAMVKILEKLYEEEVGVGMYVLYPYG
GIMDEISESAIPFPHRAGIMYELWYTATWEKQEDNEKHINWVRSVYNFTTPYVSQNPRLA
YLNYRDLDLGKTNPESPNNYTQARIWGEKYFGKNFNRLVKVKTKADPNNFFRNEQSIPPL
PPRHH
서열 번호: 7
예측된 N 말단 신호 펩티드:
MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIA
실시예 5
코돈 최적화된 서열이 대장균 (E. coli) 및 효모에 대해 산출되었다.
대장균 (E. coli) 최적화된 서열
ATGAACTGCT CGACATTTAG TTTTTGGTTT GTGTGCAAGA TCATTTTTTT TTTTCTTTCG TTTAACATTC AGATTAGTAT TGCAAACCCG CAGGAGAACT TTCTCAAATG TTTTAGCGAA TATATCCCGA ACAACCCGGC CAACCCGAAA TTCATTTACA CACAACACGA TCAACTGTAC ATGAGCGTAT TGAACAGCAC CATCCAGAAT TTGCGCTTTA CTTCGGACAC AACGCCGAAG CCTCTGGTCA TCGTTACGCC CTCGAATGTT TCACATATCC AAGCGTCAAT TCTTTGTTCT AAAAAGGTCG GCCTGCAGAT TCGCACACGG TCGGGCGGCC ATGATGCCGA AGGTCTGTCT TACATCTCAC AAGTCCCTTT CGCAATCGTT GATTTGCGGA ACATGCACAC TGTAAAAGTT GATATTCACT CACAAACCGC TTGGGTCGAA GCAGGTGCCA CGCTTGGGGA AGTATATTAC TGGATTAACG AAATGAACGA GAATTTCTCG TTTCCAGGCG GTTACTGCCC AACCGTAGGT GTGGGCGGTC ATTTTTCCGG AGGCGGTTAT GGTGCGTTAA TGCGCAACTA TGGCCTGGCG GCAGACAATA TTATTGATGC CCACCTCGTT AATGTGGATG GTAAAGTACT GGATCGCAAA TCAATGGGTG AAGACCTCTT CTGGGCGATT CGTGGTGGGG GTGGCGAGAA CTTTGGTATC ATCGCGGCAT GTAAGATCAA GCTGGTGGTA GTTCCGTCTA AAGCGACCAT CTTTAGCGTG AAAAAAAACA TGGAGATTCA CGGCCTGGTA AAATTGTTCA ACAAATGGCA GAACATCGCT TACAAATACG ACAAAGATCT GATGTTAACG ACTCACTTCC GCACCCGTAA CATTACTGAC AATCACGGCA AAAATAAGAC TACTGTGCAT GGTTACTTTA GTAGTATCTT CCTGGGTGGA GTCGATTCCC TGGTCGATTT AATGAACAAG AGCTTTCCGG AGCTGGGGAT TAAAAAAACC GACTGTAAAG AGCTGAGTTG GATCGACACG ACGATCTTCT ACAGCGGAGT AGTCAACTAC AACACTGCCA ACTTTAAGAA AGAAATTCTG CTGGACCGCA GCGCAGGTAA AAAGACCGCC TTCTCCATCA AACTGGATTA CGTCAAAAAG CTGATTCCGG AAACAGCAAT GGTAAAGATT CTGGAAAAAC TGTATGAAGA AGAGGTTGGC GTTGGCATGT ATGTCTTATA TCCGTATGGG GGCATTATGG ATGAAATTTC TGAAAGTGCT ATTCCCTTCC CACACCGCGC GGGGATTATG TACGAACTGT GGTATACGGC CACGTGGGAA AAACAAGAGG ACAATGAGAA ACACATCAAC TGGGTTCGGT CAGTATATAA CTTTACCACC CCGTATGTCT CGCAGAACCC GCGTCTGGCG TATCTGAACT ATCGCGATCT TGATTTGGGT AAAACCAATC CGGAAAGCCC GAATAACTAC ACCCAGGCAC GCATTTGGGG GGAAAAATAT TTCGGGAAAA ACTTCAACCG GCTGGTGAAG GTGAAAACGA AGGCTGACCC GAATAACTTT TTTCGGAATG AACAAAGCAT TCCGCCGTTA CCGCCGCGCC ACCAC 서열 번호: 8)
대장균 (E. coli) 최적화된 서열은 서열 번호: 1과 75% 서열 동일성을 공유한다.
사카로미세스 (Saccharomyces) (효모) 최적화된 서열
ATGAATTGTA GTACTTTCTC TTTCTGGTTT GTTTGTAAGA TTATATTTTT TTTTCTTAGT TTCAATATAC AAATTTCAAT TGCAAACCCT CAAGAAAATT TCCTTAAGTG CTTTTCAGAA TATATCCCTA ATAATCCTGC AAACCCTAAA TTCATTTATA CACAACATGA TCAGTTATAT ATGTCTGTCT TAAACTCTAC CATTCAAAAT TTGAGGTTCA CGTCTGATAC AACCCCAAAG CCTTTAGTTA TCGTGACACC CTCTAACGTT AGTCATATTC AGGCTAGTAT CTTATGTTCA AAAAAAGTGG GTTTACAAAT CAGAACTAGG TCTGGTGGTC ATGACGCGGA AGGTCTGTCT TACATATCTC AGGTGCCGTT TGCAATCGTT GATCTACGTA ATATGCATAC AGTTAAAGTC GATATTCACT CTCAAACTGC ATGGGTCGAG GCTGGTGCCA CTCTAGGTGA AGTTTATTAC TGGATCAATG AAATGAACGA GAATTTTTCC TTCCCAGGTG GTTATTGTCC TACTGTGGGT GTAGGCGGAC ACTTTTCTGG CGGGGGGTAT GGTGCTTTGA TGAGGAACTA TGGTTTGGCC GCCGATAATA TAATTGACGC CCATCTTGTA AACGTCGACG GGAAGGTTCT GGACCGTAAA TCTATGGGTG AAGATTTATT CTGGGCGATA AGAGGTGGCG GGGGAGAGAA CTTTGGTATT ATCGCAGCTT GTAAGATTAA GTTAGTTGTT GTCCCCTCAA AAGCAACAAT TTTTTCAGTG AAGAAGAACA TGGAAATCCA CGGTTTGGTA AAACTGTTTA ATAAATGGCA GAATATTGCC TACAAATACG ATAAGGATTT GATGTTGACA ACACATTTCA GAACTAGAAA TATTACTGAC AACCACGGAA AGAACAAGAC AACCGTCCAT GGATATTTTA GTTCTATTTT CTTAGGCGGA GTTGATTCAC TAGTAGACTT AATGAACAAG TCTTTCCCCG AATTGGGAAT AAAAAAAACC GATTGCAAGG AATTATCCTG GATAGATACA ACAATATTCT ACTCTGGAGT CGTTAATTAT AATACGGCCA ACTTTAAGAA GGAAATATTA TTAGATCGTT CCGCAGGTAA AAAGACAGCT TTTTCCATAA AATTGGACTA CGTCAAAAAA TTAATTCCTG AGACAGCCAT GGTAAAAATA TTGGAAAAAT TGTACGAAGA GGAGGTAGGC GTGGGTATGT ATGTGTTATA CCCATACGGT GGTATTATGG ATGAAATTTC TGAGAGCGCT ATTCCCTTCC CCCATCGTGC AGGTATAATG TATGAATTAT GGTACACAGC AACATGGGAA AAACAAGAGG ATAACGAAAA GCATATTAAT TGGGTACGTA GTGTGTACAA CTTTACGACA CCTTACGTGT CCCAAAATCC AAGATTAGCG TATTTGAACT ATAGAGACTT AGATTTAGGT AAAACAAACC CTGAGTCTCC AAATAATTAC ACCCAAGCCA GGATTTGGGG TGAAAAATAC TTCGGCAAAA ATTTCAATAG ATTGGTTAAG GTAAAAACTA AGGCGGATCC AAACAATTTT TTTAGAAATG AGCAGAGTAT TCCGCCCCTG CCTCCAAGAC ACCAT (서열 번호: 9)
효모 최적화된 서열은 서열 번호: 1과 78% 서열 동일성을 공유한다.
상기 구조에 내재하는 다른 이점은 당업자에게 명백하다. 이들 구체예는 본원에서 예시적으로 설명되고 청구된 바와 같은 발명의 범위를 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 전술한 구체예의 변이는 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 본 발명자에 의해 다음 청구항에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
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tggccttgcg 600 gctgataata tcattgatgc acacttagtc aatgttgatg gaaaagttct agatcgaaaa 660 tccatgggag aagatctatt ttgggctata cgtggtggag gaggagaaaa ctttggaatc 720 attgcagcat gtaaaatcaa acttgttgtt gtcccatcaa aggctactat attcagtgtt 780 aaaaagaaca tggagataca tgggcttgtc aagttattta acaaatggca aaatattgct 840 tacaagtatg acaaagattt aatgctcacg actcacttca gaactaggaa tattacagat 900 aatcatggga agaataagac tacagtacat ggttacttct cttccatttt tcttggtgga 960 gtggatagtc tagttgactt gatgaacaag agctttcctg agttgggtat taaaaaaact 1020 gattgcaaag aattgagctg gattgataca accatcttct acagtggtgt tgtaaattac 1080 aacactgcta attttaaaaa ggaaattttg cttgatagat cagctgggaa gaagacggct 1140 ttctcaatta agttagacta tgttaagaaa ctaatacctg aaactgcaat ggtcaaaatt 1200 ttggaaaaat tatatgaaga agaggtagga gttgggatgt atgtgttgta cccttacggt 1260 ggtataatgg atgagatttc agaatcagca attccattcc ctcatcgagc tggaataatg 1320 tatgaacttt ggtacactgc tacctgggag aagcaagaag ataacgaaaa gcatataaac 1380 tgggttcgaa gtgtttataa tttcacaact ccttatgtgt cccaaaatcc aagattggcg 1440 tatctcaatt atagggacct tgatttagga aaaactaatc ctgagagtcc taataattac 1500 acacaagcac gtatttgggg tgaaaagtat tttggtaaaa attttaacag gttagttaag 1560 gtgaaaacca aagctgatcc caataatttt tttagaaacg aacaaagtat cccacctctt 1620 ccaccgcgtc atcat 1635 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Cannabis Sativa <400> 2 Met Asn Cys Ser Thr Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe 1 5 10 15 Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Ile Ala Asn Pro Gln Glu 20 25 30 Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Glu Tyr Ile Pro Asn Asn Pro Ala Asn 35 40 45 Pro Lys Phe Ile Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val Leu 50 55 60 Asn Ser Thr Ile Gln Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp Thr Thr Pro Lys 65 70 75 80 Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser Asn Val Ser His Ile Gln Ala Ser 85 90 95 Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg Thr Arg Ser Gly 100 105 110 Gly His Asp Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Ile Ser Gln Val Pro Phe Ala 115 120 125 Ile Val Asp Leu Arg Asn Met His Thr Val Lys Val Asp Ile His Ser 130 135 140 Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr 145 150 155 160 Trp Ile Asn Glu Met Asn Glu Asn Phe Ser Phe Pro Gly Gly Tyr Cys 165 170 175 Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala 180 185 190 Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Ile Asp Ala His 195 200 205 Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu 210 215 220 Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asn Phe Gly Ile 225 230 235 240 Ile Ala Ala Cys Lys Ile Lys Leu Val Val Val Pro Ser Lys Ala Thr 245 250 255 Ile Phe Ser Val Lys Lys Asn Met Glu Ile His Gly Leu Val Lys Leu 260 265 270 Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu Met 275 280 285 Leu Thr Thr His Phe Arg Thr Arg Asn Ile Thr Asp Asn His Gly Lys 290 295 300 Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Ser Ile Phe Leu Gly Gly 305 310 315 320 Val Asp Ser Leu Val Asp Leu Met Asn Lys Ser Phe Pro Glu Leu Gly 325 330 335 Ile Lys Lys Thr Asp Cys Lys Glu Leu Ser Trp Ile Asp Thr Thr Ile 340 345 350 Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Tyr Asn Thr Ala Asn Phe Lys Lys Glu 355 360 365 Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys Thr Ala Phe Ser Ile Lys 370 375 380 Leu Asp Tyr Val Lys Lys Leu Ile Pro Glu Thr Ala Met Val Lys Ile 385 390 395 400 Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Val Gly Val Gly Met Tyr Val Leu 405 410 415 Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Asp Glu Ile Ser Glu Ser Ala Ile Pro 420 425 430 Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Met Tyr Glu Leu Trp Tyr Thr Ala Thr 435 440 445 Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Ile Asn Trp Val Arg Ser 450 455 460 Val Tyr Asn Phe Thr Thr Pro Tyr Val Ser Gln Asn Pro Arg Leu Ala 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Lys Thr Asn Pro Glu Ser 485 490 495 Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu Lys Tyr Phe Gly 500 505 510 Lys Asn Phe Asn Arg Leu Val Lys Val Lys Thr Lys Ala Asp Pro Asn 515 520 525 Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro Pro Arg His 530 535 540 His 545 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Cannabis Sativa <400> 3 ctgcaggaat gaattgctca acattctcct 30 <210> 4 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acacttagtc aatgttgatg gaaaagttct agatcgaaaa 660 tccatgggag aagatctatt ttgggctata cgtggtggag gaggagaaaa ctttggaatc 720 attgcagcat gtaaaatcaa acttgttgtt gtcccatcaa aggctactat attcagtgtt 780 aaaaagaaca tggagataca tgggcttgtc aagttattta acaaatggca aaatattgct 840 tacaagtatg acaaagattt aatgctcacg actcacttca gaactaggaa tattacagat 900 aatcatggga agaataagac tacagtacat ggttacttct cttccatttt tcttggtgga 960 gtggatagtc tagttgactt gatgaacaag agctttcctg agttgggtat taaaaaaact 1020 gattgcaaag aattgagctg gattgataca accatcttct acagtggtgt tgtaaattac 1080 aacactgcta attttaaaaa ggaaattttg cttgatagat cagctgggaa gaagacggct 1140 ttctcaatta agttagacta tgttaagaaa ctaatacctg aaactgcaat ggtcaaaatt 1200 ttggaaaaat tatatgaaga agaggtagga gttgggatgt atgtgttgta cccttacggt 1260 ggtataatgg atgagatttc agaatcagca attccattcc ctcatcgagc tggaataatg 1320 tatgaacttt ggtacactgc tacctgggag aagcaagaag ataacgaaaa gcatataaac 1380 tgggttcgaa gtgtttataa tttcacaact ccttatgtgt cccaaaatcc aagattggcg 1440 tatctcaatt atagggacct tgatttagga aaaactaatc ctgagagtcc taataattac 1500 acacaagcac gtatttgggg tgaaaagtat tttggtaaaa attttaacag gttagttaag 1560 gtgaaaacca aagctgatcc caataatttt tttagaaacg aacaaagtat cccacctctt 1620 ccaccgcgtc atcat 1635 <210> 6 <211> 545 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Asn or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Cys or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Phe or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Phe or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Trp or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Phe or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Val or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Cys or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Lys or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(15) <223> Ile or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(18) <223> Phe or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Leu or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Phe or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Asn or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Ile or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Glu or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Ile or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Ile or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Ala or absent <400> 6 Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Pro Gln Glu 20 25 30 Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Glu Tyr Ile Pro Asn Asn Pro Ala Asn 35 40 45 Pro Lys Phe Ile Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val Leu 50 55 60 Asn Ser Thr Ile Gln Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp Thr Thr Pro Lys 65 70 75 80 Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser Asn Val Ser His Ile Gln Ala Ser 85 90 95 Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg Thr Arg Ser Gly 100 105 110 Gly His Asp Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Ile Ser Gln Val Pro Phe Ala 115 120 125 Ile Val Asp Leu Arg Asn Met His Thr Val Lys Val Asp Ile His Ser 130 135 140 Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr 145 150 155 160 Trp Ile Asn Glu Met Asn Glu Asn Phe Ser Phe Pro Gly Gly Tyr Cys 165 170 175 Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala 180 185 190 Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Ile Asp Ala His 195 200 205 Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu 210 215 220 Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asn Phe Gly Ile 225 230 235 240 Ile Ala Ala Cys Lys Ile Lys Leu Val Val Val Pro Ser Lys Ala Thr 245 250 255 Ile Phe Ser Val Lys Lys Asn Met Glu Ile His Gly Leu Val Lys Leu 260 265 270 Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu Met 275 280 285 Leu Thr Thr His Phe Arg Thr Arg Asn Ile Thr Asp Asn His Gly Lys 290 295 300 Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Ser Ile Phe Leu Gly Gly 305 310 315 320 Val Asp Ser Leu Val Asp Leu Met Asn Lys Ser Phe Pro Glu Leu Gly 325 330 335 Ile Lys Lys Thr Asp Cys Lys Glu Leu Ser Trp Ile Asp Thr Thr Ile 340 345 350 Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Tyr Asn Thr Ala Asn Phe Lys Lys Glu 355 360 365 Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys Thr Ala Phe Ser Ile Lys 370 375 380 Leu Asp Tyr Val Lys Lys Leu Ile Pro Glu Thr Ala Met Val Lys Ile 385 390 395 400 Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Val Gly Val Gly Met Tyr Val Leu 405 410 415 Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Asp Glu Ile Ser Glu Ser Ala Ile Pro 420 425 430 Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Met Tyr Glu Leu Trp Tyr Thr Ala Thr 435 440 445 Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Ile Asn Trp Val Arg Ser 450 455 460 Val Tyr Asn Phe Thr Thr Pro Tyr Val Ser Gln Asn Pro Arg Leu Ala 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Lys Thr Asn Pro Glu Ser 485 490 495 Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu Lys Tyr Phe Gly 500 505 510 Lys Asn Phe Asn Arg Leu Val Lys Val Lys Thr Lys Ala Asp Pro Asn 515 520 525 Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro Pro Arg His 530 535 540 His 545 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Cannabis Sativa <400> 7 Met Asn Cys Ser Thr Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe 1 5 10 15 Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Ile Ala 20 25 <210> 8 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 atgaactgct cgacatttag tttttggttt gtgtgcaaga tcattttttt ttttctttcg 60 tttaacattc agattagtat tgcaaacccg caggagaact ttctcaaatg ttttagcgaa 120 tatatcccga acaacccggc caacccgaaa ttcatttaca cacaacacga tcaactgtac 180 atgagcgtat tgaacagcac catccagaat ttgcgcttta cttcggacac aacgccgaag 240 cctctggtca tcgttacgcc ctcgaatgtt tcacatatcc aagcgtcaat tctttgttct 300 aaaaaggtcg gcctgcagat tcgcacacgg tcgggcggcc atgatgccga aggtctgtct 360 tacatctcac aagtcccttt cgcaatcgtt gatttgcgga acatgcacac tgtaaaagtt 420 gatattcact cacaaaccgc ttgggtcgaa gcaggtgcca cgcttgggga agtatattac 480 tggattaacg aaatgaacga gaatttctcg tttccaggcg gttactgccc aaccgtaggt 540 gtgggcggtc atttttccgg aggcggttat ggtgcgttaa tgcgcaacta tggcctggcg 600 gcagacaata ttattgatgc ccacctcgtt aatgtggatg gtaaagtact ggatcgcaaa 660 tcaatgggtg aagacctctt ctgggcgatt cgtggtgggg gtggcgagaa ctttggtatc 720 atcgcggcat gtaagatcaa gctggtggta gttccgtcta aagcgaccat ctttagcgtg 780 aaaaaaaaca tggagattca cggcctggta aaattgttca acaaatggca gaacatcgct 840 tacaaatacg acaaagatct gatgttaacg actcacttcc gcacccgtaa cattactgac 900 aatcacggca aaaataagac tactgtgcat ggttacttta gtagtatctt cctgggtgga 960 gtcgattccc tggtcgattt aatgaacaag agctttccgg agctggggat taaaaaaacc 1020 gactgtaaag agctgagttg gatcgacacg acgatcttct acagcggagt agtcaactac 1080 aacactgcca actttaagaa agaaattctg ctggaccgca gcgcaggtaa aaagaccgcc 1140 ttctccatca aactggatta cgtcaaaaag ctgattccgg aaacagcaat ggtaaagatt 1200 ctggaaaaac tgtatgaaga agaggttggc gttggcatgt atgtcttata tccgtatggg 1260 ggcattatgg atgaaatttc tgaaagtgct attcccttcc cacaccgcgc ggggattatg 1320 tacgaactgt ggtatacggc cacgtgggaa aaacaagagg acaatgagaa acacatcaac 1380 tgggttcggt cagtatataa ctttaccacc ccgtatgtct cgcagaaccc gcgtctggcg 1440 tatctgaact atcgcgatct tgatttgggt aaaaccaatc cggaaagccc gaataactac 1500 acccaggcac gcatttgggg ggaaaaatat ttcgggaaaa acttcaaccg gctggtgaag 1560 gtgaaaacga aggctgaccc gaataacttt tttcggaatg aacaaagcat tccgccgtta 1620 ccgccgcgcc accac 1635 <210> 9 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 atgaattgta gtactttctc tttctggttt gtttgtaaga ttatattttt ttttcttagt 60 ttcaatatac aaatttcaat tgcaaaccct caagaaaatt tccttaagtg cttttcagaa 120 tatatcccta ataatcctgc aaaccctaaa ttcatttata cacaacatga tcagttatat 180 atgtctgtct taaactctac cattcaaaat ttgaggttca cgtctgatac aaccccaaag 240 cctttagtta tcgtgacacc ctctaacgtt agtcatattc aggctagtat cttatgttca 300 aaaaaagtgg gtttacaaat cagaactagg tctggtggtc atgacgcgga aggtctgtct 360 tacatatctc aggtgccgtt tgcaatcgtt gatctacgta atatgcatac agttaaagtc 420 gatattcact ctcaaactgc atgggtcgag gctggtgcca ctctaggtga agtttattac 480 tggatcaatg aaatgaacga gaatttttcc ttcccaggtg gttattgtcc tactgtgggt 540 gtaggcggac acttttctgg cggggggtat ggtgctttga tgaggaacta tggtttggcc 600 gccgataata taattgacgc ccatcttgta aacgtcgacg ggaaggttct ggaccgtaaa 660 tctatgggtg aagatttatt ctgggcgata agaggtggcg ggggagagaa ctttggtatt 720 atcgcagctt gtaagattaa gttagttgtt gtcccctcaa aagcaacaat tttttcagtg 780 aagaagaaca tggaaatcca cggtttggta aaactgttta ataaatggca gaatattgcc 840 tacaaatacg ataaggattt gatgttgaca acacatttca gaactagaaa tattactgac 900 aaccacggaa agaacaagac aaccgtccat ggatatttta gttctatttt cttaggcgga 960 gttgattcac tagtagactt aatgaacaag tctttccccg aattgggaat aaaaaaaacc 1020 gattgcaagg aattatcctg gatagataca acaatattct actctggagt cgttaattat 1080 aatacggcca actttaagaa ggaaatatta ttagatcgtt ccgcaggtaa aaagacagct 1140 ttttccataa aattggacta cgtcaaaaaa ttaattcctg agacagccat ggtaaaaata 1200 ttggaaaaat tgtacgaaga ggaggtaggc gtgggtatgt atgtgttata cccatacggt 1260 ggtattatgg atgaaatttc tgagagcgct attcccttcc cccatcgtgc aggtataatg 1320 tatgaattat ggtacacagc aacatgggaa aaacaagagg ataacgaaaa gcatattaat 1380 tgggtacgta gtgtgtacaa ctttacgaca ccttacgtgt cccaaaatcc aagattagcg 1440 tatttgaact atagagactt agatttaggt aaaacaaacc ctgagtctcc aaataattac 1500 acccaagcca ggatttgggg tgaaaaatac ttcggcaaaa atttcaatag attggttaag 1560 gtaaaaacta aggcggatcc aaacaatttt tttagaaatg agcagagtat tccgcccctg 1620 cctccaagac accat 1635

Claims (17)

  1. 다음을 포함하는 단리된 핵산 분자:
    i) 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호: 2 또는 6에 최소한 96% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    ii) 서열 번호: 1 또는 5에 최소한 96%, 96% 이상 또는 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
    iii) 서열 번호: 1, 5 또는 8 또는 9에 최소한 78%, 78% 이상 또는 약 78% 서열 동일성을 갖고, 그리고 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    iv) i), ii) 또는 iii)의 보체인 뉴클레오티드 서열; 또는
    v) i), ii), iii) 또는 iv)의 15개 이상, 최소한 15개 또는 약 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는, i), ii), iii) 또는 iv) 중에서 한 가지의 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1, 3, 4, 또는 5 또는 이들의 코돈 축중성 뉴클레오티드 서열에서 진술된 바와 같고, 임의선택적으로 여기서 코돈 축중성 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 8 또는 9에서 진술된 서열, 또는 전술한 것들 중에서 한 가지의 보체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  3. 칸나비크로메닉산 신타아제 활성을 갖고, 그리고 서열 번호: 2 또는 6의 전부 또는 단편에 최소한 약 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  4. 청구항 3에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호: 2 또는 6에서 진술된 바와 같은 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  5. 청구항 1 또는 2의 단리된 핵산 분자 또는 청구항 3 또는 4의 단리된 폴리펩티드, 여기서 단리된 핵산 분자 또는 단리된 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 이종성 모이어티, 임의선택적으로 링커, 신호 서열, 검출가능한 라벨 또는 태그, 예를 들면, 정제 태그 중에서 하나 또는 그 이상에 연계됨.
  6. 청구항 1 또는 2에서 규정된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 구조체 또는 시험관내 발현 시스템.
  7. 청구항 1, 2 또는 5 중에서 어느 한 항의 단리된 핵산 분자 또는 청구항 6의 구조체를 포함하고 및/또는 청구항 3 내지 5 중에서 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드를 발현하는 생물체, 세포 또는 조직.
  8. 생물체, 세포 또는 조직에서 칸나비노이드 화합물의 수준을 조정하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    i) 청구항 1, 2 또는 5에서 규정된 바와 같은 핵산 분자, 또는 최소한 5개의 인접한 아미노산을 인코딩하는 이의 단편을 생물체, 세포 또는 조직 내에 도입하고 이를 발현하여 칸나비노이드 화합물의 수준을 감소시키는 단계, 임의선택적으로 여기서 상기 핵산 분자는 칸나비크로메닉산 신타아제 유전자를 침묵시키기 위해 구조체 내에 포함되고; 또는
    ii) 청구항 1, 2 또는 5에서 규정된 바와 같은 핵산 분자 또는 청구항 6의 구조체를 생물체, 세포 또는 조직 내에 도입하고 이를 발현하거나 또는 과다발현하여 칸나비노이드 화합물의 수준을 증가시키는 단계.
  9. 청구항 7의 생물체 또는 청구항 8의 방법, 여기서 생물체는 미생물임.
  10. 청구항 9의 생물체 또는 방법, 여기서 미생물은 효모 또는 대장균 (E. coli)임.
  11. 청구항 8ii, 9 또는 10 중에서 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 칸나비노이드 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 다른 핵산의 발현 또는 과다발현과 합동으로, 발현되거나 또는 과다발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 칸나비노이드 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소는 헥사노일 CoA 합성효소, 올리베톨릭산 시클라아제, THCA 신타아제, CBDA 신타아제, 또는 방향족 프레닐전달효소 PT1 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 8 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 칸나비노이드 중에서 하나 또는 그 이상, 임의선택적으로 칸나비게롤릭산, 칸나비게롤, △9-테트라히드로칸나비놀산, 칸나비디올산, 칸나비크로메닉산, △9-테트라히드로칸나비놀, 칸나비디올, 칸나비크로멘 및 칸나비디올, 또는 메틸 또는 프로필 측쇄를 갖는 이들 화합물의 변이체가 조정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 3 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이의 최소한 5개의 인접한 아미노산의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  15. (a) 청구항 1, 2, 또는 5에 따른 단리된 핵산; (b) 청구항 3, 4 또는 5에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 6의 구조체; 청구항 7, 9 또는 10의 세포, 생물체 또는 조직; 및/또는 (c) 청구항 14에 따른 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 항체는 단일클론, 다중클론, 키메라 또는 인간화 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이합체, 미니바디, 디아바디, 또는 이들의 다합체 또는 이중특이적 항체 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
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