KR20190023088A

KR20190023088A - 세포의 배양 방법, 현탁된 세포의 제거 방법 및 현탁된 세포를 사멸시키는 방법

Info

Publication number: KR20190023088A
Application number: KR1020197002157A
Authority: KR
Inventors: 마사히코 하기하라; 신사쿠 후세; 모토히사 시미즈; 유키노리 와다
Original assignee: 우베 고산 가부시키가이샤
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-03-07
Also published as: CA3031914A1; EP3489351A4; JP6773117B2; AU2017303597A1; EP3489351A1; WO2018021367A1; CN109563476B; CA3031914C; CN109563476A; SG11201900715QA; KR102216979B1; US20190264150A1; JPWO2018021367A1

Abstract

본 발명은, 세포의 배양 방법으로서, (1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지에, 세포 배양 모듈을 적용하는 공정, (2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 세포 배양 모듈에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및 (3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 세포 배양 모듈을, 배양 용기 내에서, 제2 배지로 배양하는 공정을 포함하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통된 상기 방법을 제공한다.

Description

세포의 배양 방법, 현탁된 세포의 제거 방법 및 현탁된 세포를 사멸시키는 방법

본 발명은 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 현탁된 세포의 제거 방법에 관한 것이다. 또한, 현탁된 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

최근, 치료나 백신에 이용되는 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인, 바이러스(바이러스 단백질) 등의 단백질이 배양 세포를 이용하여 공업적으로 생산되고 있다. 그러나, 이러한 단백질의 생산 기술은 비용이 높아, 이것이 의료비를 끌어올리고 있었다. 그 때문에, 대폭적인 비용 절감을 목표로 하여, 고밀도로 세포를 배양하는 기술이나 단백질의 생산량을 증대시키는 혁신적인 기술이 요구되고 있었다.

단백질을 생산하는 세포로서, 배양 기재에 접착하는 부착 의존성의 접착 세포가 이용되는 경우가 있다. 이러한 세포는 부착 의존적으로 증식하기 때문에, 샤알레, 플레이트 또는 챔버의 표면에 접착시켜 배양할 필요가 있다. 종래, 이러한 접착 세포를 대량으로 배양하기 위해서는, 접착하기 위한 표면적을 크게 할 필요가 있었다. 그런데, 배양 면적을 크게 하기 위해서는 공간을 필연적으로 증대시킬 필요가 있어, 그것이 비용을 증대시키는 요인이 되고 있었다.

배양 공간을 작게 하면서 접착 세포를 대량으로 배양하는 방법으로서, 미소 다공을 갖는 담체, 특히 마이크로캐리어를 이용한 배양법이 개발되어 있다(예컨대 특허문헌 1). 마이크로캐리어를 이용한 세포 배양계는, 마이크로캐리어가 상호 응집하지 않게 하기 위해서 충분히 교반·확산될 필요가 있다. 그 때문에, 마이크로캐리어를 분산시킨 배지를 충분히 교반·확산할 수 있을 만큼의 용적이 필요하게 되기 때문에, 배양할 수 있는 세포의 밀도에는 상한이 있다. 또한, 마이크로캐리어와 배지를 분리하기 위해서는, 미세한 입자를 분별할 수 있는 필터로 분리시킬 필요가 있어, 그것이 비용을 증대시키는 원인으로도 되고 있었다. 이러한 상황에서, 고밀도의 세포를 배양하는 혁신적인 세포 배양의 방법론이 요구되고 있었다.

<폴리이미드 다공질막>

폴리이미드 다공질막은, 본 출원 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도를 위해서 이용되어 왔다. 특허문헌 2∼4는, 특히, 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공공률(空孔率)이 높고, 양 표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높으며, 공공률이 높음에도 불구하고 막 두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력이 우수한 매크로보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다. 이들은 모두 아믹산을 경유하여 작성된 폴리이미드 다공질막이다.

세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는 세포의 배양 방법이 보고되어 있다(특허문헌 5).

특허문헌 1: 국제공개 제2003/054174호 특허문헌 2: 국제공개 제2010/038873호 특허문헌 3: 일본 특허공개 2011-219585호 공보 특허문헌 4: 일본 특허공개 2011-219586호 공보 특허문헌 5: 국제공개 제2015/012415호

본 발명은 세포의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 현탁된 세포의 제거 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 현탁된 세포를 사멸시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 추가로, 본 발명은 세포 배양 모듈을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 소정의 구조를 갖는 폴리머 다공질막이 세포의 대량 배양 및 세포의 제거에 적합하다는 것을 알아냈다. 또한, 소정의 구조를 갖는 폴리머 다공질막이 소정의 조건에서는 세포를 사멸시키기에 적합하다는 것을 알아냈다. 즉, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.

[1] 세포의 배양 방법으로서,

(1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지에, 세포 배양 모듈을 적용하는 공정,

(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 세포 배양 모듈에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및

(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 세포 배양 모듈을, 배양 용기에서, 제2 배지로 배양하는 공정

을 포함하고,

여기서, 상기 세포 배양 모듈이

폴리머 다공질막과

2 이상의 배지 유출입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱

을 구비한 세포 배양 모듈이고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고,

여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,

수용되어 있으며,

여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는 방법.

[2] 상기 배지 유출입구의 직경이 상기 세포의 직경보다 크며 또한 상기 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 [1]에 기재한 방법.

[3] 상기 케이싱이 메쉬형의 구조를 갖는 [1] 또는 [2]에 기재한 방법.

[4] 상기 케이싱이 비가요성 소재로 이루어지는 [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[5] 상기 공정 (2)가 정치, 진탕 및/또는 교반하면서 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정인 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[6] 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 상기 배양 용기 내에 연속적 또는 간헐적으로 공급되는 계에서 행해지는 [1]∼[5] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[7] 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 폴리머 다공질막의 일부분이 세포 배양 배지의 액상과 접촉하지 않는 배양인 [1]∼[6] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[8] 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 배양 용기가 가요성 백형 배양 용기인 [1]∼[7] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[9] 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 배양 용기가 교반 배양형 용기인 [1]∼[7] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[10] 상기 폴리머 다공질막이 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[11] 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 [1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[12] 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 [1]∼[11] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[13] 상기 폴리머 다공질막의 총 막 두께가 5∼500 ㎛인 [1]∼[12] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[14] 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[15] 상기 폴리이미드 다공질막이 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 [14]에 기재한 방법.

[16] 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 [14] 또는 [15]에 기재한 방법.

[17] 상기 폴리머 다공질막이 폴리에테르술폰(PES) 다공질막인 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[18] 상기 세포가 접착 세포인 [1]∼[17] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[19] 상기 세포가 CHO 세포, Vero 세포 및 MDCK 세포, 섬유아세포로 이루어지는 군에서 선택되는 [1]∼[18] 중 어느 한 항에 기재한 방법.

[20] 현탁된 세포의 제거 방법으로서,

(1) 현탁된 세포를 포함하는 배지에, 폴리머 다공질막을 적용하는 공정,

(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정

을 포함하고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖는 방법.

[21] 현탁된 세포를 사멸시키는 방법으로서,

(1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지에, 폴리머 다공질막을 적용하는 공정,

(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및

(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 폴리머 다공질막을 배양 용기 중의 제2 배지에 부유시키고, 상기 폴리머 다공질막을 계속적으로 형태 변화시켜 배양하는 공정

을 포함하고,

여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는 방법.

[22] 폴리머 다공질막과,

을 구비한 세포 배양 모듈로서,

여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,

수용되어 있는 세포 배양 모듈.

[23] 상기 배지 유출입구의 직경이 상기 세포의 직경보다 크며 또한 상기 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 [22]에 기재한 세포 배양 모듈.

[24] 상기 케이싱이 메쉬형 구조를 갖는 [22] 또는 [23]에 기재한 세포 배양 모듈.

[25] 상기 케이싱이 비가요성 소재로 이루어지는 [22]∼[24] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[26] 상기 폴리머 다공질막이 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 [22]∼[25] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[27] 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 [22]∼[26] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[28] 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 [22]∼[27] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[29] 상기 폴리머 다공질막의 총 막 두께가 5∼500 ㎛인 [22]∼[28] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[30] 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 [22]∼[29] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

[31] 상기 폴리이미드 다공질막이 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 [30]에 기재한 세포 배양 모듈.

[32] 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 [30] 또는 [31]에 기재한 세포 배양 모듈.

[33] 상기 폴리머 다공질막이 폴리에테르술폰(PES) 다공질막인 [22]∼[29] 중 어느 한 항에 기재한 세포 배양 모듈.

본 발명에 의해서, 현탁된 세포를 효율적으로 흡착하고, 종래의 부유 배양 용기를 이용하여 안정적으로 배양할 수 있게 된다. 또한, 본 발명에 의해서, 종래와 같은 필터막을 이용하지 않고서 간편하게 세포를 제거할 수 있게 된다. 더욱이, 본 발명의 폴리머 다공질막을 이용하여, 현탁된 세포를 흡착시킨 후, 폴리머 다공질막을 계속적으로 형태 변화하는 상태로 배양하면, 간편하게 세포를 사멸시켜, 세포 내에 발현된 단백질을 유리시킨 배지를 얻을 수 있게 된다. 더욱이, 케이싱에 수용되어 모듈화된 폴리머 다공질막을 이용함으로써, 현탁된 세포가 간단하게 흡착되어, 간편하면서 또한 안정적으로 세포를 배양할 수 있게 된다.

도 1은 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다.
도 2는 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다.
도 3은 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. (A) 메쉬형의 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다. (B) 메쉬형의 네트와 골조로 이루어지는 케이싱의 일 실시양태를 도시한다.
도 4는 스피너 플라스크 내에서 세포 배양 모듈을 적용할 때에 병용하는 디바이스의 실시양태를 도시한다. (A) 회전형 디바이스. 세포 배양 모듈을 적용한 상기 디바이스를 스피너 플라스크 내에 설치하고, 이 회전형 디바이스 자체를 회전시켜 사용한다. (B) 고정형 디바이스. 세포 배양 모듈을 적용한 상기 디바이스를 스피너 플라스크의 바닥부에 설치한다. 디바이스 중앙의 공간에서 스피너 플라스크의 스터러를 회전시켜 사용한다.
도 5는 가요성 백형 배양 용기에 세포 배양 모듈을 적용하여 배양한 일 실시양태를 도시한다. 배양 시작(좌측)에서부터 1시간에 배양액의 페놀 레드가 황색으로 변화되었다(우측).
도 6은 진탕 배양 시의 메쉬 모듈 사용의 일 실시양태를 도시한다.
도 7은 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도시한다.
도 8은 실시예 1에 있어서 사용한 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다.
도 9는 실시예 2에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다.
도 10은 실시예 4에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다. (A) 세포 배양 장치의 구성을 도시한 도면이다. (B) (A)에 있어서의 세포 배양 디바이스를 배치하는 세포 배양부를 도시하는 도면이다.
도 11은 실시예 6에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다. 기본적인 구성은 도 10과 공통이지만, 각 단의 배지 배출구가 30도씩 반시계 방향으로 틀어져 있어, 배지가 배출되기 쉬운 구조로 되어 있다.
도 12는 실시예 7에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다.
도 13은 실시예 9에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다. (A) 세포 배양 장치의 구성을 도시한다. (B) 실시예 9에서 사용한 원통형 용기(나선형 유로 없음)를 도시하는 도면이다.
도 14는 실시예 10에 있어서 사용한 세포 배양 장치의 일 실시양태를 도시한다. (A) 실시예 10에서 사용한 원통형 용기(나선형 유로 있음)를 도시하는 모식도이다. (B) 실시예 10에서 사용한 원통형 용기(나선형 유로 있음)를 도시하는 도면이다.
도 15는 실시예 11에 있어서 사용한 세포 배양 모듈의 몇 개의 실시양태를 도시한다.
도 16은 실시예 12에 있어서 사용한 폴리이미드 다공질막의 형광현미경 상을 도시하는 도면이다. CHO-DP12 세포를 파종하여 배양 2일 후의 형광현미경 상을 도시한다. (A) 정치 배양 2일 후, (B) 진탕 배양 2일 후(메쉬 없음).
도 17은 실시예 13에 있어서 실시한 세포 배양의 일 실시양태를 도시한다.
도 18은 일 실시형태에 있어서의 본 발명의 세포 배양 모듈을 적용한 WAVE 형 바이오리액터를 도시하는 도면이다. (A) 세포 배양 모듈이 봉입된 백, (B) WAVE25를 이용한 세포 배양 모듈에의 세포 흡착 공정을 도시하고 있다.
도 19는 일 실시양태에 있어서 본 발명을 적용하여 배양한 항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포로부터 생성되는 항체 생성량 및 글루코오스 농도의 시간 경과에 따른 변화를 도시하는 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시하는 도면이다. (A) 세포 배양 모듈, (B) 세포 배양부, (C) 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시한다.
도 21은 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시하는 도면이다.
도 22는 일 실시형태의 세포 배양 장치에 있어서의 액적화 배지 공급 수단으로부터 적하되는 배지의 양식을 도시하는 개념도이다. (A) 드롭형, (B) 메쉬형, (C) 샤워형을 도시한다. (D) 드롭형 및 메쉬형의 액적을 공급하기 위해서 사용되는, 일 실시형태의 세포 배양 장치에 적용되는 덮개를 도시하는 도면이다. 덮개의 배지 공급구에는, 스테인리스강제 메쉬를 감아 형성한 메쉬 다발이 삽입된다.
도 23은 일 실시양태에 있어서 본 발명의 세포 배양 장치를 사용한 경우의 인간 피부 섬유아세포로부터 생성되는 피브로넥틴의 양을 도시하는 그래프이다.
도 24는 일 실시형태에 있어서의 건열 멸균형 사이펀식 세포 배양 장치(내열 사이펀형 리액터)를 도시하는 도면이다.
도 25는 일 실시양태에 있어서 본 발명의 세포 배양 장치를 사용한 경우의 인간 피부 섬유아세포로부터 생성되는 피브로넥틴의 양을 도시하는 그래프이다. 컨트롤로서, 통상의 배양 디시로 인간 피부 섬유아세포를 배양함으로써 생성된 피브로넥틴의 양을 도시하고 있다(dish day8).
도 26은 본 발명의 일 실시형태에 있어서 이용되는 배양 기재(폴리이미드 다공질막) 및 그것을 이용한 세포 배양 장치를 도시한다. (A) 단책형 폴리이미드 다공질막, (B) 일단을 융착 고정한 폴리이미드 다공질막을 도시한다. (C) 배양 백에 봉입하여 진탕 배양 중인 (A) 및 (B)의 폴리이미드 다공질막을 도시한다.
도 27은 도 26 (A): 표 9의 방법 (1) 및 도 26 (B): 표 9의 방법 (2)의 폴리이미드 다공질막에 적용한 배양한 항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포의 세포 밀도의 변화를 도시한다.

1. 세포 배양 모듈

본 발명의 일 양태는,

폴리머 다공질막과,

을 구비한 세포 배양 모듈로서,

여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,

수용되어 있는 세포 배양 모듈에 관한 것이다. 상기 세포 배양 모듈을 이하에서 「본 발명의 세포 배양 모듈」이라고도 부른다. 또한, 본 명세서에 있어서 「세포 배양 모듈」이라는 기재는 단순히 「모듈」이라고 기재할 수 있으며, 서로 변경하여도 동일한 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서 「세포 배양 모듈」이란, 세포 배양 용기, 세포 배양 장치 및 세포 배양 시스템, 특히 부유 배양에 이용되는 세포 배양 용기, 세포 배양 장치 및 세포 배양 시스템에 적용할 수 있는 세포 배양 기재를 말한다. 세포 배양 모듈의 몇 개의 실시양태를 도 1∼도 3, 도 8, 도 20 (A)에 도시한다. 본 발명의 세포 배양 모듈은 도 4∼도 6, 도 9∼도 14, 도 17, 도 18, 도 20, 도 21 및 도 24와 같은 실시양태에 의해서 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 양태에 의해서도 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 배양 모듈은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 있음으로써, 막 형상의 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 계속적으로 형태가 변형되는 것이 방지된다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 세포 배양 모듈이 구비하는 케이싱은, 2 이상의 배지 유출입구를 가짐으로써, 세포 배지가 케이싱 내부로 공급 및 외부로 배출된다. 이 케이싱의 배지 유출입구의 직경은, 케이싱의 내부로 세포가 유입할 수 있게 상기 세포의 직경보다 큰 것이 바람직하다. 또한, 배지 유출입구의 직경이, 상기 배지 유출입구로부터 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 것이 바람직하다. 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 직경은, 케이싱에 수용된 폴리머 다공질막의 형상, 크기에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예컨대, 폴리머 다공질막이 끈 형상인 경우, 상기 폴리머 다공질막의 짧은 변의 폭보다 작고, 상기 폴리머 다공질막이 유출되지 않는 알맞은 직경이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 배지 유출입구의 수는, 세포 배지가 케이싱 내외로 공급 및/또는 배출되기 쉽도록, 가능한 한 많이 마련되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 5 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 바람직하게는 100 이상이다. 배지 유출입구는 케이싱의 일부 또는 전부가 메쉬형의 구조를 갖고 있어도 좋다. 또한, 상기 케이싱 자체가 메쉬형이라도 좋다. 본 발명에 있어서, 메쉬 형상의 구조란, 예컨대 세로, 가로 및/또는 기울어진 격자형의 구조를 갖는 것이며, 각 개공도가 유체가 통과할 수 있을 정도로 배지 유출입구를 형성하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 배양 모듈이 구비하는 케이싱은, 통상의 배양 조건, 예컨대 교반 배양, 진탕 배양 조건에 있어서의 배지의 움직임에 의해서 변형되지 않을 정도로 강도를 갖는 것이 바람직하고, 비가요성 소재로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한 케이싱은, 세포 배양에 있어서 세포의 생육에 영향을 주지 않는 소재에 의해서 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 재료로서는, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 폴리머, 스테인리스강, 티탄 등의 금속을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 케이싱에 어느 정도 강도가 있음으로써, 케이싱 내부의 폴리머 다공질막의 형상이 계속적으로 변경되는 것이 방지되어, 본 발명의 효과가 보다 발휘된다. 본 명세서에 있어서 「케이싱이 변형되지 않는다」란, 통상의 배양 환경 하에서 받는 부하에 있어서 변형되지 않음을 의미하는 것이며, 절대적으로 변형되지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 세포 배양 모듈은, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,

수용되어 있다.

본 명세서에 있어서 「케이싱 내에 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어 수용되어 있다」란, 상호 독립된 2 이상의 폴리머 다공성막이 케이싱으로 둘러싸인 일정 공간 내에 집약되어 수용되어 있는 상태를 가리킨다. 본 발명에 있어서 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막은, 상기 폴리머 다공질막의 적어도 한 곳과 상기 케이싱 내의 적어도 한 곳이 임의의 방법에 의해서 고정되어, 상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않은 상태로 고정된 것이라도 좋다. 또한, 2 이상의 독립된 폴리머 다공질막은 소편(小片)이라도 좋다. 소편의 형상은 예컨대 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈 형상 등, 임의의 형태를 취할 수 있지만, 바람직하게는 대략 정방형이 바람직하다. 본 발명에 있어서 소편의 크기는 임의의 크기를 취할 수 있지만, 대략 정방형인 경우, 길이는 임의의 길이라도 좋은데, 예컨대 80 mm 이하가 좋고, 바람직하게는 50 mm 이하가 좋고, 보다 바람직하게는 30 mm 이하가 좋고, 더욱 보다 바람직하게는 20 mm 이하가 좋으며, 10 mm 이하라도 좋다. 또한, 폴리머 다공성막의 소편이 대략 정방형인 경우, 그 한 변의 길이는, 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 되도록, 케이싱의 내벽을 따라서 또는 내벽의 한 변의 길이보다 짧게(예컨대 0.1 mm∼1 mm 정도 짧게) 형성된 것이라도 좋다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 또한, 끈 형상의 폴리머 다공질막인 경우, 후술하는 것과 같이, (ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어, (iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는 (iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어, 상기 케이싱에 수용되어도 좋다. 또한, 케이싱 내에 2 이상의 독립된 폴리머 다공질막을 집약하여 수용하기 위해서, 임의 매수의 폴리머 다공질막을 적층시키더라도 좋다. 이 경우, 폴리머 다공질막과 폴리머 다공질막의 사이에는 속깔개가 마련되어도 좋다. 속깔개가 설치됨으로써, 적층된 폴리머 다공질막의 사이에 효율적으로 배지를 공급시킬 수 있다. 속깔개는, 적층된 폴리머 다공질막의 사이에 임의의 공간을 형성하여, 효율적으로 배지를 공급시키는 기능을 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 메쉬 구조를 갖는 평면 구조체를 이용할 수 있다. 속깔개의 재질은, 예컨대 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 스테인리스강제 메쉬를 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 메쉬 구조를 갖는 속깔개를 갖는 경우, 적층된 폴리머 다공질막의 사이에 배지를 공급할 수 있을 정도의 개공도를 갖고 있으면 되며, 적절하게 선택할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「절첩된 폴리머 다공질막」이란, 상기 케이싱 내에서 절첩되어 있음으로써, 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공질막이다. 본 명세서에 있어서 「절첩된」이란, 폴리머 다공막에 접음선이 생긴 상태라도 좋고, 접음선이 생기지 않은 상태라도 좋다.

본 명세서에 있어서 「롤형으로 감긴 폴리머 다공질막」이란, 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공성막을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 새끼줄형으로 엮은 폴리머 다공질막이란, 예컨대 단책형의 복수의 폴리머 다공질막을 임의의 방법에 의해서 새끼줄형으로 엮어 넣어, 폴리머 다공질막끼리의 마찰력에 의해서 상호 움직이지 않는 상태의 폴리머 다공질막을 말한다. (i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약된 폴리머 다공질막, (ii) 절첩된 폴리머 다공질막, (iii) 롤형으로 감긴 폴리머 다공질막, 및 (iv) 새끼줄형으로 연결된 폴리머 다공질막이 조합되어 케이싱 내에 수용되어 있어도 좋다.

본 명세서에 있어서 「상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태」란, 상기 세포 배양 모듈을 세포 배양 배지 중에서 배양하는 경우에, 상기 폴리머 다공질막이 계속적으로 형태 변화되지 않는 상태가 되도록 케이싱 내에 수용되어 있는 상태를 말한다. 바꿔 말하면, 상기 폴리머 다공질막 자체가 유체에 의해서 계속적으로 물결치는 움직임을 하지 않도록 억제된 상태이다. 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태를 유지하기 때문에, 폴리머 다공질막 내에서 생육되고 있는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등에 의한 세포가 사멸되는 일 없이 안정적으로 세포를 배양할 수 있게 된다.

본 발명의 세포 배양 모듈은, 세포를 배양하는 배양 장치 및 시스템 등이라면, 시판되는 것을 적용할 수 있다. 예컨대, 배양 용기가 가요성의 백으로 이루어지는 배양 장치에도 적용할 수 있으며, 상기 배양 용기 내에 부유시킨 상태에서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 세포 배양 모듈은, 예컨대 스피너 플라스크 등의 교반 배양형 용기에 적용하여 배양하는 것이 가능하다. 그 밖에 배양 용기로서는, 개방 용기에도 적용 가능하고, 폐쇄 용기에도 적용 가능하다. 예컨대, 세포 배양용의 샤알레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다.

2. 세포 배양 장치에의 세포 배양 모듈의 적용

본 명세서에 있어서 「세포 배양 장치」란, 일반적으로, 세포 배양 시스템, 바이오리액터 또는 리액터와 동의로 취급되는 용어이며, 서로 바꾸더라도 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 세포 배양 모듈은 이하에 예시하는 세포 배양 장치에 적용할 수 있다. 또한, 이하에 예시하는 장치 이외의 시판되는 장치에 있어서도 적용 가능하다.

(1) 사이펀식 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은, 도 9 및 도 24에 도시하는 사이펀식 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 사이펀식 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부를 내부에 격납한 액 저장부와, 상기 액 저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 액 저장부의 바닥부에서 연통된 역U자관과, 상기 역U자관의 타단의 하부에 설치된 배지 회수 수단과, 상기 배지 회수 수단에 배치된 배지 배출 수단을 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액 저장부에 공급된 배지의 액면이 상기 역U자관의 정상부에 달했을 때, 사이펀의 원리에 의해 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치이다. 이 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 대체하여 사용할 수 있다.

(2) 통형 기상 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은, 도 10, 도 11 및 도 21에 도시하는 통형 기상 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 일 실시형태에 있어서, 통형 기상 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 세포 배양부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 여기서, 상기 세포 배양부가, 1 이상의 배지 배출구를 갖는 바닥부와, 상기 바닥부에 대략 수직으로 배치된 측부를 구비한 세포 배양 장치이다. 또한, 일 실시형태에 있어서, 통형 기상 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 세포 배양부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고, 여기서, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 배지 회수 수단이 상기 세포 배양부를 수용하는 외통의 일부인 세포 배양 장치이다. 이 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 대체하여 사용할 수 있다.

(3) 미스트 및 샤워형 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은, 도 12에 도시하는 미스트 및 샤워형 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 미스트 및 샤워형 배양 장치란,

폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 배치된 폴리머 다공질막 배치부와, 상기 폴리머 다공질막 배치부가 수용된 케이스와, 상기 케이스의 내부에 배치된 액적화 배지 공급부와, 상기 액적화 배지 공급부와 연통된 배지 공급 라인과, 상기 배지 공급 라인에 연통된 배지 저류부와, 상기 배지 공급 라인의 일부에 설치된 펌프를 구비하고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막 배치부가 슬릿형 또는 메쉬형의 복수의 배지 배출구를 구비한 세포 배양 장치이다. 이 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 대체하여 사용하는 것이 가능하다.

(4) 기상 노출형 회전 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은, 도 13, 도 14 및 도 20에 도시하는 회전 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 기상 노출형 회전 배양 장치란,

폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막을 갖는 세포 배양부와, 상기 세포 배양부를 관통한 축과, 상기 축을 회전하기 위한 회전 모터와, 상기 세포 배양부의 적어도 일부를 침지하는 배지조를 구비하고,

상기 축을 중심으로 하여 상기 세포 배양부가 회전하고, 상기 폴리머 다공질막에 담지된 세포가 기상 및 액상에 있어서 교대로 배양되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치이다. 이 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 대체하여 사용할 수 있다.

3. 폴리머 다공질막

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 A(이하에서 「A면」 또는 「메쉬면」이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만, 0.01∼150 ㎛, 0.01∼100 ㎛, 0.01∼50 ㎛, 0.01 ㎛∼40 ㎛, 0.01 ㎛∼30 ㎛, 0.01 ㎛∼20 ㎛ 또는 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 바람직하게는 0.01 ㎛∼15 ㎛이다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 B(이하에서 「B면」 또는 「대혈면」(大穴面)이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 큰 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 5 ㎛를 넘고 200 ㎛ 이하, 20 ㎛∼100 ㎛, 30 ㎛∼100 ㎛, 40 ㎛∼100 ㎛, 50 ㎛∼100 ㎛ 또는 60 ㎛∼100 ㎛이고, 바람직하게는 20 ㎛∼100 ㎛이다.

폴리머 다공질막 표면의 평균 구멍 직경은, 다공질막 표면의 주사형 전자현미경 사진으로부터, 200점 이상의 개공부에 대해서 구멍 면적을 측정하여, 이 구멍 면적의 평균치로부터 하기 식 (1)에 따라서 구멍의 형상이 진원(眞圓)이라고 했을 때의 평균 직경을 계산으로부터 구할 수 있다.

(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균치를 의미한다.)

표면층 A 및 B의 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이고, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다.

폴리머 다공질막에 있어서의 매크로보이드층 중의 매크로보이드의 막 평면 방향의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 10∼500 ㎛이고, 바람직하게는 10∼100 ㎛이고, 보다 바람직하게는 10∼80 ㎛이다. 또한, 상기 매크로보이드층 중의 격벽의 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이고, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 매크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 매크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 매크로보이드층 중의 격벽은 구멍을 갖지 않는다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 표면의 총 막 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 5 ㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상 또는 25 ㎛ 이상이라도 좋고, 500 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이하 또는 50 ㎛ 이하라도 좋다. 바람직하게는, 5∼500 ㎛이고, 보다 바람직하게는 25∼75 ㎛이다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 막 두께는 접촉식의 두께 측정기로 측정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 공공률은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 40% 이상 95% 미만이다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막의 공공률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하여, 단위 면적당 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라서 구할 수 있다.

(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리머의 밀도를 각각 의미한다. 폴리머가 폴리이미드인 경우는, 밀도는 1.34 g/㎤로 한다.)

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은, 바람직하게는, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 매크로보이드층의 격벽, 그리고 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이고, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 매크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리머 다공질막이다. 일 실시형태에 있어서, 매크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 매크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 격벽은 그와 같은 구멍을 갖지 않는다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리로서는, 특별히 한정되지 않지만, 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막은, 상기한 구조적 특징을 갖추는 한, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 폴리이미드 다공질막 또는 폴리에테르술폰(PES) 다공질막이다.

3-1. 폴리이미드 다공질막

폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이며, 통상은, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공액 구조를 갖기 때문에, 강직하며 강고한 분자 구조를 가지면서 또한 이미드 결합이 강한 분자간력을 가지므로, 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이고, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋지만, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 주지 않는 부가적인 성분인 것을 의미한다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막도 포함된다.

폴리아믹산은 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은, 열 이미드화 또는 화학 이미드화함으로써 폐환하여 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.

폴리아믹산은, 아믹산의 일부가 이미드화되어 있더라도 본 발명에 영향을 미치지 않는 범위라면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은 부분적으로 열 이미드화 또는 화학 이미드화되어 있어도 좋다.

폴리아믹산을 열 이미드화하는 경우는, 필요에 따라서, 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학 이미드화하는 경우는, 필요에 따라서, 화학 이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합하더라도, 착색 전구체가 석출되지 않는 조건으로 행하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서 「착색 전구체」란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화되어 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 착색 전구체로서는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산되고, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재 하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해되고, 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하며, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하고, 탄소계 착색 전구체가더욱 바람직하다.

착색 전구체는, 가열해 나가면 일견 탄소화물로 보이는 것으로 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 이원소를 포함하고, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조인 것을 포함한다.

탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 석유 타르, 석유 피치, 석탄 타르, 석탄 피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로서는 폴리아크릴니트릴이 바람직하다.

또한, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 상기한 착색 전구체를 사용하지 않고서, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액을 성형한 후, 열처리함으로써 얻어지는 폴리이미드 다공질막도 포함된다.

착색 전구체를 사용하지 않고서 제조되는 폴리이미드 다공질막은, 예컨대 극한 점도수가 1.0∼3.0인 폴리아믹산 3∼60 질량%와 유기 극성 용매 40∼97 질량%로 이루어지는 폴리아믹산 용액을 필름형으로 유연(流延)하고, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜, 폴리아믹산의 다공질막을 제작하고, 그 후 상기 폴리아믹산의 다공질막을 열처리하여 이미드화함으로써 제조되어도 좋다. 이 방법에 있어서, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매가 물이거나 또는 5 질량% 이상 100 질량% 미만의 물과 0 질량%를 넘고 95 질량% 이하인 유기 극성 용매와의 혼합액이라도 좋다. 또한, 상기 이미드화 후, 얻어진 다공질 폴리이미드막의 적어도 한 면에 플라즈마 처리를 실시하여도 좋다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 테트라카르복실산이무수물은 임의의 테트라카르복실산이무수물을 이용할 수 있으며, 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 테트라카르복실산이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산이무수물, 옥시디프탈산이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐이무수물, 2,2-비스〔(3,4-디카르복시페녹시)페닐〕프로판이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로도 또는 2종 이상을 조합하여 이용하는 것도 가능하다.

이들 중에서도, 특히, 비페닐테트라카르복실산이무수물 및 피로멜리트산이무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 테트라카르복실산이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산이무수물로서는 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 디아민은 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서 이하의 것을 들 수 있다.

1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠핵 하나의 벤젠디아민;

2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐설폭시드, 3,4'-디아미노디페닐설폭시드, 4,4'-디아미노디페닐설폭시드 등의 벤젠핵 2개의 디아민;

3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(3-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠 등의 벤젠핵 3개의 디아민;

4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠핵 4개의 디아민.

이들은 단독으로도 또는 2종 이상을 혼합하여 이용하는 것도 가능하다. 이용하는 디아민은, 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.

이들 중에서도, 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히, 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디아민이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 240℃ 이상이거나 또는 300℃ 이상이며 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.

(i) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,

(ii) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드, 및/또는

(iii) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이고, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 매크로보이드층의 격벽, 그리고 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이고, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 매크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리이미드 다공질막이다. 여기서, 매크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 매크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다.

예컨대 국제공개 제2010/038873호, 일본 특허공개 2011-219585호 공보 또는 일본 특허공개 2011-219586호 공보에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도 본 발명에 사용 가능하다.

3-2. 폴리에테르술폰(PES) 다공질막

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은 폴리에테르술폰을 포함하며, 전형적으로는 실질적으로 폴리에테르술폰으로 이루어진다. 폴리에테르술폰은 당업자에게 공지된 방법으로 합성된 것이라도 좋으며, 예컨대 2가 페놀, 알칼리 금속 화합물 및 디할로게노디페닐 화합물을 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법, 2가 페놀의 알칼리 금속 2염을 미리 합성하여 디할로게노디페닐 화합물과 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법 등에 의해서 제조할 수 있다.

알칼리 금속 화합물로서는, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 수소화물, 알칼리 금속 알콕시드 등을 들 수 있다. 특히, 탄산나트륨 및 탄산칼륨이 바람직하다.

2가 페놀 화합물로서는, 하이드로퀴논, 카테콜, 레조르신, 4,4'-비페놀, 비스(하이드록시페닐)알칸류(예컨대 2,2-비스(하이드록시페닐)프로판 및 2,2-비스(하이드록시페닐)메탄), 디하이드록시디페닐술폰류, 디하이드록시디페닐에테르류, 또는 이들의 벤젠환의 수소 중 적어도 하나가 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 저급 알킬기 또는 메톡시기, 에톡시기 등의 저급 알콕시기로 치환된 것을 들 수 있다. 2가 페놀 화합물로서는 상기한 화합물을 2 종류 이상 혼합하여 이용할 수 있다.

폴리에테르술폰은 시판 제품이라도 좋다. 시판 제품의 예로서는 스미카엑셀 7600P, 스미카엑셀 5900P(이상, 스미토모카가쿠(주) 제조) 등을 들 수 있다.

폴리에테르술폰의 대수점도는, 다공질 폴리에테르술폰막의 매크로보이드를 양호하게 형성한다는 관점에서, 바람직하게는 0.5 이상, 보다 바람직하게는 0.55 이상이고, 다공질 폴리에테르술폰막의 제조 용이성의 관점에서, 바람직하게는 1.0 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 더욱 바람직하게는 0.8 이하, 특히 바람직하게는 0.75 이하이다.

또한, PES 다공질막 또는 그 원료로서의 폴리에테르술폰은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 200℃ 이상이거나 또는 명확한 유리 전이 온도가 관찰되지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대

대수점도 0.5∼1.0의 폴리에테르술폰의 0.3 질량%∼60 질량%와 유기 극성 용매 40 질량%∼99.7 질량%를 포함하는 폴리에테르술폰 용액을 필름형으로 유연하고, 폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매를 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜, 빈 구멍을 갖는 응고막을 제작하는 공정, 및

상기 공정에서 얻어진 빈 구멍을 갖는 응고막을 열처리하여 상기 빈 구멍을 조대화시켜 PES 다공질막을 얻는 공정

을 포함하고, 상기 열처리는, 상기 빈 구멍을 갖는 응고막을 상기 폴리에테르술폰의 유리 전이 온도 이상 혹은 240℃ 이상까지 승온시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되더라도 좋다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은, 바람직하게는, 표면층 A, 표면층 B 및 상기 표면층 A와 상기 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 PES 다공질막으로서,

상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 구멍 직경이 10 ㎛∼500 ㎛인 복수의 매크로보이드를 가지고,

상기 매크로보이드층의 격벽은 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,

상기 표면층 A 및 B는 각각 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,

상기 표면층 A 및 B 중 한쪽이 평균 구멍 직경 5 ㎛를 넘고 200 ㎛ 이하인 복수의 세공을 가지며, 또한 다른 쪽이 평균 구멍 직경 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만인 복수의 세공을 가지고,

표면층 A 및 표면층 B의, 한쪽의 표면 개구율이 15% 이상이며, 다른 쪽의 표면층의 표면 개구율이 10% 이상이고,

상기 표면층 A 및 상기 표면층 B의 상기 세공이 상기 매크로보이드에 연통되어 있고,

상기 PES 다공질막은, 총 막 두께가 5 ㎛∼500 ㎛이며 또한 공공률이 50%∼95%인 PES 다공질막이다.

4. 세포 배양 모듈을 이용한 세포 배양 방법

본 발명의 일 양태는,

(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 세포 배양 모듈을, 배양 용기 중에서, 제2 배지로 배양하는 공정

을 포함하고,

여기서, 세포 배양 모듈이

폴리머 다공질막과,

2 이상의 배지 유출입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱을 구비한 세포 배양 모듈이고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지고,

여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,

수용되어 있고,

여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포의 배양 방법을 이하에서 「본 발명의 세포의 배양 방법」이라고도 부른다.

본 발명에 이용할 수 있는 세포의 종류는, 예컨대 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택된다. 동물 세포는, 척추동물문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추동물(척추동물문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 대별된다. 본 명세서에 있어서의 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 척추동물문에 속하는 동물 유래의 세포를 의미한다. 척추동물문은 무악상강(無顎上綱)과 악구상강(顎口上綱)을 포함하고, 악구상강은 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로, 포유동물이라고 일컬어지는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유동물은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.

본 발명에 이용할 수 있는 동물 세포의 종류는 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 명세서에 있어서 「다능성 줄기 세포」란, 온갖 조직의 세포로 분화할 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기 세포는 배성 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 생식 줄기 세포(EG 세포), 생식 줄기 세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없다는 등의 이유에서 특히 바람직하다. 다능성 줄기 세포로서는 공지된 임의의 것을 사용할 수 있는데, 예컨대 국제공개 제2009/123349호(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있다.

「조직 줄기 세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정 조직에 한정되어 있지만, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기 세포는 혈구의 근간이 되고, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화된다. 이 밖에도 간장을 만드는 간 줄기 세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기 세포 등 다양한 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기 세포는 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포에서 선택된다.

「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대로는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는 간세포, 췌세포, 근세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 연골세포, 지방세포, 피부세포, 섬유아세포, 췌세포, 신세포, 폐세포 또는 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구, 매크로파지 혹은 거핵구의 혈구세포에서 선택된다.

「생식 세포」는 생식에 있어서 유전 정보를 차세대로 전하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.

세포는 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택하여도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암이며, 연부육종, 악성골종양 등을 포함한다. 육종 세포는 육종에서 유래하는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되어, 일정한 안정된 성질을 갖기에 이르고, 반영구적인 계대 배양이 가능하게 된 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁경부암 유래), Vero 세포(녹색원숭이 신장 상피세포 유래), MDCK 세포(개 신장 뇨세관 상피세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래 세포주), BHK 세포(신생아 햄스터 신장 세포), NIH3T3 세포(마우스 태아 섬유아세포 유래) 등 인간을 포함하는 다양한 생물종의 다양한 조직에서 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질 전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여, 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다.

본 명세서에 있어서 「접착 세포」란, 일반적으로, 증식을 위해서 적절한 표면에 자신을 접착시킬 필요가 있는 세포이며, 부착 세포 또는 부착 의존성 세포라고도 일컬어진다. 본 발명의 몇 개의 실시형태에서는, 사용하는 세포는 접착 세포이다. 본 발명에 이용되는 세포는 접착 세포이며, 보다 바람직하게는 배지 중에 현탁한 상태에서도 배양 가능한 세포이다. 현탁 배양 가능한 접착 세포란, 공지된 방법에 의해서 접착 세포를 현탁 배양에 알맞은 상태로 순화시킴으로써 얻을 수 있으며, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, Vero 세포, NIH3T3 세포 등이나 이들 세포로부터 파생하여 얻어진 세포주를 들 수 있다. 여기에 예로 들지 않은 것이라도, 본 발명에 이용되는 세포는 접착 세포이며, 순화에 의해서 현탁 배양 가능한 세포라면 특별히 한정되지 않는다.

폴리머 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도 7에 도시한다. 도 7은 이해를 돕기 위한 도면이며, 각 요소는 실제 치수가 아니다. 본 발명의 세포의 배양 방법에서는, 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여 배양함으로써, 폴리머 다공질막이 갖는 내부의 다면적인 연결 다공 부분이나 표면에 대량의 세포가 생육하기 때문에, 대량의 세포를 간편하게 배양할 수 있게 된다. 또한 본 발명의 세포의 배양 방법에서는, 세포 배양에 이용하는 배지의 양을 종래의 방법보다도 대폭 줄이면서 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 예컨대, 폴리머 다공질막의 일부분 또는 전체가 세포 배양 배지의 액상과 접촉하지 않은 상태라도 대량의 세포를 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계에 대하여, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적을 현저히 줄이는 것도 가능하게 된다.

본 명세서에 있어서, 세포를 포함하지 않는 폴리머 다공질막이 그 내부 간극의 체적도 포함하여 공간 중에 차지하는 체적을 「겉보기상 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 7 참조). 그리고, 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리머 다공질막의 표면 및 내부에 세포가 담지된 상태에 있어서, 폴리머 다공질막, 세포 및 폴리머 다공질막 내부에 침윤한 배지가 전체적으로 공간 중에 차지하는 체적을 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 1 참조). 막 두께 25 ㎛의 폴리머 다공질막의 경우, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적은, 겉보기상 폴리머 다공질막 체적보다 최대로 50% 정도 큰 값이 된다. 본 발명의 방법에서는, 하나의 세포 배양 용기 중에 복수의 폴리머 다공질막을 수용하여 배양할 수 있는데, 그 경우, 세포를 담지한 복수의 폴리머 다공질막 각각에 관한 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계를, 단순히 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계」라고 기재하는 경우가 있다.

본 발명의 방법을 이용함으로써, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계의 10000배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있게 된다. 또한, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계의 1000배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 더욱이, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계의 100배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 그리고, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총계의 10배 또는 그보다 적은 조건이라도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다.

즉, 본 발명에 의하면, 세포 배양하는 공간(용기)을 종래의 이차원 배양을 행하는 세포 배양 장치와 비교하여 극한까지 소형화할 수 있게 된다. 또한, 배양하는 세포의 수를 늘리고 싶은 경우는, 적층하는 폴리머 다공질막의 매수를 늘리는 등의 간편한 조작에 의해, 유연하게 세포 배양하는 체적을 늘릴 수 있게 된다. 본 발명에 이용되는 폴리머 다공질막을 갖춘 세포 배양 장치라면, 세포를 배양하는 공간(용기)과 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)을 분리하는 것이 가능하게 되어, 배양하는 세포수에 따라서, 필요하게 되는 양의 세포 배양 배지를 준비하는 것이 가능하게 된다. 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)은, 목적에 따라서 대형화 또는 소형화하여도 좋고, 혹은 교체 가능한 용기라도 좋으며, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 예컨대 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수가, 세포가 전부 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산되어 있는 것으로 하여, 배지 1 밀리리터당 1.0×10⁵개 이상, 1.0×10⁶개 이상, 2.0×10⁶개 이상, 5.0×10⁶개 이상, 1.0×10⁷개 이상, 2.0×10⁷개 이상, 5.0×10⁷개 이상, 1.0×10⁸개 이상, 2.0×10⁸개 이상, 5.0×10⁸개 이상, 1.0×10⁹개 이상, 2.0×10⁹개 이상 또는 5.0×10⁹개 이상이 될 때까지 배양하는 것을 말한다.

또한, 배양 중 또는 배양 후의 세포수를 계측하는 방법으로서는 다양한 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수를, 세포가 전부 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산되어 있는 것으로 하여 계측하는 방법으로서는 공지된 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 예컨대 CCK8을 이용한 세포수 계측법을 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, Cell Countinig Kit8; 도진카가쿠겐큐쇼 제조 용액 시약(이하 「CCK8」이라고 기재한다.)을 이용하여, 폴리머 다공질막을 이용하지 않는 통상의 배양에 있어서의 세포수를 계측하여, 흡광도와 실제의 세포수의 상관 계수를 구한다. 그 후, 세포를 적용하여 배양한 폴리머 다공질막을, CCK8을 포함하는 배지로 옮겨, 1∼3시간 인큐베이터 내에서 보존하고, 상청을 뽑아내어 480 nm의 파장으로 흡광도를 측정하고, 앞서 구한 상관 계수로부터 세포수를 계산한다.

또한, 다른 관점에서는, 세포의 대량 배양이란, 예컨대 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 폴리머 다공질막 1 평방센티미터당 포함되는 세포수가 1.0×10⁵개 이상, 2.0×10⁵개 이상, 1.0×10⁶개 이상, 2.0×10⁶개 이상, 5.0×10⁶개 이상, 1.0×10⁷개 이상, 2.0×10⁷개 이상, 5.0×10⁷개 이상, 1.0×10⁸개 이상, 2.0×10⁸개 이상 또는 5.0×10⁸개 이상이 될 때까지 배양하는 것을 말한다. 폴리머 다공질막 1 평방센티미터당 포함되는 세포수는, 셀 카운터 등의 공지된 방법을 이용하여 적절하게 계측할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「현탁된 세포」란, 예컨대 트립신 등의 단백질 분해 효소에 의해서 접착 세포를 강제적으로 부유시켜 배지 중에 현탁하여 얻어진 세포나, 상술한 순화 공정에 의해서 배지 중에 부유 배양 가능하게 된 세포 등을 포함하고 있다.

본 명세서에 있어서 「배지」란, 세포, 특히 동물 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지를 가리킨다. 배지는 세포 배양액과 동의의 의미로서 이용된다. 그 때문에, 본 발명에 있어서 이용되는 배지란 액체 배지를 가리킨다. 배지의 종류는, 통상 사용되는 배지를 사용하는 것이 가능하며, 배양하는 세포의 종류에 따라서 적절하게 결정된다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (1)에서 이용되는 제1 배지는, 세포를 배양할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 CHO 세포를 배양하는 경우라면, JX에너지 제조 BalanCD(상표) CHO GROWTH A를 이용할 수 있다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포 배양 가능한 온도란, 세포가 세포 배양 모듈에 흡착 가능한 온도면 되며, 10℃∼45℃, 바람직하게는 15℃∼42℃, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼39℃이다. 또한, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포를 흡착시키는 시간은, 예컨대 5분∼24시간, 바람직하게는 10분∼12시간, 보다 바람직하게는 15분∼500분이다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (2)는, 진탕 및/또는 교반하면서, 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋으며, 정치하여 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋다. 진탕하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 시판되는 진탕 장치 상에, 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 포함하는 배양 용기를 배치하여 진탕하여도 좋다. 진탕은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋으며, 예컨대 진탕과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다. 교반하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 시판되는 스피너 플라스크 내에 넣어, 스터러를 회전시킴으로써 교반하여도 좋다. 교반은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋으며, 예컨대 교반과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (3)에서 이용되는 제2 배지는, 접착 세포의 배양에 이용되는 배지가 선택되며, 예컨대 D-MEM, E-MEM, IMDM, Ham's F-12 등을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 제2 배지는, 세포가 기재에 접착하는 것을 저해하는 성분, 예컨대 계면활성제가 포함되지 않는 배지가 바람직하다. 사용되는 제2 배지는 세포의 종류에 따라서 적절하게 선택된다. 상기 공정 (3)에 있어서, 제2 배지로 배양함으로써, 상기 공정 (2)에서 폴리머 다공질막에 흡착된 세포가 상기 폴리머 다공성막 내에 접착하는 것을 촉진한다. 이에 따라, 세포가 상기 폴리머 다공질막으로부터 탈락하지 않고서 안정적으로 배양 가능하다. 또한, 본 발명의 세포의 배양 방법은 상술한 폴리머 다공질막을 갖춘 세포 배양 모듈을 사용한다. 본 발명의 세포의 배양 방법에서 이용되는 세포 배양 모듈은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 있음으로써, 막 형상의 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 계속적으로 형태가 변형되는 것이 방지되고 있다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (3)은, 세포를 배양하는 배양 장치 및 시스템 등이라면 시판되는 것을 적용할 수 있다. 예컨대, 배양 용기가 가요성 백형 배양 용기라도 좋고, 또한 교반형 배양 용기, 예컨대 스피너 플라스크 등의 배양 용기로 배양하는 것도 가능하다. 그 밖에 배양 용기로서는 개방 용기에도 적용 가능하고, 폐쇄 용기에도 적용 가능하다. 예컨대 세포 배양용의 샤알레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 또한, 세포의 배양 방법에 있어서, 세포 배양 모듈을 이용함으로써, 애초에 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 대해서도 부유 배양용 장치로 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행하는 것이 가능하게 된다. 부유 배양용 장치로서는, 예컨대 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 공정 (3)은 본 명세서에 기재된 세포 배양 장치로 실시하여도 좋다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (3)은, 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 배양 용기에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 연속 순환형의 장치를 이용하여 실행하는 것도 가능하다.

본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (3)은, 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계라도 좋다. 그 때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계로 할 수 있다.

5. 현탁된 세포의 제거 방법

본 발명의 일 양태는,

을 포함하고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 갖는, 현탁된 세포의 제거 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포의 제거 방법을 이하에서 「본 발명의 세포의 제거 방법」이라고도 부른다.

본 발명의 세포의 제거 방법에 있어서 사용되는 폴리머 다공질막은 상술한 폴리머 다공질막을 사용할 수 있다. 상기 폴리머 다공질막은 상술한 세포 배양 모듈이라도 좋고, 케이싱에 수용되어 있지 않은 폴리머 다공질막이라도 좋다.

본 발명의 세포의 제거 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포 배양 가능한 온도란, 세포가 세포 배양 모듈에 흡착할 수 있는 온도면 되며, 10℃∼45℃, 바람직하게는 15℃∼42℃, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼39℃이다. 또한, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포를 흡착시키는 시간은, 예컨대 5분∼24시간, 바람직하게는 10분∼12시간, 보다 바람직하게는 15분∼500분이다.

본 발명의 세포의 제거 방법에 있어서, 상기 공정 (2)는, 진탕 및/또는 교반하면서, 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋고, 정치하여 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋다. 진탕하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 시판되는 진탕 장치 상에, 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 포함하는 배양 용기를 배치하여 진탕하여도 좋다. 진탕은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋으며, 예컨대 진탕과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다. 교반하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 시판되는 스피너 플라스크 내에 넣어, 스터러를 회전시킴으로써 교반하여도 좋다. 교반은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋으며, 예컨대 교반과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다.

본 발명의 세포의 제거 방법에 의해서, 종래에는, 세포를 포함하는 배지로부터 세포를 제거하기 위해서는, 원심 분리 처리나 필터에 의한 처리를 행하는 등의 조작이 필요하였다. 본 발명의 방법에 의하면, 필터 등을 이용하는 일 없이, 배지로부터 세포를 제거하는 것이 가능하게 된다.

6. 현탁된 세포를 사멸시키는 방법

본 발명의 일 양태는,

을 포함하고,

여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는, 현탁된 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포를 사멸시키는 방법을 이하에서 「본 발명의 세포의 사멸 방법」이라고도 부른다.

본 발명의 세포의 사멸 방법에서 사용되는 폴리머 다공질막은 상술한 것과 마찬가지다. 본 발명의 세포의 사멸 방법에서 사용되는 상기 폴리머 다공질막은, 상술한 세포 배양 모듈 및 세포의 배양 방법과는 달리, 케이싱에 수용되어 있지 않은 폴리머 다공질막이다.

본 발명의 세포의 사멸 방법에 있어서, 상기 공정 (1)에서 이용되는 제1 배지는, 세포를 배양할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 CHO 세포를 배양하는 경우라면, JX에너지 제조 BalanCD(상표) CHO GROWTH A를 이용할 수 있다.

본 발명의 세포의 사멸 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포 배양 가능한 온도란, 세포가 폴리머 다공질막에 흡착할 수 있는 온도면 되며, 10℃∼45℃, 바람직하게는 15℃∼42℃, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼39℃이다. 또한, 본 발명의 세포의 사멸 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포를 흡착시키는 시간은, 예컨대 5분∼24시간, 바람직하게는 10분∼12시간, 보다 바람직하게는 15분∼500분이다.

본 발명의 세포의 사멸 방법에 있어서, (3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 폴리머 다공질막을 배양 용기 중의 제2 배지에 부유시키고, 상기 폴리머 다공질막을 계속적으로 형태 변화시켜 배양하는 공정을 포함함으로써, 상기 폴리머 다공질막 내의 세포가 아포토시스 등에 의해서 사멸된다. 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (3)에서 이용되는 제2 배지는, 접착 세포의 배양에 이용되는 배지가 선택되며, 예컨대 D-MEM, E-MEM, IMDM, Ham's F-12 등을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 제2 배지는, 세포가 기재에 접착하는 것을 저해하는 성분, 예컨대 계면활성제가 포함되지 않는 배지가 바람직하다. 사용되는 제2 배지는 세포의 종류에 따라서 적절하게 선택된다. 상기 공정 (3)에 있어서, 제2 배지로 배양함으로써, 상기 공정 (2)에서 폴리머 다공질막에 흡착된 세포가 상기 폴리머 다공성막 내에 접착하는 것을 촉진한다.

본 발명의 세포의 사멸 방법에 있어서, 상기 공정 (3)은 임의의 온도라도 좋으며, 10℃∼45℃, 바람직하게는 15℃∼42℃, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼39℃이다. 본 발명의 세포의 사멸 방법은, 종래의 세포를 사멸시키는 방법, 특히 세포막을 파괴하는 방법에서 이용되는 계면활성제 등을 이용하는 일 없이, 세포를 파괴하는 것이 가능하게 된다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 또한 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

이하의 실시예에서 사용된 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분인 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(s-BPDA)과 디아민 성분인 4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA)로 이루어지는 폴리아믹산 용액과, 착색 전구체인 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 조제되었다. 얻어진 폴리이미드 다공질막은, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 이 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이며, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 6 ㎛이고, 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 46 ㎛이고, 막 두께가 25 ㎛이며, 공공률이 73%였다.

(실시예 1)

백형 모듈 리액터를 이용한 세포 배양

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO Growth A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 1.6×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 박스형 모듈(도 8)을 준비하여, 이하와 같은 조합으로 멸균적으로 25 ㎛ 폴리이미드 다공질막을 모듈 내에 설치하고, 박스의 덮개 부분을 용착하여 모듈의 준비를 완료하였다. 각 실험의 구성을 표 1에 나타낸다. 또한, 사용한 폴리이미드 다공질막의 사이즈는 1.5×1.5 cm이다.

진탕 배양용 산소 투과 백에 모듈을 표 1에 기재한 대로 1∼3개를 넣고, CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 진탕 배양을 행하였다. 다음날, 각 진탕 백으로부터 세포를 포함하는 배지액을 배출하여, 세포수를 카운트하였다. 각 실험의 세포 회수 결과를 이하의 표 2에 나타낸다. 폴리이미드 다공질막의 시트 면적 및 집적 상황에 따라서 부착 세포수가 변화되는 것을 확인하였다.

새로운 배지를 20 ml 주입하고, CO₂ 인큐베이터 내에서 진탕 배양을 계속하였다. 2∼3일에 1회 배지 교환을 실시하여, 적절하게 Cell Countinig Kit8; 도진카가쿠겐큐쇼 제조 용액 시약(이하, 「CCK8」이라고 기재한다.)에 의한 비색정량법으로 세포수를 확인하고, HPLC법으로 항체 생성량을 확인하였다. 배지는 청징한 상태를 유지하고 있었다. 현탁액 제거로부터 6일째와 8일째의 배양 결과를 표 3 및 표 4에 나타낸다. 모두 배지량은 20 ml였다. 배지는 2%의 FBS를 가한 IMDM을 사용하였다.

그 후, 배양 9일째부터 배지량을 20 ml에서 40 ml로 변경하여, 추가로 10일간, 합계 19일간, 실험 1∼5의 각각의 배양을 계속하였다. 19일째에 배양 백을 해체하여, 각각의 모듈을 하나의 백에 집적시키고, 40 ml의 배지를 가하여, CO₂ 인큐베이터 내에서 진탕 배양을 실행하였다. 1시간 정도로 배지의 pH 저하가 관측되기 때문에(도 5), 1시간에 1회씩, 0.5 몰 수산화나트륨과 45% 글루코오스를 주입하여, 6시간 배양하였다. 배양 실시 후, 배양액을 회수하여 CCK8에 의한 비색정량법으로 세포수를 확인하고, HPLC법으로 항체 생성량을 확인하였다. 세포 밀도는 1 평방센티미터당 4.7×10⁵개이고, 총 세포수는 1.9×10⁸개이고, 1일당으로 환산한 항체 생성량은 55 mg/L/day였다.

(실시예 2)

사이펀식 배양 장치에 의한 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양법

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 3.9×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 10 cm 직경 샤알레 1장에 상기 부유 배양액을 각각 12 ml 주입한 후, 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투를 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 12개를 동 샤알레에 가하였다. 모듈을 세포 현탁액으로 습윤한 후, CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 방치하였다.

다음날 모듈을 빼내어, 도 9에 도시하는 사이펀식 세포 배양 장치의 스테이지 부분에 모듈 10개를 설치하고, 액 저장부에는 350 ml의 배지를(FBS 2%를 포함하는 IMDM) 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다. 2일 후에 배양을 종료하였다. 세포 밀도 5.5×10⁴ Cells/㎠에서 총 세포수 1.2×10⁷개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 3)

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 9.9×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 진탕 배양용 산소 투과 백에 모듈 10개를 넣어, CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 진탕 배양을 행하였다.

다음날 진탕 백으로부터 모듈을 빼내어, 실시예 2와 같은 조건으로 사이펀식 배양 장치에 의한 세포 배양을 행하였다. 액 저장부에는 350 ml의 배지(코진바이오 제조 KBM270)를 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다. 4일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 1.0×10⁵ Cells/㎠에서 총 세포수 2.1×10⁷개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 4)

통형 기상 배양 장치에 의한 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양법

다음날 모듈을 빼내어, 도 10에 도시하는 통형 기상 배양 장치의 스테이지 부분에 모듈 10개를 설치하고, 액 저장부에는 350 ml의 배지(코진바이오 제조 KBM270)를 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 20 ml의 속도로 순환시켰다. 4일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 2.5×10⁵ Cells/㎠에서 총 세포수 5.0×10⁷개의 세포가 관찰되었다. 산소 공급 장치를 사용하지 않고서, 컴팩트하면서 간편한 설비로, 대량의 항체 생성 세포를 배양할 수 있다는 사실이 드러났다.

(실시예 5)

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 2.4×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투(케이싱)를 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 30개를 산소 투과형 배양 백에 멸균적으로 봉입하여, 상기 배양액 30 ml를 주입하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 방치한 후, 다음날 모듈을 빼내어, 도 11에 도시하는 통형 기상 배양 장치의 스테이지 부분에 모듈 30개를 설치하고, 액 저장부에는 300 ml의 배지(코진바이오 제조 KBM270)를 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 20 ml의 속도로 순환시켰다.

4일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 7.1×10⁴ Cells/㎠에서 총 세포수 5.8×10⁷개의 세포가 관찰되었다. 산소 공급 장치를 사용하지 않고서, 컴팩트하면서 간편한 설비로, 대량의 항체 생성 세포를 배양할 수 있다는 사실이 드러났다.

(실시예 6)

미스트 및 샤워형 배양 장치에 의한 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양법

다음날 모듈을 빼내어, 도 12에 도시하는 미스트 및 샤워형 배양 장치의 내부에 모듈 12개를 설치하고, 액 저장부에는 200 ml의 배지를(FBS 2%를 포함하는 IMDM) 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다.

2일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 3.4×10⁴ Cells/㎠에서 총 세포수 8.2×10⁶개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 7)

다음날 진탕 백으로부터 모듈을 빼내어, 실시예 7과 같은 조건으로, 미스트 및 샤워형 배양 장치에 의한 세포 배양을 행하였다. 액 저장부에는 200 ml의 배지(코진바이오 제조 KBM270)를 저류하여, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 60 ml의 속도로 순환시켰다. 4일 후에 배양을 종료한 바, 세포 밀도 8.8×10⁴ Cells/㎠에서 총 세포수 1.8×10⁷개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 8)

기상 노출형 회전 배양 장치

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 1.3×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 도 13에 도시하는 기상 노출형 회전 배양 장치(세로 드럼식, 나선형 유로 없음) 내부에 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투(케이싱)을 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 18개를 설치하여, 회전 가능한 상태로 준비한다. 상기 부유 배양액을 상부 액 저장부에 40 ml 주입한 후, 매분 6 회전의 느린 속도로 부유 배양액에 습윤시켰다. 이 회전부를 포함하는 기기 전체를 CO₂ 인큐베이터 내에서 5시간 방치한 후, 상부 액 저장부의 부유 배양액을 배제하고, 모듈의 회전은 계속하게 한 채로, 500 ml의 배지를(FBS 2%를 포함하는 IMDM) 저류한 하부 액 저장부로부터, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 10 ml의 속도로 순환시켰다. 7일간 배양한 시점에서, 세포 밀도 3.2×10⁵ Cells/㎠에서 총 세포수 1.0×10⁸개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 9)

기상 노출형 회전 배양 장치

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 1.3×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 도 14에 도시하는 기상 회전 배양 장치(절결 드럼식, 나선형 유로 있음) 내부에 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투를 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 18개를 설치하여, 회전 가능한 상태로 준비한다. 상기 부유 배양액을 상부 액 저장부에 40 ml 주입한 후, 매분 6 회전의 느린 속도로 부유 배양액에 습윤시켰다. 이 회전부를 포함하는 기기 전체를 CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 방치한 후, 상부 액 저장부의 부유 배양액을 배제하고, 모듈의 회전은 계속하게 한 채로 500 ml의 배지를(FBS 2%를 포함하는 IMDM) 저류한 하부 액 저장부로부터, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 10 ml의 속도로 순환시켰다. 7일간 배양한 시점에서, 세포 밀도 2.4×10⁵ Cells/㎠에서 총 세포수 8.5×10⁷개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 10)

다양한 모듈에 의한 CHO-DP12 세포의 백 배양

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO Growth A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 1.1×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투를 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉하거나, 혹은 일부를 고정하여 폴리이미드 다공질막을 노출시킨 각종 모듈 6종(도 15; 모듈 사진)을 준비하여, 표 1에 나타내는 것과 같은 조합으로, 멸균적으로 25 ㎛ 폴리이미드 다공질막을 산소 투과형 배양 백 내부에 설치하고, 개구부를 용착하여 모듈 장비형 배양 백의 준비를 완료하였다. 각 실험의 구성을 도 15에 도시한다.

이들 배양 백에, 상기 세포 현탁액 6 ml을 주입하고, 2시간 및 5.5시간 후에 미흡착으로 부유되어 있는 세포수를 측정하였다. 모듈 형상 및 폴리이미드 다공질막의 형상에 호응하여 미흡착 세포수가 관측되는 사실을 알아냈다. 결과를 표 5에 나타낸다.

흡착 공정 종료 후, 20 ml의 배지를 공급 후, CO₂ 인큐베이터 내에서 진탕 배양을 행하였다. 매일, 수산화나트륨 용액 및 피드 배지를 가하면서 주 2회 정도 배지를 교환하였다. 배지를 교환할 때, CCK8에 의한 비색정량법으로 세포수를 정량하여 세포의 증식을 확인하였다. 모듈의 형상에 의존하여, 세포의 증식 거동이 크게 변화되는 사실을 알게 되었다. 4일, 7일 및 11일 시점에서의 세포수에 관해서 표 6에 정리하였다.

(실시예 11)

배지 교환형 신규 배양법

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 세포수가 2.0×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 0.3 cm×2.5 cm의 가늘고 긴 형상을 한 폴리이미드 다공질막을 준비하여 건열 멸균을 행한 후, 20 ㎠ 샤알레 내에 11∼12 편을 설치하고, 상기 부유 배양액 4 ml를 주입하여 충분히 폴리이미드 다공질막을 세포 현탁액으로 습윤시킨 후, CO₂ 인큐베이터 내에 방치한다. 2시간 후, 샤알레를 인큐베이터로부터 빼내어, 세포 현탁액을 흡인 제거한 후에 배지(2% FBS 첨가 IMDM) 4 ml를 가하고, 또한 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양을 계속한다. 배지는 2일에 1회의 페이스로 교환하였다.

배양 시작에서부터 7일 후, CCK8을 이용하여 배양된 3장의 샤알레 내에 있어서의 폴리이미드 다공질막 상의 세포수를, 면적당 세포수로서 산출하였다. 다음날 3개의 샤알레 중 하나는 그대로 배양을 계속하는 한편, 나머지 2개 중 하나에서는, 배양액마다 니프로 제조의 산소 투과형 배양 백으로 세포 생육한 폴리이미드 다공질막을 옮겨, 히트 실러로 멸균적으로 밀폐하였다. 또 나머지 샤알레 하나에 관해서는, 폴리이미드 다공질막을 가위로 대략 0.3 cm×0.3 cm 세편으로 멸균적으로 세단한 후, 30# 나일론 메쉬의 바깥 주머니를 준비하고, 1 cm×1 cm 정도 크기의 주머니를 히트 실러로 멸균적으로 형성하고, 그 메쉬 외막(外膜)마다, 앞의 니프로 제조의 산소 투과형 배양 백으로 배지마다 이송하여, 히트 실러로 멸균적으로 밀폐하였다.

정치 배양은 지금까지와 마찬가지로 계속하는 한편, 폴리이미드 다공질막을 직접 넣은 배양 백과, 나일론 메쉬로 외투를 작성하여 배양 백에 넣은 것을, 각각 CO₂ 인큐베이터 내에 설치한 쉐이커로 1분 동안에 20∼30회의 쉐이킹을 일으키는 설정을 하여, 진탕 배양을 2일간 실시하였다. 정치 배양 및 2종의 진탕 배양을 행한 후의 세포 밀도를, 실시 전과 같은 CCK8법으로 산출하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 직접 백에 넣은 진탕 배양의 케이스만 현저한 세포수의 감소가 관찰되었다.

직접 폴리이미드 다공질막을 넣은 백으로부터 폴리이미드 다공질막을 빼내어, 배지 1 ml를 가하고, 추가로 Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain(1 μL) 및 Hoechst33342(PromoKine사 제조)(1 μL)를 가하여 인큐베이터 내에 5분 정치하였다. 그 후, 염색 시약이 들어간 배지를 제거하고, 새로운 배지를 가하여 염색을 완료하였다. 라이브 셀 이미징을 형광현미경으로 행하였다. 마찬가지로, 정치 배양을 계속한 폴리이미드 다공질막도 같은 조건으로 이미징 측정을 실시하였다. 정치 배양에 있어서 대량의 세포가 확인된다(도 16 (A)). 한편, 직접 진탕 백에 넣은 폴리이미드 다공질막에서는 매우 소량의 세포밖에 시인되지 않았다(도 16 (B)). 형광현미경 사진을 도 16에 도시한다.

(실시예 12)

인간 간엽계 줄기 세포의 폴리이미드 다공질막을 포함하는 모듈을 이용한 세포 배양법

Lonza사 제조, 인간 간엽계 줄기 세포를 샤알레로 계대·증식시키고, 트립신 처리에 의해 5.0×10⁶개의 세포를 배지 20 ml에 현탁시켰다. 산소 투과성 배양 백에, 나일론 메쉬(30#, 개공도 547 ㎛)로 외투(케이싱)을 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 20 ㎠) 가하여 봉한 모듈 30개를 설치해 두고, 거기에 상기 현탁액을 주입한 후, CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 진탕 배양을 행하였다. 다음날, 백 내의 액을 파기한 후, 멸균적으로 스피너 플라스크에 모듈 유지 기능을 부여한 용기(도 4 (A))로 이송하고, 80 ml의 간엽계 줄기 세포 전용 배지를 가하여 교반 배양을 CO₂ 인큐베이터 내에서 실행하였다(도 17). 1주일의 교반 배양 후, CCK8을 이용한 비색정량법으로 세포수를 구한 바, 5.5×10⁷개의 세포가 확인되었다. 스피너 배양법에 의해 대량의 인간 간엽계 줄기 세포가 용이하게 배양 가능하다는 것이 드러났다.

(실시예 13)

폴리이미드 다공질막을 포함하는 모듈과 WAVE형 바이오리액터를 이용한 물질 생산법

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 2.1×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다.

클레바사 제조 교점 융착 폴리프로필렌 메쉬(25#, 개공도 670 ㎛)로 케이싱을 형성하고, 멸균적으로 폴리이미드 다공질막을 일정량(1 모듈당 10 ㎠) 및 교점 융착 폴리프로필렌 메쉬 제조 속깔개(10#, 개공도 2145 ㎛) 2장을 더하여 봉한 모듈을 300개 준비하고, GE헬스케어 제조 바이오리액터; ReadyToProcess WAVE 25(이후 WAVE25라고 표기)용 백에, 백에 부속된 캡을 통하여 멸균적으로 봉입하였다. 백을 WAVE25에 설치하고, 공기·CO₂ 농도·온도 등을 설정하여 준비를 완료하였다. 거기에, 상기 부유 배양액 500 ml를 튜브 경유로 멸균적으로 주입하고, 37℃, 5% CO₂ 농도로 진동을 시작하여, 폴리이미드 다공질막에의 세포 흡착을 실행하였다. 도 18에 리액터 및 모듈이 들어가는 백 등을 도시한다. 24시간 후, 주입한 배지를 백으로부터 배출하고, 거기에 코진바이오 제조 CHO 배지 KBM270을 500 ml 가하였다. 백 내에서 배출한 액을 셀 카운트한 바, 1 ml당 생세포수가 1.1×10⁶이었다. 48%의 생세포가 흡착된 계산이 된다.

백 내의 상황 변화를 해석하기 위해서, 정기적으로 배지를 샘플링하고, 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 글루코오스량, 젖산 생성량, 항체 생성량 등의 각종 성분 조성 분석을 실행하였다. 배지는 1일∼2일에 한 번 간헐적으로 교환하여, 약 40일간 연속적으로 세포 배양을 실행하였다. 또한, 후반의 실험에서는, 도 19에 도시한 것과 같이, 1일에 여러 번 배지 교환을 실시하여, 효과 등의 검증을 행하였다. 도 19에, 항체 생성량 및 글루코오스 농도의 경시적 결과를 도시한다. 서서히 글루코오스 소비량이나 항체 생성량이 상승하는 모습이 보임과 더불어, 연속적이며 또한 고효율로 항체가 생성될 수 있다는 사실을 알아냈다. 배양 전체 기간을 통틀어 1일당 항체 생성 효율은 64 mg/L였다.

(실시예 14)

<스테인리스강제 케이싱을 갖는 모듈화 폴리머 다공질막(이하 「메탈 모듈」이라고 한다) 및 스테인리스강제 세포 배양부(이하 「메탈 드럼」이라고 한다)의 제작>

폴리이미드 다공질막이 갖는 내열성을 최대한으로 활용하여, 간단한 전체 건열 멸균으로 멸균 작업을 완료하기 위해, 스테인리스강 메쉬 제조의 케이싱, 속깔개 및 폴리이미드 다공질막으로 구성되는 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)를 참조). 구체적으로는 1 cm×1 cm의 폴리이미드 다공질막 및 폴리이미드 다공질막과 동면적의 스테인리스강 메쉬(「속깔개」라고 한다. 도시하지 않는다)를 적층한 것(폴리이미드 다공질 3장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 4장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 3장의 순서로 적층)을, 스테인리스 메쉬 제조의 케이싱으로 밀봉하여, 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)). 작업은 개방 공간 하에서 비멸균적으로 실시하였다. 이 메탈 모듈을 운용하기 위한 메탈 드럼도 마찬가지로 스테인리스강 메쉬로 제작하고(도 20 (B)), 내부에 메탈 모듈 20개를 넣은 상태에서 비멸균적으로 조립하였다. 그 후, 메탈 모듈을 포함하는 메탈 드럼을 알루미늄 호일로 싸고, 섭씨 190도에서 80분간 건열 멸균하여 방냉하였다.

<기상 노출형 회전 배양 장치>

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 1.1×10⁶이 될 때까지 배양을 계속하였다. 도 20 (C)에 도시하는 것과 같이 메탈 모듈을 포함하는 메탈 드럼을 멸균적으로 설치하고, 클린 환경 하에서 회전 가능한 상태로 준비하였다(도 20 (C)). 상기한 것과 같이 세포를 부유 배양하여 얻은 배지 34 ml와, 신선한 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A) 6 ml를 배양조(도 13 (A)의 배양조에 상당)에 주입한 후, 메탈 드럼을 매분 1 회전의 속도로 회전시켜, 폴리이미드 다공질막에 배지를 습윤시켰다. 이 장치 전체를 CO₂ 인큐베이터 내에서 21시간 방치한 후, 상부 액 저장부의 배지를 배제하고, 메탈 드럼의 회전은 계속하게 한 채로, 200 ml의 배지(KBM-270)를 저류한 배지 배출조(도 13 (A)의 배지 배출조에 상당)로부터, 동 배지를 튜브 펌프 경유로 매분 10 ml의 속도로 순환시켰다. 4일간 배양한 시점에서, 세포 밀도 3.9×10⁵ Cells/㎠에서 총 세포수 7.8×10⁷개의 세포가 관찰되었다. 그 후, 상부 액 저장부 및 하부 액 저장부 전량의 배지를 신선한 배지(KBM-270)로 교환하고, 추가로 2일간 같은 조건으로 배양을 계속하였다. 그 시점에서 세포 밀도 1.3×10⁶ Cells/㎠, 총 세포수 2.6×10⁸개의 세포가 관찰되었다.

(실시예 15)

스테인리스강제 케이싱을 갖는 모듈화 폴리머 다공질막(이하 「메탈 모듈」이라고 한다)에 의한 통형 기상 배양 장치(이하 「기통형 바이오리액터」라고 한다)의 준비 및 그것을 사용한 세포 배양

폴리이미드 다공질막이 갖는 내열성을 최대한으로 활용하여, 간단한 전체 건열 멸균으로 멸균 작업을 완료하기 위해서, 스테인리스강 메쉬 제조의 케이싱, 속깔개 및 폴리이미드 다공질막으로 구성되는 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)에 상당). 구체적으로는, 1 cm×1 cm의 폴리이미드 다공질막 및 폴리이미드 다공질막과 동면적의 스테인리스강 메쉬(「속깔개」라고 한다. 도시하지 않는다)를 적층한 것(폴리이미드 다공질 3장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 4장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 3장의 순서로 적층)를, 스테인리스 메쉬 제조의 케이싱으로 밀봉하여, 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)). 작업은 개방 공간 하에서 비멸균적으로 실시하였다.

이 메탈 모듈을 운용하기 위한 유리제 내열 기통형 리액터는, 유리 챔버 내에 메탈 모듈이 설치되어, 액 적하에 의해 배지를 기통 내에 공급할 수 있다. 메탈 모듈을 갖춘 기통형 바이오리액터는, 내열 소재만으로 제작되어 있기 때문에, 멸균은 간편한 건열 멸균만으로 실행 가능하게 된다. 메탈 모듈 30개를 내열 기통 내에 설치한 후, 비멸균적으로 조립된 장치를 알루미늄 호일로 싸서, 섭씨 190도에서 80분간 건열 멸균하고, 방냉함으로써 멸균 작업을 완결하였다.

제작한 기통형 바이오리액터를 이용하여, 인간 피부 섬유아세포의 배양 실험에 착수하였다.

상술한 것과 같이, 기통형 리액터 전체를 멸균적으로 조립하여, CO₂ 인큐베이터 내에 장치 전체를 설치하였다(도 21). 샤알레로 배양하고 있었던 인간 피부 섬유아세포를 트립신 처리로 박리시키고, 도 22의 (A)∼(C)에 도시하는 각 반응 형식에 대하여 70 ml씩의 세포 현탁액을 준비하였다. 그 때의 세포 밀도는, 1 ml당 생세포수가 1.4×10⁵였다. 흡착 후의 세포 증식 거동에 관해서 표 8에서 설명한다.

※1: 액중 잔류 세포 밀도란, 폴리이미드 다공질막에 세포를 흡착시킨 후의, 세포 현탁액 중에 잔존한 세포수(밀도)를 나타내고 있다.

※2: 세포 흡착률이란, 파종에 사용한 세포 현탁액 중의 세포가 얼마만큼 폴리이미드 다공질막에 흡착되었는지를 나타내고 있다.

※3: 초기 예상 성숙도란, 폴리이미드 다공질막에서의 세포의 최대 생식수를 100%로 한 경우의, 실제의 세포의 흡착 세포수를 %로 하여 나타낸 것이다.

※4: ※3과 같은 것을 나타내고 있다(배양 5일째를 측정하여 산출하였다). 상부; 최상부의 모듈, 하부; 최상부의 모듈의 값을 각각 나타내고 있다.

또한, 드롭형의 액적은, 도 22 (D)에 도시한 것과 같이, 권취한 스테인리스강 메쉬(규호긴죠쿠세이사쿠쇼 제조, 품번 E9103, 20#)(도 22 (D)의 메쉬 다발에 상당)를 덮개에 형성된 배지 공급구에 삽입함으로써 실현시켰다. 메쉬형의 액적은, 드롭형의 방법에 더하여, 메쉬 다발의 바로 아래에, 평면형의 스테인리스강 메쉬(규호긴죠쿠세이사쿠쇼 제조, 품번 E9103, 20#)를 마련하여, 모듈을 커버함으로써 실현시켰다. 샤워형의 액적은 이케우치사 제조의 품번 1/8 MVVP6503PP-IN번의 노즐을 이용함으로써 실현시켰다.

그 후, 펌프를 이용하여 연속적으로 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조_ KBM Fibro Assist를 사용)를 공급함으로써 배지 순환이 시작되어, 연속 배양을 진행시켰다. 3일에 1회 배지 교환을 실시하면서 배양을 계속하였다. 세포수의 평가에 관해서는, 30개 있는 모듈 중 1∼2개를 빼내고, 이들의 모듈에 생육하는 인간 피부 섬유아세포를 CCK8의 정색 반응을 이용하여 세포수를 측정하였다. 이 실험 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 실험에서는, 배지액의 주입 방법이 그 후의 각 시스템에 있어서의 모듈 내 세포수를 결정짓게 된다는 사실이 판명되었다. 또한, 흥미롭게도, 메쉬에 의한 액 침투 평준화 효과는 매우 커, 확실히 세포가 증식되는 결과가 관찰되었다. 한편, 드롭의 첨가 방식에서는 배지가 리액터 내부 전체로 퍼져 나가지 않고 편류가 생김으로써 세포 생육 영역이 한정되어 세포수의 감소를 초래하였다고 생각된다. 샤워식으로 배지를 주입하는 방법도 어느 정도의 액 평준화 효과에 기여한다고 생각된다.

이어서, 본 배양 방법의 바이오리액터로서의 효율을 검증하기 위해, 물질 생성능 평가를 진행시켰다. 다카라바이오 제조 인간 피브로넥틴 측정용 Elisa kit를 이용하여, 생성된 피브로넥틴량을 측정하였다. 도 23에 측정 결과를 도시한다.

도 11로부터도 자명한 것과 같이, 이 물질 생성 평가에 있어서도 메쉬 배양법이 압도적으로 우위를 보이고 있으며, 피브로넥틴 생산력을 착실히 늘리고 있다. 1개월의 안정 운전을 실현할 수 있었다. 한편, 샤워형 및 드롭형에 있어서도 안정적인 물질은 달성되었지만, 생산력의 향상을 발견하지는 못하였다. 매우 간편한 장치로 기상 노출형 배양으로 인간 초대 세포를 안정적으로 배양하여, 고효율로 유용 물질의 생성을 실현할 수 있다는 것을 실증할 수 있었다.

(실시예 16)

메탈 모듈 및 유리제 내열 사이펀 리액터

폴리이미드 다공질막이 갖는 내열성을 최대한으로 활용하여, 간단한 전체 건열 멸균으로 멸균 작업을 완료하기 위해서, 스테인리스강 메쉬 제조의 케이싱, 속깔개 및 폴리이미드 다공질막으로 구성되는 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)). 구체적으로는, 1 cm×1 cm의 폴리이미드 다공질막 및 폴리이미드 다공질막과 동면적의 스테인리스강 메쉬(「속깔개」라고 한다. 도시하지 않는다)를 적층한 것(폴리이미드 다공질 3장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 4장, 속깔개 1장, 폴리이미드 다공질 3장의 순서로 적층)을, 스테인리스 메쉬 제조의 케이싱으로 밀봉하여, 메탈 모듈을 제작하였다(도 20 (A)). 작업은 개방 공간 하에서 비멸균적으로 실시하였다.

이 메탈 모듈을 운용하기 위한 유리제 내열 사이펀 리액터는, 속슬렛 추출기를 베이스로 디자인하고, 내열성을 갖게 하기 위해서, 유리와 금속만으로 제작하였다(도 24 (A)). 메탈 모듈(도 20 (A))을 넣은 유리제 내열 사이펀 리액터를 도시한다. 이 리액터 내부에 스테인리스 모듈 30개를 비멸균적으로 적층시켜 장치를 조립하였다. 그 후, 리액터 부분을 알루미늄 호일로 싸서, 섭씨 190도에서 80분간 건열 멸균하여 방냉하였다.

이어서, 내열형 사이펀 리액터에 의한 인간 피부 섬유아세포의 간만(干滿) 배양을 실시하였다. 도 24 (A)에 도시한 것과 같이, 리액터 전체를 멸균적으로 조립하여, CO₂ 인큐베이터 내에 장치 전체를 설치하였다(도 24 (B)). 샤알레로 배양하고 있던 인간 피부 섬유아세포를 트립신 처리로 박리시켜, 세포 현탁액 70 ml를 준비하였다. 셀 카운트했더니, 1 ml당 생세포수는 1.4×10⁵였다. 현탁액 70 ml를, 메탈 모듈을 설치한 속슬렛관 내부에 주입하여 30분간 정치시켰다. 정치 후, 내부액을 멸균적으로 배출하고, 배출된 액을 재차 사이펀 리액터 내부에 주입하였다. 이 작업을 3회 반복하고, 그 후, 액부를 샘플링하여 세포수를 측정한 바, 세포수는 8.0×10³이었다. 94%의 세포가 이 정치 조건에서의 자연 접촉으로 흡착하였다고 말할 수 있다. 이어서, 펌프를 이용하여 연속적으로 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조_KBM Fibro Assist를 사용)를 공급함으로써 사이펀 기능이 발현되어, 메탈 모듈 내부에 안정적이면서 또한 순환적으로 배지와 공기(산소)가 공급된다. 3일에 1회 배지 교환을 실시하면서 배양을 계속하였다. 안정적이면서 또한 대량의 피브로넥틴이 생성되었음을, 다카라바이오 제조 인간 피브로넥틴 측정용 Elisa-kit로 측정하여, 고효율의 물질 생산이 간편하면서 또한 계속적으로 달성되고 있음을 확인하였다(도 25).

도면에 나타내는 것과 같이, 단위 체적당 1일의 물질 생산량이 우수한데다, 통상의 샤알레 배양과는 달리, 스케일업이 매우 용이하기 때문에, 컴팩트한 장치로 생산성을 향상시킬 수 있다. 인간 초대 세포를 물질 생산의 기반으로 하여 연속 생성계를 제작하고, 산소 공급 등의 수단을 갖는 복잡한 장치를 사용하지 않고서, 희소 물질이나 유용 물질을 제조하는 방법이 드러났다.

(실시예 17)

폴리이미드 다공질막의 가요성을 이용한 동물 세포의 제거 방법

항인간 IL-8 항체 생성 CHO-DP12 세포(ATCC CRL-12445)를 순화·부유화한 세포를 배지(BalanCD(상표) CHO GROWTH A)를 이용하여 부유 배양하고, 1 ml당 생세포수가 6.9×10⁵가 될 때까지 배양을 계속하였다. 이어서 사용하는 배양 기재에 관해서 표 9에 나타낸다(도 26의 (A) 및 (B)). 형상 변화를 고효율로 야기시켜 효율적으로 세포사를 일으키게 하기 위해서, 통상의 배양에서 사용하는 정방형 등의 폴리이미드 다공질막과는 달리, 가늘고 긴 형상의 폴리이미드 다공질막을 선택하였다.

표 9에 나타내는 조건으로, 같은 면적·다른 형상의 폴리이미드 다공질막을 멸균적으로 포매시킨 배양 백에, 상기한 세포 현탁액을 10 ml 주입하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 1일간 정치하여, 세포를 폴리이미드 다공질막에 흡착시켰다(도 26 (C)). 이어서 각 백으로부터 세포 흡착 후의 현탁액을 뽑아내고, CHO 세포 배양용 배지(코진바이오사 제조 KBM270)를 각 20 ml씩 주입하여, 동 인큐베이터 내에서 2일간 정치하였다. 세포 증식 거동에 관해서 표 10에 나타낸다.

표 10에 나타낸 것과 같이, 정치 배양에 있어서는, 각각의 배양 기재 특성에 따라서, 순조롭게 세포가 배양 기재가 들어간 배양 백 내에서 증식하고 있음이 확인되었다. 이어서 CO₂ 인큐베이터 내부에 엘엠에스사 제조 쉐이킹믹서(SHM-2002)를 설치하고, 배양 백을 동 믹서 상에 설치하여, 진탕을 시작하였다(∼20 rpm). 2일 후에, 부재 변형을 강화하기 위해서, 공기를 50 ml 주입하여, 진동을 계속하였다. 추가로, 10일 후부터는, 배지를 50 ml로 증량하여 진탕을 강화시켰다(∼45 rpm). 정기적으로 CCK8을 이용하여 각 백의 생세포수를 계측하였다. 세포수의 변화를 도 27에 도시한다. 정치 배양에서의 세포 증식과는 달리, 배양 기재 형상 의존적으로 세포수의 감소가 야기되고, 시간이 경과함에 따라서 세포수의 감소가 진행되어, 23일 후에는 세포가 사멸되어 있는 것이 나타났다. 형상 변화가 일부 억제된 방법(2)(단책 고정형)에 있어서도, 진탕 속도의 변화로 세포수가 더욱 감소하는 사실도 발견되었다. 진탕 조건 및 배양 기재 형상 의존적으로, 비약제적으로 동물 세포를 사멸시키는 방법론이 확립되었다.

Claims

세포의 배양 방법으로서,
(1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지에, 세포 배양 모듈을 적용하는 공정,
(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 세포 배양 모듈에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및
(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 세포 배양 모듈을, 배양 용기에서, 제2 배지로 배양하는 공정
을 포함하고,
여기서, 상기 세포 배양 모듈이
폴리머 다공질막과,
2 이상의 배지 유출입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱을 구비한 세포 배양 모듈이고,
여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고,
여기서, 상기 케이싱 내에
(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어,
(ii) 상기 폴리머 다공질막이 절첩되어,
(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤형으로 감겨, 및/또는
(iv) 상기 폴리머 다공질막이 새끼줄형으로 연결되어,
수용되어 있고,
여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지 유출입구의 직경이 상기 세포의 직경보다 크며 또한 상기 폴리머 다공질막이 유출되는 직경보다 작은 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 케이싱이 메쉬형의 구조를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케이싱이 비가요성 소재로 이루어지는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (2)가, 정치, 진탕 및/또는 교반하면서 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 제2 배지가 상기 배양 용기 내에 연속적 또는 간헐적으로 공급되는 계에서 행해지는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 폴리머 다공질막의 일부분이 세포 배양 배지의 액상과 접촉하지 않는 배양인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 배양 용기가 가요성 백형 배양 용기인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (3)에서의 배양에 있어서, 상기 배양 용기가 교반 배양형 용기인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막의 총 막 두께가 5∼500 ㎛인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 방법.
제14항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 폴리에테르술폰(PES) 다공질막인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 접착 세포인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, Vero 세포 및 MDCK 세포, 섬유아세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
현탁된 세포의 제거 방법으로서,
(1) 현탁된 세포를 포함하는 배지에, 폴리머 다공질막을 적용하는 공정,
(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정
을 포함하고,
여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되어 있는 것인 방법.
현탁된 세포를 사멸시키는 방법으로서,
(1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지에, 폴리머 다공질막을 적용하는 공정,
(2) 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및
(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 폴리머 다공질막을 배양 용기 중의 제2 배지에 부유시키고, 상기 폴리머 다공질막을 계속적으로 형태 변화시켜 배양하는 공정을 포함하고,
여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이며, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다 작고, 상기 매크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 매크로보이드에 연통되고,
여기서, 상기 제2 배지가 계면활성제를 포함하지 않는 것인 방법.