KR20190020806A - 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대한 개선된 약동학적 어세이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 생물학적 샘플 중의 면역글로불린 단일 가변 도메인(본원에서 "ISV" 또는 "ISVD"라 칭하기도 함) 및 (본원에서 추가로 기재하는 것과 같은) 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 및 폴리펩티드의 수준을 측정하기 위한 개선된 약동학적 어세이에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 단일 가변 도메인에 대한 개선된 약동학적 어세이
본 발명은 일반적으로 생물학적 샘플 중의 면역글로불린 단일 가변 도메인(본원에서 "ISV" 또는 "ISVD"라 칭하기도 함) 및 (본원에서 추가로 기재하는 것과 같은) 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 및 폴리펩티드의 수준을 측정하기 위한 개선된 약동학적 어세이에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 그러한 어세이를 수행하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태, 실시형태, 용도 및 이점은 이하의 추가적인 설명으로부터 명백해질 것이다.
약물 개발에 있어서, 동물 또는 인간에게 투여한 후 약물의 운명(예를 들어, 분포, 흡수 및/또는 분비)을 확인하기 위해 약물의 약동학적(pharmacokinetic; PK) 분석이 수행된다. 일반적으로, 그러한 분석은 종종 여러 시점에 대상으로부터 채취한 생물학적 샘플(예컨대, 혈액, 혈청 또는 혈장) 중의 약물의 존재, 수준 또는 농도를 측정하는 것을 포함한다.
이 목적을 위해, 약동학적 어세이가 이용되며, 그러한 어세이를 수행하기 위한 방법 및 기법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 일반적으로, 약동학적 어세이를 수행하기 위한 통상적인 방법은, 샘플을, 측정하려는 화합물에 결합할 수 있는 포획제와 접촉시키는 단계(즉, 상기 포획제가 측정하려는 화합물을 포획할 수 있는 조건 하에), 및 그 후 그 포획제에 의해 포획된, 측정하려는 화합물의 양(이것은 샘플 중의 화합물의 양의 척도로서 이용됨)을 측정하는 단계를 포함한다. 실제로는, 종종 "샌드위치" 구성이 이용되는데, 여기에서는 포획제가 표면(예컨대 멀티웰 플레이트 또는 칩의 표면) 상에 고정화되어 있고, 상기 포획제에 의해 포획된 화합물의 양은, 검출 및/또는 측정될 수 있는 신호를 발생시킬 수 있는 검출제를 첨가함으로써 측정된다. 정량적 PK 어세이에서는, 이러한 신호의 강도가 포획제에 의해 포획된, 측정하려는 화합물의 양의 척도이며, 이것은 또한 출발 샘플 중의 측정하려는 화합물의 양의 척도이다.
언급한 바와 같이, 이러한 어세이를 수행하기 위한 적절한 기법(예컨대 ELISA, MesoScale Diagnostic LLC의 MSD-플랫폼, Gyros AB의 Gyrolab™ 플랫폼 및 Merck Millipore의 Singulex™)이 당업게에 잘 알려져 있다. 흔히, 포획제는 측정하려는 화합물에 결합할 수 있는(그리고, 대개 이 화합물에 대해 특이적으로 생성된) 항체(다클론, 그러나 바람직하게는 단클론) 항체이다(하지만, 본 발명은 다른 포획제, 예컨대 ISVD 또는 측정하려는 화합물의 표적의 사용도 고려함; 예를 들어, 도 2, 4 및 5와 본원의 추가적인 설명 참조). 검출제는 검출 가능한/측정 가능한 신호를 제공하는 데 사용될 수 있는 임의의 적합한 작용제일 수 있다. 예를 들어, 검출제는 검출 가능한 표지 또는 태그와 접합된, 측정하려는 화합물에 대한 (바람직하게는 단클론) 항체일 수 있다. 실제로 흔히 사용되는 몇몇 비한정적인 예로는 형광 표지, 전기화학발광 기법을 이용하여 검출할 수 있는 표지 또는 태그(예컨대, MSD 플랫폼의 일부로서 이용되는 루테늄에 기초한 SULFO-TAG™ 표지), 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 기질을 검출 가능한/측정 가능한 생성물로 전환시킬 수 있는 다른 효소를 들 수 있다. 샌드위치 면역어세이(예컨대, 샌드위치 ELISA)에 대해 잘 알려져 있는 바와 같이, 검출제로서, 측정하려는 화합물에 결합하는 검출 항체와 기질의 검출 가능한 생성물로의 전환을 촉진할 수 있는 효소에 연결된 2차 항체의 조합을 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 기법들과 유사한 기법들의 일반적인 설명에 대해서는, 표준 핸드북과 예를 들어 문헌['O Kennedy et al., Biochemical Education 18(3), 1990], 및 문헌[Gan and Patel, Journal of Investigative Dermatology (2013), 133, e12. doi:10.1038/jid.2013.287 (온라인 발행)]이 참조된다.
도 1∼6은 본 출원에서 고려되는 유형의 약동학적 어세이를 수행하기 위한 몇몇 바람직한, 그러나 비한정적인 구성을 모식적으로 도시한다.
도 1 및 다른 도면에서, 본 발명은 측정하려는 화합물(도 1∼6에서 각각 (1)로서 표시됨)로서 2가 ISVD 구성체(즉, 각각 타원형으로 표시되고, 예시된 구성체에서 실선으로 표시되는 적절한 링커를 통해 서로 연결되어 있는 2개의 ISVD를 포함하는 것)를 사용함으로써 예시된다. 본원에서 추가로 설명하는 바와 같이, 이러한 2가 ISVD 구성체의 선택은 단지 예시를 목적으로 한 것으로, 본 발명은, 생물학적 샘플 중의, 하나 이상의 ISVD를 포함하는 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 화합물 또는 구성체(그리고, 특히, 본원에 기재된 바와 같이, 노출된 C-말단을 갖는 하나 이상의 ISVD를 포함하는 것, 즉, 이로써, 상기 C-말단, 및 - 연장에 의한, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체 - 는 어세이가 수행되는 동안 샘플 중의 이미 존재하는 항체에 의해 결합될 위험이 있다.)의 양을 측정하기 위한 임의의 어세이에 일반적으로 적용될 수 있음에 주목해야 한다. 본원의 개시에 기초할 때 그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체의 다른 예도 당업자에게 명백할 것이며, 본원에 언급된 바와 같이, 예를 들어, 1가, 2가, 3가, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성 및/또는 바이파라토픽(biparatopic) ISVD 폴리펩티드 또는 구성체를 포함한다(예를 들어, 실시예 1에서, RSV에 대한 3가 나노바디 구성체인 ALX-0171이 사용된다).
도 1의 어세이에서는, 공유 결합 또는 다른 적절한 링커 또는 고정화 기법(3)을 통해 고체 지지체(4)에 연결된 단클론 항체(2)가 측정하려는 화합물(1)을 포획하기 위해 사용된다. 임의의 비결합 화합물(1)을 제거한 후(즉, 세척에 의해), 검출제를 첨가함으로써 단클론 항체(2)에 의해 포획된 화합물(1)의 양을 측정하며, 도 1에 도시된 구성에서는, 상기 검출제가 링커(7) 또는 다른 적절한 접합 기술(예컨대, 스트렙타비딘-바이오틴 쌍)을 통해 검출 가능한 표지(6)와 접합된 단클론 항체(5)이다. 그 후, 임의의 과잉 검출제를 제거하고(즉, 역시 세척에 의해), 그 후 포획제에 의해 포획된 화합물(1)에 결합된 검출제의 양을, 검출 가능한 표지(6)에 의해 제공되는 신호를 이용하여 측정한다.
도 2에 도시된 어세이 구성은, 화합물(1)에 대한 단클론 항체 대신에, 화합물(1)의 표적(8)을 고체 지지체(4) 상에 (즉, 링커(3)를 이용하여) 고정화하는 것을 제외하고는 도 1에 도시된 구성과 실질적으로 동일하다.
도 3에 도시된 어세이 구성에서는, 측정하려는 화합물(1)이 역시 고체 지지체(4)에 연결된 단클론 항체(2)에 의해 포획되지만, 이 경우, 어세이는 측정하려는 나노바디(Nanobody) 구성체(1)의 (가용성) 표적(8)의 존재 하에 수행되며, (링커(7)에 의해 연결된, 단클론 항체(5)와 검출 가능한 표지(6)를 포함하는) 검출제는 화합물(1)이 아니라 표적(8)에 대한 것이다.
도 4에 도시된 어세이 구성은, "항-ISVD ISVD"(9)(예를 들어, VHH의 프레임워크 서열에 대해 유도된 나노바디)가 단클론 항체 대신에 포획제로서 사용되는 것을 제외하면, 도 3에 도시된 구성과 실질적으로 동일하다.
도 5에 도시된 어세이 구성은, 단클론 항체(5) 대신에, 바이오티닐화(11) 항-ISVD ISVD(10)와 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 표지 스트렙타비딘(12)의 조합이 검출제로서 사용되는 것을 제외하고는, 도 2에 도시된 구성과 실질적으로 동일하다.
도 6에 도시된 어세이 구성은, 검출제로서, 검출 항체(13)와 표지된 2차 항체 (5)/(6)/(7)의 조합이 사용된 것을 제외하고는, 도 2에 도시된 구성과 실질적으로 동일하다.
본 개시내용과 실시예에 기초할 때, 도면에 명시적으로 설명된 것 이외의 적합한 어세어 구성이 당업자에게 명백할 것이며, 전술한 바와 같이, 도 1∼6에 도시된 어세이는 본 개시내용에 기초할 때 당업자에게 명백한 널리 알려진 기법 및 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
WO 12/175741에는, ISVD를 포함하는 생물학적 샘플(예컨대, 전혈, 혈청 및 혈장을 비롯한 혈액 샘플, 안액, 기관지세척액/BALF, 뇌척수액 또는 다른 체액 샘플)을 분석하는 데 이용되는 몇몇 어세이(예를 들어, ADA 면역어세이)에서 단백질 간섭이 일어날 수 있고, 그러한 단백질 간섭은 이들 어세이 중 일부 및/또는 이들 샘플 중 일부에서 비특이적인 신호를 발생시킬 수 있다는 것이 개시되어 있다. WO 12/175741은 또한 그러한 단백질 간섭이 ISVD로 처리된 대상 및/또는 ISVD가 투여된 대상(예컨대, 환자 또는 임상 시험 대상자)으로부터 얻은 샘플뿐만 아니라, ISVD를 전혀 투여받지 않은 대상으로부터 얻은 샘플에서도 발생할 수 있다고 언급하고 있다. WO 12/175741에 추가로 언급된 바와 같이, 이것은, 이러한 간섭이 임의의 새로 나타난 ADA에 의해서라기 보다는 기존의 단백질과의 비특이적인 단백질-단백질 상호작용에 의한 것일 가능성이 있음을 시사한다. WO 12/175741은 또한 이러한 간섭 인자가, 가변 도메인의 C-말단이 노출된다면, 이것에 결합할 수 있는 (이미 존재하는) IgG일 가능성이 가장 크다는 것을 나타내고 있다(예를 들어, 또한 WO 13/024069, Holland et al., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203 및 WO 2015/173325 참조).
약동학적 어세이는 일반적으로 혈청 샘플(즉, ISVD 또는 ISVD를 포함하는 약물이 투여된 대상으로부터 얻은)을 사용하는 것을 포함하므로, ISVD의 노출된 C-말단에 대한 그러한 "기존의 항체"가 그러한 샘플 중에 존재하는 경우 상기 어세이를 간섭할 수 있는 가능성이 있다. 이러한 점을 감안하여, 본 발명은 그러한 간섭(및/또는 그러한 간섭이 일어날 위험)이 감소된 개선된 약동학적 어세이 및 이 어세이를 수행하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일반적으로, 본 발명은, "켄처(quencher)", 즉, 샘플 중에 존재하는 임의의 기존의 항체가 결합할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 존재 하에 어세이를 수행함으로써 가능한 단백질 간섭의 문제를 해결한다. 그 결과, 간섭 인자는 포획제와 측정하려는 화합물과 검출제 간의 회합(즉, 어세이에 영향을 주거나 왜곡할 수 있는 방식의)을 방해할 수 없다(또는 더 이상 방해하지 못한다).
일반적으로, 본원에서 추가로 설명하는 바와 같이, 본원에서 사용되는 켄처는 ISVD 또는 노출된 C-말단을 갖는 ISVD를 포함하는 단백질 및 폴리펩티드이며, 상기 ISVD, 단백질 또는 폴리펩티드는 추가로 포획제에 의해 포획될 수 없고 측정하려는 화합물 또는 검출제에 의해 결합되지 않는 것이다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은, 샘플 중의, 하나 이상의 ISVD, 또는 하나 이상의 ISVD를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 화합물 또는 구성체(상기 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 화합물 또는 구성체는 본원에 기재된 것과 같다)의 양 및/또는 농도를 측정하는 방법으로서,
a) 상기 샘플을 포획제와 접촉시켜, ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 상기 포획제에 의해 포획되도록 하는 단계;
b) 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체를 검출제와 접촉시켜, 상기 검출제가 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체에 결합하도록 하는 단계;
c) 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체에 결합된 검출제의 양에 상응하는 신호를 발생시키는 단계
를 포함하며, 상기 방법은 켄처의 존재 하에 수행되고, 상기 켄처는, 기존의 항체는 결합할 수 있지만(즉, 특이적으로 결합하지만), 상기 포획제 및 상기 검출제는 (실질적으로) 결합할 수 없는(즉, 비특이적인 결합이 아닌) 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이를 위해, 상기 켄처는 바람직하게는 본원에 추가로 기재하는 것들이다.
본원의 개시내용에 기초할 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 일반적으로 상기에 기재된 방법에서, 샘플은 ISVD의 노출된 C-말단에 대해 유도된 기존의 항체를 포함하고/하거나 포함하는 것으로 의심되는 것으로 알려진 생물학적 유체의 샘플이다. 특히, 상기 샘플은 ISVD의 노출된 C-말단에 대한(및 특히, VH 또는 VHH 도메인으로부터 유래되거나 유래되었던 나노바디 또는 다른 ISVD에 대한)에 기존의 항체를 포함하고/하거나 포함하는 것으로 의심되는 것으로 알려진 생물학적 유체의 샘플이다.
상기 샘플은 측정하려는 (하나 이상의) ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체를 추가로 함유한다. 특히, 측정하려는 상기 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는, 예를 들어, 임상 시험의 일부로서, 또는 치료 또는 진단 목적으로, 그 샘플을 채취한 대상에게 투여되었던 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체일 수 있다. 한 양태에서, 상기 샘플은 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체의 약리학적 특성과 특히 그 약동학적 특성(예를 들어, 그 PK 또는 혈청 반감기 파라미터)를 측정하기 위해 채취한 것이다.
상기 샘플은 대상으로부터 얻은 생물학적 유체의 임의의 원하는 적절한 샘플, 예컨대 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 안액, 기관지세척액//BALF, 뇌척수액 또는 다른 생물학적 유체(예컨대, 객담 또는 비강 세척액); 그리고 특히 전혈, 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있다. 상기 샘플은 또한 본 발명의 어세이에 사용하기 위해 (예를 들어, 필요에 따라, 적절한 희석법 또는 추출법에 의해, 및/또는 당업자에게 공지된 하나 이상의 적절한 전처리 단계, 예컨대 적절한 산 해리 단계에 의해) 적절히 준비된 것/준비되었던 것일 수 있다. 실제, 통상적으로, 샘플은, 예를 들어, 특정량의, 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체를 함유하는 것으로 알려져 있거나 함유하는 것으로 예상되는 것인데, 그 이유는, 본원에서 언급한 바와 같이, 상기 샘플은, 상기 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 투여된 대상으로부터 얻은 것이기 때문이다.
본 발명의 어세이를 이용하여 측정할 수 있는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 1가 ISVD를 포함하거나 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 하나 이상(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 ISVD를 포함하거나 이것으로 실질적으로 이루어지는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체일 수 있다. 이들은 예를 들어 하나 이상(예컨대 1개, 2개 또는 3개)의 ISVD와, 경우에 따라, 예를 들어 직접 화학 결합에 의해 또는 하나 이상의 적절한 링커를 사용하여 서로 적절히 연결된 하나 이상의 다른 모이어티 또는 엔티티를 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체를 포함할 수 있다. 본원의 추가적인 설명과 본원에 인용된 선행 기술을 참조할 수 있다.
한 양태에서, 그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체에 있어서, 존재하는 ISVD 중 하나 이상은 치료적으로 적절한 표적에 대해 유도된 것이다. 특정한 한 양태에서, 그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 인체에서의 반감기(t1/2-베타로서 표현됨)가 하루 이상, 예컨대 3일 이상, 예를 들어 최대 5일 이상이다. 이를 위해, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 그러한 증가된 반감기를 갖는 하나 이상의 "치료적" ISVD를 제공하는 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위를 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어 (인간) 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 대한 ISVD일 수 있다. 본원의 추가적인 개시내용을 참조할 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는, 본원에서 추가로 개시하는 (인간) 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 대한 하나 이상의 ISVD를 포함한다. 일반적으로, 이 양태에서, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 통상적으로 하나 이상의 치료적으로 관련된 표적(들)에 대한 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위(또한 나노바디와 같은 ISVD를 포함함)와 같은 1종 이상의 치료적으로 활성인 모이어티, 결합 도메인 또는 결합 단위를 추가로 포함한다. 그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체에서, 혈청 알부민 결합 ISVD는 일반적으로 하나 이상의 치료적 모이어티 또는 엔티티의 반감기를 증가시키기 위해 사용된다. 또한, 그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 인체에서의 반감기(t1/2-베타로서 표현됨)가 적어도 하루, 예컨대 적어도 3일, 예를 들어 최대 5일 이상이다.
본원에서 언급된 단백질 및 폴리펩티드는 바람직하게는 융합 단백질이다. 한 양태에서, 상기 단백질 및 폴리펩티드는, 경우에 따라 하나 이상의 적절한 링커에 의해 연결된 ISVD를 포함하거나 이것으로 실질적으로 이루어진다.
일반적으로, 본 발명에 있어서, 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 기존의 항체에 의해, 특히 상기 ISVD의 노출된 C-말단에 대한 기존의 항체에 의해 결합되기 쉽고/쉽거나 결합될 위험이 있는 하나 이상의 ISVD(예컨대, 치료적 표적에 대한 ISVD 및/또는 반감기를 연장시키는 ISVD, 예컨대 혈청 단백질에 대한 ISVD)를 포함하는 것이다. 종종, 상기 ISVD는 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체의 C-말단에 있다.
특정한 한 양태에서, 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체는 기존의 항체에 의해, 특히 상기 ISVD의 노출된 C-말단에 대한 기존의 항체에 의해 결합되기 쉽고/쉽거나 결합될 위험이 있는 하나 이상의 ISVD(즉, 본원에 추가로 기재된 바와 같은, 나노바디인 ISVD 또는 VHH 또는 VH 도메인으로부터 유래되거나 유래되었던 다른 ISVD)를 포함하는 것이다. 종종, 상기 중쇄 ISVD는 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체의 C-말단에 있다.
측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체 중에 존재하는 하나 이상의 ISVD는 또한 C-말단 연장부를 갖는 것(예를 들어, WO 12/175741에 기재된 것)에 의해 및/또는 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 프레임워크 돌연변이를 갖는 것(WO 2015/173325 참조)에 의해, 기존의 항체에 의한 감소된 결합을 위해 서열 최적화된 것일 수 있다.
본 발명의 방법 및 어세이를 이용하여 측정할 수 있는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체에 대해서는, 본원의 개시내용 및 인용된 선행 기술을 참조할 수 있다.
사용되는 켄처는 노출된 C-말단을 갖는 임의의 ISVD, 또는 노출된 C-말단을 갖는(그리고, 특히 그의 C-말단에 ISVD를 갖는) 하나 이상의 ISVD를 포함하는 임의의 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체적인, 그러나 비한정적인 양태에서, 켄처는 공지된 적절한 링커를 사용하여 서로 연결한 2개(또는 3개도 포함할 수 있음)의 ISVD를 포함한다.
켄처는 샘플 중의 임의의 기존의 항체가, 특히 본원에 기재된 바와 같은 친화성으로, 그 켄처에 (특이적으로) 결합하도록 선택된다.
기존의 항체가 켄처(즉, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 아니라)에 결합하도록 확실히 하기 위해서는, 켄처가, 켄처와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성이, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성보다 크도록/우수하도록(본원에 기재된 바와 같이) 선택될 수 있다(예를 들어 비한정적으로, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 C-말단 연장부 및/또는 프레임워크 돌연변이를 포함할 경우, 이것은 그러한 C-말단 연장부 및 그러한 돌연변이를 포함하지 않는 켄처를 선택함으로써 쉽게 달성할 수 있음).
따라서, 비한정적인 일 양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 켄처는, 켄처와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성이, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성보다 적어도 10배(예컨대 적어도 100배) 더 크고/더 우수하도록 선택된다(일반적으로, 본 발명의 내용에 있어서, 예시로서, 10 nM의 친화성은 100 nM의 친화성보다 10x "더 우수한" 또는 "더 높은" 것으로 간주됨).
본원에서 추가로 기재하는 바와 같이, 이전 단락에서 기재한 친화성과 비교하기 위한 목적으로, 켄처와 항체 21-4(기존의 항체에 대한 모델/대용물로서 사용될 수 있음) 간의 결합 상호작용에 대한 친화성은, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 항체 21-4 간의 결합 상호작용에 대한 친화성과 비교될 수 있다. 따라서, 구체적인, 그러나 비한정적인 한 양태에서, 본 발명에 있어서, 컨처는, 켄처와 항체 21-4 간의 결합 상호작용에 대한 친화성이, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 항체 21-4 간의 결합 상호작용에 대한 친화성보다 더 우수하고/더 크도록(본원에 정의된 바와 같이, 특히, 적어도 10배 우수함, 예컨대 적어도 100배 우수함) 선택될 수 있다.
기존의 항체가 켄처(즉, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 아니라)에 결합하도록 확실히 하기 위한 또 다른 방법은, 샘플 중에 존재하는 것으로 (최대로) 예상되는 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체의 양에 비해 적절한 과량(예컨대 적어도 10배 과량, 예를 들어 적어도 100배 과량)을 사용하는 것이다. 일반적으로, 그러한 적절한 과량은 켄처와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성이, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성과 거의 동일하거나 그보다 나쁘고/낮을 때(그럴 것으로 예상될 때) 사용되어야 한다(일반적으로, 본 발명의 내용에 있어서, 예시로서, 100 nM의 친화성은 10 nM의 친화성보다 10x "더 나쁜" 또는 "더 낮은" 것으로 간주된다). 또한, 적절한 과잉의 켄처는, 켄처와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성이, 측정하려는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체와 기존의 항체 간의 결합 상호작용에 대한 친화성보다 더 우수할 때(그럴 것으로 예상될 때) 사용될 수 있다.
바람직하게는, 켄처(및 특히 기존의 항체가 결합하도록 의도된 켄처 중의 ISVD)는 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키기 위해 서열 최적화를 갖지 않는다. 예를 들어, 이것은 임의의 C-말단 연장부가 없이 서열 VTVSS로 끝날 수 있고, 이것은 바람직하게는 또한 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키도록 의도된 돌연변이를 포함하지 않는다. 이것과 별도로, 노출된 C-말단을 갖는 ISVD를 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체 또는 ISVD가, 어세이를 간섭하지 않는 한(그 이유는, 예를 들어, 이들이 어세이에 사용되는 임의의 다른 성분들에 결합할 수 있고/있거나 그것에 의해 결합되기 때문이다), 사용될 수 있다.
실제로, 기존의 항체에 의한 켄처의 (가능한) 결합과 관련하여, 또한, 기존의 항체가 결합할 수 있는 적절한 켄처의 선택과 관련하여, 샘플 중의 기존의 항체가 불균질한 다클론 집단을 형성할 수 있고, 기존의 항체(및 ISVD에 대한 그 친화성)가 때때로 샘플마다 및/또는 대상마다 다를 수도 있다는 것이 주목된다.
이것을 설명하기 위해, 본 발명에 있어서, 마우스 다클론 항체 클론 "21-4-3"(본원에서 "21-4" 또는 "ABH0015"라고도 함)에 의한 결합(즉, 친화성)이 후보 켄처가 기존의 항체에 의해 결합되는지 아닌지를 결정하기 위한 모델/도구로서 사용될 수 있다. 21-4-3(및 이것을 생산하는 하이브리도마, "ABH0015"로 불리기도 함)은 WO 12/175741(19면 3-28행 참조)에 개시되어 있으며, 여기에서 이것은 노출된 C-말단을 갖는 ISVD를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드가 단백질 간섭을 겪는 경향(즉, 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있는 기존의 항체에 의해 결합됨)을 갖는지를 확인하기 위한 대용물/모델로서 사용된다고 기재되어 있다. WO 12/175741은 또한 ABH0015의 VH 및 VL 서열을 제공한다(WO 12/175741, 서열 번호 35 및 36 참조). WO 12/175741의 실시예 7에 언급된 바와 같이, 21-4는 WO 2006/122825의 서열 번호 98의 나노바디 구성체로 면역화된 마우스로부터 출발하는 하이브리도마 기술을 이용하여 생성하였고, 21-4를 발현하는 하이브리도마 세포주("ABH0015"라 칭함)는 2012년 6월 4일자로 벨기에 겐트 소재의 BCCM에 수탁 번호 LMBP-9680-CB로 기탁되었다. WO 12/175741의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 단클론 21-4는 WO 2006/122825의 서열 번호 98의 나노바디 구성체의 C-말단을 인식하며, 상기 C-말단은 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand Factor; vWF)에 대해 생성된 나노바디(인간화된 VHH)로 이루어지고, ISV가 비특이적 단백질 간섭을 겪는 경향을 갖는지를 예측하는 데 이용될 수 있다. WO 12/175741은 또한 실시예 9에서, ABH0015가, 단백질 또는 폴리펩티드(특히, 노출된 C-말단을 갖는 ISVD를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드)가 단백질 간섭을 겪는 경향을 갖는지 갖지 않는지(즉, 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있는 기존의 항체에 의해 결합되는지)를 예측/판단하는 데 사용되는 프로토콜을 제공한다.
본 발명에 있어서, 21/4에 대한/의한 결합은, 단백질 또는 폴리펩티드가 켄처로서 사용하기에 적합한지 아닌지를 측정/판단하기 위한 대용물로서 사용될 수 있다(또한, 본원의 실시예 5 참조).
일반적으로, 본 발명에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드는, 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 BIAcore를 이용하여 측정할 때, 이것이 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성(KD로서 표현함), 예컨대 1000∼1 nM의 친화성으로 21-4에 의해 결합될 경우 켄처로서 사용하기에 적합하다(명확하게 하기 위해, 그리고 비한정적인 예로서, 일반적으로, 본 발명의 상세한 설명에 있어서, 1 nM의 친화성은 1 마이크로몰/1000 nM의 친화성보다 "더 높은/더 우수한" 것으로 간주된다).
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에서, 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 기존의 항체에 결합하는 친화성보다 기존의 항체에 대해 더 높은/더 우수한 친화성을 갖는 켄처를 사용하는 것을 의도할 경우, 바람직하게는, 사용되는 켄처는, 측정하려는 ISVD, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 구성체가 21-4에 결합하는 친화성보다 10x(10배) 더 높은/더 우수한, 바람직하게는 100x(100배) 더 높은/더 우수한 비율의 친화성으로 21-4에 결합한다(역시, 본원에서, 예시로서, 10 nM의 친화성은 100 nM의 친화성보다 10배 "더 높은" 것으로 간주된다).
따라서, 한 양태에서, 본 발명은, 켄처로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드가 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 BIAcore를 이용하여 측정할 때 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성, 예컨대 1000∼1 nM의 친화성으로 21-4에 의해 결합되는 단백질 또는 폴리펩티드인 상기에 기재된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
상기 켄처는 또한 포획제 또는 검출제에 의해 실질적으로 결합되지 않아야 한다(또는, 비특이적 결합이 아니라 결합하지 않아야 한다). 실제로, 이것은, 포획제 및 검출제에 대한 켄처의 친화성(또는 반대로, 켄처에 대한 포획제의 친화성 및 켄처에 대한 검출제의 친화성)이 3 마이크로몰보다 낮거나/나쁘거나, 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 더 바람직하게는 50 마이크로몰 미만, 예컨대 100 마이크로몰보다 나쁜 것을 의미한다(명확히 하기 위해, 비한정적인 예로서, 일반적으로, 본 발명의 상세한 설명에서, 10 마이크로몰의 친화성은 1 마이크로몰의 친화성보다 "나쁜/낮은" 것으로 간주된다). (후보) 포획제 및 (후보) 검출제가 선택된다면, (후보) 켄처에 대한 이들의 친화성을 결정하여, 의도된 포획제 및 검출제와 함께 사용하기에 적합한 켄처를 선택하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은, 켄처로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드가 (i) 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 BIAcore를 이용하여 측정할 때 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성, 예컨대 1000∼1 nM의 친화성으로 21-4에 의해 결합되고, (ii) 3 마이크로몰보다 낮은/나쁜, 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 더 바람직하게는 50 마이크로몰 미만, 예컨대 100 마이크로몰보다 나쁜 친화성으로 의도된 포획제 및 의도된 검출제에 의해 결합되는 단백질 또는 폴리펩티드인 상기에 기재한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 켄처는 1가 ISVD(예컨대 1가 나노바디) 또는 2개 이상(예컨대 2개 또는 3개)의 ISVD(이 중 적어도 하나는 노출된 C-말단을 가짐)를 포함하는 융합 단백질 또는 구성체일 수 있다. 실제로, 켄처는 그의 C-말단에 ISVD를 갖는 폴리펩티드, (융합) 단백질 또는 구성체이다(그 후 ISVD는 폴리펩티드, 단백질 또는 구성체의 C-말단을 형성함으로써 노출된 C-말단을 갖게 된다).
켄처가 기존의 항체에 의해 결합될 수 있어야 하기 때문에, 켄처의 C-말단을 형성하는 VHH는 바람직하게는 임의의 C-말단 연장부를 갖지 않거나(WO 12/175741에 기재된 바와 같이) 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키도록 의도된 임의의 돌연변이를 갖지 않는다(예컨대, WO 2015/173325에 기재됨).
따라서, 바람직하게는, 켄처는 그의 C-말단에 ISVD(및 바람직하게는 나노바디)를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이며, 켄처(이것의 C-말단을 형성하는 ISVD)는 바람직하게는 그의 C-말단에 아미노산 서열 VTVSS(서열 번호 1)를 갖는다. 켄처는, 예를 들어, 적절하게는 1가, 2가, 이중특이성, 3가 또는 삼중특이성 구성체 ISVD 구성체일 수 있다. 바람직하게는, 켄처는 1가 나노바디, 2가 나노바디 구성체(단일특이성 또는 이중특이성일 수 있음) 또는 3가 나노바디 구성체(단일특이성, 이중특이성 또는 삼중특이성)이다.
도 2∼6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 어세이의 몇몇 가능한 구성에서, 측정하려는 화합물에 대한 표적(도 2∼6에서 (8)로서 나타냄)이 포획제의 일부로서 또는 검출제의 일부로서(또는 둘 다로서) 사용될 수 있다. 따라서, 켄처 중에 존재하는 ISVD(들)가 임의의 표적(들)에 대해 유도된 것일지라도, 이것은, 어세이의 일부로서 사용될 경우 측정하려는 화합물의 표적에 대해 유도된 것이 아니어야 한다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은, 켄처로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드가 노출된 C-말단을 갖는 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드이고, 상기 ISVD의 C-말단은 C-말단 아미노산 서열 VTVSS(서열 번호 1)로 끝나는 것인 상기에 기재한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 켄처는 바람직하게는, (i) 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 BIAcore를 이용하여 측정할 때 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성, 예컨대 1000∼1 nM의 친화성으로 21-4에 의해 결합되고, (ii) 3 마이크로몰보다 낮은/나쁜, 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 더 바람직하게는 50 마이크로몰 미만, 예컨대 100 마이크로몰보다 나쁜 친화성으로 의도된 포획제 및 의도된 검출제에 의해 결합된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 켄처로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 C-말단에 ISVD를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이고, 상기 C-말단 ISVD(및 결과적으로, 켄처로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드)는 C-말단 아미노산 서열 VTVSS(서열 번호 1)로 끝나는 것인 상기에 기재한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 켄처는 바람직하게는, (i) 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 BIAcore를 이용하여 측정할 때 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성, 예컨대 1000∼1 nM의 친화성으로 21-4에 의해 결합되고, (ii) 3 마이크로몰보다 낮은/나쁜, 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 더 바람직하게는 50 마이크로몰 미만, 예컨대 100 마이크로몰보다 나쁜 친화성으로 의도된 포획제 및 의도된 검출제에 의해 결합된다.
본 발명의 방법에서 켄처를 사용하는 편리한 방법 중 하나는, 포획 단계 전에 (과량의) 켄처를 함유하는 적절한 희석 완충액으로 테스트하려는 샘플(이것은 전술한 바와 같이, 산 해리 단계와 같은 공지된 하나 이상의 적절한 전처리 단계에 이미 적용된 것일 수 있음)을 희석하는 것이다. 이렇게 하여, 샘플 중의 기존의 항체가 포획 및 검출 단계 전에 켄처에 의해 결합되어, 이들이 측정 및/또는 어세이 판독값을 간섭하지 못하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태, 실시형태, 이점 및 용도는 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 명세서에서,
- 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"("ISV" 또는 ISVD"라 칭하기도 함)은 일반적으로 다른 가변 도메인과의 상호작용 없이(예를 들어, 통상적인 4 사슬 단클론 항체의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 요구되는 것과 같은 VH/VL 상호작용 없이) 기능성 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인(VH, VHH 또는 VL 도메인을 포함한 중쇄 또는 경쇄 도메인일 수 있음)을 지칭하기 위해 사용된다. ISVD의 예는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 나노바디(VHH, 인간화 VHH 및/또는 낙타화 VH, 예컨대 낙타화 인간 VH를 포함함), IgNAR, 도메인, VH 도메인이거나 VH 도메인으로부터 유래된 (단일 도메인) 항체(예컨대 dAb's™) 및 VL 도메인이거나 VL 도메인으로부터 유래된 (단일 도메인) 항체(예컨대 dAb's™)를 포함한다. 본원에서 달리 명시적으로 언급하지 않는다면, 중쇄 가변 도메인(예컨대 VH 또는 VHH 도메인)을 기초로 하고/하거나 이로부터 유래된 ISVD가 일반적으로 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본원에서 달리 명시적으로 나타내지 않는다면, ISVD는 나노바디이다.
- 용어 "나노바디"는 일반적으로 WO 2008/020079 또는 WO 2009/138519에 정의된 바와 같으며, 따라서, 구체적인 양태에서, 일반적으로 VHH, 인간화 VHH 또는 낙타화 VH(예컨대 낙타화 인간 VH) 또는 일반적으로 서열 최적화된 VHH(예컨대, 화학적 안정성 및/또는 용해도, 공지된 인간 프레임워크 영역과의 최대 중복 및 최대 발현을 위해 최적화됨)를 나타낸다. 용어 나노바디 또는 나노바디들은 상표명 Ablynx N.V.로 등록되어 있으므로, 나노바디(Nanobody)® 및/또는 나노바디즈(Nanobodies)®)로 칭해질 수도 있다.
- 일반적으로, 본원에서 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 언급되는 ISVD, 나노바디, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구성체는 인간(및/또는 경우에 따라, 또한, 온혈 동물, 특히 포유동물)의 질환 또는 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 것이다. 따라서, 일반적으로, 본원에 기재된 ISVD, 나노바디, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구성체는, (생물학적) 약물 또는 다른 약학적으로 또는 치료적으로 활성을 갖는 화합물 및/또는 약학 제품 또는 조성물로서 사용될 수 있고/있거나 그 일부로서 사용될 수 있는 것이 바람직하다. 그러한 약물, 화합물 또는 제품은, 바람직하게는, 예를 들어, 예방 또는 치료를 요하는 대상의 예방 또는 치료를 위해 또는 예를 들어 임상 시험의 일부로서 인간에게 투여하기에 적합한 것이다. 본원에서 추가로 기재하는 바와 같이, 이를 위해, 그러한 약물 또는 화합물은 본 발명에 의해 제공되는 ISVD 이외에도 다른 모이어티, 엔티티 또는 결합 단위를 포함할 수 있다(이것은, 역시 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 ISVD에 기초한 또는 나노바디에 기초한 생물학적 물질의 약동학적 또는 약력학적 특성, 예컨대 반감기에 영향을 주는 하나 이상의 다른 추가의 치료적 모이어티 및/또는 하나 이상의 다른 모이어티일 수 있다). 그러한 추가의 치료적 또는 다른 모이어티의 적절한 예는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 일반적으로, 임의의 치료 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 결합 도메인 또는 결합 단위와, 예를 들어 WO 2009/138159의 149-152면에 기재된 것과 같은 변형을 포함할 수 있다. ISVD에 기초한 생물학적 물질 또는 나노바디에 기초한 생물학적 물질은 바람직하게는 치료제 또는 (예방 및 진단을 포함하는) 치료제로서 사용하기 위한 것이며, 이를 위해, 바람직하게는 치료적으로 관련된 표적(예를 들어, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 또는 다른 인터루킨 또는 이들의 수용체 등)에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함한다. 그러한 ISVD에 기초한 또는 나노바디에 기초한 생물학적 물질의 몇몇 특이적인, 그러나 비한정적인 예와 관련해서는, 실시예 8∼18을 참조할 수 있고, 또한, 예를 들어 Ablynx N.V.의 다양한 출원들(비한정적인 예로서 WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 및 WO 2009/068627)과, 예를 들어(비한정적으로), WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 및 WO 2007/085814와 같은 출원들을 참조할 수 있다. 또한, 본원에서 추가로 기재하는 바와 같이, 추가의 모이어티는 (인간) 혈청 단백질, 예컨대 (인간) 혈청 알부민에 대해 유도된 본원에 기재된 바와 같은 ISVD 또는 나노바디일 수 있으며, 이러한 ISVD 또는 나노바디는 또한 치료적 용도, 특히 하나 이상의 치료적 ISVD의 반감기를 연장시키는 데 및/또는 연장시키기 위한 치료적 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 반감기 연장을 위한 혈청 알부민 결합 나노바디의 용도를 개괄적으로 기술하는 WO 2004/041865, WO 2006/122787 및 WO 2012/175400을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, 명시적으로 다르게 언급하지 않는다면, 본원에서 언급된 모든 용어들은 WO 2009/138519(또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술) 또는 WO 2008/020079(또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술)에 제시된 의미를 갖는다. 또한, 방법 또는 기법이 본원에서 구체적으로 기재되지 않는다면, 이것은 WO 2009/138519(또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술) 또는 WO 2008/020079(또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술)에 기재된 대로 수행될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 ISVD 또는 화합물을 포함하는 임의의 약학 제품 또는 조성물은 또한 (즉, 목적하는 약제 형태에 따라) 약학 제품 또는 조성물에 사용되는 것으로 공지된 1종 이상의 추가의 성분들 및/또는 예를 들어 치료 용도로 의도된 1종 이상의 다른 화합물 또는 활성 주성분을 포함할 수 있다(즉, 병용 제품을 제공하기 위해).
또한, 본 명세서 또는 청구범위에서 사용될 때, 하기 용어들은 WO 2009/138519의 62-75면에 기재된 것과 동일한 의미를 갖고/갖거나, 적용된다면, 거기에 기재된 방식으로 결정될 수 있다: "아고니스트", "안타고니스트", "역 아고니스트", "비극성 비하전 아미노산 잔기", "극성 비하전 아미노산 잔기", "극성 하전 아미노산 잔기", "서열 동일성", "정확히 동일한" 및 "아미노산 차이"(2개의 아미노산 서열의 서열 비교와 관련하여 언급될 때), "실질적으로 단리된 (형태)(로)", "도메인", "결합 도메인", "항원 결정부위", "에피토프", "(항원)에 대한" 또는 "(항원)에 대해 유도된", "특이성" 및 "반감기". 추가로, 용어 "조절하는" 및 "조절하기 위해", "상호작용 부위", "∼에 특이적인", "교차 차단", "교차 차단된" 및 "교차 차단하는" 및 "pH에 실질적으로 독립적인"은 Ablynx N.V.의 WO 2010/130832의 74-79면에 정의된 바와 같다(및/또는 그 곳에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다). 또한, 본 발명의 구성체, 화합물, 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "1가", "2가"(또는 "다가"), "이중특이성"(또는 "다중특이성"), 및 "바이파라토픽(biparatopic)"(또는 "멀티파라토픽(multiparatopic)")은 WO 2009/138519, WO 2010/130832 또는 WO 2008/020079에 제공된 의미를 가질 수 있다.
본원에서 언급되는 ISVD, 나노바디, ISVD에 기초한 생물학적 물질, 나노바디에 기초한 생물학적 물질 또는 임의의 다른 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드와 관련하여 본 발명에서 사용되는 용어 "반감기"는 일반적으로 WO 2008/020079의 57면의 단락 o)에 기재된 바와 같이 정의될 수 있고, 거기에 언급된 바와 같이, 예를 들어, 자연적 메커니즘에 의한 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 서열 또는 화합물의 제거 또는 격리로 인해, 생체내에서, 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 50% 감소되는 데 걸리는 시간을 의미한다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는, 임의의 공지된 방법으로, 예컨대 약동학적 분석에 의해 측정될 수 있다. 적절한 기법은 당업자에게 명백하며, 예를 들어, 일반적으로, WO 2008/020079의 57면의 단락 o)에 기재된 바와 같을 수 있다. 또한, WO 2008/020079의 57면의 단락 o)에 언급된 바와 같이, 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하면적(AUC)과 같은 파라미터를 사용하여 표현할 수 있다. 이와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "반감기"는 특히 t1/2-베타 또는 최종 반감기(이 때, t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다 고려되지 않을 수 있다)를 의미한다. 예를 들어, 하기 실험 파트와 표준 핸드북, 예컨대 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조할 수 있다. 또한, 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]도 참조할 수 있다. 마찬가지로, "반감기의 증가" 또는 "증가된 반감기"라는 용어도 WO 2008/020079의 57면의 단락 o)에 정의된 바와 같고, 특히 t1/2-베타의 증가를 의미하며, t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다의 증가는 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
본원에 용어가 구체적으로 정의되어 있지 않다면, 그 용어는 당업자에게 명백한 당업계의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예컨대 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; 문헌[F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]; 문헌[Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)]; 문헌[Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)]; 문헌[Roitt et al., "Immunology"(6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)]; 문헌[Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)]; 및 문헌[Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)]과 여기에 인용된 일반적인 배경기술을 참조할 수 있다.
또한, 본원에 이미 나타낸 바와 같이, 나노바디의 아미노산 잔기는, 문헌[Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195]; 또는 여기에 인용된 문헌에서의 낙타과 유래의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, Kabat 등["Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91]에 의해 제안된 VH의 일반적 넘버링에 따라 넘버링된다. 이 넘버링에 따르면, 나노바디의 FR1은 위치 1∼30에 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31∼35에 아미노산 잔기를 포함하며, 나노바디의 FR2는 위치 36∼49에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50∼65에서 아미노산 잔기를 포함하며, 나노바디의 FR3은 위치 66∼94에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95∼102에서 아미노산 잔기를 포함하며, 나노바디의 FR4는 위치 103∼113에서 아미노산 잔기를 포함한다. [이와 관련하여, - VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이 - 각각의 CDR의 아미노산 잔기의 총수는 변동될 수 있으며, Kabat 넘버링에 의해 표시되는 아미노산 잔기의 총수에 상응하지 않을 수 있다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에 점유되지 않거나, 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다). 이것은, 일반적으로, Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수도 있고 상응하지 않을 수도 있음을 의미한다. 그러나, 일반적으로, Kabat 넘버링에 따르면, CDR 내의 아미노산 잔기의 수에 관계 없이, Kabat 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 시작에 상응하고, 반대의 경우도 마찬가지이며, Kabat 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 시작에 상응하고, 반대의 경우도 마찬가지이며, Kabat 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 시작에 상응하고, 반대의 경우도 마찬가지이고, Kabat 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 시작에 상응하고, 반대의 경우도 마찬가지이다.].
또한 낙타과 유래의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하는 대안적인 방법은 문헌[Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989))]에 기재된 방법으로서, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의(contact definition)"라 불린다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명, 양태 및 도면에 있어서, 달리 나타내지 않는다면, Riechmann 및 Muyldermans에 의해 VHH 도메인에 적용되는 바와 같은 Kabat에 따른 넘버링을 따른다.
또한, 도면, 임의의 서열 목록 및 실험 파트/실시예는 단지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된 것이며, 본원에서 명백히 달리 나타내지 않는다면, 본 발명 및/또는 첨부된 청구범위를 어떠한 식으로든 한정하려는 것으로 해석되거나 간주되어서는 안 된다는 점에 유념해야 한다.
이하에서는, 본 발명을 후술하는 비한정적인 바람직한 양태, 실시예 및 도면을 이용하여 추가로 설명할 것이며, 여기서 도 1∼6은 본 발명에서 사용될 수 있는 유형의 약동학적 어세이를 수행하기 위한 다양한 구성을 모식으로 예시하고 있다(각 경우, 본 발명에서 사용된 켄처는 도시되지 않음).
달리 나타내지 않는다면, 하기 실험 파트에서 수행된 모든 단계들은 제조업자의 설명서에 따라 또는 당업자에게 널리 알려진 표준 조건을 이용하여 수행되었다.
실시예 1: 메소스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery™)(MSD) 플랫폼을 이용한 PK 어세이에서의 켄처의 사용
이 실시예는, 인간 혈청 샘플 중의 나노바디에 기초한 (융합) 단백질의 총 농도를 측정하기 위해 사용되는 약동학적 어세이에서의 켄처의 사용을 예시한다. 이 실시예에서는, 다양한 농도의 ALX-0171(인간 호흡기 합포체 바이러스에 대한 3가 나노바디 구성체; WO 2010/139808 참조)로 스파이킹된 인간 혈청 샘플 중의 ALX-0171의 농도를 측정하기 위해 메소스케일 디스커버리 플랫폼이 사용된다. 이 어세이 구성은 도 1에 모식적으로 도시된 것과 실질적으로 동일하다(다만, ALX-0171은, 도 1에 예시를 위해 도시된 2가 나노바디 구성체가 아니라 3가 나노바디 구성체임).
사용된 켄처는 3가 나노바디 구성체(N-말단 HIS-태그 및 서열 번호 1의 서열인 C-말단(즉, 임의의 C-말단 연장부가 없음)을 가지며, 그 서열은 도 7에 서열 번호 2로서 제시되어 있다.
ALX-0171 나노바디에 결합하여 중화시키는 바이오티닐화된 마우스 단클론 항체가 포획제로서 사용되었고(PBS/0.1% 카세인 중 5.0 ㎍/ml), 스트렙타비딘-골드-멀티어레이 96웰 플레이트에 고정화되었다. 테스트하려는 인간 혈청 샘플을 50배 희석하였다(먼저 PBS/0.1% 카세인에 5배 희석하고, 그 후 1000 mM 아세트산에 5배 희석함, RT에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 4.0 ㎍/ml의 켄처를 함유하는 1 M Tris-완충액, pH 9.5로 2배 희석함). RT에서 밤새 인큐베이션한 후, ALX-0171이 포획제에 의해 포획될 수 있도록 하는 표준 조건 하에 샘플을 포획제로 코팅된 96웰 플레이트에 (50 ㎕ 분액으로) 적용한다.
1시간의 인큐베이션과 세척 후, 검출제(ALX-0171 나노바디에 결합하여 중화시키는 SULFO 태깅 마우스 단클론 항체)를 첨가하여 고정화된 포획제에 의해 포획된 ALX-0171에 결합되도록 하였다. 세척 후, Sector Imager 2400을 이용하여, MDS 리드 완충액을 첨가한 후 10분 내에 플레이트의 각 웰의 전기발광 신호의 양을 측정하였다.
ALX-0171이 987 pg/mL∼658537 pg/mL의 알려진 농도로 인간 혈청 샘플로 스파이킹될 경우, 사용된 인간 혈청 샘플 중의 임의의 기존의 항체의 존재와 어세이의 일부로서의 켄처의 존재 또는 사용 중 어느 것도 ALX-0171의 농도 측정에 어떠한 유의적인 방식으로 영향을 미치지 않았음이 확인되었다. 이러한 농도는, 특히, (예를 들어, 나노바디에 기초한 치료제의 PK를 측정하기 위한 목적으로) 나노바디에 기초한 치료제를 이용하는 임상 시험 중에, 경우에 따라 적절한 희석 후에, 인간 대상으로부터 얻은 혈청 샘플에서 접하게 될 것으로 예상되는 나노바디에 기초한 치료제의 농도에 해당하는 일반적인 농도 범위 내에 속한다.
실시예 2: ELISA에 기초한 PK 어세이에서의 켄처의 사용
이 실시예는, 인간 혈청 샘플 중의 나노바디에 기초한 (융합) 단백질의 총 활성 농도를 측정하기 위해 사용되는 ELISA에 기초한 약동학적 어세이에서의 켄처의 사용을 예시한다.
이 실시예에서는, 나노바디가 IL-6 수용체 및 인간 혈청 알부민에 대해 유도된 이중특이성 구성체이다(WO 2008/020079 및 WO 2009/095489 참조). 잘 알려진 바와 같이, IL-6 수용체는 막결합 형태와 가용성 형태 둘 다로서 존재하는 것으로 알려져 있다. 이 실시예에 기재된 어세이는 샘플 중에 존재하는 "유리" 나노바디(즉, 사용된 혈장 샘플 중에 존재하는 가용성 IL-6 수용체에 결합되지 않음)와 가용성 IL-6 수용체에 결합된 나노바디를 포함하는 총 활성 농도를 측정할 수 있다.
이 어세이 구성은 도 4에 모식적으로 도시된 것과 실질적으로 같다.
사용된 켄처는 1가 나노바디 구성체(N-말단 HIS-태그 및 임의의 C-말단 연장부가 없는 서열 번호 1의 서열인 C-말단을 가짐)이며, 그 서열은 도 7에 서열 번호 3으로서 제시되어 있다.
나노바디의 프레임워크(들)를 인식하는 2가 나노바디가 포획제로서 사용되었고(BICA 완충액 중 3.0 ㎍/ml), C96 Maxisorp 플레이트 상에 코팅되었다. 테스트하려는 인간 혈청 샘플을 200배 희석하였다(먼저 PBS/0.1% 카세인에 20배 희석하고, 그 후 1600 mM 아세트산에 5배 희석함, RT에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 0.5 ㎍/ml의 인간 sIL-6 수용체 및 4.0 ㎍/ml의 켄처를 함유하는 1 M Tris-완충액, pH 9.5로 2배 희석함). RT에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 항-IL-6R 나노바디가 포획제에 의해 포획될 수 있도록 하는 표준 조건 하에 샘플을 포획제로 코팅된 96웰 플레이트에 (100 ㎕ 분액으로) 적용한다.
1시간의 인큐베이션과 세척 후, 가용성 IL-6 수용체의 용액(0.25 ㎍/ml)을 첨가하고 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 검출제(나노바디와 상이한 IL-6R 상의 에피토프를 인식하여 항체와 나노바디의 동시 결합을 가능하게 하는 마우스 단클론 항체 0.25 ㎍/ml)를 첨가하여, 고정화된 포획제에 의해 스스로 결합되어 있는 나노바디에 의해 포획된 IL-6R에 결합하도록 하였다. 세척 후, 0.65 ㎍/ml의 HRP 표지 토끼 항-마우스 Ig를 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고, 각 웰의 OD 신호를 620 nm를 레퍼런스로 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
항-IL-6R 나노바디가 20.0 ng/mL∼1483.1 ng/mL의 알려진 농도로 인간 혈청 샘플로 스파이킹될 경우, 사용된 인간 혈청 샘플 중의 임의의 기존의 항체의 존재와 어세이의 일부로서의 켄처의 존재 또는 사용 중 어느 것도 항-IL-6R 나노바디의 농도 측정에 어떠한 유의적인 방식으로 영향을 미치지 않았음이 확인되었다. 이러한 농도는, 특히, (예를 들어, 나노바디에 기초한 치료제의 PK를 측정하기 위한 목적으로) 나노바디에 기초한 치료제를 이용하는 임상 시험 중에, 경우에 따라 적절한 희석 후에, 인간 대상으로부터 얻은 혈청 샘플에서 접하게 될 것으로 예상되는 나노바디에 기초한 치료제의 농도에 해당하는 일반적인 농도 범위 내에 속한다.
실시예 3: 메소스케일 디스커버리™(MSD) 플랫폼을 이용한 PK 분석에서의 켄처의 사용
이 실시예는, 인간 혈청 샘플 중의 나노바디에 기초한 (융합) 단백질의 총 활성 농도를 측정하기 위해 사용되는 약동학적 어세이에서의 켄처의 사용을 예시한다. 이 실시예에서는, 메소스케일 디스커버리 플랫폼이 상이한 농도의 ALX-0761로 스파이킹된 인간 혈청 샘플 중의 ALX-0761(인터루킨 17 A 및 F에 대한 3가 나노바디 구성체)의 농도를 측정하기 위해 사용된다.
이 어세이 구성은 도 3에 모식적으로 도시된 것과 실질적으로 같다. 사용된 켄처는 1가 나노바디(임의의 C-말단 연장부를 갖지 않는 서열 번호 1의 서열을 갖는 C-말단을 가짐)였고, 그 서열은 도 7에 서열 번호 4로서 제시되어 있다.
나노바디의 프레임워크를 인식하는 바이오티닐화 마우스 단클론 항체가 포획제로서 사용되었고(PBS/0.1% 카세인 중 1.0 ㎍/ml), 스트렙타비딘-골드 멀티 어레이 96웰 플레이트 상에 고정화되었다. 테스트하려는 인간 혈청 샘플을 100배 희석하였다(20.0 ㎍/mL의 켄처 및 50.0 ㎍/mL의 항-IL-17 mAb(임의의 유리 IL-17이 어세이를 간섭하는 것을 막기 위해 첨가됨)를 함유하는 PBS/0.1% 카세인에 먼저 50배, 그 후 2배 희석함). RT에서 밤새 인큐베이션한 후, ALX-0761이 포획제에 의해 포획될 수 있도록 하는 표준 조건 하에 샘플을 포획제로 코팅된 96웰 플레이트에 (50 ㎕ 분액으로) 적용한다.
1시간의 인큐베이션과 세척 후, 가용성 IL-17A의 용액(2.0 ㎍/mL)을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 검출제(0.25 ㎍/ml의, 표적 IL-7A에 결합하는 SULFO 태깅 마우스 단클론 항체)를 첨가하여, 고정화된 포획제에 의해 스스로 결합되어 있는, 나노바디에 의해 포획된 IL-17A에 결합하도록 하였다. 세척 후, Sector Imager 2400을 이용하여, MSD 리드 완충액을 첨가한 후 10분 내에 플레이트의 각 웰의 전기발광 신호의 양을 측정하였다.
ALX-0761이 99.7 ng/mL∼3280.9 ng/mL의 알려진 농도로 인간 혈청 샘플로 스파이킹될 경우, 사용된 인간 혈청 샘플 중의 임의의 기존의 항체의 존재와 어세이의 일부로서의 켄처의 존재 또는 사용 중 어느 것도 ALX-0761의 농도 측정에 어떠한 유의적인 방식으로 영향을 미치지 않았음이 확인되었다. 이러한 농도는, 특히, (예를 들어, 나노바디에 기초한 치료제의 PK를 측정하기 위한 목적으로) 나노바디에 기초한 치료제를 이용하는 임상 시험 중에, 경우에 따라 적절한 희석 후에, 인간 대상으로부터 얻은 혈청 샘플에서 접하게 될 것으로 예상되는 나노바디에 기초한 치료제의 농도에 해당하는 일반적인 농도 범위 내에 속한다.
실시예 4: ELISA에 기초한 PK 어세이에서의 켄처의 사용
이 실시예는, 마우스 혈장 샘플 중의 나노바디에 기초한 (융합) 단백질의 농도를 측정하기 위해 사용되는 ELISA에 기초한 약동학적 어세이에서의 켄처의 사용을 예시한다.
이 실시예에서, 나노바디는 Her3이 대해 유도된 것이다. 이 실시예에 기재된 어세이는 샘플 중에 존재하는 ALX-0751의 농도를 측정할 수 있다.
어세이 구성은 도 5에 모식적으로 도시된 것과 실질적으로 같다.
사용된 켄처는 이중특이성 나노바디 구성체(임의의 C-말단 연장부가 없는 서열 번호 1의 서열인 C-말단을 가짐)였으며, 그 서열은 도 7에 서열 번호 5로서 제시되어 있다.
이 ELISA에서는, HER3-ECD(10:10 Trizma NaCl 완충액 중 1.5 ㎍/mL)는 C96 Maxisorp 플레이트 상에 코팅되어 있다. 테스트하려는 마우스 혈장 샘플을 1 mL당 200 ㎍의 켄처를 함유하는 PBS/0.1% 카세인에 20배 희석한다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후, ALX-0751이 포획제에 의해 포획될 수 있도록 하는 표준 조건 하에 샘플을 포획제(표적)로 코팅된 96웰 플레이트에 (50 ㎕ 분액으로) 적용한다.
1시간의 인큐베이션과 세척 후, 검출제(ALX-0751 나노바디의 프레임워크를 인식하는 1 ㎍/ml의 바이오티닐화된 나노바디)를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, HRP 표지된 스트렙타비딘을 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 각 웰의 OD 신호를 620 nm를 레퍼런스로 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
ALX-0751이 24.9 ng/mL∼266.7 ng/mL의 알려진 농도로 마우스 혈장 샘플로 스파이킹될 경우, 사용된 마우스 혈장 샘플 중의 임의의 기존의 항체의 존재와 어세이의 일부로서의 켄처의 존재 또는 사용 중 어느 것도 ALX-0751의 농도 측정에 어떠한 유의적인 방식으로 영향을 미치지 않았음이 확인되었다. 이러한 농도는, 특히, (예를 들어, 나노바디에 기초한 치료제의 PK를 측정하기 위한 목적으로) 나노바디에 기초한 치료제를 이용하는 전임상 시험 중에, 경우에 따라 적절한 희석 후에, 마우스로부터 얻은 혈장 샘플에서 접하게 될 것으로 예상되는 나노바디에 기초한 치료제의 농도에 해당하는 일반적인 농도 범위 내에 속한다.
실시예 5: 21-4에 대한 친화성을 측정하기 위한 프로토콜
25℃에서 러닝 완충액 HBS-EP+를 사용하여, CM5 센서 칩을 이용하는 Biacore T100에 의해 결합 측정을 수행하였다. 직접적으로 고정화된 mAb 21-4 표면은 효율적으로 재생될 수 없는 것으로 확인되었기 때문에, 21-4를 고정화된 토끼 항-마우스 IgG를 통해 포획하였다. 사용된 항-마우스 IgG는 모든 IgG 서브클래스, IgA 및 IgM과 반응하는 다클론 토끼 항-마우스 IgG 항체였다(GE Healthcare; Cat#BR-1008-38; Lot#10111487). 항-마우스 IgG의 고정화는, 활성화를 위한 EDC/NHS의 7분 주입과 불활성화를 위한 1 M 에탄올아민 HCl, pH 8.5의 7분 주입을 이용하여 수동 아민 커플링을 이용하여 수행하였다(Biacore, 아민 커플링 키트). 결합 조건은 하기 표 I에 기재되어 있다. 고정화 수준과 단백질의 분자량에 기초할 때, 고정화된 항-마우스 IgG에 결합하는 mAb21-4에 대한 이론적 Rmax는 ∼13000 RU였다(하나의 mAb21-4 분자가 하나의 항-마우스 IgG 분자에 결합할 경우).
Figure pct00001
고정화된 21-4를 사용하는 결합 실험(Biacore T100)에 이용된 조건은 도 8에 제시된다. 항-마우스 IgG 표면은, mAb 21-4의 포획 및 모든 샘플의 주입 후 성공적으로 재생될 수 있었다(각 재생 후 베이스라인 수준에 대해 제한된 증가로).
상기 프로토콜을 이용하여, 하기 표 II에 기재된 바와 같은 다양한 켄처에 대한 21-4 친화성 데이터를 얻었다.
Figure pct00002
SEQUENCE LISTING <110> Ablynx N.V. <120> Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains <130> 197447 <150> US62/353,784 <151> 2016-06-23 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end of ISVD <400> 1 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher <400> 2 His His His His His His Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 180 185 190 Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln 195 200 205 Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly 210 215 220 Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg 225 230 235 240 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 245 250 255 Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser 260 265 270 Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly 275 280 285 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 325 330 335 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu 340 345 350 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp 355 360 365 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser 370 375 380 Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 385 390 395 400 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 405 410 415 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly 420 425 430 Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 435 440 445 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher <400> 3 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Quencher <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Lys Ser Ser Gly Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Thr Tyr Asp Asn Arg 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met 165 170 175 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 180 185 190 Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp 195 200 205 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu 245 250 255 Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270

Claims (8)

  1. 샘플 중의, 하나 이상의 ISVD, 또는 하나 이상의 ISVD를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 양 및/또는 농도를 측정하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플을 포획제와 접촉시켜, ISVD, 단백질 또는 폴리펩티드가 상기 포획제에 의해 포획되도록 하는 단계;
    b) 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질 또는 폴리펩티드를 검출제와 접촉시켜, 상기 검출제가 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하도록 하는 단계;
    c) 상기 포획제에 의해 포획된 ISVD, 단백질 또는 폴리펩티드에 결합된 검출제의 양에 상응하는 신호를 발생시키는 단계
    를 포함하며, 상기 방법은 켄처의 존재 하에 수행되고, 상기 켄처는, 기존의 항체는 결합할 수 있지만 상기 포획제와 상기 검출제 중 어느 것도 결합할 수 없는 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 켄처로서 사용된 단백질 또는 폴리펩티드가 1 마이크로몰(μM)보다 우수한 친화성으로, 예컨대 1000 내지 1 nM의 친화성으로 단클론 항체 21-4에 의해 결합되는 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 켄처로서 사용된 단백질 또는 폴리펩티드가, 3 마이크로몰보다 낮은/나쁜 친화성으로, 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 더 바람직하게는 50 마이크로몰 미만, 예컨대 100 마이크로몰보다 나쁜 친화성으로, 의도된 포획제 및 의도된 검출제에 의해 결합되는 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 켄처가 1가 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 5개 이하, 예컨대 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(들)을 포함하는 융합 단백질 또는 구성체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 켄처 내에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 중 적어도 하나가 노출된 C-말단을 갖는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 노출된 C-말단을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 중 적어도 하나가 그의 C-말단에 서열 VTVSS(서열 번호 1)를 갖는 것인 방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 적어도 켄처가 그의 C-말단에 면역글로불린 단일 가변 도메인을 갖는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 켄처의 C-말단의 면역글로불린 단일 가변 도메인(및 연장에 의해, 전체 켄처)이 그의 C-말단에 서열 VTVSS(서열 번호 1)를 갖는 것인 방법.
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