KR20190018314A - 아미노레불린산 헥실 에스테르 봉입 리포좀 및 그 제조방법 - Google Patents

아미노레불린산 헥실 에스테르 봉입 리포좀 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노레불린산 헥실 에스테르 (aminolevulinic acid hexyl ester, hexyl levulinate, 이하 HAL)를 함유하는 리포좀 조성물과 이를 함유하는 화장품 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 a) HAL과 상호작용하여 리포좀내에 HAL을 유지되도록 할 수 있는 염을 리포좀 내부와 외부에서 서로 다른 농도로 존재하도록 하여 봉입효율을 극대화하고, b) 아민기를 함유하는 HAL이 리포좀 내로 봉입이 잘 되도록 하고 보관중에 리포좀으로부터의 방출을 최소화할 수 있는 지질조성을 도입하여 HAL 함유 고봉입효율 리포좀 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 수용액상에서 불안정한 HAL을 안정화시키며, 또한 생체막 투과를 증진시킬 수 있는 리포좀 조성물을 제공할 수 있다. 이를 통하여 광역동치료의 효과를 극대화할 수 있다.

Description

아미노레불린산 헥실 에스테르 봉입 리포좀 및 그 제조방법 {Aminolevulinic acid hexyl ester-encapsulated liposome, and preparing method thereof}
본 발명은 아미노레불린산 헥실 에스테르 (aminolevulinic acid hexyl ester, hexyl levulinate, 이하 HAL)를 봉입한 리포좀 및 그 제조방법, 그리고 이를 함유하는 화장품 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
5-아미노레불린산 (5-aminolevulinic acid, 이하 ALA)은 체내에서 생성되는 물질로서, 포유동물에서는 ALA로부터 프로토포르피린 (protoporphyrin) IX (PpIX)를 거쳐 포르피린 (porphyrin) 분자의 일종인 헴 (heme)이 생성된다. 포르피린류는 빛을 강하게 흡수하며, 빛을 쪼인 부위에서 활성산소를 생성하므로 이를 이용하여 광역동치료 (photodynamic therapy)를 하고자 하는 시도가 광범위하게 이루어지고 있다.
헴생성과정에서 속도결정단계가 두 단계가 있으며, 이중 하나는 숙시닐 (succinyl) CoA와 글리신(glycine)으로부터 ALA 신세타제 (synthetase)의 작용으로 ALA가 생성되는 반응이며, 다른 하나는 페로킬레타제 (ferrochelatase) 효소에 의해 PpIX가 헴으로 전환되는 반응이다 (D. Martin, Porphyrins, in: D. Martin, P. Mayes, V. Rodwel (Eds.), Harper´s Review of Biochemistry, Los Altos, CA, Lange Medical Publications, 1983, pp. 317-333.). 세포가 과량의 외인성 ALA에 노출되면 첫 번째 속도결정단계를 건너뛰게 되어 PpIX의 축적을 일으키게 되어 결국 세포사멸을 유발한다 (J. Van Steveninck 등. Photochem. Photobiol. 44 (1986) 711-716). 동물에서 암에 대한 광역동치료를 위해 PpIX 생성을 유도하기 위해 ALA를 전신투여하거나 혹은 국소투여한다 (J. Kennedy과 R. Pottier, J. Photochem. Photobiol. B 14 (1992) 275-292).
국소 광역동치료는 또한 다양한 피부 및 모낭관련 질환에도 활용되고 있다. 예를 들어 자외선각화증(actinic keratoses), 소양증(psoriasis), 보웬 질환(Bowen’s disease), 피부암 및 여드름(acne) 등의 치료를 위해 ALA를 국소적용하여 표피에서 PpIX 생성을 유도하도록 한다 (E.K Oh등, European Journal of Pharmaceutical Sciences 44 (2011) 149-157).
그러나 ALA는 양성전해질로서 친수성이 강하여 피부 각질층과 같은 조직장벽을 투과하기는 매우 어렵다. 따라서 ALA의 투과 깊이가 국소 투여를 통한 ALA 광역동치료에서 해결되어야 할 과제이다 (C. Fritsch 등, Br. J. Cancer 79 (1999) 1603-1608). 이에 ALA의 에스테르화 유도체를 이용하여 ALA의 생체막 투과도를 증가시키고자 하는 시도가 이루어져 왔다 (H. Brunner 등, Photochem. Photobiol., 74 (2001) 721-725). 헥실 에스테르의 경우 ALA보다 더 낮은 농도에서 PpIX의 생성을 유도하고, 또한 생성 속도도 더 빠른 것으로 보고된 바 있다 (W. Xiang 등, Photochem Photobiol 74 (2001) 617-623). 그러나 에스테르화 유도체들도 ALA의 수용액 상태에서의 화학적 불안정성을 완전히 개선하지는 못하는 것으로 알려져 있다 (M. Kaliszewski 등, Acta Poloniae Pharmaceutica, 61 (2004) 15-19; A. Babi
Figure pat00001
, Journal of Controlled Release 235 (2016) 155-164). 이에 ALA 뿐만 아니라 그 에스테르 유도체들에 대해서도 화학적 안정성, 피부나 세포막으로의 투과성 및 암동역동치료에 있어 세포내 이행특이성 등을 높이기 위하여 리포좀이나 다른 약물전달시스템을 활용하고자 하는 시도들이 이루어져 왔다 (H. Pass, J. Natl. Cancer Inst. 85 (1993) 443-456).
그러나 현재 발표된 여러 연구들에 따르면 ALA 및 그 유도체를 함유하는 리포좀들이 봉입효율이 높지 않거나, 제조과정이 복잡하고 또한 수상에 분산된 상태로서는 물리화학적 안정성이 충분치 않다는 단점이 있다.
베르노사 (Vernosa) 등의 연구발표에 따르면 ALA와 헥실 에스테르 유도체에 대해 3종의 리포좀 조성물을 가지고 봉입효율을 평가한 결과 ALA의 경우에는 1.4∼21.4% 정도를 얻은 반면, 헥실 에스테르의 경우 2.6∼69.5% 정도의 봉입효율을 나타내었으며, 이 봉입효율은 4℃에서 1주일 보관하는 동안 원래의 봉입효율을 유지하는 것으로 나타났지만, 물리적 안정성은 장시간 유지되지 않았다 (G. Di Vernosa 등, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 92 (2008) 1-9).
케사스 (Casas) 등도 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine)을 이용하여 ALA 및 헥실 에스테르를 함유하는 중성 리포좀을 제조하였으며, 이 리포좀의 경우에도 봉입효율이 5%정도에 불과하였으며, 리포좀은 제조 즉시 사용하는 등 리포좀의 안정성이 확보되지 못한 것으로 추정된다 (A. Casas등, British Journal of Cancer 86 (2002) 837-842).
따라서 ALA의 경우 화학적 안정성이 보다 개선된 헥실 에스테르로 개발하였다 하더라도, 이 유도체의 수용액 중에서의 화학적 분해를 방지하고, 유리형 약물과는 다른, 보다 더 특이적인 세포내 이행특성이나 생체내 거동을 나타내도록 하기 위해서는 봉입효율이 높으면서 지속적으로 봉입된 상태로 유지되도록 할 수 있는 리포좀 조성물의 개발 및 제조방법의 도입이 요구된다.
1) G. Di Vernosa 등, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 92 (2008) 1-9; 2) A. Casas등, British Journal of Cancer 86 (2002) 837-842.
본 발명의 목적은 봉입 효율이 높은 HAL 봉입 리포좀의 제조방법을 제공하는 데 있다. 또한 보관중 제제로부터의 봉입물질의 방출이 최소화되는 안정한 HAL 봉입 리포좀 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
이에 본 발명자는 HAL과 상호작용을 통하여 리포좀 내에 HAL을 유지되도록 할 수 있는 염을 리포좀 내부와 외부에서 서로 다른 농도로 존재하도록 하여 HAL 봉입 효율을 극대화할 수 있음을 발견하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다. 또한 HAL이 리포좀 내로 봉입이 잘 되도록 할 수 있을 뿐만 아니라 보관중에 리포좀으로부터의 방출을 최소화할 수 있는 신규한 지질조성을 발견하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HAL과 상호작용을 통하여 리포좀 내에 HAL을 유지되도록 할 수 있는 염을 리포좀 내부와 외부에서 서로 다른 농도로 존재하도록 하여 HAL 봉입 효율을 극대화할 수 있는 HAL 봉입 리포좀의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아민기를 함유하는 HAL이 리포좀 내로 봉입이 잘 되도록 하고 보관중에 리포좀으로부터의 방출을 최소화할 수 있는 신규한 지질조성을 이용하여 제조되는 HAL 봉입 리포좀 및 그 제조방법, 그리고 이를 함유하는 화장품 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 하기 [1]~[10]를 제공하는 것이다.
[1] 아미노레불린산 헥실 에스테르 (HAL)와 상호작용할 수 있는 염을 이용하여 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배를 형성시켜 HAL을 40% 이상의 고효율로 봉입하는 것을 특징으로 하는, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[2] [1]에 있어서, 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배가 10 내지 10,000 : 1인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[3] [2]에 있어서, 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배가 100 내지 1000 : 1인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[4] [1]에 있어서,
1) 리포좀을 구성하는 인지질을 클로르포름에 녹인 후 이 액을 감압하에서 증발건고하여 지질필름을 형성시키고,
2) 형성된 지질필름에 염을 함유하는 수용액을 가하여 인지질 필름을 분산시켜 리포좀 분산액을 제조하고,
3) 초음파분쇄기를 사용하여 리포좀 입자를 균질화하거나, 혹은 막을 통한 압출 (extrusion)을 실시하여 입자크기를 조절하고,
4) 얻어진 리포좀을 당초 농도의 희석농도로서 1/10,000 내지 1/10 농도의 염 수용액을 매질로 하여 투석을 실시하여 리포좀 외상을 1/10,000 내지 1/10 농도의 염 수용액으로 교환하여 리포좀 내부와 외부간에 염 농도구배를 형성시키고,
5) 얻어진 리포좀 분산액에 HAL을 가하여 인지질의 상전이온도 이상에서 교반하면서 방치하여 HAL을 리포좀 내로 봉입시키는 단계를 포함하는 것인,
HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[5] [4]에 있어서, 상기 단계 4)에서 사용한 희석농도가 1/2,000 내지 1/100 인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[6] [1]에 있어서, 상기 염이 암모늄염인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[7] [4]에 있어서, 리포좀을 구성하는 인지질로서, 중성 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤 (phsophatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phsophatidylserine), 및 포스파틱산(phosphatidic acid), 양이온 성 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합물을 사용하는 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[8] 리포좀을 구성하는 인지질로서, 중성 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤 (phsophatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phsophatidylserine), 및 포스파틱산(phosphatidic acid), 양이온 성 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합물을 사용하여, [1]의 제조방법으로 제조된 것인, HAL 봉입 리포좀;
[9] [4]에 있어서, 리포좀을 구성하는 인지질로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 인지질 또는 둘 이상의 인지질 혼합물과 포스파티딜세린(PS) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 사용하는 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법;
[10] 리포좀을 구성하는 인지질로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 인지질 또는 둘 이상의 인지질 혼합물과 포스파티딜세린(PS) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 사용하여, [1]의 제조방법으로 제조된 것인, HAL 봉입 리포좀;
[11] [8] 또는 [10]의 HAL 봉입 리포좀을 함유하는 화장품; 및
[12] [8] 또는 [10]의 HAL 봉입 리포좀을 함유하는 약제학적 조성물.
이하에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
a) HAL과의 상호작용을 통하여 리포좀 내에 HAL을 고농도로 유지되도록 할 수 있는 염으로서는 암모늄 (ammonium) 염을 사용한다. 리포좀을 구성하는 인지질을 클로르포름에 녹인 후 이 액을 감압하에서 증발건고하여 지질필름을 형성시킨다. 형성된 지질필름은 질소가스를 불어넣어 미량 남은 클로르포름을 완전히 제거하도록 한다. 그런 다음 암모늄 염을 함유하는 수용액을 가하여 인지질 필름을 분산시켜 일차 리포좀 분산액을 제조한다. 일차 리포좀 분산액은 다시 프로브형 (probe type) 혹은 수욕상 (bath type)의 초음파분쇄기 (sonicator)나 고압 호모게나이저 (high pressure homogenizer)를 이용하여 리포좀 입자를 균질화하거나, 혹은 막을 통한 압출 (extrusion)을 실시하여 입자크기를 조절한다. 입자크기가 조절된 리포좀은 당초 농도의 1/1000 농도의 암모늄 염 수용액을 매질로 하여 투석을 실시하여 리포좀 외상을 1/1000 농도의 암모늄 염 수용액으로 교환하여 리포좀 내부와 외부간의 암모늄 염 농도구배를 형성시킨다. 이 리포좀 분산액에 HAL을 가하여 인지질의 상전이온도 이상에서 교반하면서 방치하여 HAL이 리포좀 내로 이행되도록 한다.
상기 암모늄 염은 황산암모늄 (ammonium sulfate), 염화암모늄 (ammonium chloride), 초산암모늄 (ammonium acetate), 글루콘산암모늄 (ammonium gluconate), 인산암모늄 (ammonium phosphate), 시트르산암모늄 (ammonium citrate) 및 이들의 혼합물중에서 1 종을 선택할 수 있다.
상기 염의 농도는 리포좀 내부와 외부 사이의 농도구배가 약 10∼10,000배가 나도록 하며, 바람직하게는 100∼1000배의 차이가 나도록 한다.
b) 구조 중에 아민기를 함유하는 HAL의 봉입이 잘 되도록 하기 위하여 리포좀 막 구성 인지질에 중성지질을 기본으로 음이온성 지질을 적절히 배합한다. 또한 여기에 적절히 양이온성 지질을 함유시킬 수 있다. 예를 들어 중성지질로서는 L-a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine, PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phophocholine, DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phophocholine, DPPC), 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine, HPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoylsn-glycero-3-phophoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phophoethanolamine, DPPE), 콜레스테롤 (cholesterol), 및 이소프로필 미리스테이트 (isopropyl myristate) 등 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
상기 음이온성 지질로는 L-α-포스파티딕산(L-α-phosphatidic acid), L-α-포스파티딜-DL-글리세롤(L-α-phosphatidyl-DL-glycerol), 카디오리핀(cardiolipin), L-a-포스파티딜이노시톨(L-aphosphatidylinositol), L-α-포스파티딜세린(L-α-phosphatidylserine), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DLPG), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DLPS), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate, DLPA), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DMPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DMPS), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate, DMPA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, DOPA), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DPPS), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate, DPPA), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DSPG), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DSPS), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate, DSPA),1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌글리콜2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)2000]), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine -N-[maleimide(polyethylene glycol)2000]), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)2000]), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], POPG), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], POPS), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스페이트(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate, POPA) 및 올레산 (oleicacid) 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
상기 양이온성 지질로서는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane, DOTAP), 디올레오일 글루타마이드 (dioleoyl glutamide), 디스테아로일 글루타마이드 (distearoyl glutamide), 디팔미토일 글루타마이드 (dipalmitoyl glutamide), 디올레오일 아스파르타마이드 (dioleoyl aspartamide), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, DODAP), ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄-카바모일], (3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl], DC-Chol), 및 메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDAB), 콜레스테롤 등 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
상기 인지질로서 바람직하기로는 중성 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤 (phsophatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phsophatidylserine), 및 포스파틱산(phosphatidic acid), 양이온 성 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.
보다 더 바람직하게는 상기 인지질의 지질사슬이 탄소수가 14 이상인 것을 사용한다.
상기한 성분을 포함하여 이루어지는 본 발명의 리포좀은 HAL의 봉입률이 40% 이상이며, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱더 바람직한 경우에는 90% 이상까지도 가능하다. 리포좀의 크기는 10 내지 5000 nm 범위로 이루어진다.
본 발명은 리포좀에 봉입한 HAL의 생체막 투과증진을 위해 적용가능하다. 적용부위로서는 피부, 위장관 점막, 구강점막, 비강점막, 질점막 및 직장점막 등이 가능하며, 투여경로로는 상황에 따라 국소, 전신, 경구투여가 가능하다.
본 발명의 리포좀 조성물은 화장품이나 의약품에 사용될 수 있으며, 제형으로는 로숀, 크림, 주사제, 연고제, 겔제, 로션제, 캡슐제, 정제, 액제, 현탁제, 분무제, 흡입제, 점안제, 점착제, 첩부제 중에서 선택된 제형인 것이 바람직하며, 국소적용 제형에 보다 더 바람직하다.
상기한 본 발명에 의하면, 수용액상에서 불안정한 HAL을 안정화시키며, 또한 생체막 투과를 증진시킬 수 있는 리포좀 조성물을 제공할 수 있다. 이를 통하여 광역동치료의 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 HAL 함유 리포좀을 4℃에서 보관할 때 시간에 따른 봉입된 HAL의 리포좀내 잔존율을 나타낸 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
다음 표 1, 2, 3 및 4와 같은 조성 및 함량을 이용하여, 우선 인지질을 함유하는 클로르포름 용액을 취하여 유리관에 넣고 충분히 와류교반기(vortex mixer)를 이용하여 충분히 혼합하였다. 그런 다음 감압회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 약 1시간 이상 유기용매를 완전히 제거하여 유리관 표면에 인지질 피막이 형성되도록 하였다. 인지질 피막은 다시 질소가스를 불어넣어 유기용매를 제거하는 과정을 거쳐 클로르포름을 완전히 제거하였다. 그런 다음 여기에 염 용액 1 mL을 가하여 인지질의 종류에 따라 인지질의 전이온도 보다 높은 온도인 40 내지 70 ℃에서 회전시키면서 인지질피막이 수화되면서 피막이 벗겨져 리포좀이 형성되도록 하였다. 형성된 리포좀은 다시 수욕상 초음파분쇄기(bath type sonicator)를 이용하여 더 미세, 균질하게 분산되도록 하였다. 이 리포좀을 다시 압출 장치를 이용하여 최종적으로 100 nm 입자크기의 막을 통과시켜 리포좀의 입자크기를 조절하였다. 제조된 리포좀 분산액은 분자배제 크기 한도가 10,000인 투석막을 이용하여, 투석액을 0.2 mM 염 수용액으로 투석을 실시함으로서 리포좀 외부의 액을 내부액보다 1/1000 희석된 액으로 교환하여 농도 구배를 형성시켰다. 그런 다음 여기에 HAL 수용액 100 ㎕를 가하여 인지질의 전이온도 보다 높은 온도인 40 내지 70 ℃에서 2시간 방치하였다. 이렇게 HAL이 봉입된 리포좀은 다시 투석을 실시하여 미봉입약물을 제거한 후 4℃에 보관하였다.
실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6
지질
(μmol)		 달걀 (egg) PC 10 10
HPC 10 10
DSPC 10 10
PEG2000DSPE 0.5 0.5 0.5
DSPG
DOTAP
콜레스테롤 5 5 5 5 5
봉입물질
(mM)		 HAL 2 2 2 2 2 2
염(mM) 황산암모늄 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200
시트르산암모늄
염화암모늄
글루콘산암모늄
인산암모늄
초산암모늄
실시예7 실시예8 실시예9 실시예10 실시예11 실시예12
지질
(μmol)		 달걀 PC 10 10
HPC 10 10
DSPC 10 10
PEG2000DSPE 0.5 0.5 0.5
DSPG
DOTAP
콜레스테롤 5 5 5 5 5 5
봉입물질
(mM)		 HAL 2 2 2 2 2 2
염(mM) 황산암모늄
시트르산암모늄 2/20/200 2/20/200
염화암모늄 2/20/200 2/20/200
글루콘산암모늄 2/20/200 2/20/200
인산암모늄
초산암모늄
실시예13 실시예14 실시예15 실시예16 실시예17 실시예18
지질
(μmol)		 달걀 PC 8 8
HPC 8 8
DSPC 8 8
PEG2000DSPE 0.5 0.5 0.5
DSPG 2 2 2 2 2 2
DOTAP
콜레스테롤 5 5 5 5 5
봉입물질
(mM)		 HAL 2 2 2 2 2 2
염(mM) 황산암모늄 2/20/200 2/20/200
시트르산암모늄
염화암모늄
글루콘산암모늄
인산암모늄 2/20/200 2/20/200
초산암모늄 2/20/200 2/20/200
실시예19 실시예20 실시예21 실시예22 실시예23 실시예24
지질
(μmol)		 달걀 PC 8 8
HPC 8 8
DSPC 8 8
PEG2000DSPE 0.5 0.5 0.5
DSPG
DOTAP 2 2 2 2 2 2
콜레스테롤 5 5 5 5 5
봉입물질
(mM)		 HAL 2 2 2 2 2 2
염(mM) 황산암모늄 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200 2/20/200
시트르산암모늄
염화암모늄
글루콘산암모늄
인산암모늄
초산암모늄
[실험예 1] 봉입효율측정
실시예 중에서 암모늄 염 농도 200 mM를 사용하여 제조한 리포좀에 대하여 HAL을 가한 후 투석을 거치고, 이 리포좀 액 100 μL를 취하여 여기에 아세토니트릴 100 μL를 가하였다 그런 다음 이 액을 0.45μm를 통하여 여과한 후, 이 여액 20 μL에 아세토니트릴에 녹인 0.1% 플루오레스카민 (fluorescamin) 액 200 μL와 0.1 M 붕산염 완충액 (borate buffer: pH 8.0) 200 μL를 가하여 잘 혼합하여 실온에서 3분간 방치하였다. 그런 다음 이 반응액을 가지고 다음의 조건으로 HPLC 분석을 실시하였다. 봉입효율(%)은 리포좀 제조에 가해준 량을 100%로 하여 투석 후 봉입되어 남아있는 약물량의 백분율로서 산출하였다. 그 결과는 표 5에 요약하였다.
HPLC 조건
HPLC 기기: Shiseido SI 2 system
이동상 A : 0.1% trifluoroacetic acid(TFA) 수용액
이동상 B : 0.1% TFA/acetonitrile 액
이동상 조건: 기울기 용리
Figure pat00002
칼럼: Cadenza CD-C18 (Imtakt, 150×4.6 mm, 3 μm)
검출기: UV detector, 405 nm
칼럼 온도: 35℃
주입량: 20 μL

봉입
효율
(%)		 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8
85 88 86 87 90 92 78 77
실시예9 실시예10 실시예11 실시예12 실시예13 실시예14 실시예15 실시예16
60 62 72 74 78 80 68 66
실시예17 실시예18 실시예19 실시예20 실시예21 실시예22 실시예23 실시예24
91 90 54 55 48 49 52 54
[실험예 2] 입자크기 측정
실시예 중에서 암모늄 염 농도 200 mM를 사용하여 제조한 리포좀에 대하여 HAL을 가한 후 투석을 거치고, 이 리포좀 액을 가지고 입도분석기 (Otsuka사)를 이용하여 입자크기를 측정하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

입자
크기
(nm)		 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8
210 250 460 430 360 350 220 230
실시예9 실시예10 실시예11 실시예12 실시예13 실시예14 실시예15 실시예16
560 520 310 305 180 160 290 310
실시예17 실시예18 실시예19 실시예20 실시예21 실시예22 실시예23 실시예24
360 320 220 260 450 480 350 310
[실험예 3] 저장기간동안의 리포좀내 잔존률
리포좀 분산액을 4℃에 보관하면서 200 μL를 꺼내어 분자배제크기가 3000 Da인 막이 장착된 원심분리관에 가하여 원심분리하여 방출된 HAL을 리포좀에 봉입된 HAL과 분리하였다. 그런 다음 분리된 HAL을 상기의 HPLC법으로 정량하였다. 시간에 따른 리포좀내 잔존율을 도 1에 나타내었다.

Claims (12)

  1. 아미노레불린산 헥실 에스테르 (HAL)와 상호작용할 수 있는 염을 이용하여 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배를 형성시켜 HAL을 40% 이상의 고효율로 봉입하는 것을 특징으로 하는, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배가 10 내지 10,000 : 1인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 리포좀 내부와 외부 사이 염의 농도구배가 100 내지 1000 : 1인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    1) 리포좀을 구성하는 인지질을 클로르포름에 녹인 후 이 액을 감압하에서 증발건고하여 지질필름을 형성시키고,
    2) 형성된 지질필름에 염을 함유하는 수용액을 가하여 인지질 필름을 분산시켜 리포좀 분산액을 제조하고,
    3) 초음파분쇄기를 사용하여 리포좀 입자를 균질화하거나, 혹은 막을 통한 압출 (extrusion)을 실시하여 입자크기를 조절하고,
    4) 얻어진 리포좀을 당초 농도의 희석농도로서 1/10,000 내지 1/10 농도의 염 수용액을 매질로 하여 투석을 실시하여 리포좀 외상을 1/10,000 내지 1/10 농도의 염 수용액으로 교환하여 리포좀 내부와 외부간에 염 농도구배를 형성시키고,
    5) 얻어진 리포좀 분산액에 HAL을 가하여 인지질의 상전이온도 이상에서 교반하면서 방치하여 HAL을 리포좀 내로 봉입시키는 단계를 포함하는 것인,
    HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 4)에서 사용한 희석농도가 1/2,000 내지 1/100 인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 염이 암모늄염인 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서, 리포좀을 구성하는 인지질로서, 중성 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤 (phsophatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phsophatidylserine), 및 포스파틱산(phosphatidic acid), 양이온 성 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합물을 사용하는 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  8. 리포좀을 구성하는 인지질로서, 중성 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤 (phsophatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티딜세린(phsophatidylserine), 및 포스파틱산(phosphatidic acid), 양이온 성 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합물을 사용하여, 제 1항의 제조방법으로 제조된 것인, HAL 봉입 리포좀.
  9. 제 4항에 있어서, 리포좀을 구성하는 인지질로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 인지질 또는 둘 이상의 인지질 혼합물과 포스파티딜세린(PS) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 사용하는 것인, HAL 봉입 리포좀의 제조방법.
  10. 리포좀을 구성하는 인지질로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 인지질 또는 둘 이상의 인지질 혼합물과 포스파티딜세린(PS) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 사용하여, 제 1항의 제조방법으로 제조된 것인, HAL 봉입 리포좀.
  11. 제 8항 또는 제 10항의 HAL 봉입 리포좀을 함유하는 화장품.
  12. 제 8항 또는 제 10항의 HAL 봉입 리포좀을 함유하는 약제학적 조성물.

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Non-Patent Citations (2)

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1) G. Di Vernosa 등, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 92 (2008) 1-9;
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