KR20190016466A

KR20190016466A - 돌연변이에 의해, 혈중 반감기 및 공수병 바이러스 중화 효능이 증대된 공수병 바이러스 중화 항체

Info

Publication number: KR20190016466A
Application number: KR1020180092636A
Authority: KR
Inventors: 고기성; 박솔아; 송일찬
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2019-02-18
Also published as: KR102642178B1

Abstract

본 발명은 돌연변이에 의해, 혈중 반감기 및 공수병 바이러스 중화 효능이 증대된 공수병 바이러스 중화 항체 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 또는 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체에 대한 것이다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 또는 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체는 시중항체 및 기존 식물유래 항체보다도 혈중 반감기가 매우 증가되고, 공수병 바이러스 중화효능 또한 뛰어나 공수병 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

돌연변이에 의해, 혈중 반감기 및 공수병 바이러스 중화 효능이 증대된 공수병 바이러스 중화 항체{Mutant anti-rabies antibody with improved serum half-lives and neutralizing rabies virus}

본 발명은 돌연변이에 의해, 혈중 반감기 및 공수병 바이러스 중화 효능이 증대된 공수병 바이러스 중화 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체에 대한 것이다.

공수병(rabies)은 바이러스성 인수공통 감염병이며, 주로 야생 및 애완동물에 영향을 미칠 뿐 아니라 인간을 포함한 포유류에게 영향을 미쳐 급성 뇌 질환의 원인이 된다. 한 번 발생하면 거의 사망에 이르는 치명적인 질병으로, 에이즈와 더불어 치사율이 가장 높은 질병으로 알려져 있다. 이러한 공수병은 전 세계적으로 퍼져 있으며, 매년 천만 명 이상이 감염 후 치료를 받으며 매년 40,000명에서 70,000명이 사망한다.

공수병은 타액과 피로 전염되는데, 주로 공수병에 감염된 개 또는 고양이 등에 물리게 되면 발병한다. 또한 스컹크, 박쥐 등 대부분의 포유류에 의해 감염될 수 있다.

공수병 바이러스(rabies virus)는 신체의 말단 신경 조직을 통해 뇌신경 조직으로 도달한 뒤 실제 발병 증상을 나타낸다. 원래 인간의 뇌에는 혈액 내 장벽(blood brain barrier)이 존재하여 외부 물질을 차단하기 때문에 바이러스 등이 침투할 수 없으나, 공수병 바이러스는 RVG(rabies virus glycoprotein) 단백질을 통해 혈액 내 장벽을 통과하여 중추신경계(central nervous system) 뇌를 감염시킨다.

초기에는 감기와 비슷한 증상 이외에, 물린 부위에 가려움증이나 열을 느낀다. 공수병이 진행되면서 불안감, 공수증(물 등의 액체를 삼키게 되면 근육이 경련을 일으키고 심한 통증을 느껴 물을 두려워하는 증상), 바람에 대한 두려움(바람이 감각 기관을 과민하게 함), 흥분, 마비, 정신 이상 등의 신경 이상 증상이 나타난다. 또한 햇빛에 과민 반응을 일으키기도 한다. 이러한 증상이 관찰된 지 2-7일 뒤에 전신의 신경이나 근육이 마비를 일으켜 혼수 상태에 빠지고, 결국 호흡 장애로 사망하게 된다.

현재 공수병에 대한 예방 주사는 있으나 치료제는 없는 실정이다. 공수병에 노출된 후의 처치로는 교상 후 치료법 (노출 후 예방요법)이 있다. 교상 후 치료법은 즉각적인 국소 상처 보호와 수동면역을 위한 항체 투여(항-공수병 이뮤노글로블린: 이하 "anti-rabies antibody"라 칭함), 능동 면역을 위한 백신 투여로 이루어 져 있다. 현재 개발된 anti-rabies antibody는 인간 유래 공수병 항체(human derived rabies immunoglobulin: 이하 "HRIG"라 칭함)와 말 유래 공수병 항체(equine derived rabies immunoglobulin: 이하 "ERIG"라 칭함)가 있다. HRIG의 경우 공급이 원활하지 않으며 고가인데다 다클론 항체(polyclonal antibody)여서 단위 무게당 효능이 높지 않다. 또한 인간의 혈액에서 유래한 것이기 때문에 HIV 등 인간 유래 질병의 잠재적 감염 위험성이 높다. ERIG의 경우 HRIG보다 저가이기는 하나 이 역시 원활한 공급이 되지 않고 있고, HRIG 보다도 치료 효율이 낮아 훨씬 높은 용량으로 환자에게 투여된다. 이에 더하여 인간과는 다른 동물인 말에서 유래한 항체이므로 과민증(anaphyaxis)을 일으킬 수 있다. 이와 같이 원활하지 못한 공급과 다클론 항체가 갖는 단점을 극복하고자 공수병 바이러스를 중화시킬 수 있은 단일 항체(monoclonal antibody)의 사용이 제안되었다. 1980년 대에 공수병-바이러스 중화 뮤린 단일 항체가 개발되었으나 (Schumacher CL et al., J. Clin. Invest. Vol. 84, p. 971-975, 1989), 인체 내에서의 짧은 반감기와, 항체에 의한 체내 면역반응의 부재, 인간 항-뮤린 항체의(HAMA ; human anti-mouse antibody)유도 등의 단점으로 인간 환자에 대한 직접적인 투여에는 제한되어 있다.

생체 내에서 만들어지는 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 Fc 부분과 결합하여 항체(IgG)의 체내 항상성을 조절해주는 역할을 한다. FcRn과 항체(IgG)의 결합력이 높을수록 생체 내에서 항체의 분해를 막아 생체에 더 오래 머물 수 있다. 이 때 항체(IgG)의 Fc 부분에 mutation 하여 FcRn과의 결합력을 증가시킨다면 항체의 효율성을 높일 수 있다.

따라서 효과적인 공수병 치료를 위하여, FcRn과 결합력이 증대되어 체내 혈중 반감기가 길어지면서, 중화효능이 향상되며, 대량 생산가능한 항체의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 공수병 치료제 혈중 반감기를 향상시키고 중화효능을 향상시키기 위하여 중쇄 부분의 아미노산이 변이된 항체를 제작하고 식물에서 효과적으로 발현되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벡터로 형질전환된 식물 또는 그 조직을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 공수병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체를 제공한다.

또한, 상기 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 상기 벡터로 형질전환된 식물 또는 그 조직을 제공한다.

또한, 상기 항체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 공수병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체를 제공한다.

본 발명자들은 기존의 인간 SO57 항체를 식물 코돈에 최적화되도록 중쇄 염기서열을 변형하여, 담배 등의 작물에서 효과적으로 발현되는 것을 확인한 바, 본 명세서에서 처음으로 공개한다.

본 발명에서 용어 ‘항체’는 ‘면역글로불린(immunoglobulin, 이하 “Ig”로 표기)’과 혼동하여 사용되며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 항체는 경쇄 및 중쇄의 2개 쌍으로 이루어진다. 이러한 항체의 경쇄 및 중쇄는 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드이다. 전체 항체에서, 각가의 중쇄는 중쇄 가변 부위(VH) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위는 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3(항체 부류 IgA, IgD 및 IgG) 및 임의로 중쇄 불변 도메인 CH4(항체 부류 IgE 및 IgM)를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 가변 도메인 VH 및 VL은 보다 보전된, 골격부위(FR)이라 불리는 부위 내에 산재된 상보성 결정 부위(CDR)라 불리는 과가변성 부위로 보다 세분화 될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 구성되어 있다.(Janeway, C.A., JR. 등 (2001). Immunobiology., 5^th ed., Garland Publishing; and Woof, J., Burton, D., Nat Rev Innunol 4 (2004) 89-99). 중쇄 및 경쇄의 2개의 쌍(HC/LC)은 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 상기 전체 항체는 2가, 단일특이성 항체이다.

본 발명 항체는 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체이다.

본 발명의 일 실시예에서는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체 SO57의 FcRn과의 결합력및 공수병 바이러스 중화능이 다른 위치를 치환한 항체들보다 가장 효능이 증대된 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 상기 항체는 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticlum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드(ER 신호 서열)는 세포질 세망 상의 신호 인식 입자에 의해 단백질이 인식되는 것을 허용하여 단백질이 ER 내강 내에 전위되게 하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 소포체 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO 2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 소포체 신호 펩타이드는 바람직하게 KDEL(서열번호 14), HDEL(서열번호 15), SEKDEL(서열번호 16), KHEDL(서열번호 17), KEEL(서열번호 18), SEHEDL(서열번호 19) 로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩타이드일 수 있으며, 가장 바람직하게 KDEL로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다.

소포체 신호 펩타이드의 삽입부위는 항체의 항원 인식 및 결합 능력에 영향을 주지 않는 한 제한되지 않으나, 바람직하게 항체 중쇄 단백질 펩타이드 서열의 말단일 수 있고, 더욱 바람직하게는 항체 중쇄 단백질 펩타이드 서열의 C-말단 부위일 수 있다.

상기 KDEL을 코딩하는 뉴클레오타이드를 특정 유전자(본 발명에서는 항체 발현 유전자) 내에 삽입함으로서, 최종산물의 아미노산 서열 말단에 KDEL이 노출될 수 있도록 한다. 이것은 생산된 단백질이 식물 세포 외부로 분비되지 않고 형질전환된 세포 내의 소포체에 존재할 수 있도록 유도한다. 상기 특정 유전자가 도입된 숙주 세포 속에서 생산되는 단백질은 KDEL 서열에 의하여 소포체 내에 저장되고 식물체 내에서 이루어질 수 있는 번역 후 과정(post-translatonal modification)을 거친다. 이는 세포 내 항체 단백질의 발현량 증가와 이종간 면역 반응의 중요한 역할을 하는 이종간 당구조 차이에 따른 문제점을 해결하는데에 중요한 역할을 한다. 상기 KDEL 서열에 의해 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 저장과정을 거쳐 생성된 항체에서는 high-mannose 당사슬 구조(high-mannose glycan-type 이라고도 한다.)가 수지상세포 또는 대식세포에서 만노오스 수용체를 통하여 면역반응을 증가시키는 것으로 생각되고 있다.(Zhe Lu, et al.,Expression of GA733-Fc Fusion Protein as a Vaccine Candidate for Colorectal Cancer in Transgenic Plants, Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2012, Article ID 364240, 11 pages, doi:10.1155/2012/364240).

본 발명의 상기 항체는 대장균, 효모, 포유류와 같은 진핵생물에서 발현된 것일 수 있으나, 바람직하게는 식물에서 발현된 것일 수 있다.

상기 식물은 바람직하게는 씨(종자)를 만들고 퍼뜨려 번식하는 식물인 종자식물일 수 있으며, 겉씨식물과 속씨식물을 모두 포함하며, 속씨식물은 쌍떡잎식물과 외떡잎식물을 모두 포함한다. 종자식물은 크게 영양기관인 뿌리, 줄기, 잎, 그리고 생식기관인 꽃으로 구성되어 있고, 발달하지 않은 배아 상태의 식물인 종자가 있다. 본 발명에서의 식물은 완전한 구조를 갖는 전체 식물이거나 상기 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등 식물의 기관, 조직, 또는 다수의 식물 세포로 이루어진 식물의 일부일 수 있다. 식물의 일부는 전체 식물에 연결된 상태일 수도 있고, 분리된 것일 수도 있다.

또한 본 발명에 따른 형질전환된 식물의 세포 또는 조직은 식물에서 유래한 것이라면 종류가 제한되지 않는다. 식물의 조직으로는 예를 들어 식물의 표면을 구성하는 표피 세포로 구성된 표피 조직, 표피에서 2개의 공변세포가 구성하는 기공 조직, 표피 세포로부터 형성되는 털, 뿌리의 표피세포로부터 형성되는 뿌리털, 줄기나 뿌리의 관다발을 제외한 부분과 광합성을 하는 엽육 조직(울타리 조직, 해면 조직)을 포함하는 유조직, 줄기나 잎자루의 유조직에서 비대해진 후각 조직, 세포벽이 비대해진 후막 조직, 식물체 내에서 물의 이동에 관여하는 물관 또는 헛물관, 물관부 유조직, 물관부 섬유를 포함하는 물관부, 유기 물질의 운반을 담당하는 체관부 유조직, 체관부 섬유, 반세포 등을 포함하는 체관부 조직 등이 있다.

또한 본 발명에서의 식물은 식물 세포 또는 조직의 배양물을 포함한다. 상기 ‘배양물(culture)'은 식물 세포나 조직이 식물 전체의 형태를 형성하거나 식물체를 재생하는 능력인 전형성능을 이용하여 식물의 세포, 조직, 기관, 배, 종자 등 식물의 일부를 영양소가 첨가된 배지에서 배양한 산물을 의미한다. 상기 식물의 세포/조직 배양 산물로는 예를 들어, 배 배양, 절편 배양, 캘러스(callus) 배양, 현탁 배양, 약 배양(화분 배양), 원형질체 배양 등의 배양물일 수 있으나 여기 제한되는 것은 아니다. 원형질체는 식물 세포벽을 제거하고 분리해 낸 세포 내용물을 의미한다.

본 발명의 식물은 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L.나 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’는 ‘핵산’으로, 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명에서 ‘벡터’란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. ‘작동가능하게 연결된(operably linked)’이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 ‘발현조절서열(expression control sequence)’이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.

본 발명의 벡터는 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체를 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 벡터에 포함되는 중쇄는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 경쇄는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

항체의 발현을 위해 경쇄 및 중쇄를 벡터에 포함하는데, 경쇄 및 중쇄의 발현을 위한 프로모터는 서로 동일한 프로모터를 사용할 수도 있고, 서로 상이한 프로모터를 사용할 수도 있으며, 이는 발현되는 숙주세포, 발현 수준 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다.

구분 편의상 본 발명에서는 경쇄에 대한 프로모터를 제1프로모터로, 중쇄에 대한 프로모터를 제2프로모터로 명명하였다.

본 발명의 목적을 위하여 상기 발현조절서열과 기타 유전자 발현에 필수적인 요소들은 숙주로 하는 식물에서 유래한 것이거나 식물에서의 발현에 최적화된 것이 바람직하다. 예를 들어 식물 유전자의 프로모터 또는 식물을 숙주로 하거나 식물에서 발현가능한 유전자의 프로모터를 본 발명에 따른 서열번호 1로 표현되는 중쇄부분이 변이된 항체의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 식물에서 유래한 프로모터로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 것이면 어느 것이나 선택하여 사용할 수 있으나, 예를 들어 리불로스-1,6-비스포스페이트(RUBP) 카르복실라제 소형 서브유닛(ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 파세올린 프로모터, ADH(알콜 데히드로게나제) 프로모터, 열 충격 프로모터, ADF(액틴 해중합 인자) 프로모터 및 조직 특이 프로모터 등을 제한없이 사용할 수 있다. 또한 박테리아에서 유래한 옥토파인 중합효소(synthase) 프로모터, 노팔린 중합효소 프로모터, 만노파인 중합효소 프로모터, 그리고 바이러스에서 유래한 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 및 19S 프로모터 등을 사용할 수 있다. 프로모터 외에 전사 효율을 높일 수 있는 인핸서 등 부가적인 발현 조절 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 모든 식물 세포에서 계속적으로 유전자를 발현시키는 구성적 프로모터이거나, 특정한 식물의 조직/기관에서만 또는 특정한 식물의 발달 시기에만 유전자를 발현시키거나 빛, 호르몬 등의 특정 자극이나 환경에 의해 프로모터 활성을 갖는 유도성 프로모터일 수 있다. 본 발명의 항체를 발현하기 위하여 사용하는 제1 또는 제2프로모터는 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터(Ca2p) 또는 감자의 프로테아제 억제자 II의 프로모터(Pin2P)를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 제1 프로모터는 감자의 프로테아제 억제자II의 프로모터(Pin2P) 및 제2프로모터는 CaMV 35S 프로모터(Ca2p)일 수 있다.

항체의 발현을 위해 경쇄 및 중쇄를 벡터에 포함하는데, 경쇄 및 중쇄의 종결서열은 서로 동일한 것을 사용할 수도 있고, 서로 상이한 것을 사용할 수도 있으며, 이는 발현되는 숙주세포, 발현 수준 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다.

구분 편의상 본 발명에서는 경쇄에 대한 종결서열을 제1 종결서열로, 중쇄에 대한 종결서열을 제2 종결서열로 명명하였다.

또한 본 발명에 적합한 mRNA의 3'-말단의 폴리아데닐화(polyadenylation)를 위한 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 중합효소 또는 옥토파인 중합효소 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator) 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 제1 종결서열 또는 제2 종결서열은 감자의 프로테아제 억제자 I, Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 또는 노팔린중합효소 유전자로부터 유래된 종결 서열(terminator sequencee, T2)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 제1 종결서열은 감자의 프로테아제 억제자 II 유전자의 3‘말단 부분(Terminator of Pin2 gene from potato, T1), 제2 종결서열은 노팔린중합효소 유전자로부터 유래된 종결서열(Terminator of nopaline synthase(NOS) gene, T2)일 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 식물을 기반으로 한 단백질 발현 분야에서 사용되는 것으로서 당업자가 적절히 선택할 수 있는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 식물에서의 유전자 발현에 바람직한 요소들, 예를 들어 5' 비번역 부위 염기 서열(5‘region sequence), RNA 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 신호 서열을 당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 재조합 발현 벡터 제작 시 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 포함하고 있을 수 있으며, 또한 상기 발현 벡터는 필요에 따라 항체의 발현과 활성을 해치지 않는 범위에서 세포막이나 기타 세포소기관으로의 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 등을 포함하며, 리포터(reporter) 또는 마커(marker) 유전자의 서열 등을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 세포소기관으로의 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열은 바람직하게는 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticlum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 일 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드(ER 신호 서열)는 세포질 세망 상의 신호 인식 입자에 의해 단백질이 인식되는 것을 허용하여 단백질이 ER 내강 내에 전위되게 하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 소포체 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO 2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 소포체 신호 펩타이드는 바람직하게 KDEL(서열번호 14), HDEL(서열번호 15), SEKDEL(서열번호 16), KHEDL(서열번호 17), KEEL(서열번호 18), SEHEDL(서열번호 19) 로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩타이드일 수 있으며, 가장 바람직하게 KDEL로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명을 구현하기 위한 식물에서의 발현을 위한 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 아그로박테리움 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 상기 ‘바이너리 벡터(binary vector)'는 아그로박테리움으로 매개되는 형질전환에서, 종양 유발 유전자인 Ti 플라스미드(tumor inducible plasmid, Ti plasmid)를 두 개의 플라스미드로 분리한 것, 즉 재조합 유전자를 식물의 유전체로 이동시키는데 필요한 LB(left border)와 RB(right border) 서열을 갖는 플라스미드와, 재조합 유전자를 이동시키는데 필요한 단백질을 암호화하는 플라스미드로 분리한 벡터를 의미한다. 바람직하게는 pBI121 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 아그로박테리움은 식물 형질전환용으로 통상 사용되는 것이면 어느 것이라도 이용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 도 1에 도시된 개열지도를 가지는 벡터(서열번호 21)를 제조하여 식물을 형질전환하였다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 식물 또는 그 조직을 제공한다.

본 발명에서는 또한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다. 상기 형질전환된 식물은 본 발명의 중쇄 변이 부분을 포함하는 항체를 발현하며, 식물의 세포, 조직 또는 그 배양물일 수 있으며 식물의 일부 또는 전체를 포함한다.

상기 식물의 종류는 위에서 설명한 바와 같다.

상기 식물 세포 또는 조직을 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 당업자는 숙주로 선택한 식물의 특성을 고려하여 특정 식물에 적절한 공지의 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다. 식물의 형질전환 방법으로는 예를 들어 재조합 발현 벡터를 포함하는 리포좀과 식물 원형질체의 융합하는 방법, PEG를 이용하여 재조합 발현 벡터를 식물 원형질체로 주입하는 방법, 상기 재조합 발현 벡터의 식물 세포로의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법(electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법, 진공을 이용한 형질전환법(vaccum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.

상기 ‘아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법’은 식물의 뿌리와 줄기에 종양을 일으키는 토양의 그람 음성 세균인 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포에 외부 유전자를 전달하는 방법이다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등의 아그로박테리움에서 발견되는 종양 유발 플라스미드(tumor-inducing plasmid, Ti plasmid)의 T-DNA(transfer DNA)가 식물의 유전체(genome)에 삽입되는 현상을 이용한 방법이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환에서는 식물에 도입하려는 외부 유전자(exogenous DNA)와 T-DNA(외부 유전자의 양쪽 가장가리에 위치하는 LB와 RB 서열)를 포함하는 바이너리 플라스미드(또는 바이너리 벡터) 및 T-DNA가 식물 유전체에 삽입되도록 하는 보조 플라스미드(helper plasmid)의 두 가지 플라스미드로 이루어진 바이너리 시스템을 이용하는 것이 일반적이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 잎, 줄기, 뿌리 등 다양한 식물의 조직에 사용할 수 있으며, 어린 조직이 형질전환이 잘 되는 경향이 있다.

본 발명에서의 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하여 항체를 일과성 발현(transient expression)할 수도 있고, 안정적 발현(stable expression)할 수도 있다. 일과성 발현을 위해서는 식물의 일부, 예를 들어 식물의 잎을 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환하고, 목적하는 단백질이 충분히 발현될 수 있는 시간이 지난 뒤 식물에서 감염된 부분을 수득할 수 있다. 안정적 발현을 위하여 식물의 세포나 조직을 배양하여 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환한 뒤, 추가 배양하여 적합한 형질전환체를 선별하고 재분화 과정을 거친 뒤 완전한 구조를 갖는 형질전환 식물체로 배양할 수 있다. 상기 형질전환된 식물체에서 종자를 수득하고 발아시킴으로서 다음 세대에서도 안정적으로 형질전환 식물체를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 공수병 바이러스 중화 항체를 유효성분으로 포함하는 공수병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항체는 공수병 바이러스 중화 효능이 뛰어나면서 혈중 반감기가 증가되어 체내에 오래 남아있을 수 있어, 공수병 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있으며, 바람직하게는 혈관내 투여할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성 성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

본 발명의 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강흡입제의 형태로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야하며 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양하게 제형화될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 공수병을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 항체가 담배식물에서도 잘 발현되는 것을 확인하여, 본 발명 항체의 대량 생산 및 정제가 가능함을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항체가 야생 SO57 항체 및 중쇄 아미노산 서열의 다른 부분을 치환시킨 MST 항체, MN 항체보다 FcRn 친화력이 우수한 것을 확인하여, 본 발명에 따른 항체가 혈중 반감기가 가장 긴 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항체가 야생 SO57 항체, 중쇄 아미노산 서열의 다른 부분을 치환시킨 MST 항체, MN 항체보다 공수병 바이러스 중화 효능이 우수한 것을 확인하여, 공수병 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물세포 또는 조직, 그리고 상기 공수병 바이러스 중화 항체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 공수병 바이러스 중화항체는 시중항체 및 기존 식물 유래 항체보다도 혈중 반감기가 매우 증가되고, 공수병 바이러스 중화효능 또한 뛰어나 공수병 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 형질전환 벡터들의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 담배를 형질전환 시켜, 공수병항체 단백질 발현 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 3은 형질전환 담배식물을 최적화된 조건에서 대량생산을 수행하였으며(왼쪽), SDS-PAGE를 통해 시중항체(mAb^H,the 2nd international standard for anti-rabies innunoglobulin, Human NIBSC, RAI, NIBSC사)와 세 가지 항체(MST, MN, HN)의 정제를 확인한 결과이다.
도 4는 세 가지 항체(MST, MN, HN)와 human FcRn (hFcRn)과의 binding affinity를 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)로 분석한 결과이다.
도 5는 세 가지 항체(MST, MN, HN)와 human FcRn (hFcRn)과의 binding affinity를 XPR36 surface instrument (bio-rad)을 이용하여 Surface Plasmon Resonance (SPR)를 분석한 결과이다.
도 6은 담배식물 유래 공수병 항체치료제의 Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT)를 이용하여 공수병 바이러스인 CVS11에 대한 활성분석을 수행한 결과이다.
도 7은 MALDI-TOF mass 스펙트럼 분석을 이용하여 WT과 세 가지 항체 (MST, MN, HN) 변형체들로부터 얻은 N-glycans 구조들을 분석한 결과이다.(■ : GlcNAc, ○ : mannose, △ : xlylose)

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

SO57를 식물 기반 시스템에서 발현시키기 위한 바이너리 벡터의 제조

기존 식물 유래 공수병 항체 벡터 (pBI121 vector)에 QuikChangeⅡ XL site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies)와 MST, MN, HN 세 종류의 항체의 중쇄에 대한 각각의 primer들을 이용하여 SO57 항체의 중쇄(GenBank accession no. AY172957)에 대하여 PCR을 수행하였다. 그에 따라, MST(M281Y/S283T/T285E), MN (M457L/N463S), HN (H462K/N463F) 위치가 변이된 항체의 서열을 제조하였다.

PCR은 94℃에서 20초, 53℃에서 20초, 72℃에서 90초로 조건에서 30회 수행되었다.

프라이머 서열

항체	프라이머 서열
MST	5'-CACCACGCATGTGACCTCAGGCTCCCGGGTGATATAGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGG-3' (서열번호 6)
MST	5'-CCAAAACCCAAGGACACCCTCTATATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTG-3' (서열번호 7)
MN	5'-CTGCGTGTAGTGGCTGTGCAGAGCCTCATGC-3' (서열번호 8)
	5'-GCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAG-3' (서열번호 9)
	5'-TTCTCATGCTCCGTGTTGCATGAGGCTCTGC-3' (서열번호 10)
	5'-GCAGAGCCTCATGCAACACGGAGCATGAGAA-3' (서열번호 11)
HN	5'-GCTCTTCTGCGTGTA GTGGAACTTCAGAGCCTCATGCATCACG-3' (서열번호 12)
HN	5'-CGTGATGCATGAGGCTCTGAA GTTCCACTACACGCAGAAGAGC-3' (서열번호 13)

Ca2p 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter)와 노팔린 중합효소 종결 서열(terminator of nopaline synthase gene, T2)을 포함하는 pBI121 벡터에 변이된 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 NcoI 와 XbaI를 함유하는 프라이머, PstI 와 BamHI 를 함유하는 프라이머를 이용하여 도입하였다. 변이된 중쇄와 KDEL이 결합된 HCK는 AMV 번역 인핸서와 함께 배치되었으며, 경쇄(서열번호 2, GenBank accession no. AY172960)는 Pin2P(감자의 Pin2 gene 프로모터)의 조절하에 배치되었다.

중쇄 아미노산 서열이 변이된 SO57 항체의 중쇄 및 경쇄가 도입된 pBI121 바이너리 벡터의 세 가지의 개열지도는 도 1에 나타낸 바와 같다.

<실시예 2>

담배 세포에서의 변형된 SO57 항체 발현(transient expression)

상기 <실시예 1>에서 제작한 변형된 세 가지 타입의 항체 유전자를 아그로박테리움(LBA4404)을 이용하여 담배식물 세포에 도입하여, 서로 다른 항체를 발현하는 형질전환 식물체들을 제조하였다.

각각의 변형된 공수병항체 단백질의 발현 여부는 웨스턴블롯을 통해 확인하였다. 변형된 공수병 항체는 호스라디시 페록시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 컨쥬게이션된 토끼 항-인간 Fcγ와 염소 항-인간 F(ab’)₂를 이차항체로 detection하여 확인하였다.

도 2에 나타나듯이, 중쇄 (50 kDa), 경쇄 (25 kDa)에서 각각 밴드를 확인한 결과, 본 발명의 항체가 담배에서 식물에서 잘 발현됨을 확인하였다.

<실시예 3>

담배에서의 변형된 SO57 항체 정제

세 가지 타입의 항체가 형질전환 된 담배식물을 최적화된 조건에서 대량생산을 수행하였으며(도 3 왼쪽 참조), Down streaming 프로세스를 활용하여 Protein A affinity column을 이용한 단백질 정제 방법을 통하여 세 가지 형태의 공수병 항체 치료제를 정제하였다. 각 유전자당 약 200-250g 담배식물 잎을 갈아 정제하여, SDS-PAGE를 통해 시중항체(mAb^H,the 2nd international standard for anti-rabies innunoglobulin, Human NIBSC, RAI, NIBSC사)와 기존의 항체 및 세 가지 항체(MST, MN, HN)의 정제 결과를 확인하였다(도 3 오른쪽).

도 3에서 나타나듯이, 세 종류의 항체 모두 기존의 항체와의 큰 차이 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 항체가 담배식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.

<실시예 4>

변형된 항체의 FcRn과의 친화성 확인(ELISA)

세 가지 항체(MST, MN, HN)와 인간 FcRn (hFcRn)과의 친화성(binding affinity)을 각각 pH 6.0과 pH 7.4에서 효소면역측정법(competitive ELISA) 으로 분석하였다. 기존 항체(WT)와 세 가지 항체(MST, MN, HN)를 각 100 ㎕씩 4℃에서 overnight하여 96 well plate에 부착한 후 hFcRn 37℃에서 1시간 30분 동안 처리한 후 hFcRn을 탐지하는 이차항체(6-His Antibody, Bethyl)를 각 100 ㎕ RT에서 2시간동안 처리한 뒤, 흡광도를 측정(Friguet B. et al., J. Immunol. Meth., 77; 305-319, 1985)하여 비교하였다.

도 4에 나타나듯이, pH 6.0에서는 WT보다 MST, MN, HN 차례로 약 12, 16, 18배로 친화성이 증가하였고, pH 7.4에서는 각각 약 2, 15, 17배가 증가하였다. 이를 통해 HN 항체의 FcRn과의 친화성이 기존 항체 및 MST, MN 항체보다 현저히 우수함을 확인하였고, 그에 따라 비교 대상 항체들보다 생체 내에서 항체의 분해가 저해되어 더 오래 머무를 수 있음을 확인하였다.

<실시예 5>

변형된 항체의 FcRn과의 친화성 확인(SPR 분석)

세 가지 항체(MST, MN, HN)와 human FcRn (hFcRn)과의 친화성(binding affinity)를 각각 pH 6.0과 pH 7.4에서 XPR36 surface instrument (bio-rad)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 방법(SPR)으로 분석하였다. Biochip에 hFcRn을 부착한 후 WT과 세 가지 항체(MST, MN, HN)를 흘린 후 친화력을 측정하여 비교하였다.

도 5에 나타나듯이, SPR 결과 또한 hFcRn과 ELISA 결과와 같은 경향성을 보였다. pH 6.0에서 WT, MST, MN, HN 각각 100, 140, 180, 195 RU를 나타냈고, pH 7.4에서는 각각 20, 20, 70, 100 RU를 나타났다. 이를 통해 기존 항체 및 MST, MN 항체보다 HN의 FcRn 친화성이 현저히 우수함을 확인하였고, 그에 따라 비교 대상 항체들보다 생체 내에서 항체의 분해가 저해되어 더 오래 머무를 수 있음을 확인하였다.

<실시예 6>

변형된 항체의 공수병 바이러스 중화효능 확인

변형된 항체의 공수병 바이러스 CVS11에 대한 활성분석을 시험관 내 중화 분석(RFFIT)을 이용하여 수행하였다. 각 항체를 1:2.5, 1:12.5, 1:62.5, 1:312.5로 CVS를 32~100 FFD50이 되도록 희석하여 함께 slide에 분주한 후 mouse neuroblastoma (N2a) 세포를 첨가해 35℃에서 20시간 배양시킨다. 아세톤 고정 후 간접면역형광항체법으로 염색하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 현광현미경(x200) 하에서 관찰하였다.

그 결과 도 6에 나타나듯이, 시중에서 판매되고 있는 항체(the 2nd international standard for anti-rabies innunoglobulin, Human NIBSC, RAI, NIBSC사) 및 아미노산 서열 변경 전의 항체와 비교하여 변경된 세 가지 타입의 항체들 모두 더 높은 중화효능을 보였다. 이상의 실험 결과를 통해, 기존 항체 및 MST, MN 항체보다 HN의 공수병 바이러스 중화 효능이 가장 뛰어남을 확인할 수 있었으며, 아미노산 치환 위치에 따라 그 효능이 달라짐을 확인하였다.

상기 실시예들의 결과를 종합한 결과, 본 발명의 항체는 식물에서도 잘 발현 및 정제되어 대량생산이 가능하고, FcRn 친화력이 가장 우수하여 체내에서 가장 오래 머무를 수 있으며, 공수병 바이러스 중화 효능도 다른 비교 항체들보다 우수한 기술적 특징이 있음을 확인하였는 바, 공수병 치료제로서 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 7>

MALDI-TOF를 이용한 변형된 항체 (MST, MN, HN)의 N-glycan 분석

Permethylation 처리 후, MALDI-TOF mass 스펙트럼 분석을 이용하여 WT과 세 가지 항체 (MST, MN, HN) 변형체들로부터 얻은 N-glycans 구조들을 분석 하였다.

도 7에 나타나듯이, 회색 사각형은 GlcNAc, 흰색 원형은 mannose, 흰색 삼각형은 xlylose를 나타낸다. WT과 세가지 항체 (MST, MN, HN) 들의 당구조를 볼 때, oligomannose (OM) 형태 구조를 보였다. MST의 경우는 β(1,2)-xylose를 갖고 있는 당구조 형태가 관찰되었다. 하지만, 그 구조는 매우 적은 편이라고 평가된다. 그리고, 대부분의 당구조는 7개의 mannose를 갖는 항체로 구성되어 있는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과로 볼 때, Fc 부분의 아미노산의 변형이 있다 하더라도 당구조의 변형은 거의 미미하다고 보여진다.

따라서, 본 발명의 항체는 실시예 3의 실험 결과에 더하여, 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 보다 명확히 확인한 것으로, 본 발명에 따른 항체가 식물에서 당구조 변형없이 잘 생산될 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 중쇄 영역이 H462K 또는 N463F의 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체는 시중항체 및 기존 식물유래 항체보다도 혈중 반감기가 매우 증가되고, 공수병 바이러스 중화효능 또한 뛰어나 공수병 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Mutant anti-rabies antibody with improved serum half-lives and neutralizing rabies virus <130> NP17-0053P <150> KR 10-2017-0100556 <151> 2017-08-08 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human SO57 wild type HC <400> 1 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Asn Arg Tyr Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Arg Phe Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Phe Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 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gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480 cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 3540 aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600 ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 3660 ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720 gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 3780 catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840 cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg 3900 gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960 cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc 4020 cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080 gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4140 catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200 cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4260 tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320 gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag 4380 gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440 ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca 4500 aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560 ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg 4620 ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680 ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc 4740 tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800 cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4860 tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920 caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctttataa aaagctaaat aagatagagg 4980 gtattttcgt aaacaaataa ctaattctta gaaagtattc aatgcttatt agttataata 5040 caacaaacca aacaagcaat aaaaactaat ccccaacata acttatccca gcataactta 5100 tcccatcata acttattcca tcataacttg ttttcaaacc aaatgacccc taaagctata 5160 tatgcaaaag gaaaaagggc taaaaatacc cctagactat ttgaaaagat ttaaatatac 5220 ccctcattca tttatttggt taaaaatatc cctcaatcta tcaatccttt ttaaaattat 5280 tgttattctt attttttaat taggtgacat cttcctattg gataaaaaaa aaaaatttct 5340 acctatcaaa tctttctcga cccaattcaa agaacttgtt cattaattat tatttttcca 5400 gcaaaatgaa aatttttagt taggatgata aaatttatcc aaatttctac caccacccaa 5460 aactaaatct tccaattcag aaaaaatcat tcattacaac tcttggattt gtttgtatga 5520 tgtgttagaa gcagaaatgg gtttaaaagg tgaattaaat ggtattttta actaaagaaa 5580 tgaatgcggg atatatttaa gttttttcag ataattcatg aatattttta tcctctttcc 5640 gtgtgcaata atagagttcc aacttaatta tcacgtggac ttataagaaa ccgatgctgg 5700 atgataatta tttaaaaaaa caagcaagtc ggggtcagta cagcttgctg aataggagaa 5760 attaaagata gcaaccagga aaagttaaga gcttttggct cctccgtcca attataaccg 5820 tccactatat atatttgaga ctcgtattga gaaacaataa ataataagaa tgatattact 5880 atattacctt ttgaatatat taaatttaat gctttgaaaa atatatttga taatgaataa 5940 tatctaatag cagcaagaat aaaatagaca caaacaagta aaattactca ttgatctttc 6000 aaattagaca agtattatcg gacatctact tttagtatag taaacaagta aagatcggat 6060 aaagagagta ataaagaaga agcaagcgta agtaccttgc caaaataatt aactaacaag 6120 cacatctttt ttttttatca aatattaata aaaataattt atattaatat gaagaaaaaa 6180 aaggttttag tttgctatct ttttgatcac tcgtttgcta taaataggtg gaggaggaca 6240 gacactcttc accccaaaat taaaagaaaa agaggcaggg ctgcagatga gtgtccccac 6300 catggcctgg gctctgctcc tcctcagcct cctcactcag ggcacaggat cctgggctca 6360 gtctgccctg actcagcctc gctcagtgtc cgggtctcct ggacagtcag tcaccatctc 6420 ctgcactgga accagcagtg atattggtgg ttataacttt gtctcctggt accaacaaca 6480 cccaggcaaa gcccccaaac tcatgattta tgatgccact aagcggccct caggggtccc 6540 tgatcgcttc tctggctcca agtctggcaa cacggcctcc ctgaccatct ctgggctcca 6600 ggctgaggat gaggctgatt attactgctg ctcatatgca ggcgactaca ccccgggcgt 6660 ggttttcggc ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt 6720 cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct 6780 cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt 6840 caaggcggga gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag 6900 cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt 6960 cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt catagggatc 7020 cgcatgccac cctgcaatgt gaccctagac ttgtccatct tctggattgg ccaacttaat 7080 taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct aatcactata atgtgggcat 7140 caaagttgtg tgttatgtgt aattactaat tatctgaata agagaaagag atcatccata 7200 tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc agatgcattt 7260 tattaaccaa ttccatatac atataaatgg catgcaagct tgcatgcctg caggtccgat 7320 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 7380 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 7440 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 7500 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 7560 ggattgatgt gatggtccga ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 7620 cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 7680 ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 7740 cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 7800 aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 7860 acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 7920 gaggagatct ttttattttt aattttcttt caaatacttc caccatggac tggacctgga 7980 ggttcctctt tgtggtggca gcagctacag gtgtccagtc ccaggtgcag ctggtgcagt 8040 ctggggctga ggtgaagaag cctgggtcct cggtgaaggt ctcctgcaag gcttctggag 8100 gcaccttcaa caggtatact gtcaactggg tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt 8160 ggatgggagg catcatccct atctttggta cagcaaacta cgcacagagg ttccagggca 8220 gactcaccat taccgcggac gaatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 8280 gatctgatga cacggccgtg tatttctgtg cgagagagaa tctcgataat tcggggactt 8340 attattattt ctcaggctgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct 8400 cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg 8460 ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 8520 cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct 8580 caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga 8640 cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc 8700 ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg 8760 gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 8820 ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact 8880 ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca 8940 acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 9000 aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct 9060 ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg 9120 agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 9180 tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 9240 tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt 9300 ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgaag ttccactaca 9360 cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aaaaggacga actttgatct agacggatcc 9420 ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 9480 cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 9540 gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 9600 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 9660 ctatgttact agatcgggaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 9720 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 9780 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgcccgc 9840 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 9900 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 9960 acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 10020 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 10080 caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc 10140 atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct 10200 cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc 10260 accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt 10320 tacaccacaa tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac 10380 aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt 10440 tgtaaggcgg cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct 10500 gccgggtttg aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag 10560 agcgttgctg cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc 10620 ttattcattt ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat 10680 aggaaatcgc tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa 10740 cgttgacgat atcaactccc ctatccattg ctcaccgaat ggtacaggtc ggggacccga 10800 agttccgact gtcggcctga tgcatccccg gctgatcgac cccagatctg gggctgagaa 10860 agcccagtaa ggaaacaact gtaggttcga gtcgcgagat cccccggaac caaaggaagt 10920 aggttaaacc cgctccgatc aggccgagcc acgccaggcc gagaacattg gttcctgtag 10980 gcatcgggat tggcggatca aacactaaag ctactggaac gagcagaagt cctccggccg 11040 ccagttgcca ggcggtaaag gtgagcagag gcacgggagg ttgccacttg cgggtcagca 11100 cggttccgaa cgccatggaa accgcccccg ccaggcccgc tgcgacgccg acaggatcta 11160 gcgctgcgtt tggtgtcaac accaacagcg ccacgcccgc agttccgcaa atagccccca 11220 ggaccgccat caatcgtatc gggctaccta gcagagcggc agagatgaac acgaccatca 11280 gcggctgcac agcgcctacc gtcgccgcga ccccgcccgg caggcggtag accgaaataa 11340 acaacaagct ccagaatagc gaaatattaa gtgcgccgag gatgaagatg cgcatccacc 11400 agattcccgt tggaatctgt cggacgatca tcacgagcaa taaacccgcc ggcaacgccc 11460 gcagcagcat accggcgacc cctcggcctc gctgttcggg ctccacgaaa acgccggaca 11520 gatgcgcctt gtgagcgtcc ttggggccgt cctcctgttt gaagaccgac agcccaatga 11580 tctcgccgtc gatgtaggcg ccgaatgcca cggcatctcg caaccgttca gcgaacgcct 11640 ccatgggctt tttctcctcg tgctcgtaaa cggacccgaa catctctgga gctttcttca 11700 gggccgacaa tcggatctcg cggaaatcct gcacgtcggc cgctccaagc cgtcgaatct 11760 gagccttaat cacaattgtc aattttaatc ctctgtttat cggcagttcg tagagcgcgc 11820 cgtgcgtccc gagcgatact gagcgaagca agtgcgtcga gcagtgcccg cttgttcctg 11880 aaatgccagt aaagcgctgg ctgctgaacc cccagccgga actgacccca caaggcccta 11940 gcgtttgcaa tgcaccaggt catcattgac ccaggcgtgt tccaccaggc cgctgcctcg 12000 caactcttcg caggcttcgc cgacctgctc gcgccacttc ttcacgcggg tggaatccga 12060 tccgcacatg aggcggaagg tttccagctt gagcgggtac ggctcccggt gcgagctgaa 12120 atagtcgaac atccgtcggg ccgtcggcga cagcttgcgg tacttctccc atatgaattt 12180 cgtgtagtgg tcgccagcaa acagcacgac gatttcctcg tcgatcagga cctggcaacg 12240 ggacgttttc ttgccacggt ccaggacgcg gaagcggtgc agcagcgaca ccgattccag 12300 gtgcccaacg cggtcggacg tgaagcccat cgccgtcgcc tgtaggcgcg acaggcattc 12360 ctcggccttc gtgtaatacc ggccattgat cgaccagccc aggtcctggc aaagctcgta 12420 gaacgtgaag gtgatcggct cgccgatagg ggtgcgcttc gcgtactcca acacctgctg 12480 ccacaccagt tcgtcatcgt cggcccgcag ctcgacgccg gtgtaggtga tcttcacgtc 12540 cttgttgacg tggaaaatga ccttgttttg cagcgcctcg cgcgggattt tcttgttgcg 12600 cgtggtgaac agggcagagc gggccgtgtc gtttggcatc gctcgcatcg tgtccggcca 12660 cggcgcaata tcgaacaagg aaagctgcat ttccttgatc tgctgcttcg tgtgtttcag 12720 caacgcggcc tgcttggcct cgctgacctg ttttgccagg tcctcgccgg cggtttttcg 12780 cttcttggtc gtcatagttc ctcgcgtgtc gatggtcatc gacttcgcca aacctgccgc 12840 ctcctgttcg agacgacgcg aacgctccac ggcggccgat ggcgcgggca gggcaggggg 12900 agccagttgc acgctgtcgc gctcgatctt ggccgtagct tgctggacca tcgagccgac 12960 ggactggaag gtttcgcggg gcgcacgcat gacggtgcgg cttgcgatgg tttcggcatc 13020 ctcggcggaa aaccccgcgt cgatcagttc ttgcctgtat gccttccggt caaacgtccg 13080 attcattcac cctccttgcg ggattgcccc gactcacgcc ggggcaatgt gcccttattc 13140 ctgatttgac ccgcctggtg ccttggtgtc cagataatcc accttatcgg caatgaagtc 13200 ggtcccgtag accgtctggc cgtccttctc gtacttggta ttccgaatct tgccctgcac 13260 gaataccagc gaccccttgc ccaaatactt gccgtgggcc tcggcctgag agccaaaaca 13320 cttgatgcgg aagaagtcgg tgcgctcctg cttgtcgccg gcatcgttgc gccacatcta 13380 ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga 13440 tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc cccgatatcc 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ttggcgtata acatagtatc 14340 gacggagccg attttgaaac cacaattatg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt 14400 atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtgtct atcagctgtc cctcctgttc 14460 agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc gctatctctg 14520 ctctcactgc cgtaaaacat ggcaactgca gttcacttac accgcttctc aacccggtac 14580 gcaccagaaa atcattgata tggccatgaa tggcgttgga tgccgggcaa cagcccgcat 14640 tatgggcgtt ggcctcaaca cgattttacg tcacttaaaa aactcaggcc gcagtcggta 14700 acctcgcgca tacagccggg cagtgacgtc atcgtctgcg cggaaatgga cgaacagtgg 14760 ggctatgtcg gggctaaatc gcgccagcgc tggctgtttt acgcgtatga cagtctccgg 14820 aagacggttg ttgcgcacgt attcggtgaa cgcactatgg cgacgctggg gcgtcttatg 14880 agcctgctgt caccctttga cgtggtgata tggatgacgg atggctggcc gctgtatgaa 14940 tcccgcctga agggaaagct gcacgtaatc agcaagcgat atacgcagcg aattgagcgg 15000 cataacctga atctgaggca gcacctggca cggctgggac ggaagtcgct gtcgttctca 15060 aaatcggtgg agctgcatga caaagtcatc gggcattatc tgaacataaa acactatcaa 15120 taagttggag tcattaccca attatgatag aatttacaag ctataaggtt attgtcctgg 15180 gtttcaagca ttagtccatg caagttttta tgctttgccc attctataga tatattgata 15240 agcgcgctgc ctatgccttg ccccctgaaa tccttacata cggcgatatc ttctatataa 15300 aagatatatt atcttatcag tattgtcaat atattcaagg caatctgcct cctcatcctc 15360 ttcatcctct tcgtcttggt agctttttaa atatggcgct tcatagagta attctgtaaa 15420 ggtccaattc tcgttttcat acctcggtat aatcttacct atcacctcaa atggttcgct 15480 gggtttatcg cacccccgaa cacgagcacg gcacccgcga ccactatgcc aagaatgccc 15540 aaggtaaaaa ttgccggccc cgccatgaag tccgtgaatg ccccgacggc cgaagtgaag 15600 ggcaggccgc cacccaggcc gccgccctca ctgcccggca cctggtcgct gaatgtcgat 15660 gccagcacct gcggcacgtc aatgcttccg ggcgtcgcgc tcgggctgat cgcccatccc 15720 gttactgccc cgatcccggc aatggcaagg actgccagcg ctgccatttt tggggtgagg 15780 ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt agcgggccgg 15840 gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca 15900 gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta 15960 gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag 16020 cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa 16080 ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc gcccctcaag tgtcaatacc gcagggcact 16140 tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc 16200 gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt 16260 caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt 16320 gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg 16380 cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag 16440 ggcaaccagc ccgg 16454

Claims

서열번호 1로 표시되는 중쇄(HC) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄(LC)를 포함하며, 상기 서열번호 1로 표시되는 중쇄의 462번째 아미노산이 라이신(K) 및 463번째 아미노산이 페닐알라닌(F)으로 치환된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 식물에서 발현된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 중화 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 소포체 잔류 펩타이드를 추가로 포함하는 항체.
제1항의 공수병 바이러스 중화 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 벡터는 제1 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2로 표시된 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 제1 종결서열(terminator);
제2 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 3으로 표시된 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 소포체 잔류 펩타이드 및 제2 종결서열(terminator)을 포함하는 벡터.
제6항에 있어서, 상기 소포체 잔류 펩타이드는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 벡터는 도 1에 기재된 개열 지도를 가지는 HN 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제5항의 벡터로 형질전환된 식물 세포 또는 식물 조직.
제1항의 항체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 공수병 예방 또는 치료용 약학 조성물.