KR20190015751A - 마이크로 레이저 입자용 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

광자 입자, 및 생물학적 샘플에서 입자를 사용하는 방법이 개시된다. 상기 입자는, 예를 들어 펌프 공급원에 의해 에너지적으로 자극될 때 레이저 광을 방출하도록 구성된다. 상기 입자는, 무기 물질을 포함하는 이득 매질, 높은 굴절률을 갖는 광 공동, 및 유기 물질을 포함하는 코팅을 포함할 수 있다. 상기 입자는 이의 가장 긴 축을 따라 3㎛보다 작을 수 있다. 상기 입자들은 서로 부착되어, 예를 들어 더블렛 또는 트리플렛을 형성할 수 있다. 상기 입자는 펌핑 동안 입자 내로의 주입 빔의 커플링에 의해 주입 잠금(injection locking)되어, 주입 시드가 증폭되어 레이저 발진으로 전개될 수 있다. 현미경 시스템은, 펌프 공급원, 빔 스캐너, 1nm 이하의 해상도 및 1kHz 이상의 획득 레이트(acquisition rate)를 갖는 분광계, 및 광대역 배경으로부터 레이저 출력의 스펙트럼 피크를 구별하기 위해 구성된 스펙트럼 분석기를 포함할 수 있다.

Description

마이크로 레이저 입자용 시스템 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2016년 6월 3일자로 출원된 "레이저 마이크로-입자"라는 명칭의 미국 가특허출원 제62/345,070호에 기초하고, 이에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다. 상기 가특허출원에 인용된 참고문헌들도 인용에 의해 본원에 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 진술
본 발명은, 미국 국립 과학 재단(National Science Foundation)이 수여한 ECCS-1505569 및 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 DP1-DB024242 하에 정부 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
기술분야
본원은 일반적으로, 샘플, 예를 들어 생물 세포 및 조직 내에 매립(embedded), 이식, 또는 주입될 수 있는 소형 레이저, 보다 구체적으로는 유기 및 무기 물질로 제조된 광학적으로 여기될 수 있는(excitable) 레이저 입자, 및 상기 레이저 입자의 제조, 관능화, 전달 및 이미징, 및 대량 병렬 이미징, 센서 및 검정을 위한 프로브로서의 이의 용도에 관한 발명에 관한 것이다.
형광 프로브, 예를 들어 염료, 형광 단백질 및 양자 도트는, 생의학 이미징, 세포 분류, 면역 조직학, 고속 처리 스크리닝, 및 다양한 기타 생화학 측정에서 없어서는 안될 도구가 되었다. 이러한 발광 프로브는 매우 유용하지만, 통상적으로 30 내지 100nm인 이들의 비교적 넓은 방출 스펙트럼은, 모호하지 않게 동시에 사용할 수 있는 프로브의 수를 제한하며, 종종 이들의 스펙트럼을 조직의 내인성 분자의 배경 방출과 구별할 수 없게 만든다. 통상적인 형광 현미경은 3 내지 4가지 염료를 분석하기 위해 장착되며, 최첨단 세포 측정은 11개의 채널로 제한된다. 복합적인 4개의 상이한 염료는 16(=24)개의 조합을 제공할 수 있다. 세포에서 상이한 비로 청색, 녹색 및 적색 형광 단백질을 암호화하는 3가지 유전자의 동시의 발현은, Brainbow 및 RGB 마킹에서와 같이 수백 가지의 색상을 생성할 수 있다. 그러나, 형질 주입은 확률적이며, 색상 판독의 충실도는 잡음에 취약하다. 지금까지 이미징을 위한 형광 색상 수는 12개 이하로 제한되어 왔다.
분자에서 전자 레벨의 양자-역학적 확장으로 인해, 보다 더 좁은 방출 선폭을 위한 형광체를 엔지니어링하는 것이 근본적인 과제이다. 불규칙한 형상과 열역학적 변동은 반도체 양자 도트로부터 방출의 스펙트럼 확장을 야기했다. 금속 나노 입자에서 플라즈몬 전자 진동의 감쇠는 > 50 내지 100nm의 방출 폭을 야기했다. 이러한 전자 공명과 비교하여, 광학 공명은 좁은 방출 라인을 발생하는 효과적인 접근법을 제공한다. 레이저가 좋은 예이다. 형광체 및 반도체 물질을 광 공동(optical cavity) 내부에 배치함으로써, 매우 좁은 스펙트럼 라인을 발생시킬 수 있다. 단일 주파수 레이저의 출력은 공동 공명을 변경함으로써 전체 이득 폭에 걸쳐 조정가능한, 1/1,000,000nm의 파장이 될 수 있다.
본 발명은, 하나 이상의 이득 매질(gain medium) 및 하나 이상의 광 공동을 포함하고, 바람직한 실시에서는 실질적으로 3㎛를 초과하지 않는, 또는 다른 바람직한 실시에서는 2㎛를 초과하지 않는 최대 치수를 갖는, 예시적인 광자 입자를 제공한다. 이득 매질은 충분한 수의 이득 요소(gain element), 예를 들어 형광체 및 전자-정공 쌍을 포함하고, 공동은 충분히 낮은 광 손실(optical loss)을 가지므로, 상기 이득 매질이 충분히 강한 강도 레벨에서 펌프 광에 의해 여기 또는 자극될 때, 상기 이득 요소는 공동의 광학 공명 모드들에 의해 한정되는 스펙트럼 특성을 나타내는 광을 방출한다. 상기 입자는, 적절한 형상 및 구조를 갖는 반도체 물질, 예를 들어 양자 우물 구조, 구형 형상, 또는 다중층 브래그 반사기로 이루어질 수 있다. 다르게는, 입자는 형광 이득 분자, 고반사율 유전체 공명기 및 잠재적으로는 금속으로 구성될 수 있다.
예시적인 레이저 입자는, 각각의 선폭이 바람직한 실시에서는 5nm보다 좁고, 다른 바람직한 실시에서는 일반적으로 1nm 이하 또는 심지어 0.3nm 이하인, 하나 또는 복수의 피크를 갖는 출력 방출 스펙트럼을 갖는다. 피크는 주로 입자 내의 광 공동의 공명에 의해 결정된다. 출력 스펙트럼의 중심 파장은 전체 가시광선 범위 및 근적외선 범위, 예를 들어 400 내지 1,900nm를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 레이저 입자들을 여기시키기 위한 하나 이상의 펌프 광원 및 하나 이상의 검출 설비를 포함하는 광학 시스템을 제공한다. 상기 검출 설비는 스펙트럼 분해 요소, 예를 들어 회절 격자 및 2색성 필터를 포함한다. 펌프 제공원은 펄스 폭이 100fs 내지 10ns 범위인 펄스 레이저를 포함한다.
레이저 입자에 대한 특정의 바람직한 양태는, 모두 직경이 500nm 내지 3㎛ 범위인, 양자 우물 마이크로 디스크 레이저, 독립형 표면 방출형 브래그(Bragg) 반사기 반도체 레이저, 반도체 구체를 포함한다.
본 발명의 상기 및 다른 장점은 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다. 명세서에서, 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 바람직한 양태를 예시하는 방식으로 도시되는 첨부 도면을 참조한다. 그러나, 이러한 양태는 반드시 본 발명의 전체 범위를 나타내는 것은 아니며, 따라서 본 발명의 범위를 설명하기 위한 참조가 청구범위 및 본원 명세서에서 이루어진다.
본 발명의 상기 및 다른 양태 및 이점은 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다. 명세서에서, 본 명세서의 일부를 형성하고, 하나 이상의 예시적인 버전을 예시하는 방식으로 도시되는 첨부 도면을 참조한다. 이러한 버전은 반드시 본 발명의 전체적인 범위를 나타내는 것은 아니다.
본 발명은 이하에 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명될 것이며, 동일한 참조 번호는 동일한 요소를 나타낸다.
도 1은, 레이저가 생물학적 시스템 외부에 배치되는 레이저의 전통적인 활용의 예시이다.
도 2는, 레이저 입자의 생의학적 사용 예의 예시이다. 소형 생체 적합성 레이저 입자가 시스템에 주입된다. 이러한 레이저는 이미징, 진단 및 치료에 새로운 접근법을 허용할 수 있고, 생물학적 시스템과의 양방향 상호 작용을 가능하게 할 수 있다. 확장된 개념으로서, 생물학적 샘플을 레이저에 도입하여, 표본(specimen)의 변화가 레이저의 출력 방출에 반영되게 할 수 있다. 또한, 레이저는 자체 구동되고 작동되고 유지되는 "살아있는" 레이저를 실현하기 위해 전적으로 생물학적 물질에 관한 것일 수 있다.
도 3a는, 레이저 입자의 펌핑된 이득 매질로부터의 형광 방출을 예시한다. 적색 화살표는 형광등을 나타낸다.
도 3b는, 레이저 입자를 형성하는 광 공동에 위치된 도 3a의 이득 매질을 예시한다.
도 3c는, 도 3b에 예시된 공동 내의 이득 매질로부터의 자발적이고 자극된 광 방출을 도시한다. 공동의 적색 선은 공동내 공동 모드(cavity mode)를 나타낸다.
도 3d는, 2개의 에너지 레벨 또는 밴드 그룹을 갖는 이득 요소(황색 원)의 예시적인 에너지 다이어그램을 도시한다. 펌핑은, 이득 요소를 더 높은 전자 상태로 여기시키고, 이로부터 이득 요소는 바닥 상태로 이완되어, 자발적 방출 또는 유도 방출을 방출한다. 이 다이어그램에는 2개의 전자 상태가 도시되어 있지만, 전자 상태의 각 대역 내에서 비복사적 전이를 고려하면, 이 이득 매질은 준 4개의(quasi-four) 레벨 시스템을 형성한다.
도 4a는, β = 0.01에 대한 정상 상태에서의, 레이저 모드의 출력 레이트(rate) P 1 및 자발적 방출 P f 의 수치 계산된 값을 도시한다. 레이저 출력은 임계값 근처에서 비선형적으로 증가하며, 임계값의 선예도는 β가 감소함에 따라 증가한다. 정상 상태에 대한 수치 계산. (a) β = 0.01에 대한 정상 상태에서의 레이저 모드의 출력 레이트 P 1 및 자발적 방출 P f . 레이저 출력은 임계값 근처에서 비선형적으로 증가한다. 임계값의 선예도는 β가 감소함에 따라 증가한다.
도 4b는, 이득 요소의 수를 예시하며, 이는 하기 식 (2)에 따라
Figure pct00001
로 또는 등가적으로 식 (5)로부터
Figure pct00002
로 표현된다.
도 5a는, 20ns의 펌프 지속 시간에 대한 수치 모의를 도시한다. 모의 파라미터는 τs = 3ns, τc = 30ps, β = 0.01, P th = 3.54x1012s-1이다. 펄스 레이트는 식 (11)에 따라 임계 레이트의 2배로 설정된다.
도 5b는, 100ns의 펌프 지속 시간에 대한 수치 모의를 도시한다. 모의 파라미터는 τs = 3ns, τc = 30ps, β = 0.01, P th = 3.54x1012s-1이다. 펄스 레이트는 식 (11)에 따라 임계 레이트의 2배로 설정된다.
도 6a는, 염료 레이저의 분자 에너지 준위와 관련되며, 형광체 염료의 프랑크-콘돈(Franck-Condon) 원리 에너지 다이어그램을 예시한다. 전자 전이는 핵 이동에 비해 매우 빠르기 때문에, 동일한 핵 좌표에서 진동 레벨간에 전이가 발생한다.
도 6b는, 유기 형광 염료 분자의 흡수(점선) 및 자발적 형광(실선) 스펙트럼을 예시한다.
도 6c는, 지시된 펌프 및 신호 파장에 대한 4-레벨 에너지 레벨 다이어그램을 예시한다.
도 7a는, GFP의 화학 구조를 예시하는 형광 단백질에 관한 것이다. 형광체(삽입 도면)는 베타 배럴 내에서 보호되어 환경에 대한 안정성과 같은 다수의 바람직한 특성을 제공한다.
도 7b는, 상이한 농도를 갖는 수성 eGFP 용액(□) 및 고체 상태 eGFP(40mM, ■)의 박막의 형광 세기를 예시한다. 합성 피로메텐 염료의 형광(○). 모든 데이터는 표본 두께에 대해 정규화되고, 여기 공핍에 대해 수정되었다. 흑색 점선, 저농도에서 선형 피트(농도 켄칭 없음). 녹색 및 분홍색 선, 각각 eGFP에 대한 푀르스터(Foerster)형 켄칭 모델 및 피로메텐 염료에 대한 응집 유도 켄칭 모델.
도 8a는, 직접 반도체 격자에 대한 캐리어의 포텐셜 에너지 및 모멘텀에 관련된 에너지-모멘텀 다이어그램(또는 E-k 다이어그램)을 도시한다. 펌핑에 의한 전도대로의 전자의 여기는 가전자대에 정공을 생성한다.
도 8b는, 전도대의 자유 전자와 가전자대의 정공의 재결합에 의한 유도 방출을 예시한다.
도 9a는, 말단 반사(end reflection)를 갖는 패브리-페롯(Fabry-Perot) 공동 형태의 독립형 레이저 입자에 대한 광 공명기를 도시한다.
도 9b는, 각각 디스크형, 환형 및 구형 형상의 위스퍼링 갤러리 모드(WGM: whispering gallery mode) 공명기를 도시한다.
도 9c는, 각각 선형, 평면형 및 복사형 격자 구조를 갖는 광 결정 공명기를 도시한다.
도 9d는, 산란 입자들의 클러스터에 의해 형성된 랜덤 마이크로-공명기를 도시한다.
도 10a는, 화학적으로 개시되는 반딧불이 루시페라제-루시페린의 전자 교환 발광(CIEEL) 반응을 제공한다.
도 10b는, 알칼리성 포스파타제(AP)-클로로-5-치환된 아다만틸-1,2-디옥세탄 포스페이트(CSPD) CIEEL 반응을 제공한다.
도 10c는, 퍼옥시옥살레이트-염료 CIEEL 반응을 제공한다. 여기서, 비스(2,4,6-트리클로로페닐)옥살레이트 및 9,10-디페닐안트라센(DPA)은 각각 퍼옥시옥살레이트 및 발광 염료의 예로 사용된다.
도 10d는, 퍼옥시다제-루미놀 CIEEL 반응을 제공한다.
도 11은, 레이저 입자의 펄스 작동 동안의 열역학 공정을 도시한다.
도 12는, 완화 시간 τ, 다양한 시간에서의 온도 분포를 갖는 매질에서 반경 R을 갖는 구형에 대한 온도 프로파일(좌측), r = 0.5*R의 구형 내부 온도의 시간-프로파일(중앙), 펄스 반복 주기의 함수로서 100회 펌프 펄스 후에 축적된 온도 상승(우측)을 도시한다.
도 13은, 생체 발광 구동 마이크로 공명기를 도시한다. 루시페린이 비드의 표면에 부착된 루시페라제와 반응시 광이 생성되며, 이의 일부는 위스퍼링 갤러리 공동 모드 내로 커플링된다(좌측). 루시페라제로 코팅된 비드의 발광이 도시된다(중앙). 광학 모드는 방출된 광의 스펙트럼에서 명확하게 관찰된다(우측).
도 14는, 레이저 입자로부터의 자극된 방출의 검출에 의한 고해상도 광학 섹션화의 원리를 예시한다. 좌측 상단에는, 가깝게 초점을 맞춘 광학 펌프 빔(회색)에 의해 여기된 소형 레이저 입자(원)가 있다. 상이한 양식들의 비교: 밝은 범위 이미징(우측 상단); 2개 광자 현미경(좌측 하단); 레이저 입자 자극 방출(LASE) 현미경(우측 하단).
도 15는, 설정의 개략도를 예시한다. L1, L2, L3: 구형 렌즈, λ/2: 반파장 판, CL: 원통형 렌즈, DM: 2색성 미러, M: 미러, Obj: 대물 렌즈(NA = 0.8, 수침), LF: 롱 패스 필터(long pass filter), 및 BS: 빔 스플리터(beam splitter). SEM: 통상적인 요오드화납 페로브스카이트 나노와이어의 주사 전자 현미경 이미지. 삽입 도면(좌측으로부터 우측으로): 임계값 이하의 페로브스카이트 나노와이어의 일반적인 형광 이미지, 나노와이어 임계값 이상의 자극 방출(stimulated emission) 이미지, 및 전하 결합 소자 카메라에 기록된 펌프 빔 프로파일.
도 16a는, 페로브스카이트 나노와이어로부터의 통상적인 레이저 출력 스펙트럼(원)을 도시한다. 곡선: 형광 배경(회색)에 대한 곡선 피트, 및 측정된 스펙트럼으로부터 형광 배경을 제하여 계산된 자극 방출 레이저 출력 스펙트럼(마젠타색).
도 16b는, 펌프 펄스 에너지 강도 레벨의 함수로서 측정된 자극 방출 출력 전력(정사각형)을 도시한다. 선: 식 (6)에 기초하는 곡선 피트. 삽입: 로그-로그 규모에서의 동일한 플롯.
도 16c는, 각각 p(= P/Pth) < 1(녹색 점선)에서의 형광 배경 및 p = 1(금색) 및 p = 1.8(사이안색)에서의 자극 방출에 대한 나노와이어의 3개의 펌프-빔 스캔 프로파일을 도시한다.
도 16d는, 레이저 방출 프로파일(청색 원) 및 형광 프로파일(녹색 원)의 측정된 FWHM값을 도시한다. 점선: 모의 결과.
도 17a는, 하나 이상의 실시에 따라, 레이저 입자들로부터의 레이저 방출을 측정하고, 이에 의해 이들을 식별하고 위치화하는 예시적인 하이퍼-스펙트럼 현미경검사를 도시한다.
도 17b는, 하나 이상의 실시에 따라, 하이-스펙트럼과 다중 광자 이미징을 결합하는 예시적인 다중 모드 현미경을 도시한다.
도 18a는, 주입 씨드가 증폭되고 레이저 발진으로 발전하도록 펌핑이 계속되는 동안 주입 잠금이 레이저 입자 내로의 주입 빔의 커플링을 필요로 함을 예시하는, 주입-잠금된 레이저 입자의 원리 및 응용을 도시한다.
도 18b는, 주입 씨드 광이 없는 자유 동작 모드 출력에서의 출력 스펙트럼과는 통상적으로 상이한 주입 잠금된 레이저 출력을 도시한다. 주입 잠금된 출력은 주입 빔에 대해 높은 레벨의 코히어런시(coherency)를 갖는다. 상기 코히어런시는 주입 레이저의 출력과의 간섭에 의해 레이저 출력이 감지되게 한다.
도 18c는, 산란 매질, 예를 들어 생물학적 조직에 매립된 레이저 입자로부터의 협대역 광(narrowband light)에 의해 가이딩되는(guided) 파면 형상화의 개략도이다.
도 19a는, 하나 이상의 실시에 따라, 제어된 방식으로 레이저 입자를 세포에 로딩하기 위한 예시적인 마이크로 유체 칩의 개략도를 도시한다.
도 19b는, 하나 이상의 실시에 따라, 각 세포에서 레이저 입자를 판독하기 위한 장치를 도시한다. 레이저 방출 스펙트럼의 판독에 따라 세포를 분류하기 위해 분류 설비가 추가될 수도 있다.
도 20은, 하나 이상의 실시에 따라, 특정 세포 표면 마커를 표적화하는 발광 프로브로서 레이저 입자에 기초한 유세포 분석(flow cytometry)의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 21a는, 하나 이상의 실시에 따라, 좌측의 예시적인 근적외선 InGaAsP 마이크로 레이저(200nm x 1.8㎛, 부분적으로 제거된 희생 기둥)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지; 하나 이상의 실시에 따라, 단일 웨이퍼로부터 다수의 레이저 입자의 생성 가능성을 나타내는, 부분 에칭 이후의 예시적인 마이크로 레이저 웨이퍼; ~5pJ(10ns, λp = 980nm)의 임계 펌프 에너지로의 물 및 공기에서 200nm x 1.8㎛ 디스크로부터의 출력 스펙트럼을 제공한다. 우측 패널에서, 선폭은 이득 대역폭의 1/1000에 불과하다. 열 분석은 하나 이상의 실시에 따라, 10㎛2에 적층된 최대 10nJ의 에너지에 의한 무시할만한 가열을 예측한다.
도 21b는, 하나 이상의 실시에 따라, 3개의 InAlGaAs 양자 우물 층을 갖는 마이크로 디스크 레이저의 주사 전자 현미경 사진을 제공한다: e-빔 리소그래피 및 이온빔 에칭 후(좌측); 기둥을 남기는 부분 습식 에칭 후(중앙); 및 완전 에칭 후(우측). 도시된 단리된 디스크 레이저 입자(우측)의 두께는 200nm이고 직경은 약 2.3㎛이다.
도 21c는, 좌측에서, 하나 이상의 양태에 따라, 플라스틱 접시 상의 분리된 디스크로부터의 레이징(lasing)을 예시한다. 우측에는, 하나 이상의 실시에 따라, 쥐 귀 피부(~500㎛의 두께)를 통해 수집된 또 다른 디스크 레이저의 출력 스펙트럼이 제공된다.
도 22a는, 하나 이상의 양태에 따라, 상이한 스펙트럼 바코드 피처(feature)를 갖는 레이저 입자의 제조방법을 도시한다. 상단에는, 점진적으로 변화하는 직경을 갖는 마이크로디스크 레이저가 도시된다. 하단에는, 크기에 따라 명확하게 상이한 레이저 모드가 도시된다.
도 22b는, 상이한 디스크 직경에 대해 e-빔 리소그래피에 의해 제조된 다양한 반도체 마이크로디스크를 도시한다.
도 23은, 하나 이상의 실시에 따라, 색으로 나타낸 상이한 합금 조성을 갖는 4개의 상이한 반도체 웨이퍼로부터의 제조된 512개의 레이저 디스크 입자의 출력 파장의 히스토그램을 예시한다. 빈(bin)의 크기는 1nm이다.
도 24a는, 생체 적합성 및 표적화된 전달에 대한 전략을 달성하기 위한, 레이저 입자의 표면 처리에 대한 바람직한 양태를 도시한다: 반도체 디스크 레이저(좌측) 및 부동화 층(예를 들어, SiO2)으로의 캡슐화(우측).
도 24b는, 중합체 코팅(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜))(좌측) 및 관능성 분자의 임의의 부착(우측)을 도시한다.
도 24c는, 리포솜 비히클(좌측) 및 표적화된 리포솜 비히클(우측)로의, 전신 전달을 위한 레이저 입자의 리포솜 캡슐화의 개략도를 도시한다.
도 25는, 하나 이상의 실시에 따라, 상이한 두께의 실리카 층으로 코팅된 예시적인 2개의 마이크로디스크의 SEM 이미지를 제공한다.
도 26은, 하나 이상의 실시에 따라, 예시적인 레이저 입자를 포함하는 세포의 광학 이미지를 제공한다. GFP 발현 세포의 밝은 영역 및 형광 이미지가 도시된다. 레이저 디스크는 제1 열의 관측 평면을 따라 거의 평평하고, 제2 열의 관측 평면으로부터 기울어져 있다. 제3 열에서, 현미경 이미지의 밝은 스팟은 상기 영역에 초점을 맞춘 펌프 레이저 빔 때문이다.
도 27은, 예시적인 실시에서 세포 내의 예시적인 레이저 디스크 입자로부터의 레이저 출력의 특징을 도시한다. 좌측 상단에는, 펌프 에너지의 함수로서 측정 된 광자의 수가 도시된다. 곡선의 곱슬곱슬한(kink) 형태는 약 20pJ의 임계 펌프 에너지에서 레이저 발사의 개시를 나타낸다. 우측 상단에는, 약 1시간 시간 간격으로 측정한 3개의 레이저 입자인 L1, L2 및 L3의 출력 스펙트럼이 도시된다. 좌측 하단에는, 각각의 레이징 임계값에 대해 정규화된 펌프 에너지 레벨의 함수로서 3개의 세포로부터 측정된 스펙트럼의 반치 전폭(FWHM)이 도시된다. 우측 하단에는, 상이한 세포 내로 로드되고 1일 후에 측정한 10개의 상이한 세포내 레이저 디스크 입자의 출력 스펙트럼이 도시된다.
도 28은, 하나 이상의 실시에 따라, 레이저 입자(정사각형)의 파장 분할 다중화에 기초하는 세포 태깅(tagging) 및 추적의 원리를 예시한다. 상이한 수의 레이저 및 출력 레이저 라인을 포함하는 세포가 도시된다. 단일 레이저 입자(S, 싱글렛), 2개 입자 이중(D; 더블렛(doublet)), 및 트리플렛(triplet)(T)의 조합의 수가 예시된다. 괄호 안의 숫자는 세포당 요소의 수, m에 해당한다. 세포(원)는 레이저 프로브를 추적함으로써 이의 분열을 통해 추적된다.
도 29a는, 하나 이상의 실시에 따라, 레이저 입자들의 2개의 어레이의 결합을 도시하는, 더블렛 및 트리플렛 입자를 형성하는 예시적인 프로세스를 예시한다.
도 29b는, 각각 더블렛 입자 상에 생체 적합성 코팅(죄측 2개의 개략도) 및 광학적으로 절연성인 스페이서(spaser)로서의 비드(우측 2개의 개략도)를 갖는 2개의 더블렛 입자를 도시한다. 상기 더블렛은 어셈블리, 또는 다층 웨이퍼로부터 직접 생성될 수 있고, 생체 적합성 중합체와 같은 물질로 추가로 코팅될 수 있다.
도 29c는, 하나 이상의 실시에 따라, 상이한 직경 및 상이한 출력 파장(우측)을 갖는 3개의 레이저로 이루어진 트리플렛 레이저 입자의 개략도를 도시한다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 개시된 특정 양태로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어는 특정 양태만을 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 의도하지 않는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 제한될 것이다. 본원에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 복수의 양태를 포함한다.
본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 이미 개시된 것 이외의 다수의 추가적인 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥에 따라 가능한 한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는"의 변형은, 요소, 컴포넌트 또는 단계를 비독점적인 방식으로 나타내어, 인용된 요소, 컴포넌트 또는 단계가 명확히 나타내지 않는 다른 요소, 컴포넌트 또는 단계와 결합될 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 특정 요소를 "포함하는" 것으로 나타낸 양태는 이들 요소로 "필수적으로 구성되는" 그리고 "구성되는" 것으로도 고려된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생의학 적용에서 샘플을 특성확인하거나 조작하기 위해 광을 사용하는 표준 패러다임은 몇 가지 실질적이고 개념적인 한계를 발생시킨다. 예를 들어, 광은 생물학적 조직에서 전파될 때 산란 및 흡수를 겪기 때문에, 이의 1/e 투과 깊이가 가시광선 및 근적외선 범위에서 3mm를 넘지 않는다. 이는 광학 투과율을 넘어서는 조직 내로의 광 전달에 어려움을 야기하고, 광의 임상적 유용성을 제한한다. 또한, 레이저가 단지 조명기로 사용될 때, 광원과 생물학적 시스템간의 상호 작용은 일방적이며, 레이저는 샘플에 영향을 미치지만 그 반대는 아니다.
생체 적합성이고 세포의 (또는 보다 더 작은) 크기로 소형화된 레이저가, 일정 기간 동안 신체에 이식되거나 조직 내로 주입되고, 원격으로 작동됨으로써 생체 시스템 내에서 사용될 수 있다. 이러한 신규한 패러다임은 광원을 표적에 물리적으로 전달하는 것을 포함한다. 도 2를 참조하면, 이러한 레이저 "입자"는, 외부 광선 전달용으로 사용되는 레이저의 실질적인 문제들 중 적어도 일부, 예를 들어 침투 깊이를 해결할 수 있는 내부 광원으로서 작용할 수 있고, 광선 치료를 위해 광을 사용하는 신규한 방식을 사용가능하게 할 수 있다. 또한, 조직에 매립된 레이저 입자는 다양한 방식으로 이의 국부 환경과 상호 작용하여, 양방향 상호 작용을 가능하게 할 수 있다. 레이저 광이 생의학 환경에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 생체 시스템도 레이저에 영향을 미쳐, 이의 출력 특성을 변경할 수 있다. 이러한 기능은 진단 및 건강 모니터링을 개선하기 위해 활용될 수 있다.
레이저는 이득 매질, 공동, 및 펌프 에너지원의 3가지 요소로 구성된다. 이득 매질에서의 광학 증폭은 자극 방출을 발생하는 데 필수적이다. 충분한 이득 및 긴 전파 길이를 갖는 증폭기는 증폭된 자발적 방출을 발생할 수 있다. 이러한 프로세스가 레이저 유사 특성을 갖는 출력, 예를 들어 스펙트럼 협대역을 생성할 수 있지만, 레이저의 협소한 한정은 공동에 의한 광학 피드백을 필요로 한다. 공동은 광을 구속하고 광의 공명을 일으킨다.
광 또는 광자 공동 이외에, 준입자(quasiparticle)에 대한 다른 유형의 공동, 예를 들어 폴라리톤(polariton) 및 플라즈몬(plasmon)을 사용하여 레이저를 사용가능하게 할 수 있다. 엑시톤 폴라리톤에 기초하는 폴라리톤 레이저는 "비-광자" 레이저의 대표적인 예이다. 폴라리톤 레이저의 메커니즘은 일반적으로 폴라리톤의 보스-아인슈타인(Bose-Einstein) 응축과 관련하여 개시된다. 복사선의 자극 방출 또는 "스페이서"에 의한 표면 플라즈몬 증폭은, 통상적으로 자유 전자 또는 플라즈몬 공명을 위한 금속 공동을 포함한다.
활성 이득 요소를 포함하는 이득 매질, 예를 들어 수용액 중의 염료 분자 또는 고체 상태의 결정에 어셈블링된 반도체 원자를 생각해보자. 도 3a는, 이득 매체가 펌프 공급원, 예를 들어 여기 레이저에 의해 더 높은 에너지 상태로 여기되어, 원래의 바닥 상태로 복귀하면서 형광을 방출하는 이득 매체를 예시한다. 도 3b 및 도 3c에서, 동일한 이득 매체가 광 공동 내부에 배치되고, P의 레이트로 펌핑하여, 형광 광의 일부가 공동에 포획되고, 공동내 광이 자극 방출에 의해 증폭된다. 충분한 단일 경로 이득, 및 이득 매질을 통한 충분한 경로가 제공된다면, 공동내 광은 레이저 방출로 전개된다. 자발적인 형광 방출이 모든 방향으로 복사되는 반면, 레이저 방출은 공동에 의해 결정된 특정한 강도 패턴으로 공동을 빠져나간다. 그러나, 광학 파장에 필적하는 크기의 소형 공동의 경우, 출력 커플링의 방향성이 덜 두드러지며, 레이저는 자발적 방출 및 자극 방출 둘 다에 대해 점 공급원과 같이 거동할 것이다.
도 3d는, 이득 요소의 전자 상태의 에너지 다이어그램을 사용하는 이득 매질, 예를 들어 형광체, 반도체 중의 전자, 또는 결정 중의 이온에서의 펌핑 및 방출 프로세스를 도시한다. 이득 요소는 먼저, 통상적으로 이산 상태 또는 연속 상태의 다수의 진동 상태로 구성되는 바닥 상태에 채워진다(populated). 펌프 에너지를 흡수하는 이득 요소는 여기 상태로 여기된 후, 비-복사 내부-밴드 전이를 통해 여기 상태의 더 낮은 에너지 레벨에 축적된 다음, 공동내 광자와 상호 작용시 자발적 방출 또는 자극 방출을 겪는다.
이러한 유형의 4레벨 이득 매체에서의 레이저 입자를 설명하는 단순화된 레이트 방정식은 다음과 같이 쓸 수 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
여기서, N 1(t)는 이득 매질에서 여기된 형광체의 수이고, q(t)는 레이저 공동 모드에서의 광자의 수, P(t)는 펌프 레이트, τ s 는 이득 분자의 자발적 방출(형광) 수명, 및 β는 레이저 모드에 의해 포획된 자발적 방출 레이트를 나타내는 자발적 방출 인자이다. 1/τ s 는 모든 주파수 및 방향에서 가능한 모든 복사 모드에 대한 자발적 방출 레이트에 해당하며, 따라서, β/τ s 는 레이저 모드 내로 커플링된 자발적 방출 레이트를 나타낸다. 자극 전이 레이트는 공동 모드의 수에 비례하며, 공동 모드의 자발적 전이 레이트와 광자 수를 곱한 값과 같다:
Figure pct00005
.
광학 펌핑의 경우, 펌프 레이트는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00006
여기서 QY는 자발적 방출 또는 자극 방출을 통해 1개의 광자를 생성하는 1개의 흡수된 광자의 확률을 특정하는 양자 수율이고, σa는 이득 요소의 흡수 단면적이고, N g(t)는 바닥 상태의 이득 요소의 수이다. 도 3d의 상황을 포함하는 대부분의 경우에서, N g(t)와 N 1(t)의 합은 이득 요소의 총 수 N tot(t)와 동일하며, 일정할 수 있거나 시간에 따라 변할 수 있다.
식 (3)에서, 펌프 광의 강도는 공간 불변이라고 가정했다. 이 가정은 펌프 빔의 크기보다 훨씬 더 작은 크기의 레이저 입자에 대해 유효하다. 불균일한 펌프를 갖는 보다 더 큰 레이저의 경우, 펌프 레이트는 피크 펌프 출력에 의해서만 결정되는 것이 아니라, 펌프 강도 프로파일과 레이저 모드 프로파일 사이의 중첩에 의해서도 결정된다.
공동 모드 P l (t) 및 자발적 형광 방출 P f (t)의 출력 방출 레이트는 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 식에서,
q l(t) 및 q f(t)는 각각 레이저 모드 및 형광 방출의 방출된 광자 수이다. 이들은, (P(t)의 정의에 의해 제공되는) 광자 수의 보존을 기술하는, P(t) = P l (t) + P f (t)를 따른다.
일정 상태(t >> τ s ): 레이저가 일정 상태(즉,
Figure pct00009
)일 때, 본 발명자들은,
Figure pct00010
Figure pct00011
을 수득했으며,
상기 식에서,
Figure pct00012
이다.
도 4a 및 도 4b는, 펌프 레이트의 함수로서 자극 및 자발적 출력 방출 레이트의 플롯을 도시한다. 그래프로부터, P th 는 레이저 모드의 임계값에서의 펌프 레이트에 해당한다는 것이 분명해진다.
레이저 발진은 이득 요소의 "재순환" 레이트를 향상시킨다. 레이저 임계값 이하에서, 이득 포화가 발생하지 않는 한, 여기된 요소의 수 N 1이 펌프 레이트에 따라 선형적으로 증가한다, 즉, N 1은 N tot에 필적하게 된다(도 4b). 임계값 이상에서는, N 1은 펌프 레이트에 관계없이 일정한 레벨으로 고정되어, 광 이득이 공동 손실과 동일하게 유지된다, 즉, 레이저의 총 이득은 1(unity)이다. 펌프가 증가함에 따라, 공동내 광의 강도가 증가하고, 자극 방출의 레이트도 증가한다. 이 과정은 여기된 이득 요소를 증가된 레이트로 바닥 상태로 가져온다. 이러한 향상된 이완 레이트는 펌프 레이트와 균형을 이루어, 일정한 수의 여기 상태의 이득 요소와 일정한 광학 이득을 발생시킨다. 결과적으로, 펌프 레이트가 임계값 이상으로 증가함에 따라 여기 상태의 유효 수명이 단축된다.
일시적인 빌드업 상태: 관리 식 (1) 및 (2)는 레이저 발진의 역학을 설명한다. 레이저 모드의 빌드업을 위해 필요한 조건은 (t=0; q=0에서)
Figure pct00013
이고, 이로부터, 여기 상태의 최소 이득 요소의 수는 다음을 만족해야 한다:
Figure pct00014
일정한 레이트로 τp 동안 펌프 에너지가 공급되는 상황을 고려하라. q=0(임계값 이하) 및 정사각형-프로파일 펌프 펄스에 대해, 식 (1)의 해는 다음과 같다:
Figure pct00015
식 (9)에서 임계 조건에 도달하는 데 필요한 펌프 레이트는 다음과 같다:
Figure pct00016
준-연속 펌핑(τ p > τ s )의 경우, 본 발명자들은 식 (8):
Figure pct00017
을 확인했으며, 레이징 임계값에서의 펌프 출력은 펄스 지속 시간과 무관하며, 임계 펄스 에너지는 펄스 지속 시간에 비례한다. 한편, 단-펄스(short-pulse) 펌핑(τ p < τ s )의 경우, 본 발명자들은
Figure pct00018
를 확인했으며, 펌프 전력은 펄스 폭이 감소함에 따라 증가하고, 임계 펌프 에너지 P th τ p는 펌프 펄스 지속 시간과 무관하다.
도 5a 및 도 5b는, 2가지 체계에 대한 수치 결과를 도시한다:도 5a에서, τ p > τs이고, 도 5b에서, τp < τs이다(여기서, τs = 3ns 이고 τc = 30ps이다). 먼저, τp = 20ns 동안, t = 0에서의 펌핑의 개시 후에, 여기된 이득 요소의 수 N 1 및 형광 방출 레이트 P f가 증가한다(도 5a). 초기 오버슛(overshoot) 및 급속 링잉(ringing)은 이완 진동으로 알려져 있으며, 이들은 정사각형 펄스에서는 통상적이지만 가우스 펄스에서는 덜 나타난다(pronounced). t > τs에서, 레이저는 일정 상태에 도달한다. 이 모의에서, 펌프 레이트는 식 (11)에 따라 임계값의 2배로 설정되었다. t = 20ns에서 펌핑의 종료 후, 형광 방출은 τs = 3ns와 동일한 이완 시간으로 지수함수적으로 감쇠되는 반면, 자극 방출은 τc = 30ps의 공동 수명 1로 지수함수적으로 감소된다. τp = 100ps의 짧은 펌프 펄스를 사용하면, 짧은 레이저 펄스가 생성된다(도 5b). 출력 펄스 지속 시간은 이완 발진의 피크 폭과 동일한 순서이다. 여기 상태의 이득 요소의 수는 펌프 펄스의 종료에서 최고조에 달하며, 레이저 펄스가 방출됨에 따라 급격하게 감쇠되고, 임계값 레벨 이하로 떨어지면 지수함수적 감쇠가 뒤따른다.
식 (9)에서, 레이저에서 여기된 이득 요소의 최소 수는 τs/(βτc)보다 커야한다. 용적 V를 갖는 이득 매질에서 이러한 다수의 요소를 가지려면, 절대 최소 농도는
Figure pct00019
보다 커야 한다. 예를 들어, τs = 3ns, τc = 300fs 및 β = 0.05에서, 이득 매질은 적어도 2x105개의 이득 요소를 가져야한다. V = 10㎛2의 경우, 이론적인 최소 농도는 330nM이고, V = 1㎛2의 경우, 330μM 보다 더 큰 매우 높은 농도가 필요하다. 실제로, 대부분의 레이저는 펌프 에너지의 유한한 흡수때문에 N 1보다 더 큰 N tot를 요구한다(아래에서 추가로 설명함). 따라서, 이득 요소의 최소 농도는 상기에서 추정한 것보다 1 또는 2 오더(order)보다 더 높다.
반도체 및 고체 상태 레이저는 염료 레이저보다 더 소형이고, 유지 보수가 용이하다. 그러나, 생의학 레이저 입자의 경우, 형광 염료는 이득 물질로서 중요하고 실용적인 선택이다. 개선된 명도와 광안정성 및 이전의 레이저 염료에 비해 최적화된 생체 민감성을 지닌 다양한 형광 염료가, 형광 기반 생체 이미징 및 생화학적 검정에 사용될 수 있다.
도 6a는, 분자 구조에서의 원자 분리의 함수로서, 통상적인 형광체 분자의 전자 및 진동 에너지 레벨을 도시한다. 펌프 광자의 흡수시, 분자는 최고 에너지 점유 분자 오비탈 또는 HOMO 대역의 바닥 상태(g)로부터 최저 에너지 비점유 분자 오비탈 또는 LUMO 대역의 여기 상태(1')로의 전자 전이를 겪는다. 초기에 여기된 전자는, 전자가 HOMO의 바닥 상태(g')로 감쇠하는 비복사(진동) 이완에 의해 LUMO에서 최저 에너지 레벨(1)로 이동한다. 이 에너지 다이어그램은 통상적으로, 단리된 형광 염료, (염료들이 서로 약하게 상호 작용할 수 있도록 저농도인) 용액 내의 형광 프로브, 및 단백질 구조체(즉, 형광 단백질) 내부의 보호된 형광체 유닛을 포함하는 모든 분자에 적용된다.
도 6b는, 형광체의 일반적인 흡수 및 방출 스펙트럼을 도시한다. 흡수 및 방출 스펙트럼은 부분적으로 서로 중첩되며, 이는 도 6a의 에너지 다이어그램으로부터 이해할 수 있다. 이러한 예에서, 분자는 형광 방출이 무시할 수 있는 청색 광(λ
Figure pct00020
430 내지 490nm)으로 펌핑될 때, 레이저 작동을 위한 효과적인 4-레벨 시스템을 형성한다. 4-레벨 시스템은 바닥 레벨인 g; 펌프 레벨인 1'; 준안정한 상부 레이저 레벨인 1; 하부 레이저 레벨인 g'를 포함한다(도 6c). 이 상부 상태의 수명 τs는 대부분의 유기 분자에서는 통상적으로 1 내지 10ns이지만, 외부 섭동, 예를 들어 켄칭 또는 포스터 공명 에너지 전이(FRET)에 의해 보다 더 짧아질 수 있다. 상부 레이저 레벨로부터 하부 레이저 레벨로의 전이는 자발적 방출 또는 유도 방출 둘 다에 의한 것일 수 있다.
통상적인 염료 분자의 최대 흡광 계수(ε)는 10,000 내지 100,000M-1cm-1의 범위이다. 예를 들어, ε = 56,000M-1cm-1 및 0.6의 형광 QY를 갖는 분자를 고려해보자. 이득 매질 중의 분자의 절반이 주어진 시간에 상위 레벨로 여기되는 경우, 본 발명자들은 최대 16,800M-1cm-1의 자극 방출(이득)을 얻을 수 있었다(신호 유도 된 이득 소모(gain depletion)는 무시함). 1cm 길이의 큐벳 내부의 1mM 농도의 이러한 분자 용액은 100.0168 = 1.039의 단일 경로 광 이득을 생성할 수 있으며, 즉, 광학 강도는 3.9% 또는 0.168dB 증폭된다. 직경 10㎛의 세포질 중 1mM의 농도로 분자를 포함하는 단일 포유류 세포에 의해 동일한 양의 단일 경로 이득이 달성된다.
형광 단백질은 형광을 방출할 수 있는 단백질이다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 해파리인 Aequorea victoria에서 처음으로 발견딘 유형이다. 생의학 과학에서 형광 단백질의 인기가 높아짐에 따라, 다양한 생물체로부터 새로운 야생형 단백질을 지속적으로 발견하고, 향상된 형광 특성을 갖는 돌연변이 변이체를 개발했다. 여러 가지 효율적인 형광 단백질이 해파리(eGFP, mCFP, eYFP 등), 산호초(DsRed, tdTomoto) 및 버블-팁 말미잘(TurboRFP)로부터 유도되었다. FP는 통상적인 형광 염료와 비슷하거나 이보다 높은 QY 및 큰 흡수 및 방출 단면적을 가지며, 생물학적 레이저의 이득 매질로 사용하기에 매우 적합하다. 소형 분자 유기 염료에 비해 FP의 가장 독특하고 중요한 이점은, 유전적으로 암호화될 수 있다는 것이다. 이는 유전자 표적화에 의해 FP가 특정 표적 세포 유형에서 발현되게 한다. FP의 이러한 성질은 이득 물질로서의 FP에 기초한 레이저 입자의 적용을 위한 유전적 특이성을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
도 7a를 참조하여, FP는 중앙에 형광체를 갖는 일반적인 캔 유형의 원통형 형상을 갖는다. GFP는, 분자의 중앙에서 실제 형광체인 4-(p-하이드록시-벤질리덴)-이미다졸리딘-5-온을 둘러싸는 11개의 스트랜드의 규칙적인 β-배럴을 갖는다. β-캔 구조는 Ser-Tyr-Gly 서열을 이의 발광 형태(conformation)로 만들기 때문에 GFP의 형광에 있어 필수적이다. 독특한 보호 분자 쉘(protective molecular shell)은 형광의 농도 켄칭을 방지한다. GFP는 형광을 밝게 유지한다. 이는 높은 농도에서의 켄칭에 의해 이의 형광을 고농도로 손실하는 소형 합성 형광 염료와는 대조적이다(도 7b 참조). 높은 농도에서 GFP의 낮은 켄칭은, 건조 향상된 GFP 필름에 대해 96dB cm-1의 매우 높은 이득 계수를 야기했다.
무기 반도체는 레이저의 이득 물질로 사용될 수 있다. 반도체는 충전된 원자가 밴드와 빈 전도 밴드를 갖는 결정질 또는 비정질 고체이다. 반도체는 절연체와는 달리 밴드 에너지 갭(Eg)이 일반적으로 4eV 이하여서, 일부 전자는 광학적 또는 열적 여기에 의해 빈 전도대로 전이할 수 있으며, 물질는 불순물로 도핑되어 이들의 전자적 성질을 변경할 수 있다. 대부분의 공지된 반도체 물질는 결정성 무기 고체이다. 이들은 IV족 물질, 예를 들어 규소(Si) 및 게르마늄(Ge), III-V 화합물, 예를 들어 GaAs 및 InP, 및 이들의 합금, 예를 들어 AlGaAs 및 InGaAsP, 및 II-VI 화합물, 예를 들어 CdS 및 ZnO를 포함한다. TiO2와 같은 산화물 및 MoS2 및 WS2와 같은 2차원(2D) 전이 금속 디칼코게나이드도 반도체이다. 레이저 작용은 효율적인 복사 프로세스에 의존하기 때문에, 간접 갭 물질, 예를 들어 규소 및 게르마늄은 적합하지 않을 수 있으며, 직접 갭 III-V 및 II-VI 화합물 반도체가 바람직하다.
이러한 시스템에서의 레이저 작용의 물리학과 관련하여, 도 8a 및 도 8b는 직접 밴드 갭을 갖는 고유 반도체 물질의 간단한 에너지 다이어그램을 예시한다. 원자가 밴드는 펌핑 없이 완전히 충전되기 때문에, 이러한 반도체 레이저는 3레벨 레이저 시스템과 유사하게 거동한다. 여기 상태의 유한 분포(finite population)는 물질에서 순 이득을 얻기 위해 필요하며, 그러한 조건에 도달하는 캐리어 밀도는 투과도 분포라 불리며, 통상적으로는 1018cm-3 오더이다. 이들 물질에서의 광자의 자극 방출은 자유 전하 캐리어의 복사 재결합(즉, 전도대의 전자와 원자가 밴드의 정공)으로부터 기인한다.
개략도는 반전이 없는 레이저에 대한 것이지만, 유한 이득을 얻기 위해서는 분포 반전(population inversion)이 필요하다. 전도대 및 원자가 밴드의 전자 상태의 수는 캐리어의 상태 밀도(ρ c )로부터 쉽게 계산되며, 이는 다음과 같다:
Figure pct00021
벌크(3D) 반도체에 있어서, m*는 캐리어의 유효 질량이다. 체적 V를 갖는 벌크 반도체의 전도대를 최대 Ec 이상의 에너지 ΔE로 충전하기 위한 전자의 수 N 1은 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00022
예를 들어, 벌크 GaAs의 경우, 유효 전자 질량은 m e * = 0.61x10-31kg이고, T = 0K 및 ΔE = 0.1eV에서, 본 발명자들은 전자 농도의 관점에서 4.15mM인 N 1/V = 2.5x1018개 전자/cm3을 얻었으며, 이는 켄칭 없는 유기 형광체의 최고 밀도와 비견될만 했다(도 7b 참조). 반도체는 실제로 ㎛당 ~1%의 매우 큰 이득을 달성할 수 있다.
반도체는 이들의 밴드 에지보다 더 짧은 모든 파장에서 광을 효율적으로 흡수한다. 흡수 계수(α, 자연 대수 기준)는 밴드 갭 바로 위의 광 주파수에서 ~104cm-1이다. 방출 전이(전자-정공 조합)의 복사 수명 τs는 정공의 분포 밀도 및 복사 재결합 계수 B(B
Figure pct00023
10-10cm3 s-1)에 비례하며, 대략적으로는,
Figure pct00024
이다.
레이징에서의 통상적인 분포 밀도(N 1/V
Figure pct00025
1018 내지 1019cm-3)에 대하여, 복사 수명은 1 내지 10ns이며, 염료의 형광 수명과 동일한 오더 규모이다.
이전의 반도체 레이저는 p-n 호모 접합의 계면 영역에서 수득되는 분포 역전을 사용했다. 소수의 캐리어의 확산으로 인해, 실제 활성 영역은 상대적으로 두껍고(~1㎛) 높은 임계 펌프 에너지를 필요로 한다. 보다 효율적인 설계는, 활성 영역이 보다 더 낮은 밴드 갭 및 보다 더 높은 굴절률을 갖는 상이한 반도체의 박층(~100nm)으로 구분되는 이중 헤테로 구조이다. 이 구조를 통해, 전하 캐리어는 활성 박층에 구속되어 분포 밀도가 증가된다. 양자 효과가 우세한, 예를 들어 1차원의 구속을 갖는 양자 우물(QW), 2D 구속을 갖는 양자 와이어(quantin wire), 및 3D 구속을 갖는 양자 도트(QD)과 같이 ≪ 100nm의 치수로 전하를 추가로 구속함으로써, 보다 더 높은 N1을 달성할 수 있다. QW의 상태 밀도는
Figure pct00026
로 수정된다.
반도체의 이득 스펙트럼 범위는 화합물의 화학량론을 다양하게 조정하고 기계적 응력을 유도함으로써 어느 정도로 조정할 수 있다. AlGaAs의 경우 720 내지 850nm, InGaAs의 경우 900 내지 1,100nm의 방출 스펙트럼이, 이들이 조직에서의 광 투과를 위한 광학 창과 잘 일치하기 때문에 생의학 적용과 관련된다. 가시광으로 방출을 위해, InGaAlP 시스템은 적색(630 내지 700nm)에서 작동하는 반면, 사이안 영역(400 내지 530nm)에서는 (GaN 및 InGaN과 같은) III족 질화물이 일반적으로 사용된다.
반도체 물질는, 최종 디바이스가 리소그래피 프로세스를 통해 제조되는 웨이퍼 상의 에피택셜 프로세스를 통해 성장할 수 있다. 나노규모 무기 반도체도 용액에서의 화학적 합성에 의해 콜로이드성 나노 결정 형태로 성장할 수 있다. 다양한 콜로이드성 나노 결정은 생물학적 응용에서, 주로 생체 이미징 및 바이오센싱을 위한 형광 태그로서 광범위하게 사용된다. 나노규모 치수에서의 높은 양자 구속으로 인해, 밴드 갭, 및 따라서 방출 파장은 입자의 크기를 제어함으로써 쉽게 조정할 수 있다. 통상적인 나노결정은 코어가 방출성 물질인 구형 코어/쉘 양자 도트 형태인 반면, 상기 쉘은 일반적으로 표면 결함으로부터의 비방사적 재조합을 감소시키는 패시베이션 층으로서의 역할을 한다. 또한, 코어/쉘 아키텍쳐(architecture)는 이러한 물질로 광학 이득을 얻는 데에 있어 중요한 것으로 보여왔다. 막대형 또는 분지형 나노결정과 같은 보다 더 복잡한 형상이 개발되어, 증가된 방사 전이의 수명, 제어된 분극화, 및 다중 방출 밴드의 장점을 제공해 왔다.
유기 반도체는 형광성 소형 분자, 올리고머 또는 고분자를 포함하는 응축된 상태로 매우 고농도로 형성되어, 개별 요소들이 커플링되고, 비국소화 된 전자를 갖는 π-공액 시스템을 집합적으로 형성한다. π-공액 시스템은 가시적인 전자 전이 및 전하의 전도능을 유기 반도체에 부여한다. 유기 반도체의 통상적인 구조는, 용해도를 향상시키기 위해 특정 관능을 분자에 부여하도록 조정될 수 있는 측면 그룹으로, 예를 들어 알킬 쇄로 데코레이팅된 주요 광전자 특성을 결정하는 중심 공액 주쇄(central conjugated backbone)로 구성된다. 유기 반도체는 일반적으로 매우 넓은 이득 스펙트럼을 가지며, 특히 고분자 공액 중합체의 경우 물질을 변경하지 않고 이의 방출을 미세 조정할 수 있다. 이러한 물질로부터의 레이저는 일반적으로 가시적인 범위에서 발생한다. 근적외선에서 밴드 갭을 갖는 공액 중합체는 일반적으로 효율적인 발광 방출을 갖지 않는다.
유기 물질의 레이징은 싱글렛 엑시톤의 복사성 재결합을 포함한다. 엑시톤의 수명은 수백 피코초 내지 나노초이다. 형광 염료 및 단백질의 경우에서와 같이, 이러한 짧은 수명은 레이저 임계값에 도달하기 위해 높은 펌프 레이트가 필요하고, 유기 반도체 레이저는 펄스 체계에서만 입증되어 왔다. 유기 반도체는 결정질 무기 반도체에 비해 낮은 전하 이동성을 가지며, 폴라론(전자-포논 커플링 전하 캐리어)은 상당한 흡수를 가지므로, 높은 캐리어 밀도에서 높은 손실을 야기한다. 이러한 이유로, 유기 반도체의 전기적 펌핑은 아직까지 성공적이지 못했다.
유기 반도체의 안정성은 생물학적 환경에서의 사용을 고려할 때 중요한 요소이다. 이러한 물질는 일반적으로 산소와 물의 물리화학적 상호작용에 매우 민감하며, 전하 수송 및 형광 방출 둘 다에 대하여 특히 해로울 수 있다. 그럼에도 불구하고, 유기 반도체는 생물학적 환경에서의 레이저 입자용으로 잠재적으로 매력있는 몇 가지 특성을 제공한다. 하나는, 이들의 유기 조성물, 보다 순응적인 기계적 특성, 및 세포 친화적인 표면 거칠기로 인해, 무기 물질에 비해 일반적으로 우수한 생체 적합성이다. 일부 유기 물질는, 이온 및 전자 전도 둘 다를 허용하여, 이들을 일반적으로 이온 이동에 의해 전기 신호가 전달되는 생물학적 조직과의 인터페이싱에 적합하게 만든다. 또한, 유기 물질는 특정 분석물에 민감한 관능성 그룹으로 화학적으로 조정할 수 있다. 형광 변조 및 심지어 공액 물질로부터의 레이저 방출에 기초하는 화학적 및 생물학적 감지가 보고되어 있다.
투명한 고체 상태 호스트에 불순물로 포함된 희토류 또는 전이 금속의 이온은, 레이저에 대한 잘 확립된 이득 요소이다. T.H. Maiman에 의해 1960년에 시연된 첫 번째 레이저는, Al2O3 결정에 Cr3 + 이온이 도핑된 루비를 사용했다. 호스트 물질는 산화물 결정(예를 들어, Al2O3 및 Y3Al5O12 또는 YAG), 불화물 결정(YLiF4 또는 YLF), 유리(SiO2 또는 실리카), 또는 중합체(폴리스티렌)일 수 있다. 결정질 호스트와 비교하여, 비정질 물질는 마이크론 크기로 보다 더 쉽게 제조될 수 있으며, 일반적으로 결정보다 높은 이들의 광 감쇠 및 열 저항이 소형 레이저용으로 바람직하다. 이득 요소에 대해 사용되는 가장 일반적인 도펀트 이온은, 3가 란탄족인 네오디뮴(Nd3+), 에르븀(Er3 +) 및 이테르븀(Yr3 +), 및 전이 금속인 티탄(Ti3 +) 및 크롬(Cr2+, Cr3 +, Cr4 +)을 포함한다. 이들은 일반적으로 레이저 작용을 지원할 수 있는 다중 전자 전이를 가지며, 이들의 방출 특성 또한 특정 호스트 물질에 따른다. 대부분의 경우, 레이징은 0.9 내지 1.6㎛의 근적외선 영역에 있지만, (694nm의 루비와 같은) 보다 더 짧은 파장 및 (2.9㎛의 Er:YAG와 같은) 보다 더 긴 파장에서의 일부 시스템도 존재한다. 이온 도핑된 고체 상태 레이저의 공통적인 특징은, 상부로부터 바닥 상태로의 전자 전이가 보다 더 약해서 이완 시간 τs가 ㎲ 오더 내지 10ms의 매우 긴 시간이 될 수 있다는 것이다. 긴 이완 시간은 연속 작동에 매우 적합하다.
긴 수명을 감안할 때, 희토류는 펌프 광자보다 더 높은 에너지에서 방출을 생성하는 상향전환(upconversion)에 적합하다. 이 프로세스는 2개의 광자를 순차적으로 흡수하여 전자를 준안정 상태로, 이후에 여기 상태로 촉진하고, 이로부터 전자가 바닥 상태로 감쇠되어 약 2배의 펌프 광자 에너지를 갖는 단일 광자를 방출시킨다. 중간 상태는 수명이 길기 때문에, 프로세스가 매우 효율적이다. 상향전환은, 중간 상태(및 최종 상부 상태)가 수 펨토세컨드만의 수명을 갖는 가상 상태인 전형적인 비선형 2광자 흡수와 구별되며, 따라서 효율적인 여기가 높은 피크 강도를 갖는 초고속 펄스로만 달성할 수 있다. 상세한 광물리학적 경로는 다른 곳에서 광범위하게 검토된다. 상향전환에 기초하는 첫 번째 레이저는 1971년에 시연되었으며, 상기 프로세스는, 근적외선 펌핑을 사용하여 가시광선 방출을 얻을 수 있으므로 특히 발광 나노 입자와 같은 생의학적 적용에 대하여 상당한 흥미를 끌었다. 이 물질는, 보다 더 깊은 투과 깊이를 갖고, 조직에서 가시광보다 덜 유해한 근적외선 펌프 광의 주요한 이점을 갖는 레이저 입자용으로 매력적인 후보이다.
광 공명기 또는 레이저 공동은. 이득 매질에서 재생성 증폭되게 하는 위상 코히어런시 광학 피드백을 제공한다. 이득 매질을 포함하는 다양한 광학 요소는 레이저 공동 내로 포함되어, 공동내 광 및 출력 레이저 특성의 광학 특성을 제어하고 조절할 수 있다.
공동 모드는 공동에서 공명적으로 발진할 수 있는 특정 공간파(횡파) 및 스펙트럼(종파) 광파이다. 횡파 모드는 광 발진 축에 평행한 치수를 따라 공동의 형상 및 크기에 의해 결정된다. 종파 모드는 한 번의 왕복 전파에서 누적된 전체 광학 위상이 2π의 정수배와 동일한 것을 만족시키는 주파수 컴포넌트들의 세트이다. 이러한 공명 조건은 다음과 같이 표현된다:
Figure pct00027
상기 식에서, l은 양의 정수이고, υl은 l번째 종파 공명 모드의 광 주파수이고, L c는 공동의 왕복 거리(예를 들어, 선형 공동의 길이의 2배 또는 환형 공동의 직경의 2π배)이고, n은 주파수가 υl인 l번째 모드의 (유효) 굴절률이다. 최소 l이 1이므로, 공명기에 대한 최소 길이 규모는, 공명기의 유효 굴절률 n으로 나눈 자유 공간 파장 λ와 동일하다.
높은 n은 작은 Lc를 허용하므로 소형 레이저 용으로 유리하다. 따라서. 반도체 물질는 공명기(및 이득 매질)를 실현하는 매력적인 물질이다. 금속으로 제조된 플라즈몬 폴라리톤 공명기는, 굴절률의 실제 부분이 공동 내에 구속된 자유 전자의 플라즈몬, 집단 운동과 광의 커플링에 의해 향상된다는 사실의 이점을 취하는 또 다른 매력적인 접근법이다.
공동 모드의 수는 공동의 용적에 비례한다. 공동 크기가 광학 파장에 필적하게 될수록, 총 방사 모드의 수가 감소하고, 자발적 방출 계수 β가 증가한다(식 (1) 참조). β가 1에 접근할수록, 흡수된 펌프 에너지의 대부분이 공동 모드로 이동한다. 극단적인 경우, 공동 크기가 광학 파장의 절반 이하이면, 모드의 수가 1이 되고, 알려진 상황은 "임계값 없는(threshold-less)" 레이저를 얻는다.
광 공동은 공동 모드로의 커플링을 통해 이득 매질의 이득 요소의 자발적 방출 레이트에 영향을 줄 수 있다. 퍼셀(Purcell) 효과라 불리는 구속된 모드의 자발적 감쇠 레이트의 향상은, 마이크로 및 나노 규모 레이저에서 유리하게 사용될 수 있는 요소이다.
크기가 광 진공 파장 λ에 필적하거나 이보다 더 작으면, 레이저는 점 광원과 유사하게 거동하여 넓은 입체각으로 광을 방출한다. 이후, 레이저 출력의 일명 "지향성"이 덜 두드러진다. 크기가 가능한 최소 크기(즉, Lc = λ/n)에 가까워짐에 따라, 공동으로부터 방출된 레이저 출력은 모든 방향으로 방사될 것이다. 레이저 출력은 단일 분자로부터의 형광 광과 마찬가지로 모든 방향으로 방출된다. 그러나, 지향성을 향상시키기 위해 일부 부가적인 피쳐(feature), 예를 들어 비대칭이 레이저 공동 내로 포함될 수 있다.
기하학적 형상 및 광 공명 축의 관점에서, 레이저 공동은 다양한 유형으로 분류될 수 있다. 실시예는 도 9a 내지 9d에 예시된다.
공동 손실 레이트의 역수인 공동 수명 τc는 공동의 Q 인자와 관련되며, 이는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00028
상기 식에서, 여기서 υ는 광 주파수이다. 상이한 공동 모드는 상이한 공동 손실을 경험할 수 있으므로, 상이한 Q 인자를 가질 수 있다. 소형 공동에서, 공동 수명은 일반적으로 자발적 방출의 광학 수명 τs보다 훨씬 짧다. 예를 들어, λ = 532nm의 경우, Q 인자가 106인 경우 τc = 0.28ns이고, Q 인자가 103인 경우 τc = 280fs이다.
식 (8)로부터, 임계 펌프 레이트는 Q 인자에 반비례한다:
Figure pct00029
부동 공동의 스펙트럼 선폭(임계값 이하)은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00030
임계치를 초과하면, 레이저 모드의 선폭은 감소되는데, 이는 공동 손실이 이득에 의해 보상되기 때문이다. 숄로 및 타운스(Schawlow 및 Townes) 한계에 따르면, 레이저 선폭의 근본적인 한계는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00031
실제로, 레이저 선폭을 넓히는 데에는 여러 요인이 기여한다. 레이저 작동 동안의 열적 가열은 공동의 굴절률 neff를 변화시켜 선폭을 넓힌다. 반도체 레이저에서, 캐리어-유도된 굴절률 변조는 중요한 선폭 확장 인자이다.
일반적으로, 펄스 펌핑은 연속파 펌핑보다 넓은 스펙트럼 폭을 발생시킨다. 공동의 온도 및 굴절률의 변조는 레이징 모드의 공명 주파수를 시간에 따라 처핑(chirp)시켜 출력 스펙트럼을 넓혀준다. 레이저 빌드업 동안의 이완 발진은 변조를 향상시킨다. 펄스 체계에서 작동되는 소형 레이저에서, 실제 레이저 스펙트럼 폭은 식 (18)에서의 이론적인 한계보다 몇 오더 더 커질 수 있다. 이러한 다수의 실제적인 경우에, 공동 Q는 레이저 선폭의 직접 결정 요인은 아니지만, 레이저 임계값(식 (17))에 도달하는 것이 중요하다.
R1 및 R2의 반사율을 갖고 거리 L(Lc/2)로 분리된 평면 또는 구형 거울쌍에 의해 형성된 선형 또는 동심원 공명기를 고려한다. 공동 수명은 다음과 같이 표현된다:
Figure pct00032
상기 식에서, n은 공동 내의 매질의 굴절률이고, η는 공동에서의 흡수 또는 산란 손실로 인해 발생할 수 있는 경로당 내부 손실의 분율이다.
λ = 600nm로의 방출을 위한 형광 염료를 포함하고, R 1,2(1-η) = 0.98인, n = 1.6의 굴절률을 갖는 매질로 충전된 패브리-페롯 공명기(도 9a)를 생각하라. 식 (16)에서 Q = 1,000은 L = 3.2λ/n = 1.2㎛일 때 얻어진다. 가장 작은 공명기는 L = λ/2n으로 주어진다. n = 1.6 및 R 1,2=0.98에 대해 이 최소 길이가 375nm인 공동의 경우, 본 발명자들은 Q = 155.5 및 Δυcacity = 3.86nm을 구했다.
광자 결정 공동은 주기적인 구조와 결함을 갖는다. 상기 결함 및 충분히 높은 Q 인자에서의 레이저 이득을 가짐으로써 레이징이 달성될 수 있다. 주기적인 구조는 1D, 2D 또는 3D 중 하나일 수 있다(도 9c). 1D 및 2D 광자 결정의 경우, 다른 차원에서의 광 구속은 전체 내부 반사에 의해 달성된다. 선형 격자 구조를 갖는 레이저는 분포 피드백 레이저(DFB) 및 수직 공동 표면 방출 레이저(VCSEL)를 포함한다. 2D 레이저는 일반적으로 내부 밴드 갭 구조가 있는 얇은 슬래브(slab) 상에서 실시된다. 3D 광자 결정 레이저는 제작하기가 더 어렵지만, 성공적인 레이저가 보고 되어 있다. 액정의 자가 어셈블리를 사용하여, 직경 15㎛의 방사형 브레그(Bragg) 마이크로 공동 레이저(3D 물체에 대한 1D 주기성)가 입증되었다. 출력 방출 패턴은 방사형이며, 모든 방향으로 균일하다.
각각 굴절률 n1 및 n2를 갖는, 2개의 교대하는 1/4 파장 두께의 물질의 m 이중 층의 주기적인 슬래브를 생각하라. 브래그 파장 λB는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00033
여기서, ∧는 이중 층 구조의 주기수(periodicity)이다. 브래그 파장에서의 반사율은
Figure pct00034
이다. 예를 들어, 99% 반사율을 달성하기 위해서는, n 1 = 3.5인 반도체 물질와 n 2 = 1.33인 저밀도 내부공간의 4개 이상의 이중 층이 필요하다. 광 공동의 각 측 상의 2개의 이러한 스택(stack)은 약 1.6㎛인 총 두께(8∧)를 가진다. 이는 세포 내부에서 사용하기에 충분히 작을 것이다.
위스퍼링-갤러리 모드(WGM)는 원형 형상의 공명기, 예를 들어 구형, 환상체형, 원통형 및 환형에서 지원된다(도 9a 내지 9b). 모드가 외부 계면에서의 전체 내부 반사에 의해 공동 내로 구속되고, 공동을 순환하도록, 굴절률은 주변 매질의 굴절률보다 커야한다. 공동내 광의 광학 필드가 공동 밖으로 순간적으로 확장될 수 있다. 이 순간적인 필드는 이득 매질이 공동 외부에 물리적으로 배치되게하며, 특정 응용, 예를 들어 주변 환경에서의 분자의 감지에서 중요하다.
WGM은 방사 모드 수 q, 극성 모드 수 l, 방위각 모드 수 m, 및 편광 p로 나타낼 수 있다. 구체의 경우, WGM의 주파수는 점근적인 확장을 사용하여 근사화될 수 있다(l ≫ 1):
Figure pct00035
상기 식에서, n1은 구체의 굴절률이고, n2는 주변 매질의 굴절률이고, TE 모드의 경우 χ = 1이고 TM 모드의 경우 χ = n2/n1이고, a는 구체의 반경이고, αq는 에어리(Airy) 함수의 음의 q번째 영(zero)(-2.3381, -4.0879, ...)이다. 상기 공식은 Lc = 2πa인 식 (15)와 일치하는 2πn1a/λ = 1로 추가로 근사화될 수 있다.
WGM 공명기의 크기가 광학 파장에 가까워지면, 이의 Q 인자는 복사(곡률) 손실에 의해 제한된다:
Figure pct00036
상기 식에서,
Figure pct00037
이고,
Figure pct00038
은 상대 굴절률이고, TE 모드에 대한 k = 0이고, TM 모드에 대한 k = 1이다. 수 mM의 통상적인 유기 형광 염료 및 나노초 펌핑을 포함하는 구체의 경우, 레이징을 달성하기 위해 필요한 최소 Q 인자는 ~10,000이다. 다음 방정식으로부터 다음 근사 공식을 얻을 수 있다:
Figure pct00039
주어진 Q 인자의 경우, 공명기 크기를 줄이기 위해 높은 n1이 필요하다. 예를 들어, λ = 0.6㎛에서, 세포질(n2 = 1.37)에서 2a < 1㎛로 Q = 104를 달성하기 위해서는 공명기 물질이 n1 > 2.61이어야한다.
유전체 물질로 만들어진 공동에서, 광학 에너지는 광학적 파장과 동일하거나 이보다 큰 길이 규모의 광자 모드에 저장된다. 예를 들어, 파장 이하(sub-wavelength) 유전체 공명기 상의 금속 박층을 코팅함으로써, 금속을 사용하여 보다 양호한 구속이 달성될 수 있다. 이러한 구성은 두 가지 유형의 공명 모드를 지원할 수 있다: 순수 반사 공동 모드 및 플라즈몬 기반 공명 모드.
순수 반사 공동 모드의 경우, 유전체 공동에서와 같이 공동내 에너지가 광학파에 저장된다. 금속 층은 금속 표면에서의 높은 반사에 의해 공동 내부에 모드를 구속하는 거울처럼 작용한다. 반사 표면에 의해 제공되는 효율적인 구속은 광학 파장 크기의 치수에 대해서도 높은 Q 인자를 허용한다.
플라즈몬 기반 공명 모드는, 금속-유전체 계면에서 발생하는 플라즈몬 효과에 기초한다. 공동내 에너지는, 광학 파장보다 훨씬 짧은 파장을 갖는 유전체 매질과 금속 사이의 계면에 강하게 구속된 플라즈몬 모드에 저장된다. 따라서, 플라즈몬 모드 공명은 광학 파장보다 훨씬 작은 공동으로 달성될 수 있다. 플라즈몬 모드는 일반적으로 장 범위 표면-플라즈몬-폴라리톤(LR-SPP)과 국부적 표면 플라즈몬(LSP)으로 나뉜다.
장 범위 폴라리톤은 금속과 유전체 물질 사이의 계면을 따라 전파되는 전자기파이다. 이들은 표면에 직각인 방향으로 순간적으로 구속된다. 일반적인 구조는 금속/절연체/반도체/절연체/금속 도파관 및 금속-절연체/반도체 나노와이어를 포함한다. 플라즈몬 모드는 절연 영역에서 주로 1차원 또는 2차원으로 구속되는 반면, 공동은 여전히 (적어도) 여러 파장의 순서로 상기 구조의 말단 면에 의해 전파 방향을 따라 구분된다. 그러나, 전자기 모드와 금속 내의 전자와의 강한 커플링은, 플라즈몬 모드의 본질적인 보다 더 높은 저항 유형(옴) 손실을 야기하여, 최소화하기가 어렵다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 이들의 Q 인자는 광자 모드에 기초하는 유사한 구조보다 낮다. 따라서 레이징은 극저온 온도에서만 달성가능하다.
국부화 플라즈몬은, 강한 전자기장과의 커플링에 의한 금속성 나노 입자의 표면에서의 전자들의 집단 발진이다. 표면 플라즈몬은, 나노 입자의 형상과 금속 및 주변 유전체 매질의 유전율에 의해 결정되는 공명 주파수를 갖는 공명성 전기 쌍극자의 역할을 한다. 플라즈몬 레이저는 금속 나노 스피어를 염료 도핑된 유전체 쉘로의 코팅에 의해 입증되었다. 염료의 광학 펌핑시, 광학 에너지는 FRET을 통해 금속 코어의 스펙트럼-매칭된 플라즈몬 공명으로 쉽게 전이된다. 표면 플라즈몬의 여기는 염료로부터 플라즈몬 모드 내로의 방출의 증가된 커플링을 자극하는 강한 국부 필드를 생성한다. 이러한 피드백 메커니즘은 방사선의 자극 방출에 의한 표면 플라즈몬 증폭으로 나타내며, 상기 메커니즘에 기초하여 작동되는 디바이스는 스페이서로 알려져 있다.
몇 가지 실험적 관찰에도 불구하고, 스페이서의 안정적인 구현은 낮은 Q 인자 및 금속 가열, 및 나노 규모 용적 내의 제한된 수의 이득 요소로 인해 어려웠다. 예를 들어, 40nm 구체는 2mM(1.2 x 1018cm-3)의 고농도에서도 40개의 염료 분자만을 포함할 수 있다. 지금까지 단일 입자 레벨에서의 스페이서의 실험적 실현에 대한 설득력 있는 증거는 보고되지 않았다. 실험적으로 입증된 모든 스페이서는 기재를 포함하여 수 ㎛보다 큰 치수를 갖는다.
지금까지 설명한 통상적인 공동은 잘 한정된 광학 공명 경로를 제공한다. 랜덤 레이저의 경우, 다중 산란에 의해 무질서 매질의 이득 영역에 광이 포착된다(도 9d). 이 매질에 대해, 전송 평균 자유 경로 lt는, 광의 전파 방향이 랜덤화된 후의 거리를 정의하고, lg는 광이 팩터 e(즉, 4.34dB)로 증폭되는 거리로서 정의되는 이득 길이를 나타낸다. 산란 매질은 충분한 이득 및 산란 피드백을 갖기 위해 임계 최소 용적을 가져야 한다. 이러한 조건으로부터, 랜덤 레이저 Lc의 최소 크기는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00040
예를 들어, 산란체로서 TiO2 나노 입자 및 이득 염료로서 로다민 6G를 포함하는 매질을 고려하라. 5.6 x 1010cm-3의 높은 농도에서 200nm 직경을 갖는 TiO2 나노 입자는 lt = 35㎛이다. 10mM의 높은 농도에서 로다민 6G 용액의 이득 길이는 ~10㎛이다. 이러한 랜덤 레이저 공동은 Lc
Figure pct00041
10㎛의 임계 크기를 제공한다. 즉, 10x10x10㎛3보다 큰 용적이 강력한 펌프 광으로 조사될 때, 원칙적으로 레이저 방출이 생성될 수 있다. 일반적인 피부 조직은 lt = 50㎛이며, 조직 내로의 10mM 로다민 6G의 투입은 Lc = 13㎛를 제공할 수 있다.
랜덤 레이저의 방출 스펙트럼은 일반적으로, 상이한 강도를 갖는 불규칙한 파장에 여러개의 협대역 피크를 포함한다. 출력 방출의 공간 프로파일은 상당히 복잡하며, 스페클(speckle) 패턴과 유사하다. 원칙적으로, 레이저 스펙트럼 및 공간 프로파일은 분산체의 특정한 분포로부터 결정된다. 그러나, 여러개의 산란체로부터의 광 산란은 분석하기가 어렵다. 그럼에도 불구하고, 산란 매질에 대한 레이저 출력의 감도는 감지에 대해 유용할 수 있다.
레이저가 작동하고 광을 생성하기 위해서는, 일부 형태의 에너지가 공급되어야 한다. 이득 매질에 의해 흡수된 입력 에너지는, 이득 매질에서 분포 반전을 생성하고 공동에서의 손실을 극복하기에 충분한 증폭을 생성하기에 충분해야 한다. 레이저 입자를 펌핑하는 다수의 상이한 방식이 있다. 광학 펌핑은 가장 편리한 방식을 제공하며, 레이저 입자가 광으로 쉽게 접근할 수 있는 상황, 예를 들어, 배지의 세포에 배치되거나 얕은 깊이의 조직에 이식된 레이저 입자의 경우에 매우 적합하다.
전류 주입은 통상적인 반도체 레이저를 구동하기 위한 확립된 방법이다. 반도체 입자가 생물학적 시스템에 매립될 때, 전기 펌핑할 수 있지만, 순 이득을 생성하기 위해 반도체 매질을 통과하여 충분한 전기 전류 및 전압을 유도하기(draw) 위한 영리한 방식이 필요하다. 무선 전기 에너지 전송은 동물에 매립된 밀리미터 크기의 발광 다이오드(LED)를 구동할 수 있는 것으로 확인된 하나의 옵션이다. 디바이스가 더욱 소형화됨에 따라, 상응하는 안테나가 작아지고, 효율적인 무선 전송에 필요한 공명 주파수가 증가한다. 크기가 마이크론 또는 마이크론 이하(submicron) 규모에 접근하면, 최적의 주파수 범위가 광학 주파수에 접근한다. 이는 무선 펌핑을 광학 펌핑과 동일하게 만든다. 본 섹션에서, 본 발명자들은 다양한 펌프 방법의 원칙을 설명한다. 또한, 본 발명자들은 생체 시스템으로부터 유도한 생체 에너지를 사용하여 레이저 입자를 작동하기 위한 흥미롭고도 예측하기 힘든 잠재력에 대해 논의한다.
광학 펌핑은 레이저 입자를 작동시키는 데 에너지를 제공하는 편리한 방식이다. ε을 이득 매질의 흡수 계수라 하자. 이는 흡수 단면 σa와 관련된다:
Figure pct00042
[식 (3) 참조]. 레이저 입자에 의해 흡수된 입사 펌프 에너지의 흡수 효율 ηabs, 또는 분율은 입자의 직경 2a의 대략 ε배로 결정된다.
Figure pct00043
상기 식에서, υp는 펌프 광의 광학 주파수이다. 예를 들어, 몰 흡광 계수가 65,000M-1cm-1인 형광 염료를 생각하라. 1mM의 농도로 염료를 포함하는 이득 매질은 ε = 65cm-1을 갖는다. 두께가 10㎛인 염료 필름은 펌프 빔의 14%를 흡수할 수 있다(ηabs = 0.86).
반도체의 흡수는 캐리어 밀도 ρc에 비례한다. 직접 밴드 갭을 갖는 벌크 반도체의 흡수 계수는, ε = A(υp/υg-1)0.5(여기서, 대부분의 벌크 반도체에서 A = 104 내지 105cm-1이고 υg는 밴드 갭 주파수이다)로 표현된다. 예를 들어, ε는, υp/υg = 1.2에서 GaAs(hυg = 1.42eV)의 경우 1.5x104cm-1이다. 250nm 두께의 얇은 GaAs 슬래브는 펌프 에너지의 58%를 흡수할 수 있다(ηabs = 10-1.5*0.25 = 0.42).
Ep의 에너지 및 빔 크기를 갖는 펌프 펄스를 고려하자. 흡수된 에너지는
Figure pct00044
로 주어지며, 여기서, 중첩 파라미터 ηarea는 빔 크기에 대한 레이저 입자의 크기의 비와 같고, 빔 크기가 이득 매질의 크기보다 작은 경우에는 1이다. 총 흡수 에너지의 일부는 자발적 및 자극 방출을 통해 광의 형태로 공동에서 방사 배출되며, 나머지는 열 및 다른 형태의 에너지로 전환된다.
펌프 강도가 증가함에 따라, 보다 더 많은 이득 요소가 상부 상태로 여기된다. 식 (1) 및 (3) 및 N tot(t) = N g(t) + N 1(t)로부터, 일정 상태에서의 발광 준비 상위 레벨의 이득 요소의 분율은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00045
신호 유도된 이득 포화(즉, 분모의 마지막 항)가 무시되는 경우(βq ≪ 1, 임계값 근처 및 임계값 이하), 50% 역전(N 1 = 0.5, N tot = N g)이 펌프 강도에서 달성되며, 다음과 동일하다:
Figure pct00046
50% 펌프 강도는 상위 레벨 수명당 흡수 단면적당 1개의 광자를 양자 수율로 나눈 값에 해당한다. 50% 분포 반전은 고효율 이득 매질에 대한 광학 펌핑에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, eGFP의 흡수 단면적은 λ = 488nm(hυp = 4.1x10-19J)에서의 펌프 펄스에 대해 σa = 2.1x10-16 cm2 및 QY = 0.8이다. 펄스 지속 기간이 수명과 같을 때(τs = τp), 분자 상부 레벨의 절반을 여기시키기 위해 필요한 펌프 선속(pump flux) I p ,50% τ p 는 2.4mJ/cm2 또는 24pJ/㎛2이다. 이러한 플루언스 레벨은, 광열 손상에 관한 인간 피부 조직의 일반적인 안전 한계보다 펄스 폭에 따라 1 내지 3 오더 더 낮다.
화학적 에너지는 분포 반전을 생성하는데 사용될 수 있다. 하나의 알려진 예는 불화수소 레이저에서 발견되었으며, 상기 레이저는
Figure pct00047
의 기본 반응에 의한 불화수소의 회전 진동 여기를 사용한다. 상기 반응은 ΔG = -31.6kcal/mol의 자유 에너지를 방출한다. 이러한 화학적 에너지의 일부는 2.7 내지 2.9㎛(9.8 내지 10.6kcal/mol)의 스펙트럼 범위에서 광자로 전환된다. 그러나, 회전 진동 여기에 기초하는 일반적인 발열 화학 반응은 1 내지 10kcal/mol만의 ΔG를 생성한다. 이는 가시광선 광자의 에너지보다 훨씬 더 작다(예를 들어, 400 내지 700nm에서 40 내지 70kcal/mol). 결과적으로, 이러한 화학적 에너지에 기초하는 모든 통상적인 화학 레이저는 적외선 영역에서 작동한다.
진동, 전이 대신에 전자를 포함하는 화학 반응은 가시광선 또는 근적외선 레이저를 펌핑하는데 적합할 수 있다. 전자 전이는 화학 반응에서 비교적 드물며, 일명 "화학적으로 개시된 전자 교환 발광(CIEEL)" 반응은 전자 전환을 고유하게 지원한다. CIEEL은 두 가지 유형으로 분류할 수 있다. 유형 1은 분자내 CIEEL이며, 용매 케이지(solvent cage)에서의 에너지 전달과 반응 생성물로부터의 직접 광 방출을 사용한다: 상징적으로는
Figure pct00048
및
Figure pct00049
. 유형 2는 분자간 CIEEL이며, 형광 염료를 사용하여 광을 방출한다:
Figure pct00050
;
Figure pct00051
; 및
Figure pct00052
(여기서, E는 염료를 나타낸다).
도 10a 내지 10d는 CIEEL 반응의 다양한 예를 도시한다: 즉, 반딧불이 루시페라제-루시페린 반응, 알칼리성 포스파타제(AP) 및 클로로-5-치환된 아다만틸-1,2-디옥세탄 포스페이트(CSPD) 반응, 퍼옥시옥살레이트-염료 반응(글로우 스틱 반응으로도 알려짐), 및 퍼옥시다제-루미놀 반응. 출발 반응믈이 상이하지만, 이러한 모든 반응은 유사한 고에너지 중간체인 1,2-디옥세탄을 갖는다. 화학발광 반응 중간체로서 1,2-디옥세탄의 독특한 이점이 있다. 1,2-디옥세탄의 분해는 π2-π2 광 부가환화의 역 프로세스이며, 이는 열적 여기에 대해 금지되어 있어, 대부분의 에너지는 열 에너지 대신 광자 에너지에 의해 배출된다. 1,2-디옥세탄과 이의 두 개의 카보닐 생성물의 에너지 차이는 ~72.5kcal/mol이어서, 가시광선 방출을 위한 전자 전이가 가능하다.
생체 발광 및 화학 발광 반응은 레이저 입자 펌핑의 잠재적인 후보이다. 고에너지 중간 상태는 전자기 복사로 광을 방출하거나(유형 1), 근거리장 FRET을 통해 광자 에너지를 인근 발광 입자, 예를 들어 염료에 전달할 수 있다(유형 2). FRET이 생체 발광 분자로부터 발생하면, 이는 종종 '생체 발광 공명 에너지 전달' 또는 BRET으로 나타낸다.
속도론적 조건은, 펌핑 반응 레이트가 감쇠 레이트보다 훨씬 빠를 것을 요구한다. 높은 반응 레이트를 달성하기 위해, 통상적인 화학 레이저는 기체상 반응을 사용한다. 예를 들어, 불화수소 레이저의 펌핑 반응의 레이트 결정 단계는
Figure pct00053
이다. 이 반응의 속도 상수는 1.6 x 1010M-1s-1이고, 실온에서의 확산 제어된 2분자 반응에 대해 일반적인 속도 상수인 109 내지 1010M-1s-1과 유사하다. 이에 비해, 액체상 화학 발광 반응은 보다 낮은 속도 상수를 갖는다. 예를 들어, 루시페라제-루시페린의 일반적인 속도 상수는 단지 10s-1이다. 속도 상수는 퍼옥시옥살레이트-루브렌 염료 반응에 대해 105s-1이고, 페놀 증강제를 포함하는 루미놀-퍼옥시다제 반응에 대해 107s-1로 보다 높을 수 있다. 루미놀-퍼옥시다제 반응은 불화수소 레이저의 반응보다 1,000배 느리다.
포도당의 산화는 많은 양의 깁스 자유 에너지를 방출한다: C6H12O6 (s) + 6O2 (g) → 6CO2 (g) + 6H2O (l), ΔG=-685.7kcal/mol. 이 화학적 에너지는 예를 들어 후속적인 화학 발광 반응을 통해 이론적으로 광을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 대사 에너지는, 세포의 에너지 통화(energy currency)로 알려진 아데노신 트리포스페이트(ATP) 분자를 생성하기 위해 소비된다. 이 프로세스는 아데노신 디포스페이트(ADP)에 세 번째 포스페이트 그룹을 추가하는 것을 포함한다. 총 30개 또는 32개의 ATP 분자가 하나의 포도당 분자로부터 생성된다. 임의의 주어진 시간에서, 약 1g의 ATP가 우리 몸에 존재한다. 세포가 에너지를 필요로 할 때, ATP 분자는 가수분해되어 ADP와 포스페이트로 해리된다. 평균적으로 일반적인 세포에서 1 내지 2백만개의 ATP 분자가 매 초 가수분해되어, 다음과 같은 프로세스를 통해 다양한 세포 기능에 사용할 수 있는 자유 에너지를 만든다: ATP (aq) + H2O (l) → ADP (aq) + Pi (aq), ΔG= -7.3kcal/mol. 이 에너지는 가시광선 및 근적외선 범위에서 광자를 직접 생성하기에는 충분하지 않다. 일부 생체 발광 유기체, 예를 들어 반딧불이 및 쿼럼 감지(quorum-sensing) 박테리아는, 화학 발광 반응에서 활성화 장벽을 극복하기 위한 보조 인자로서 ATP를 필요로 한다. 레이저 입자의 펌프 공급원으로서 신진 대사 에너지를 사용하는 것이 옵션일 수 있다.
전기 펌핑을 위한 사용가능한 방법은, 전기 화학 발광, 반도체 내로의 전류 주입, 및 가스로의 전기 방전을 포함한다. 가스 레이저, 예를 들어 He-Ne 레이저 및 CO2 레이저는 가스를 통해 방전되는 전류를 사용한다. 전자는 고전압(300 내지 1,400V)에 의해 촉진되고, 플라즈마를 생성하는 가스 분자와 충돌한다. 여기된 분자 이온은 직접 광을 방출하거나 다른 이득 분자로 에너지를 전달한다.
전기 화학 발광의 일반적인 메커니즘은, 전극 표면에서의 전자 전달 반응 및 라디칼 중간체의 소멸을 포함한다: (1)
Figure pct00054
(전극에서의 산화); (2)
Figure pct00055
(전극에서의 환원); (3)
Figure pct00056
(여기 상태 형성); 및 (4)
Figure pct00057
. 상기 반응은 이온 소멸이 레이트 결정 단계일 때 확산 제어 한계 근처에서 발생한다. 9,10-디페닐안트라센(DPA)의 이온 소멸 단계의 속도 상수는 2 x 1010M-1s-1이다. 전기 화학 발광 펌핑된 DPA 레이저는 10V의 미러 전극을 사용하여 시연되었다.
전기적으로 펌핑된 반도체 레이저에서, p-n 접합은 전압(일반적으로 1.5 내지 2.5V)으로 순방향 바이어스된다. 순방향 바이어스될 때, n형 측에 주입된 전자는 p형 측으로 유동하고, 여기서, 전도대의 전자는 가전자대의 정공과 재결합된다. 이러한 복사적 재결합 프로세스는 다음의 단순화된 레이트 방정식으로 설명될 수 있다:
Figure pct00059
여기서, N 1은 이득 영역의 캐리어의 수이고, N 0는 광학적 투명도에서의 캐리어 분포이고, q는 공동 내의 광자 수이고, I는 주입 전류이고, h는 커플링 효율(양자 수율과 동일)이고, e는 전자 전하이고, g는 이득 계수(
Figure pct00060
β/τs)이다. 일반적인 반도체 물질는, V = 10-12cm3, N 0 = 106인 마이크론 크기 레이저의 경우 N 0/V = ~1018cm-3을 갖는다. η = 0.4, τc = 1ps, τs = 3ns를 사용하면, 일정 상태에서의 임계 전류는 I th
Figure pct00061
eN 0/(ητs) = ~130μA로 주어진다.
전기 펌핑이 반도체 레이저에서 일반적으로 사용되지만, 일반적인 디바이스 아키텍처는 독립형 레이저 입자에 대해 직접 적용 가능하지 않을 수 있다. 본 발명자들은 유선 및 무선 접근 방식을 고려할 수 있다. 필요한 바이어스 전압 및 전류를 공급하기 위해 일부 유형의 좁은 전선을 사용하는 것은 비교적 간단하다. 무선 전력 전달은 생체내 적용에 있어서 더욱 매력적이다. 무선 주파수 전송은 4.1mW의 전력을 전달하여 1m 거리에서 반도체 LED를 구동하여, 7mW/mm2의 광학 출력을 생성했다. 그럼에도 불구하고, 유선 및 무선 방법 둘 다는 독립형 마이크론 크기의 레이저 입자에는 적합하지 않을 수 있다. 레이저의 크기가 감소함에 따라, 전기 신호의 파장이 비례하여 감소하지 않으면 안테나의 효율은 감소한다. 이는 광학 주파수 내의 주파수를 필요로 하여, 무선 전송을 광학 펌핑과 동일하게 만든다.
이러한 문제를 감안할 때, 주변의 생물학적 문제로부터 전기 전류 및 전압을 수확(harvesting)할 수 있는 가능성을 고려할 수 있다. 하나의 관련 예는, 화학적 에너지를 전기로 전환시키는 바이오 연료 전지이다. 예를 들어, 피루브산을 사용하는 미토콘드리아 기반 애노드 및 포도당을 사용하는 생 클램(live clam) 기반 애노드에서 0.5 내지 0.8V의 개방 회로 포텐셜(potential) 세대가 달성되었다. 전기 뱀장어는 600V를 생성할 수 있다. 전기 뱀장어로부터 영감을 얻은 인공 배터리는 레이저 입자의 전기 펌핑이 가능할 수 있다.
다른 종류의 에너지는, 근육 및 몸의 움직임에 의해 생성되는 운동 에너지를 포함하며, 이는 압전성 물질을 가짐으로써 전기 에너지로, 그리고 음파 발광(sono-luminescence)으로 전환될 수 있다.
펌프 펄스가 흡수되면, 그 에너지의 일부는 열로 전환되어 이득 매질의 온도를 증가시킨다. < 10ns보다 짧은 펌프 펄스의 경우, 주변 수성 매질로의 열 소실은 펄스 기간 동안 무시할 수 있다. 이 경우, 펌프 에너지(Eabs)의 흡수 직후의 피크 온도가 ΔT 증가하며, 이는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00062
상기 식에서, ρ는 질량 밀도이고, V는 용적이고, cv는 비열 용량이다. 인자 (1-QY)는 열로 전환된 흡수된 에너지의 분율을 나타낸다.
3가지 예를 생각해보자. 경우 I: 크기가 20㎛(3.8ng)이고 비열(cp)이 1.8J g-1 K -1인 오일 소적의 경우, 상기 소적 상의 10nJ의 펌프 에너지(즉, 플루언스에서 3.1 mJ/cm2)는 4.5nJ의 열 에너지 및 ΔT = 0.7℃의 온도 증가를 일으킨다. 경우 II: 크기가 10㎛(0.52ng)이고 cp = 1.4J g-1 K-1인 폴리스티렌 비드의 경우, 상기 비드 상의 1nJ의 펌프 에너지(즉, 플루언스에서 1.3mJ/cm2)는 0.45nJ의 열 에너지 및 ΔT = 0.6℃의 온도 증가를 일으킨다. 경우 III: 직경이 1㎛이고 두께가 250nm(~1.1pg = 5.8kg/m3(ρ) * 0.2x10-12cm3)이고 cp = 0.33J g-1 K-1인 GaAs 디스크의 경우, 상기 디스크 상의 5pJ의 펌프 에너지(플루언스에서 0.6mJ/cm2)는 2.2pJ의 열 및 ΔT = 6.1℃을 생성한다.
과도한 온도 상승은 주변 매질에 유해한 영향을 줄 수 있다. 대표적인 효과는, 단백질 구조의 전개를 유도하고 단백질 활성의 손실을 유도하는 단백질 변성이다. 물에서 일반적인 단백질의 전개시 자유 에너지 변화는 10 내지 20kcal mol-1이다. 이는 분자당 0.4 내지 0.9eV의 활성화 에너지 Ea에 해당한다. 아레니우스 모델에 따르면, 분해 레이트는
Figure pct00063
에 비례한다.
펄스된 가열의 경우, 단백질 변성에 의해 나타나는 열 손상의 크기는, 온도뿐만 아니라 승온에 노출되는 기간에도 따른다. τe의 기간 동안 온도가 증가하면, 변성의 양 또는 열적 손상(damage)의 크기는 다음 식으로 주어진다:
Figure pct00064
가열 시간이 감소되면, 변성에 대해 상당히 높은 온도가 필요해진다. 예를 들어, 10ns의 짧은 기간 동안 열에 노출되면 90℃(ΔT = 53℃)의 피크 온도에서 단백질 변성이 일어나는 반면, 1초로 길게 노출되는 경우에는 60℃(ΔT = 23℃)의 온도에서 단백질 변성이 유도된다.
온도 상승으로 인한 내부 압력 변화는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00065
상기 식에서, αv는 열팽창 계수(물의 경우 2.1x10-4K-1, 연조직의 경우 ~4x10-4K-1, 및 GaAs의 경우 ~1.7x10-5K-1)이고, KB는 (등온) 벌크 계수(물의 경우 2.2x109Pa, 및 GaAs의 경우 8.6x1010Pa)이고, p 0 및 p 1은 펌프 펄스 전후의 압력이다. 1℃의 온도 증가는 비압축성 고체 및 액체에 대해 0.4 내지 1.5MPa를 발생시킨다.
압력 및 열팽창으로 일(work)을 생성할 수 있다. 이러한 에너지의 일부는 역학적 (음향) 파동을 발생시킨다. 음향 에너지는 다음과 같이 표현된다:
Figure pct00066
흡수된 열 에너지에 대한 음향 에너지의 비로 정의되는 광음향 생성의 효율(efficiency)은 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00067
여기서, Γ=α V K B /(ρc V)는 그뤼나이젠(Grueneisen) 파라미터이다. 이의 값은 물 및 세포의 경우 ~0.11, 및 연조직의 경우 0.7 내지 0.8이다. 상기 계수 ΓαV는, 물의 경우 2.3x10-5(GaAs의 경우 1.3x10-5)이다. 생의학 적용에서 T1 - T∞는 일반적으로 < 10℃로 제한되므로, 흡수 에너지의 소분획(< 10-4)만이 음향파로 방사된다.
전환 효율은 일정하지 않고, 온도 상승에 비례한다. 음향 에너지는 입력 에너지 그 자체에 선형적으로 비례하는 것이 아니라, 흡수된 에너지의 제곱에 비례한다는 것을 인식하는 것이 흥미롭다. 이러한 관계는 반직관적으로 보일 수 있지만, 초기 압력 증가가 식 (34)에서 주어진다는 사실로 인해, 실제로 후속적인 (단열) 용적 확장 동안 시간에 따라 감소한다(도 11). 광음향 생성은 열 엔진으로 볼 수 있다. 고체 또는 액체에서는 효율이 낮다. 기체에서는, αv = ~1/T1(여기서, T는 K로 주어진다)이고, 본 발명자들은 카르노 열 엔진에 대한 익숙한 표현을 얻었다:
Figure pct00068
. 이 경우, 보다 높은 광음향 전환 효율을 얻을 수 있다.
방사형 대칭 기하학적 구조의 열 전도는 다음에 의해 설명된다:
Figure pct00069
상기 식에서, k는 열전도율이고,
Figure pct00070
는 단위 용적당 열 생성 레이트이다. 열의 흑체 방사는 무시되었다.
경우 I: 단 펄스 펌핑: 초기에 T = T∞에서 매질과 열 평형인, 반경 R인 구체 입자를 고려해보자. 상기 입자는 t < 0에서 짧은 광학 펄스로 펌핑되고, t = 0에서 T1의 온도로 가열되었다. 단순화를 위해, 본 발명자들은 입자 및 매질이 열전도율을 포함하여 동일한 물질 특성을 갖고 있다고 가정한다. 주변 매질에서 분자의 운동에 기인하는 대류는 짧은 시간 규모 동안 무시된다. 경계 조건은 다음과 같이 다시 쓸 수 있다:
Figure pct00071
Figure pct00072
미분 방정식의 그린 함수는 다음과 같다:
Figure pct00073
상기 식에서, α = k/ρcp는 매질의 열확산률이다. 주어진 t에서 상기 그린 함수는 r = (4αt)1/2에서 1/e 반 폭을 갖는다.
따라서, 열이 직경이 2R인 구체를 통해 확산되는데 걸리는 시간은 다음이 된다:
Figure pct00074
상기 시간 τ는 구체 입자의 열 이완 시간이라고 부른다.
그린 함수 및 상기 경계 조건을 사용하면, 해는 다음과 같이 표시될 수 있다:
Figure pct00075
상기 식에서,
Figure pct00076
는 정규화된 온도 프로파일이고, erfc = 1 - erf는 상보적인 오류 함수를 나타낸다. 도 12의 좌측 패널에서, 본 발명자들은 ΔTnor를 여러 시간 지연으로 플로팅한다. 입자 내의 온도 구배는 입자의 유한 열전도율 및 열확산률에 기인한다. 도 12는 중앙 패널에서, r = 0.5R에서의 입자 온도가 시간에 따라 어떻게 감소하는지를 도시한다. t < 0.2τ일 때 4τ의 1/e 시간 및 t > τ일 때 T ∝ t-3/2의 지수 감쇠가 따른다. 유한 이완 시간은 반복적인 펌핑으로 인해 가열에 영향을 미친다. 도 12는 우측 패널에서 펄스들 사이의 균일한 주기 Δt를 갖는 100회의 펄스 이후 누적 온도 상승을 플로팅한다. Δt = 0.3τ일 때, 일정 상태 온도 증가는 단일 펄스에 의한 온도 상승의 약 2배이다. 이는 펌핑에 대한 최대 반복 레이트의 한계를 설정하며, 본 예에서는 500kHz로 설정된다.
펄스 폭이 열 이완 시간보다 짧으면, 입자에 축적된 모든 열이 펄스 흡수 동안 매질로 확산배출될 수 없다. 매질이 조직 또는 세포인 경우, 이의 열 특성은 물의 열 특성과 유사하다: 따라서, 본 발명자들은 k = 0.6Wm-1K-1 및 α = 0.14x10-6 m2s-1을 사용할 수 있다. 완화 시간 τ는 매질로의 열 소실에 의한 입자 냉각을 제어하는 기본 시간 상수이다. 상기 시간 상수는 열확산률의 역수에 비례한다. 수성 매질, 예를 들어 세포질 및 조직은 공기보다 우수한 열전도체이지만, 반도체보다 절연성이 우수하다. 따라서, 생물학적 매질의 열 소실은 일반적으로 온칩 반도체 레이저의 열 소실보다 느리다. τ는 R2 또는 입자의 표면적에 비례한다는 것에 주목해야 한다. 입자가 클수록(작을수록), 열 이완 시간은 더 길어지며(더 짧아지며); R = 10㎛의 경우, τ = 700㎲이고; R = 1㎛의 경우, τ = 7㎲이고; R = 100nm의 경우, τ = 70ns이다.
상기 분석은 균질한 물질에 대하여 유효하며, 높은 물 함량을 갖거나 액체 또는 중합체로 이루어진 입자, 예를 들어 오일(k = 0.15Wm-1K-1), 폴리스티렌(k = 0.14Wm-1K-1), 및 실리카(k = 1.4Wm-1K-1)에 대해서는 합리적인 근사치이다.
반도체 및 금속으로 이루어진 레이저 입자는 유전체의 열전도율보다 2 내지 3 오더 규모로 큰 열전도율을 갖는다: 예를 들어 GaAs(k = 52Wm-1K-1), 규소(k = 150Wm-1K-1), 은(k = 410Wm-1K-1), 및 다이아몬드(k = ~1000Wm-1K-1). 이 경우, 입자 내의 온도는 거의 일정하다. 이러한 조건은 종종 Biot 수인 Bi = hR/k1로 설명되며, 여기서, h는 열 전달 계수이고, k1은 입자의 열전도율이다. 특징 시간에 비견할 수 있는 짧은 시간, 예를 들어, t < 0.2τ 동안, h는 시간에 따라 변하지만, h
Figure pct00077
k2 /R로 근사될 수 있다(여기서. k2는 매질의 열전도율이고, 따라서 Bi
Figure pct00078
k2 /k1이다). Biot 수는 체내 전도에 대한 입자 표면에서의 대류의 비에 해당한다. 작은 Biot 수는 입자 내에서의 열 전도 및 작은 온도 구배에 대한 작은 내성을 나타낸다.
경우 II: 연속 펌핑: 이제부터 본 발명자들은 펌프 에너지가
Figure pct00079
의 레이트로 입자에 지속적으로 공급된다고 간주하여, 입자가 일정 상태에 도달했을 때의 입자의 온도를 계산한다. 매질의 열 방정식, 즉 ▽2T = 0 및
Figure pct00080
의 경계 조건으로부터 입자의 표면 온도 T1은 다음과 같다:
Figure pct00081
상기 식에서, 용적당 에너지 레이트
Figure pct00082
는
Figure pct00083
로 주어진다. 온도 상승은 매질의 이완 시간에 비례한다.
광학 복사에 대한 요구 사항은, 유해 광열 및 광화학 효과의 손상 임계값의 1/10로 근사하여 정의되는 최대 허용 노출(MPE) 측면에서 정량화된다. ANSI Z136.1 표준은 망막 및 피부의 생물학적 위험에 따라 레이저를 분류한다. 표준 가이드라인에 따르면, 피부의 레이저 노출 한도는 τp = 1 내지 100ns에 대해 0.02*CAJ/cm2, τp = 100ns 내지 10s에 대해 1.1*CA τp 0 .25J/cm2로 주어지며, 여기서, CA는 파장 의존 실험 계수이다: 400 내지 700nm의 스펙트럼 범위의 경우 CA = 1이고, 700 내지 1,050nm에 대한 CA = 100.002(1 내지 700)이고, 1,050 내지 1,400nm에 대한 CA = 5이다. τp > 10s의 장시간 노출의 경우, MPE 레벨은 2*CA W/cm2이며, 이는 장시간 노출 동안 레이저 유도 가열과 전도성 냉각 사이의 열 평형에 도달하기 때문에 플루언스가 아닌 광 강도로 주어진다. 눈에 750 내지 1,050nm의 근적외선 시준광을 장시간 광학적으로 노출되는 경우, 망막 안전성에 대한 MPE 레벨은 CA mW/cm2이며, 여기서, 강도는 각막에서 측정된다.
생물학적 조직 또는 생체 세포 내로의 레이저 공급원의 통합은, 마이크로미터 치수(HeLa와 같이 직경이 약 20㎛인 일반적인 포유류 세포), 펌핑 에너지 공급원, 및 우수한 생체 적합성을 갖는 독립형 컴팩트 디바이스를 필요로 한다. 현재, 일반적으로 최장 치수가 8㎛보다 큰 레이징 구조체를 세포에 성공적으로 통합한 몇 가지 예만이 있다.
레이저 공급원의 소형화는, 빠른 스위칭 시간 및/또는 저전력 소비를 갖는 통합 된 광전자 디바이스를 실현하고자 하는 목적으로 지난 수십 년 동안 적극적으로 추진되어 왔다. 소형 컴팩트 레이저를 제작하기 위한 가장 광범위한 선택 중 하나는, 외부 환경에 대해 충분히 높은 굴절률을 갖는 소형 구조체에서 발생하는 위스퍼링 갤러리 모드(WGM)를 사용하는 것이다. WGM 공명기는 다수의 상이한 형상 및 물질로 구현되었으며, 이득 매질은 공동 자체를 구성하는 데 사용될 수 있거나, 이득 매질의 방출이 불활성 물질로 제조된 공명기에서 WGM에 커플링될 수 있다. 염료로 도핑된 폴리스티렌 마이크로구체는 광학 펌핑시 레이저를 생성하는 것으로 확인되었다. 현재까지 보고된 가장 작은 마이크로구체 레이저는 약 8㎛이며, 크기의 감소에 따른 Q 인자의 감소에 의해 제한된다. 약 3.5㎛로 작은 크기의 염료 도핑된 마이크로구체로부터의 자발적 방출이 보고되었으나, 제한된 공동의 Q 인자, 이득 및 펌프 에너지로 인해 레이저 임계치 이하의 작동만이 입증되었다.
마이크로디스크는 이득 매질로서 반도체로 제조된 컴팩트 레이저의 일반적인 예인데, 이러한 구조체는 에피택셜 성장된 웨이퍼로부터 리소그래피 프로세스를 통해 얻어질 수 있기 때문이다. 이들은 수 마이크론에서 수십 마이크론의 측면 치수를 특징으로 하지만, 이들의 두께는 약 100nm로 줄어들 수 있다(λ/4n 오더의 한도에 해당). 가장 일반적으로 사용되는 III-V 화합물에 대해 약 3 내지 3.5인 이들의 높은 굴절률을 감안할 때, 가장 작은 공동은 무기 반도체로 입증되었다. 예를 들어, 직경이 2 내지 4㎛, 두께가 100 내지 200nm, Q 인자가 12,000 내지 17,000인 구조체가 약 900 내지 1,000nm의 레이징에 대해 실현되었다. 디바이스 형상 및 표면 거칠기의 적절한 엔지니어링으로 훨씬 더 높은 품질 인자(108 초과)에 실제로 도달할 수 있지만, 이러한 구조체는 일반적으로 상당히 큰 직경(수십 마이크론)을 갖는다. 한편으로는, (103 오더의) 낮은 Q 인자에도 불구하고,
Figure pct00084
600nm의 작은 디바이스가 입증되었다. 그러나, 이들 디스크 레이저는, 디스크 크기보다 훨씬 더 큰 크기를 갖는 기재 상에 제작된다는 점에 주목해야 한다. 확실히, 이러한 디스크를 코팅하거나 디스크 레이저를 세포 내에 삽입하려는 시도는 보고되지 않았다.
가시광선 범위에서 높은 핵내 주입 효율 및 높은 명도를 갖는 몇 쌍의 생체 발광 효소 및 기질이 공지되어 있다. 생체 발광의 스펙트럼 대역폭은 형광의 스펙트럼 대역폭과 유사한 50 내지 100nm이다. 생체 발광의 수명은 나노초 오더의 일반적인 유기 형광체와 유사하다. 생물학적 환경에서의 일반적인 생체 발광 반응 속도는 효소 분자당 0.1 내지 10개 광자/s이다. 이 레이트는 자극 방출을 생성하기에는 충분하지 않지만, 생체 발광은 광학 공동과 커플링될 수 있다.
예를 들어, 바람직한 양태로서, 본 발명자들은, 공동 모드에 의해 조절된 방출 스펙트럼으로 생체 발광을 생성할 수 있는, 루시페라제로 코팅된 비도핑된 폴리스티렌 비드를 제조했다. 비오틴화 가우시아 루시페라제(Gaussia luciferase)(GLuc, 19.9kDa)를 폴리스티렌 마이크로비드의 스트렙타비딘-코팅된 표면에 코팅했다. 상기 비드의 표면의 Gluc은, 순간적으로 상기 비드의 WGM로 커플링하는 생체 발광 광을 생성하기 위해 코엘렌테라진(CTZ, 423.46Da)을 산화시킨다(도 15, 좌측 패널). CTZ(25μM)가 분산된 GLuc-코팅된 비드를 포함하는 매질에 첨가됐을 때, 밝은 생체 발광이 상기 비드의 표면으로부터 생성됐다(도 15, 중앙 패널). CTZ의 첨가 후 23 내지 28초에서 획득한 대표 출력 스펙트럼은 잘 구별되는 WGM 구조체를 보여준다(도 15의 우측 패널). 출력 방출에서의 모드 구조체는 생체 발광의 표준 광연 방출과는 구분된다. 광학적으로 펌핑된 형광 입자와 비교하여, 생체 발광 입자는, 예를 들어, 정맥내 주사를 통해, 광학 펌프의 침투 깊이에 의해 부과되는 제한 없이 기질 분자를 투입함으로써, 유기체의 깊은(at depth) 조직에서 그리고 거의 모든 곳에서 여기될 수 있다.
독립형 레이저 입자는, 생물학적 시스템, 예를 들어 연조직 내로 주입되면, 광학 이미징 기기, 예를 들어 형광 현미경으로 검출 및 국소화될 수 있다. 그러나, 레이저 입자로부터 자극된 방출을 검출하기 위해 신규한 현미경 구성이 고안될 수 있다. 프로브의 균일한 분포를 포함하는 매질에 초점을 맞추는 여기 빔을 고려하라(도 16, 좌측 상단). 1광자 여기를 사용하여, z에서의 단면적에 대해 적분된 신호의 총량은 일정하며(도 16, 우측 상단), 따라서 밝은 영역 이미징은 두꺼운 샘플에 대한 광학 단면을 제공하지 않는다. 2광자 현미경에서, 신호 강도는 여기 빔의 강도의 제곱에 비례하며, 이는 광학 섹션화(optical sectioning)를 제공한다(도 16, 좌측 하단). 레이저 입자의 경우, 레이징은 강도는 레이징 임계값을 초과하는 초점에서만 달성될 수 있으며(도 16, 우측 하단), 이는 회절 한계 이하의 공간 해상도를 갖는 광학 섹션화를 제공한다. 이 기술은 레이저 입자 자극 방출(LASE) 현미경으로 나타낼 수 있다.
역치 이상에서, PSF의 반치 전폭(FWHM)인 ΔLASE는 축 (z) 및 측면(x, y) 방향에 대한 식 (6)으로부터 유도될 수 있다. 해상도 강화 인자에 대한 대략적인 형태는 다음과 같이 나타내어진다:
Figure pct00085
상기 식에서, Δ0는 가우시안 빔의 회절 한계이다:
Figure pct00086
(여기서, zR 및 NA는 여기 빔의 레일리 길이 및 개구수이다. 해상도는 항상 회절 한계보다 작고, 임계값 Pth 근처에서 가장 작으며, 이때
Figure pct00087
이다.
LASE 현미경은 (2광자 펌핑이 가능하더라도) 단일 광자 흡수를 사용하고, 초점 용적에서만 자극 방출을 생성하며, 촘촘한(tight) 핀홀을 필요로 하지 않는다. 이러한 의미에서, LASE 현미경은 회절 한계 이하의 해상도를 갖는 신호의 효율적인 생성 및 수집을 달성하기 위한 공초점의 2광자 현미경의 유리한 피쳐를 갖는다.
또 다른 유리한 피쳐는 초점 이탈(out-of-focus)이 낮은 배경이다. 레이저 출력의 좁은 스펙트럼 피쳐는, 레이저 입자 주변에 존재할 수 있는 다른 형광 분자로부터의 자동 형광과 쉽게 구별된다. 유도 방출의 감쇠 시간은, 형광 감쇠 시간보다 훨씬 더 짧은 공동 수명에 의해 결정된다. 따라서, 수명 측정은 자발적 배경과 레이저 모드를 구별할 수 있다. LASE 현미경에서의 낮은 배경은, 산란 조직에서 500㎛보다 크거나 심지어 1 내지 2mm인 향상된 이미징 깊이를 제공할 수 있다.
본 발명자들은 역상의 이미징 설정을 구성했다(도 15). 설정의 구성은, 라인-공초점 하이퍼스펙트럼 형광 현미경과 유사하지만 일반적인 하이퍼스펙트럼 현미경과는 다르며, 상기 장치는, 가변 입구 슬릿, 회절 격자, 및 1,024 내지 4,096픽셀의 전하 결합 소자(CCD) 카메라를 포함하는 고 해상도(0.05 내지 2nm) 분광계를 사용한다.
레이저 입자에서와 같이, 본 발명자들은 300 내지 500nm의 일반적인 폭 및 3 내지 7㎛의 길이로 성장된 요오드화납 페로브스카이트(CH3NH3PbI3) 나노와이어를 사용했다. 샘플을 슬라이드 유리로 옮기고, 커버 유리 광학 에폭시로 공기로부터 씰링하여 수분 및 산소에 의한 분해를 방지했다.
나노와이어의 긴 형상을 감안할 때, 펌프 빔은 일치하는 연신된 형상을 갖도록 성형되고, 나노와이어의 짧은 축을 가로지르는 스캔 프로파일을 측정했다. 펌프 광원은, 반복 레이트가 5kHz이고, 펄스 지속 시간이 페로브스카이트의 형광 수명(τ
Figure pct00088
2ns)보다 약간 긴 ~2.5ns인, 532nm에서 방출되는 마이크로칩 레이저였다. 대물 렌즈는 0.8-NA, 40X 수침 렌즈(Nikon)였다. 원통형 렌즈(CL; f = 500mm)를 사용하여 FWHM이 x축을 따라 2.4㎛이고 y축에서 9.5㎛인 초점에서 타원형 펌프 빔 프로파일을 만들었다. 타원형 펌프 프로파일을 사용하여 나노와이어의 전체 길이를 비추고, 따라서 효율적인 펌핑을 달성했다. 샘플 스테이지의 나노와이어는 펌프 빔의 주(y)축에 평행하게 배향되었다. 펌프 빔의 편광 축은, 임계 강도가 가장 낮은 나노와이어의 긴(y)축에 대해 직각으로 정렬되었다. 펌프 빔은, 이미징 평면에서 35nm 단계 해상도로 생성되는 시준 렌즈(L1)를 전환하여 x축을 따라 스캔되었다. 출력 방출은, 카메라 및 편광 독립적인 회절 격자 기반 분광계에 대해 배향되었다. 분광계의 입구 슬릿은 나노와이어의 장축(y)을 따라 배향되어, 전체 나노와이어로부터의 방출이 분광계에 의해 수집되게 했다. 스펙트럼 해상도는 ~1nm이었다.
도 15의 삽입 도면은 각각, CCD에 이미징된 일반적인 펌프 빔 프로파일, 및 임계값 이하 및 이상의 펌프 에너지 레벨에서의 CCD 상의 롱 패스 필터(LF: long-pass filter)를 통해 수집된 5㎛ 길이의 나노와이어의 형광 및 레이저 방출 이미지를 도시한다. 레이저 방출 프로파일은, 길이 방향 레이저 발진을 나타내는 양 말단에서의 밝은 스팟, 및 코히어런트(coherent) 레이저 방출의 특징적인 간섭 패턴을 나타낸다. 검출기 평면에서의 레이저 출력의 편광 상태는 단(x)축에 거의 평행했다.
LASE 이미징의 개념 증명을 지지하기 위해 실험을 실시했다. 도 16a는, 임계값 이상에서의 나노와이어로부터의 일반적인 출력 스펙트럼을 도시한다. 스펙트럼은, 낮은 펌프 출력에서 수득되는 형광 스펙트럼과 동일한 프로파일을 갖는 광대역 형광 배경(broadband fluorescence background)(도 16a의 회색 곡선)과 협대역 자극 방출 컴포넌트(마젠타색 곡선)으로 분해되었다. 레이저 출력은 자극 방출 스펙트럼을 적분하여 측정했다. 도 16b는 펌프 에너지의 함수로서 측정된 출력을 도시한다. 이 데이터는 0.58 mJ/cm2의 펌프 펄스 에너지에서의 잘 한정된 레이저 임계값을 보여준다. 식 (6)에 기초하는 최상의 곡선 피트는 β = 1.3×10-3으로 얻어졌다.
도 16c는, 2개의 상이한 펌프 레벨, 각각 p (= P/Pth) = 1 및 1.8에서의 나노와이어의 x-스캔 프로파일을 도시한다. 측정된 가로축(x축) 해상도 ΔLASE는 p = 1에서 520nm이며, p = 1(FWHM, ~2.5㎛)에서의 형광 배경 방출의 스캔 프로파일로부터 측정되는 형광 검출의 해상도보다 약 5배 더 낮다. LASE 현미경의 FWHM은 p
Figure pct00089
1에서 최소값을 가지며, 도 16d에 도시된 바와 같이 펌프 펄스 에너지의 증가에 따라 증가한다. 실제 펌프 프로파일 및 가정된 나노와이어 크기(5㎛ × 0.3㎛)를 사용하는 수치 모의에 기초하는 피트 곡선은 실험 데이터와의 양호한 일치를 보여준다. 펌프 증가에 따른 형광 FWHM의 약간의 증가는, 아마도 펌프 유도 형광 포화 또는 이득 소모(즉, N0가 q와 함께 감소됨)에 기인한다.
유사한 길이 및 β값을 갖는 다수의 상이한 나노와이어로부터 일관되게 ~5배의 유사한 해상도 향상이 측정되었다. 분광계 앞쪽에 있는 공초점 슬릿의 개구 폭은, 약간 상이한 β값을 야기하는 레이저 출력 측정에 대한 이의 영향을 통해, 적당하게만 해상도에 영향을 미쳤다.
도 17a에 도시된 바와 같이, LASE 현미경은 도 15의 셋업으로부터, 빔 스캐너를 사용함으로써 빔 스캐닝 이미징 셋업으로 확장될 수 있다. 다른 것들 중 갈바노미터 미러 스캐너 및 음향 광학 빔 편향기가 널리 공지되어 있다.
LASE 현미경은 다른 이미징 방식, 예를 들어 공초점 형광 이미징, 다중 광자 이미징, 반사 이미징, 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT)과 추가로 결합될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 펨토세컨드 레이저를 사용하여, 레이저 입자 주위의 구조체, 예를 들어 세포 및 조직으로부터 2개 광자 또는 3개 광자 여기된 형광 또는 고조파 생성 신호를 생성 및 수집할 수 있다. 예시적인 양태가 도 17b에 예시된다. 당업계에 공지된 적절한 2색성 필터 및 빔 스플리터를 사용하여, 펨토세컨드 여기 빔 및 펌프 빔, 및 레이저 입자로부터의 형광 및 고조파 신호 및 자극 방출을 관리할 수 있다.
광학 검출 대신, 레이저 입자는 광음향 현미경을 사용하여 검출되고 이미징될 수 있다. 레이저 입자는 흡수된 펌프 에너지의 작은 부분을 음향파 에너지로서 배출할 수 있다. 이러한 메커니즘은 입자가 광음향 검출에서와 같이 음향 변환기에 의해 검출되게 할 수 있다. 음향파의 진폭은 펌프 레이트 P(t)에 비례한다. Ng
Figure pct00090
Ntot인 불포화 체계에서, 광음향 신호는 펌프 강도에 단순히 비례한다.
그러나, 여기 상태 N1에 있는 분자의 수는 Ntot에 필적할 것이고, 바닥 상태의 소모는 펌프 흡수를 제한하여, 결과적으로 동일한 강도에 대한 불포화 경우와 비교하여 광음향 신호를 감쇠시킨다. 자극 방출이 여기 상태 분자를 바닥 상태로 떨어뜨리기 때문에, 임계값 이상에서 레이저 발진은 여기된 분자의 수를 일정한 레벨로 고정시킨다는 점에 주목해야 한다. 이득 분자가 레이저에서 보다 신속하게 재순환되기 때문에, 이 프로세스는 포화 체계의 공동이 없는 동일한 이득 매질과 비교하여 레이저 입자에서 더 높은 광음향 신호를 발생시킬 수 있다.
가이드 스타(guide star)는 대기 난기류에 의한 파면 왜곡을 추정하는 천문학적 기술이다. 난기류가 존재할 때 공기의 밀도가 변하기 때문에, 굴절률의 불균질성(heterogeneity)이 광의 파면을 변형시켜, 지상 관측소의 망원경이 심각하게 저하된 별 이미지를 검출한다. 이 문제를 해결하기 위해, 레이저 빔을 하늘에 직접 비추고, 유입 광(incoming light)과 회귀 광(returning light)의 차이를 비교하여 파면 왜곡을 측정한다. 회귀 광은 10 내지 15km 고도의 공기 분자 또는 95km 고도의 원자 나트륨의 레이저 유도 형광으로부터의 레이저 광의 레일리 산란에 의해 발생될 수 있다. 가이드 스타 보조된 파면 측정 후, 흐려진 스타 이미지를 적응형 광학 디바이스, 예를 들어 변형가능한 미러 어레이를 통해 복구하여 파면 왜곡을 보상할 수 있다.
천문학에서 동일한 원리를 사용하여, 가이드 스타는 생물학적 이미징에서도 중요한 역할을 한다. 생물학적 조직은 이의 불균질한 광학 특성으로 인해 파면의 산란 및 왜곡을 일으키며, 특히 깊이 배치된 시료의 이미징을 제한한다. 전송 매트릭스가 주어진 임의의 입력 필드에서 산란 매질 이후의 출력 필드의 추정을 제공하기 때문에, 전송 매트릭스의 정보에 기초하는 입력 광의 파면을 성형함으로써, 심부 조직의 시료의 초점 맞춰진 스팟 또는 분해된 이미지를 교정할 수 있다. 이 프로세스에서, 가이드 스타는 주어진 조직의 전달 매트릭스를 측정하는데 유용하다. 가이드 스타의 원리는 피드백 및 접합 프로세스를 포함한다. 첫 번째로, 피드백 방법은 심부 조직에 배치된 형광 입자를 사용하고, 형광 강도를 모니터링하고, 최대 강도를 찾는다. 두 번째로, 접합 방법은, 표적으로부터 방출된 광을 수집하고, 조직에 조사될 때 초점으로 추적할 수 있는 위상 결합된 빔을 합성한다. 이 프로세스는 조직에서 광의 산란 및 전파가 시간 가역적이기 때문에 가능하다.
정규 형광성 표지보다 레이저 입자가, 가이드 스타로서 더 나은 성능을 보일 수 있는 잠재적인 후보가 될 수 있다. 예를 들어, 레이저 입자의 레이징 임계값은 피드백 가이드 스타의 민감한 지표가 될 수 있다. 레이저 입자는, 이들이 공간적으로 그리고 시간적으로 코히어런트 광을 생성할 수 있기 때문에, 접합 가이드 스타에 대한 이상적인 공급원이 될 수 있다. 레이저 입자로부터 방출된 광에 일시적인 위상을 제공하는 주입 잠금과 결합하여, 레이저 입자는 다양한 적용, 예를 들어 코히어런스 게이팅(coherence gating)을 사용하는 접합 기반 교정 내로 실시될 수 있다.
출력의 코히어런시는 주입 잠금을 사용하여 광학 위상 레벨로 확장될 수 있다(도 18a). 주입 잠금은, 외부로부터 협대역 광이 레이저로 진입하면, 상기 광이 공동에서 증폭되어 출력을 잠금하여, 레이저 출력 위상이 주입된 빔에 위상-잠금되게 할 수 있는 것을 나타낸다. 주입 잠금은 주입 빔에 대한 위상 코히어런시를 확립하고, 코히어런트 간섭법(coherent interferometry)을 사용하여 레이저 입자가 검출될 수 있게 해야 한다(도 18b). 이 원리를 사용하여, 본 발명자들은, 펌프가 온 및 오프로 조정될 때(가이드 스타의 깜박임), 주입 빔의 간섭을 통해 조직 외부의 레이저 출력의 파면을 측정할 수 있다. 동일한 파장이지만 접합 파면(conjugate wavefront)을 갖는 접합 빔이 조직에 조사되면, 레이저 입자가 위치된 곳으로 이의 경로를 추적할 수 있다(도 18c). 이 기술은 정밀한 심부 조직 광학 변조에 유용할 수 있다. 또한, 주입 잠금된 레이저 입자는 원칙적으로, 잠재적으로 조영제 역할을 하여 광학 간섭 단층 촬영으로 검출될 수 있다.
레이저 입자는 살아있는 세포의 세포질에 포함될 수 있다. 세포내 이입, 포식 작용, 및 거대 음세포 작용을 포함하는 다양한 생물학적 및 세포 흡수 프로세스가 존재한다. 세포는, 입자의 세포 흡수가 발생하도록 충분한 시간 동안 레이저 입자를 함유하는 배지에서 항온처리될 수 있다.
입자를 효율적으로 섭취하지 않는 세포의 경우, 물리적인 삽입 방법, 예를 들어 로봇 피펫에 기초하는 주입을 사용할 수 있다.
마이크로 유체 소적 디바이스를 사용하여 보다 제어된 섭취 또는 레이저 부하 프로세스를 달성할 수 있다. 시린지 펌프를 사용하여 오일에서 마이크로 및 나노 규모 물체를 캡슐화하는 수성 소적을 생성하는 몇 가지 기술이 당업계에 널리 공지되어 있다. 도 19a는, 예시적인 마이크로 유체 채널 디바이스의 개략도를 도시하며, 여기서, 각각 레이저 입자 또는 세포를 포함하는 2개의 소적은 단일 소적으로 합쳐지도록 구성되고, 소적 내의 세포는 후속적으로 레이저 입자를 흡수한다(internalize)(도 19a).
도 19b는, 마이크로 유체 채널 디바이스, 펌프 광원, 및 세포 내의 레이저 입자의 출력 스펙트럼을 측정할 수 있는 스펙트럼 분해 검출 디바이스를 사용하는 장치의 개략도이다. 상기 장치는, 고속으로의 세포내 레이저의 스펙트럼 서명 또는 바코드의 고속 처리 판독에 매우 적합하다.
부동 또는 활성 분류 장치, 예를 들어 기둥 및 고전압 전극을 사용하여, 상기 장치는, 레이저 입자로부터의 출력 방출 스펙트럼에 기초하는 광학 정보를 사용하여 레이저 입자, 또는 레이저 입자를 운반하거나 포함하는 세포를 분류하도록 작동될 수 있다.
이들의 좁은 방출 스펙트럼으로 인해, 세포에 매립된 레이저 및 광 공동은 단일 세포의 광학 태깅에서의 적용에 대해 매우 큰 잠재력(potential)을 갖는다. 세포 태깅은, 많은 양의 세포 하위모집단들을 구별할 수 있게 하거나, 단일 세포 레벨에서 그리고 고도로 다중화된 검정을 위해 세포를 연구할 수 있게 한다. 현재의 태깅 방법은 특정 패턴으로 배열된 방출체를 사용하는 그래픽 암호화, 물리적인 암호화, 수명 암호화, 분광 암호화, 및 희토류 원소를 사용하는 질량 기반 태깅을 포함한다. 이러한 방법의 대부분은 약 10 내지 100개의 바코드로 제한된다. 그래픽 바코드는 보다 더 많은 수의 조합을 가능하게 하지만, 이들은 이미징을 필요로 하며, 이는 느리다. 브레인보우(Brainbow) 및 멀티보우(Multibow)를 포함하는 분광법은, 염료, 양자 도트, 또는 형광 단백질의 광범위한 방출에 의해 제한된다. 고유한 태깅의 수는 강도로 다중화하여 증가시킬 수 있으며, 최대 500개의 조합으로의 암호화를 상업적으로 입수할 수 있다. 그러나, 강도 암호화는 보정된 장비를 필요로 하며, 생체내 연구에서 특히 문제가 될 수 있는 광표백(photobleaching), 염료 분해, 광 산란, 및 흡수로 인해 변경될 수 있다.
통상적인 형광 현미경 및 형광 활성 세포 분류기(FACS)는 미세한 스펙트럼 선을 분석할 수 없다. 높은 스펙트럼 측정 해상도의 경우, 펌프 공급원 및 고해상도 분광기를 사용하여 유세포 분석 장치를 구성할 수 있다(도 20).
마이크론 이하 크기의 레이저 입자는, 결합 분자, 예를 들어 항체, 펩타이드 및 클릭 분자(click molecule)로 코팅되어 있다. 이러한 레이저 프로브는, 상기 프로브가 세포 표면 상의 또는 세포질 내의 특정 표적 바이오마커와 결합하도록 세포와 혼합된다(도 20). 각각의 인식 분자에 대해, 동일한 출력 파장을 갖는 레이저 입자가 할당되고, 상이한 인식 분자가 상이한 파장을 갖는 레이저 입자에 부착된다. 이후, 각 유형의 레이저 입자의 양은 이들의 해당 파장에서의 강도를 측정하여 쉽게 분석할 수 있다. 상기 양은 이의 표적 분자의 존재비(abundance)에 비례한다.
소규모 레이저 입자를 구현하기 위해, 특정 실시에서, 광자 반도체 위스퍼 링-갤러리-모드 디스크 레이저를 사용할 수 있다. 반도체의 굴절률(n = 3 내지 3.5)이 사이토졸(n = 1.33 내지 1.4)의 굴절률보다 훨씬 높기 때문에, 반도체 디스크 레이저는, 진공 광학 파장보다 더 작은 직경, 및 파장의 일부의 두께를 가질 수 있다. 양자 도트과 마찬가지로, 반도체 입자는 광표백 및 생분해되지 않으므로 장기 추적에 적합하다.
표준 전자 빔 리소그래피에 의해 단일 배취로부터 수 백만개의 동일한 또는 점진적인 입자들(incremental particles)을 제작할 수 있다(도 21a). 반응성 이온 에칭 및 부분 화학적 습식 에칭 후, 기둥에 마이크로디스크가 제조된다. 이러한 구조는 당업계에 널리 공지되어 있다. 980nm, 5ns 펄스로 광학 펌핑시, 마이크로디스크-온-기둥(microdisk-on-pillar) 레이저는 좁은 레이저 방출을 발생한다(도 21a).
예시적인 실시에서, 본 발명자들은 직경이 0.5 내지 3㎛ 범위인 반도체 마이크로 디스크를 제작했다. 이러한 마이크로 디스크는 InP 기재 상에 구축된 InAlGaAs 양자 우물 구조를 가질 수 있다. 디스크 형상은 우선, 전자 빔 리소그래피, 반응성 이온 에칭을 사용하여 리소그래피로 카빙된(carved) 후, InP 희생 층을 제거하는 산성 습식 에칭에 의해 상기 기재로부터 분리된다(도 21b). 최종 생성물은 독립형 디스크 레이저 또는 "레이저 입자"이다(도 21b). 레이저 입자는 적절한 여과 후에 수용액으로 옮길 수 있다.
충분한 펄스 에너지(1 내지 100pJ)로 1,064nm에서 광학적으로 펌핑시, 수확되는 거의 모든 레이저 입자가 레이저 임계값에 도달하고, 협대역 자극 방출을 생성했다(도 21c). 대부분의 레이저 입자는 l = 10 내지 11의 WGM 모드에 상응하는 단일 모드를 방출한다. 일부 입자는, 디스크 공동의 자유 스펙트럼 범위에 해당하는, 50 내지 60nm로 분리되는 2개의 개별 레이저 라인을 특징으로 하는 2개의 모드를 생성했다.
마이크로디스크 입자로부터의 레이저 출력은, 높은 신호 대 잡음비를 갖는 비교적 두꺼운 생물학적 조직, 예를 들어 쥐의 귀 피부를 통과하여 측정할 수 있다(그림 21C).
식 (22)에 설명된 바와 같이, 레이저 디스크의 출력 파장은 직경을 변화시켜 조정될 수 있다(도 22a). 전자 빔 리소그래피를 사용하여, 1nm까지의 스텝 다운(step down)에서 높은 정밀도로 디스크의 직경을 변화시킬 수 있다(도 22b).
직경 외에도, 몇 가지 다른 변수를 사용하여 출력 파장을 조정할 수 있다. 여기에는 활성 및 클래드(쉘) 영역에 대한 상이한 반도체 물질, 반도체 물질의 변형, 양자 우물의 두께, 다중 양자 우물의 경우 양자 우물들 사이의 거리, 및 부동화 층의 두께가 포함된다. 격자 구조는, 모드 선택을 위해 그리고 단일 모드 발진을 달성하기 위해 레이저 입자의 표면 상에 형성될 수 있다.
UV, 청색 및 녹색 영역의 단파장을 위한 물질 시스템은, II-VI 화합물 및 III-V 질화물 시스템, 예를 들어 ZnS, ZnSe, GaN 및 AlN이다. AlGaInP 시스템, 예를 들어 (AlxGa1 -x)0.51In0 .49P 분리 구속 장벽 층에 샌드위치된(sandwiched) GayIn1 - yP 양자 우물은 600 내지 700nm의 가시광선 파장을 생성할 수 있다. GaAs 격자 상에 성장된 AlxGa1 - xAs는 이중 헤테로 구조체에 대해 700 내지 900nm 범위의 레이징 파장을 얻는데에 적합하다. 900 내지 1,100nm의 파장 영역은 AlGaAs 또는 GaAs 층들 사이에 샌드위치된 변형된 InxGa1 - xAs에 의해 전환될 수 있다. 1.1 내지 1.65㎛의 범위는 InP 또는 AlxGayIn1 -x- yAs-InP 시스템 상에서 성장된 In1 - xGaxAsyP1 -y로 덮여있다. 다른 시스템은 InGaAsN/GaAs 양자 우물 구조체를 포함한다.
레이저 입자 및 이들의 세포내 작동의 또 다른 실험적 입증을 위해, 본 발명자들은 다양한 반도체 에피택셜 웨이퍼로부터 마이크로디스크 레이저를 제작했다. 웨이퍼는 200nm(또는 350nm)의 두께를 갖는 InAlGaAs 이득 층에 대해 상이한 합금 조성을 갖는 InP/InAlGaAs/InP를 포함한다. 웨이퍼의 공칭 이득 중심 파장은 각각 1,200, 1,275, 1,350 및 1,425nm였다. 본 발명자들은 GaAs/AlGaAs/GaAs(840nm) 및 InP/InAlAs/InP (840nm)로부터의 마이크로디스크 레이저, 및 양자 우물 웨이퍼도 제작했다.
전자 빔 리소그래피는 10nm 규모에서 높은 해상도를 갖지만, 상대적으로 긴 스캔 시간을 필요로 한다. 대용적의 신속한 제조를 위해, 본 발명자들은 맞춤형(custom-made) 마스크 및 포토레지스트를 사용하는 광학 리소그래피를 사용했다. UV 조사 및 활성 이온 에칭 후, 디스크 컬럼의 크기는 1.5 내지 3㎛의 범위였다. 패터닝된 기재를, InP 희생 층을 제거하기 위한 습식 에칭용 HCl 용액으로 옮겼다. 여과 및 세척 후, 본 발명자들은 콜로이드 용액으로 독립형 레이저 입자를 수득했다. 습식 에칭/전사 프로세스의 수율은, 입자의 손실을 신중하게 최소화함으로써 50%로 우수할 수 있었다. 기재 상의 1,000만개의 마이크로디스크 중에서 500만개 이상의 독립형 레이저 입자를 수집했다.
도 23은, InAlGaAs의 합금 조성이 약간 상이한 3개의 웨이퍼로 이루어진 128개의 레이저 입자의 출력 파장의 분포를 도시한다. 입자를, 편평한 유리 기재와 접촉하는 평평한 표면들 중 하나와 함께 배치하고, 다른 표면은 공기에 노출시킨다. 광학 펌핑은 Nd-YAG 레이저(1,064nm)로부터의 나노초 펄스로 실시했으며, 1 내지 2㎛의 일반적인 스팟 크기에 초점을 맞추었다. 레이저 입자의 공칭 크기는 2.3㎛이지만, 실제 크기는, 유한 해상도 및 무작위 또는 체계적 변화 이온, 광학 리소그래피 단계 및 기타 가능한 인자로 인해 동일하지 않다. 결과적으로, 측정 된 히스토그램은 각 웨이퍼에 대한 전체 이득 스펙트럼에 걸친 광범위한 파장을 보여준다. 적절한 조성을 갖는 웨이퍼 및 직경 범위의 최적화를 사용하여, 1,150 내지 1,500nm의 넓은 스펙트럼 범위가 1 내지 2nm 이하의 간격으로 완전히 충전될 수 있다.
수성 및 생물학적 환경에 노출된 반도체 물질는, 치명적(toxic)일 수 있는 전기화학적 영향을 생성할 수 있다. 표면에서 결합 구조가 깨졌다. 깨진 결합은 표면을 매우 반응성으로 만들어, 표면 재구성(이들 중에서의 표면 원자 결합) 및 O, C 및 기타 원자 및 분자의 흡착에 의한 표면 오염을 일으킨다. 이는 표면에서 반도체의 에너지 레벨을 변경할 수 있으며, 반도체의 에너지 레벨의 변경은 표면을 통해 주변 환경으로 캐리어 전류의 누수를 야기할 수 있고, 바람직하지 않은 전기화학적 프로세스, 예를 들어 반도체 부식 및 물 분할(water splitting), 및 레이저 입자의 양자 효율의 붕괴를 생성할 수 있다.
이러한 문제에 대한 실질적인 해결책은, 반도체 표면을 부동화 층으로 코팅하여, 반도체 표면에 벌크 결합이 우선하게 하는 것이다. 널리 사용되는 캡핑 물질는 SiO2(도 24a) 또는 격자 상수가 매칭되지만 더 넓은 밴드 갭을 갖는 유사한 반도체를 포함한다. 넓은 밴드 갭은 캐리어가 반도체로부터 벗어나는 것을 방지한다. 표면 전기화학으로 인한 바람직하지 않은 영향을 추가로 감소시키기 위해, 캡슐화 물질이 펌프 광에 의해 광학적으로 여기되지 않도록 캡슐화 물질 및 펌프 파장이 선택될 수 있다.
생체 적합성 양자 도트에서 사용되는 바와 같이, 생체 적합성 중합체로의 표면 코팅 또는 표면 관능화는, 레이저 입자의 생체 적합성을 추가로 증가시켜, 장기간 실험을 위해 세포 및 동물에서 유용하게 만들 수 있다. 레이저 입자는 이러한 중합체 및 생체 적합성 또는 생체 불활성 물질로 코팅될 수 있다(도 24b). 또한, 생체 인식용 분자, 예를 들어 항체, 단백질, 다양한 소형 분자 및 약물, 및 무기 나노 입자, 예를 들어 산화철이 레이저 입자에 부착될 수 있다(도 24b).
또한, 레이저 입자는 생체 적합성 및 순환 시간을 향상시키기 위해 리포솜에 의해 캡슐화될 수 있다(도 24c). 리포솜은 표적화를 위해 생물학적 인식 분자, 예를 들어 항체로 추가로 관능화될 수 있다(도 24c).
유전적으로 태깅된 프로브가 유용하며, 이를 위해 본 발명자들은 하이브리드 접근법을 사용할 수 있다. 동물의 표적 세포 그룹은 특정 표면 막 단백질을 과발현시키기도록 제조될 수 있으며, 레이저 입자는 이들이 세포 표면에 결합하도록 이들의 항체로 코팅된다. 둘째, 세포를 특정한 세포내 단백질을 제조하기 위해 형질 주입시키고, 입자는 표적 세포의 단백질과 결합시에만 특정한 방출 특징을 생성하도록 설계된다.
생체 적합성 코팅을 위해, HCl에 침지시키고 HCl을 제거하기 위해 여과하여 웨이퍼에서 디스크를 옮긴 후, 본 발명자들은 디스크(EtOH 중 1백만개/ml)를 0.1μM의 MPTMS(3-머캅토프로필 트리메톡시실란)와 혼합하여, 반도체 표면에 실란의 단층을 침착시켰다. 이후, NH3, H2O 및 TEOS를 상기 용액에 첨가하여, 실리카 쉘을 성장시켰다. 반응 시간 및 TEOS 농도를 조정하여 원하는 실리카 쉘 두께를 수득했다. 도 25는 상이한 두께를 갖는 실리카 층들로 코팅된 2개의 InAlGaAs 마이크로디스크 레이저 입자의 SEM 이미지를 도시한다.
세포를 단리된 레이저 디스크 입자와 함께 항온처리하여 이들을 세포질 내로 로 흡수시켰다. 도 26은 핵 외부의 세포질에 1개 또는 2개의 세포내 레이저 입자를 갖는 HeLa 세포의 다양한 이미지를 도시한다. 세포당 입자 수는, 세포 밀도 및 세포 매질 비에서의 레이저 입자의 농도, 및 다른 인자를 조절함으로써 다양해질 수 있다. 본 발명자들은 비코팅된 또는 실리카 코팅된 레이저 입자가 세포질 내부에서 자유롭게 움직이고 이들의 위치 및 방향이 변경되는 것을 명확하게 확인했다. 본 발명자들은 광학 펌프 펄스에 의한 복사력이 입자가 이동할 수 있게 만드는 것도 확인했다.
도 27은 일반적인 출력-펌프-에너지 곡선, 스펙트럼의 안정성(< 1 내지 2nm), 스펙트럼 선폭(0.3 내지 0.6nm)을 도시한다. 세포내 레이저로부터의 협대역 단일 피크 레이저 방출은, 다중화 및 세포 태깅을 위한 레이저 입자의 사용 가능성을 명확하게 보여준다(도 27).
도 28을 참조하여, 1nm 이하의 스펙트럼 폭(Q 인자 > 103)을 갖는 레이저 입자를 고려하면, 이들의 중심 파장은 1nm의 단계로 1,000nm 이상의 넓은 범위의 모든 곳(예를 들어, 0.6 내지 1.6㎛)에 존재할 수 있다. 1천개의 스펙트럼 빈(N = 1,000)를 충전하는 1,000개의 독특한 레이저 입자가 있을 수 있다. 무작위로 선택된 5개의 레이저 입자 그룹이 세포로 전달될 때, 상기 세포는 5개의 레이저 라인의 독특한 조합으로 표지된다. 가능한 조합 수는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00091
(여기서, m은 세포당 레이저 입자 수이다). N = 1,000이고 m = 5인 경우, 본 발명자들은 마우스의 전체 세포를 표지하기에 충분한 8조가지의 조합이 있음을 확인했다.
2개의 레이저 입자가 부착되어 더블렛을 형성한다고 가정하자. 더블렛의 조합은 499,500개(= C(1000,2) = D(1) = S(2))이다. (3개의 레이저로 형성되는) 166백만가지 유형의 트리플렛 레이저가 있다. 이러한 전략은 사실상 무한한 수의 표지를 제공한다. 이 거대한 파장-분할 다중화의 핵심 요소는 N이 크다는 것이다. 형광을 사용하면 N은 겨우 4 또는 10으로 제한된다.
레이저에 기초하는 태깅은 세포 혈통 추적을 허용한다. 우선, 세포들이 각각 다수의 입자 또는 감염의 큰 다중도(multiplicity)로 로딩된다. 예를 들어, 중첩되지 않는 더블렛 입자의 <m> = 128이다. 이는 약 3,500개(D(1)/128)의 세포를 표지화할 수 있다. 이제, 이러한 세포들은 시간에 따라 분열한다. 입자 그룹이 각 분열에서 대략 절반으로 분할되기 때문에, 5세대 이후에는 세포에 평균 4개의 더블렛이 잔류할 것이다. 동일한 더블렛이 이들의 직계 조상에만 존재하고, 다른 조상에게는 존재하지 않았기 때문에, 이들의 가계도를 확인할 수 있다. 입자의 수를 계수하여, 대략적인 계대(passage) 수를 추정할 수도 있다. 증식 지도도 측정할 수 있다.
더블렛 및 트리플렛을 형성하여 원반 형상의 이점을 취할 수 있다(도 29). 더블렛 및 트리플렛을 제작하는 데에는 다수의 상이한 방법이 있을 수 있다. 하나의 예로서, 2개의 반도체 디스크를 직접 결합시키기 위한 예시가 도 29a에 도시된다. 광학 누화(cross-talk)를 피하기 위해, 디스크들 사이에 절연층, 예를 들어 SiO2 층이 삽입될 수 있다(도 29b). 수확된 입자는 관능성 분자 또는 나노 입자, 및 중합체로 추가로 코팅될 수 있다(도 29b).
다르게는, 2개의 레이저 디스크는 2개의 서로 상이한 결합 화학 물질(chemical), 예를 들어 각각 Tz 및 TCO 클릭 화학 분자로 코팅되어 서로 접착될 수 있다. 또 다른 방법은 스페이서 물질, 예를 들어 직경이 0.3 내지 1㎛인 폴리스티렌 비드를 사용하는 것이다. 적절한 화학적 글루(glue)를 사용하면, 더블렛 레이저 입자(도 29b) 및 트리플렛 레이저 입자(도 29c)를 생성할 수 있다.
세포 태깅 외에, 개별 세포를 추적하여 살아있는 동물에서 이들의 증식, 이동, 및 세포-세포 및 세포-조직 상호 작용을 시간에 따라 관찰할 수 있는 능력이 매우 유용하다. 이는, 광학 이미징으로 시각화할 수 없고 PCR 증폭 및 시퀀싱를 사용하여 동물을 희생시킨 후에만 시험관내 판독할 수 있는, DNA 바코드로 알려진 바이러스 표지화 기술에 비해 큰 이점이다. 레이저 태깅된 세포는 생체내에서 반복적으로 이미징될 수 있고, 유세포 분석에 의해 분석될 수 있고, 유전자 프로파일링 및 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 분류될 수 있다. 단일 동물 실험에서 수백만내지 수십억개의 세포에 걸쳐 분자, 세포, 조직 및 시스템 수준에서 이러한 포괄적인 정보를 얻을 수 있는 능력은 전례가 없었다. 레이저 프로브는 통상적인 형광 표지화 기술 및 유전자 변형 리포터 마우스, 및 DNA 바코딩과 함께 사용할 수 있다.
레이저 입자의 또 다른 적용 분야는 바이오센싱이다. 상이한 레이저 공동은 공동 주변의 굴절률 변화, 특히, WGM 공동 및 광자 결정 공동에서의 변화에 민감하다. 이 공동들 중 하나는 레이징 체계에서 또는 공명 주파수의 이동(shift)을 측정하기 위한 노치 필터와 같이 작동될 수 있다. 굴절률만을 측정하는 대신, 공동의 표면을 관능화하여 특정 분자를 상기 표면에 결합시킬 수 있으며, 이러한 방식으로 특정한 검출이 가능하다. WGM은 순간적인 영역을 통해 마이크로구체 외부의 환경과 상호작용할 수 있다. 마이크로구체의 표면 또는 상기 표면 근처의 입자는 광의 광학 경로 및/또는 공동 손실을 변화시킨다. 이는 공명 주파수의 이동을 유발한다. 위스퍼링-갤러리 모드 공명기에서의 공명 조건은 대략
Figure pct00092
이다. 여기서, a는 공명기의 반경이고, n1은 굴절률이고, l은 모드의 수이고, λ는 모드의 공명 파장이다. 표면에 대한 분자의 부착은 유효 굴절률을 증가시킨다.
굴절률 변경은 다음을 통해 공명 파장을 변경한다:
Figure pct00093
상기 식에서, αex는 결합 분자의 과도한 분극도(polarizability)이고, σ는 분자의 표면 밀도이고, ε는 진공 유전율이고, n1 및 n2는 각각 공명기와 주변 매질의 굴절률이다. 모드 이동의 검출은 모드의 기본 선폭에 의해 제한되기 때문에, 가장 작은 표면 밀도가
Figure pct00094
를 사용하여 근사될 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)은 αex/4πε0 = 3.85x10-21cm3을 갖고, Q = 2,000인 물(n2 = 1.33) 중의 15㎛ 폴리스티렌 비드(n1 = 1.59)를 사용하여 5.9x1012개 분자cm-2의 낮은 표면 밀도를 측정할 수 있으며, 이는 비드 표면의 107개 분자에 해당한다.
예를 들어, BSA의 스토크(Stokes) 반경은 3.48nm이어서, 공명기 표면의 유효 결합 면적은 약 3.8x10-13cm2이 된다. BSA 분자가 15㎛ 폴리스티렌 비드의 표면에 어떠한 갭도 없이 결합하면, BSA의 총 수는 1.9x107이다. 이는 Q = 1,000으로 쉽게 검출할 수 있으며, 이러한 감도 수준은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 다른 표지 없는 방법과 필적할만 하다.
매우 높은 Q 인자를 갖는 구체 마이크로공명기는 가장 민감한 광학 시스템 중 하나이다. Q = 108이고 직경이 100㎛인 마이크로공명기의 경우, 광은 구체 주위에서 수십 미터씩 이동하며, 표면의 입자는 100,000회 이상 샘플링된다.
레이징 모드는 레이저 공동의 기하학적 구조에 크게 따른다. 이는 연질 레이저 공동을 만들고 이를 힘 센서로서 사용함으로써 사용할 수 있다. 세포 내부의 작은 힘의 측정은, 오일 소적 WGM 세포내 레이저를 사용하여 입증되었다. 소적이 단축 응력을 받으면, 이의 형상이 변형되어 방출 스펙트럼에서 레이저 선들의 분할로 나타난다. 작은 힘의 경우, 형상은 환형체로 근사될 수 있다. 레이징은 최소 곡률로 인해 가장 적은 광 손실을 갖는 적도 평면에 구속된다. 비구체 WGM에 대한 모델에 피팅함으로써, 적도 및 극성 반축(polar semi-axis)이 계산되어 평균 직경 및 이심률이 계산된다. 평탄화 응력 Δσ는
Figure pct00095
에 의해 소적 표면의 국부 평균 곡률과 관련되며, 상기 식에서, γ는 표면 장력이고, ΔH는 곡률의 차이이다. 작은 이심률(ε2 ≪ 1)의 경우, 상기 응력은 다음 식을 사용하여 근사화된다:
Figure pct00096
예를 들어, HeLa 세포에서 직경 8㎛의 오일 소적에 가해지는 측면 응력은 Δσ = 500pN/㎛2(500Pa)로 측정되었다. 세포 역학으로 인해 상기 응력은 시간에 따라 변한다. 내부 응력의 평균 변동은 ~150pN/㎛2(Pa)로 측정되었다. 사멸된 세포에서의 변동으로부터 결정되는 이 방법의 감도 한계는 ~20pN/㎛2(20Pa)으로, 직접 이미지 기반 분석보다 약 1 오더 더 우수하다.
세포 및 가능한 조직 내의 역장도 고형 폴리스티렌 비드를 사용하여 측정할 수 있지만, 이의 영률이 높기 때문에 측정할 수 있는 최소 힘은 소적의 경우에서보다 훨씬 높다. 힘은 세포가 최소 측정 응력이 100kPa 오더인 비드를 섭취하는 동안 측정되었다. 공동의 변형으로 인한 모드 분할은 세포에 의한 비드 섭취 동안의 굴절률의 국부적인 변화로 인해 상기 분할로부터 분리되기 어렵다.
온도에 대한 공명 피크의 민감도는 물질 특성으로부터 추정할 수 있다.
Figure pct00097
상기 식에서, αT는 선 열팽창 계수이고, βT는 공동 물질의 상대 지수 변화 계수이다. 폴리스티렌의 경우, αT
Figure pct00098
7.5×10-5℃-1 및 βT = -8.2×10-5℃-1이다. 따라서, 이 두 가지 효과는 서로 거의 상쇄된다. 사실, 본 발명자들의 측정은 순수(pure water)에 침지된 비드에 대해서 3pm/℃만의 모드 이동을 보여준다. 이는 10㎛ 비드의 경우 60pm/℃의 직경 오차에 해당한다. 이러한 온도 의존 효과는 2nm의 직경 간격 내에 널리 존재한다. 본 발명자들은 항온처리 또는 생체내 포유류 세포에서, 주위 온도가 37℃ 전후의 일정한 정도로 유지된다는 것에 주목한다.
반도체의 경우, 열 팽창 및 지수 변화의 기여도는 동일한 부호를 갖는다. 예를 들어, 37℃에서의 GaAs 및 InP는 각각 0.59×10-5℃-1 및 0.46×10-5℃-1의 αT, 및 각각 1.15㎛에서 7.8×10-5℃-1 및 7.2×10-5℃-1의 βT를 갖는다. 이는 GaAs 및 InP 레이저에 대해 60 내지 90pm/℃의 파장 이동을 얻는다.
특정 값에 대한 용어 "실질적으로"(상기 값과 실질적으로 상이하거나 상기 값과 실질적으로 동일한 것과 같음), "약", "대략" 등은, 허용되는 제조 공차 내에서 그리고/또는 의도된 작동 파라미터에 상당한 영향을 미칠 수 있는 편차 없이. 명백하게 (또는 거의 인식하지 못할 정도로) 상기 값과는 상이한 것을 나타낼 수 있다는 것에 주의한다. 특정 실시에서, (상기 값과 실질적으로 동일하거나, 상기 값과 실질적으로 상이하거나, 약 또는 대략의 특정 값인) 허용되는 값은, 예를 들어 특정 적용에 따라 특정 값에서 +/- 1%의 편차, +/- 5%의 편차, 또는 +/- 10%의 편차를 가질 수 있다. 다른 허용되는 편차는, 예를 들어, (실질적으로 상기 값과 동일하거나, 약 상기 값이거나 또는 대략 상기 값인 경우) 최대 1% 또는 최대 5%, 또는 (실질적으로 상기 값보다 더 큰/더 작은 경우) 적어도 5% 또는 적어도 10%를 포함한다.
본 발명은 예시적인 양태와 관련하여 설명되었지만, 명시적으로 언급된 것 이외에 그리고 상기 버전의 상이한 피처들을 조합하는 것 이외에, 다양한 방식으로의 다수의 균등물, 대안, 변형, 추가 및 수정이 이루어질 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해해야 한다. 상기 상세한 설명은 다양한 양태들에 적용되는 바와 같은 신규한 피처들을 도시하고, 기술하고, 지적하였지만, 도시된 디바이스들 또는 알고리즘들의 형태 및 세부 사항들에서 다양한 생략, 대체 및 변경이 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 인식되는 바와 같이, 본 발명에 개시된 설명의 특정 양태는, 일부 피처가 다른 것들과 별도로 사용되거나 실행될 수 있기 때문에, 본원 명세서에서 제시된 모든 피처 및 이점을 제공하지 않는 형태로 구현될 수 있다. 본원 명세서에 개시된 특정 설명의 범위는 상기한 설명보다는 청구되는 청구범위에 의해 표시된다. 청구범위와 동등한 의미 및 범위 내에 있는 모든 변경은 상기 청구범위 내에 포함되어야 한다.

Claims (88)

  1. 에너지적으로 여기(energetically excited)될 때 광을 방출하도록 구성된 광자 입자로서, 상기 입자가,
    하나 이상의 무기 물질을 포함하는 이득 매질(gain medium);
    상기 이득 매질 주위에 위치되고 2 이상의 굴절률을 갖는 광 공동(optical cavity); 및
    상기 광 공동의 적어도 일부를 덮으며 하나 이상의 유기 물질을 포함하는 코팅을 포함하는, 광자 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 입자는, 상기 입자가 에너지적으로 여기될 때에 생물학적 샘플 내부에서 코히어런트 광(coherent light)을 방출하도록 생물학적 샘플 내에 배치하기 위해 구성되는, 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 입자는, 상기 입자가 펌프 광원을 사용하여 광학적으로 여기될 때에 생체 내부에서 레이저 광을 방출하도록 생체(living organism) 내로 삽입하기 위해 구성되는, 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 입자가 실질적으로 27㎛3를 초과하지 않는 용적을 갖는, 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 입자가, 이의 가장 긴 축을 따라 3㎛를 초과하지 않는 3차원 형상을 갖는, 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 입자가, 이의 가장 긴 축을 따라 2㎛를 초과하지 않는 3차원 형상을 갖는, 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 약 3의 굴절률을 갖는, 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 3 이상의 굴절률을 갖는, 입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 약 3.5의 굴절률을 갖는, 입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 3.5 이상의 굴절률을 갖는, 입자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 광 공동의 공동 모드(cavity mode)에 의해 한정되는 하나 이상의 협대역 피크(narrowband peak)를 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되는, 입자.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 피크의 스펙트럼 폭이 1nm보다 넓지 않은, 입자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 스펙트럼이 하나의 협대역 피크만을 가지며, 상기 피크의 스펙트럼 폭이 1nm보다 크지 않은, 입자.
  14. 제11항에 있어서, 각 피크의 파장이 0.4 내지 1.9㎛의 범위인, 입자.
  15. 제1항에 있어서, 상기 입자가 양자 우물 마이크로 디스크 레이저인, 입자.
  16. 제1항에 있어서, 상기 공동이 패브리-페롯(Fabry-Perot) 간섭계 유형 또는 위스퍼링-갤러리-모드(whispering-gallery-mode) 유형인, 입자.
  17. 제1항에 있어서, 상기 입자가 반도체 구체인, 입자.
  18. 제1항에 있어서, 상기 이득 매질이 하나 이상의 반도체를 포함하는, 입자.
  19. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 하나 이상의 반도체를 포함하는, 입자.
  20. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 하나 이상의 유전체 물질을 포함하는, 입자.
  21. 제1항에 있어서, 상기 광 공동이 하나 이상의 금속을 포함하는, 입자.
  22. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 생물학적으로 불활성이어서 상기 입자가 생체 적합성인, 입자.
  23. 제1항에 있어서, 상기 코팅은 생물학적 샘플 내에서 화학적으로 결합되도록 구성되는, 입자.
  24. 제1항에 있어서, 상기 코팅은 생물학적 인식(biological recognition)용으로 구성되는, 입자.
  25. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 유전체 쉘(dielectric shell)인, 입자.
  26. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 중합체를 포함하는, 입자.
  27. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 펩타이드를 포함하는, 입자.
  28. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 단백질을 포함하는, 입자.
  29. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 항체를 포함하는, 입자.
  30. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 핵산을 포함하는, 입자.
  31. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 약제학적으로 활성인 제제를 포함하는, 입자.
  32. 제1항에 있어서, 상기 코팅이 상기 광학 입자를 실질적으로 전부 덮는, 입자.
  33. 제1항에 있어서, 상기 광 공동의 왕복 길이가 상기 이득 매질 내의 충분히 많은 수의 활성 이득 요소(gain element)를 지원하고, 상기 광 공동의 광 손실(optical loss)이 충분히 낮아, 상기 광자 입자가 레이저 발진을 지원하는, 입자.
  34. 제1항에 있어서, 상기 이득 매질 내의 활성 이득 요소의 수가 충분히 크고, 상기 공동의 광 손실이 충분히 낮아, 상기 입자가 Q-팩터가 100 이상인 공동 모드를 지원하는, 입자.
  35. 제1항에 있어서, 상기 이득 매질 내의 활성 이득 요소의 수가 충분히 크고, 상기 공동의 광 손실이 충분히 낮아, 상기 입자가 광학적으로 여기되어 레이저 임계값에 도달하고 레이저 발진을 지원할 수 있는, 입자.
  36. 제1항에 있어서, 펌프 광원에 의해 에너지적으로 자극될 때 레이저 방출을 발생하도록 구성되는, 입자.
  37. 제1항에 있어서, 광학적으로 자극될 때 레이저 광을 발생하도록 구성되는, 입자.
  38. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 상기 세트 내의 입자들이 서로 점진적으로(incrementally) 상이한 크기인, 2개 이상의 입자들의 세트.
  39. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 각각의 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나 이상의 협대역 피크들을 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되며, 여기서, 상기 입자들의 레이징(lasing) 파장들은 서로 상이한, 2개 이상의 입자들의 세트.
  40. 제39항에 있어서, 레이징 파장들의 차이가 상기 레이징 피크들의 스펙트럼 폭과 실질적으로 동일하거나 이보다 더 큰, 2개 이상의 입자들의 세트.
  41. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 각각의 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나의 협대역 피크를 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되며, 여기서, 상기 입자들의 레이징 파장들은 상기 레이저 피크들의 스펙트럼 폭 내에서 실질적으로 동일한, 2개 이상의 입자들의 세트.
  42. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 각각의 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나 이상의 협대역 피크들을 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되며, 여기서, 상기 입자들의 레이징 파장들은 실질적으로 동일한, 2개 이상의 입자들의 세트.
  43. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 다수의 입자들이 서로 부착되는, 2개 이상의 입자들의 세트.
  44. 제43항에 있어서, 각각의 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나의 협대역 피크를 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되며, 여기서, 상기 입자들의 레이징 파장들은 실질적으로 서로 상이한, 2개 이상의 입자들의 세트.
  45. 2개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 상기 입자들 중 적어도 2개는 서로 부착되어 더블렛(doublet)을 형성하는, 2개 이상의 입자들의 세트.
  46. 3개 이상의 제1항에 기재된 입자들의 세트로서, 상기 입자들 중 적어도 3개는 서로 부착되어 트리플렛(triplet)을 형성하는, 2개 이상의 입자들의 세트.
  47. 제1항에 기재된 콜로이드성으로 현탁된 입자들의 세트를 포함하는, 수용액.
  48. 생물학적 샘플 내에서 레이저 광을 방출시키는 방법으로서, 상기 방법은, 하나 이상의 광자 입자를 상기 생물학적 샘플에 배치하는 단계를 포함하고, 상기 광자 입자들은 에너지적으로 여기되거나 자극될 때 레이저 광을 방출하도록 구성되며, 하나 이상의 상기 광자 입자는,
    하나 이상의 무기 물질을 포함하는 이득 매질;
    상기 이득 매질 주위에 위치되고 2 이상의 굴절률을 갖는 광 공동; 및
    상기 광 공동의 적어도 일부를 덮으며 하나 이상의 유기 물질을 포함하는 코팅을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 광원을 사용하여 상기 광자 입자들을 광학적으로 여기시키거나 자극하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 외부로부터 광자 입자들에서 여기 광을 방출시키는 펌프 광원을 사용하여, 상기 광자 입자를 여기시켜 상기 레이저 광을 방출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 생체인, 방법.
  52. 제48항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 치료되는 대상체의 조직인, 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 입자가 실질적으로 27㎛3를 초과하지 않는 용적을 갖는, 방법.
  54. 제48항에 있어서, 상기 입자가, 이의 가장 긴 축을 따라 3㎛보다 크지 않은 3차원 형상을 갖는, 방법.
  55. 제48항에 있어서, 상기 입자가, 이의 가장 긴 축을 따라 2㎛보다 크지 않은 3차원 형상을 갖는, 방법.
  56. 제48항에 있어서, 상기 광 공동이 약 3의 굴절률을 갖는, 방법.
  57. 제48항에 있어서, 상기 광 공동이 3 이상의 굴절률을 갖는, 방법.
  58. 제48항에 있어서, 상기 광 공동이 약 3.5의 굴절률을 갖는, 방법.
  59. 제48항에 있어서, 상기 광 공동이 3.5 이상의 굴절률을 갖는, 방법.
  60. 제48항에 있어서, 상기 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나 이상의 협대역 피크들을 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되는, 방법.
  61. 제48항에 있어서, 상기 입자는, 상기 광 공동의 공동 모드들에 의해 한정되는 하나 이상의 협대역 피크들을 갖는 스펙트럼을 포함하는 광을 방출하도록 구성되며, 여기서, 상기 스펙트럼은 하나의 협대역 피크만을 갖고, 상기 피크의 스펙트럼 폭은 1nm보다 크지 않은, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 각 피크의 스펙트럼 폭이 1nm보다 좁은, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 각 피크의 파장이 0.4 내지 1.9㎛의 범위인, 방법.
  64. 제48항에 있어서, 상기 이득 매질이 하나 이상의 반도체를 포함하는, 방법.
  65. 제48항에 있어서, 상기 광 공동이 하나 이상의 반도체를 포함하는, 방법.
  66. 제48항에 있어서, 상기 코팅은 화학적으로 결합되도록 구성되는, 방법.
  67. 제48항에 있어서, 상기 코팅은 생물학적 인식용으로 구성되는, 방법.
  68. 제48항에 있어서, 상기 코팅이 하나 이상의 약제학적으로 활성인 제제를 포함하며, 여기서, 상기 방법은 상기 약제학적으로 활성인 제제를 상기 생물학적 샘플에 투입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  69. 제48항에 있어서, 상기 이득 매질 내의 활성 이득 요소의 수가 충분히 크고, 상기 공동의 광 손실이 충분히 낮아, 상기 입자가 광학적으로 여기되어 레이저 임계값에 도달하고 레이저 발진을 지원할 수 있는, 방법.
  70. 제48항에 있어서, 다수의 입자들이 상기 생물학적 샘플에 배치되고, 상기 입자들은 서로 점진적으로 상이한 크기인, 방법.
  71. 제48항에 있어서, 다수의 입자들이 상기 생물학적 샘플에 배치되고, 상기 입자들의 레이징 모드는 서로 상이한, 방법.
  72. 레이저 입자들을 세포들 내로 삽입하고, 세포들 내의 레이저 입자들로부터의 방출을 고속으로 판독하기 위한 고속 처리 시스템(high-throughput system)으로서, 상기 속도는 초당 100개 세포 이상인, 시스템.
  73. 현미경 시스템(microscopy system)으로서,
    펌프 광원;
    빔 스캐너;
    분광계로서,
    1nm 이하의 해상도; 및
    1kHz 이상의 획득 레이트(acquisition rate)를 갖는 상기 분광계; 및
    형광으로 인한 광대역 배경(braodband background)으로부터 레이저 출력의 스펙트럼 피크를 구별하기 위해 구성된 스펙트럼 분석기를 포함하는, 현미경 시스템.
  74. 제73항에 있어서, 레이저 입자들을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 저장소(receptacle)를 추가로 포함하는, 현미경 시스템.
  75. 제74항에 있어서, 협대역 스펙트럼을 방출하도록 구성된 하나 이상의 광자 레이저 입자들을 포함하는 샘플을 추가로 포함하는, 현미경 시스템.
  76. 제73항에 있어서, 상기 샘플에 포함된 광자 레이저 입자들로부터의 방출 스펙트럼에 기초하여, 샘플의 하나 이상의 이미지를 생성하도록 구성된 컴퓨터 설비(computer arrangement)를 추가로 포함하는, 현미경 시스템.
  77. 제73항에 있어서, 형광 현미경을 위한 설비를 추가로 포함하는, 현미경 시스템.
  78. 제77항에 있어서, 상기 설비가 광원 및 형광을 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는, 현미경 시스템.
  79. 현미경 시스템을 사용하여 광자 입자들을 포함하는 생물학적 샘플을 스펙트럼 분석하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 현미경 시스템이,
    펌프 광원;
    빔 스캐너;
    분광계로서,
    1nm 이하의 해상도; 및
    1kHz 이상의 획득 레이트를 갖는 상기 분광계; 및
    형광으로 인한 광대역 배경으로부터 레이저 출력의 스펙트럼 피크를 구별하기 위해 구성된 스펙트럼 분석기를 포함하는, 방법.
  80. 유세포 분석 및 분류 시스템(flow cytometry and sorting system)으로서,
    펌프 광원;
    유동 채널;
    분광계; 및
    형광으로 인한 광대역 배경으로부터 레이저 출력의 스펙트럼 피크를 구별하기 위해 구성된 스펙트럼 분석기를 포함하는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  81. 제80항에 있어서, 상기 분광계가 1nm 이하의 해상도를 갖는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  82. 제80항에 있어서, 레이저 입자들을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 저장소를 추가로 포함하는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  83. 제80항에 있어서, 협대역 스펙트럼을 방출하도록 구성된 하나 이상의 광자 레이저 입자들을 포함하는 샘플을 추가로 포함하는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  84. 제80항에 있어서, 샘플에 포함된 광자 레이저 입자들로부터의 방출에 기초하여 데이터를 생성하도록 구성된 컴퓨터 설비를 추가로 포함하는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  85. 제80항에 있어서, 형광 세포 분석을 위한 하나 이상의 광원 및 하나 이상의 검출기를 추가로 포함하는, 유세포 분석 및 분류 시스템.
  86. 장치(apparatus)로서,
    펌프 광원;
    주입 잠금(injection locking)에 의해 레이저 입자들을 제어하도록 구성된 주입 레이저;
    레이저 입자들을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 저장소; 및
    주입 빔과 레이저 입자들로부터의 출력 사이의 프린지(fringe)를 측정하도록 구성된 간섭계를 포함하는, 장치.
  87. 제86항에 있어서, 상기 레이저 입자들로부터의 방출의 특징을 측정하도록 구성된 검출기를 추가로 포함하는, 장치.
  88. 제86항에 있어서, 상기 주입 레이저로부터의 방출 위상에 대한 상기 레이저 입자들로부터의 레이저 방출의 위상을 측정하도록 구성된 간섭계 설비를 추가로 포함하는, 장치.
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