KR20190003603A - 단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법 - Google Patents

단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190003603A
KR20190003603A KR1020187033842A KR20187033842A KR20190003603A KR 20190003603 A KR20190003603 A KR 20190003603A KR 1020187033842 A KR1020187033842 A KR 1020187033842A KR 20187033842 A KR20187033842 A KR 20187033842A KR 20190003603 A KR20190003603 A KR 20190003603A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sulfocysteine
cell culture
cysteine
protein
salt
Prior art date
Application number
KR1020187033842A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102425040B1 (ko
Inventor
알리네 침머
Original Assignee
메르크 파텐트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메르크 파텐트 게엠베하 filed Critical 메르크 파텐트 게엠베하
Publication of KR20190003603A publication Critical patent/KR20190003603A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102425040B1 publication Critical patent/KR102425040B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 배양으로 생산되는 단백질에서 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 세포 배양 첨가제로서 술포시스테인 및 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법
본 발명은 세포 배양으로 생산되는 IgG와 같은 단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 세포 배양 첨가제로서 술포시스테인 및 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
재조합 단백질, 및 특히 단일클론 항체 (mAb)는 광범위한 질환의 치료를 위해 적용되는 중요한 부류의 치료적 화합물이 되었다.
이러한 생물분자, 예를 들어 항체를 포함한 치료적 단백질의 효율적이고 경제적인 대규모 생산은 생물공학 및 약학 산업을 위해서 점진적으로 중요한 고려사항이다.
전형적으로, 단백질은, 예를 들어 관심 단백질을 생산하도록 재조합적으로 조작된 포유동물 또는 박테리아 세포주를 사용하는 세포 배양 방법을 사용해 생산된다.
그러나, 이러한 재조합적으로 생산된 단백질은 상당한 불균질성을 나타낸다. 이러한 불균질성은 화학적으로 유도된 변형 예컨대 산화, 탈아미드화, 및 당화를 포함하여 번역후 변형 예컨대 단백질가수분해적 성숙화, 단백질 폴딩, 글리코실화, 인산화, 및 디술파이드 결합 형성으로 인해 초래될 수 있다. 분자적 불균질성은 특히 치료적 단백질이 인간에서 사용하고자 하여, 미국 식품 의약국 (Food and Drug Administration) (FDA)과 같은 규제 기관의 승인이 있어야만 하는 경우라면 바람직하지 않다.
특히 관심을 얻고 있는 한 분자적 불균질성은 트리술파이드 결합의 형성이다.
항체 (또는 면역글로불린)는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 경쇄 폴리펩티드 (LC) 및 2개의 중쇄 폴리펩티드 (HC)로 구성된다. 4개의 사슬은 전형적으로 중쇄 및 경쇄에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성되는 디술파이드 결합에 의해 "Y" 입체형태로 연결된다. 이들 디설파이드 연결은 천연 HC2LC2 사량체의 전체적인 구조를 지배한다. 전형적으로, 항체는 H 사슬을 연결하는 2개의 힌지 영역 디술파이드를 포함한, 4개의 사슬간 디술파이드 결합, 및 각각의 중쇄 H 및 L 사슬 사이의 한 개 디술파이드 결합을 함유한다. 또한, 12개의 사슬내 디술파이드 연결은 분자에 존재하는 각각의 나머지 시스테인 잔기가 관여될 수 있다. 불완전한 디술파이드 결합 형성, 또는 디술파이드 스크램블링이 뒤따르는 산화 또는 베타-제거를 통한 결합 파괴가 모두 항체 불균질성의 잠재적인 공급원이다. 또한, 추가 유형의 변형, 즉 트리술파이드 (-CH2-S-S-S-CH2-) 결합 형성이 최근에 보고되었다. 트리술파이드 결합 형성에 관한 추가 정보는 문헌 [Pristatsky et al., Anal. Chem. 81: 6148 (2009)]에서 확인할 수 있다.
문헌 [Rashmi Kshirsagar et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 10, October, 2012, page 2523-2532]은 그들이 시스테인 함량과 트리술파이드 결합의 형성 간 관련성을 이해함에 따라 세포 배양 배지 중 시스테인 함량을 교정하고 특히 감소시키는 것을 제안한다.
WO 2011 041721은 용액 중 단백질이 고형 지지체와 접촉하여 회합될 수 있게 한 후에 상기 단백질을 환원제를 포함하는 용액에 노출시켜서 단백질 내 트리술파이드 결합을 디술파이드 결합으로 전환시키기 위한 방법을 개시한다.
WO2012158551은 대규모 생산 동안 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키기 위한 방법으로서, 시스테인 분해의 억제제, 예를 들어 글루타티온, 피루베이트 등의 유효량의 존재 하에서 상기 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다.
단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 다른 덜 복잡하고/하거나 보다 효율적인 방식을 찾는 것이 유리할 것이다.
세포 배양 배지 내 시스테인이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체되면, 상기 세포 배양 배지에서 생산되는 단백질 내 트리술파이드 결합의 양이 시스테인을 포함하는 동일한 세포 배양 배지와 비교하여 감소된다는 것을 발견하였다.
본 발명은 그 결과로서 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키기 위한 방법으로서, 임의의 유의한 양의 시스테인 또는 시스틴을 함유하지 않으나 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급 배지가 세포 배양 동안 1회 이상으로 세포 배양물에 첨가되게 하여 상기 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 그리하여 상기 단백질 내 트리술파이드 연결 형성이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 부분적으로 또는 바람직하게는 완전하게 대체되지 않은 세포 배양 배지에서 배양된 세포에 비하여 감소되는 것인 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 S-술포시스테인 소듐 염이다.
바람직한 구체예에서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급물의 pH는 6.8 내지 7.5이다.
다른 바람직한 구체예에서, S-술포시스테인 및/또는 S-술포시스테인 염은 세포 배양물 내 그들 농도가 0.4 내지 50 mM이 되도록 하는 양으로 첨가된다.
일 구체예에서, 세포는 적어도 하나 이상의 사카라이드 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다.
일 구체예에서, 상기 단백질 내 경쇄 및 중쇄 간 트리술파이드 연결 형성은 공급 배지 내 시스테인 및/또는 시스틴이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체되지 않은 세포 배양 배지에서 배양된 세포에 비해 감소된다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은
- 생물반응기에 세포 및 액상 세포 배양 배지를 충전시키는 단계
- 세포를 생물반응기에서 인큐베이션시키는 단계
- 생물반응기 내 세포의 전체 인큐베이션 시간 동안 연속적으로 또는 상기 인큐베이션 시간 내에 1회 또는 수회로, 이 경우에는 공급 배지인 세포 배양 배지를 생물반응기에 첨가하는 단계
에 의해 수행되고,
상기 공급 배지는 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하고 유의한 양의 시스테인 및/또는 시스틴은 포함하지 않는다. S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하지 않는 다른 공급 배지를 첨가하는 것도 역시 물론 가능하다. 바람직하게, 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하는 공급 배지는 첨가하지 않는다.
바람직하게, 공급 배지는 1 내지 100 mmol/ℓ, 바람직하게 5 내지 20 mmol/ℓ 농도로 S-술포시스테인 및/또는 S-술포시스테인 염을 포함한다.
바람직하게, 생물반응기에서 세포의 전체 인큐베이션 시간 동안 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하는 공급 배지는 첨가되지 않는다.
도 1은 IgG 중 트리술파이드 수준을 모니터링하는데 사용되는 전략을 도시한다. 더욱 상세한 사항은 실시예에서 확인할 수 있다.
도 2-5는 FB 과정의 13일 및 18일에 조합된 Lys-C/트립신 분해시 트리술파이드 연결된 펩티드의 상대적 정량을 도시한다. 더욱 상세한 사항은 실시예에서 확인할 수 있다.
도 6은 디술파이드 브릿지를 갖는 LC-HC 연결과 트리술파이드 브릿지를 갖는 LC-HC 연결 간 관련성을 보여주는 추출된 이온 크로마토그램의 오버레이를 도시한다.
"트리술파이드 결합"은 디술파이드 결합에 추가적인 황 원자의 삽입에 의해 발생되는 것으로서, 그 결과로 3개의 연속하는 황 원자의 공유 결합이 생성된다. 트리술파이드는 번역후 변형이다. 트리술파이드 결합은 단백질 내 시스테인 잔기 간에 형성될 수 있고 분자내에서 (즉, 동일한 단백질 내 2개 시스테인 사이에서) 또는 분자간에 (즉, 별개 단백질의 2개 시스테인 사이에서) 형성될 수 있다. 트리술파이드는 예를 들어 사슬간 연결에서, 주로 경쇄-중쇄 연결에서 검출되었다.
트리술파이드 결합의 존재는 예를 들어 펩티드 맵핑을 사용하여 검출될 수 있고 추가 황 원자 (32Da)로 인한 온전한 단백질의 질량 증가를 기반으로 검출될 수 있다. 따라서 트리술파이드 결합은 질량 분광분석법을 사용하거나, 또는 고압 액상 크로마토그래피 및 질량 분광분석법 (LC-MS 시스템을 이용하는 펩티드 맵핑)에 의해 검출될 수 있다. 도 1은 이러한 분석을 수행할 수 있는 방법에 관한 일반적인 계획안을 도시한다. 추가의 세부사항은 실시예에서 찾을 수 있다.
"단백질"은 아미노산 잔기의 하나 이상의 사슬로 이루어진 거대분자이다. 올리고펩티드 및 바람직하게 폴리펩티드가 단백질의 정의 내에 포함된다. 단백질은 물질대사 반응의 촉매, DNA 복제, 자극에 대한 반응, 및 한 위치에서 다른 곳으로 분자의 수송을 포함하여, 살아있는 유기체 내에서 엄청나게 많은 기능을 수행한다. 단백질은 주로 서로 그들의 아미노산 서열이 상이하다. 대부분의 단백질은 고유한 3-차원 구조로 폴딩된다. 단백질은 예를 들어 천연 발생 단백질일 수 있거나, 또는 바람직하게 재조합적으로 생산되는 단백질일 수 있다. 단백질의 예는 효소 또는 바람직하게 항체이다. 또한 본 발명에 따른 단백질로서 전술한 단백질의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 이의 임의 조합이 포함된다.
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 의미한다. 전형적으로, 항체는 2개 중쇄 및 2개 경쇄로 이루어진 기본적인 4개-폴리펩티드 사슬 구조를 가지며, 상기 사슬들은 예를 들어 사슬간 디술파이드 결합에 의해 안정화된다. 항체는 단일클론일 수 있거나 또는 다클론일 수 있고 단량체 또는 다량체 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어, IgM 항체는 5량체 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 항체는 또한 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그들이 리간드-특이적 결합 도메인을 보유하거나, 또는 포함하도록 변형되었다면 항체 단편을 포함할 수도 있다. 용어 "단편"은 온전하거나 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬보다 소수의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 의미한다. 단편은 온전하거나 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해서 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생산될 때, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질이라고 하는 거대 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 예시적인 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라서 융합 단백질은 또한 용어 "항체"에 의해 포괄된다.
(S)-2-아미노-3-술포술파닐프로판산이라고도 하는 S-술포시스테인은 예를 들어 황산과 시스테인의 축합에 의해 수득가능한 생성물이다. 적합한 염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속 염, 예를 들어 리튬 염, 소듐 염, 포타슘 염, 칼슘 염 또는 마그네슘 염 또는 이의 혼합물이다. 바람직한 것은 소듐 염, 포타슘 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염이고, 가장 바람직한 것은 소듐 염이고, 특히 소듐 염이다.
S-술포시스테인 및 이의 염은 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:
Figure pct00001
상기 식에서, R은
Figure pct00002
이고, X는 H, Li, Na, K, ½ Ca, ½ Mg, 바람직하게 H, Na, K이다. 용어 프로판산은 또한 용어 프로피온산 대신에 사용될 수도 있다.
(S)-2-아미노-3-술포술파닐-프로판산S-술포-시스테인 또는 시스테인-S-술페이트라고도 하는 2-아미노-3-술포술파닐-프로피온산, 및 이의 염의 합성은 예를 들어, 문헌 [I.H.Segel and M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5 (1963), 330-337] 및 [J.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262]에 개시되어 있다. S-술포-시스테인은 상업적으로 Sigma-Aldrich (US)에서 입수할 수 있다. 소듐 염은 더 나아가서 Bachem (Switzerland)에서 상업적으로 입수할 수 있다.
세포 배양은 세포를 배양하는 임의의 셋업이다. 세포 배양은 예를 들어, 약제와 같은 표적 분자, 특히 항체와 같은 재조합 단백질을 생산하는데 사용된다.
세포 배양 배지는 세포의 시험관내 성장을 유지시키고/시키거나 지원하는 성분들의 임의 혼합물이다. 이것은 복합 배지일 수 있거나 또는 화학적으로 한정된 배지일 수 있다. 세포 배양 배지는 세포의 시험관내 성장을 유지시키고/시키거나 지원하는데 필요한 모든 성분 또는 추가 성분은 개별적으로 첨가하도록 오직 일부 성분만을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지의 예에는 세포의 시험관내 성장을 유지시키고/시키거나 지원하는데 필수적인 모든 성분을 포함하는 완전 배지 뿐만 아니라 배지 보충물 또는 공급물이 있다. 기본 배지라고도 하는 완전 배지는 6.8 내지 7.8의 pH를 갖는다. 공급 배지는 바람직하게 8.5 이하의 pH를 갖는다. 본 발명에 따라서 사용되는 세포 배양 배지는 바람직하게 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다.
전형적으로, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 생물반응기에서 세포의 성장을 유지시키고/시키거나 지원하고 상기 세포의 IgG 생산을 지원하는데 사용된다.
일부 세포 배양 배지는 멸균된 수성 액체로서 공급된다. 액상 세포 배양 배지의 단점은 그들의 감소된 저장 수명 및 운송 및 저장에 대한 어려움이다. 그 결과로서, 많은 세포 배양 배지는 현재 미분 건조 분말 혼합물로서 공급된다. 그들은 물 및/또는 수용액에 용해시키는 목적으로 제조되고, 용해된 상태에서, 종종 다른 보충물과 함께, 세포에 성장 및/또는 상기 세포로부터 생물약제의 생산을 위한 실질적인 영양분 베이스를 제공하도록 디자인된다.
대부분의 생물약제 생산 플랫폼은 유가식 세포 배양 프로토콜을 기반으로 한다. 목적은 전형적으로 증가되는 시장 수요를 충족시키고 제조 비용을 절감하기 위해 고역가 세포 배양 공정을 개발하는 것이다. 고성능 재조합 세포주의 사용 이외에도, 세포 배양 배지 및 공정 변수의 개선이 최대 생산 가능성을 실현시키는데 요구된다.
유가식 공정에서, 기본 배지는 초기 성장 및 생산을 지원하고, 공급 배지는 영양분의 고갈을 방지하고 생산 시기를 지속시킨다. 배지는 상이한 생산 시기 동안 별개의 물질대사 요건을 수용하도록 선택된다. 공급 전략 및 제어 변수를 포함하여 공정 변수 설정은 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 화학적 및 물리적 환경을 한정한다.
공급물 또는 공급 배지는 세포 배양에서 초기 성장 및 생산을 지원하는 기본 배지는 아니지만 영양분의 고갈을 방지하고 생산 시기를 지속시키는 후기 단계에 첨가되는 배지인 세포 배양 배지이다. 공급 배지는 기본 배양 배지와 비교하여 일부 성분을 더 높은 농도로 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 성분, 예컨대, 예를 들어 아미노산 또는 탄수화물을 포함하는 영양분은 기본 배지 농도의 약 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, 또는 심지어 약 1000X로 공급 배지에 존재할 수 있다.
본 발명에 따라서, 임의의 유의한 양의 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하지 않으나 대체물로서 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 함유하는 공급 배지는 시스테인 및/또는 시스틴을 S-술포시스테인 및/또는 이의 염의 5% (w/w) 미만의 양으로, 바람직하게 1% (w/w) 미만의 양으로 함유하는 임의 배지이고, 가장 바람직하게 이것은 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하지 않으나 오직 S-술포시스테인 및/또는 이의 염 뿐만 아니라 시스테인 및/또는 시스틴 이외의 잠재적인 다른 공급 성분을 포함한다.
포유동물 세포 배양 배지는 포유동물 세포의 시험관내 성장을 유지시키고/시키거나 지원하는 성분의 혼합물이다. 포유동물 세포의 예는 인간 또는 동물 세포, 바람직하게 CHO 세포, COS 세포, I VERO 세포, BHK 세포, AK-1 세포, SP2/0 세포, L5.1 세포, 하이브리도마 세포 또는 인간 세포이다.
화학적으로 한정된 세포 배양 배지는 임의의 화학적으로 불확정적인 물질을 포함하지 않는 세포 배양 배지이다. 이것은 배지에 사용되는 모든 화학물의 화학적 조성이 알려져 있다는 것을 의미한다. 화학적으로 한정된 배지는 임의의 효모, 동물 또는 식물 조직을 포함하지 않으며, 그들은 피더 세포, 혈청, 추출물, 가수분해물 또는 분해물 또는 다른 화학적으로 불완전하게 한정된 성분을 포함하지 않는다. 화학적으로 불확정적이거나 또는 불완전하게 한정된 화학적 성분은 그들 화학 조성 및 구조가 알려져 있지 않은 것이고, 다양한 조성으로 존재하거나 또는 알부민 또는 카세인과 같은 단백질의 화학적 조성 및 구조의 평가와 비슷한, 수많은 실험적 노력으로만 한정할 수 있다.
분말화된 세포 배양 배지 또는 건조 분말 배지는 전형적으로 밀링 공정 또는 동결건조 공정에 의한 세포 배양 배지이다. 그것은 분말화된 세포 배양 배지가 과립형, 미립자 배지이고, 액상 배지가 아니라는 의미이다. 용어 "건조 분말"은 용어 "분말"과 상호교환적으로 사용될 수 있지만, 본 명세서에서 사용시 "건조 분말"은 단순하게 과립형 재료의 전체 외관을 의미하고 달리 표시하지 않으면 그 재료가 착화 또는 집화된 용매가 완전하게 없는 것을 의미하려는 의도가 아니다. 분말화된 세포 배양 배지는 또한 예를 들어 롤러 압밀에 의해 건조 과립화된, 과립형 세포 배양 배지일 수 있다.
분말화된 세포 배양 배지는 바람직하게 모든 성분을 혼합하고 그들을 밀링하여 생산된다. 성분의 밀링은 밀링에 의하여 건조 분말화 세포 배양 배지를 생산하는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게, 모든 성분은 철저하게 혼합되어서 혼합물의 모든 부분이 거의 같은 조성을 갖게 된다. 조성물의 균일성이 높을수록, 균질한 세포 성장에 있어서 최종 배지의 품질이 더 양호하다.
밀링은 분말화 세포 배양 배지를 생산하는데 적합한 임의 유형의 밀에 의해 수행될 수 있다. 전형적인 예에는 볼밀, 핀밀, 피츠밀 또는 제트밀이 있다. 바람직한 것은 핀밀, 피츠밀 또는 제트밀이고, 매우 바람직한 것은 핀밀이다.
당업자는 이러한 밀을 작동시키는 방법에 관해 알고 있다.
밀링된 분말화 배지의 사용을 위해, 용매, 바람직하게 물 (가장 특히 증류되고/되거나 탈이온화된 물 또는 정제된 물 또는 주사용 물) 또는 수성 완충액이 배지에 첨가되고 성분은 배지가 용매에 완전하게 용해될 때까지 혼합된다.
용매는 또한 염수, 적합한 pH 범위 (전형적으로 pH 1.0 내지 pH 10.0의 범위)를 제공하는 가용성 산 또는 염기 이온, 안정화제, 계면활성제, 보존제, 및 알콜 또는 다른 극성 유기 용매를 포함할 수 있다.
pH의 조정을 위한 완충액 물질, 태아 소 혈청, 당류 등과 같은 추가 물질을 세포 배양 배지 및 용매의 혼합물에 첨가하는 것이 또한 가능하다. 그후에 최종 액상 세포 배양 배지는 성장 또는 유지시키려는 세포와 접촉된다.
본 발명에 따른 방법으로 처리하려는 세포는 정상 세포, 불멸화 세포, 질환 세포, 형질전환 세포, 돌연변이체 세포, 체액 세포, 생식 세포, 줄기 세포, 전구체 세포 또는 배아 세포일 수 있고, 임의의 이들 세포는 확립되거나 또는 형질전환된 세포주일 수 있거나 또는 천연 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 세포는 포유동물 세포이고, 보다 바람직하게는 BHK, VERO, HEK 또는 CHO 세포, 가장 바람직하게는 CHO-S, CHO dhfr- (DG44 및 Duxb11), CHO-M 및 CHOK1 세포이다.
세포 배양 배지, 특히 완전 배지는 전형적으로 적어도 하나 이상의 사카라이드 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함한다.
배지는 또한 소듐 피루베이트, 인슐린, 식물성 단백질, 지방산 및/또는 지방산 유도체 및/또는 플루론산 및/또는 표면 활성 성분 예컨대 화학적으로 제조된 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 적합한 비이온성 계면활성제의 일례는 예를 들어 BASF (Germany)에서 상표명 pluronic® 하에 입수할 수 있는, 폴록사머라고도 하는 1차 히드록실 기로 종결된 이작용성 블록 공중합체 계면활성제이다.
사카라이드 성분은 또한 모든 단당류 또는 이당류, 예컨대 글루코스, 갈락토스, 리보스 또는 프룩토스 (단당류의 예) 또는 수크로스, 락토스 또는 말토스 (이당류의 예)가 있다.
본 발명에 따른 아미노산의 예에는 티로신, 단백질형성성 아미노산, 특히 필수 아미노산, 류신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린 뿐만 아니라, 비단백질형성성 아미노산 예컨대 D-아미노산이 있다.
티로신은 L-티로신 또는 D-티로신, 바람직하게 L-티로신을 의미한다.
시스테인은 L-시스테인 또는 D-시스테인, 바람직하게 L-시스테인을 의미한다.
비타민의 예에는 비타민 A (레티놀, 레티날, 다양한 레티노이드, 및 4 카로테노이드), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신, 니아신아미드), 비타민 B5 (판토텐산), 비타민 B6 (피리독신, 피리독사민, 피리독살), 비타민 B7 (바이오틴), 비타민 B9 (폴산, 폴린산), 비타민 B12 (시아노코발라민, 히드록시코발라민, 메틸코발라민), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤), 비타민 E (토코페롤, 토코트리에놀) 및 비타민 K (필로퀴논, 메나퀴논)가 있다. 비타민 전구체가 또한 포함된다.
염의 예에는 무기 이온 예컨대 바이카보네이트, 칼슘, 클로라이드, 마그네슘, 포스페이트, 포타슘 및 소듐 또는 미량 원소 예컨대 Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V 및 Zn을 포함하는 성분이 있다. 예로는 구리(II) 술페이트 펜타히드레이트 (CuSO4 .5H2O), 소듐 클로라이드 (NaCl), 칼슘 클로라이드 (CaCl2 .2H2O), 포타슘 클로라이드 (KCl), 철(II)술페이트, 소듐 포스페이트 일염기성 무수물 (NaH2PO4), 마그네슘 술페이트 무수물 (MgSO4), 소듐 포스페이트 이염기성 무수물 (Na2HPO4), 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트 (MgCl2 .6H2O), 아연 술페이트 헵타히드레이트가 있다.
완충제의 예에는 CO2/HCO3 (카보네이트), 포스페이트, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS 및 TRIS가 있다.
보조인자의 예에는 티아민 유도체, 바이오틴, 비타민 C, NAD/NADP, 코발라민, 플라빈 모노뉴클레오티드 및 유도체, 글루타티온, 헴 뉴클레오티드 포스페이트 및 유도체가 있다.
본 발명에 따른, 핵산 성분은 핵염기, 예컨대 시토신, 구아닌, 아데닌, 티민 또는 우라실, 뉴클레오시드 예컨대 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 티미딘, 및 뉴클레오티드 예컨대 아데노신 모노포스페이트 또는 아데노신 디포스페이트 또는 아데노신 트리포스페이트이다.
공급 배지는 완전 배지와 비교하여 상이한 조성을 가질 수 있다. 그들은 전형적으로 아미노산, 미량 원소 및 비타민을 포함한다. 그들은 또한 사카라이드 성분을 포함할 수 있지만 때때로 생산 이유 때문에 사카라이드 성분은 개별 공급으로 첨가된다.
본 발명의 방법에 따라서 사용하려는 적합한 공급 배지는 예를 들어, S-술포시스테인 이외에도, 시스테인 또는 시스틴이 아닌, 하기 화합물 중 하나 이상을 포함할 수도 있다:
L-아스파라긴 모노히드레이트
L-이소류신
L-페닐알라닌
소듐 L-글루타메이트 모노히드레이트
L-류신
L-트레오닌
L-리신 모노히드로클로라이드
L-프롤린
L-세린
L-아르기닌 모노히드로클로라이드
L-히스티딘 모노히드로클로라이드 모노히드레이트
L-메티오닌
L-발린
모노-소듐-L-아스파테이트-모노히드레이트
L-트립토판
콜린 클로라이드
미오-이노시톨
니코틴아미드
칼슘-D(+) 판토테네이트
피리독신 히드로클로라이드
티아민 클로라이드 히드로클로라이드
비타민 B12 (시아노코발라민) 미분화
바이오틴
폴산
리보플라빈
마그네슘 술페이트 무수물
구리(II) 술페이트 펜타히드레이트
아연 술페이트 헵타히드레이트
1,4-디아미노부탄 디히드로클로라이드
암모늄 헵타몰리브데이트 테트라히드레이트
카드뮴 술페이트 히드레이트
망간(II) 클로라이드 테트라히드레이트
니켈(II) 클로라이드 헥사히드레이트
소듐 메타 실리케이트
소듐 메타바나데이트
주석(II) 클로라이드 디히드레이트
소듐 셀레나이트 (약 45% SE)
소듐 디히드로겐 포스페이트 모노히드레이트
암모늄 철(III) 시트레이트 (약 18% FE)
본 발명의 요지는 시스테인 및/또는 시스틴을 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체하여 세포 배양으로 생산되는 단백질 또는 바람직하게 IgG에 존재하는 트리술파이드 결합의 양을 감소시키는 것이다.
상기 단백질, 특히 항체의 경쇄와 중쇄 사이에서 트리술파이드 연결 형성은 공급물 중 시스테인 및/또는 시스틴을 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체하지 않은 세포 배양과 비교하여, 효율적으로, 전형적으로 75%를 초과하여 감소시킨다는 것을 확인하였다.
놀랍게도, 다른 트리술파이드 형성의 감소가 확인되었다. 상기 단백질, 특히 항체에서, 중쇄의 시스테인 259와 시스테인 319 사이의 연결에서 트리술파이드 형성이 확인되었고 이것은 또한 본 발명의 방법에 의해 감소시킬 수 있었다.
본 발명에 따라서 시스테인 및/또는 시스틴 대신 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급 배지로 처리하려는 세포는 전형적으로 생물약제 생산 목적을 위해 생물반응기에서 배양되는 세포이다.
S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 시스테인 및/또는 시스틴의 첨가와 비슷하게, 세포 배양의 임의 단계에서 세포에 첨가될 수 있다.
이것은 세포 배양을 시작할 때 첨가될 수 있다. 이러한 경우에서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 바람직하게 세포 배양을 시작하는데 사용되는 기본 배지의 다른 성분들과 혼합되어 밀링된다. S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 이러한 건조 분말 혼합물은 이후에 분말과 용매를 혼합함으로써 적합한 용매에 용해되어서 분말이 용해되어 배지 성분의 바람직하고 균질한 농도의 액상 세포 배양 배지를 생성시킨다.
S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 또한 세포의 배양 동안 1회 이상 첨가될 수 있다. 세포 배양은 전형적으로 1주 내지 3주 동안 수행된다. 이 시간 동안 공급 배지는 연속적으로 또는 1회 이상 첨가된다. S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 다른 공급 배지 성분들과 함께 공급 배지 중의 배양물에 첨가될 수 있거나 또는 오직 S-술포시스테인 및/또는 이의 염만을 포함하는 개별 공급으로 첨가될 수 있다. 또한 공급물은 전형적으로 액상이어서 공급물의 모든 성분이 세포 배양물에 첨가 이전에 적합한 용매에 용해된다.
바람직한 구체예에서, 세포 배양은 시스테인 및/또는 시스틴을 포함하지만 S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 포함하지 않는 기본 배지로 시작하여 S-술포시스테인 및/또는 이의 염이 공급물로서 첨가된다. 바람직하게 세포 배양 동안 적어도 4회, 바람직하게 4회 내지 6회 첨가된다.
일 구체예에서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 2일 내지 4일 마다 첨가된다.
S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급물의 pH는 전형적으로 5 내지 7.5, 바람직하게 6.8 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.8 내지 7.1이다.
전형적으로 세포 배양은
a) 생물반응기를 제공하는 단계
b) 생물반응기 내 액상 세포 배양 배지와 배양하려는 세포를 혼합하는 단계,
c) 일정 시간 동안 단계 b)의 혼합물을 인큐베이션시키고 그로써 S-술포시스테인을 포함하지만 시스틴 또는 시스테인을 유의한 양으로 포함하지 않고, 바람직하게 전혀 포함하지 않는 공급 배지를 이 시간 동안 적어도 1회 첨가하는 것인 단계에 의해 수행된다.
생물반응기는 세포를 배양할 수 있는 임의 용기, 백, 베슬 또는 탱크이다. 세포 배양의 수행은 당업자에게 공지되어 있다. 이것은 전형적으로 pH, 삼투압, 온도, 교반, 통기 (산소/CO2) 등과 같은 적합한 조건 하에 생물반응기에서 세포의 인큐베이션, 및 세포 배양 동안 1회 또는 수회 공급 배지의 임의 첨가를 통해서 수행된다. 바람직하게, 세포 배양은 유가식 세포 배양으로서 수행된다.
유가식 배양은 하나 이상의 영양분 (기질)이 세포의 배양 동안 생물반응기에 공급(제공)되고 생성물(들)이 작업 종료까지 생물반응기에 잔류하는 세포 배양 공정이다. 방법의 대안적인 설명은 기본 배지가 초기 세포 배양을 지원하고 공급 배지가 영양분 고갈을 방지하도록 첨가되는 배양이다. 유가식 배양의 장점은 임의의 바람직한 수준으로 배양 액체 중 공급-기질의 농도를 제어할 수 있다는 것이다.
일반적으로 말해서, 유가식 배양은 영양분 (또는 영양분들)의 농도 제어가 바람직한 대사산물, 예컨대 이 경우에서는 S-술포시스테인 및/또는 이의 염의 균질성 또는 수율에 영향을 미칠 경우 통상의 회분식 배양보다 우수하다.
결과적으로, 바람직하게, 본 발명은
- 생물반응기에 세포 및 액상 세포 배양 배지를 충전하는 단계
- 생물반응기에서 세포를 인큐베이션시키는 단계
- 생물반응기 내 세포의 전체 인큐베이션 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 상기 인큐베이션 시간 내에서 1회 또는 수회, 이 경우에는 공급 배지인 세포 배양 배지를 생물반응기에 첨가하는 단계에 의해 수행되고,
상기 공급 배지는 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하지만, 시스테인 및/또는 시스틴은 유의한 양으로 포함하지 않고, 바람직하게는 전혀 함유하지 않으며, 바람직하게 6.8 내지 7.5의 pH를 갖는다.
트리술파이드 결합 양의 감소는 세포 배양이 시스테인 및/또는 시스틴을 가능한 적게 함유할수록 특히 효과적이라는 것을 확인하였다. 그 결과로서, 세포가 S-술포시스테인 및/또는 이의 염 단독에서 성장할 수 있다면, 바람직하게, 세포 배양은 임의의 시스테인 및/또는 시스틴을 포함하지 않는다. 일부 세포의 경우, 그들이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하지만 임의의 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하지 않는 배지에서 충분한 성능 및/또는 성장을 보이지 않기 때문에 기본 배지가 시스테인 및/또는 시스테인을 포함하는 것을 필요로 한다. 이러한 경우에서, 바람직하게, 기본 배지는 시스테인 및/또는 시스틴을 포함하고 배양 동안 첨가되는 공급 배지는 임의의 추가적인 시스테인 및/또는 시스틴을 포함하지 않는다.
하나 또는 몇가지 유형의 공급 배지가 세포 배양에 첨가될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 단일 공급 전략이 사용되면, 오직 한 가지 유형의 공급 배지가 세포 배양 동안 연속적으로, 또는 1회 또는 수회, 세포 배양에 첨가된다. 본 발명의 방법에 따라서, 이러한 단일 공급 배지는 임의의 유의한 양의 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하지 않으나 대체물로서 S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 함유한다. 몇몇 상이한 공급 배지가 세포 배양에 첨가되면, 본 발명의 방법에 따라서, 바람직하게, 이들 공급 배지 중 어떠한 것도 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하지 않는다. 모든 공급 배지가 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 함유할 필요는 없다. 예를 들어 비타민, 미량 원소 및 아미노산 뿐만 아니라 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급물, 및 다른 회차에 제2 공급물로서, 예를 들어 바람직하게 임의의 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하지 않는 탄수화물 공급물인 제2 공급물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 임의 경우에서, 세포 배양 동안 적어도 1회, 시스테인 및/또는 시스틴을 임의의 유의한 양으로 함유하지 않거나 또는 바람직하게 전혀 함유하지 않지만 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급물이 첨가된다.
본 발명의 방법에 따라서, 트리술파이드의 양은 효과적으로 감소될 수 있다는 것을 확인하였다. 바람직하게, 경쇄와 중쇄 사이의 트리술파이드 형성을 감소시킬 수 있다. 이러한 트리술파이드 형성은 공급 배지 중 시스틴 및/또는 시스테인이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체되지 않은 세포 배양 공정과 비교하여 75% 초과로, 바람직하게 85% 초과로 감소될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 처리되고 트리술파이드 결합 형성이 감소된 단백질은 진단 어세이, 면역어세이 및/또는 약학 조성물에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 단백질, 예를 들어 항체는 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 저장 안정성을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법으로 처리된 단백질, 예를 들어 항체는 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 응집 경향을 갖는다. 여전히 다른 구체예에서, 본 발명의 방법으로 단백질, 예를 들어 항체의 처리는 그 결과로 미처리 대조군과 비교하여 산화, 예를 들어 메티오닌 산화가 감소된다.
그러므로, 본 발명은 또한 단백질의 조성물 중 트리술파이드의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 단백질, 예를 들어 항체의 조성물에서 단백질 산화, 예를 들어 메티오닌 산화를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 구체예는 단백질의 조성물 중 트리술파이드의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 단백질, 예를 들어 항체의 조성물에서 단백질 응집을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 구체예는 단백질, 예를 들어 항체의 조성물 중 단백질 안정성을 증가시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 단백질의 조성물 중 트리술파이드의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
다른 구체예는 상기 기술된 공정 단계를 수행하여 항체 내 트리술파이드 결합을 디술파이드 결합으로 전환시킴으로써, 장기간 단백질 및 항체 저장 안정성을 증가시키거나 또는 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 더욱 예시되지만, 이에 제한되는 것이 아니다.
상기 및 하기에 인용된 모든 출원, 특히, 및 공개물의 전체 개시 내용 뿐만 아니라 2016년 4월 28일에 출원된 해당 특허 출원 EP 16167461.9는 참조로 본 명세서에 편입된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실질적인 적용을 대표한다.
1. 프로토콜
a. 유가식 공정
IgG1을 발현하는 재조합 CHO 세포를 1.5 mM 시스테인을 함유하는 완전하게 화학적으로 한정된 기본 배지 (Cellvento ® CHO 220)에서 성장시켰다. 3일, 5일, 7일, 10일, 14일에, 시스테인 또는 S-술포시스테인을 함유하는 공급물(들)을 첨가하였다.
대조군 조건의 경우, 주요 공급물은 시스테인을 제외한 (이 아미노산의 낮은 안정성 때문에) 아미노산, 미량 원소, 및 비타민을 포함하였다. 150 mM의 시스테인을 pH 11에서 개별 공급으로 용해시켰다. 주요 공급물은 3%, 6%, 6%, 6% 및 6% (v/v)로 첨가한데 반해 시스테인은 0.3%, 0.6%, 0.6%, 0.6% 및 0.6%로 3일, 5일, 7일, 10일 및 14일에 각각 첨가하였다.
SSC 조건의 경우, 주요 공급물은 동일한 비타민, 미량 원소 및 아미노산을 포함하였고 15 mM의 S-술포시스테인 디-소듐 염을 더 보충하였다. 주요 공급물은 3%, 6%, 6%, 6% 및 6% (v/v)로 3일, 5일, 7일, 10일 및 14일에 각각 첨가하였고, 그 결과로 대조군 조건과 비교했을 때 동일한 양의 시스테인 공급원이 되었다.
글루코스는 양쪽 조건에 대해서 1일 단위로 모니터링되었고 400 g/ℓ 용액을 사용하여 6 g/ℓ로 조정하였다.
공정은 1.2 L 생물반응기 중에서 37℃, pH 7.0, 50% 용존 산소, 140 rpm에서의 교반으로 수행되었다.
13일 및 18일에 트리술파이드 분석을 위해 생물반응기로부터 샘플을 채취하였다. 샘플채취 후에, 세포 배양 상청액을 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였고, IgG 농도는 자동 혼탁도측정 방법 (Cedex bioHT)을 사용해 정량하고 후속 처리를 위해 냉동시켰다.
b. 세포 배양 상청액으로부터 IgG 정제
IgG는 단백질 A 결합 (Phytips 방법)을 사용해 냉동 샘플로부터 정제하였고 200 mM NAH2PO4; 140 mM NaCl 및 96 mM Tris HCl에서 용리하고 다시 정량하였다.
c. IgG로부터 펩티드 생성
먼저, 샘플 중 자유 시스테인을 30분간 암실에서 N-에틸말레이미드 (0.1 M Na 아세테이트 완충액 pH 5.0 중 10 mM 용액)를 첨가하여 알킬화시켰다.
Lys-C로 분해를 위해서, 55 ㎕ 분해 완충액 (8 M 우레아, 0.1 M Tris, pH 7) 및 15 ㎕ Lys-C 효소 (Promega, V1671)를 첨가하였고 샘플을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 후속하여, 샘플을 468 ㎕ 분해 완충액을 첨가하여 1 M 우레아로 희석하였고 12 ㎕ 트립신을 첨가하여 밤새 37℃에서 분해시켰다. 최종 항체 농도는 50 mg/ℓ였다. 디술파이드 및 트리술파이드 결합의 분석을 위해서, 샘플을 10% 포름산 (4.4 ㎕)을 첨가하여 분해를 중지시키고 LC-MS로 분석하였다.
d. LC-MS/MS 방법
수득된 펩티드 혼합물을 주입하고 역상 HPLC (RSLC3000 nano LC, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany)를 사용해 분리하였다. nanoLC 컬럼 (Acquity UPLC M-Class HSS T3, 1.8 μm, 75 μm x 150 mm, Waters)과 카트리지 (PM100, C18, 5 μm, 0,3x5 mm, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany)를 샘플의 사전농축 및 분리에 사용하였다. 블랭크 작업 및 컬럼 세척 작업은 연속 샘플 작업 내에서 수행되었다.
다양한 기울기의 최적화된 26분 선형 구배를 다음과 같이 50℃에서 적용하였다 (분/%B): 0/2, 0.25/2, 8/16, 20/29, 26.25/45, 27.25/99, 30.25/99, 31.25/20 32.25/20, 33.25/99, 34.25/99, 35.25/2, 38/2. 주입량은 5 내지 7 ㎕ (∼0.35 ㎍)였다. 샘플을 0.25분 동안 카트리지 상에 120 ㎕/분의 유속으로 적재하였다. 적재 동안, 97.95% 물, 2% 아세토니트릴 및 0.05% TFA로 구성된 용리액을 사용하였다. 후속하여, 밸브를 교체하고, 샘플을 분석 컬럼으로 전달하였고 0.6 ㎕/분의 유속을 사용하여 분리하였다. HPLC 용리액을 QExactive 플러스 질량 분광분석계 (Thermo scientific, Bremen, Germany)에 직접 주입하였다. 질량 분광분석계는 포지티브 이온 모드로 작동시켰고, 스프레이 전압은 1.9 kV였고, 모세관 온도는 275℃ 였으며 S-Lens RF 전압은 55 V였다. MS/MS 생성물 이온 스캔의 경우, 활성화 유형은 충돌-유도 해리 (CID)였고, 디폴트 전하 상태는 2였다. 적용된 4-스캔-이벤트 QExactive 방법은 m/z 200-2000 및 70 000의 해상력 (RP)에서 완전 MS 서베이 스캔에 후속하여 상위 3 최고 강도 이온 상에서 3회의 데이타-의존적 MS/MS 스캔으로 이루어진다. 동적 배제 기능이 가능하였고 변수는 다음과 같았다: 10초의 동적 배제, 2 m/z의 단리창, 17 500의 해상도, 3e6의 AGC 표적, 250 msec의 최대 주입 시간, 25의 정규화 충돌 에너지, 0.1%의 언더필 비율, 1.2e4의 강도 한계치. 비지정 전하 상태 및 전하 상태 ≥ 8을 MS/MS 촉발을 위해 거부하였고 폴리실록산 이온을 함유하는 거부 질량 목록이 가능하였다. 동적 배제는 10 s였다. 반복 작업을 전하 상태 +1 배제와 함께 그리고 없이 수행하였다. 데이타 처리를 위해서 각각 분석하려는 항체의 경쇄 및 중쇄의 서열을 함유하는 인 하우스 단백질 데이타베이스를 기반으로 Mascot 2.3 오류 내성 검색 (Matrix Science London, UK)을 사용하였다. MS/MS 스펙트럼은 데이타베이스 검색 이전에 MS2 프로세서를 사용하여 전하 디컨볼루션하였고 Mascot 설정을 조정하여 소형 펩티드의 동정을 가능하게 하였다: 검색에서 시험되고 보고에서 입증된 최단 길이 펩티드는 4개 아미노산으로 설정되었다. Mascot 검색 변수는 다음과 같다: 효소는 트립신임, 2회의 손실된 절단은 허용됨, 트립신 분해를 위한 고정된 변형 카바미도메틸화, 펩티드 허용오차: 6 ppm, MS/MS 허용오차 0.05 Da, 펩티드 전하 +2, +3, +4, 오류 내성 검색 활성화, 최소 이온 점수 15.
2. 결과
도 2 - 5는 각각 13일 및 18일에 IgG 의 경쇄와 중쇄 사이 (LC-HC) 뿐만 아니라 HC 의 2개 시스테인 잔기 사이 (HC_cys259-Cys319) 의 트리술파이드 형성의 정량 결과를 보여준다.
트리술파이드 연결된 펩티드의 상대적 백분율은 트리술파이드 연결된 펩티드의 면적을 트리술파이드 및 디술파이드 연결된 펩티드의 면적합으로 나누어 계산하였다.
결과는 개별 공급으로 시스테인을 사용해 생산된 대조군 샘플 중 LC-HC 연결된 펩티드에 최고량의 트리술파이드가 존재한다는 것을 의미한다. 트리술파이드의 양은 SSC 공급을 사용해 생산된 샘플에서 감소된다. 트리술파이드의 평균 감소율은 대조군 조건과 비교시 13일에 93.3%였고 18일에 92.4%였다.
3자릿수 더 낮게, 우리는 중쇄의 시스테인 259와 시스테인 319 사이의 연결에서 트리술파이드 형성의 증거를 확인하였다. 상대적인 양이 매우 낮지만, 데이타는 고도로 일관적이며 LC-HC 연결 사이에서 트리술파이드 형성에 대해 관찰된 경향을 입증하였다. 트리술파이드의 양은 SSC 공급을 사용해 생산된 샘플에서 감소된다. 트리술파이드의 평균 감소율은 대조군 조건과 비교시 SSC를 사용하는 경우 13일에 46.7%였고 18일에 25.9%이다.
도 6은 디술파이드 브릿지를 갖는 LC-HC 연결과 트리술파이드 브릿지를 갖는 LC-HC 연결 간 상관성을 보여주는 추출 이온 크로마토그래피의 오버레이를 도시한다.
도 6은 개별 공급으로 시스테인을 사용하는 대조군 FB (연회색)에서의 LC-HC 연결과 비교시 디술파이드 연결된 펩티드에 대해서 SSC를 사용한 FB (진회색)에서 LC-HC 연결 중 트리술파이드 형성의 상대적 감소를 예시한다.

Claims (11)

  1. 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법으로서,
    임의의 유의한 양의 시스테인 또는 시스틴을 함유하지 않으나 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급 배지를 세포 배양 동안 1회 이상 세포 배양물에 첨가하여 상기 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 그리하여 상기 단백질 내 트리술파이드 연결 형성이 공급 배지 내 시스테인 및/또는 시스틴이 S-술포시스테인 및/또는 이의 염으로 대체되지 않은 세포 배양 배지에서 배양된 세포에 의해 발현되는 단백질에 비해 감소되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염은 S-술포시스테인 소듐 염인 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, S-술포시스테인 및/또는 S-술포시스테인 염은 세포 배양물 중 그들 농도가 0.4 내지 50 mM이 되도록 하는 양으로 공급 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 적어도 하나 이상의 사카라이드 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하는 공급물의 pH는 6.8 내지 7.5인 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 배지는 S-술포시스테인 및/또는 S-술포시스테인 염 뿐만 아니라 비타민, 미량 원소 및 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 경쇄 및 중쇄 사이의 트리술파이드 연결 형성이 감소되는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 중쇄 내 시스테인 259 및 시스테인 319 사이의 연결에서 트리술파이드 형성이 감소되는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은
    - 생물반응기에 세포 및 액상 세포 배양 배지를 충전시키는 단계
    - 세포를 생물반응기에서 인큐베이션시키는 단계
    - 생물반응기에서 세포의 전체 인큐베이션 시간 동안 연속적으로 또는 상기 인큐베이션 시간 내에 1회 또는 수 회로, 이 경우에는 공급 배지인 세포 배양 배지를 생물반응기에 첨가하는 단계
    에 의해 수행되고,
    상기 공급 배지는 S-술포시스테인 및/또는 이의 염을 포함하고 유의한 양의 시스테인 및/또는 시스틴을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 배지는 1 내지 100 mmol/ℓ의 농도로 S-술포시스테인 및/또는 S-술포시스테인 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 반응기에서 세포의 전체 인큐베이션 시간 동안 시스테인 및/또는 시스틴을 함유하는 공급 배지가 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는, 단백질 내 트리술파이드 결합의 형성을 감소시키는 방법.
KR1020187033842A 2016-04-28 2017-04-25 단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법 KR102425040B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16167461.9 2016-04-28
EP16167461 2016-04-28
PCT/EP2017/059691 WO2017186654A1 (en) 2016-04-28 2017-04-25 Method for reducing the trisulfide level in proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190003603A true KR20190003603A (ko) 2019-01-09
KR102425040B1 KR102425040B1 (ko) 2022-07-25

Family

ID=56008475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187033842A KR102425040B1 (ko) 2016-04-28 2017-04-25 단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11220668B2 (ko)
EP (1) EP3448871B1 (ko)
JP (1) JP7253381B2 (ko)
KR (1) KR102425040B1 (ko)
CN (1) CN109071595A (ko)
ES (1) ES2967868T3 (ko)
SG (2) SG11201809408SA (ko)
WO (1) WO2017186654A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201708655D0 (en) * 2017-05-31 2017-07-12 Ucb Biopharma Sprl Cell culture methods
EP3492582A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-05 UCB Biopharma SPRL Cell culture methods
CN117534728A (zh) * 2024-01-10 2024-02-09 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 一种奥曲肽三硫键杂质e的制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2483289T3 (da) 2009-10-02 2019-06-11 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder til forebyggelse og fjernelse af trisulfidbindinger
KR20120107793A (ko) 2011-03-22 2012-10-04 엘지이노텍 주식회사 표시장치 및 광 변환 부재
EP2707383B1 (en) 2011-05-13 2018-04-18 Biogen MA Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
AR093460A1 (es) * 2012-11-14 2015-06-10 Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung Medios de cultivo celular
EP3328410B1 (en) 2015-07-30 2020-09-23 Merck Patent GmbH Method for increasing the glutathione level in cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hecklau, C., et al., Journal of Biotechnology, vol. 218, pp. 53-63 (2015.12.02.) 1부.* *
Kshirsagar, R., et al., Biotechnology and Bioengineering, vol. 109, no. 10, pp. 2523-2532 (2012.04.09.) 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
US11220668B2 (en) 2022-01-11
EP3448871B1 (en) 2023-10-11
JP7253381B2 (ja) 2023-04-06
SG10202010606YA (en) 2020-11-27
KR102425040B1 (ko) 2022-07-25
WO2017186654A1 (en) 2017-11-02
SG11201809408SA (en) 2018-11-29
ES2967868T3 (es) 2024-05-06
CN109071595A (zh) 2018-12-21
US20200255796A1 (en) 2020-08-13
EP3448871A1 (en) 2019-03-06
JP2019514918A (ja) 2019-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104812891B (zh) 细胞培养基
KR102425040B1 (ko) 단백질 내 트리술파이드 수준을 감소시키기 위한 방법
EP3328410B1 (en) Method for increasing the glutathione level in cells
CN104395459A (zh) 用于产生细胞培养基的方法
JP2022527582A (ja) ケト酸を含む細胞培養培地
KR20240004718A (ko) 스페솔리맙의 제조방법
EP4077371B1 (en) Methods and compositions for modulating the glycosylation profile of proteins
KR20220097972A (ko) 세포 배양 배지
Knox et al. Structural characterization of cobalamin-dependent radical S-adenosylmethionine methylases

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant