KR20180135912A - 개선된 제형을 이용한 알파바이러스의 안정화 조성물 및 방법 - Google Patents
개선된 제형을 이용한 알파바이러스의 안정화 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에서 구현예는 살아있는 알파바이러스를 안정화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 다른 구현예는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 분해를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예는 개선된 제형을 제공함으로써 살아있는 알파바이러스를 안정화시키는 부형제에 대상체에서 면역 반응을 감소시키면서 안정화 조성물 제공에 관한 것이다. 더욱 다른 구현예는 조성물이 상기 살아있는 알파바이러스의 분해를 감소시키는 방법 그리고 휴대용 응용을 위한 키트에서 본 명세서에서 개시된 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
우선권
본 PCT 출원은, 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입되는, 2016년 3월 31일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/316,262의 35 USC § 119(e)하에 이점을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 인가 R01AI093491하에 정부 지원으로 작성되었다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
분야
본 명세서에서 구현예는 알파바이러스를 안정화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물 및 방법은 살아있는 알파바이러스의 안정화 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정화에 관한 것이다. 다른 구현예는 알파바이러스의 분해를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 다른 구현예는 대상체에게 본 명세서에서 개시된 조성물의 안정화 및 전달을 위하여 개선된 제형을 제공함으로써 살아있는, 약독화된 또는 살아있는 알파바이러스에 대하여 부형제에 대상체에서 감소된 면역 반응으로 살아있는, 약독화된 또는 살아있는 알파바이러스에 제형을 제공하는 것에 관한 것이다. 다른 구현예는 인간 또는 다른 포유류-유래된 부산물 예컨대 단백질을 갖지 않는 HEPES 완충액에서 만니톨, 히스티딘 및 수크로스에 대한 제형에 관한 것이다. 더욱 다른 구현예는 휴대용 응용 및 방법을 위하여 키트에서 사용하는 알파바이러스 제형에 관한 것이다.
바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 백신은 인간 또는 동물 바이러스 질환의 발병률을 감소시키기 위해 효과적으로 사용되어 왔다. 바이러스 백신에 대하여 가장 성공적인 기술 중 하나는 상기 표적 바이러스 ("살아있는, 약독화된 바이러스")의 약화된 또는 약독화된 균주로 동물 또는 인간을 면역화시키는 것이다. 대상체의 면역화 후 제한된 복제로 인해, 약독화된 균주는 숙주상에 중복 및 통과될 수 없기 때문에 바이러스성-관련된 질환을 야기시키지 않는다. 그러나, 약독화된 바이러스는 여전히 바이러스 항원을 발현시킬 수 있고 노출된 대상체에서 바이러스에 강력한 및 오래 지속되는 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 따라서, 바이러스에 후속적인 노출시, 면역화된 개체는 바이러스 감염에 관련된 질환 발생의 감소된 기회를 갖는다.
살아있는, 약독화된 바이러스가 백신에서 효과적이기 위해, 살아있는, 약독화된 바이러스는 면역화 후 복제할 수 있어야 하고 바이러스 자체는 효과적으로 및 정확하게 사용되기 위해 분해로부터 보호되어야 한다. 일부 백신은 온도 극단에 감수성이고; 어느 한쪽 과도한 열 또는 우연한 냉동은 바이러스를 비활성화시킬 수 있다. 분포 내내 효과성 및 보호성 환경 유지는 개발도상국가에서 또는 오지에서 환자 치료 경우 특히 어렵다.
본 명세서에서 구현예는 살아있는, 알파바이러스를 안정화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 다른 구현예는 알파바이러스에 의해 야기된 감염에 대해 대상체 면역화용 면역원성 조성물에서 사용하는 살아있는, 약독화된 알파바이러스를 안정화시키기 위한 및/또는 분해를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 다른 구현예는 살아있는, 약독화된 알파바이러스를 안정화시키는 부형제에 대상체에서 면역 반응을 감소시키기 위해 인간 또는 다른 포유류 부산물을 함유하지 않는 안정화 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 안정화 제형은 대상체에서 알파바이러스 감염에 대해 면역원성 조성물로서 사용된 경우 동물 부산물을 함유하지 않는다. 더욱 다른 구현예는 휴대용 응용 및 방법용 키트에서 본 명세서에서 개시된 안정화 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 특정 조성물은 대상체에게 투여된 경우 대상체에 의해 감소된 알러지성 반응을 갖는 제형을 제공하면서 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 분해를 감소시키는 성분의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 특정 제형은 면역원성 알파바이러스 제형에서 사용하는 알파바이러스를 안정화시키는데 사용된 원료의 순도를 고려함으로써 면역원성 알파바이러스 제형의 안전성의 더 높은 수준을 제공하도록 설계되었다. 과거의 일부 제형은 바이러스 안정화를 위하여 동물-유래된 부형제 및 다른 제제를 사용한다. 특정 상황에서, 일부의 이들 동물-유래된 부형제 및 단백질은 이들 제제에 노출된 경우 대상체에서 역반응을 야기시킬 수 있는 이질적인 제제 (예를 들면 BSE 또는 알러지항원)을 운반할 수 있다. 인간 또는 다른 포유류-유래된 부형제가 없는 제형은 대상체에 미공지된 또는 불안한 제제 (예를 들면 이들 제제와 관련된 불순물) 도입의 위험을 감소시킨다. 동물-유래된 제제-함유 제형을 안정화시키는 뿐만 아니라, 또는 상기보다 더 나은 동물-유래된 제제-없는 제형은 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 개시된 다른 구현예는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성을 크게 향상시키는 부형제의 조합에 관한 것이다. 추가의 구현예는 오지에 바이러스 제형의 안정화된 이송을 용이하게 하기 위해 더 낮은 온도 (예를 들면 냉장된 또는 냉동된 저장)에 대하여 필요성을 감소시키기 위한 그리고 저장의 모든 온도 범위에서 바이러스 제형의 안정성을 향상시키기 위한 다른 조성물 및 방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물 및 방법은 이들 조성물을 함유하지 않는 다른 제형에 비교하여 조성물의 재현탁 시간 감소, 및/또는 생리적 특성 개선 뿐만 아니라 수성 및/또는 재구성된 살아있는 알파바이러스의 저장수명 증가에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 제형은 액체, 냉동된, 동결건조된 및 재-수화된 제형에서 바이러스 역가의 손실로부터 안정화 효과를 부여할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은, 비제한적으로, 하나 이상의 살아있는 알파바이러스, HEPES 완충액, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 탄수화물 제제를 포함하는 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안정화 조성물은 HEPES 완충액에서 살아있는 알파바이러스, 히스티딘을 포함하는 아미노산, 및 하나 이상의 수크로스 및 만니톨을 포함하는 하나 이상의 탄수화물 제제를 포함할 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, 살아있는 알파바이러스 제형은 히스티딘, 만니톨 및 수크로스를 가진 HEPES 기반 완충액에서 살아있는, 알파바이러스를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 알파바이러스 제형은, 비제한적으로, 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 만니톨, 히스티딘, 및/또는 수크로스를 갖는 완충액에서 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 완충액 예컨대 베이스 완충액은 HEPES 완충액을 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에서 완충된 HEPES는 약 1.0 내지 약 200.0 mM HEPES의 농도를 갖는 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0일 수 있고, 히스티딘은 농도 약 0.1% 내지 약 5.0% (w/v) (약 1 내지 약 50 mg/ml)일 수 있고, 수크로스는 약 0.1% 내지 약 20% (w/v) (약 1 내지 약 200 mg/mL)일 수 있고, 만니톨은 약 1.0% 내지 약 15% (w/v) (약 1 내지 약 150 mg/mL)일 수 있다. 다른 구현예에서, HEPES 완충액 농도는 약 5.0 mM 내지 약 50.0 mM, 약 10.0 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 10.0 mM 내지 약 20 mM일 수 있다.
특정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에서 알파바이러스 제형 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.5 또는 약 7.2에서 약 15 mM HEPES 완충액일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml일 수 있고, 수크로스는 약 35.0 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml일 수 있고, 만니톨은 약 25.0 mg/ml 내지 약 40.0 mg/ml일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 안정화시키기 위해 본 명세서에서 개시된 제형은 pH 7.2에서 약 15.0 mM 용액의 농도를 갖는 HEPES 완충액을 포함할 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5.0 mg/mL 내지 약 12.5 mg/mL일 수 있고, 수크로스는 약 35.0 mg/mL 내지 약 50.0 mg/mL일 수 있고, 만니톨은 약 25.0 mg/mL 내지 약 40.0 mg/mL일 수 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 다양한 조건 하에 살아있는, 약독화된 알파바이러스를 안정화시키기 위해, 비제한적으로, 수크로스, 염화나트륨, 글루탐산일나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨 및 염화칼륨을 포함하는 하나 이상의 제제와 조합될 수 있다. 이들 구현예에 따르면, HEPES 완충액은, 비제한적으로, 하나 이상의 약 1.0% 내지 약 10.0% (w/v)의 농도를 갖는 수크로스; 약 0.05% 내지 약 1.5% (w/v)의 농도를 갖는 염화나트륨; 약 0.05% 내지 약 0.5% (w/v)의 농도를 갖는 글루탐산일나트륨; 약 0.01 내지 약 0.15% (w/v)의 농도를 갖는 인산나트륨; 약 0.01% 내지 약 0.05% (w/v)의 농도를 갖는 인산칼륨; 및 약 0.005% 내지 약 0.05% (w/v)의 농도를 갖는 염화칼륨을 알파바이러스가 안정화되고 알파바이러스의 분해가 감소되는 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합으로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 살아있는 알파바이러스가 안정화되고 분해가 감소되고 저장수명이 연장되는 살아있는 알파바이러스와 조합으로 수크로스의 농도는 약 5.0% (w/v)일 수 있고; 염화나트륨은 약 0.64% (w/v)일 수 있고; 글루탐산일나트륨은 약 0.1% (w/v)일 수 있고; 인산나트륨은 약 0.09% (w/v)일 수 있고; 인산칼륨은 약 0.016% (w/v)일 수 있고; 염화칼륨은 약 0.016% (w/v)일 수 있다. 본 명세서에서 개시된 일부 구현예는 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소 방법에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 방법은, 비제한적으로, 0.1mM 내지 200.0 mM HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제 (예를 들면 단당, 당 알코올 및 기타 동종), 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 조성물과 살아있는 알파바이러스를 조합시키는 단계를, 비제한적으로, 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우, HEPES 완충액은 농도 약 1.0 mM 내지 약 200 mM에서 약 pH 6.0 내지 pH 9.0일 수 있고, 히스티딘은 약 0.1% 내지 약 5.0% (w/v)일 수 있고, 수크로스는 약 0.1% 내지 약 20% (w/v)일 수 있고, 만니톨은 약 1.0% 내지 약 10% (w/v)일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일부 구현예는 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소 방법에 관한 것일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는, 비제한적으로, 0.1 내지 200 mM HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제, 및 하나 이상의 염 제제를 포함하는 조성물과 조합될 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 알파바이러스의 분해를 감소시키기 위해 살아있는 알파바이러스와 조합된 경우 수크로스 농도는 약 1.0% 내지 약 10.0% (w/v)일 수 있고; 염화나트륨 농도는 약 0.1% 내지 약 1.5% (w/v)일 수 있고; 글루탐산일나트륨 농도는 약 0.05% 내지 약 0.5% (w/v)일 수 있고; 인산나트륨 농도는 약 0.01 내지 약 0.15% (w/v)일 수 있고; 인산칼륨 농도는 약 0.01% 내지 약 0.05% (w/v)일 수 있고; 염화칼륨 농도는 약 0.01% 내지 약 0.05% (w/v)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 살아있는 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 수크로스 농도는 약 5.0% (w/v)일 수 있고; 염화나트륨 농도는 약 0.64% (w/v)일 수 있고; 글루탐산일나트륨 농도는 약 0.1% (w/v)일 수 있고; 인산나트륨 농도는 약 0.09% (w/v)일 수 있고; 인산칼륨 농도는 약 0.016% (w/v)일 수 있고; 염화칼륨 농도는 약 0.016% (w/v)일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 동결건조된 살아있는 알파바이러스를 재구성 또는 재수화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 냉동된 내지 실온 및 기타 동종에서 다양한 온도로 탈수된 또는 동결건조된 또는 냉동된 살아있는 알파바이러스의 수송 후. 본 명세서에서 사용하는 조성물은 다양한 저장 온도에서 그리고 냉동-해동 사이클 동안 살아있는 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 비활성화 및/또는 분해를 감소 및/또는 안정화를 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물로부터 유익할 수 있는 살아있는 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스는, 비제한적으로, 코로나비리다에 및 토가비리다에 계열에서 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 서부 말 뇌염 또는 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다. 다른 셈리키 삼림열 바이러스 복합체는, 비제한적으로, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 게타 바이러스; 하위유형: 사기야마 바이러스, 및 셈리키 삼림열 바이러스: 하위유형: 메 트리 바이러스를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 다른 구현예는 본 명세서에서 고려된 하나 이상의 알파바이러스에 의해 야기된 의료 병태의 개시를 감소 또는 예방할 수 있는 백신 또는 면역원성 조성물 창출에 대한 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물의 하나 이상의 살아있는, 약독화된 바이러스는 약제학적 조성물의 일부일 수 있고 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 본 명세서에서 개시된 약제학적 조성물은 약제학적 조성물이 대상체에게 투여되는 경우 알파바이러스 감염에 의해 야기된 병태 그리고 알파바이러스의 감염의 개시를 감소시키는데 사용될 수 있다. 대상체는 포유동물 예를 들어, 사육된 동물 애완동물, 가축, 다른 동물 또는 인간 대상체 (성인 또는 아동)일 수 있다.
다른 구현예는, 비제한적으로, 컨테이너; 및 본 명세서에서 개시된 조성물을 포함하는 살아있는, 약독화된 바이러스의 비활성화 감소용 키트에 관한 것이다.
하기 도면은 본 사양의 일부를 형성하고 본 명세서에서 특정 구현예의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 구현예는 본 명세서에서 제시된 상세한 설명과 조합으로 하나 이상의 이들 도면을 참고로 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 액체 및 동결건조된 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 히스토그램 플롯이다.
도 2는 냉동-해동 처리 후 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 액체 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 히스토그램 플롯이다.
도 3은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 4는 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 5는 약 4℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 6은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
도 7은 살아있는 알파바이러스 안정화용 이들 예시적 조성물에서 포함된 제제가 만니톨, 히스티딘 및 수크로스인 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 사용하는 다양한 제제의 농도 범위를 나타내는 히스토그램이다.
도 8은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 액체 및 동결건조된 상태에서 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도 9는 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 냉동-해동 조건 하에 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도 10은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 11은 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 12는 약 4℃ 또는 약 냉동 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 13은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
도 14는 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는, 약독화된 알파바이러스에 대하여 바람직한 안정화 조성물 예측을 위하여 사용하는 제제 자체 및 다른 제제에 비교된 상이한 조건 하에서 다양한 제제의 그래프이다.
도 15는 살아있는 알파바이러스 안정화용 이들 예시적 조성물에서 포함된 제제가 만니톨, 히스티딘 및 수크로스인 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 사용하는 다양한 제제의 농도 범위를 나타내는 히스토그램이다.
도16은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 액체 및 동결건조된 상태에서 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도17은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 18은 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 19는 약 4℃ 또는 약 냉동 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 20은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
도 1은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 액체 및 동결건조된 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 히스토그램 플롯이다.
도 2는 냉동-해동 처리 후 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 액체 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 히스토그램 플롯이다.
도 3은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 4는 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 5는 약 4℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 6은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
도 7은 살아있는 알파바이러스 안정화용 이들 예시적 조성물에서 포함된 제제가 만니톨, 히스티딘 및 수크로스인 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 사용하는 다양한 제제의 농도 범위를 나타내는 히스토그램이다.
도 8은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 액체 및 동결건조된 상태에서 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도 9는 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 냉동-해동 조건 하에 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도 10은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 11은 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 12는 약 4℃ 또는 약 냉동 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 13은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
도 14는 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는, 약독화된 알파바이러스에 대하여 바람직한 안정화 조성물 예측을 위하여 사용하는 제제 자체 및 다른 제제에 비교된 상이한 조건 하에서 다양한 제제의 그래프이다.
도 15는 살아있는 알파바이러스 안정화용 이들 예시적 조성물에서 포함된 제제가 만니톨, 히스티딘 및 수크로스인 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 사용하는 다양한 제제의 농도 범위를 나타내는 히스토그램이다.
도16은 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 살아있는 알파바이러스에서 효과 시험을 위하여 액체 및 동결건조된 상태에서 본 명세서에서 개시된 다양한 조성물을 이용하는 실험을 나타내는 히스토그램이다.
도17은 약 40℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 18은 약 25℃에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 19는 약 4℃ 또는 약 냉동 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 다양한 제형내 예시적 살아있는 알파바이러스의 안정성 시험을 위한 실험을 나타내는 예시적 그래프이다.
도 20은 다양한 온도에서 본 명세서에서 개시된 하나의 구현예에서 예시적 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성 시험을 위하여 다양한 조성물을 이용하는 실험의 누적 개요를 나타내는 히스토그램 플롯이다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "한" 또는 "하나"는 항목의 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약"은 최대 그리고 플러스 또는 마이너스 5 퍼센트를 포함하는 것을 의미할 수 있고, 예를 들어, 약 100은 95 및 최대 105를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 CHIKV는 치쿤구니야 바이러스를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 TCID50은 50% 조직 배양 감염 용량을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 HB는 HEPES 완충액 식염수를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 HBS는 HEPES 완충액 식염수+수크로스를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 DMEM은 둘베코 변형 최소 필수 배지를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 PBS는 포스페이트 완충 식염수를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 FBS는 태아 소 혈청을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 Lyo는 참조의 제형에 의존하여 동결건조된 또는 탈수된 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약독화된 알파바이러스" 또는 "살아있는, 약독화된 알파바이러스"는 대상체 (예를 들면 동물 또는 인간)에 투여된 경우 질환의 감소된 또는 없는 임상 징후를 입증하는 알파바이러스를 의미할 수 있다.
상세한 설명
하기 부문에서, 다양한 예시적 조성물 및 방법은 다양한 구현예를 상세히 설명하기 위해 기재된다. 다양한 구현예 실시는 본 명세서에서 설명된 특정 세부사항의 전부 또는 심지어 일부의 사용을 요구하지 않는 것, 오히려 농도, 시간 및 다른 특정 세부사항이 일상적인 실험과정을 통해 변형될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 명백할 것이다. 일부 경우에, 잘 알려진 방법 또는 성분은 설명에서 포함되지 않았다.
특정 구현예에서, 면역원성 또는 백신 제형에서 사용하는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성은 본 명세서에서 개시된 다양한 제형에서 관측되어 왔다. 일부 구현예에서, 액체, 냉동된, 동결건조된 및 재-구성된 또는 재-수화된 살아있는, 약독화된 알파바이러스에서 역가의 손실 감소에 의한 알파바이러스 안정성 증가용 제형은 실증되어 왔다. 특정 구현예에서, 살아있는 알파바이러스 제형은, 비제한적으로, 하나 이상의 살아있는 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스, HEPES 완충액, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 탄수화물 제제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 HEPES 완충액에서 알파바이러스, 히스티딘을 포함하는 하나 이상의 아미노산, 및 적어도 하나의 수크로스 및/또는 만니톨을 포함하는 하나 이상의 탄수화물 제제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 특정 조성물은 염 또는 염 용액을 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 본 명세서에서 개시된 제형은 조성물에서 알파바이러스 역가의 상당한 손실 없이 약 -80℃ 내지 약 40℃ 이상 살아있는 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 액체, 냉동된 또는 동결건조된 저장에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 4℃에서 장기간 저장은 본 명세서에서 개시된 제형을 이용하여 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수 또는 수화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물로부터 유익한 것으로 고려된 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 코로나비리다에 및 토가비리다에 계열에서, 비제한적으로, 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 서부 말 뇌염 또는 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다. 다른 셈리키 삼림열 바이러스 복합체는, 비제한적으로, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 하위유형: 우나 바이러스, 오뇽뇽 바이러스: 하위유형: 이그보-오라 바이러스, 로스 리버 바이러스: 하위유형: 베바루 바이러스; 하위유형: 게타 바이러스; 하위유형: 사기야마 바이러스, 및 셈리키 삼림열 바이러스: 하위유형: 메 트리 바이러스를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 특정 구현예는 치쿤구니야 바이러스에 관한 것이다. 치쿤구니야 바이러스는 대략 11.6kb의 양성 센스 단일가닥 RNA 게놈을 가진 알파바이러스이다. 셈리키 삼림열 바이러스 복합체의 구성원이고 로스 리버 바이러스, 오뇽뇽 바이러스 및 셈리키 삼림열 바이러스에 밀접하게 관련된다. 본 명세서에서 개시된 조성물은 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 분해 감소에 의해 셈리키 삼림열 바이러스 복합체 다양성의 바이러스를 안정화시키는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 키메라성 알파바이러스를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 살아있는 약독화된 또는 키메라성 치쿤구니야 바이러스를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 하나의 예시적 키메라성 알파바이러스는 곤충 세포에서가 아니고 포유류 세포에서 표현될 수 있는 것이다. 특정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 모기 및 모기 세포에서 복제할 수 있는 살아있는, 약독화된 알파바이러스를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물로부터 유익한 것으로 고려된 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 진핵 대조군 하에 있도록 조작된 것일 수 있다 (예를 들면 진핵 구성요소 예컨대 IRES 서열의 삽입 및/또는 알파바이러스의 서브게놈 프로모터의 비활성화). 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스는, (i) 비구조적 단백질 4 (nsP4) 코딩 서열의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)의 삽입, 및 (ii) 불활성화된 서브게놈 프로모터를 갖는, 알파바이러스 핵산을 포함할 수 있고, 여기서 알파바이러스는 약독화된다. 특정 구현예에서, IRES 서열은 백신 조성물에서 사용하는 생존가능한 약독화된 알파바이러스 작제물을 창출할 수 있는 뇌심근염 바이러스 (EMCV) IRES 또는 다른 유사한 IRES일 수 있다.
본 명세서에서 구현예는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 분해 및/또는 비활성화를 감소 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 특정 조성물은 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 분해 및/또는 비활성화를 감소시키는 성분의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 다른 구현예는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성을 향상시킬 수 있는 제제의 조합에 관한 것이다. 본 명세서에서 추가의 다른 조성물 및 방법은 수성 및/또는 재구성된 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 저장수명을 증가시키면서 더 낮은 온도 (예를 들면 냉장된 또는 냉동된 저장)에 대한 필요성 감소에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스는 하나 이상의 아미노산 및 하나 이상의 탄수화물과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 알파바이러스 제형은 HEPES 완충액, 탄수화물(들) 및 아미노산의 적어도 3 성분을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 살아있는 알파바이러스의 안정화 증가용 제형은 인간 또는 포유류 유래된 제제 예컨대 단백질 (예를 들면 무 혈청 또는 젤라틴)을 함유하지 않는 조성물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 염 제제는 제형의 완충 수용력 또는 다른 원하는 특성을 향상시키기 위해 이들 조성물에 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 다른 구현예는 대상체에게 투여된 경우 하나 이상의 알파바이러스에 의해 야기된 노출의 부작용 또는 감염의 개시를 감소 또는 예방할 수 있는 면역원성 또는 백신 조성물의 제조에서 사용하기 위한 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에 관한 것이다. 이들 면역원성 또는 백신 조성물로부터 유익한 것으로 고려된 대상체는 인간 (예를 들면 성인, 청소년, 소아 및 영아) 및 동물 예컨대 애완동물, 가축 또는 다른 사육된 또는 야생 동물을 포함한다.
일부 구현예는, 비제한적으로, 하나 이상의 단백질 제제, 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 당류 또는 폴리올 제제, 및 선택적으로, HEPES 완충액을 포함하는 알파바이러스의 비활성화를 감소시킬 수 있는 조성물과 하나 이상의 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스를, 비제한적으로, 조합시키는 것을 포함하는 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 비활성화 감소 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 조성물은 알파바이러스의 비활성화를 감소시킨다. 이들 구현예에 따르면, 살아있는 약독화된 바이러스는 특정 알파바이러스, 예컨대 치쿤구니야 (예를 들면 셈리키 삼림열 복합체 바이러스)와 유사한 피쳐를 갖는 것 그리고 알파바이러스 치쿤구니야와 유사한 유전적 구조, 구조적 및 비-구조적 단백질 레이아웃 및/또는 2차 구조 또는 기타 동종을 갖는 다른 알파바이러스를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 제형에서 사용하는 탄수화물은 당 또는 폴리올 또는 당 알코올일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 당류는, 비제한적으로, 단당류, (예를 들면 글루코스, 갈락토스, 리보오스, 만노스, 람노오스, 탈로스, 자일로스 또는 알로스 아라비노오스), 이당류 (예를 들면 트레할로스, 수크로스, 말토스, 이소말토스, 셀리비오스, 젠티오비오스, 라미나리보스, 크실로비오스, 만노바이오스, 락토스, 또는 푸룩토스.), 삼당류 (예를 들면 아카르보스, 라피노오스, 멜리지토스, 파노스, 또는 셀로트리오스) 또는 당 폴리머 (예를 들면 덱스트란, 크산탄, 풀루란, 사이클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 전분, 셀로올로고당류, 셀룰로스, 말토올리고당, 글리코겐, 키토산, 또는 키틴)을 포함할 수 있다. 폴리올은, 비제한적으로 당 알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 아라비톨, 에리트리톨, 말티톨, 자일리톨, 글리시톨, 글리콜, 폴리글리시톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 아이소말트, 수소화된 전분 하이드로실레이트 및 글리세롤을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 조성물에서 사용하는 것으로 고려될 수 있는 본 명세서에서 개시된 제형에서 사용하는 다른 탄수화물 제제는, 비제한적으로, 수크로스, 푸룩토스, 갈락토스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 아밀로스, 아밀로펙틴, 전분, 셀룰로스, 말토올리고당, 글리코겐, 키토산, 또는 키틴을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 사용하는 것으로 고려된 아미노산은 적어도 히스티딘 및 선택적으로, 글리신을 포함한다.
일부 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에서 HEPES 완충액은 약 pH 6.0 내지 약 pH 10의 pH, 농도 약 1.0 mM 내지 약 200 mM를 가질 수 있고, 하나 이상의 아미노산 농도는 약 1.0 mg/ml 내지 약 40 mg/ml일 수 있고 하나 이상의 탄수화물 제제 농도는 약 1.0 mg/ml 내지 약 100 mg/ml일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물에서 HEPES 완충액 농도는 약 1.0 mM 내지 약 40 mM의 농도에서 약 pH 6.5 내지 pH 8.0일 수 있고, 하나 이상의 아미노산 농도는 약 1.0 mg/ml 내지 약 30 mg/ml일 수 있고 하나 이상의 탄수화물 제제 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있다.
특정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물은, 비제한적으로, HEPES 완충액, 만니톨, 히스티딘, 및 수크로스를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, HEPES 완충액은 약 1.0 mM 내지 약 200 mM의 농도에서 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0의 pH일 수 있고, 히스티딘은 약 0.1% 내지 약 5.0%의 농도일 수 있고, 수크로스는 약 0.1% 내지 20.0%의 농도일 수 있고, 만니톨은 약 1.0% 내지 약 10%의 농도일 수 있고 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스. 특정 구현예에서, 제형은 추가로 10 mM 내지 150 mM 염 (예를 들면 염화나트륨 또는 다른 적절한 염)을 포함할 수 있다.
살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물의 비활성화를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한, 일부 구현예는, 비제한적으로, 0.1 mM 내지 200 mM HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제, 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 조성물과 하나 또는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 조합시키는 것을, 비제한적으로, 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 완충된 HEPES의 농도는 약 1 내지 약 200 mM에서 약 pH 6.0 내지 pH 10일 수 있고, 히스티딘은 약 0.1% 내지 약 5.0%일 수 있고, 수크로스는 약 0.1% 내지 약 20%일 수 있고, 만니톨은 약 1.0% 내지 약 10%일 수 있다. 일부 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 HEPES 완충액은 약 1 내지 약 40 mM에서 약 pH 6.0 내지 pH 10일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있고, 수크로스는 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있고, 만니톨은 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 HEPES 완충액은 약 1 내지 약 30 mM에서 약 pH 6.5 내지 pH 7.5일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5 내지 약 30 mg/ml일 수 있고, 수크로스는 약 10 내지 약 50 mg/ml일 수 있고, 만니톨은 약 5 내지 약 40 mg/ml일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 HEPES 완충액은 약 10 내지 20 mM에서 약 pH 7.2일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml일 수 있고, 수크로스는 약 20 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있고, 만니톨은 약 10 mg/ml 내지 약 40 mg/ml일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 HEPES 완충액은 pH 7.2에서 15 mM 용액일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5 mg/ml 내지 약 20 mg/ml일 수 있고, 수크로스는 약 35 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있고, 만니톨은 약 25 mg/ml 내지 약 40 mg/ml일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 알파바이러스와 조합된 경우 HEPES 완충액은 pH 7.2에서 15 mM 용액일 수 있고 그 동안 히스티딘은 약 5.0 mg/ml 내지 12.5 mg/mL이고, 수크로스는 약 35.0 mg/ml 내지 약 50.0 mg/mL이고, 만니톨은 약 25.0 mg/ml 내지 약 40.0 mg/mL이다.
본 명세서에서 개시된 일부 구현예는, 비제한적으로, 0.1 mM 내지 200 mM HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제, 및 하나 이상의 염 제제를 포함하는 조성물과 하나 이상의 알파바이러스를, 비제한적으로, 조합시키는 것을 조성물 및 방법이 포함할 수 있는 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 비활성화를 감소시키기 위한 조성물에 관한 것일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 알파바이러스의 분해를 감소시키기 위해 수크로스 농도는 약 1.0% 내지 약 10.0% (w/v)일 수 있고; 염화나트륨 농도는 약 0.1% 내지 약 1.5% (w/v)일 수 있고; 글루탐산일나트륨 농도는 약 0.05% 내지 약 0.5% (w/v)일 수 있고; 인산나트륨 농도는 약 0.01 내지 약 0.15% (w/v)일 수 있고; 인산칼륨 농도는 약 0.01% 내지 약 0.05% (w/v)일 수 있고; 염화칼륨 농도는 약 0.01% 내지 약 0.05% (w/v)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 살아있는 알파바이러스와 조합된 경우 수크로스 농도는 약 5.0% (w/v)일 수 있고; 염화나트륨 농도는 약 0.64% (w/v)일 수 있고; 글루탐산일나트륨 농도는 약 0.1% (w/v)일 수 있고; 인산나트륨 농도는 약 0.09% (w/v)일 수 있고; 인산칼륨 농도는 약 0.016% (w/v)일 수 있고; 염화칼륨 농도는 약 0.016% (w/v)일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 부분적으로 또는 완전히 동결건조된 살아있는 알파바이러스를 재수화시키는데 또는 여러가지의 온도로부터 다양한 온도에서 살아있는 알파바이러스를 수송하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 고려된 조성물은 다양한 저장 온도에서, 가공, 제조 또는 정제 동안, 수송, 전달 동안 그리고 냉동-해동 사이클 동안 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 비활성화 및/또는 분해를 감소 및/또는 안정화를 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수 또는 수화될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 개시된 조성물은 살아있는 알파바이러스의 동결건조 동안 및 이후 사용될 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 조성물은 20% 이상; 30% 이상; 40% 이상; 50% 이상; 60% 이상; 70% 이상; 80% 이상; 90% 이상; 또는 95% 이상 탈수될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 조성물은 수성 또는 재수화된 살아있는 약독화된 알파바이러스의 저장수명을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에서 개시된 조성물은 동결건조된 또는 액체/냉동된 조건 하에 광범위의 온도 예컨대 실온, 영하의 온도, 상승된 온도 (예를 들면 -80℃ 내지 40℃ 및 초과)에서 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 안정성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제, 및 하나 이상의 아미노산의 조성물에서 제형화되지 않은 살아있는 알파바이러스보다 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배 또는 10 배 이상 살아있는 알파바이러스의 안정성을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 개시된 조성물에서 알파바이러스를 보존시키기 위해 냉동 건조 또는 다른 탈수화 방법을 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 본 명세서에서 개시된 조성물은 냉동건조된 또는 부분적으로 또는 전체적으로 탈수된 살아있는 알파바이러스의 비활성화를 감소시킬 수 있다. 다른 방법에서, 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소용 조성물은 탈수 후 재수화된 조성물을 포함할 수 있거나 수성 조성물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 알파바이러스의 분해 감소에 의해 수성 또는 재수화된 알파바이러스 제형의 저장수명을 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물은 실온 (예를 들면 약 20℃ 내지 약 25℃ 또는 심지어 40℃만큼 높은) 또는 냉동 온도 (예를 들면 약 0℃ 내지 약 10℃ 또는 최대 20 ℃)에서 12 초과 내지 24 시간 초과 동안 수화된 살아있는 약독화된 알파바이러스의 비활성화 및/또는 분해를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 24 시간 이상 동안 90% 이상 살아있는 약독화된 알파바이러스를 유지시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에서 개시된 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 및 초과 냉동-해동 사이클 동안 수화된 살아있는 알파바이러스의 비활성화를 감소시킬 수 있다. 다른 구현예는 냉동 온도 (예를 들면 약 0℃ 내지 약 10℃)에서 약 24 시간 내지 26 주 초과 동안 수화된 또는 수성 살아있는 알파바이러스의 비활성화를 감소시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다. 이들 방법에서 고려된 조성물은, 비제한적으로, HEPES 완충액, 히스티딘, 수크로스, 및 만니톨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 살아있는, 알파바이러스 조성물은 대략 40℃에서 24 시간 초과후 약 100%, 또는 약 90%, 또는 약 80% 또는 약 70% 바이러스 역가 그리고 냉동 온도 약 4℃에서 4 주후 90% 초과 바이러스 역가를 유지시킨다. 본 명세서에서 다른 구현예는 대략 25℃에서 12 주후 약 90%, 또는 약 80% 바이러스 또는 약 70% 바이러스 역가 그리고 냉동 온도 약 4℃에서 약 26 주후 약 90%, 또는 약 80% 바이러스 역가 또는 약 70%를 유지시키는 살아있는 알파바이러스 조성물을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려된 다른 구현예는 당해 분야에서 공지된 다른 조성물에 비교하여 대략 40℃에서 몇 시간 (예를 들면 20 시간)후 바이러스 역가의 농도를 약 3 배 내지 약 10 배에서 잔존하는 살아있는 알파바이러스 조성물을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물은 미량 또는 무 2가 양이온을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 고려된 조성물은 미량 또는 무 칼슘/마그네슘 (Ca+2/Mg+2)를 가질 수 있다.
다른 살아있는, 약독화된 바이러스용 제형은 이전에 기재되어 왔다 (참조 예를 들어 Burke, Hsu 등 1999). SPGA로 칭하는, 하나의 흔한 안정화제는 2 내지 10% 수크로스, 포스페이트, 칼륨 글루타메이트 및 0.5 내지 2% 혈청 알부민의 혼합물이다 (참조 예를 들어 Bovarnick, Miller 등 1950). 이러한 기본 제형의 다양한 변형은 상이한 양이온으로, 수크로스에 대하여 전분 가수분해물 또는 덱스트란의 치환으로, 그리고 혈청 알부민에 대하여 카세인 가수분해물 또는 폴리-비닐 피롤리돈의 치환으로 확인되어 왔다. 다른 제형은 가수분해된 젤라틴 대신에 혈청 알부민을 단백질 공급원으로 이용한다 (Burke, Hsu 등 1999). 그러나, 젤라틴은 면역화된 소아 및 성인에서 알러지성 반응을 야기시킬 수 있고 백신-관련된 유해 사례의 원인이 될 수 있다. 추가적으로, 젤라틴은 소 또는 돼지 뼈 및 척추 물질로부터 공급될 수 있다. 이들 공급원은 이질적인 제제 (레트로바이러스 및/또는 프리온 - BSE)의 공급원이 되어 왔고 안전성 우려를 제공한다. 추가적으로, 알부민은 인간으로부터 수집될 수 있고 - 이는 또한 불안한 이질적인 제제 도입의 잠재적인 위험을 가한다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 하나의 목표는 제제 예컨대 젤라틴 및/또는 혈청 알부민에 대상체내 부정적인 알러지성 반응 또는 가능한 안전성 우려 없이 살아있는, 약독화된 또는 살아있는 알파바이러스에서 개선된 안정화 효과와 동등한 것을 갖는 제형을 확인하는 것이었다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 제형은 본 제형이 젤라틴-함유 제형의 역효과 없이 알파바이러스에서 우월한 안정화 효과와 동등한 것을 입증하는 젤라틴을 함유하는 제형에 비교될 수 있다.
본 명세서에서 구현예는 선행기술에서의 것에 비교된 살아있는 알파바이러스 조성물의 알러지성 반응의 기회를 감소시키거나 악화를 감소 및/또는 상기의 안정성을 향상시키는 조성물을 개시한다. 본 명세서에서 개시된 특정 조성물은 약 40℃에서 최대 1 일; 최대 2 일; 최대 4 일 및 6 주 초과 동안 수성 바이러스의 안정성을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 특정 조성물은 약 실온 (예를 들면 25℃)에서 최대 1 일 내지 약 12 주 이상 동안 수성 바이러스의 안정성을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 예를 들어, 냉동 및/또는 해동, 및/또는 상승된 온도로부터 살아있는 바이러스의 보호를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 실온 조건 (예를 들면 약 25℃)에서 탈수된 살아있는, 약독화된 바이러스 생성물을 안정화, 생성물의 악화를 감소 및/또는 생성물의 비활성화를 예방할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 고려된 조성물은 약 25℃ 또는 최대 또는 약 40℃ 이상에서 수성 살아있는, 바이러스 생성물을 안정화, 생성물의 악화를 감소 및/또는 생성물의 비활성화를 예방할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 조성물은 선진국 및 저개발 지역에서 알파바이러스 백신의 저장, 분포, 전달 및 정확한 투여를 용이하게 할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 개시된 조성물 또는 제형이, 비제한적으로, 세포 배양 통로/선택, 재편성, 감염성 클론에 돌연변이의 편입, 역유전학, 삽입, 결실, 키메라성 작제물 다른 재조합 DNA 또는 RNA 조작을 포함하는, 임의의 방법으로 살아있는 또는 살아있고 약독화되는 바이러스에 관련한다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 개시된 제형의 보호성 효과로부터 유익할 수 있는 특정 알파바이러스가, 비제한적으로, 재조합 알파바이러스 작제물을 포함하는 다른 단백질 또는 RNA를 발현시키도록 조작될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 바이러스는 감염성 질환용 백신, 종양 병태의 개시를 치료 또는 감소하기 위한 백신, 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 단백질 또는 RNA (예를 들면, 유전자 요법, 안티센스 요법, 리보자임 요법 또는 작은 억제성 RNA 요법) 발현용 알파바이러스로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 토가바이러스, 또는 코로나바이러스, 또는 토가바이러스 계열의 임의의 알파바이러스의 막 외피를 가진 하나 이상의 바이러스 (예를 들면, 외피보유한 바이러스)를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 조성물은 토가바이러스, 또는 코로나바이러스 계열의 하나 이상의 외피보유한, 양성 가닥 RNA 바이러스를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 백신 조성물에서 사용을 위하여 바이러스의 약독화를 유도하기 위해 하나 이상의 삽입, 결실 또는 돌연변이를 갖는 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스 (예를 들면 치쿤구니야, VEEV, EEEV 또는 유사한 것)을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 살아있는 알파바이러스 조성물은 하기에서 기재된 하나 이상의 살아있는, 약독화된 알파바이러스 작제물 또는 바이러스를 포함할 수 있다: 미국 출원 번호 PCT/US2009/000458, 2009년 1월 23일 출원, 명칭: ATTENUATED RECOMBINANT ALPHAVIRUSES INCAPABLE OF REPLICATING IN MOSQUITOES AND USES THER댈 및 미국 특허 출원 번호 12/804,535, 23, 2010년 7월 23일 출원, 두 출원 그리고 이의 연속출원 및 분할출원은 참고로 모든 목적을 위해 그 전문이 편입된다.
약제학적 조성물
본 명세서에서 일부 구현예는 수성 또는 동결건조된 형태로 살아있는, 약독화된 바이러스용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 개시된 약제학적 조성물의 냉동-해동 비활성화를 감소시키는 그리고 열적 바이러스 안정성을 개선하는 제형이 수성 형태인, 분말화되는, 냉동건조되는 또는 동결건조되는 그리고 당해 분야에서 공지된 방법으로 제조되는 생성물을 개선할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 재구성 후, 그와 같은 안정화된 면역원성 조성물은, 비제한적으로 진피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 폐 투여 또는 경구 투여를 포함하는, 여러가지의 경로로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 임의의 약제학적 조성물을 전달하기 위한 디바이스가 고려된다. 이들 구현예에 따르면, 여러가지의 디바이스는, 비제한적으로, 주사기 및 바늘 주사, 분지된 바늘 투여, 진피내 패치 또는 펌프에 의한 투여, 진피내 무바늘 젯트 전달 (진피내 등), 진피내 입자 전달, 또는 에어로졸 분말 전달을 포함하는 백신 또는 다른 면역원성 조성물의 전달에 대하여 당해 기술에 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 전형적으로 생리적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, HEPES 완충액은 다른 완충액에 비교된 경우 알파바이러스 조성물에서 예기치 못한 안정화 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 특정 구현예에서, 6.0 초과 pH 내지 약 pH 10을 가진 완충 배지는 고려되고; 일부 살아있는, 약독화된 또는 살아있는 바이러스 (예를 들면 알파바이러스)는 저 pH에서 불안정하다.
본 명세서에서 구현예는 생체내 약제학적 투여에 적합한 생물학적으로 양립가능한 형태로 대상체에 조성물의 투여를 제공한다. "생체내 투여에 적합한 생물학적으로 양립가능한 형태"는 임의의 독성 효과가 활성 제제의 치료 이점에 의해 지배되는 것에서 투여되도록 활성 제제 (예를 들면 특정 구현예의 살아있는, 약독화된 바이러스)의 형태를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 약제학적 조성물의 치료적으로 활성 양의 투여는 원하는 결과를 달성하는데 필요한 기간 동안 그리고 투약량에서, 효과적인 양으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 화합물의 치료적 유효량은 인자 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 중량, 그리고 개체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 능력 제형에 따라 다양할 수 있다. 투약량 레짐은 특정 개체의 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들면 약제학적) 조성물은 대상체에 임의의 공지된 방식으로, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 경구 투여로, 흡입, 경피 투여, 질내 투여, 국소 투여, 비강내 또는 직장 투여로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 화합물은 비강내로, 예컨대 흡입 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 면역원성 조성물은 피하로 또는 진피내로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 화합물 또는 활성 제제 (예를 들면 살아있는, 약독화된 알파바이러스)는, 조성물과 공-투여된, 적절한 캐리어 또는 희석제에서 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 희석제 예컨대 식염수 및 수성 완충액 용액을 포함하도록 의도된다. 활성 제제는 또한 비경구로 또는 복강내로 투여될 수 있다.
주사가능 용도에 적합한 약제학적 조성물은 당해 분야에서 공지된 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 멸균된 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위하여 멸균된 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균된 분말은 사용될 수 있다. 모든 경우에, 조성물은 멸균될 수 있고 용이한 주사침통과성이 실재하는 정도로 유체일 수 있다. 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 추가로 보존될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 캐리어는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에티에일렌 글리콜, 및 기타 동종), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유체성은, 예를 들어, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에서 요구된 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
제형화시, 용액은 투약량 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 효과적인 그와 같은 양으로 투여될 수 있다. 제형은 여러가지의 투약 형태, 예컨대 상기 기재된 주사가능 용액의 유형으로 쉽게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 제형은 본 발명의 알파바이러스의 노출 전, 동안 및/또는 후 투여될 수 있다.
키트
다른 구현예는 본 명세서에서 개시된 그리고 조성물 및 방법으로 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 조성물 및 살아있는 바이러스 제형은 과학적 연구에서 사용을 위하여 또는 대상체에게 투여하기 위한 전달 및/또는 사용을 위하여 키트에서 제공될 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 키트는, 비제한적으로, 적합한 컨테이너, 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스 조성물 및 하나 이상의 추가의 제제 예컨대 다른 항-바이러스 제제, 항진균 또는 항균 제제를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 키트는 추가로본 명세서에서 개시된 적합하게 분취된 알파바이러스 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수되거나 수성일 수 있다. 본 명세서에서 고려된 키트는 특정한 제형에 의존하여 본 명세서에서 개시된 바와 같이 실온에서 또는 냉장된 온도에서 저장될 수 있다.
다른 구현예에서, 키트는 일반적으로, 조성물이 배치, 및 적합하게 분취될 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 컨테이너를 포함할 수 있다. 추가의 성분이 제공되는 경우, 키트는 또한 일반적으로 이러한 제제 또는 성분이 배치될 수 있는 하나 이상의 추가의 컨테이너를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 키트는 또한 시판용 컨테이너내 조성물 및 임의의 다른 시약을 함유하는 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 컨테이너는 원하는 바이알이 유지되는 (예를 들면 면역원성 또는 백신 조성물) 주사 또는 취입 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에서 제시된 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 후술하는 실시예에서 개시된 기술이 본 명세서에서 개시된 실시에서 양호하게 기능하도록 발견된 기술을 나타내고, 따라서 그것의 실시를 위하여 바람직한 방식을 구성하도록 간주될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는, 본 개시내용에 비추어, 많은 변화가 개시되는 특정 구현예에서 실시될 수 있고 여전히 본 명세서에서 사상 및 범위에서 이탈 없이 같은 또는 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인정해야 한다.
실시예 1
완충액 스크린
특정 예시적 방법에서, 전임상 및 임상 시험에 적합한 액체 조성물 및 동결건조가능한 조성물 그리고 알파바이러스 면역원성 조성물 또는 백신의 용도는 확인된다. 이들 예시적 조성물에 따른 액체 조성물에 관한 하나의 고려사항은 일부 알파바이러스가 (예를 들면 저 pH에) pH 감수성이라는 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 조성물의 성분은 pH에 관한 주의 깊은 고려사항들을 포함한다. 특정 예시적 조성물에서, 제형의 pH는 약 pH 6.5 내지 7.5 유지된 몇 개의 제형을 갖는 약 pH 6.0 내지 약 10.0이었다.
일부 방법에서, 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스 (CHIK)는 전-임상 및 임상 시험용 알파바이러스 조성물의 예로서 사용된다. 이들 방법용 조성물은 제공된다. 하나의 예시적 실험에서, 삽입된 IRES 제어 하에 구조적 유전자를 가진 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스인, CHIK-IRES 백신 (pMVS)의 예정된 양이 사용된다. 임의의 약독화된 또는 살아있는 알파바이러스가 알파바이러스의 안정성을 증가시키기 위해 그리고 분해를 감소시키기 위해 이들 예시적 조성물에서 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 초기에, 많은 상이한 완충액 예컨대 DMEM, PBS, HEPES 및 기타는 시험되었다.
다른 예시적 방법에서, 특정 시험, 예컨대 살아있는, 약독화된 바이러스의 안정성을 시험하기 위해 40℃에서 최대 6 주 동안 인큐베이션은 수행되었다. 샘플은 Vero 세포의 96 웰 플레이트에서 TCID50으로 감염성 바이러스의 존재에 대하여 적정하기 위해 얻어졌다. 투입 (비-인큐베이션된) 알파바이러스 조성물 대조군에 비교된 경우 잔존 바이러스의 백분율은 계산되었다. 예를 들어, PBS 단독, 20% FBS DMEM 또는 DMEM 완충된 덱스트로스를 함유하는 살아있는 알파바이러스의 105 TCID50의 인큐베이션은 알파바이러스 (예를 들면 CHIK)의 효력에서 신속 손실을 실증하였다. 특정 예시적 조성물은 살아있는 약독화된 알파바이러스 예컨대 살아있는, 약독화된 알파바이러스 (예를 들면 CHIK), 예를 들어, 약 1.0 내지 약 200 mM HEPES에서 HEPES 완충액 (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)을 함유하는 조성물 안정화에서 효과적인 것으로 실증되었다 (데이터 도시되지 않음). 일 예에서, 15mM HEPES (HEPES 완충액 식염수 - HS) 및 150mM NaCl을 함유하는 조성물은 대조군에 비교된 경우 약독화된 알파바이러스 백신에 증가된 안정성을 제공하는 것으로 밝혀졌다 (데이터 도시되지 않음).
실시예 2
단백질 알러지항원이 없는 제형 안정화용 스크리닝
특정 방법에서, 일부 제형은 단백질 공급원으로서 혈청 알부민 대신에 가수분해된 젤라틴을 사용하고 (Burke, Hsu 등 1999) 이전에 제시된 발명은 본 발명에 관련하였다. 그러나, 젤라틴은, 살아있는, 약독화된 바이러스에 안정성을 제공하면서, 대상체에게 투여된 경우 알러지성 반응을 야기시킬 수 있고 때때로 백신-관련된 유해 사례의 원인이 될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 특정 조성물은 대상체에게 투여된 경우 감소된 알러지성 반응을 갖는 제형을 제공하면서 살아있는, 약독화된 알파바이러스의 악화를 감소시키기 위해 젤라틴을 함유하는 것과 비교할만한 결과를 제공하는 성분의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 살아있는 알파바이러스 또는 살아있는, 약독화된 알파바이러스에 비교할만한 또는 심지어 증가된 안정성을 제공할 수 있는 알부민 또는 젤라틴을 갖지 않는 제형은 기재된다. 이들 제형은, 비제한적으로, HEPES 완충액, 하나 이상의 탄수화물 제제, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 단백질 제제, 및/또는 하나 이상의 염 제제를 포함한다.
예시적 제형은 아래 제공된다 (아래 시험된 모든 제형은 약 pH 7.2 +/- 0.2이었다):
I. 150 mM HEPES, 5% 수크로스, 1% 젤라틴, 및 0.9% 염화나트륨 (양성 대조군) 15.0 mM 및 150.0 mM HEPES가 알파바이러스 안정화를 위하여 유사하게 거동하였다는 것이 실증되었다.
II. 7% 수크로스, 3% 인간 혈청 알부민, 및 1.5% 만니톨 (잠재적인 알러지항원을 함유하는 단백질)
III. 2.5% 수크로스, 및 3% 히스티딘
IV. 1.5% 수크로스, 및 2% 글리신
V. 1.5% 수크로스, 2% 글리신, 0.44% 염화나트륨
VI. 2% 수크로스, 4% 만니톨, 0.5% 히스티딘
VII. 5% 수크로스, 0.64% 염화나트륨, 0.1% 글루탐산일나트륨, 0.09% 인산나트륨, 0.016% 인산칼륨, 및 0.016% 염화칼륨
VIII. 2.5% 만니톨, 및 4.5% 펩톤
이들 조성물에서 제형화된 살아있는, 약독화된 알파바이러스 샘플은 제어된 온도에서 저장되었다. 제형당 18, 15 및 9 샘플은 4℃, 25℃, 및 40℃ 각각의 한쪽에서 저장되었다. 샘플은 표 1에서 그리고 예시적 도 3-5에서 명시된 시점에서 효력 평가에 대하여 관측되었다. 25℃ 및 4℃에서 인큐베이션된 샘플 (도 4-5, 각각)은 4 내지 26 주 기간 동안 안정성 추세를 관찰하기 위해 40℃에서 인큐베이션된 샘플과 병렬적으로 분석되었다 (도 3).
표 2는 0 주째에서 제형 I-VIII을 사용하는 실험으로부터 예시적 결과의 편집을 나타낸다. 생리적 피쳐 예컨대 평균 재현탁 시간, pH, 케이크 외관 스코어, 외관 설명, 예상된 삼투, 및 잔존 수분은 각각의 제형에 대하여 측정 기록되었다. 제형 I, II, 및 VIII은 단백질 제제 (예를 들면, 젤라틴, 알부민, 및 펩톤)을 함유하고 대조군으로서 사용되었고 단백질 제제를 함유하지 않는 제형에 비교되었다. 예를 들어, 제형 III, VI, 및 VII은 단백질을 함유하지 않고 3 초과의 케이크 외관 스코어를 나타냈고 약 0.47% 내지 약 1.15% 잔존 수분 백분율을 가졌다.
표 2 연구 I용 제형의 목록
실시예 3
액체 및 동결건조된 제형
다른 예시적 방법에서, 동결건조된 약독화된 알파바이러스 제형 (예를 들면 CHIK)의 안정성은 평가되었다. 제형의 어느 것도 0 주째에 동결건조시 상당한 역가를 손실하지 않았다. 그러나, 제형 V 및 VIII는, 액체 안정성의 지표인, 가공시 상당한 역가를 손실하였다 (참조 도 1). 또한, 제형 V는 액체 제형의 냉동-해동 사이클시 역가의 상당한 손실을 나타냈다 (도 2). 동결건조된 제형 I-VIII은 40℃ (도 3), 25℃ (도 4), 또는 4℃ (도 5)에서 저장되었다. 명시된 시점에서 얻어진 샘플은 재구성되었고 TCID50으로 Vero 세포에서 적정되었다. 예시적 알파바이러스 제형 (예를 들면 살아있는, 약독화된 CHIK 제형) VI (2% 수크로스, 4% 만니톨, 0.5% 히스티딘) 및 제형 VII ( 5% 수크로스, 0.64% 염화나트륨, 0.1% 글루탐산일나트륨, 0.09% 인산나트륨, 0.016% 인산칼륨, 및 0.016% 염화칼륨)은 40℃에서 4 주 동안 대조군 제형 I 및 II의 것에 비교할만한 안정화 피쳐를 실증하였다 (도 3). 이들 제형은 또한 25℃에서 그리고 4℃에서 12 주 초과 동안 바이러스 역가의 최소 손실을 실증하였다 (도 4 및 5).
도 6은 가속화된 및 실시간 안정성 실험 동안 역가의 손실을 실례하는 히스토그램 플롯이다. 모든 제형은 4℃에서 1 주째부터 26 주째까지 살아있는, 약독화된 바이러스에 제공된 안정성이 시험되었지만, 제형 IV, V, 및 VIII은 40 ℃에서 4 주 후 상당한 역가가 손실되었다. 제형 VI 및 VII은 40℃, 25℃, 및 4℃에서 살아있는, 약독화된 바이러스에 안정화 조성물을 제공하였다. 제형 VI (2% 수크로스, 4% 만니톨, 0.5% 히스티딘)은 추가의 평가 및 팽창용 제형 후보로서 선택되었다.
실시예 4
인간 및 포유류 단백질 제제가 없는 안정화 제형
다른 예시적 방법에서, 40℃, 25℃, 및 4℃에서 장기간 안정성 실험은 살아있는, 약독화된 알파바이러스 안정성에 관해 탄수화물 (예를 들면 수크로스 및 만니톨) 및 아미노산 (예를 들면, 히스티딘)의 다양한 농도의 효과를 분석하기 위해 수행되었고, 예를 들어 살아있는, 약독화된 CHIK는, 하나 이상의 탄수화물 및 하나 이상의 아미노산을 갖는 제형이 CHIK 안정성에서 긍정적인 효과를 가졌다는 관찰에 기반하여, 사용되었다 (참조 상기). 베이스 제형으로서 상기 제시된 제형 VI을 사용하여, 수크로스, 만니톨, 및 히스티딘의 다양한 농도를 가진 제형은 pH 7.2 +/- 0.2에서 15 mM HEPES 완충액으로 제형화되었다.
예시적 제형:
1. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
2. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 20.0 mg/ml 수크로스
3. 15.0 mM HEPES, 40.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
4. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 20.0 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
5. 15.0 mM HEPES, 40.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 20.0 mg/ml 수크로스 (상기 논의된 제형 VI에 등가물)
6. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
7. 15.0 mM HEPES, 40.0 mg/ml 만니톨, 20.0 mg/ml 히스티딘, 및 20.0 mg/ml 수크로스
8. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
9. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
10. 15.0 mM HEPES, 40.0 mg/ml 만니톨, 20.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
11. 15.0 mM HEPES, 10.0 mg/ml 만니톨, 20.0 mg/ml 히스티딘, 및 20.0 mg/ml 수크로스
12. 15.0 mM HEPES, 10.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
13. 15.0 mM HEPES, 10.0 mg/ml 만니톨, 20.0 mg/ml 히스티딘, 및 40.0 mg/ml 수크로스
14. 15.0 mM HEPES, 10.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 20.0 mg/ml 수크로스
15. 15.0 mM HEPES, 40.0 mg/ml 만니톨, 12.5 mg/ml 히스티딘, 및 35.0 mg/ml 수크로스
16. 15.0 mM HEPES, 10.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 40.0 mg/ml 수크로스
17. 수크로스 및 젤라틴 (HSG)를 함유하는 (양성 대조군) 15.0 mM HEPES 완충 식염수 15.0 mM HEPES, 5% 수크로스, 1% 젤라틴, 및 0.9% 염화나트륨. 15.0 mM 및 150.0 mM HEPES가 알파바이러스 안정화를 위하여 유사하게 거동하였다는 것이 실증되었다.
이들 조성물에서 제형화된 살아있는, 약독화된 알파바이러스 샘플은 저장되었다. 제형당 15 샘플은 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 저장되었다. 샘플 제형은 표 3에서 명시된 시점에서 효력 평가에 대하여 연구되었고 예시적 결과는 도 10-12에서 설명되었다. 4℃ 및 25℃에서 인큐베이션된 샘플 (도 11-12)는 12 및 6 주 기간, 각각 동안 잔존하는 역가의 추세를 입증하기 위해 40℃에서 인큐베이션된 샘플과 병렬적으로 분석되었다 (도 10).
실시예 5
액체 및 동결건조된 제형
또 다른 예시적 방법에서, 동결건조된 살아있는, 약독화된 알파바이러스 (예를 들면 CHIK)의 안정성은 평가되었다. 0 주째에, 모든 조성물 1-16은 생리적 피쳐에 대하여 분석되었고 3 초과의 케이크 외관 스코어를 나타냈고 약 0.46% 내지 약 1.46% 잔존 수분 백분율을 가졌다 (데이터 도시되지 않음).
이들 제형의 일부는 0 주째에 동결건조된 경우 더 높은 잔존 역가를 나타냈다 (도 8). 이들 제형의 일부는 냉동-해동 사이클시 더 높은 잔존 역가를 나타냈다 (도 9). 다른 실험에서, 동결건조된 백신 제형 1-16은 40℃ (도 10), 25℃ (도 11), 또는 4℃ (도 12)에서 저장되었고 다양한 온도에서 전반적인 역가 손실에 대하여 평가되었다. 명시된 시점에서 얻어진 샘플은 재구성되었고 TCID50을 계산하기 위해 지표를 사용하여 Vero 세포에서 적정되었다. 양성 대조군 17에 비교된 이 시험 그룹의 예시적 살아있는 알파바이러스 (예를 들면 살아있는, 약독화된 CHIK) 제형 1, 3, 9, 및 10은 >45% 회수율로 40℃에서 최대 적어도 6 주 동안 안정한 것으로 밝혀졌고 반면 다른 제형 2, 5, 7, 11, 12, 13, 14는 1, 3, 9, 10 및 대조군 제형 17에 비교된 경우 실온, 약 40℃ (도 10)에서 저장된 경우 적어도 6 주까지 감소된 회수율을 나타냈다. 양성 대조군 제형 17에 비교된 제형 1, 3, 9, 및 15는 약 25℃에서 저장된 경우 적어도 12 주 동안 안정하였고 반면 제형 5, 11, 및 13은 25℃에서 약 8-12 주 후 상당한 역가 손실을 가졌다 (도 11). 25℃에서 이 비교할만한 손실에도 불구하고, 시험된 모든 제형 (1-16)은 약 4℃의 냉동 온도에서 저장된 경우 12 주 초과 동안 바이러스 역가의 최소 손실을 실증하였다 (도 12).
도 13은 상기에 기재된 안정성 연구 동안 역가의 손실을 실례하는 히스토그램 플롯이다. 모든 제형이 약 4℃의 냉동 온도에서 적어도 12 주째까지 살아있는 알파바이러스의 안정한 역가를 유지하였다는 것이 관측되었다. 실온, 대략 40℃에서, 제형 2, 5, 7, 11, 12, 13, 및 14는 약 6 주만큼 상당한 손실을 나타냈다. 제형 1, 3, 9, 10, 및 15는 실온, 약 40℃에서 6 주 보다 더 긴 기간 동안 제형 5 (상기 실시예 1에서 제형 6에 등가물)과 비교하여 향상된 안정성을 실증하였다.
도 14는 예시적 살아있는 알파바이러스용 제형에서 바람직한 특성을 예측하기 위해 다양한 제형을 사용하는 실험으로부터 데이터를 설명하는 출력물을 나타낸다. 이러한 데이터는 특정 탄수화물 제제의 고 농도 및 특정 아미노산의 저 농도를 갖는 제형이 약 40℃의 실온에서 몇 주 동안 개선된 안정성을 나타냈다는 지지를 제공한다. 따라서, 이들 특정된 제형은 대상체에 수송, 전달 및 최종적인 투여 동안 살아있는 알파바이러스의 안정성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들 예시적 제형은 수령체에서 부정적인 면역 및 다른 효과를 감소시킬 수 있는 인간 또는 동물 단백질 제제가 없다.
실시예 6
인간 또는 동물 유래된 단백질 제제가 없는 제형 안정화
다른 예시적 방법에서, 40℃, 25℃, 및 4℃에서 장기간 안정성 실험은 살아있는 알파바이러스 안정성에 관하여 탄수화물 (예를 들면 수크로스 및 만니톨) 및 아미노산 (예를 들면, 히스티딘)의 추가의 다양한 농도의 효과를 분석하기 위해 수행되었고, 예를 들어 살아있는, 약독화된 CHIK 바이러스는, 하나 이상의 탄수화물 및 하나 이상의 아미노산을 갖는 제형이 CHIK 안정성에서 긍정적인 효과를 가졌다는 관찰에 기반하여, 사용되었다 (참조 상기). 베이스 제형으로서 상기 제시된 제형 VI을 사용하여, 수크로스, 만니톨, 및 히스티딘의 다양한 농도를 가진 제형은 pH 7.2 +/- 0.2에서 15.0 mM HEPES 완충액으로 제형화되었다. 또한, 만니톨, 히스티딘, 및 수크로스의 조성물을 포함하는 이들 표적 제제의 팽창은 상기 17 샘플 연구에서 관찰에 기반되었다. 만니톨, 수크로스, 히스티딘, 및 HEPES는 17 제형 연구에서 그리고 그것의 비-동물 기원에 대하여 그것의 성능에 기반하여 조합으로 선택되었다. 10 제형의 이 그룹에서 만니톨 및 수크로스에 대하여 선택된 상기 표적 농도는 이전의 실험에서 생성된 데이터를 사용하는 통계적인 예측에 기반되었다.
예시적 제형:
1. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
2. 15.0 mM HEPES, 35.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 30.0 mg/ml 수크로스
3. 15.0 mM HEPES, 15.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 30.0 mg/ml 수크로스
4. 15.0 mM HEPES, 25 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
5. 15.0 mM HEPES, 35.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 70.0 mg/ml 수크로스
6. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 21.72 mg/ml 수크로스
7. 15.0 mM HEPES, 10.86 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
8. 15.0 mM HEPES, 25.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 78.28 mg/ml 수크로스
9. 15.0 mM HEPES, 15.0 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 70.0 mg/ml 수크로스
10. 15.0 mM HEPES, 39.14 mg/ml 만니톨, 5.0 mg/ml 히스티딘, 및 50.0 mg/ml 수크로스
실시예 7
액체 및 동결건조된 제형
이들 조성물에서 제형화된 살아있는, 약독화된 알파바이러스 샘플은 저장되었다. 이 연구에서, 17 샘플 연구에 기반된 다양한 제형에서 살아있는, 약독화된 치쿤구니야 바이러스 안정성은 분석되었다. 상기 연구에서 샘플 17은 양성 대조군으로서 선택되었다. 10 제형당 15 샘플은 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 저장되었다. 샘플 제형은 표 4에서 명시된 시점에서 효력 평가에 대하여 연구되었고 예시적 결과는 도 16-20에서 설명되었다. 4℃ 및 25℃에서 인큐베이션된 샘플 (도 19 및 18, 각각)은 6-12 주 기간 동안 잔존하는 역가의 추세를 실증하기 위해 40℃에서 인큐베이션된 샘플과 병렬적으로 분석되었다 (도 17).
실시예 8
또 다른 예시적 방법에서, 동결건조된 살아있는, 약독화된 알파바이러스 (예를 들면 CHIK)의 안정성은 평가되었다. 0 주째에, 모든 조성물 1-10은 생리적 피쳐에 대하여 분석되었고 3 초과의 케이크 외관 스코어를 나타냈고 <0.5% 수분 잔존 수분 백분율을 가졌다 (데이터 도시되지 않음). 25 mg/ml 만니톨 및 50 mg/mL 수크로스를 함유하는 중심점 제형 (이 연구에서 Rx 1 및 4)는, 수송 동안 안정성에 중요한 온도인, 양쪽 25℃ 및 40℃에서 제형 중에 더 높은 안정성을 여전히 달성하면서 케이크 미관에 따른 양성 물리적 기준을 충족시켰다 (데이터 도시되지 않음). 일 예에서, 이들 샘플은 실험 디자인의 부형제 농도 중심점에 대하여 설정된 더욱 강력한 통계적인 데이터를 생성하기 위해 중복시행되었다.
이들 제형의 일부는 0 주째에 동결건조된 경우 더 높은 잔존 역가를 나타냈다 (도 16). 예를 들어, 1, 4, 5, 8 및 9는 액체 형태로 더 높은 역가를 실증하였다. 반면, 제형 5 및 8은 동결건조된 상태로 더 높은 역가를 실증하였다 (도 16). 이들 제형의 일부는 냉동-해동 사이클시 더 높은 잔존 역가를 나타냈다 (데이터 도시되지 않음). 다른 실험에서, 동결건조된 백신 제형 1-10은 40℃ (도 17), 25℃ (도 18), 또는 4℃ (도 19)에서 저장되었고 명시된 시기 동안 다양한 온도에서 전반적인 역가 손실에 대하여 평가되었다. 명시된 시점에서 얻어진 샘플은 재구성되었고 TCID50을 계산하기 위해 지표를 이용하는 Vero 세포에서 적정되었다. 이 시험 그룹의 예시적 살아있는 알파바이러스 (예를 들면 살아있는, 약독화된 CHIK 바이러스) 제형 1, 3, 4, 5, 8, 9, 및 10은 >60% 회수율로 40℃에서 최대 적어도 6 주 동안 안정한 것으로 밝혀졌고 반면 다른 제형 2, 6, 및 7은 제형 1, 3, 4, 5, 8, 9, 및 10에 비교된 경우 약 40℃의 실온에서 저장된 경우 적어도 6 주까지 약간 감소된 회수율을 나타냈다 (도 17). 모든 시험된 제형은 이 기간 동안 약 40℃의 실온에 노출 후 적어도 6 주 적어도 50% 회수율을 가졌다. 이것은 당해 분야에서 그리고 본 명세서에서 시험된 다른 제형보다 상당한 개선이다.
제형 1, 2, 4, 5, 8, 및 10은 약 25℃에서 저장된 경우 적어도 12 주 동안 적어도 80% 회수율을 실증하였고 반면 제형 3, 6, 7, 9 및 13은 25℃에서 약 8-12 주 후 다른 시험된 제형에 비교된 경우 약간의 역가 손실을 가졌다 (도 18). 25℃에서 이 비교할만한 손실에도 불구하고, 시험된 모든 제형 (1-10)은 약 25℃에서 저장된 경우 적어도 12 주 동안 적어도 70% 회수율을 실증하였다 (도 18). 시험된 모든 제형 (1-10)은 단지 약간의 손실을 실증하였고 적어도 12 주 동안 약 4℃의 냉동 온도에서 저장된 경우 90% 초과 회수율을 가졌다 (도 19).
도 20은 상기에 기재된 안정성 연구 동안 역가의 손실을 실례하는 히스토그램 플롯이다. 모든 제형이 약 4℃의 냉동 온도에서 적어도 12 주째까지 살아있는 알파바이러스의 안정한 역가를 유지하였다는 것이 관측되었다. 실온, 대략 40℃에서, 제형 2, 3, 6 및 7은 약 6 주만큼 상당한 손실을 나타냈다. 제형 1, 8 및 9는 실온, 약 40℃에서 6 주 보다 더 긴 기간 동안 제형 2와 비교하여 향상된 안정성을 실증하였다.
물질 및 방법
CHIK-IRES 백신 (사전-MVS, 마스터바이러스 종자)의 예정된 용량의 개별 분취액은 HEPES 완충 식염수 (HB), 수크로스 (HBS)를 함유하는 HEPES 완충 식염수, 수크로스 및 젤라틴 (HSG)를 함유하는 HEPES 완충 식염수를 포함하는 완충액을 함유하는 조성물에서 제형화되었다. 제형화된 수화된 또는 액체 백신은 특정 온도 예컨대 실온 25℃ 및 40℃, 및 냉동 온도 4℃에서 인큐베이션되었다. 분취액은 예정된 간격에서 이들 제형으로부터 제거되었고, 예를 들어, Vero 세포를 가진 96 웰 플레이트에서 TCID50으로 감염성 알파바이러스의 존재에 대하여 적정되었다.
세포주 및 조직 배양
출원인의 cGMP Working Cell Bank에서 유래된 연구-등급 Vero 세포 은행은 이들 실험을 수행하기 위해 제조되었다. Vero 세포는 수득되었고: Vero (WHO) Working Cell Bank 통로: 142 (lot#INV-VERO-WCB-001; 5x106), 액체 질소에서 저장되었다. 바이알은 수조에서 빠르게 해동되었고 T-75cm2 플라스크에서 페니실린-스트렙토마이신, 40mM L-글루타민 및 10% FBS)를 함유하는 사전-가온된 cDMEM (둘베코 변형 최소 필수 배지), 약 19 밀리리터에 직접적으로 접종되었고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 세포는 밀집도로 성장하게 되었고, PBS, 트립신 (하이클론, 예를 들어, cat#SH30042.01) 및 cDMEM-10을 사용하여 계대배양되었다. 이 플라스크는 2 T-185cm2 플라스크까지 팽창되었고 세포가 100% 밀집도에 도달한 때까지 성장되었다. 세포는 트립신화에 의해 수확되었고, 10 분 동안 800 x g로 원심분리되었고, 1x107 세포/mL의 농도에서 20% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 DMEM에서 재현탁되었다.
Vero는 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS (하이클론)을 함유하는 둘베코 변형 최소 필수 배지 (DMEM) (DMEM-10%-FBS)에서 성장 및 유지되었다. 트립신은 세포를 유지하는데 사용되었다. 바이러스 흡착 2일 전, 96-웰 플레이트는 DMEM-FBS-10%의 웰당 100 uL에서 1.4 x 105 세포/mL로 플레이팅되었다. 인큐베이터는 매일 모니터링되어 명시된 온도를 유지시켰다. 바이러스 희석, 흡착 및 TCID50 검정은 cDMEM-FBS 2%에서 수행되었다.
CHIK-IRES: 살아있는, 약독화된 알파바이러스
기재된 다양한 방법에서 사용된 살아있는, 약독화된 CHIK 바이러스의 분자 생성은 (이전에 기재된) CHIK-002로 지정된다. CHIK-002는 IRES 삽입에 의해 생성되었고 Vero 세포에서 번식되었다. 사전-마스터 바이러스 씨드 스톡은 105 TCID50/mL의 농도에서 이들 실험에 사용되었다. 간단히, CHIK 사전-MVS는 Vero 세포의 단일층의 감염 후 생성되었다. CHIK-바이러스는 상청액에 분비되고, 바이러스는 사망한 Vero 세포의 정화/제거 후 배지로부터 수확된다. CHIK-사전-MVS는 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 안정화되었고, -80℃에서 저장되었다.
검정 방법
TCID50 검정 방법은 바이러스-함유 제제에서 존재하는 감염성 바이러스의 양 (효력 또는 안정성)을 정량화하는데 사용되었다. TCID50은 96-웰 플레이트에서 감염된 웰들의 일련의 복제물의 절반이, 예를 들어, CPE (세포병리적 효과)에 의해 입증된 바와 같이, 바이러스 감염성의 징후를 보여주는 바이러스의 희석의 수준으로서 정의된다. Vero 세포는 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% FBS (하이클론)을 함유하는 둘베코 변형 최소 필수 배지 (DMEM) (DMEM 10%-FBS)에서 성장 및 유지되었다. 제형화된 샘플의 분취액은 수조에서 빠르게 해동되었고 혼합되었다. 작업 농도로 사전-MVS의 초기 희석은 수행되었고, 이들 샘플의 10-배 희석 시리즈는 예를 들어, 96-웰 플레이트내 cDMEM-2%FBS에서 만들어졌다. 희석된 바이러스는 Vero 세포 단일층의 접종에 앞서 4℃에서 유지되었다. 검정의 시간에, 성장 배지는 96-웰 플레이트로부터 흡인되었고, 100 μL의 각각의 바이러스 희석액은 웰들에 첨가되었다. 플레이트는 3-5 일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 역가는 스피어만-카르버 방법을 사용하여 계산되었다.
백신 제형
안정성 실험은 연구-등급 백신 제제를 포함하는 백신, 및 내부적으로 유래된 CHIK-IRES pMVS로 준비되었다. 본 명세서에서 제공된 다양한 조성물을 사용하는 부형제 및 안정성 연구의 스크리닝을 위하여, 알파바이러스 제형은 샘플당 105 TCID50/mL 바이러스를 함유하는 500μL의 최종 용적으로 제조되었다. 샘플은 명시된 완충액/제형에서 벌크로 제조되었고 투입 샘플은 연구가 초기 역가의 측정치로서 개시되기 전 얻어졌다. 샘플은 MCT에 분취되었고 명시된 시간 및 온도 동안 저장되었다. 각각의 4 제형은 샘플당 105 TCID50/mL 바이러스를 가진 500μL 최종으로 제조되었다. 제형당 60 샘플은 벌크로 제조되었고 투입 샘플은 이들이 500uL를 함유하는 1.5mL MCT에 분취되기 전 얻어졌다.
제형화된 면역원성 작제물 저장
면역원성 바이러스 제형은 4℃ (Micro Climate Chamber; Model# MCB-12-33-33-H/AC)에서 그리고 -80℃ (REVCO Elite Plus; Model# ULT2186-6-D43)에서 저장되었다. 양쪽 시스템은 Dickson Wizard2 - 900MHZ Logger (4℃에 대하여 Model#WT-220 및 -80℃에 대하여 WT-240)으로 모니터링되었다.
본 명세서에서 개시된 및 청구된 조성물 및 방법의 모두는 본 개시내용에 비추어 과도한 실험과정 없이 제조 및 실행될 수 있다. 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 관하여 기재된 동안, 변화가 본 명세서에서 개념, 사상 및 범위에서 이탈 없이 본 명세서에서 기재된 방법의 단계에서 또는 단계의 순서에서 그리고 조성물 및 방법에 적용될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 분명하다. 더 구체적으로, 둘 모두 화학적으로 및 생리적으로 관련되는 특정 제제는 동일한 또는 유사한 결과가 달성될 동안 본 명세서에서 기재된 제제로 치환될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 분명한 모든 그와 같은 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 사상, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.
Claims (62)
- 살아있는 약독화된 알파바이러스 조성물로서:
하나 이상의 살아있는 알파바이러스;
히스티딘을 포함하는 하나 이상의 아미노산;
둘 이상의 탄수화물 제제를 포함하되;
상기 조성물은 혈청 또는 젤라틴을 포함하지 않고, 상기 조성물은 살아있는 알파바이러스를 안정화시키는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1에 있어서,
HEPES 완충액을 추가로 포함하고, 상기 HEPES 완충액 농도가 1.0 mM 내지 200.0 mM인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 및 서부 말 뇌염, 다른 셈리키 삼림열 바이러스, 또는 다른 토가바이러스 및 이의 조합을 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 (CHIK) 바이러스인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 수성 형태인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수되는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 둘 이상의 탄수화물 제제는 트레할로스, 갈락토스, 푸룩토스, 수크로스, 키토산, 소르비톨, 만니톨 및 이의 조합의 하나 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 둘 이상의 탄수화물 제제는 수크로스 및 만니톨을 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 2 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도의 농도는 10.0 mM 내지 150.0 mM인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 2 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 10.0 mM 내지 30.0 mM이고; 상기 둘 이상의 탄수화물 제제 농도는 10.0 내지 100.0 mg/ml이고; 및 상기 아미노산 농도는 1.0 mg/ml 내지 20.0 mg/ml인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 2 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 15.0 mM이고; 상기 둘 이상의 탄수화물 제제 농도는 각각 20.0 mg/ml 내지 70.0 mg/ml이고; 및 상기 아미노산 농도는 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 2 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스 조성물은 HEPES 완충액, 히스티딘, 수크로스, 및 만니톨을 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 13에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 15.0 mM이고, 히스티딘 농도는 1.0 mg/ml 내지 20.0 mg/ml이고; 수크로스 농도는 20.0 mg/ml 내지 90.0 mg/ml이고; 및 만니톨 농도는 10.0 mg/ml 내지 50.0 mg/ml인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 15.0 mM이고, 히스티딘 농도는 5.0 내지 20.0 mg/ml이고; 수크로스 농도는 40.0 내지 90.0 mg/ml이고; 및 만니톨은 15.0 내지 40.0 mg/ml인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 15에 있어서,
상기 히스티딘 농도는 5.0 내지 15.0 mg/ml이고; 수크로스 농도는 40.0 내지 80.0 mg/ml이고; 및 만니톨 농도는 15.0 내지 40.0 mg/ml인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
염을 추가로 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 하기를 포함하는, 살아있는 약독화된 알파바이러스 조성물로서:
하나 이상의 살아있는 알파바이러스;
하나 이상의 염 제제; 및
수크로스를 포함하는 하나 이상의 탄수화물 제제;
상기 조성물은 혈청 또는 젤라틴 또는 다른 포유류 단백질 생성물을 포함하지 않고, 상기 조성물은 살아있는 알파바이러스를 안정화시키는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18에 있어서,
HEPES 완충액을 추가로 포함하고, 상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 mM 내지 200.0 mM인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 또는 청구항 19에 있어서,
상기 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 동부 말 뇌염 및 서부 말 뇌염, 다른 셈리키 삼림열 바이러스, 또는 다른 토가바이러스 및 이의 조합을 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
상기 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 살아있는 알파바이러스는 살아있는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV)인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 수성 형태인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수되는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
트레할로스, 갈락토스, 푸룩토스, 키토산, 소르비톨, 만니톨 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 탄수화물 제제를 추가로 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 염 제제는 염화나트륨, 글루탐산일나트륨 (MSG), 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 19 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 농도는 1.0 mM 내지 40.0 mM인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 19 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 내지 30.0 mM이고; 상기 하나 이상의 탄수화물 제제 농도는 1.0% 내지 10.0%이고; 및 각각의 상기 하나 이상의 염 농도는 0.001% 내지 1.0% (w/v)인, 알파바이러스 조성물. - 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 수크로스, 염화나트륨, 글루탐산일나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 및 염화칼륨을 포함하는, 알파바이러스 조성물. - 청구항 29에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 15mM이고, 수크로스 농도는 1.0% 내지 15.0% (w/v)이고; 염화나트륨 농도는 0.1% 내지 1.5% (w/v)이고; 글루탐산일나트륨 농도는 0.05% 내지 0.5% (w/v)이고; 인산나트륨 농도는 0.01 내지 0.15% (w/v)이고; 인산칼륨 농도는 0.01% 내지 0.1% (w/v)이고; 및 염화칼륨 농도는 0.01% 내지 0.1% (w/v)인, 알파바이러스 조성물. - 둘 이상의 탄수화물 제제; 및 히스티딘을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 조성물과 하나 이상의 살아있는 알파바이러스를 조합시키는 단계를 포함하는, 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소 방법으로서, 상기 조성물은 상기 살아있는 알파바이러스의 비활성화를 감소시키는, 방법.
- 청구항 31에 있어서,
HEPES 완충액을 추가로 포함하고, 상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 mM 내지 200.0 mM인, 방법. - 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 다른 셈리키 삼림열 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 및 서부 말 뇌염 및 이의 조합을 포함하는, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조합을 부분적으로 또는 전체적으로 탈수시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
투여에 앞서 상기 조성물을 부분적으로 또는 전체적으로 재-수화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 수성 바이러스 조성물의 상기 저장수명을 증가시키는, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 내지 30.0 mM이고; 상기 둘 이상의 탄수화물 제제 농도는 각각 1.0 내지 약 100.0 mg/ml이고; 및 상기 아미노산 농도는 1.0 내지 40.0 mg/ml인, 방법. - 청구항 32 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 히스티딘, 수크로스, 및 만니톨을 포함하는, 방법. - 청구항 38에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 15mM이고, 상기 히스티딘 농도는 5.0 mg/ml 내지 20.0 mg/ml이고; 상기 수크로스 농도는 20.0 mg/ml 내지 90.0 mg/ml이고; 및 상기 만니톨 농도는 10.0 mg/ml 내지 40.0 mg/ml인, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
염 제제를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 31 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스 조성물은 알파바이러스 감염을 예방하기 위해 또는 상기의 개시를 감소시키기 위해 대상체에게 투여용 약제로서 사용하기 위해 추가로 제형화되는, 방법. - 0.1 mM 내지 200 mM HEPES 완충액; 하나 이상의 염 제제, 및 수크로스를 포함하는 둘 이상의 탄수화물 제제를 포함하는 조성물과 하나 이상의 살아있는 알파바이러스를 조합시키는 단계를 포함하는, 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소 방법으로서, 상기 조성물은 상기 살아있는 알파바이러스의 비활성화를 감소시키는, 방법.
- 청구항 42에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (CHIK), 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 다른 셈리키 삼림열 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 및 서부 말 뇌염 및 이의 조합을 포함하는, 방법. - 청구항 42 또는 청구항 43에 있어서,
상기 조합을 부분적으로 또는 전체적으로 탈수시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 42 또는 청구항 43에 있어서,
투여에 앞서 상기 조성물을 부분적으로 또는 전체적으로 재-수화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 수성 바이러스 조성물의 상기 저장수명을 증가시키는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
상기 둘 이상의 탄수화물 제제는 트레할로스, 갈락토스, 푸룩토스, 키토산, 소르비톨, 만니톨 및 이의 조합의 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 염 제제는 염화나트륨, 글루탐산일나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨, 및 이의 조합의 하나 이상을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 mM 내지 40.0 mM인, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HEPES 완충액 농도는 1.0 내지 30.0 mM이고; 상기 둘 이상의 탄수화물 제제 농도는 각각 1% 내지 10%이고; 및 상기 염 제제 농도는 0.001% 내지 0.2% (w/v)인, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 수크로스, 염화나트륨, 글루탐산일나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 및 염화칼륨을 포함하는, 방법. - 하기를 포함하는, 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소용 키트:
적어도 하나의 컨테이너;
0.1 mM 내지 40.0 mM HEPES 완충액, 수크로스를 포함하는 둘 이상의 탄수화물 제제, 및 히스티딘을 포함하는 하나 이상의 아미노산; 및
하나 이상의 살아있는 알파바이러스. - 청구항 52에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 히스티딘, 수크로스, 및 만니톨을 포함하는, 키트. - 청구항 52 또는 청구항 53에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는, 키트. - 하기를 포함하는, 살아있는 알파바이러스의 비활성화 감소용 키트:
적어도 하나의 컨테이너;
0.1 내지 40.0 mM HEPES 완충액, 수크로스를 포함하는 하나 이상의 탄수화물 제제, 적어도 글루탐산일나트륨을 포함하는 하나 이상의 염 제제, 및
살아있는 알파바이러스. - 청구항 55에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 수크로스, 염화나트륨, 글루탐산일나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 및 염화칼륨을 포함하는, 키트. - 청구항 52 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 살아있는 약독화된 알파바이러스를 포함하는, 키트. - 청구항 53 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살아있는 알파바이러스는 치쿤구니야 (CHIK) 바이러스, 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스 복합체, 동부 말 뇌염 및 서부 말 뇌염 및 이의 조합을 포함하는, 키트. - 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알파바이러스 조성물은 살아있는 약독화된 알파바이러스 조성물이고, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물. - 청구항 59에 있어서,
알파바이러스에 대한 노출에서 비롯하는 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법에서 사용하기 위한, 약제학적 조성물. - 알파바이러스에 대한 노출에서 비롯하는 감염으로부터 대상체를 보호하는 백신을 제조하기 위한, 청구항 59에 따른 약제학적 조성물의 용도.
- 상기 대상체가 인간, 가축 또는 다른 사육된 동물인, 청구항 60에서 정의된 바와 같이 사용하기 위한 약제학적 조성물 및 청구항 61에 따른 용도.
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