KR20180122415A - 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법 - Google Patents

Abstract

단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법이 제공된다. (1) 단백질을 포함하는 조성물 및 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계; (2) 상기 처리 조성물을 처리 용기(vessel)에 이동시키는 단계; (3) 사전결정된 조건에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션(incubation)하는 단계; 및 (4) 상기 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하는 단계를 포함한다. 상기 단일 사전결정된 용적 비는 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질에 대해 예상된 농도의 범위에 걸쳐 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 유지됨을 보장하도록 선택되었다. 단계 (1) 내지 단계 (3)은 (a) 연속적으로 그리고 (b) 상기 처리 조성물의 상기 용적 비의 조정 또는 전용(diversion)에 의해 발휘되는 피드백(feeback) 제어의 부재 하에 수행된다.

Description

단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법

본 발명은 일반적으로 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법에 관한 것이고, 그리고 보다 구체적으로는 (1) 단백질을 포함하는 조성물 및 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계; (2) 상기 처리 조성물을 처리 용기(vessel)에 이동시키는 단계; (3) 사전결정된 조건에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션(incubation)하는 단계; 및 (4) 상기 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하는 단계를 포함하는 상기 방법으로서, (i) 상기 단일 사전결정된 용적 비는 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질에 대해 예상된 농도의 범위에 걸쳐 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 유지됨을 보장하도록 선택되었고, (ii) 단계 (1) 내지 단계 (3)은 (a) 연속적으로 그리고 (b) 상기 처리 조성물의 상기 용적 비의 조정 또는 전용(diversion)에 의해 발휘되는 피드백(feeback) 제어의 부재 하에 수행하는, 상기 방법에 관한 것이다.

치료학적 항체와 같은 생물약제학적 생성물(biopharmaceutical product)에서의 사용을 위해 의도되는 단백질을 포함하는 조성물에 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화는 상기 생물약제학적 생성물이 의도된 바와 같이 작동할 것이고 우연히 질환 또는 기타 피해를 야기하지 않을 것임을 보장하기 위한 품질 관리의 중요한 측면이다. 단백질의 생산 동안 외인성 및 내인성 공급원 둘 다를 통해 바이러스 오염이 발생할 수 있다. 바이러스는 이들의 구조와 게놈의 다양성을 고려하면 검출하기 어려울 수 있고, 일단 존재하면 이들의 작은 크기로 인하여 물리적으로 제거하기 어려울 수 있다. 바이러스 오염의 가능성을 설명하기 위해, 단백질의 생산을 위한 산업 공정은 전형적으로 잠재적인 바이러스 오염물질의 불활성화를 위한 하나 이상의 단계를 포함한다.

최근 기술의 전형적인 방법은 단백질을 포함하는 조성물에 산 또는 세제와 같은 바이러스-불활성화 시약을 부가하는 단계, 완전히 혼합하는 단계, 특정 시간 동안 인큐베이션하는 단계, 이어서 상기 바이러스-불활성화 시약을 중화시키거나 제거하는 단계를 포함하고, 상기는 전부 예를 들면, 문헌[Ristol Debart et al., U.S. Pat. No. 6,875,848, Shadle et al., U.S. Pat. No. 5,429,746, 및 Latham et al, U.S. Pub. No. 2013/0236358]에 의해 교시된 바와 같이, 불연속적 방식, 즉 회분식(batch mode)으로 수행하여 상기 단백질을 포함하는 조성물에 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화가 달성된다. 이러한 방법들에 따르면, 해당 시간 동안 상기 단백질을 포함하는 조성물은 전형적으로 달리 프로세싱되지 않고, 이는 잠재적으로는 단백질을 제조하기 위한 전체 공정에 상당한 시간을 추가하지만, 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화는 다중 불연속적 단계들 및/또는 연장된 인큐베이션 시간을 필요로 할 수 있다.

다른 방법들은 예를 들면 문헌[Anderle et al., U.S. Pat. No. 7,993,580]에 의해 교시된 바와 같이, 예를 들면 상기 조성물에 존재할 수 있는 미생물의 불활성화를 달성하기 위해서 상기 조성물이 임의로 체류 시간 분포를 좁히고 불활성화 속도를 증가시키도록 혼합되면서 박층 조사기(irradiator)를 통해 유동함에 따라 단백질을 포함하는 조성물을 단색 또는 다색 광과 같은 광량으로 연속 방식으로 처리하는 것을 포함한다. 그러나, 조사 동안 상기 조성물의 흡광도의 미세-이질성(micro-heterogeneity) 및 유동 속도와 같은 인자들에 의존하여 조성물에 따라 광량이 변할 수 있고, 상응하는 광원의 노화 및 발광의 변동에 의존하여 시간에 따라 변할 수 있으므로, 광량의 제어가 어려울 수 있다.

다른 방법들은, 단백질을 포함하는 조성물에 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화시키기 위해서, 상기 조성물을 산 또는 세제와 같은 바이러스-불활성화 시약과 연속적으로 예를 들면, 문헌[Xenopoulos, U.S. Pub. No. 2015/0064769]에 의해 교시된 바와 같이, 예를 들면, 제1 단위 조작(unit operation)으로부터 제2 단위 조작으로의 유동 동안에, 각각의 정적 혼합기 후에 그리고 pH 프로브 전에 적절한 직경 및 길이의 튜브를 가짐으로써 바이러스 불활성화를 위한 체류 시간이 변경되는 하나 이상의 인-라인(in-line) 정적 혼합기를 이용하여 혼합하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 방법으로의 문제점은 상기 방법이 본질적으로 pH 피드백 루프에 기초한 회분 적정의 성능을 포함하고, 바이러스의 불활성화에 적합한 낮은 최적의 pH 범위로의 pH의 조절 및 유지를 위해 pH 미터의 적절한 기능에 의존한다는 것이다. 이는 상기 방법을 불안정하고 pH의 급속하고 제어되지 않는 변동에 취약하게 만들고, 이는 바이러스의 불활성화에 부정적 영향을 미칠 수 있고, 따라서 상응하는 단백질의 품질에 부정적 영향을 미칠 수 있다.

다른 방법들은 생물학적 생성물을 포함하는 조성물 및 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 연속적으로 배합하여 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계, 상기 처리 조성물이 사전결정된 성질을 나타내는 것을 확인하는 단계, 상기 처리 조성물을 정적 혼합기를 포함하는 처리 용기에 이동시키는 단계, 상기 처리 조성물을 사전결정된 속도로 유동시키고 정적 혼합기와 접촉시키면서 사전결정된 온도에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션하는 단계, 및 상기 처리 용기로부터 상기 처리 조성물을 수집하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단계들은 예를 들면, 문헌[Coffman et al., WO 2015/158776]에 교시된 바와 같이 연속적으로 수행한다. 그러나, 이러한 방법들은 예를 들면, 상기 처리 조성물이 사전결정된 특성을 나타내는지 확인하는 단계가 피드백 제어의 목적을 위해, 예를 들면, 사전결정된 특성을 나타내지 않을 수 있는 처리 조성물의 전용을 가능하게 하기 위해 수행되는 정도로, 제거될 수 있는 제어 부담을 포함할 수 있다.

따라서, 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 개선된 방법에 대한 필요가 존재한다.

본 발명의 간단한 요약

본 개시의 제1 양상에서, 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (1) (a) 단백질을 포함하는 조성물 및 (b) 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 (c) 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 (2) 상기 처리 조성물을 처리 용기(vessel)에 이동시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 (3) 사전결정된 조건에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션(incubation)하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 (4) 상기 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 따르면, 상기 단일 사전결정된 용적 비는 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질에 대해 예상된 농도의 범위에 걸쳐 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 유지됨을 보장하도록 선택되었다. 또한, 상기 방법에 따르면 단계 (1) 내지 단계 (3)은 (a) 연속적으로 그리고 (b) 상기 처리 조성물의 상기 용적 비의 조정 또는 전용(diversion)에 의해 발휘되는 피드백(feeback) 제어의 부재 하에 수행된다.

이론에 얽매이지 않으면서, 상기 단일 사전결정된 용적 비를 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질에 대해 예상된 농도의 범위에 걸쳐 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 유지됨을 보장하도록 선택함으로써 그리고 단계 (1) 내지 단계 (3)을 연속적으로 그리고 상기 처리 조성물의 상기 용적 비 또는 전용에 의해 발휘되는 피드백 제어의 부재 하에 수행함으로써, 바이러스의 불활성화가 수행됨에 따라 상기 처리 조성물이 상기 사전결정된 특성을 나타내는지를 확인할 필요 없이 안정한 방식으로 단백질의 제조 동안의 바이러스의 불활성화가 수행될 수 있고, 이는 바이러스의 불활성화 동안의 피드백 제어와 관련된 제어 부담의 제거를 가능하게 하는 것으로 생각된다.

본 개시의 제2 양상에서, 샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 샘플이 표적 분자를 정제하기 위한 프로세스 동안 제1 단위 조작으로부터 제2 단위 조작으로 유동함에 따라 상기 샘플을 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약과 연속적으로 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 따르면, 상기 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약 대 상기 샘플의 비는 피드백 제어 메커니즘과 독립적으로 또는 피드백 제어 메커니즘의 부재 하에 결정된다.

이론에 얽매이지 않으면서, 또한 상기 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약 대 상기 샘플의 비는 피드백 제어 메커니즘과 독립적으로 또는 피드백 제어 메커니즘의 부재 하에 결정됨을 포함하는 본원에 개시되는 원칙 및 접근법에 따라, 상기 샘플이 표적 분자를 정제하기 위한 프로세스 동안 제1 단위 조작으로부터 제2 단위 조작으로 유동함에 따라 상기 샘플을 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약과 연속적으로 혼합함으로써, 상기 하나 이상의 바이러스의 불활성화가 생물약제학적 생성물을 제조할 목적에 충분한 정도로 달성될 수 있고, 또한 이는 상기 하나 이상의 바이러스의 불활성화 동안 피드백 제어와 관련된 제어 부담의 제거를 가능하게 하는 것으로 생각된다.

청구된 방법들, 장치들 및 시스템들의 이들 및 다른 특징들, 양상들, 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 첨부된 도면들을 참조하여 읽을 때 더 잘 이해된다.
도 1은 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법에 사용하기 위한 예시의 치료 용기(210)의 도해이고, 여기서 상기 예시의 치료 용기(210)는 직선 형태를 갖는다;
도 2는 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법에 사용하기 위한 예시의 치료 용기(210)의 도해이고, 여기서 상기 예시의 치료 용기(210)는 곡선 형태를 갖는다;
도 3은 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법에 사용하기 위한 예시의 치료 용기(210)의 도해이고, 여기서 상기 예시의 치료 용기(210)는 나선 형태를 갖는다;
도 4는 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법을 수행하기 위한 예시의 시스템(500)의 도해이다;
도 5는 단백질 A 용출물의 회분식 적정에 관한 결과를 나타내는 단백질 A 용출물 프로파일이고, 여기서 녹색 실선은 모노클로날 항체의 농도(컬럼 용적당 g/L)에 상응하고, 적색 실선은 (컬럼 용적당) 단백질 A 용출물의 pH에 상응하고, 청색 실선은 (컬럼 용적당) pH 3.5인 처리 조성물을 수득하는데 필요한 상대적 적정제 용적에 상응한다;
도 6은 pH 3.3에서의 2M 글리신, pH 3.4에서의 2M 글리신, pH 3.3에서의 1.5M 글리신, pH 3.4에서의 1.5M 글리신, pH 3.4에서의 1M 글리신, pH 3.3에서의 1M 글리신, pH 3.4에서의 0.5M 글리신, pH 3.3에서의 0.5M 글리신, pH 3.4에서의 3M 글리신, 및 pH 3.3에서의 3M 글리신(범례에서와 같은 순서로, 상단으로부터 하단으로)에 상응하는 적정제 용액에 대한, 단백질 A 용출물과의 배합시 pH 3.5를 달성하기 위해 필요한 적정제의 용적(적정제 용액 용적/용출물 용적 %로서 표현됨, 이는 백분율로서 표현되는 단백질 A 용출물의 용적당 적정제 용액의 용적을 의미함) 대 단백질 A 용출물 중의 모노클로날 항체의 농도(g/L)의 플롯(plot)이다;
도 7은 pH 3.4에서의 3M 글리신(짧은 선 표시된 선), pH 3.3에서의 1.5M 글리신(삼각형 표시된 선), pH 3.3에서의 2M 글리신(선택된 적정제에 상응하는 다이아몬드 표시된 상단 선), 및 pH 3.3에서의 3M 글리신(다이아몬드 표시된 하단 선)에 상응하는 적정제 용액에 대한, 단백질 A 용출물과의 배합시 pH 3.5를 달성하기 위해 필요한 적정제의 용적(또한 적정제 용액 용적/용출물 용적 %로서 표현됨) 대 단백질 A 용출물 중의 모노클로날 항체의 농도(g/L)의 플롯이다;
도 8은 pH 출력(output)으로서 표현된 모노클로날 항체에 대한 탈선(excursion) 시험의 결과 대 모노클로날 항체의 농도(g/L)를 나타내는 플롯이다;
도 9는 pH 출력으로서 표현된 적정제에 대한 탈선 시험의 결과 대 적정제 용적(또한 적정제 용액 용적/용출물 용적 %로서 표현됨)을 나타내는 플롯이다; 그리고
도 10은 단백질 A 및 연속적 저 pH 바이러스 불활성화와 연관된 100L 반응기에 대한 결과를 보여주는 단백질 A 용출물 프로파일이고, 여기서 청색 실선은 (시간당) 280nm에서의 mAU로서 측정되는 단백질 A 용출물에서 모노클로날 항체의 상대적 농도에 상응하고, 적색 점선은 단백질 A 용출물의 (시간당) pH에 상응하고, 적색 실선은 최종 바이러스 불활성화 처리 조성물의 (시간당) pH에 상응한다.

청구된 방법의 양상들은 예시적인 실시형태들이 도시된 첨부된 도면들을 참조하여 하기에 보다 완전하게 설명될 것이다. 가능한 한, 동일한 참조 부호 숫자(reference numeral)는 동일하거나 유사한 부분을 나타내기 위해 도면 전체에 걸쳐 사용된다. 그러나, 청구된 방법은 다수의 상이한 형태들로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 실시형태들에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 예시적인 실시형태들은 본 개시가 철저하고 완전할 수 있도록 제공되고, 청구된 방법의 범위를 당해 분야 숙련가들에게 완전히 전달할 것이다.

단백질의 제조 동안에 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법이 제공된다. 상기 언급한 바와 같이, 생물약제학적 생성물에서의 사용하기 위해 의도되는 단백질을 포함하는 조성물에 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화는 품질 관리의 중요한 측면이다. 상기 단백질은 예를 들면, 이들 중에서도 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 효소 또는 혈액 응고 인자와 같은 치료학적 단백질, 또는 이들 중에서도 항원성 단백질과 같은 백신 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 세포, 조직 또는 유기체와 같은 살아있는 시스템에 의해, 예를 들면 이들 중에서도 포유동물 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포에 의해 생성될 수 있다. 상기 단백질은 비연속적 방식, 예를 들면, 회분식 배양 또는 유가식 배양으로 또는 연속적 방식, 예를 들면, 관류를 이용한 연속 배양으로 수행되는 바와 같이 그리고 임의의 적합한 규모, 예를 들면, 실험실, 파일럿(pilot) 또는 생산 규모로 수행되는 바와 같이, 균질(homogeneous) 프로세스, 예를 들면, 교반-탱크 생물반응기(bioreactor), 에어-리프트(air-lift) 생물반응기 또는 웨이브 생물반응기의 사용에 기초한 현탁 배양, 또는 비균질(heterogeneous) 프로세스, 예를 들면, 마이크로캐리어(microcarrier)-기반 시스템, 충전층(packed bed) 생물반응기, 또는 중공-섬유(hollow-fiber) 생물반응기에 기초한 부착 배양에 의해 생산될 수 있다. 바이러스는 세균(즉, "파지(pahge)"로서도 칭하는 "박테리오파지(bacteriophage)") 또는 사람 및/또는 동물, 예를 들면 이들 중에서도 단백질이 투여되도록 의도된 각각의 사람 또는 동물을 감염시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 바이러스는 예를 들면, 멸균 유지의 부주의한 실패에 의한 외인성 공급원으로부터 또는 내인성 공급원, 예를 들면, 단백질을 제조하는데 사용되는 생명체(living system)로부터 단백질을 포함하는 조성물에 도입되었을 수 있다.

상기 방법은 단백질의 제조 동안에 예를 들면, 바이러스 오염에 기초하여 존재할 수 있는 바이러스가 불활성화됨을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 상이한 유형의 바이러스 및/또는 주어진 유형의 바이러스의 다수의 활성 입자가 존재할 수 있는 한, 상기 방법은 다수의 상이한 유형 및/또는 주어진 유형의 다수의 활성 입자를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 방법은 단백질을 궁극적으로 포함하는 생물약제학적 생성물이 임의의 유형의 바이러스 활성 입자를 허용가능한 한계 이상의 임의의 양으로 포함하지 않을 것임을, 예를 들면 상기 생물약제학적 생성물이 바이러스의 활성 입자를 포함하지 않을 것임을 보장하기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법은 (1) (a) 단백질을 포함하는 조성물, 및 (b) 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 (c) 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.

상기 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들면, 생물반응기, 예를 들면 포유동물 세포 배양과 같은 생체에 의한 단백질의 생산을 위해 사용되는 생물반응기로부터 직접적으로 유도된 조성물일 수 있다. 상기 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들면, 연속 방식, 예를 들면 관류를 이용한 연속 배양으로 작동되는 생물반응기로부터 수득된 것일 수 있고, 따라서 포유동물 세포 배양의 세포에 의해 소정 정도까지 이용된 세포 배양 배지 및 상기 세포로부터 분비된 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 포함하는 조성물은, 상기 단백질을 포함하는 조성물에 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법을 행하기 전에 원하지 않는 잔해(debris), 화합물 및 기타 물질의 일부 또는 전부를 제거하기 위해서, 다른 단계들 중에서, 예를 들면, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 분리와 같은 1회 이상의 프로세싱 조작 후 생물반응기로부터 간접적으로 유도된 조성물일 수 있다. 이러한 경우, 상기 프로세싱 조작은 사전-처리 프로세싱 조작에 상응할 수 있고, 이는 본원에 개시된 바와 같이 바이러스의 불활성화를 위한 단계가 프로세싱 조작 후에 수행될 것임을 의미한다.

따라서, 상기 단백질을 포함하는 조성물은 사전-처리 프로세싱 조작으로부터 수득될 수 있다. 상기 사전처리-프로세싱 조작은 예를 들면, 단백질이 생물반응기로부터 처음에 수득될 때 단백질과 함께 존재할 수 있는 원하지 않는 잔해, 화합물 및/또는 다른 물질로부터 분리된 단백질을 포함하는 조성물을 수득하기 위한 프로세싱 조작에 상응할 수 있다. 상기 사전-처리 프로세싱 조작은 다른 프로세싱 조작들 중에서도 예를 들면, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 분리를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들면, 다른 유형의 조성물들 중에서도 예를 들면, 여과인 사전-처리 프로세싱 조작을 위한 단백질을 포함하는 여과물, 예를 들면, 침전인 사전-처리 프로세싱 조작을 위한 단백질을 포함하는 침전물, 및/또는 예를 들면, 크로마토그래피 분리인 사전-처리 프로세싱 조작을 위한 크로마토그래피 용출물을 포함할 수 있다.

특히 크로마토그래피 분리에 관해서, 상기 사전-처리 프로세싱 조작은 예를 들면, 면역글로불린-결합 단백질 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 면역글로불린-결합 단백질 크로마토그래피는 다른 면역글로불린들 중에서도 예를 들면 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하는 면역글로불린을 정제하는데 유용하다. 면역글로불린-결합 단백질 크로마토그래피에 적합한 면역글로불린-결합 단백질로는 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 및 단백질 L이 포함된다. 특히 단백질 A는 천연 및 재조합 형태로 이용가능하고, 면역글로불린 G의 결정가능성 단편(Fc(Fragment crystallizable)라고도 칭함)에 대한 높은 친화성을 갖는다. 면역글로불린-결합 단백질 크로마토그래피는 예를 들면, 고체 지지체, 예를 들면 가교결합된 주상(beaded) 아가로스, 폴리아크릴아미드 또는 기타 다공성 고체 지지체에의 면역글로불린-결합 단백질의 고정화에 기초하여 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 사전-처리 프로세싱 조작은 예를 들면, 단백질 A 항체 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 항체 친화성 크로마토그래피, 단백질 A/G 항체 친화성 크로마토그래피 및/또는 단백질 L 항체 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 상기 방법은 (1) (a) 단백질을 포함하는 조성물, 및 (b) 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 (c) 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계를 포함한다.

바이러스의 불활성화를 위한 처리 조성물의 사전결정된 특성은 3.0 내지 3.8의 pH 또는 0.05% 내지 10%(v/v)(v/v는 세제의 경우에 세제 용적/최종 용적을 나타냄)의 세제 농도 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 3.0 내지 3.8의 pH는 단백질에 훼손하지 않고 바이러스의 불활성화를 야기할 수 있다. 마찬가지로, 0.05% 내지 10%(v/v)의 세제 농도는 단백질을 훼손하지 않고 바이러스의 불활성화를 야기할 수 있다. 상기 사전결정된 특성은 바이러스의 불활성화에 대한 특이적 특성을 갖는 처리 조성물을 제조하고 충분성(sufficiency)을 측정하고 확인하기 위한 각종 조건을 시험하는 것에 기초하여 처리 조성물에서 바이러스의 불활성화를 원하는 정도로 달성하기에 충분한 전체 프로세스가 개발될 수 있고, 이어서 일반적으로 단백질의 제조 동안 상기 프로세스를 적용한다는 의미에서 사전결정될 수 있다. 이러한 적용은 단백질을 포함하는 조성물 및 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 배합하여 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 얻는 것을 포함할 수 있고, 즉, 상기 방법은 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화를 보장하기 위한 특정 계획에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 몇몇의 예에서 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성은 3.0 내지 3.8, 예를 들면, 3.3 내지 3.7 또는 3.4 내지 3.6의 pH를 포함한다. 몇몇의 예에서, 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성은 0.05% 내지 10%(v/v), 예를 들면, 0.05% 내지 5.0%(v/v) 또는 0.05% 내지 2.0%(v/v)의 세제 농도를 포함한다. 몇몇의 예에서, 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성은 3.0 내지 3.8의 pH 및 0.05% 내지 10%(v/v)의 세제 농도, 예를 들면, 3.3 내지 3.7의 pH 및 0.05% 내지 5.0%(v/v)의 세제 농도, 또는 3.3 내지 3.7의 pH 및 0.05% 내지 2.0%(v/v)의 세제 농도, 또는 3.4 내지 3.6의 pH 및 0.05% 내지 5.0%(v/v)의 세제 농도, 또는 3.4 내지 3.6의 pH 및 0.05% 내지 2.0%(v/v)의 세제 농도 둘 다를 포함한다.

바이러스-불활성화 시약은 예를 들면 (a) 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산, (b) 아세트산, 또는 (c) 230nm 내지 600nm에 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산은 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적어도 하나의 적정가능한 그룹을 갖고, 2.3 미만 또는 8.5 초과의 pKa를 갖는 추가의 적정가능한 그룹을 가질 수 있지만, 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산을 의미하고, 각각의 pKa는 약 20 내지 25℃에서 측정된 바와 같다.

유기산, 예를 들면 카르복실산 또는 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아미노산이 이러한 산이다. 이러한 유기산으로는 예를 들면, 25℃에서 3.86의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 락트산이 포함된다. 20℃에서 약 3.74의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 포름산 또한 이러한 유기산이다. 약 20 내지 25℃에서 4.17의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹 및 또한 약 20 내지 25℃에서 11.6의 pKa를 갖는 추가의 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아스코르브산도 이러한 유기산이다. 약 20 내지 25℃에서 2.34의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 글리신도 이러한 유기산이다. 따라서, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약은 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 유기산, 락트산, 포름산, 아스코르브산, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아미노산, 글리신 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산일 수 있다.

2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산은 적어도 하기 원인으로 상기 방법에서 유용할 수 있다. 첫 째로, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 가짐으로써, 상기 산은 다량의 산을 포함할 필요 없이 상기 처리 조성물을 3.0 내지 3.8의 pH로 적당하게 완충시킬 수 있고, 예를 들면, 상기 산은 상기 처리 조성물 중에 100mM로 또는 100mM 미만으로 존재할 수 있고 여전히 충분한 완충 능력을 제공할 수 있다. 이는 상기 처리 조성물을, 바이러스의 불활성화를 가능하게 하기에 충분히 낮지만 단백질의 훼손, 예를 들면 단백질의 산 변성을 피하기에 충분히 높은 pH인 3.0 내지 3.8의 pH로 유지하는 것을 보장할 수 있다. 둘 째로, 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않음으로써, 상기 산을 포함하는 처리 조성물은 나중에 다른 적정가능한 그룹의 적정을 필요로 하지 않고, 따라서 그렇지 않으면 다른 적정가능한 그룹의 부재시에 부가될 필요가 없는 여분의 이온을 부가할 필요 없이 중화될 수 있다. 이는 바이러스의 불활성화 후에 수행될 수 있는 임의의 이온 교환 단계의 유효성을 촉진시킬 수 있다.

2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 소정의 특정 산은 또한 추가의 원인으로 유용할 수 있다. 예를 들면, 락트산은 세포에 자연적으로 존재하고 따라서 단백질의 생산을 위한 프로세스에 존재하고, FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된 물질("GRAS"라고도 칭함)이며, 가격이 저렴하므로 추가로 유용하다.

약 20 내지 25℃에서 4.74의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아세트산도 또한 상기 방법에서 유용할 수 있다.

230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제로는 예를 들면, 이들 중에서도 방향족 그룹을 갖는 폴리에틸렌 옥사이드 세제가 포함되고, 이로는 예를 들면 이들 중에서도 Triton-X 100 세제가 포함된다. 따라서, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약은 방향족 그룹을 갖는 폴리에틸렌 옥사이드 세제, Triton-X 100 세제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제일 수 있다.

230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제는 적어도 하기 원인으로 상기 방법에서 유용할 수 있다. 첫 째로, 비-이온성 세제가 상기 처리 조성물에 적합한 농도로 존재하는 경우, 비-이온성 세제의 비하전된(uncharged) 친수성 그룹은 단백질을 훼손하지 않고 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 둘 째로, 상기 비-이온성 세제의 230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹은 예를 들면, 농도-의존적 특성인 발색 그룹에 의한 자외선 흡착에 기초하여 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물 내에서의 그리고/또는 상기 처리 조성물 내에서의 세제 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.

따라서, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물은 (a) 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산, 또는 (b) 아세트산, 또는 (c) 230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제 중 적어도 하나를 포함하는 조성물일 수 있고, 예를 들면 상기 조성물은 인용된 산들 중 하나 이상, 인용된 비-이온성 세제들 중 하나 이상, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

또한, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약은 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 유기산, 락트산, 포름산, 아스코르브산, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아미노산, 글리신, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산일 수 있고, 사전결정된 특성은 3.0 내지 3.8의 pH를 포함할 수 있다. 이러한 예에 따르면, 이들 사전결정된 특성은 3.3 내지 3.7의 pH를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 예에 따르면, 사전결정된 특성은 3.4 내지 3.6의 pH를 포함할 수 있다.

또한, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약은 아세트산일 수 있고, 사전결정된 특성은 3.0 내지 3.8의 pH를 포함할 수 있다. 이러한 예에 따르면, 사전결정된 특성은 3.3 내지 3.7의 pH를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 예에 따르면, 사전결정된 특성은 3.4 내지 3.6의 pH를 포함할 수 있다.

또한, 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약은 방향족 그룹을 갖는 폴리에틸렌 옥사이드 세제, Triton-X 100 세제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제일 수 있고, 사전결정된 특성은 0.05% 내지 10%(v/v)의 세제 농도를 포함할 수 있다.

또한, 언급된 바와 같이, 상기 방법은 (1) (a) 단백질을 포함하는 조성물, 및 (b) 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여 (c) 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물을 수득하는 단계를 포함한다. 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화시키기 위한 바이러스-불활성화 시약의 유효성은 다른 인자들 중에서도 처리 조성물 중의 바이러스-불활성화 시약의 농도에 의존할 것이다. 바이러스를 주어진 정도로 불활성화시키는데 필요한 바이러스-불활성화 시약의 농도는 실제 조건 하에서 경험적으로 결정될 수 있고, 유사한 조건 하에서 이전의 경험에 기초하여 추정되거나, 또는 이론에 기초하여 예측될 수 있다. 추가로 이해되는 바와 같이, 이러한 농도는 또한 처리 조성물의 용적에 대한 바이러스 불활성화 시약을 포함하는 조성물의 비례 기여를 고려하여, 바이러스-불활성화 시약이 바이러스의 불활성화에 효과적인 농도로 처리 조성물 중에 존재할 것임을 보장하기 위해 바이러스-불활성화 시약을 적합한 농도로 포함하는 조성물 중에 바이러스-불활성화 시약이 포함됨을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 인용된 산들 중 하나에 상응하는 바이러스-불활성화 시약, 예를 들면, 락트산의 사용을 고려하여, 상기 산이 상기 처리 조성물에 약 100mM로 포함되어야 한다고 결정되면, 상기 처리 조성물은 단백질을 포함하는 조성물의 9용적당 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 약 1용적을 배합함으로써 제조될 것이고, 이어서 약 1M의 농도로 산을 포함하는 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물이 제조될 수 있다. 또한, 예를 들면, 인용된 비-이온성 세제들 중 하나에 상응하는 바이러스-불활성화 시약, 예를 들면, Triton-X 100 세제의 사용을 고려하여, 상기 비-이온성 세제가 상기 처리 조성물에 약 1.0%(v/v)(또한 v/v은 세제의 경우에 최종 용적당 세제 용적을 나타냄)로 포함되어야 한다고 결정되면, 상기 처리 조성물은 단백질을 포함하는 조성물의 9용적당 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 약 1용적을 배합함으로써 제조될 것이고, 이어서 약 10%(v/v)의 농도로 비-이온성 세제를 포함하는 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물이 제조될 수 있다.

언급된 바와 같이, 단계 (1)에 따르면 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 배합하여 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물이 수득된다. 상기 배합은 예를 들면, 하나 이상의 혼합기를 포함하는 용기 내에서 수행하여 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물이 예를 들면 별도로 그리고 동시에 용기에 부가하고, 예를 들면 가압 하에 용기를 통해 유동하고, 예를 들면 하나 이상의 혼합기에 의해 유동하면서 혼합되도록 할 수 있다. 상기 혼합은 일정 시간 동안, 예를 들면, 1 내지 5분 동안 발생할 수 있고, 이는 처리 조성물이 균질하게 혼합됨을 보장하기에 충분히 길지만, 바이러스의 불활성화가 실질적인 정도로 진행될 만큼 길지는 않다. 다른 접근법도 사용될 수 있고, 다른 접근법들 중에서도 예를 들면 상기 배합은 하나 이상의 혼합기를 사용하지 않고 수행될 수 있고/있거나, 상기 배합은 보다 긴 시간 또는 보다 짧은 시간 동안 수행될 수 있다.

또한, 언급된 바와 같이, 단계 (1)에 따르면, 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물은 단일 사전결정된 용적 비로 배합된다. 이는 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물이 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 상기 방법을 수행하기에 적합한 것으로 미리 결정된 상기 단백질을 포함하는 조성물의 용적 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 용적의 비로 배합됨을 의미한다.

상기 방법은 또한 (2) 상기 처리 조성물을 처리 용기에 이동시키는 단계를 포함한다. 상기 처리 용기는 바이러스의 연속적 불활성화에 적합한 용기일 수 있다. 처리 용기에의 처리 조성물의 이동은 예를 들면, 처리 용기에의 가압 하에 유동하는 처리 조성물에 기초하여 발생할 수 있다.

보다 상세하게 처리 용기에 관하여 도 1을 참조하면 예시의 처리 용기(210)가 제공된다. 상기 예시의 처리 용기(210)는 주입구(220), 배출구(230) 및 정적 혼합기(240)를 포함하고, 내부 용적(212)을 갖고, 상기 주입구(220) 및 배출구(230)는 반대편 단부에 위치하고, 즉 예시의 처리 용기(210) 및 정적 혼합기(240)의 주축(270)의 주입구 단부(250) 및 배출구 단부(260)는 주축(270)을 따라 예시의 처리 용기(210)의 내부에 존재한다. 이러한 예에 따르면, 단계 (2)는 주입구(220)에서 발생하는 이동과 함께 처리 조성물을 예시의 처리 용기(210)로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 처리 용기(210)는 다른 형태들 중에서도 예를 들면, 컬럼 또는 튜브의 형태로 존재할 수 있다. 도 1, 도 2 및 도 3에 각각 도시된 바와 같이, 예시의 처리 용기(210)는 다른 형태들 중에서도 예를 들면, 직선형, 곡선형 또는 나선형인 형태를 가질 수 있고, 따라서 또한 다른 형태들 중에서도 예를 들면, 직선형, 곡선형 또는 나선형인 주축(270)을 가질 수 있다. 예시의 처리 용기(210)는 다른 재료들 중에서도 예를 들면, 금속, 플라스틱 또는 이들의 조합으로부터 제조될 수 있다. 상기 처리 용기는 1개의 정적 혼합기(240) 또는 효과적인 혼합을 보장하기 위해 적절하게 예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 다수의 정적 혼합기들(240)을 포함할 수 있다. 상기 정적 혼합기는 예를 들면, 배플(baffle), 오리피스(orifice), 충돌판(impingement plate) 및/또는 기타 인-라인 돌기(in-line protuberance)를 포함하는 한 유형의 정적 혼합기일 수 있다. 상기 정적 혼합기는 생물약제학적 프로세싱과 적합한 하나 이상의 재료, 예를 들면 생물약제학적 프로세싱과 적합한 금속, 플라스틱, 고무 및/또는 유리 중 하나 이상으로 이루어질 수 있다.

다른 처리 용기도 사용될 수 있다.

보다 상세하게 처리 용기에의 처리 조성물의 이동을 고려하면, 상기 이동은 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 혼합기를 포함하는 용기로부터 처리 용기로 이루어질 수 있고, 상기 용기는 하나 이상의 혼합기를 포함하고 상기 처리 용기는 유동적으로 연결, 즉 유체가 내부에서 그리고 적어도 한 방향으로 하나 이상의 혼합기를 포함하는 용기로부터 처리 용기로 유동할 수 있도록 연결되어 있다. 이동 속도는 예를 들면, 펌프에 의해 제어될 수 있다.

상기 방법은 또한 (3) 사전결정된 조건에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 단계 (3) 이전에 상기 처리 조성물 중에 바이러스가 예를 들면, 다수의 상이한 유형의 바이러스 및/또는 주어진 유형의 바이러스의 다수의 활성 입자로서 존재하는 한, 바이러스는 단계 (3) 동안 처리 용기 내에서의 인큐베이션에 기초하여 적어도 어느 정도 불활성화될 것이다.

사전결정된 조건은 바이러스의 불활성화에 유용한 처리 용기 내의 처리 조성물의 인큐베이션의 사전결정된 온도 및 사전결정된 시간과 같은 조건들의 조합일 수 있다. 처리 용기 내의 처리 조성물의 유동을 포함하는 처리 조성물의 인큐베이션을 위해, 사전결정된 인큐베이션 시간은 처리 용기 내의 처리 조성물의 유동 속도에 기초하여 반영될 수 있다.

따라서, 예를 들면, 처리 용기는 가열 요소의 사용에 의해 사전결정된 온도로 유지될 수 있고, 처리 조성물의 유동은 예를 들면, 펌프의 사용에 의해 사전결정된 속도로 유지될 수 있다. 또한, 예를 들면, 사전결정된 온도 및 사전결정된 속도는 바이러스의 불활성화를 원하는 정도로 달성하기에 충분한 전체 프로세스가

처리 용기 내의 처리 조성물을 특정 온도에서 그리고 특정 시간 동안 인큐베이션하고 충분성을 측정하고 확인하기 위한 각종 조건을 시험하는 것에 기초하여 개발될 수 있고, 이어서 일반적으로, 처리 조성물에 바이러스의 불활성화를 원하는 정도로 달성하기에 충분한 처리가 행해짐을 보장하기 위해서 처리 용기의 온도를 제어하고 처리 용기에 걸친 처리 조성물의 유동 속도를 제어함을 포함하는 단백질의 제조 동안 상기 프로세스를 적용한다는 의미에서 사전결정될 수 있다. 또한, 상기 방법은 존재할 수 있는 바이러스의 불활성화를 보장하기 위한 특정 계획에 따라 수행될 수 있다.

또한, 예를 들면, 사전결정된 조건은 17 내지 40℃의 사전결정된 온도 및 시간당 처리 용기의 내부 용적의 0.3 내지 3배인 처리 용기를 통한 처리 조성물의 사전결정된 유동 속도를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 사전결정되 온도가 증가함에 따라 사전결정된 속도도 증가될 수 있고, 그 반대로도 마찬가지이다. 역으로, 사전결정된 온도가 감소됨에 따라, 사전결정된 속도는 감소될 필요가 있을 수 있고, 그 반대로도 마찬가지이다. 이는 바이러스-불활성화 시약이 전형적으로 보다 높은 온도에서 보다 신속하게 처리 조성물 중의 바이러스를 불활성화시킬 수 있고, 따라서 상기 처리 조성물은 보다 짧은 시간 동안 여전히 바이러스의 불활성화를 원하는 정도로 달성하면서 처리 용기 내에서 인큐베이션될 수 있기 때문이다. 예를 들면, 사전결정된 온도는 18 내지 25℃일 수 있고, 사전결정된 속도는 시간당 처리 용기의 내부 용적의 0.5 내지 1.5배일 수 있다. 또한, 예를 들면, 사전결정된 온도는 30 내지 39℃일 수 있고, 사전결정된 속도는 시간당 처리 용기의 내부 용적의 0.8 내지 2.0배일 수 있다.

사전결정된 조건은 단계 (3) 동안에 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1 × 10¹의 인자만큼 야기하기에 충분할 수 있다. 예를 들면, 사전결정된 조건은 (3) 동안에 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1 × 10², 적어도 1 × 10³, 적어도 1 × 10⁴, 적어도 1 × 10⁵, 또는 적어도 1 × 10⁶의 인자만큼 야기하기에 충분할 수 있다. 이러한 예에 따르면, 사전결정된 조건은 바이러스 오염이 실제 존재하는지 여부에 관계없이, 바이러스 오염이 존재할 수 있는 조건 하에서뿐만 아니라 실제 바이러스 오염의 조건 하에서도 명시된 범위 이상으로 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분할 수 있다. 또한, 바이러스의 불활성화를 야기하기 위한 사전결정된 조건의 충분성은 특정 유형의 바이러스, 다수의 특정 유형의 바이러스들 및/또는 일반적 또는 다양한 범위의 바이러스들에 관한 불활성화와 연관될 수 있다. 또한, 바이러스의 불활성화를 야기하기 위한 사전결정된 조건의 충분성은 단계 (3) 동안 인큐베이션을 행한 처리 조성물의 단지 일부에, 예를 들면, 상기 방법이 수행된 기간의 부분 동안 처리 용기에서 인큐베이션된 처리 조성물의 일부에 또는 단계 (3) 동안 인큐베이션을 행한 처리 조성물의 전부에, 예를 들면, 상기 방법이 수행된 전체 기간 동안 시작부터 종료까지 인큐베이션된 처리 조성물의 전부에 관한 불활성화와 연관될 수 있다.

또한, 예를 들면, 처리 용기의 내부 용적은 처리 조성물의 1ppm(part per million) 이하가 단계 (3) 동안 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1×10¹의 인자만큼 야기하는데 필요한 것보다 더 짧은 지속기간의 처리 용기에서의 체류 시간을 가짐을 보장하기에 충분히 클 수 있다. 이와 관련하여, 상기 처리 용기는 단계 (3) 동안 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1×10¹의 인자만큼 야기하는데 필요한 것보다 더 짧은 시간 내에 처리 용기를 통해 유동할 수 있는 처리 조성물의 비율을 제어하고 최소화하기 위해, 처리 조성물이 처리 용기를 통해 유동함에 따라 처리 조성물의 축성 분산(axial dispersion), 즉, 처리 용기의 주축에 따른 처리 조성물의 분산을 처리하기에 충분히 큰 내부 용적을 갖는 것에 기초하여 제조되거나 선택될 수 있다. 예를 들면, 처리 용기는 축성 분산을 처리하기 위해 이론적인 플러그 유동 용적(theoretical plug flow volume)을 초과하는 여분의 용적을 포함하는 내부 용적을 갖는 것에 기초하여 제조되거나 선택될 수 있다. 용기의 이론적인 플러그 유동 용적 Vh^*은 용기 내의 조성물의 임계 보유 시간 Tr 및 용적측정 유동 속도 Q의 곱으로서 계산될 수 있다. 축성 분산을 처리하는데 필요한 여분의 용적은 다른 접근법들 중에서도 예를 들면, 층류 또는 플러그 유동에 테일러(Taylor) 분산 모델을 사용하거나, 난류에 가우시안(Gaussian) 모델을 사용하거나, 또는 주어진 정적 혼합기를 위해 특별히 개발된 모델을 사용함으로써 추정할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 처리 용기의 내부 용적은 처리 조성물의 1ppm 이하, 예를 들면 0.1ppm, 0.01ppm 또는 1ppb(part per billion) 이하가 단계 (3) 동안 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1×10¹의 인자만큼, 예를 들면 적어도 1×10², 적어도 1×10³, 적어도 1×10⁴, 적어도 1×10⁵, 또는 적어도 1×10⁶의 인자만큼 야기하는데 필요한 것보다 더 짧은 지속기간의 처리 용기에서의 체류 시간을 가짐을 보장하기에 충분히 클 수 있다. 또한, 예를 들면, 처리 용기의 내부 용적은 처리 조성물 중의 바이러스의 활성 입자의 1ppm 이하, 예를 들면 0.1ppm, 0.01ppm 또는 1ppb 이하가 단계 (3) 동안 바이러스-불활성화 시약에 의한 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1×10¹의 인자만큼, 예를 들면 적어도 1×10², 적어도 1×10³, 적어도 1×10⁴, 적어도 1×10⁵, 또는 적어도 1×10⁶의 인자만큼 야기하는데 필요한 것보다 더 짧은 지속기간의 처리 용기에서의 체류 시간을 가짐을 보장하기에 충분히 클 수 있다.

상기 논의된 바와 같은 예시의 처리 용기(210)를 고려하면, 언급된 바와 같이, 처리 조성물이 처리 용기(210)의 주축(270)을 따라 유동함에 따라 처리 조성물은 정적 혼합기(240)와 접촉하고, 예를 들면, 다수의 정적 혼합기(240)를 포함하는 처리 용기(210)에 대한 다수의 정적 혼합기(240)의 접촉을 포함한다. 이러한 접촉은 처리 용기(210)의 연속적 혼합을 제공하고, 따라서 처리 조성물의 축성 분산이 최소화된다. 따라서, 몇몇의 예에서 단계 (3)은 치료 조성물이 주축(270)을 따라 소정의 속도로 유동하여 정적 혼합기(240)에 접촉하면서 사전결정된 온도에서 예시의 처리 용기(210)에서 처리 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 사전결정된 온도 및 사전결정된 속도의 조합은 사전결정된 특성에 기초하여 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분하다.

다른 접근법들도 사용될 수 있다.

상기 방법은 또한 (4) 상기 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하는 단계를 포함한다. 사전-처리 프로세싱 조작에 대한 것과 유사하게, 후-처리 프로세싱 조작은 예를 들면, 상기 처리 조성물 중에 단백질과 함께 존재할 수 있는, 원하지 않는 잔해, 화합물 및/또는 다른 물질로부터 분리된, 단백질을 포함하는 현재-처리되는 조성물을 수득하기 위한 프로세싱 조작에 상응할 수 있다. 후-처리 프로세싱 조작은 다른 프로세싱 조작들 중에서도 예를 들면, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 분리를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 후-처리 프로세싱 조작은 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 바이러스 여과 배지를 통한 계대 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피에 관하여, 면역글로불린-결합 단백질 크로마토그래피와 유사하게, 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 다른 면역글로불린들 중에서도 예를 들면 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하는 면역글로불린을 정제하는데 유용하다. 음이온 교환 크로마토그래피에 적합한 음이온 교환 그룹으로는 예를 들면, 데티엘아미노에틸(DEAE라고도 칭함) 그룹, 폴리에틸렌이민(PEI라고도 칭함) 그룹 및 4급 암모늄(Q라고도 칭함) 그룹이 포함된다. 음이온 교환 그룹은 예를 들면, 적합한 해상도 및 속도에 기초한 단백질의 정제를 위한 최종 단계(폴리싱(polishing) 단계라고도 칭함)로서 사용될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 예를 들면, 고체 지지체 상의 음이온 교환 그룹의 존재에 기초하여 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 후-처리 프로세싱 조작은 예를 들면, 디에틸아미노에틸 음이온 교환 크로마토그래피, 폴리에틸렌이민 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 암모늄 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

단계 (4)에 따라 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행할 목적으로, 처리 조성물은 처리 용기로부터 예를 들면, 처리 용기로부터 처리 조성물을 수집함으로써 수득될 수 있다. 상기 수집은 예를 들면, 처리 조성물이 처리 용기로부터 예를 들면, 바이러스-불활성화 시약의 중화 또는 제거를 위한, 바이러스의 추가의 불활성화를 위한, 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하고/하거나 후-처리 프로세싱 조작을 직접 행하기 전에 보관을 위한 다른 용기로 유동하도록 하는 것에 상응할 수 있다.

또한 상기 논의된 바와 같은 예시의 처리 용기(210)를 고려하면, 언급된 바와 같이, 상기 처리 조성물은 주입구(230)에서 예시의 처리 용기(210)로부터 수집될 수 있고, 이어서 단계 (4)에 따라 후-처리 프로세싱 조작을 행할 수 있다.

상기 방법에 따르면, 단일 사전결정된 용적 비는 처리 조성물의 사전결정된 특성이 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질에 대해 예측된 농도 범위에 걸쳐 유지됨을 보장하도록 선택되었다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 용적은 상기 방법을 수행하기 전에 결정된, 상기 단백질을 포함하는 조성물의 용적 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 용적의 비로 배합된다. 구체적으로, 단일 사전결정된 용적 비는 처리 조성물의 사전결정된 특성이 단백질의 농도 변화에 반응하여 상기 용적 비를 변경할 필요 없이, 그리고 따라서 상기 단일 사전결정된 용적 비 이외의 다른 용적 비를 이용할 필요 없이 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질에 대해 예측된 농도 범위에 걸쳐 유지됨을 보장하도록 선택되었다.

놀랍게도, 단백질 A 용출물의 모노클로날 항체를 포함하는 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화에 필요한 바이러스-불활성화 시약의 농도는 주로 모노클로날 항체의 농도에 의해 유도된다는 것이 확인되었다. 따라서, 처리 조성물을 수득하기 위한, 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물과 배합될 것인 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질에 대해 예측된 농도 범위, 예를 들면, 면역글로불린-결합 단백질 친화성 크로마토그래피로부터의 용출물의 순차적 분획에서의 단백질에 대해 예측된 농도 범위를 결정함으로써 그리고 상기 단백질의 농도가 상기 범위의 상한을 실질적으로 초과하지 않을 것임을 보장함으로써, 바이러스의 연속적 불활성화 단계는 상기 처리 조성물의 용적 비의 조정 또는 전용 중 어느 하나에 의해 발휘되는 피드백 제어를 필요로 하지 않고 수행될 수 있다.

다른 방식으로 생각하면, 상기 방법은 화학적 제어를 이용하여 수행될 수 있고, 이는 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 이용하여 바이러스-불활성화 시약의 사전결정된 농도 및/또는 도입 단백질 스트림에 대한 엄격한 윈도우(window) 내의 pH를 갖는 처리 조성물을 유지하는 것을 의미한다. 상기 방법은 바이러스-불활성화 시약의 사전결정된 농도 및/또는 pH를 달성하기 위해, 프로브로부터의 활성 또는 동적 피드백 또는 출력에 기초한 비례-적분-미분(PID(proportional-integral-derivative)라고도 칭함) 제어 루프에 의존하기보다는 물리적으로 2개 이상의 용액, 예를 들면 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 펌프 계량즉, 처리 조성물의 모니터링에 의존할 수 있다. 단백질을 포함하는 조성물의 용적 및 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 용적의 비는 프로세스의 주요 인자에 대한 선험적 지식에 의해 사전결정된다. 따라서, 예를 들면, 펌프 계량을 위한 프로세스의 물리적 제어는 사전설정될 수 있고, 단일 용적 비는 상기 방법이 수행됨에 따른 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질의 농도 변화에도 불구하고 상기 방법 전체에 걸쳐 사용될 수 있다.

산, 예를 들면, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산 및/또는 아세트산을 포함하는 바이러스-불활성화 시약의 사용을 포함하고 단백질 A 항체 친화성 크로마토그래피를 포함하는 사전-처리 프로세싱 조작을 포함하는 상기 방법의 한 예를 고려하면, 상기 방법은 처리 조성물이 한 단위 조작으로부터 다음으로, 예를 들면 사전-처리 프로세싱 조작으로부터 후-처리 프로세싱 조작으로 인-라인 유동함에 따라 3.3 내지 3.7의 엄격하고 균일한 pH 범위 내에서 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물과 배합된 단백질 A 용출물을 포함하는 처리 조성물에 의해 상기 논의된 문제를 해소하여 pH 측정기에 의존하지 않고 바이러스 불활성화가 정확하게 그리고 효율적으로 달성되도록 한다. 상기 방법은 바이러스-불활성화 시약이 주어진 단백질에 대해 바이러스의 가장 효율적인 불활성화를 제공할 것이라는 선험적으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 바이러스-불활성화 시약은 단백질 A 항체 친화성 크로마토그래피로부터의 용출물에 부가하거나 상기 용출물로 적정하여 처리 조성물을 수득할 수 있다. 이어서, 상기 처리 조성물은 이것이 한 단위 조작으로부터 다음으로 유동함에 따라 3.3 내지 3.7의 pH 범위를 보유한다. 상기 방법은 상기 용출물과의 조합을 위한 바이러스-불활성화 시약 조성물의 부가를 개시하거나, 정지하거나, 또는 그렇지 않으면 상기 조성물의 부가 속도를 조정하기 위한 펌프의 기능 제어시 pH 측정기 또는 pH 피드백 루프에 의존하지 않는다. 오히려, 처리 조성물의 pH는 단일 사전결정된 용적 비의 사용에 기초하여 최적 범위 내로 유지된다. pH 측정기는 실시간 pH를 보고하지 않으므로, pH 측정기나 pH 피드백 루프에 의존할 필요성을 제거하는 것은 바이러스 불활성화 단계의 효율성 및 정확성을 향상시킨다.

바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 부가로 적정되는 단백질의 주요 종의 이해는 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화의 출력을 선험적으로 예측하는데 유용하다. 유용한 다른 변수들로는 단백질의 총 유효 전하, 적정 시점의 단백질의 배경 완충제, 적정제 강도(약산) 및 단백질 A 용출물과 바이러스 불활성화 시약이 혼합되는 비가 포함된다.

최근 적정은 단백질 A 용출 스트림에서 동적이고 변화하는 시스템을 제어하는 것과 관련된 복잡성(complexity) 때문에 회분식 또는 풀(pool)로서 자동화된다. 시스템의 선험적 지식 부재 하의 직접적 인-라인 적정은 하나 이상의 PID 루프, pH 프로브 및 펌프 계측에 대한 철저한 검증을 필요로 할 수 있다. 이러한 제어는 pH 프로브가 특히 신속한 피드백 환경에서 응답 지연, 드리프트(drift), 오프셋(offset)의 영향을 받기 쉽기 때문에 바람직하지 않다.

230nm 내지 600nm에서 흡착 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제를 포함하는 바이러스-불활성화 시약의 사용을 포함하는 상기 방법에 관해서도 유사한 고려사항이 적용된다.

따라서, 몇몇의 예에서, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물은 수학식 1에 의해 결정되고 수학식 2 및 수학식 3을 뒷받침하는 pH를 갖는다:

수학식 1:

수학식 2:

수학식 3:

이들 예는 화학적 제어 수학식의 사용을 포함하는 것으로 간주될 수 있다.

또한, 몇몇의 예에서, 상기 단백질을 포함하는 조성물에 대한 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 일정한 부가율 % v/v은 +/- 0.1 pH의 상한 및 하한 밴드를 갖는 표적 pH의 pH 범위 내에 밴드를 갖는다. 여기서, 일정한 % v/v은 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물과 상기 단백질을 포함하는 조성물을 백분율로서 표시되는, 상기 단백질을 포함하는 조성물의 용적당 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 용적으로서 제공되는 용적 비인 배합 과정 동안 변하지 않는 용적 비로 배합함을 의미한다. 이들 예에 따르면, 밴드를 갖는 불활성화 pH의 상한 밴드는 표적 pH + 0.1 pH와 동일하다. 밴드를 갖는 불활성화 pH의 하한 밴드는 바이러스-불활성화 시약, 예를 들면 적정제를 포함하는 조성물의 pH와 동일하다.

또한, 몇몇의 예에서, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 부가 % v/v은 수학식 4에 의해 결정되고 수학식 5 내지 수학식 9를 뒷받침한다:

수학식 4:

A는 바이러스 불활성화 시약의 부가 % v/v이다.

B는 최종 불활성화 시약 몰 농도이다.

C는 스톡(stock) 불활성화 시약 몰 농도이다.

최종 불활성화 시약 몰 농도 측정 = (최종 불활성화 짝염기 몰 농도 + 최종 불활성화 짝산 몰 농도)의 총합.

수학식 5:

D = 최종 불활성화 짝염기 몰 농도

E = 최종 불활성화 짝산 몰 농도

최종 불활성화 짝염기 몰 농도 측정 = 총 시스템 짝염기 몰 농도 - 총 시스템 비 시약 염기 몰 농도.

수학식 6:

F = 총 시스템 짝염기 몰 농도

G = 총 시스템 비 시약 염기 몰 농도

최종 불활성화 짝산 몰 농도 측정 = 총 시스템 짝산 몰 농도 - 총 시스템 비 시약 산 몰 농도.

수학식 7:

H = 총 시스템 짝산 몰 농도

비-불활성화 시약 염기 몰 농도의 측정은 배경 완충제 짝염기 종 및 단백질의 총 전하 몰 농도의 총합과 동일하다.

수학식 8:

I = 배경 완충제 몰 농도 / (1+(1/10^(pH_{ProA스트림}-pKA_{배경완충제})))

J = 단백질의 총 전하 몰 농도

주어진 pH 및 몰 농도에서의 총 단백질 전하의 측정은 불활성화 pH에서 차단되지 않은 총 전하를 곱한 몰 농도로서의 단백질이다.

수학식 9

K = 단백질 몰 농도

단백질 농도는 다운스트림(downstream) 단위 조작에서 접하는 농도와 동일하다. 단백질 A 스트림을 사용하면, 농도는 단백질 A 부하 시도, 용출 완충액의 강도(몰 농도 및 pH), 용출물의 유동 속도, 단백질 A 매트릭스와의 생성물 상호작용 및 분산 및 희석 후 용출 수준을 포함하는 몇몇의 인자들의 결과일 수 있다.

L = 총 차단되지 않은 단백질 전하

L은 내부 라이브러리로부터 사전결정되었다.

효과적인 단백질 전하는 문헌["Effect of Protein and Solution Properties on the Donnan Effect During the Ultrafiltration of Proteins" Glen R. Bolton, Biotechnol. Prog., 2011, Vol. 27, No. 1, pages 140-152 (단백질 분자 전하의 측정, pages 145-146)]에 기술되어 있는 방법에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

여기서, 원하는 바이러스 불활성화 pH = pKA_{바이러스 불활성화 시약} + log(총 시스템 짝염기 몰 농도/총 시스템 짝산 몰 농도)

M = N + Log(F/G)

M = 원하는 바이러스 불활성화 pH_{조작 온도}

N = 바이러스 불활성화 시약의 pKA_{조작 온도}

F = 총 시스템 짝염기 몰 농도

G = 총 시스템 짝산 몰 농도

또한, 몇몇의 예에서, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 부가 % v/v은 예를 들면, 선택된 바이러스-불활성화 시약의 부가 %, 초기 단백질 농도, 및 우세한 배경 완충제 몰 농도의 함수로서의 원하는 바이러스 불활성화 pH에 대한 값을 수렴시킴으로써 반복적으로 해결될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 단일 사전결정된 용적 비는 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 단백질의 농도 변화에 반응하여 상기 용적 비를 변경할 필요 없이, 그리고 따라서 상기 단일 사전결정된 용적 비 이외의 다른 용적 비를 이용할 필요 없이, 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질에 대해 예측된 농도 범위에 걸쳐 유지됨을 보장하도록 선택되었다. 상기 단백질을 포함하는 조성물과 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하는 것은 예를 들면 처리 조성물을 수득하기 위한 이들 조성물의 배합 동안 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물의 펌핑과 관련된 가변성(variability)에 따라 상기 단일 사전결정된 용적 비로부터 예를 들면 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 그리고/또는 1% 이하만큼 변하는 것에 기초하여 단일 사전결정된 용적 비와 약간 다른 용적 비로 상기 조성물을 배합하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법에 따르면, 단계 (1) 내지 단계 (3)은 (a) 연속적으로 그리고 (b) 상기 처리 조성물의 상기 용적 비의 조정 또는 전용에 의해 발휘되는 피드백 제어의 부재 하에 수행한다.

연속적으로 수행되는 단계 (1) 내지 단계 (3)에 관해서, 이는 단계 (1), 단계 (2), 및 단계 (3)이 연속적으로 수행됨, 즉 각각의 단계가 적어도 소정 시간 동안 상기 단백질을 포함하는 조성물, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물 및 상기 처리 조성물의 상이한 부분에 대해 동시에 수행됨을 의미한다. 예를 들면, 단계 (1), 단계 (2) 및 단계 (3)은 다른 시간의 양들 중에서도 적어도 1시간 동안, 적어도 4시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 3일 동안, 적어도 10일 동안, 또는 적어도 30일 동안 연속적으로 수행될 수 있다. 또한, 예를 들면, 단계 (4)는 단계 (1), 단계 (2) 및 단계 (3)과 연속적으로 수행될 수 있다. 또한, 예를 들면, 단계 (1), 단계 (2) 및 단계 (3)은 단지 단백질의 전체 제조 동안이 아니라 단백질의 제조 동안 생체에 의한 단백질의 실제 생산과 연속적으로 그리고 상기 단백질의 실제 생산과 동시에 연속적으로 수행될 수 있다.

상기 처리 조성물의 용적 비의 조정 또는 전용에 의해 발휘되는 피드백 제어의 부재 하에 수행되는 단계 (1) 내지 단계 (3)에 관해서, 이는 단계 (1) 내지 단계 (3)이 바이러스 불활성화의 사전결정된 특성으로부터 상기 처리 조성물의 잠재적 편차의 보정를 교정(correction)하지 않고 수행됨을 의미한다. 따라서, 단계 (1) 내지 단계 (3)은 상기 단백질을 포함하는 조성물 및 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물이 배합되는 용적 비의 조정에 의해 발휘되는 피드백 제어의 부재 하에 수행된다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 용적 비는 피드백 제어와 관련된 조정에 기초하지 않지만 예를 들면, 펌핑과 관련된 가변성에 따라 상기 단일 사전결정된 용적 비로부터 예를 들면 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하만큼 약간 변할 수 있다. 또한, 단계 (1) 내지 단계 (3)는 생성물 스트림으로부터의 처리 조성물의 전용, 예들 들면 처리 용기 및/또는 후-처리 프로세싱 조작으로부터의 전용에 의해 발휘되는 피드백 제어의 부재 하에 수행한다. 단계 (1) 내지 단계 (3)은 피드백 제어와 관련된 전용에 기초하지 않지만 다른 원인으로, 예를 들면, 단백질의 간헐적 샘플링으로 인한 생성물 스트림으로부터의 처리 조성물의 전용을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 몇몇의 실시형태들에서, 상기 방법은 또한 피드백 제어에 관한 것은 아니지만 예를 들면, 검증의 목적을 위해 상기 처리 조성물이 사전결정된 특성을 나타냄을 확인하는 것을 포함한다. 상기 확인은 처리 조성물의 특성, 예를 들면, pH, 전도성, 온도, 분광광도측정 특성 또는 분광학적 특성을 측정하는데 사용될 수 있는 검출기, 예를 들면, pH 측정기, 전도성 측정기, 온도 측정기, 분광광도측정 장치 또는 분광학적 장치의 사용에 의해 수행될 수 있다.

상기 단백질을 보다 상세하게 고려하면, 상기 단백질은 예를 들면 상기 언급된 단백질들 중 임의의 것, 예를 들면 이들 중에서도 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 효소 또는 혈액 응고 인자와 같은 치료학적 단백질, 또는 이들 중에서도 항원성 단백질과 같은 백신 단백질일 수 있다.

예를 들면, 상기 단백질은 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체일 수 있다. 또한, 예를 들면 상기 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체는 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 포유동물 항체, 뮤린 항체, 영장류 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 영장류화된 항체, 사람화된 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄와 면역글로불린 중쇄, 항체 단편, 항체 유도체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fc 단편, Fc-Fc 융합 단백질, Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편, 단일 도메인 Fv 단편, 4가의 단일쇄 Fv 단편, 디설파이드-연결된 Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 펜타바디, 미니바디, 미니항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인, 면역글로불린 단일 가변 경쇄 도메인, VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 단일-도메인 항체, 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 기능성 도메인과 모듈러 포맷(modular format)으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개 이상의 동일한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다가의 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토픽(biparatopic) 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이특이적 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 기능성 도메인을 포함하는 이-기능성 단백질, 도메인-결실된 항체, 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 항체 단편의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합, Fc-독소 융합, 및 항체 단편과 스캐폴드(scaffold) 단백질의 융합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

당해 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 항체는 일반적으로 유사한 전반적 구조, 즉 면역글로불린 구조를 공유하는 항체를 갖고 특정 항체가 이의 상응하는 항원에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 하는 고유한 구조를 갖는 각각의 특정 항체 분자를 갖는 특정 기질, 즉 이들의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질이다. 예시의 항체는 예를 들면, 문헌[Murphy et al., Janeway's Immunobiology, 7th edition, Garland Science, New York (2008)]에 기술되어 있다. 또한 익히 공지되어 있는 바와 같이, 항체는 예를 들면, 다른 문헌들 중에서도 문헌[Tamashiro et al., Monoclonal Antibodies, pp. 409-433, in Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy (eds. Castilho et al.), Taylor & Francis Group, New York (2008)]에 기술되어 있는 바와 같이, 상기 항체가 생성된 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체에 상응할 수 있고, 상기 항체가 유래하거나 유도된 유기체에 따라 포유동물 항체, 뮤린 항체, 영장류 항체 또는 사람 항체에 상응할 수 있고, 상기 항체를 특정 유기체에서 사용하기에 보다 적합하도록 만들기 위해 상기 항체가 변형되었는지 여부에 따라 키메라 항체, 영장류화된 항체 또는 사람화된 항체에 상응할 수 있고, 항체의 구조에 따라 이들 중에서도 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 또는 면역글로불린 경쇄와 면역글로불린 중쇄에 상응할 수 있다.

또한 익히 공지되어 있는 바와 같이, 항체 단편 및 항체 유도체는 항체로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, Fab 단편(항원-결합 단편이라고도 칭함)은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 각각의 가변 영역들로 이루어지고, 이들은 인접한 불변 영역들에 의해 함께 고정되어 있다. Fab 단편은 종래 항체로부터 예를 들면 파파인을 이용한 프로테아제 분해(digestion)에 의해 또는 유전자 조작에 의해 형성될 수 있다. 유사하게, F(ab')₂ 단편은 또한 인접한 불변 영역에 의해 함께 고정된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 각각의 가변 영역들을 포함한다. F(ab')₂ 단편은 펩신에 의한 단백질분해성 절단에 의해 제조될 수 있다.

또한, 유전자 조작 방법을 이용하여 Fv 단편(가변성 단편이라고도 칭함)이라고 칭하는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들만으로 이루어진 단축화된 항체 단편을 생산할 수 있다. Fv 단편에는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 불변 영역이 결여되어 있고, 따라서 이들의 시스테인 사이에 공유 결합이 결여되어 있으므로, Fv 단편은 종종 안정화될 것이다. 예를 들면, Fv 단편을 안정화시키기 위해 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 링크하는데 짧은 펩타이드를 이용하는 것이 유리하다. 짧은 펩타이드는 예를 들면, 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일-쇄-Fv(scFv라고도 칭함)로서 공지되어 있다. 예시의 이러한 종류의 scFv-항체 단백질은 문헌[Huston et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85:5879-5883 (1988)]에 의해 기술되어 있다.

또한, 최근 수년간 scFv를 다량체성 유도체로서 제조하기 위한 각종 전략들이 개발되어 왔다. 이는 특히 약동학적 및 생물학적 분류(biodistribution) 특성이 개선된 또한 결합가(binding avidity)가 증가된 재조합 항체를 유도하도록 의도된다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조되었다. 다량체화 도메인은 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG라고도 칭함)의 CH3 영역 또는 코일드 코일(coiled coil) 구조(나선 구조), 예를 들면 류신-지퍼 도메인일 수 있다. 또한, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화를 위해 사용되는 전략들, 이들 중에서도 디아바디, 트리아바디 및 펜타바디가 존재한다.

따라서, 예를 들면 디아바디는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체이다. scFv 분자에서 링커를 5 내지 10개 아미노산으로 단축시키는 것은 쇄간 VH/VL-합성(superimposition)이 발생하는 동종이량체의 형성을 유도한다. 디아바디는 디설파이드 가교의 혼입(incorporation)에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 예시의 디아바디는 예를 들면, 문헌[Perisic et al., Structure 2:1217-1226 (1994)]에 의해 기술되어 있다.

또한, 예를 들면, 트리아바디는 3가의 동종삼량체성 scFv 유도체이다. 링커 서열 없이 VH-VL이 직접 융합되어 있는 scFv 유도체는 삼량체의 형성을 유도한다. 예시의 트리아바디는 예를 들면, 문헌[Kortt et al., Protein Engineering 10:423-433 (1997)]에 의해 기술되어 있다.

또한, 예를 들면, 미니바디는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체이다. 미니바디는 힌지(hinge) 영역(예를 들면, 또한 IgG1 유래) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결되어 있는 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 예시의 미니바디 항체 단백질은 예를 들면, 문헌[Hu et al., Cancer Research 56:3055-3061 (1996)]에 의해 기술되어 있다.

또한, 예를 들면, 미니항체는 2가, 3가 또는 4가 구조를 갖는 scFv 유도체이다. 미니항체 다량체화는 예를 들면, 문헌[Lovejoy et al., Science 259:1288-1293 (1993), Pack et al., Biotechnology 11:1271-1277 (1993)] 및 문헌[Pack et al., Journal of Molecular Biology 246:28-34 (1995)]에 개시되어 있는 바와 같이 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 코일드 코일 구조에 의해 수행된다.

항체 단편 및 항체 유도체는 또한 예를 들면 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 문헌[Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들면, 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인(VH 도메인이라고도 칭함) 또는 면역글로불린 단일 가변 경쇄 도메인(VL 도메인이라고도 칭함)일 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 또한 예를 들면, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]에 기술되어 있는 바와 같이 카멜리드 중쇄 항체로부터 유도된, VHH 도메인, 바람직하게는 사람화된 VHH 도메인일 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 또한 예를 들면, 단일-도메인 항체일 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 또한 1개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 치료학적 단백질, 예를 들면, NANOBODY(R)(Ablynx N.V.에 의해 소유된 상표)일 수 있다.

항체 단편 및 항체 유도체는 또한 예를 들면, 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 기능성 도메인과 모듈러 포맷으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이러한 단백질의 예로는 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개 이상의 동일한 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면 2개 이상의 동일한 VHH 도메인을 포함하는 다가의 단백질, 각각 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면, 2개의 상이한 VHH 도메인을 포함하는 바이파라토픽 단백질, 및 각각 상이한 항원을 인식하는, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들면, 2개의 상이한 VHH 도메인을 포함하는 이특이적 단백질이 포함된다. 이러한 단백질의 예로는 또한 모듈러 포맷으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 기능성 도메인을 포함하는 이-기능성 단백질이 포함된다. 또한, 예로는 다가의, 바이파라토픽, 이특이적 및 이-기능성 치료학적 단백질 NANOBODY(R)이 포함된다.

항체 단편 및 항체 유도체는 또한 예를 들면, 항체 단편과 스캐폴드 단백질의 융합, 즉, 단일 폴리펩타이드 쇄를 형성하기 위해 융합된 항체 단편을 포함하는 단백질 및 스캐폴드 단백질을 융합을 포함한다. 이러한 문맥에서, 스캐폴드 단백질은 예를 들면, 유전자 클로닝에 의해 또는 동시-번역 프로세스에 의해 항체 단편과 커플링된 다른 단백질의 임의의 기능성 도메인일 수 있다.

다른 유형의 단백질을 고려하면, 목적하는 단백질은 또한 예를 들면, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 인터류킨(IL)과 같은 사이토카인, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자(TNF), 예를 들면 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL, 또는 G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 또는 VEGF일 수 있다. 목적하는 단백질은 또한 예를 들면, 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장 인자일 수 있다. 목적하는 단백질은 또한 예를 들면, DARPin일 수 있다.

상기 단백질은 숙주 세포에 의해 제조될 수 있다. 숙주 세포는 예를 들면, 상기 언급된 세포들 중 임의의 것, 이들 중에서도 예를 들면, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 세균 세포일 수 있다. 숙주 세포는 예를 들면, BHK21, BHK TK^-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 또는 CHO-DG44 세포와 같은 햄스터 세포, 또는 이러한 세포주의 유도체/후손(progeny)일 수 있다. 상기 숙주 세포는 또한 예를 들면, 뮤린 골수종 세포, 예를 들면, NSO 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/후손일 수 있다. 상기 숙주 세포는 또한 예를 들면, 이들 세포의 유도체/후손, 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 다른 포유동물 세포, 또는 효모 세포 및 곤충 세포를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 진핵생물 세포일 수 있다. 예시의 숙주 세포는 이들 중에서도 예를 들면, 문헌[Leo et al., Animal Cells: Basic Concepts, pp. 13-37, in Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy (eds. Castilho et al.), Taylor & Francis Group, New York (2008)]에 기술되어 있다.

상기 숙주 세포는 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 예를 들면, 상업적으로 입수가능한 배지, 예를 들면, Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium)(MEM; Sigma), 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM; Sigma), CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, Calif.), CHO-S-Invitrogen), 무-혈청 CHO 배지(Sigma), 및 무-단백질 CHO 배지(Sigma)일 수 있다. 임의의 배지에는 필요에 따라 각종 화합물을 보충할 수 있고, 이의 예로는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자들(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염(예를 들면, 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제(예를 들면, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들면, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지 공급원, 항생제, 미량 원소가 포함된다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 예시의 배양 배지는 이들 중에서도 예를 들면, 문헌[Moraes et al., Culture Media for Animal Cells, pp. 111-128, in Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy (eds. Castilho et al.), Taylor & Francis Group, New York (2008)]에 의해 기술되어 있다.

숙주 세포에 의한 목적하는 단백질의 발현은 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 숙주 세포 내에서의 전사 및/또는 번역을 포함할 수 있다. 목적하는 단백질의 발현 수준은 다른 접근법들 중에서도 예를 들면, 숙주 세포 내에 존재하는 목적하는 단백질을 암호화하는 상응하는 mRNA의 양, 숙주 세포 내에 존재하는 목적하는 단백질의 양 또는 숙주 세포로부터 분비된 목적하는 단백질의 양에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 상응하는 mRNA는 문헌들 중에서도 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d edition, New York, Cold Spring Laboratory Press (1989)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987-2014)]에 의해 기술되어 있는 바와 같이, 다른 접근법들 중에서도 노던 블롯 하이브리드화(Northern blot hybridization), 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 동일반응계내(in situ) 하이브리드화 또는 RT-PCR에 의해 정량될 수 있다. 또한, 예를 들면, 숙주 세포 내에 존재하거나 숙주 세포로부터 분비된 목적하는 단백질의 양은 또한 문헌[Sambrook et al. (1989), and Ausubel et al. (1987-2014)]에 의해 기술되어 있는 바와 같이, 각종 방법에 의해, 이들 중에서도 예를 들면, ELISA에 의해, 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해, 방사성 면역검정에 의해, 면역침전에 의해, 단백질의 생물학적 활성에 관한 검정에 의해, 단백질의 면역염색 후 FACS 분석에 의해, 또는 균질 시간-분해 형광성(HTRF: homogeneous time-resolved fluorescence) 검정에 의해 정량될 수 있다.

배양 배지에서의 숙주 세포의 배양은 숙주 세포에 의한 단백질의 발현과 함께, 비연속적 방식, 예를 들면, 회분식 배양 또는 유가식 배양으로 또는 연속적 방식, 예를 들면, 관류를 이용한 연속 배양으로 수행되는 바와 같이 그리고 임의의 적합한 규모, 예를 들면, 실험실, 파일럿 또는 생산 규모로 수행되는 바와 같이, 상기 언급된 단백질을 생산하기 위한 프로세스들 중 임의의 것, 예를 들면, 균질 프로세스, 예를 들면, 교반-탱크 생물반응기, 에어-리프트 생물반응기 또는 웨이브 생물반응기의 사용에 기초한 현탁 배양, 또는 비균질 프로세스, 예를 들면, 마이크로캐리어-기반 시스템, 충전층 생물반응기, 또는 중공-섬유 생물반응기에 기초한 부착 배양에 의해 수행될 수 있다. 예시의 프로세스는 예를 들면, 문헌[Veliz et al., Bioreactors for Animal Cells, pp. 221-258, in Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene]에 의해 기술되어 있다.

상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질은 각종 농도로 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질의 농도는 10 내지 70mg/mL일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 단백질의 농도는 20 내지 65mg/mL, 30 내지 60mg/mL, 40 내지 55mg/mL 그리고/또는 약 50mg/mL일 수 있다.

단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법에 따라 제조된 단백질도 제공된다. 상기 단백질은 상기 기술된 바와 같은 단백질일 수 있다.

단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법을 수행하기 위한 예시의 시스템(500)이 도 4에 도시되고, 이는 화학적 제어를 위한 바이러스 불활성화 유동 경로를 도해한다. 예시의 시스템(500)은 (i) 단백질 스트림 주입구(510), 예를 들면 단백질 A 용출 스트림 및/또는 생성물 스트림 주입구, (ii) 바이러스-불활성화 시약 용액 주입구(520), 예를 들면 산/적정제/불활성화 용액 주입구, 및 정적 혼합기(240), 예를 들면 저 pH 정적 혼합기를 포함하는 처리 용기(210)를 포함한다. 상기 방법은 상기 논의된 바와 같이 예시의 시스템(500)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 사전-결정된 바이러스 적정제의 부가 속도 %는 주 생성물 유동에 부가되어 pH 및 불활성화를 엄격하게 제어한다. 예시의 시스템(500)에 따르면, pH 검출기는 프로세스를 측정하는데 사용되지만, 프로세스를 제어하는 것은 아니다. 따라서, pH 검출기는 단지 pH를 모니터링하기 위해 사용되고, 예시의 시스템(500)에의 산 부가의 양 또는 시점을 제어하기 위한 것은 아니다.

제공되는 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법의 이점은 하기를 포함한다: (1) 바이러스 불활성화를 위한 최적 pH 범위인 3.3 내지 3.7의 엄격한 pH 범위, 예를 들면 pH 3.4 내지 3.6에서 연속적 바이러스 불활성화를 제공한다; (2) 수학적 식에 의해 바이러스 불활성화 시약 %를 사전결정한다; (3) 일정한 용적 부가에 의해 pH 및 농도 조정의 동적 제어를 피한다; (4) 연속적 또는 주기적 프로세스 스트림을 불활성화시킨다; (5) 연속적 및 주기적 단계에서 정적 프로세스 홀드(hold) 및 관련된 수수조(break tank)를 제거한다; (6) 스트림 불활성화를 자동화하고 바이러스 불활성화를 즉시 개시한다; (7) 동적 스트림 및 용액 농도 및 pH를 이용하여 불활성화를 처리한다; (8) 임의의 프로세스 유동 속도를 불활성화시킨다; (9) 불활성화를 프로세스 유동 속도에 자동으로 매칭한다; (10) 단백질 A 용출 스트림을 불활성화시킨다; (11) 불활성화의 과-적정을 피하고 생성물 품질을 보존한다; (12) 시스템의 주기적 섹션에 불활성화 단계를 배치하여 연속적 저 pH 바이러스 불활성화 시스템의 임의의 구성을 사용한다; (13) 예를 들면, 저 pH에서의 바이러스의 불활성화 후에 그리고 음이온 교환 크로마토그래피의 추가의 프로세싱 조작 전에 염기 부가를 위한 동일한 접근법을 사용한다(따라서 불활성화보다는 오히려 적정에 상응함); (14) 다음의 단위 조작을 위한 원하는 조건을 달성한다; (15) 세제 불활성화를 위해 동일한 접근법을 사용한다; 그리고 (16) 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비용, 복잡성, 시간 및 시설 크기를 최소화한다.

또한, 샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 표적 분자를 정제하기 위한 프로세스 동안 샘플이 제1 단위 조작으로부터 제2 단위 조작으로 유동함에 따라 상기 샘플을 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약과 연속적으로 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 따르면, 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약 대 샘플의 비는 피드백 제어 메커니즘과 독립적으로 또는 피드백 제어 메커니즘의 부재 하에 결정된다.

샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법은 상기 논의된 원칙 및 접근법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 샘플은 상기 논의된 바와 같은 단백질을 포함하는 조성물에 상응할 수 있다. 또한, 예를 들면 상기 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약은 상기 논의된 바와 같이 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물 중에 제공될 수 있다. 또한, 예를 들면 제1 단위 조작은 상기 논의된 바와 같은 사전-처리 프로세싱 단계일 수 있다. 또한, 예를 들면 제2 단위 조작은 상기 논의된 바와 같은 후-처리 프로세싱 단계일 수 있다. 또한, 예를 들면 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약 대 샘플의 비는 미리 결정될 수 있고, 따라서 상기 논의된 바와 같이 사전결정된다. 또한, 예를 들면 하나 이상의 바이러스-불활성화 시약 대 샘플의 비는 상기 논의된 바와 같이 pH 제어 피드백 루프와 같은 피드백 제어 메커니즘과는 독립적으로 또는 피드백 제어 메커니즘의 부재 하에 결정될 수 있다.

이러한 방법에 따르면, 상기 하나 이상의 바이러스 불활성화 시약 대 샘플의 비는 수학식 1에 의해 % v/v으로서 상기 논의되고 수학식 2 및 수학식 3을 지지하는 바와 같이 결정될 수 있다:

수학식 1:

수학식 2:

수학식 3:

샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법에 따라 제조된 단백질도 제공된다. 상기 단백질은 상기 기술된 바와 같은 단백질일 수 있다.

제공되는 샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법의 이점은 상기 논의되는 바와 같은 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키기 위한 방법의 이점과 유사하다.

실시예

실시예 1

통합된 생물학적 프로세싱(bioprocessing)은 보다 유연하고 관리가능한 임상학적 제조와 관련하여 이점을 제공할 수 있다. 연속적/통합된 프로세싱은 예를 들면, 증가된 자동화, 감소된 장비 크기, 증가된 수지 이용을 통해 견고성을 더하고 비용을 절감할 수 있다.

예시의 연속적인 제조 프로세스는 (i) 관류 반응기 및 수확, (ii) 연속적 단백질 A 포획(예를 들면, 2개 이상의 컬럼 포함), (iii) 연속적 저 pH 바이러스 불활성화 및 (iv) 폴리싱 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피)를 포함한다. 저 pH 바이러스 불활성화는 이러한 프로세스에서 매우 중요하다.

이러한 문맥에서, 바이러스의 연속적 불활성화를 위한 화학적 제어 개념은 여기에 개시된다. 목적은 전체 용액에 걸쳐 엄격한 저 pH 윈도우를 유지하기 위한 단일 비로의 단일 적정제 용액을 개발하는 것이다. 이는 pH 반응에 의해 좌우되는 PID 피드백 루프보다는 펌프-수준의 견고성에 의존할 것이다. 주요 인자는 바이러스-불활성화 시약으로서 사용하기에 적합한 적정제를 결정하는 것이고, 보다 구체적으로는 적정제가 용출액에 부가될 수 있는 % v/v, 적정제에 적합한 농도 및 pH 3.4 내지 3.6에 상응하는 바이러스의 불활성화를 위한 출력값을 수득하기 위한 적정제에 적합한 pH를 결정하는 것이다.

현재의 업계 관행은 회분식 단백질 A 용출 및 풀 불활성화에 의존한다. 회분식 프로세스에서, 하나의 컬럼 용적 대 몇몇의 컬럼 용적의 재료가 용출물로부터 컨테이너로 풀링된다. 상기 풀을 약산을 이용한 수동으로 적정하여 낮은 pH를 달성하고, 따라서 바이러스 불활성화가 개시된다. 최근 낮은 pH 불활성화는 자동화된 적정으로 수행된다. 이는 예를 들면, pH 3.8 내지 4.0에서 12 내지 15g/L의 단백질을 포함하는 단백질 A 용출물 풀을 수득하기 위해 단백질 A 용출액을 풀링하고, 이어서 약산을 이용하여 상기 풀을 1 내지 10%로 적정하여 3.5의 pH를 달성하는 것을 포함할 수 있다.

화학적 제어 개념을 시험하기 위해서, 오프-라인 분획화(fractionation)에 기초하여 분획 적정제 요건을 결정하였다. 흥미롭게도, 단백질 A 용출물은 용출 과정에 걸쳐 약 pH 7.5로부터 약 pH 4.5로의 pH를 감소시키지만, 최고 pH, 즉 약 pH 7.5를 갖는 단백질 A 용출물의 분획은 보다 낮은 pH를 달성하기 위한 적정제에 대한 가장 큰 필요성을 초래하지 않았다. 놀랍게도, 오히려, 적정제에 대한 필요성은 단백질 A 용출물의 분획에서의 단백질의 농도에 의해 유도되었다. 이는 도 5에 도시되고, 이는 필요로 하는 적정제 백분율이 단백질 농도와 강하게 상호관련되어 있음을 도해한다.

이들 결과에 기초하여, 한 모델의 주요 인자들이 드러났다. 주요 인자들로는 용출 동안(또는 적정 이전에) 피크 단백질 농도 및 단백질 전하를 포함하는 단백질 변수가 포함된다. 주요 인자들로는 또한 모노클로날 항체 안정성 및 바이러스 청소율(clearance)에 관한 min/max pH 및 혼합 및 희석 영향에 관한 min/max 부가 %를 포함하는 적정제 변수가 포함된다. 다른 고려사항으로는 크로마토그래피 완충제 및 유동 속도 영향은 주어진 플랫폼에 관해 일정함에도 불구하고 이들이 포함된다. 다른 고려사항으로는 또한 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 폴리싱에 관한 음이온 고려사항이 포함된다.

완충제 등가물로서의 피크 영향을 고려하면, 상기 모델은 피크 단백질 용출물에서 단백질 및 전하가 100mM 완충제보다 크거나 이와 동일함을 예측한다. 세척 완충제는 10mM 완충제에 상응한다.

제한조건(constraint) 내의 최악의 경우의 피크 농도를 고려하면, 현재의 제한 하에서 용출 최대 피크 농도는 약 50g/L였다. 이는 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 48 내지 58g/L(10% 동적 결합 능력)에 상응하는 2개의 모노클로날 항체에 기초한 것이다. 용출 완충제는 플랫폼에 관해 일정하게 유지되었다. 농도는 초기 0.1mm 경로 길이 및 100+ Au/cm 선형성(linearity)으로 사용된 Flow VPE Kinetic에 기초하여 정렬되어 결정되었다.

각종 단백질에 대한 전하 밀도의 스펙트럼이 확인되었다. 흥미롭게도, 표 1에 도시된 바와 같이, 전하 밀도는 다른 단백질과는 대조적으로 모노클로날 항체에 대해 상대적으로 군집되었다.

상기 결과는 보편적인 적정제 조건이 모노클로날 항체를 제조하기 위한 프로세스에서 바이러스의 연속적인 불활성화에 대해 가능할 수 있음을 시사한다.

화학적 제어 수학식이 개발되었다. 수학식에 따라, 바이러스 불활성화 pH에 관한 조건은 염기 적정제로서 (MAb(mol/kg) * 유효 MAb 전하 델타)로 약산에 대한 헨더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbalch) 수학식을 사용하여 결정할 수 있다.

인 라인 명령으로는 하기가 포함된다:

단백질 A 용출물 유동 속도 + 일정한 적정제 부가 % = 밴드를 갖는 불활성화 pH.

이러한 접근법에 따르면, 바이러스의 불활성화를 위한 pH의 상한 밴드는 표적 pH + 0.1 pH와 동일하다. 하한 밴드는 적정제 pH와 동일하다.

예시적인 모노클로날 항체 MAb2에 대한 조건 조절(conditioning) %, 생성물 g/L, 적정제 몰 농도 및 적정제 pH에 관해 조작 윈도우에 대한 모델 데이터를 생성하였다. 각종 적정제 용액에 관한 결과는 도 6에 도시한다. 공간 전체에 걸친 평평한 곡선이 이상적이다. 나타내어질 수 있는 바와 같이, 50g/L의 모노클로날 항체 농도에서 pH 3.5을 용해시키는 조합은 소수이다.

적정제 용액의 서브세트는 추가 시험을 위해 고려되었다. 적정제 용액의 서브세트에 관한 결과는 도 7에 도시된다. pH 3.3에서의 2M 글리신에 상응하고 따라서 3.5의 표적 pH 미만인 0.2 유닛(unit)에 상응하는 리드(lead) 적정제 용액이 선택되었다. 이들 중에서도, 도 7로부터 나타내어질 수 있는 바와 같이, pH 3.3에서의 3M 글리신의 적정제 용액이 적합할 것이다. 흥미롭게도, 비록 pH 3.3에서의 3M 글리신의 적정제 용액이 이론적 고려사항에 기초하여 더 우수한 것으로 보일 수 있지만, pH 3.3에서의 2M 글리신의 적정제 용액에 관한 것보다 더 낮은 부가 용적에 기초하여 50g/L의 모노클로날 항체 농도에서 pH 3.5에 대해 용해시키는데 사용될 수 있다는 점을 감안하면, 놀랍게도 pH 3.3에서의 2M 글리신의 적정제 용액이 이들의 부가 동안 pH 및 적정제 농도의 보다 정밀한 제어의 관점에서 pH 3.3에서의 3M 글리신의 적정제 용액에 비하여 이점을 제공하고, 따라서 단백질에 대한 원하지 않는 보다 낮은 부작용을 제공하, 시스템의 사용시 상응하는 보다 큰 유연성을 제공함이 관찰되었다. 따라서, 나타내어질 수 있는 바와 같이, pH 3.3에서의 2M 글리신의 리드 적정제 용액은 33%의 우수하게 매칭된 부가 용적(적정제 용액 용적/용적물 용적 %로서 표현됨, 이는 백분율로서 표현되는 단백질 A 용출물의 용적당 적정제 용액의 용적을 의미한다)을 초래하였다.

선택된 적정제의 모노클로날 항체 전하 영향은 표 2에 나타낸 바와 같이 측정되었다.

상기 결과는 모노클로날 항체의 확산이 27 내지 34%의 리드 적정제의 부가 용적(또한 적정제 용액 용적/용출액 용적 %로서 표현됨)으로 용해될 수 있음을 시사한다. 나타내어질 수 있는 바와 같이, 직접적 적정은 모델 출력을 지지한다. 상기 결과는 보편적인 적정제가 가능할 수 있음을 시사한다. 이는 현재 산업 관행과 관련된 용적성 비효율성 대신에 단순성과 견고성을 고려할 수 있다.

탈선에 대한 이러한 접근법의 견고성도 시험하였다. 도 8에 도시되는 바와 같이, 60g/L의 보다 높은 농도로의 모노클로날 항체의 탈선은 단지 0.03 유닛의 pH 증가를 초래하였다. 또한, 보다 낮은 농도로의 모노클로날 항체의 탈선은 리드 적정제의 pH, 즉 pH 3.3으로의 pH 감소를 초래하였다. 또한, 도 9에 도시되는 바와 같이, 리드 적정제의 부가 용적 %에 관한 15%의 상대적 부가 탈선(예를 들면, 모델링 펌프 탈선)은 0.02 유닛의 pH 변화를 초래하였다.

이들 결과 및 기타는 이어지는 실시예에서 보다 상세하게 고려된다.

실시예 2

저 pH 연속적 바이러스 불활성화를 위한 일반적 조건

연속적 프로세스를 위한 저 pH 연속적 바이러스 불활성화를 가능하게 하기 위해서, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출물에 상응하는 생성물을 산(예를 들면, 1.5 내지 3M 글리신 또는 아세트산)에 상응하는 바이러스-불활성화 시약과 3-방향 밸브를 이용하여 인-라인 혼합하고, 정적 혼합기를 통과시킨다. 정적 혼합기의 치수는 산과 생성물 스트림의 효율적 혼합을 가능하게 하도록 선택한다. 예를 들면, 60분 일 수 있지만, 또한 예를 들면 1 내지 5분만큼 짧을 수도 있는 강한 바이러스 불활성화에 충분한 체류 시간을 제공하기 위해서, 정적 혼합기 후에 충분한 용적의 튜브가 이어질 수 있다. 바이러스 불활성화를 종료하기 위해서, 바이러스 불활성화된 스트림을 3-방향 밸브를 이용하여 염기(예를 들면, 1 내지 2M HEPES pH 8.0 또는 pH 11에서의 Tris-염기)와 혼합하고, 혼합을 가능하게 하고 pH를 연속적 프로세스에서 다음의 정제 단계에 적합한 pH, 예를 들면 전형적으로 pH 5 내지 8.1로 증가시키기 위해서 정적 혼합기를 통과시킨다.

실시예 3

이러한 실험에서, MAbD라고 명명하는 모노클로날 항체는 용출에 앞서 중성 pH 용액 또는 단백질 A 세척 용액으로 투석여과하였고(diafiltered) 바이러스 불활성화 용액으로 수동 적정하였다. 상기 실험의 목적은 모델이 상이한 단백질 농도에서 적정제 필요성 %를 얼마나 정확하게 예측했는지를 정량화하는 것이었다.

이들 연구에서 사용되는 MAbD는 화학적으로 정의된 배지에서 성장된 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생성된 정제된 사람화된 IgG2였다. 상기 단백질에는 150,000달톤(Dalton)의 분자량이 할당되었다. 이론적인 등전점은 아미노산 서열로부터 측정되었고, 이의 실제 등전점은 등전점 전기영동 겔로부터 측정되었다. 사용된 재료는 단백질 A 리드 재료 또는 정제된 사전-형성 재료 중 어느 하나였다.

단백질 농도는 Cary 50 Bio, Varian Instruments와 통합된 SoloVPE, C Technologies와 그리고 Cary 50 Bio, Varian Instruments와 통합된 FlowVPE, C Technologies와 인-라인으로 UV 분광광도계를 사용하여 정적으로 측정되었다. UV 흡광도로부터 단백질 농도를 계산하기 위해 사용된 흡광 계수(extinction coefficient)는 이론으로부터 예측되었다.

활성 온도 보상을 갖는 Thermo/Orion 4-Star pH 측정기로 단백질 pH를 정적으로 측정하였다. pH 프로브는 실온 22 ±3℃에서 측정된 Orion 8102BNUWP ROSS Ultra pH 전극이었다.

시스템의 Protein A 용출 완충액은 아세테이트 또는 글리신으로 구성되고, 이는 측정된 샘플에서 영향력이 강한 온도 계수 pH 오프셋(offset)을 갖지 않는다. 낮은 pH 불활성화 시약은 아세테이트 또는 글리신으로 구성되며, 이는 또한 측정된 샘플에서 영향력이 강한 온도 계수 pH 오프셋을 갖지 않는다.

측정의 가변성은 Tris 또는 포스페이트로 구성될 수 있는 사전-용출 단백질 A 세척 용액으로부터 발생할 수 있다. 추가로, 단백질 구조 및 적정가능한 아미노산은 온도-의존적인 오프셋을 입증할 수 있다.

Protein A 정제는 AKTA Explorer 100 시스템에서 수행되었고, pH는 통합 프로브로의 경향을 보였다. 분자는 60 내지 240cm/hr의 가변 유동 속도에서 10%의 동적 결합 능력(DBC라고도 칭함)까지 새로운 저 주기 번호 수지에 부하되었다. 사용된 단백질 A 매트릭스는 MabSelect 매트릭스 또는 MabSelect Sure LX 매트릭스 중 어느 하나였다. 컬럼 높이는 19 내지 26cm였다. 부하된 컬럼을 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 하나 이상의 세척 용액으로 세척하였고, 적정 필요성이 낮은 용액에 컬럼을 위치시켰다. 용출은 60 내지 240cm/hr에서 25mM 나트륨 아세테이트 pH 3.5 또는 150mM 글라이신 pH 3.5 중 어느 하나로 수행하였다.

단백질 A 정제를 위한 예시의 파일럿 규모 프로토콜은 하기와 같다. 부하 재료에 관해서, 역가(titer)는 3.2mg/mL에 상응한다. 상기 컬럼은 40mg/mL로 부하되었다. 유동 속도 및 용적은 표 3에 제공된다. 단백질 A 스트림 용출 동안, 추가의 유동 속도는 AKTA cVI Explorer 시스템을 통해 가해졌다. 적정제 부가 %는 30%(또한 적정제 용액 용적/용출물 용적 %로서 표현됨)였다. 용출 스트림 부가를 위한 펌프 A 유동 속도는 18.25mL/min이었다.

정적 적정 측정을 위한 재료는 풀로서 상기 기술된 단백질 A 정제로부터 취하였고, pH 7.5 ± 0.2로 중화시켰고, 추가로 투석여과하였고 한외여과/투석여과(UF/DF라고도 칭함)를 통해 농축시켰다. 상기 재료를 10mM Tris, 10 mM NaCl pH 7.5, 최종 단백질 A 세척 완충액에 대해 7 이상의 "투석용적(diavolume)"에 대해 x투석여과하였다. SoloVPE에 의해 측정시 > 75g/L로 상기 재료를 회수하기 위해 최종 농축 단계를 수행하였다. 상기 재료는 pH 7.5 ± 0.1로 측정되었고, 이는 농도 또는 완충액의 결과로서 발생한 pH 오프셋을 나타내지 않는다.

사용된 UF/DF 시스템은 Quattro 유동 다이어프램(diaphragm) 펌프, Biopharm 튜빙(tubing) 및 30kD Millipore PLCTK 복합 재생 셀룰로스 막을 사용하여 수동으로 조립하였다.

파일럿 시험 및 입증 목적으로, 인라인 저 pH 바이러스 불활성화는 단백질 A AKTA Explorer 시스템과 별도로 cVI Explorer라고 명명된 전용 AKTA Explorer 100 시스템으로 수행되었다. 상기 시스템은 주입 밸브를 통해 단백질 A Explorer 시스템으로부터 주요 단백질 유동을 수용하고 펌프 A를 통해 혼합 챔버 또는 T 및 정적 혼합기로의 직접적인 유동(불활성화 시약)을 부가하기 위해 재-배관되었다. 생성된 혼합 용액을 인-라인 AKTA 프로브로 pH에 대한 경향을 보였다. cVI Explorer 시스템은 불활성화 시약으로 불활성화 유동 경로를 부하하도록 프로그래밍되었다. UV 신호의 검출시, 이는 단백질 A 스트림을 폐기물로부터 불활성화를 위한 인-라인으로 보냈다. 펌프 A는 펌프 A로부터의 유동이 불활성화에 대해 사전-결정된 부가 % v/v과 동일하고 단백질 A 스트림 유동 속도와 관련하여 설정되도록 설정하였다. 예를 들면, 불활성화를 위한 측정이 바이러스-불활성화 시약의 30% v/v 부가였다면, 이어서 단백질 A 스트림이 50ml/min으로 유입되면, cVI Explorer 시스템은 상기 스트림에 불활성화 시약의 펌프 A 전달 15ml/min을 갖도록 프로그래밍될 것이다.

낮은 pH 바이러스 불활성화의 정적 측정은 공지된 배경 완충제 조성물을 갖는 이전에 기술된 투석여과된 재료로 수행하였다. 75g/l 내지 0g/L인 용액을 22 ± 3℃에서 pH 3.50을 달성하도록 불활성화 시약 단계로 적정하였고 이전에 기술된 pH 측정기 및 프로브로 측정하였다.

상기 결과는 표 4에 제공된다.

실시예 4

이러한 실험에서, MAbB로 명명된 모노클로날 항체를 용출에 앞서 중성 pH 용액 또는 단백질 A 세척 용액으로 투석여과하였고 바이러스 불활성화 용액으로 수동 적정하였다. 상기 실험의 목적은 모델이 상이한 단백질 농도에서 적정제 필요성 %를 얼마나 정확하게 예측했는지를 정량화하는 것이었다.

이들 연구에서 사용되는 MAbB는 화학적으로 정의된 배지에서 성장된 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생성된 정제된 사람화된 IgG1이었다. 상기 단백질에는 150,000달톤의 분자량이 할당되었다. 이론적인 등전점은 아미노산 서열로부터 측정되었고, 실제 등전점은 등전점 전기영동 겔로부터 측정되었다. 사용된 재료는 단백질 A 정제된 재료였다.

상기 연구는 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.

상기 결과는 표 5에 제공된다.

실시예 5

이러한 실험에서, MAbD는 글리신을 포함하는 사전결정된 바이러스 불활성화 용액의 사전설정된 부가 용적 %로 연속적으로 인-라인 불활성화되었다. 실험은 다중 컬럼 연속 단백질 A 포획으로 작동되는 100L 반응기 규모로 수행되었고, 여기서 주기적 용출이 화학적 제어 개념으로 불활성화되었다.

결과는 도 10에 도시한다. 상기 결과는 동적 단백질 A 스트림에 대하여 연속적 바이러스 불활성화를 위한 사양(specification) 내에서의 출력값 pH의 달성 및 유지를 나타낸다. 상기 결과는 바이러스-불활성화 시약의 한 용액으로 1회 희석하여 pH를 미달시키지 않고 달성되었고, 따라서 안정성이 입증되었다.

이러한 예들의 결과와 함께 저 pH 바이러스 불활성화의 화학적 제어가 선험적으로 강하게 달성 될 수 있음을 나타낸다. 이는 적정에 필요한 최대 전하의 지식을 통해 수행할 수 있다. 이동상에 대한 적정제의 용적 비는 과-적정 없이 pH v표적을 달성한다. 따라서, pH 측정은 능동적 제어보다는 확인(affirmation) 경향으로 감소될 수 있다.

청구된 방법의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 기술된 실시형태들에 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 청구된 본 발명의 방법은 첨부된 청구범위 및 이들의 등가물 범위 내에 있는 한, 본원에 기술된 실시형태들의 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

산업상 이용가능성

본원에 개시된 방법은 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키고, 따라서 단백질을 제조하기 위한 산업적 방법을 개선시키는데 유용하다.

Claims (29)

1. (1) (a) 단백질을 포함하는 조성물, 및
   (b) 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물
   을 단일 사전결정된 용적 비로 배합하여
   (c) 바이러스의 불활성화를 위한 사전결정된 특성을 갖는 처리 조성물
   을 수득하는 단계;
   (2) 상기 처리 조성물을 처리 용기(vessel)에 이동시키는 단계;
   (3) 사전결정된 조건에서 상기 처리 용기 중의 상기 처리 조성물을 인큐베이션(incubation)하는 단계; 및
   (4) 상기 처리 조성물에 후-처리 프로세싱 조작을 행하는 단계
   를 포함하는, 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법으로서:
   (i) 상기 단일 사전결정된 용적 비는 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질에 대해 예상된 농도의 범위에 걸쳐 상기 처리 조성물의 사전결정된 특성이 유지됨을 보장하도록 선택되었고;
   (ii) 단계 (1) 내지 단계 (3)은 (a) 연속적으로 그리고 (b) 상기 처리 조성물의 상기 용적 비의 조정 또는 전용(diversion)에 의해 발휘되는 피드백(feeback) 제어의 부재 하에 수행하는, 단백질의 제조 동안 바이러스를 연속적으로 불활성화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 사전결정된 특성이 (a) 3.0 내지 3.8의 pH 또는 (b) 0.05% 내지 10%(v/v)의 세제 농도 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물은 수학식 1에 의해 결정되고 수학식 2 및 수학식 3을 뒷받침하는 pH를 갖는, 방법.
   수학식 1:
   

   

   
   수학식 2:
   

   

   
   수학식 3:
   

   
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 바이러스-불활성화 시약을 포함하는 조성물 대 상기 단백질을 포함하는 조성물의 일정한 부가 백분율(v/v %)이 +/- 0.1 pH의 상한 및 하한 밴드를 갖는 표적 pH의 pH 범위 내에 밴드를 갖는(banded), 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-불활성화 시약이:
   (a) 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산;
   (b) 아세트산; 또는
   (c) 230nm 내지 600nm에서 흡광 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제
   중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 바이러스-불활성화 시약이, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 유기산, 락트산, 포름산, 아스코르브산, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 아미노산, 글리신 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 2.3 내지 4.2의 pKa를 갖는 적정가능한 그룹을 갖고 4.2 내지 8.5의 pKa를 갖는 다른 적정가능한 그룹을 갖지 않는 산이고;
   상기 사전결정된 특성이 3.0 내지 3.8의 pH를 포함하는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 사전결정된 특성이 3.3 내지 3.7의 pH를 포함하는, 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 사전결정된 특성이 3.4 내지 3.6의 pH를 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서:
   상기 바이러스-불활성화 시약이 아세트산이고;
   상기 사전결정된 특성이 3.0 내지 3.8의 pH를 포함하는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 사전결정된 특성이 3.3 내지 3.7의 pH를 포함하는, 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 사전결정된 특성이 3.4 내지 3.6의 pH를 포함하는, 방법.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서:
    상기 바이러스-불활성화 시약이, 방향족 그룹을 갖는 폴리에틸렌 옥사이드 세제, Triton-X 100 세제 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 230nm 내지 600nm에서 흡광 피크를 갖는 발색 그룹을 갖는 비-이온성 세제이고;
    상기 사전결정된 특성이 0.05% 내지 10%(v/v)의 세제 농도를 포함하는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전결정된 조건이 단계 (3) 동안 바이러스-불활성화 시약에 의해 상기 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1 × 10¹의 인자만큼 야기하기에 충분한, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전결정된 조건이 17 내지 40℃의 사전결정된 온도 및 시간당 처리 용기의 내부 용적의 0.3 내지 3배인 처리 용기를 통한 처리 조성물의 사전결정된 유동 속도를 포함하는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 처리 용기의 내부 용적이, 상기 처리 조성물 중 1ppm(part per million) 이하가 단계 (3) 동안에 바이러스-불활성화 시약에 의해 처리 조성물에서의 바이러스의 불활성화를 적어도 1 × 10¹의 인자만큼 야기하는데 필요한 것보다 더 짧은 지속시간의 처리 용기에서의 체류 시간을 갖다는 것을 보장하기에 충분히 큰, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1) 내지 단계 (3)이 적어도 1시간 동안 연속적으로 수행되는, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (4)가 단계 (1) 내지 단계 (3)과 연속적으로 수행되는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 포함하는 조성물이 사전-처리 프로세싱 조작으로부터 수득되는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 사전-처리 프로세싱 조작이 면역글로불린-결합 단백질 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후-처리 프로세싱 조작이 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 바이러스 여과 배지를 통한 계대 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 후-처리 프로세싱 조작이 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체가 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 포유동물 항체, 뮤린 항체, 영장류 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 영장류화된 항체, 사람화된 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄, 항체 단편, 항체 유도체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fc 단편, Fc-Fc 융합 단백질, Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편, 단일 도메인 Fv 단편, 4가의 단일쇄 Fv 단편, 디설파이드-연결된 Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 펜타바디, 미니바디, 미니항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인, 면역글로불린 단일 가변 경쇄 도메인, VHH 도메인, 사람화된 VHH 도메인, 단일-도메인 항체, 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 기능성 도메인과 모듈러 포맷(modular format)으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개 이상의 동일한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다가의 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토픽(biparatopic) 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이특이적 단백질, 모듈러 포맷으로 함께 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 기능성 도메인을 포함하는 이-기능성 단백질, 도메인-결실된 항체, 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 항체 단편의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합, Fc-독소 융합, 및 항체 단편과 스캐폴드(scaffold) 단백질의 융합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 포함하는 조성물 중의 상기 단백질의 농도가 10 내지 70mg/mL인, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 단백질.
26. 샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 샘플이 표적 분자를 정제하기 위한 프로세스 동안 제1 단위 조작으로부터 제2 단위 조작으로 유동함에 따라 상기 샘플을 하나 이상의 바이러스 불활성화 시약과 연속적으로 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 바이러스 불활성화 시약 대 상기 샘플의 비는 피드백 제어 메커니즘과 독립적으로 또는 피드백 제어 메커니즘의 부재 하에 결정되는, 샘플 중의 하나 이상의 바이러스를 불활성화시키기 위한 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 불활성화 시약 대 상기 샘플의 비가 수학식 1에 의해 %(v/v)로서 결정되고 수학식 2 및 수학식 3을 뒷받침하는, 방법.
    수학식 1:
    

    

    
    수학식 2:
    

    

    
    수학식 3:
    

    
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 불활성화 시약 대상기 샘플의 비가 상기 피드백 제어 메커니즘과 독립적으로 또는 상기 제어 메커니즘의 부재 하에 결정되는 상기 피드백 제어 메커니즘이 pH 피드백 루프(loop)인, 방법.
29. 제26항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 단백질.

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