KR20180117678A - 마이크로니들 패치-보조된 전달에 의한 향상된 암 면역요법 - Google Patents

마이크로니들 패치-보조된 전달에 의한 향상된 암 면역요법 Download PDF

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KR20180117678A
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Abstract

면역치료제의 제어된-방출용 자기-분해성 마이크로니들 디바이스가 본 명세서에서 개시된다. 면역치료제 (예를 들어, PD1 항체)의 지속된 전달을 위하여 자기-분해성 마이크로니들 패치를 사용하는 질환 (예를 들어, 암)의 치료 방법이 또한 개시된다.

Description

마이크로니들 패치-보조된 전달에 의한 향상된 암 면역요법
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 3월 1일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/301,789의 이점을 주장하고, 이의 개시내용은 본 명세서에서 참고로 명확히 편입된다.
분야
본 개시내용은 면역치료제 (예를 들어, 항-PD1 항체)의 지속된 전달을 위하여 자기-분해성 마이크로니들 패치를 사용하는 질환 (예를 들어, 암) 치료용 마이크로니들 디바이스 및 방법에 관한 것이다.
피부 암은, 인간에서, 특히 백인 중에서 가장 흔한 악성종양이다. 현재 추정은 5 미국인 중 1명이 그들의 일생에서 피부 암을 발병할 것을 시사한다 (Simoes, M. 등. Cancer Lett . 2015, 357, (1), 8-42; Rogers, H. W.; Weinstock, M. 등. Arch. Dermatol . 2010, 146, (3), 283-287). 피부 암 치료를 위하여, 면역요법은 과거 몇 년 동안 집중적으로 연구되었다 (Chinembiri, T. N. 등. Molecules 2014, 19, (8), 11679-11721; Pardoll, D. M. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, (4), 252-264). 이들 연구 중에서, 프로그래밍된 사망-1 (PD-1) 경로를 차단하는 체크포인트 억제제는 강력한 임상 효력을 보여주었다 (Pardoll, D. M. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, (4), 252-264; Gubin, M. M. 등. Nature 2014, 515, (7528), 577-581; Tumeh, P. C. 등. Nature 2014, 515, (7528), 568-571). T 세포에서 발현된 PD-1 수용체는 T-세포 수용체 (TCR)의 억제성 신호전달 다운스트림 유발 그리고 T-림프구의 활성화 예방에 의해 면역 시스템의 하향 조절에서 중추적 역할을 한다 (Pardoll, D. M. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, (4), 252-264; Chinai, J. M. 등. Trends Pharmacol . Sci. 2015, 36, (9), 587-595; Gubin, M. M. 등. Nature 2014, 515, (7528), 577-581). 억제성 수용체를 표적하는 항-PD-1 항체는 진전된 흑색종의 II 기 및 III 기 임상시험에서 인상적인 항종양 활성을 보여주었다 (Kyi, C.; Postow, M. A. FEBS Letters 2014, 588, (2), 368-376; Sullivan, R. J.; Flaherty, K. T. Nat. Rev. Clin . Oncol . 2015, 12, (11), 625-626; Topalian, S. L. 등. N. Engl. J. Med. 2012, 366, (26), 2443-2454).
흑색종의 치료를 위하여 항-PD-1 항체의 놀라운 임상 결과에도 불구하고, 접근법의 효능은 개선되도록 남아있다. 화학요법과 비교하여 훨씬 높아도, 장기간 내구성 반응 속도 및 전반적인 반응 속도는 증가하는 잠재력을 갖는다 (Topalian, S. L. 등. J. Clin . Oncol . 2014, 32, (10), 1020-1030). 치료의 비용은 필요한 억제제의 양으로 인해 또한 유지 불가능하게 높다. 게다가, 부작용, 예컨대 투약량-의존적 자가면역 장애는 관측되었다 (Topalian, S. L. 등. N. Engl . J. Med . 2012, 366, (26), 2443-2454; Chapman, A. P. Adv . Drug Deliv . Rev. 2002, 54, (4), 531-545; Mitragotri, S.; Burke, P. A.; Langer, R. Nat. Rev. Drug Discovery 2014, 13, (9), 655-72). 따라서, 면역치료제의 전달 및 효능 개선용 신규한 디바이스 및 방법이 필요하다.
생리학적으로 제어가능한 방식으로 면역치료제 (예를 들어, aPD1 (항-PD1 항체))의 지속된 전달을 위하여 획기적인 자기-분해성 마이크로니들 (MN) 패치가 본 명세서에서 개시된다.
하기를 포함하는, 대상체의 생물학적 장벽에서 물질의 수송용 디바이스는 본 명세서에서 개시된다:
i) 베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
ii) 마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
iii) 산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
하기 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법은 또한 본 명세서에서 개시된다:
a) 마이크로니들 패치를 대상체에 제공하는 단계, 상기 마이크로니들 패치는 하기를 포함함:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질;
산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴;
b) 마이크로니들을 생물학적 장벽 속에 삽입시키는 단계, 상기 pH 변경제는 산-분해성 나노입자 안에서 pH를 감소시키고, 여기서 pH에서 상기 감소는 나노입자를 분해시키고 면역치료제를 대상체 속에 제어된-방출 방식으로 방출시킴.
일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고체 종양이다. 일 구현예에서, 암은 흑색종이다.
또한, 하기를 포함하는, 생물학적 장벽에서 면역치료제 전달용 부품의 키트는 본 명세서에서 개시된다:
a) 하기를 포함하는 마이크로니들 패치:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
b) 산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
일 구현예에서, 산-분해성 나노입자는 변형된 덱스트란을 포함한다. 일 구현예에서, 산-분해성 나노입자는 pH-감수성 덱스트란 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, pH 변경제는 글루코스 옥시다제이다. 일 구현예에서, pH 변경제는 카탈라제와 조합으로 글루코스 옥시다제이다.
일 구현예에서, 나노입자는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 알긴산염이다.
일 구현예에서, 마이크로니들은 히알루론산을 포함한다.
일 구현예에서, 마이크로니들은, 혈액 글루코스를 글루콘산으로 전환시키는, 면역치료제 (예를 들어, aPD1) 및 글루코스 옥시다제 (GOx)를 캡슐화시키는 pH-감수성 덱스트란 나노입자 (NPs)로 통합된 생체적합성 히알루론산으로 구성된다. 이러한 구현예에서, 산성 환경의 생성은 NPs의 자기-해리를 촉진시키고 면역치료제 (예를 들어, aPD1)의 실질적인 방출을 후속적으로 초래한다. 본 발명자들은 심지어 마이크로니들 (MN) 패치의 단일 투여가 열화 유발제 없이 MN 또는 동일한 용량으로 자유 aPD1의 종양내 주사에 비교하여 B16F10 마우스 흑색종 모델에서 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 투여 전략은 항-종양 효능 향상용 조합 요법을 달성하기 위해 다른 면역조절물질 (예컨대 항-CTLA-4)와 통합할 수 있다.
하기를 포함하는, 대상체의 생물학적 장벽에서 물질의 수송용 디바이스는 추가로 본 명세서에서 개시된다:
i) 베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
ii) 마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
iii) 산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 치료제, 예방제, 또는 진단제, 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
본 명세서의 일부에 편입되고 상기의 일부를 구성하는, 동반하는 도면은 아래 기재된 몇 개의 측면을 설명한다.
도 1A-1B는 피부 암 치료를 위하여 aPD1의 마이크로니들 (MN) 패치-보조된 전달의 개략도를 보여준다. (a) 생리학적으로 자기-해리된 나노입자 (NPs)로 장입된 MN 패치에 의해 전달된 aPD1의 개략도. 이중-에멀젼 방법에 의해 NPs 내부에서 고정된 GOx/CAT 효소 시스템으로, 혈액 글루코스의 글루콘산으로의 효소-매개된 전환은 NPs의 지속된 해리를 촉진시키고, 후속적으로 aPD1의 방출로 이어진다. (b) 피부 암 세포를 파괴하기 위해 면역계를 활성화시키도록 aPD1에 의한 PD-1의 봉쇄.
도 2A-2F는 aPD1 장입된 마이크로니들의 특성규명을 도시한다. (a) NPs의 SEM 이미지 (스케일 바: 1000nm). (b) DLS에 의해 결정된 평균 유체역학적 크기. (c) MN 패치의 SEM 이미지 (스케일 바: 200μm). (d) MN 정점의 SEM 이미지형성의 더 높은 배율은 MN이 NPs로 장입되었던 것을 확인하였다 (스케일 바: 5μm). (e) FITC-항체 장입된 NPs를 함유하였던 대표적인 MN 패치의 형광 이미지형성 (스케일 바: 200μm). (f) MN의 기계적 특성. 원하는 MN에 대하여 실패력은 0.38 N/바늘로서 정량적으로 측정되었다.
도 3A-3E는 나노입자 (NPs) 장입된-마이크로니들 (MN) 패치의 시험관내 연구를 도시한다. (a) 경시적으로 37 ℃에서 PBS (좌) 또는 100 mg/dL (우) 글루코스 용액에서 인큐베이션된 자기-해리된 NPs의 사진. (b) 3일 동안 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션 전 (좌) 및 후 (우) NP 형태학 변화의 SEM 이미지. (스케일 바: 100nm) (c) 경시적으로 37 ℃에서 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션된 MNs의 관련된 pH. 평형은 용액에서 인큐베이션된 경우 최초 10 분에서 MNs의 팽윤후 도달되었다. (d) A400 nm에 96 웰 플레이트에서 NP 현탁액의 UV 흡광도. (e) 경시적으로 37 ℃에서 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션된 MN 패치로부터 시험 관내 축적된 aPD1 방출. 오차 막대는 샘플 (n=3)의 표준 편차 (SD)에 기반된다.
도 4A-4G는 마이크로니들 (MNs)에 의해 전달된 aPD1의 생체내 항 피부 암 치료를 도시한다. (a) 마우스 등 및 관련된 피부 (적색 점선 안에서의 면적)은 MN 패치 (좌)로 경피로 치료되었고, 트립판 블루 염색의 이미지는 마우스 피부 (우) 속에 MN 패치의 침투를 보여주었다. (스케일 바: 1 mm) (b) 하나의 MN에 의해 침투된 마우스 피부 단면적의 H&E-염색된 부문. (스케일 바: 200 μm) (c) FITC-항체 장입된 MNs에 의해 침투된 마우스 피부의 병합된 형광 및 명시야 이미지. (녹색: aPD1) (스케일 바: 200 μm) (d) 지시된 상이한 그룹 (1, 미치료; 2, MN-GOx; 3, 자유 aPD1; 4, MN-aPD1; 5, MN-GOx-aPD1)의 B16F10 종양의 생체내 생물발광 이미지형성. 오차 막대는 3 마우스의 표준 편차 (SD)에 기반된다. (e) d에 따른 정량화된 종양 신호. (f) 치료된 및 대조군 마우스용 카플란 메이어 생존 곡선. 치료 그룹당 8 마우스가 도시된다. (g) 상이한 시점에서 MN-GOx-aPD1 또는 자유 aPD1로 치료된 종양의 면역형광 염색 (녹색: aPD1, 청색: 핵) (스케일 바: 100 μm). 통계적 유의도는 터키 후-시험을 사용하여 2-원 ANOVA에 의해 계산되었다. 생존 곡선의 비교는 로그-순위 시험을 사용하여 작성되었다. P 값: *, P<0.05.
도 5A-5C는 마이크로니들 (MNs)에 의해 전달된 aPD1의 치료후 종양 속에 T 세포 침윤의 특성규명을 도시한다. (a) 종양의 면역형광은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 침윤 (스케일 바: 100 μm)를 보여주었다. (b) 유세포측정에 의해 분석된 치료된 종양에서 T 세포의 대표적인 플롯. (CD3+ T 세포에서 게이팅됨). (c) b에 따른 종양-침윤 CD8+ T 세포의 분율. 오차 막대는 3 마우스의 SD에 기반된다. 통계적 유의도는 터키 후-시험을 사용하여 2-원 ANOVA에 의해 계산되었다. P 값: *, P<0.05.
도 6은 변형된 덱스트란 (m-덱스트란)의 합성 및 열화 경로를 도시한다.
도 7은 변형된 덱스트란의 핵자기 공명 (NMR)을 도시한다.
도 8은 aPD1과 덱스트란 사이 상이한 중량비에서 aPD1의 장입 수용력을 도시한다.
도 9는 마이크로니들 (MN) 패치의 사진을 도시한다. (스케일 바: 5 mm)
도 10은 m-HA의 합성 단계를 도시한다.
도 11은 MBA와 HA 사이 상이한 중량비를 가진 마이크로니들 (MN)의 기계적 특성을 도시한다.
도 12A-12B는 마이크로니들 속에 로다민-HA 및 FITC-NPs 편입을 도시한다. (a) FITC-항체 장입된 NPs로 장입된 로다민-표지된 HA 마이크로니들의 대표적인 공초점 이미지; 스케일 바 100 μm. (b) 마이크로니들 속에 로다민-HA 및 FITC-NPs 편입의 정량화. 분석은, 제작 과정 동안 5 침착 시간에 의해 수득된 총 강도로 정규화된, 마이크로니들의 길이를 따라 수집된 공초점 z-스택에서 총 형광 강도의 ImageJ 측정을 사용하여 수행되었다 (도시된 결과는 n = 15 개별 마이크로니들 / 조건으로부터 평균이다).
도 13A-13B는 3일 동안 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션 전 (a) 및 후 (b) 나노입자 (NP) 형태학 변화의 TEM 이미지를 도시한다. (스케일 바: 200μm)
도 14는 동적 광 산란에 의해 결정된 경시적으로 37 ℃에서 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션 동안 나노입자 (NPs)의 평균 유체역학적 입자 크기 변화를 도시한다.
도 15는 경시적으로 37 ℃에서 100 mg/dL 글루코스 용액에서 인큐베이션된 MNs의 관련된 pH 변화를 도시한다. 변화는 제조 동안 NP의 상이한 효소 함량을 나타낸다. 평형은 용액에서 인큐베이션된 경우 최초 10 분에서 MNs의 팽윤후 도달되었다.
도 16은 3 일 동안 37 ℃에서 글루코스 용액에서 인큐베이션된 MNs로부터 방출된 aPD1을 도시한다.
도 17은 마이크로니들 (MNs)에서 캡슐화후 aPD1의 생물활성을 도시한다.
도 18은 B16F10 세포로 24 시간의 인큐베이션후 비어있는 나노입자 (NPs)의 세포독성 연구를 도시한다. 오차 막대는 SD (n = 6)을 나타낸다.
도 19는 투여 2 일후 MN 패치 (좌) 및 주위 조직 (우)에 투여된 H&E-염색된 피부 부문을 도시한다. (스케일 바: 200 μm)
도 20은 5 분, 10 분, 및 30 분에서 피부 천자 마크를 도시한다.
도 21A-21C는 B16F10 종양에서 aPD1의 효과를 도시한다. (a) 지시된 상이한 그룹 (1, 미치료; 2, aPD1 i.v. 주사; 3, aPD1로 장입된 NPs의 종양내 주사; 4, MN-GOx-aPD1)의 B16F10 종양의 생체내 생물발광 이미지형성. 오차 막대는 표준 편차 (SD) (n=3)에 기반된다. (b) a에 따른 정량화된 종양 신호. (c) 치료된 및 대조군 그룹 (n=7 또는 8)용 카플란 메이어 생존 곡선. (P 값: *, P<0.05)
도 22A-22B는 종양의 성장에서 aPD1 및 aCTLA4 치료의 효과를 도시한다. (a) 지시된 다양한 치료후 마우스의 상이한 그룹 (7-8 마우스 / 그룹)의 종양 성장 곡선. 오차 막대는 SEM에 기반된다. (b) 지시된 다양한 치료후 60 일에서 마우스의 생존 곡선. 통계적 유의도는 터키 후-시험을 사용하여 2-원 ANOVA에 의해 계산되었다. (P 값: *, P<0.05).
면역치료제 (예를 들어, a PD1 항체)의 지속된 전달을 위하여 자기-분해성 마이크로니들 (MN) 패치를 사용하는 면역치료제의 지속된 전달용 디바이스 및 방법이 본 명세서에서 개시된다. 일 구현예에서, 마이크로니들은 면역치료제 및 pH-변경제를 캡슐화시키는 pH-감수성 덱스트란 나노입자 (NPs)로 통합된 생체적합성 히알루론산으로 구성된다. pH 변경제에 의한 산성 환경의 생성은 NPs의 자기-해리를 촉진시키고 면역치료제의 지속된 방출을 후속적으로 초래한다. 본 발명자들은 심지어 마이크로니들 패치의 단일 투여가 열화 유발제 (예를 들어, pH-변경제 예컨대 글루코스 옥시다제) 없이 마이크로니들에 또는 면역치료제의 동일한 용량으로 자유 aPD1의 종양내 주사와 비교된 경우 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 밝혀내었다. 게다가, 다른 면역조절물질 (예컨대 항-CTLA-4)와 aPD1의 투여는 상승작용 항-종양 효능을 초래하였다.
이제 본 발명의 구현예를 상세히 참조할 것이고, 그것의 예들은 도면 및 실시예에서 설명된다. 본 발명은, 그러나, 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본 명세서에서 제시된 구현예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 정의는 본 명세서에서 사용된 용어의 전체 이해를 위하여 제공된다.
용어
본원 내내 사용된 용어는 당해 분야의 숙련가에 통상적인 및 전형적인 의미로 해석되어야 한다. 그러나, 출원인은 하기 용어가 아래에 정의된 바와 같이 특정한 정의로 제공되기를 바란다.
명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한, 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는, 이의 혼합물을 포함하는, 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "할 수 있는", "선택적으로", 및 "선택적으로 할 수 있는"은 상호교환적으로 사용되고 조건이 발생하는 사례 뿐만 아니라 조건이 발생하지 않는 사례를 포함하는 의미이다. 따라서, 예를 들어, 제형이 "부형제를 포함할 수 있다"라는 서술은 제형이 부형제를 포함하는 사례 뿐만 아니라 제형이 부형제를 포함하지 않는 사례를 포함하는 의미이다.
용어 "약" 및 "대략"은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이 "에 가까운" 것으로서 정의된다. 하나의 비-제한 구현예에서 상기 용어는 10% 이내인 것으로 정의된다. 또 다른 비-제한 구현예에서, 상기 용어는 5% 이내인 것으로 정의된다. 추가의 또 다른 비-제한 구현예에서, 상기 용어는 1% 이내인 것으로 정의된다.
"생물활성"에 관한 것을 포함하는, 단백질의 "활성"은, 예를 들어, 전사, 번역, 세포내 전좌, 분비, 키나제에 의한 인산화, 프로테아제에 의한 절단, 및/또는 다른 단백질에 동종친화성 및 이종친화성 결합을 포함한다.
용어 "투여하는"은 경구, 국소, 정맥내, 피하, 경피, 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 진피내, 심실내, 두개내, 복강내, 병소내, 비강내, 직장, 질, 흡입으로 또는 이식된 저장소를 통한 투여를 지칭한다. 투여는 경피 마이크로니들-어레이 패치를 사용하여 수행될 수 있다. 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병소내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
"생체적합성"은 수령체에 일반적으로 무독성이고 대상체에 임의의 상당한 역효과를 야기시키지 않는 물질 및 임의의 대사물 또는 이의 열화 생성물을 일반적으로 지칭한다.
"조성물"은 활성제 및 또 다른 화합물 또는 조성물, 불활성 (예를 들어, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성, 예컨대 아쥬반트의 조합을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이, 기타를 제외하지 않지만, 인용된 요소를 포함하는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때 "으로 본질적으로 구성되는"은 조합에 임의의 필수적인 유의성의 다른 요소 제외를 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 요소로 본질적으로 구성되는 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터 미량 오염물질 그리고 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 보존제, 및 기타를 제외하지 않을 것이다. "으로 구성되는"은 본 발명의 조성물 투여용 실질적인 방법 단계 그리고 다른 성분의 미량 초과 원소 제외를 의미할 수 있다. 각각의 이들 이행 용어에 의해 정의된 구현예는 본 발명의 범위 내에 있다.
"대조군"은 비교하기 위해 실험에서 사용된 대안적인 대상체 또는 샘플이다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "접합된"은 비-가역적 결합 상호작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대체하다"는, 예를 들어, 단백질 도메인과 펩타이드, 단백질 도메인과 화학물질, 단백질 도메인과 화학물질에 의한 핵산 서열, 펩타이드, 또는 대체될 펩타이드, 화학물질, 또는 핵산보다 그 특정 단백질 도메인에 대하여 친화성을 갖는 핵산 사이 분자 또는 화학 상호작용 차단을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "링커"는 인접한 분자를 결합시키는 분자를 지칭한다. 일반적으로 링커는 인접한 분자를 결합시키는 것 또는 이들 사이 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외 특정 생물학적 활성은 갖지 않는다. 일부 경우에, 링커는 인접한 분자의 일부 특성, 예컨대 분자의 폴딩, 순전하, 또는 소수성에 영향을 미치기 위해 또는 상기를 안정화시키기 위해 선택될 수 있다.
용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 또 다른 것의 알파 아미노 기에 하나의 아미노산의 카복실기에 의해 연결된 2 이상 아미노산을 포함하는 천연 또는 합성 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "캐리어" 또는 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 일반적으로 안전하고 무독성인 약제학적 또는 치료적 조성물 제조에 유용한 캐리어 또는 부형제를 의미하고, 수의과 및/또는 인간 약제학적 또는 치료 용도로 허용가능한 캐리어를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "캐리어" 또는 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼 (예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및/또는 다양한 유형의 습윤제를 포함한다 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "캐리어"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제, 또는 약제학적 제형에서 그리고 아래에 추가로 기재된 바와 같이 사용을 위하여 당해 분야에서 잘 알려진 다른 물질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머"는, 구조가 반복된 작은 단위, 모노머 (예를 들면, 폴리에틸렌, 고무, 셀룰로오스)에 의해 표시될 수 있는, 천연 또는 합성, 상대적으로 고분자량 유기 화합물을 지칭한다. 합성 폴리머는 모노머의 첨가 또는 축합 중합에 의해 전형적으로 형성된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "코폴리머"는 2 이상의 상이한 반복 단위 (모노머 잔기)로부터 형성된 폴리머를 지칭한다. 예로써 및 비제한적으로, 코폴리머는 교대 코폴리머, 랜덤 코폴리머, 블록 코폴리머, 또는 그라프트 코폴리머일 수 있다. 특정 측면에서, 블록 코폴리머의 다양한 블록 분절이 코폴리머를 자체 포함할 수 있다는 것이 또한 고려된다.
범위는 "약" 하나의 특정 값부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로서 본 명세서에서 표현될 수 있다. 그와 같은 범위가 표현되는 경우, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값부터 및/또는 다른 특정 값까지 포함한다. 유사하게, 값이 선행된 "약"의 사용에 의해 근사치로서 표현되는 경우, 특정한 값이 또 다른 구현예를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점이 다른 종점과 관련하여, 그리고 다른 종점과 독립적으로 모두 유의미하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본 명세서에서 개시된다수의 값이 있다는 것, 그리고 각각의 값이 그 값 자체에 더하여 "약" 그 특정 값으로서 또한 본 명세서에서 개시되는 것이 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"은 또한 개시된다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은, 일반화된 기간 동안 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 구해지는 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의료적 반응을 유도할, 조성물, 예컨대 면역치료제의 양을 지칭한다. 일부 사례에서, 원하는 생물학적 또는 의료적 반응은 일, 주, 또는 년의 기간 동안 대상체에 조성물의 다중 투약량의 투여 이후 달성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "치료한다", "치료하는", "치료", 및 이의 문법적 변화는 장애 또는 병태의 하나 이상의 수반되는 증상의 강도의 부분적으로 또는 완전히 지연, 경감, 저감 또는 감소 및/또는 장애 또는 병태의 하나 이상의 원인의 경감, 저감 또는 지체를 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 방어적으로, 예방적으로, 일시적으로 또는 교정적으로 적용될 수 있다. 예방적 치료는 암의 개시에 앞서 (예를 들면, 암의 명백한 징후 이전), 암의 조기 발병 동안 (예를 들면, 암의 초기 징후 및 증상시), 또는 암의 확립된 발병후 대상체에 투여된다. 예방적 투여는 감염의 증상의 징후에 앞서 몇일 내지 몇년 동안 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는, (항체를 포함하는) 폴리펩타이드 또는 수용체를 지칭하는 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 모집단에서 수용체의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 병태 (예를 들면 항체의 경우에서 면역검정 조건) 하에, 리간드 또는 항체가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 단백질에 또는 샘플에서 존재하는 다른 단백질에 상당한 양으로 결합하지 않는 경우 지정된 리간드 또는 항체는 그것의 특정 "표적" (예를 들면 내피 항원에 특이적으로 결합하는 항체)에 "특이적으로 결합한다". 일반적으로, 제2 분자를 "특이적으로 결합하는" 제1 분자는 그 제2 분자와 친화 상수 (Ka) 약 105 M-1 초과 (예를 들면, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 및 1012 M-1 이상)을 갖는다.
용어 "면역 체크포인트 억제제" 또는 "면역치료제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전적으로 또는 부분적으로 감소시키는, 억제시키는, 방해하는 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 수많은 체크포인트 단백질, 예컨대 CTLA-4 및 그것의 리간드 CD 80 및 CD86; 그리고 그것의 리간드 PDL1 및 PDL2와 PD1은 공지된다 (Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). 이들 단백질은 T-세포 반응의 공통자극성 또는 억제성 상호작용을 책임진다. 면역 체크포인트 단백질은 자기-내성을 조절하고 생리적 면역 반응의 지속기간 및 진폭을 유지시킨다. 면역 체크포인트 억제제는 항체를 포함하거나 항체로부터 유래된다.
치료제의 용어 "유효량"은 원하는 효과를 제공하기 위해 유익한 제제의 비독성 그러나 충분한 양을 의미한다. "효과적인" 유익한 제제의 양은, 대상체의 연령 및 일반 조건, 특정한 유익한 제제 또는 제제들, 및 기타에 의존하여, 대상체부터 대상체까지 다양할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것이 항상 가능하지 않다. 그러나, 임의의 대상체에서 적절한 "유효"량은 일상적인 실험과정을 사용하는 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그리고 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 유익한의 "유효량"은 양쪽 치료적 유효량 및 예방적 유효량을 포함하는 양을 또한 지칭할 수 있다.
치료 효과를 달성하는데 필요한 약물의 "유효량"은 인자 예컨대 연령, 성별, 및 대상체의 중량에 따라 다양할 수 있다. 투약 요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇 개의 분할 용량은 매일 투여될 수 있거나 상기 용량은 치료 상황의 긴급에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 치료제의 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭하고, 치료제의 "예방적 유효량"은 원치않는 생리적 병태를 예방하는데 효과적인 양을 지칭한다. 주어진 치료제의 치료적으로 효과적인 및 예방적 유효량은 전형적으로 인자 예컨대 치료될 장애 또는 질환의 유형 및 중증도 그리고 대상체의 연령, 성별, 및 중량에 관해 다양할 것이다.
용어 "치료적 유효량"은, 원하는 치료 효과를 용이하게 하는데 효과적인, 치료제의 전달 속도 또는, 치료제의 양 (예를 들면, 경시적으로 양)을 또한 지칭할 수 있다. 정확한 원하는 치료 효과는 치료될 병태, 대상체의 내성, 투여되는 약물 및/또는 약물 제형 (예를 들면, 치료제 (약물)의 효력, 제형에서 약물의 농도, 및 기타), 그리고 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되는 다양한 다른 인자에 따라 다양할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한" 성분은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 성분을 지칭할 수 있다, 즉, 상기 성분은 함유되는 제형의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 방해 또는 임의의 상당한 바람직하지 않은 생물학적 효과 유발 없이 본 명세서에서 기재된 바와 같이 대상체에 투여될 수 있고 본 발명의 약제학적 제형 속에 편입될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"이 부형제를 지칭하는데 사용되는 경우, 성분이 독물학적 및 제조 시험의 요구된 표준을 충족시킨다는 것 그리고 미국 식품의약국에 의해 준비된 불활성 성분 가이드에서 포함되는 것이 일반적으로 암시된다.
또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약리적으로 활성" 유도체 또는 유사체에서처럼, 용어 "약리적으로 활성" (또는 간단히 "활성")은 대략 동등 정도로 그리고 모 화합물로서 약리적 활성의 동일한 유형을 갖는 유도체 또는 유사체 (예를 들면, 염, 에스테르, 아미드, 콘주게이트, 대사물, 이성질체, 단편, 등)을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "혼합물"은 혼합물의 성분이 완전히 혼화성인 용액, 뿐만 아니라 혼합물의 성분이 완전히 비혼화성인 현탁액 및 에멀젼을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는, 비제한적으로 인간, 가축, 개, 고양이, 및 다른 포유동물을 포함하는, 살아있는 유기체 예컨대 포유동물을 지칭할 수 있다. 치료제의 투여는 대상체의 치료에 효과적인 기간 동안 그리고 투약량에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "제어된-방출" 또는 "제어된-방출 약물 전달" 또는 "지속된-방출"은 생체내 원하는 약동학적 프로파일을 달성하기 위해 제어된 방식에서 주어진 투약 형태로부터 약물의 방출 또는 투여를 지칭한다. "제어된" 약물 전달의 측면은 약물 방출의 원하는 동력학을 확립하기 위해 제형 및/또는 투약 형태를 조종하는 능력이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 어구 "동반 투여", "조합으로 투여", "동시 투여" 또는 "동시에 투여된"은 화합물이 동일한 시점에서 또는 서로 직후 투여되는 것을 의미한다. 후자의 경우에, 2 화합물은 관측된 결과가 화합물이 동일한 시점에서 투여되는 경우 달성된 것과 구별할 수 없는 것에 충분히 가까운 시간에서 투여된다.
마이크로니들 디바이스 (패치)
생리학적으로 제어가능한 방식으로 면역치료제 (예를 들어, aPD1)의 지속된 전달을 위하여 획기적인 자기-분해성 마이크로니들 (MN) 패치가 본 명세서에서 개시된다.
하기를 포함하는, 대상체의 생물학적 장벽에서 물질의 수송용 디바이스는 본 명세서에서 개시된다:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
또한, 하기를 포함하는, 생물학적 장벽에서 면역치료제 전달용 부품의 키트는 본 명세서에서 개시된다:
하기를 포함하는 마이크로니들 패치:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
일 구현예에서, 마이크로니들은 히알루론산으로 구성된다. 일 구현예에서, 마이크로니들은, 혈액 글루코스를 글루콘산으로 전환시키는, aPD1 및 글루코스 옥시다제 (GOx)를 캡슐화시키는 pH-감수성 덱스트란 나노입자 (NPs)와 통합된 생체적합성 히알루론산으로 구성된다. 이러한 구현예에서, 산성 환경의 생성은 NPs의 자기-해리를 촉진시키고 aPD1의 실질적인 방출을 후속적으로 초래한다. 본 발명자들은 심지어 MN 패치의 단일 투여가 열화 유발제 없이 MN 또는 동일한 용량으로 자유 aPD1의 종양내 주사에 비교하여 B16F10 마우스 흑색종 모델에서 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 투여 전략은 항-종양 효능 향상용 조합 요법을 달성하기 위해 다른 면역조절물질 (예컨대 항-CTLA-4)와 통합할 수 있다.
면역치료제에 더하여, 수령체에 전달되는 제제는 또한 치료제, 예방제, 또는 진단제일 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산 분자, 지질, 유기 분자, 생물학적 활성 무기 분자, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 광범위한 약물은 본 마이크로니들 디바이스 및 방법으로 전달을 위하여 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약물" 또는 "약물 제형"은, 약제학적 부형제 그리고 문신술, 화장품, 및 기타용 서브스턴스를 포함하는, 생물학적 조직에의 도입에 적합할 수 있는 다른 서브스턴스나, 임의의 예방제, 치료제, 또는 진단제를 지칭하는데 광범위하게 사용된다. 약물은 생물학적 활성을 갖는 서브스턴스일 수 있다. 약물 제형은 다양한 형태, 예컨대 액체 용액, 겔, 고체 입자 (예를 들면, 극미립자, 나노입자), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 약물은 소 분자, 대 (즉, 거대-) 분자, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 대표적인, 비-제한이 아닌, 구현예에서, 약물은 면역적 아쥬반트 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 알루미늄 염 (명반), CpG 올리오고데옥시뉴클레오타이드 (ODN)), 아미노산, 백신, 항바이러스제, 유전자 전달 벡터, 인터류킨 억제제, 면역조절물질, 신경친화성 인자, 신경보호성 제제, 항신생물성 제제, 화학치료제, 다당류, 항-응고제, 항생제, 진통제, 마취제, 항히스타민제, 항-염증제, 및 바이러스 중에서부터 선택될 수 있다. 약물은, 자연 발생, 합성 또는 재조합으로 생산될 수 있는, 적합한 단백질, 펩타이드 및 이의 단편으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 하기를 포함하는, 대상체의 생물학적 장벽에서 물질의 수송용 디바이스는 본 명세서에서 개시된다:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 치료제, 예방제, 또는 진단제, 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
일 구현예에서, 나노입자는 치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킨다. 일 구현예에서, 나노입자는 예방제 및 pH 변경제를 캡슐화시킨다. 일 구현예에서, 나노입자는 진단제 및 pH 변경제를 캡슐화시킨다.
약물 제형은, 당해 기술에 공지되어 있는, pH 조절제, 점도 조절제, 희석제, 등을 포함하는, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로니들은 히알루론산을 포함한다. 히알루론산에 더하여, 마이크로니들은 또한, 금속, 세라믹, 반도체, 유기물, 폴리머, 복합체, 또는 이의 조합을 포함하는, 다양한 물질을 포함할 수 있다. 전형적인 작제 물질은 약품 등급 스테인레스강, 금, 티타늄, 니켈, 철, 주석, 크로뮴, 구리, 팔라듐, 백금, 이들 또는 다른 금속의 합금, 규소, 이산화규소, 및 폴리머를 포함한다. 대표적인 생분해성 폴리머는 하이드록시 산의 폴리머 예컨대 락트산 및 글라이콜산 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드, 폴리락타이드-코-글라이콜라이드, 및 PEG를 가진 코폴리머, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 및 폴리(락타이드-코-카프로락톤)을 포함한다.
마이크로니들은 생물학적 장벽 속에 삽입될 동안, 최대 다수의 일 동안 원위치에 잔존하는 동안, 그리고 제거될 동안, 온전하게 남아있도록 기계적 강도를 가져야 한다. 일부 구현예에서, 마이크로니들은 마이크로니들이 그것의 의도된 목적 (예를 들면, 면역치료제의 전달)을 제공하기에 충분히 적어도 오래 온전하게 남아있어야 한다.
마이크로니들은 직선 또는 테이퍼링된 샤프트를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 마이크로니들의 직경은 마이크로니들의 베이스 단부에서 가장 크고 베이스 원위 단부에서 지점에 테이퍼링한다. 마이크로니들은 또한 양쪽 직선 (테이퍼링되지 않은) 부분 및 테이퍼링된 부분을 포함하는 샤프트를 갖도록 제작될 수 있다. 니들은 또한 테이퍼링된 단부를 전혀 갖지 않을 수 있다, 즉 이들은 간단히 뭉툭한 또는 평평한 팁을 가진 원통형일 수 있다.
마이크로니들은 기질에 기울어져 또는 수직으로 배향될 수 있다. 일 구현예에서, 마이크로니들은 기질의 단위 면적당 마이크로니들의 더 큰 밀도가 제공될 수 있도록 기질에 수직으로 배향된다. 다수의 마이크로니들은 마이크로니들 배향, 높이, 또는 다른 파라미터의 혼합물을 포함할 수 있다.
마이크로니들은 수직에서 원형 단면을 갖는 샤프트로 형성될 수 있거나, 단면이 비-원형일 수 있다. 예를 들어, 마이크로니들의 단면은 다각형 (예를 들면 별형, 정사각형, 삼각형), 타원형, 또는 또 다른 형상일 수 있다. 단면 치수는 약 1 μm 내지 1000 μm일 수 있어서, 이로써 베이스는 약 100-500 μm일 수 있고, 팁은 1 내지 20 μm일 수 있다. 일 구현예에서, 마이크로니들은 베이스에서 대략 300 μm, 및 팁에서 대략 5 μm일 수 있다.
마이크로니들의 길이는 전형적으로 약 10 μm 내지 1 mm, 바람직하게는 400 μm 내지 1 mm이다. 일 구현예에서, 마이크로니들의 길이 (또는 높이)는 약 600 μm이다. 길이는 양쪽 삽입된 및 삽입되지 않은 부분을 차지하는, 특정한 적용에 선택된다. 다수의 마이크로니들은, 예를 들어, 다양한 길이, 외부 직경, 내부 직경, 단면 형상, 및 마이크로니들 사이 간격을 갖는 마이크로니들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 마이크로니들은 600 μm 팁-대-팁 간격을 가진 15 곱하기 15 어레이에서 배열된다.
일 구현예에서, 산-분해성 나노입자는 변형된 덱스트란을 포함한다. 일 구현예에서, 산-분해성 나노입자는 아세탈 변형된 덱스트란을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 덱스트란의 합성은 도 6에서 도시된다.
일 구현예에서, 나노입자는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 알긴산염이다.
일 구현예에서, pH 변경제는 글루코스 옥시다제 (GOx)이다. 글루코스 옥시다제는 혈액 글루코스를 글루콘산으로 전환시킨다. 이것은 pH에서 감소를 유발시킨다. pH에서 이러한 감소는 그 다음 나노입자의 열화를 유발시키고 면역치료제의 지속된-방출을 유발시킨다.
치료 방법
하기 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법은 또한 본 명세서에서 개시된다:
마이크로니들 패치를 대상체에 제공하는 단계, 상기 마이크로니들 패치는 하기를 포함함:
베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
마이크로니들의 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질
산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴;
마이크로니들을 생물학적 장벽 속에 삽입시키는 단계, 상기 pH 변경제는 산-분해성 나노입자 안에서 pH를 감소시키고, 여기서 pH에서 상기 감소는 나노입자를 분해하고 면역치료제를 대상체 속에 제어된-방출 방식으로 방출시킴.
본 명세서에서 기재된 디바이스 및 방법은 암 또는 종양의 치료에 유용하다. 일 구현예에서, 치료되는 암은 피부 암. 일 구현예에서, 암은 흑색종이다.
본 명세서에서 고려된 바와 같이, 치료된 암은 1차 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 일 측면에서, 본 명세서에서 기재된 방법은 그 중에서도 하기를 치료하는데 사용된다: 고체 종양, 예를 들어, 흑색종, 폐 암 (폐 선암종, 기저 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 큰 세포 암종, 세기관지폐포 암종, 기관지 암종, 비-소-세포 암종, 소 세포 암종, 중피종 포함); 유방 암 (유관 암종, 소엽 암종, 염증성 유방 암, 투명 세포 암종, 점액성 암종, 장막 강 유방 암종 포함); 결장직장 암 (결장 암, 직장 암, 결장직장 선암종); 항문 암; 췌장 암 (췌장 선암종, 소도 세포 암종, 신경내분비 종양 포함); 전립선 암; 전립선 선암종; 난소 암종 (장액 종양, 자궁내막모양 종양 및 점액성 낭샘암종, 성삭기질 종양을 포함하는 난소 상피성 암종 또는 표면 상피성-기질 종양); 간 및 담관 암종 (간세포 암종, 담관암종, 혈관종 포함); 식도 암종 (식도 선암종 및 편평상피 세포 암종 포함); 경구 및 구강인두 편평상피 세포 암종; 타액샘 선양 낭성 암종; 방광 암; 방광 암종; 자궁의 암종 (자궁내막 선암종, 안구, 자궁 유두상 장액 암종, 자궁 투명-세포 암종, 자궁 육종, 평활근육종, 혼합된 뮬레리안 종양 포함); 신경아교종, 교모세포종, 수모세포종, 및 뇌의 다른 종양; 신장 암 (신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 윌름스 종양 포함); 두경부의 암 (편평상피 세포 암종 포함); 위의 암 (위 암, 위 선암종, 위장 기질 종양); 고환 암; 세균 세포 종양; 신경내분비 종양; 자궁경부 암; 위장관, 유방, 및 다른 기관의 암양종; 인환 세포 암종; 육종을 포함하는 간엽 종양, 섬유육종, 혈관종, 혈관종증, 혈관외피세포종양, 의사혈관종 기질 과다형성, 근섬유모세포종, 섬유종증, 염증성 근섬유아세포 종양, 지방종, 혈관지방종, 과립 세포 종양, 신경섬유종, 신경집종, 맥관육종, 지방육종, 횡문근육종, 골육종, 평활근종, 평활근육종, 흑색종을 포함하는, 피부, 자궁경부, 망막모세포종, 두경부 암, 췌장, 뇌, 갑상선, 고환, 신장, 방광, 연조직, 부신, 요도, 음경의 암, 점액육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 악성 섬유질 조직구종, 림프관육종, 중피종, 편평상피 세포 암종; 표피모양 암종, 악성 피부 부속기 종양, 선암종, 간종양, 간세포 암종, 신장 세포 암종, 부신종, 담관암종, 과도기적 세포 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 세포 암종, 신경아교종 역형성; 다형상 교모세포종, 신경교세포종, 수모세포종, 악성 수막종, 악성 신경집종, 신경섬유육종, 부갑상선 암종, 갑상선의 수질 암종, 기관지 암양종, 크롬친화세포종, 소도 세포 암종, 악성 암양종, 악성 부신경절종, 흑색종, 메르켈 세포 신생물, 엽상낭상 육종, 타액 암, 흉선 암종, 및 질의 암.
면역치료제 (면역 체크포인트 억제제) 및 면역적 아쥬반트
면역 체크포인트 단백질 (면역 체크포인트 억제제)를 억제시키는 것으로 공지되는 다수의 면역치료제가 있다. 공지된 면역 체크포인트 단백질은 CTLA-4, PD1 및 그것의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 그리고 게다가 LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR을 포함한다. LAG3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, 및 KIR을 포함하는 경로는 CTLA-4 및 PD-1 의존적 경로에 유사한 면역 체크포인트 경로를 구성하기 위해 당해 분야에서 인식된다 (참조 예를 들면 Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264).
면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질의 기능을 억제시키는 임의의 화합물이다. 억제는 기능의 감소 및/또는 전체 봉쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 단백질은 인간 면역 체크포인트 단백질이다. 따라서, 면역 체크포인트 단백질 억제제는 인간 면역 체크포인트 단백질의 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트 단백질은 당해 분야에서 기재된다 (참조 예를 들어, Pardoll, 2012. Nature Rev. Cancer 12: 252-264).
바람직한 면역 체크포인트 단백질 억제제는 면역 체크포인트 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 다수의 PD1, PDL-1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, 4-1BB (CD137), TIM3 및 KIR 억제제는 공지되고 이들 공지된 면역 체크포인트 단백질 억제제의 유사성에서, 대안적인 면역 체크포인트 억제제는 본 명세서에서 개시된 디바이스 및 방법을 사용하여 투여될 수 있다.
PD-1 억제제의 예는 비제한적으로 인간 PD-1을 차단하는 인간화된 항체 예컨대 펨브롤리주맙 (예전에 람브롤리주맙), 또는 피딜리주맙 뿐만 아니라 완전하게 인간 항체 예컨대 (MDX-1106 또는 BMS-936558로서 이전에 공지된) 니볼루맙을 포함한다. 이필리무맙은 명칭 Yervoy (Bristol-Myers Squibb) 하에 현재 시판되는 완전하게 인간 CTLA-4 차단 항체이다. 제2 CTLA-4 억제제는 트레멜리무맙이다. 일 구현예에서, 면역치료제는 니볼루맙이다.
게다가, 면역 체크포인트 억제제는 비제한적으로 PD-L1을 차단하는 인간화된 또는 완전하게 인간 항체 예컨대 MEDI-4736 (WO2011066389 Al에서 개시됨), MPDL328 OA (US8217149 B2에서 개시됨) 및 MIH1 (eBioscience (16.5983.82)를 통해 수득가능한 Affymetrix) 그리고 현재 조사 하에 다른 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다. PD-LI에 추가의 항체는 아테졸리주맙 및 더발루맙을 포함한다.
일 구현예에서, KIR 억제제는 투여된다. 리릴루맙은 KIR2DL1/2L3에 결합하는 인간 단클론성 항체이다. 일 구현예에서, 4-1BB (CD137)의 억제제는 투여된다. 우렐루맙은 CD137의 세포외 도메인을 표적한다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 바람직하게는 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1 억제제로부터 선택되고, 예컨대 상기 언급된 공지된 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1 억제제 (이필리무맙, 트레멜리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, AMP-244, MEDI-4736, MPDL328 OA, MIH1), 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
PD1 및 PD-L1 억제제, 예컨대 상기 언급된 공지된 PD-1 또는 PD-L1 억제제로부터 면역 체크포인트 억제제의 선택은 더욱 바람직하고 가장 바람직하게는 PD-1 억제제, 예컨대 상기 언급된 공지된 PD1 억제제로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, PD1 억제제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 또는 인간 PD1에 대한 또 다른 길항제 항체이다.
일 구현예에서, 면역치료제는 면역학적 아쥬반트와 조합으로 투여될 수 있다. 면역적 아쥬반트는 다른 면역치료제 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 알루미늄 염 (명반), 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드-함유 DNA)와 조합으로 사용된 경우 면역 반응을 촉진, 연장, 또는 향상시키기 위한 작용을 하는 임의의 서브스턴스이다 (참조 Lim, YT. Clin Exp vaccine Res. 2015 Jan; 4(1): 54-58).
실시예
하기 실시예는 조성물, 디바이스, 방법, 및 개시된 주제에 따른 결과를 설명하기 위해 아래에 제시된다. 이들 실시예는 본 명세서에서 개시된 주제의 모든 측면을 포괄하는 의도는 아니고, 오히려 대표적인 방법 및 결과를 설명하는 의도이다. 이들 실시예는 당해 분야의 숙련가에 분명한 본 발명의 등가물 및 변화를 제외하는 의도는 아니다.
실시예 1. 항-PD1 항체의 마이크로니들 패치- 보조된 전달에 의해 향상된 암 면역요법
물질
모든 화학물질은 상업적 공급원으로부터 수득되었고 추가 정제없이 사용되었다. 나트륨 히알루론산 (300 kDa의 분자량)은 Freda Biochem Co., Ltd. (Shandong, China)로부터 구매되었다. 알긴산염 (Mn=160 kDa), 덱스트란 (Mn=9-11 kDa), 글루코스 옥시다제 (GOx) 및 소 카탈라제 (CAT)는 Sigma-Aldrich로부터 구매되었다. 2-에톡시-1-프로펜은 Synthonix Inc.로부터 수득되었다. 탈이온수는 Millipore NanoPure 정제 시스템 (18.2 MΩ·cm-1 초과 저항률)에 의해 제조되었다. 합성 및 분석용 모든 유기 용매는 Fisher Scientific Inc.로부터 주문되었고 받은 채로 사용되었다.
세포주
마우스 흑색종 세포주 B16F10은 미국 종균 협회로부터 구매되었다. 생물발광 생체내 종양 이미지형성을 위하여, B16F10-luc 세포는 UNC에서 Dr. Leaf Huang으로부터 기증이었다. 세포는 10% 우태 혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/mL 페니실린 (Invitrogen) 및 100 U/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen)으로 보충된 둘베코 변형된 이글 배지 (Gibco, Invitrogen)에서 유지되었다. RAW 264.7 쥣과 대식세포는 미국 종균 협회로부터 구매되었고 10% 우태 혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/mL 페니실린 (Invitrogen) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen)으로 보충된 RPMI 1640 배지 (Gibco, Invitrogen)에서 유지되었다.
항체
생체내 사용된 aPD1 (항-PD1 항체) 및 aCTLA4 (항-CTLA4 항체)는 Biolegend Inc.로부터 구매되었다. 주사당 투약은 1 mg/kg이었다. 염색 항체는 FACS를 위하여 CD3, CD4, 및 CD8을 포함하였고 제조자의 지침에 따라 분석되었다. 염색된 세포는 Calibur FACS 기기 (BD)에서 분석되었고 flowjo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
아크릴레이트 변형된 HA ( m -HA)의 합성 및 특성규명
m-HA는 문헌 (Lee, D.-K. 등. ACS Nano 2015, 9, (11), 11490-11501)에 따라 합성되었다. 간단히, 1.0 g의 HA는 4℃에서 50 mL의 DI 수에 용해되었고, 여기에 0.8 mL의 메타크릴산 무수물 (MA)는 적가되었다. 반응 용액은 5N NaOH의 첨가에 의해 pH 8-9로 조정되었고 4℃에서 24 시간 동안 교반되었다. 수득한 폴리머는 아세톤내 침전, 이어서 에탄올로 3회 세정에 의해 수득되었다. 생성물은 DI 수에 재용해되었고 그 용액은 2 일 동안 DI 수에 대해 투석되었다. m-HA는 87.5%의 수율로 동결건조에 의해 달성되었다. 변형의 감소는 별개의 가깝게 이격된 피크에 표준 디콘볼루션 알고리즘 수행후 5.74 및 6.17 ppm (메타크릴레이트 양성자)에서 양성자 피크하 면적 대 1.99 ppm (HA의 N-아세틸 글루코사민)에서 피크하 면적의 비 비교에 의해 15%인 것으로 계산되었다.
m-HA: 1H NMR (D2O, 300 MHz, δ ppm): 1.85-1.96 (m, 3H, CH2=C(CH 3 )CO), 1.99 (s, 3H, NHCOCH 3 ), 5.74 (s, 1H, CH 1 H2=C(CH3)CO), 6.17 (s, 1H, CH1 H 2 =C(CH3)CO).
현수 아세탈 변형된 덱스트란 ( m -덱스트란)의 합성 및 특성규명
간단히, 1.0 g의 덱스트란 (분자량: 9-11 kDa)은 불꽃-건조된 플라스크에 첨가되었고 아르곤으로 퍼징되었다. 10 mL의 무수 DMSO는 덱스트란이 완전히 용해된 때까지 첨가 및 교반되었다. 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 (PPTS, 15.6 mg, 0.062 mmol) 이어서 2-에톡시프로펜 (4.16 mL, 37 mmol)은 용액에 첨가되었다. 혼합물은 아르곤으로 퍼징되었고 그 다음 밀봉되어 반응물 증발을 예방하였다. 반응은 실온에서 30 분 동안 교반되었고, 그 다음 1 mL의 트리에틸아민으로 켄칭되었다. 수득한 혼합물은 침전되었고 염기성 물 (pH~8)에서 3회 세정되어 열화를 예방하였고 원심분리 (8000 rpm, 15 분)에 의해 수집되었다. 잔존 물은 동결건조에 의해 제거되었다.
m-덱스트란: 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz, δ ppm): 1.10 (m, OCH2CH 3), 1.30 (m, C(CH 3)2), 3.40 (m, OCH 2CH3), 3.55-3.85 (br, 덱스트란 C2-H ~ C6-H), 4.88 (br, 덱스트란 C1-H).
나노입자의 제조
나노입자는 개선된 이중 에멀젼 (수중유중수) 용매 증발/추출 방법에 의해 제조되었다. 간단히, 25 mg의 m-덱스트란을 함유하는 1 mL의 유기상 (디클로로메탄 (DCM))은 45 사이클 (45%의 듀티 사이클을 가진 각 1 s) 동안 초음파처리에 의해 0.25 mg의 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체를 단독으로 또는 1.25 mg의 효소 (글루코스 옥시다제 대 카탈라제의 중량비 4:1)과 함께 함유하는 0.5 mL의 수상으로 에멀젼화되었다. 그 후에, 1차 에멀젼은 25 mL의 알긴산염 수용액 (1%)에 즉시 부어졌고 45 사이클 동안 초음파처리되었다. 이중 에멀젼은 150 mL의 알긴산염 수용액 (0.2%) 속에 후속적으로 전달되었다. 혼합된 현탁액은 실온에서 교반되어 증발에 의해 DCM을 제거하였다. 2 시간 후, 수득한 나노입자는 클리닝되었고 10,000 rpm에서 원심분리 및 증류수 3회 현탁의 절차 반복에 의해 수집되었다. 이중 에멀젼의 제조용 m-덱스트란/항-PD-1 항체/효소의 최종 중량비는 100/1/5로서 결정되었다. 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC) 표지된 항체를 함유하는 입자는 상기와 동일한 방식으로 만들어졌다.
항체-캡슐화된 나노입자의 장입 수용력 (LC) 및 캡슐화 효율 (EE)는 마우스 단클론성 항체 ELISA 검정을 통한 비-캡슐화된 IgG의 양의 측정 및 기초 정정으로서 비어있는 입자의 사용에 의해 결정되었다. LC 및 EE는 LC = (A-B)/C, EE = (A-B)/A로서 계산되었고, 여기에서 A는 항체의 기대된 캡슐화된 양이었고, B는 수집 용액에서 항체의 자유 양이었고, C는 입자의 총 중량이었다. 입자 크기 및 다분산도 강도는 동적 광 산란 (DLS)에 의해 측정되었다. NPs의 제타 전위는 DI 수에서 적절한 희석 후 동일한 기기를 사용하여 그것의 전기영동 이동도에 의해 결정되었다. 측정은 실온에서 3중으로 실시되었다.
나노입자 (NP) 형태학은 주사 전자 현미경검사에 의해 조사되었다. 입자는 0.5 mg/mL의 농도에서 탈이온수에 현탁되었고 수득한 분산물은 실리콘 웨이퍼 상에 적가되었고 실온 하에 밤새 공기 건조되었다. 입자는 그 다음 금/팔라듐으로 스퍼터 코팅되었고 이미지화되었다. 이미지는, 20 kV에서 작동하는, JEOL 6400F SEM (Tokyo, Japan)에 의해 포착되었다.
나노입자-장입된 마이크로니들의 제작 및 특성규명
이 연구에서 MNs 모두는 원통형 홀의 어레이를 창출하기 위해 직접적으로 레이저 제거에 의해 기계 가공된 Blueacre Technology Ltd.로부터 6 균일한 실리콘 금형을 사용하여 제작되었다. 각각의 마이크로니들은 대략 5μm의 팁 반경과 600 μm의 높이로 300 μm 곱하기 300 μm 둥근 베이스 테이퍼링을 가졌다. 마이크로니들은 600 μm 팁-대-팁 간격으로 15 곱하기 15 어레이에서 배열되었다.
나노입자의 제조 후, 제조된 나노입자는 1 분 동안 배쓰 초음파발생장치내 0.6 mL 증류수에서 분산되었다. 그 다음, (2mg의 NPs를 함유하는) 50uL의 NPs 현탁액은 각각의 실리콘 미세금형 표면상에 피펫팅 이어서 5 분 동안 진공 (600mmHg) 조건화에 의해 직접적으로 침착되어 마이크로니들 공동 속에 NP 용액 유동을 허용하였다. 그 후에, 미세금형은 rpm = 2000에서 20 분 동안 Hettich Universal 32R 원심분리기에 전달되어 NPs를 마이크로니들 공동 속에 압축시켰다. 침착 공정은 총 5회 동안 반복되었고 제작 동안 금형 표면에서 잔류 NPs는 제거되어 임의의 원하지 않는 결과를 없앴다. 더 나은 마이크로니들 형태학을 위하여, 4 cm×9 cm 은 접착 테이프의 피스는 2 cm×2 cm 미세금형 베이스플레이트 주위 적용되었다. 게다가, N,N '-메틸렌비스아크릴아미드 (MBA, 4 wt%) 및 광개시제 (Irgacure　2959, 0.05 wt%) 용액과 3mL 사전혼합된 m-HA (4 wt%)는 준비된 미세금형 저장소에 첨가되었다. 최종 디바이스는 진공 데시케이터에서 25℃에 6-8 시간의 건조를 경험하였다. 건조가 완료된 후, 마이크로니들 어레이는 실리콘 금형으로부터 주의하여 분리되었고 30초 동안 UV 광 (파장: 320-450 nm)에 노출되었다. 니들 베이스는 주사 시린지를 적합하게 하기 위해 맞춤화될 수 있다. 수득한 생성물은 최대 30 일 동안 밀봉된 6 웰 컨테이너에서 저장될 수 있다. 형광 마이크로니들은 FITC 표지된 나노입자 및 로다민 B 표지된 m-HA로 제작되었다. 마이크로니들의 형태학은 노스 캐롤라이나 주립 대학교에서 분석적 계기 장비 설비에 FEI Verios 460L 전계-방출 주사 전자현미경 (FESEM)에서 특성규명되었다. MNs의 형광 이미지는 Olympus IX70 다중-파라미터 형광 현미경에 의해 얻어졌다. UV 가교결합 공정은 Dymax BlueWave 75 UV Curing Spot Lamp를 사용하여 수행되었다.
기계적 강도 시험
MNs의 기계적 강도 측정은 인장 하중 프레임에서 주위 및 아이소메트릭 시험 조건 하에 수행되었다. 인장력은 응력-변형 게이지에서 y-방향을 따라 마이크로니들의 어레이를 압축하는 스테인레스강 플레이트로서 계속해서 모니터링되었다. 초기 게이지는 MN 팁과 스테인레스강 플레이트 사이 2.00mm, 장입 셀 수용력으로서 10.00 N에서 설정되었다. MN-어레이 패치에 대한 최상부 스테인레스강 플레이트 운동의 속도는 0.1 mm/s이었다. MNs의 실패력은 니들이 찌그러지기 시작한 경우 기록되었다.
피부 침투 효율 시험
MN-어레이는 30분 동안 마우스의 등에 적용되었고 제거되었다. 마우스는 안락사되었고 피부 샘플은 OCT 화합물 (Sakura Finetek)에서 포매되었고 드라이아이스상의 이소펜탄 배쓰에서 플래시-냉동되었다. 냉동된 조직은 절단되었고 (10-μm 두께), 현미경 슬라이드상에 실장되었고, -80 ℃에서 저장되었다. FITC 표지된 마이크로니들의 삽입후 피부 조직학적 섹션의 형광 현미경사진은 Olympus IX70 다중-파라미터 형광 현미경에 의해 얻어졌다. 샘플은 NC 주립 대학교 수의과 대학에 조직학 실험실에서 염색된 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)이었다. 별개의 실험에서, 들뜬 피부의 부위는 이미지형성전 5 분 동안 트립판 블루로 염색되었다. 건조 조직 종이로 피부 표면에서 잔존 염료 닦아냄 후, 피부 샘플은 광학 현미경검사 (Leica EZ4 D 입체 현미경)으로 보여졌다.
MNs로부터 시험관내 항체 방출 연구
MNs로부터 항체의 시험관내 방출은 회전식 진탕기의 6 웰 플레이트에서 37℃에 2mL PBS 완충액 (NaCl, 137 mM; KCl, 2.7 mM; Na2HPO4, 10 mM; KH2PO4, 2 mM; pH 7.4)내 MN 패치의 인큐베이션을 통해 평가되었다. 글루코스의 다양한 양은 각각의 튜브에 첨가되어 최종 글루코스 농도 (0 mg/dL, 100mg/dL)에 도달하였다. 예정된 시간에서, 25 μL의 샘플은 분석을 위하여 제거되었고 25 μL의 신선한 방출 배지는 그 다음 웰에 첨가되어 일정한 용적을 유지하였고 인큐베이터 안에 역으로 배치되었다. 샘플의 pH 값은 pH 미터 (Fisher Scientific, AB15)에 의해 기록되었고, 그 다음 총 항체 함량은 ELISA를 사용하여 검사되었다. 각각의 웰의 흡광도는 450 nm에 UV-Vis 분광측정기에서 검출되었고, 농도는 항체 표준 곡선으로부터 보간되었다.
세포독성 연구
MNs에 대한 세포독성 연구는 B16F10 세포를 사용하여 수행되었다. 세포는 5,000 세포 / 웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 씨딩되었고 500 mL 배지당 10 % 태아 소 성장 혈청 (FBS), 1 × Pen-Strep, 1 × L-글루타민 및 2.5 μL의 베타 메르캅토에탄올 (Biorad, Hercules, CA, USA)를 가진 100 μL의 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM, 25 mM 글루코스)에서 배양되었다. 플레이트는 그 다음 5% CO2에서 37℃에 12 시간 동안 인큐베이션되어 70 - 80% 밀집도에 도달한 다음 비어있는 MNs로 인큐베이션된 방출 배지의 연속 희석액이 첨가되었다. 24 시간 동안 MNs로 인큐베이션후, 세포는 PBS 용액으로 세정되었고 100 μL의 신선한 FBS 자유 DMEM 및 20 μL의 새롭게 제조된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 용액 (MTT 용액, 5 mg/mL)로 인큐베이션되었다. 플레이트는 추가의 4 시간 동안 인큐베이션되었다. 4 시간 후, 용액은 주의하여 제거되었고 그 다음 150 μL의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)가 첨가되었다. 플레이트의 흡광도는 10 분 안에 마이크로플레이트 판독기 (Infinite M200 Pro, Tecan, Morrisville, NC, USA)를 사용하여 620 nm의 참조 파장 및 590 nm에서 판독되었다.
마우스 및 생체내 종양 모델
암컷 C57B6 마우스는 Jackson Lab (USA)로부터 구매되었다. 모든 마우스 연구는 노쓰 캐롤라이나 주립 대학교 및 채플 힐 소재 노쓰 캐롤라이나 대학교에서 동물실험위원회에 의해 승인된 동물 프로토콜의 문맥에서 수행되었다. 마우스는 칭량되었고 상이한 그룹으로 무작위로 분할되었다. 마우스의 등에 1 Х 106 루시퍼라아제-태깅된 B16F10 종양 세포 이식된 10 일후 (종양은 ~50-60 mm3에 도달한다), aPD1 (1mg/kg)은 마우스에 종양내/정맥내 주사에 의해 또는 마이크로니들에 의해 투여되었다. 종양 성장은 B16F10 세포의 생물발광 신호에 의해 모니터링되었다. 종양은 디지털 캘리퍼스로 또한 측정되었다. 종양 용적 (mm3)는 (긴 직경 x 짧은 직경2)/2로서 계산되었다
생체내 생물발광 및 이미지형성
생물발광 이미지는 Xenogen IVIS 스펙트럼 이미지형성 시스템으로 수집되었다. 리빙 이미지 소프트웨어 (Xenogen)는 동물 (체중의 10 μL/g) 속에 DPBS (15 mg/ml)내 d-루시페린 (Pierce)의 복강내 주사 10 분후 데이터를 획득하는데 사용되었다.
공초점 현미경검사
종양은 마우스로부터 절개되었고 최적의 컷팅 배지 (O.C.T.)에서 스냅 냉동되었다. 몇 개의 마이크로미터 섹션은 크리오톰을 사용하여 컷팅되었고 슬라이드상에 실장되었다. 섹션은 PBS로 재수화에 앞서 10 분 동안 빙랭 아세톤에서 고정되었다. BSA (3%)로 차단 후, 섹션은 1차 항체로 밤새 4 ℃에서 염색되었다. 슬라이드는 공초점 현미경 (Zeiss)를 사용하여 분석되었다.
ELISA
aPD1의 생물활성을 시험하기 위해, 총 aPD1은 MN 패치로부터 상이한 시점에서 ELISA 검정을 위하여 추출되었다. Corning Costar 9018 ELISA 플레이트는 PBS내 정제된 마우스 PD1 단백질로 코팅되었다. 플레이트는 밀봉되었고 밤새 4 ℃에서 인큐베이션되었다. 세정 및 차단 후, aPD1의 샘플은 2 시간 동안 실온에서 웰 속에 첨가되었다. 세정 완충액으로 세정후, HRP-접합된 항-랫트 lg(H+L) mAbs는 1 시간 동안 실온에서 웰 속에 첨가되었고 이어서 세정되었다. TMB 기질 용액은 aPD1의 생물활성의 검출을 위하여 첨가되었다.
통계적인 분석
통계적인 분석은 GraphPad Prism (5.0)을 사용하여 평가되었다. 통계적 유의도는 쌍으로 된 스튜던트 t 시험 및 2-원 ANOVA로 계산되었다. 0.05 이하의 P 값은 유의미한 것으로 고려되었다.
결과
흑색종에 대한 aPD1의 제어된 전달을 위하여 생리학적으로 자기-분해성 MN 패치-보조된 암 면역요법이 이 실시예에서 개시된다 (도 1). MNs는 지난 10 년 동안 경피 약물 전달에서 널리 탐구되어 왔다 (Chiappini, C. 등. Nat. Mater. 2015; Yu, J. 등. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 2015, 112, (27), 8260-8265; Sullivan, S. P. 등. Adv . Mater. 2008, 20, (5), 933-938; Prausnitz, M. R. Adv . Drug Deliv . Rev. 2004, 56, (5), 581-587; Lee, D.-K. 등. ACS Nano 2015, 9, (11), 11490-11501). 피부는 면역 감시 시스템으로서 작용하는 활성 보호성 장벽이다. MNs는 면역-세포-풍부 표피 속에 무통증으로 침투할 수 있고, T 세포와 그것의 상호작용을 촉진시키는, 영역 림프 및 모세혈관에 aPD1을 전달할 수 있다 (Harvey, A. J. 등. J. Pharm .Res. 2010, 28, (1), 107-116). 종양 미세환경에서 aPD1의 유지 향상, 효소-매개된 지속된 약물 방출 제공, 다른 치료제와 손쉬운 조합 허용의 목적으로, MNs는 pH-감수성 덱스트란 NPs와 통합되었다 (Lu, Y. 등. J. Control Release 2014, 194, 1-19). 각각의 MN은 aPD1 및 글루코스 옥시다제 (GOx)를 캡슐화시키는 NPs와 통합된 생체적합성 히알루론산 (HA)으로 구성된다. GOx는 산소 (O2)의 존재 하에 혈액 글루코스를 글루콘산으로 전환시키기 위해 적용된다. 카탈라제 (CAT)는 O2의 재생에 의해 글루코스 산화를 보조하고 원하지 않는 과산화수소 (H2O2) 소비를 돕는다:
글루코스 + O2 + H2O
Figure pct00001
글루콘산 + H2O2.
NPs 내부에 고정된 GOx/CAT 효소 시스템으로, 글루콘산의 효소-매개된 생성은 3-일 투여 기간 동안 aPD1의 지속된 방출을 초래하고 NPs의 점진적인 자기-해리를 촉진시킨다 (Mura, S. 등. Nat. Mater. 2013, 12, (11), 991-1003; Chen, Q. 등. Biomaterials 2015, 73, 214-230). MN 패치의 단일 투여는 자유 aPD1의 종양내 주사 또는 유발제 요소 (pH 변경제) (GOx)의 부재 하에 MN을 초과하는 B16F10 마우스 흑색종 모델에서 강력한 면역 반응을 유도한다. 추가로, MN은 다른 면역조절물질과 병용 요법용 플랫폼으로서 작용하여 면역요법 효율을 향상시킨다. 이들 결과는 MN 패치-보조된 시스템이 암 면역원성을 개선하고 흑색종의 임상 치료를 용이하게 하는 단순한 및 안전한 기술을 통해 aPD1의 획기적인 전달 전략을 제공한다는 것을 입증한다.
자기-해리된 나노입자 (NPs)는 4 성분: 산-분해성 폴리머 매트릭스, 고분자전해질-기반 계면활성제, GOx/CAT 효소 시스템, 및 aPD1로 구성되었다. 원상태 덱스트란은 완전하게 생체적합성이고, 생분해성이고, 널리 이용가능하고, 변형시키기 쉽고, NPs의 기질 성분으로서 선택되었다 (Naessens, M. 등. J. Ind. Microbiol . Biotechnol . 2005, 32, (8), 323-334). 에톡시프로펜은, 현수 아세탈에 하이드록실의 89% 치환을 가진 유래된 덱스트란 (지정된 m-덱스트란)을 만들었던, 산-촉매 반응을 통해 덱스트란에 콘주게이션되었다 (도 6, 7) (Bachelder, E. M. 등. J. Am. Chem . Soc . 2008, 130, (32), 10494-10495; Gu, Z. 등. ACS Nano 2013, 7, (5), 4194-4201). m-덱스트란은 유기 용매에서 가용성이었고 이중 에멀젼 공정에서 NPs의 형성 동안 aPD1의 캡슐화를 가능하게 하였다 (Gu, Z. 등. G. ACS Nano 2013, 7, (5), 4194-4201). 음이온성 다당류, 알긴산염은 계면활성제로서 추가로 편입되어 음으로 하전된 표면 코팅물을 형성하였다. 주사 전자 현미경검사 (SEM) 이미지 (도 2A)에서 묘사된 바와 같이, 수득한 NPs는 모노-분산 입자 크기를 가진 구형 형상을 가졌다. 동적 광 산란 (DLS)에 의해 결정된 평균 유체역학적 크기는 250 nm이었다 (도 2b). NPs는, 3 주 동안 4 ℃에서 명백한 형태적 변화 또는 항체의 상당한 누출 없이, 7.1 wt%의 항체 장입 수용력을 가졌다 (도 8).
나노입자 (NPs)는 투여의 용이성으로 흑색종 부위에 대하여 캡슐화된 aPD1의 전달용 폴리머-기반 MN에서 추가로 포매되었다. 225 MNs의 어레이는 600 μm의 중심-대-중심 간격으로 9 × 9 mm2 패치에서 조립되었다 (도 9). 각각의 니들은 베이스에서 직경 300 μm, 높이 600 μm 및 5 μm 곡률 반경에 테이퍼링하는 예리한 팁을 가진 원뿔형 형상의 것이었다 (도 2C). HA는 그것의 탁월한 생체적합성, 기계적 특성, 및 맞추어진 가교결합 밀도로 인해 폴리머 MN용 구조적 물질로서 선택되었다 (도 2F). MN 매트릭스는 UV 광 (30 초 동안 9 mW/cm2의 강도에서 365 nm, 상당한 광-독성 없이 양호하게 최적화된 프로토콜)에 노출시 원 위치에서 중합을 통해 가교결합된 히알루론산 (HA), N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (MBA), 및 광개시제 (Irgacure　2959, 0.05 wt%)로부터 제조되었고 (Yu, J. 등. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 2015, 112, (27), 8260-8265; Bryant, S. J. 등. J. Biomater . Sci . Polym . Ed. 2000, 11, (5), 439-57) (도 10), 이는 항체 변성 또는 그것의 안정성 영향을 피하기 위해 온화한 반응 조건을 제공한다 (Ye, Y. 등. Macromol . Chem . Phys. 2015, DOI: 10.1002/macp.201500296; DeMuth, P. C. 등. Nat. Mater. 2013, 12, (4), 367-376). 게다가, MBA와 HA 사이 더 높은 중량비는 MN의 향상된 기계적 특성을 반영하였다 (도 11). 다중 침착을 통해, NPs는 니들의 팁에서 농축되었다. 장입된 약물의 형광 강도에서 규칙적 선형 증가는, 공초점 현미경검사에 의해 측정된 최대 5배 증가하는 침착 사이클로, 관측되었다 (도 12). 장입된 NPs의 분포는 SEM 이미지에서 추가로 확인되었다 (도 2D). FITC-항체 장입된 NPs를 함유하였던 대표적인 MN 패치의 형광도는 NPs가 MNs의 팁에서 우세하게 분포되었다는 것을 명확히 실증하였다 (도 2E). 원하는 MN에 대하여 실패력은 0.38 N/니들로서 정량적으로 측정되었고 (도 2F), 이는 파괴 없이 피부 삽입을 용이하게 하기 위해 충분한 강도를 제공하였다 (Gittard, S. D. 등. J. Adhes . Sci . Technol . 2013, 27, (3), 227-243). aPD1의 제어된 방출 프로파일을 시험하기 위해, GOx의 부재 또는 존재 하에 NPs는 인체에서 정상혈당성 수준 (100 mg/dL)로 글루코스를 함유하는 PBS 완충액에서 모두 인큐베이션되었다. GOx를 가진 NPs는, 400 nm에서 UV 흡광도의 감소, 뿐만 아니라 인큐베이션 용액의 투명도 (도 3D)에 따라, 이후 3일에서 서서히 해리하였다 (도 3A) (Tao, P. 등. ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, (9), 3638-3645). SEM 및 TEM 이미지는 NPs의 형태 변화를 추가로 입증하였다 (도 3B, 13). 포매된 NPs로 MNs의 기록된 pH 값은 경시적으로 7.10에서 4.28로 떨어졌고, 글루코스의 글루콘산으로의 효소 전환을 확인하였다 (도 3C). 그 동안에, GOx를 가진 NPs의 유체역학적 크기 변화는 꾸준히 감소하였다 (도 14). 그에 반해서, 현저한 해리는 GOx 없이 대조군 샘플에서 관측되지 않았다. aPD1의 방출 동력학은 또한 평가되었다. NPs를 함유하는 니들의 팁은 80 시간 동안 글루코스 용액에서 인큐베이션되었다. 지속된 방출 프로파일은 GOx를 가진 MN으로부터 달성되었고, 반면에 무의미한 방출은 GOx 없이 샘플로부터 수집되었다 (도 3E). 게다가, aPD1의 방출 동력학은 또한 NPs에서 효소의 장입 양 변화에 의해 맞추어질 수 있다 (도 15). 따라서 aPD1의 요법 효율은 흑색종의 상이한 단계에 따라 효소의 수준을 변화시킴으로써 추가로 최적화될 수 있다. 정상 글루코스 농도에서 약물 방출은 검사되었고, 정상혈당 범위 안에 상이한 글루코스 수준 사이 유의차는 관측되지 않았다 (도 16). 집합적으로, 이들 결과는 MNs로부터 aPD1의 방출이 글루코스-매개된 및 pH-의존적 방식이었다는 것을 확인하였다. MNs에서 캡슐화후 aPD1의 생물활성은 또한 시험되었다 (도 17). aPD1의 90% 이상이 4℃ 아래 1-개월 저장후 PD1 항원을 결합시키기 위해 생물활성을 남겨두었다는 것이 추정되었다.
수득된 MN 패치는, 트립판 블루 염색 및 하에마톡실린 및 에오신 얼룩 (H&E) 염색에 의해 입증된 바와 같이, 효과적으로 마우스 피부를 침투할 수 있다 (도 4A-4B). 마우스 피부에 삽입시, MNs는 대략 200 μm의 깊이로 침투하였다 (도 4B). 시스템의 생체적합성을 평가하기 위해, 나노입자 (NPs)의 세포독성 및 B16F10 세포에 대한 그것의 열화 생성물은 0.1 내지 1.0 mg/mL 범위의 다양한 농도에서 평가되었다. 연구된 모든 농도에 대하여, m-덱스트란-기반 NPs 및 관련된 열화 생성물은 세포 생존력의 상당한 감소를 보여주지 못했다 (도 18). 패치의 생체내 생체적합성을 추가로 조사하기 위해, 피부가 MN 주사후 빠르게 회복하였고 주위 조직에 비교하여 투여 2일 후 영역에서 관측된 상당한 염증이 없었다는 것이 밝혀졌다 (도 19-20).
MN 패치에 의해 전달된 aPD1의 항-피부 암 효율을 평가하기 위해, 흑색종의 B16F10 마우스 모델은 임상 전이성 흑색종을 모방하는데 사용되었다. B16F10-luc 암 세포는 암컷 C57BL/6 마우스의 뒷쪽 등 영역에서 피하로 이식되었다. 종양 크기가 약 50-60 mm3를 도달한 후, (GOx를 가진) MN 패치, 자유 aPD1, 및 GOx와 무관하게 aPD1로 장입된 MN 패치는 종양 부위상에 단일 국부 투여에 의해 투여되었다 (패치의 영역은 종양 부위보다 더 컸다). 그룹 사이 항-흑색종 효율을 비교하기 위해, 마우스는 aPD1의 상대적으로 더 낮은 용량 (1 투약량: 1mg/kg)으로 처리되었다. 이후 2 주에서, 종양 성장은 쉽게 시각화되었고 B16F10-luc 세포의 생물발광 신호에 의해 측정되었다 (도 4D-4E). (GOx를 가진) 대조군 MN 패치 치료가 미처리된 그룹에 비교하여 종양 퇴행에서 거의 효과가 없다는 것이 관측되었다. 자유 aPD1로 처리된 마우스가 제1 며칠에서 지연된 종양 성장을 보여주었던 반면, 종양 재발은 나중에 극적으로 발생하였다. GOx 장입 없이 MN-항-PD-1로 처리된 그룹에서 종양 퇴행에 관한 효과는 aPD1의 제한된 방출로 인해 제한되었다. 그에 반해서, (GOx를 가진) MN 패치에 의해 전달된 aPD1을 수령하는 마우스는 상당한 지속된 종양 억제를 보여주었고, 종양의 일부는 심지어 치료후 사라졌다. 중요하게는, 마우스의 40%가 aPD1-GOx-MN 패치로 처리된 후 40 일을 여전히 생존하였다는 것이 밝혀졌다. 예리한 대조로, 마우스의 어느 것도 대조군 그룹에서 생존하지 못했다 (도 4F). 이 현저한 항-종양 효능은 종양 부위에서 MNs에 의한 aPD1의 지속된 방출 및 종양 미세환경에서 aPD1의 향상된 유지에 기인될 수 있다.
다음으로, 처리된 종양은 상이한 시점에서 면역염색을 위하여 수집되었다. 대조군으로서, 자유 aPD1이 직접적으로 종양내로 주사된 경우, 강한 항체 신호는 투여 날짜 (0 일째)에 종양 부위에서 발견되었다. 그러나, 다른 조직 속에 항체의 확산을 나타내는, 신호는 이후 3일에서 상당히 줄어들었고, 반면에 MN에 의해 전달된 aPD1은 종양 부위에서 발견된 항체의 계속해서 관측된 신호로 이어질 수 있다. 종양 미세환경에서 aPD1의 존재는 종양의 미세환경에서 억제성 대 세포독성 반응의 밸런스 변경에서 핵심 역할을 하여 (Zou, W. Nat. Rev. Cancer 2005, 5, (4), 263-274), 암 세포를 인식하고 파괴하는 면역 세포를 초래한다.
치료후 종양 부위 속에 면역 세포의 침윤을 연구하기 위해, 종양으로부터 종양-침윤 림프구 (TILs)는 그 다음 수확되었고 치료 10 일 후 면역형광 및 유세포측정에 의해 분석되었다. 면역형광 염색은 미처리된 종양이 제한된 T-세포 침윤을 가졌다는 것을 드러냈다 (도 5A). 그에 반해서, MN-GOx-aPD1 처리된 마우스로부터 종양은 양쪽 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 의해 현저하게 침윤되었다. aPD1이 MN 패치에 의해 전달된 후 종양에서 CD8 + T 세포의 백분율은 자유 aPD1 치료 그룹에서의 것의 1.5-배, 그리고 대조군 MNs 또는 미처리된 그룹에서의 것에 비교하여 2-배이었다 (도 5B-5C).
추가 단계에서, MN 패치의 항-흑색종 효능은 aPD1 (1mg/kg)으로 장입된 자기-해리된 NPs의 직접적으로 종양내 주사 또는 정맥내 (i.v.) 주사에 의한 aPD1의 전신 투여를 포함하는 이전의 방법에 비교되었다. 도 21에서 나타낸 바와 같이, MN-GOx-aPD1로 처리된 마우스는 다른 치료와 비교하여 상당한 항-종양 효율을 보여주었다. 40 일 내에 aPD1-GOx-MN 패치로 처리된 후 검출불가능한 종양을 가진 마우스의 약 50%는 생존하였다. aPD1의 전신 투여 또는 자기-해리된 aPD1-NPs의 종양내 주사는 평균 생존 시간을 약간 증가시켰지만 마우스의 어느 것도 40 일 지나서 생존하지 못했다. 이들 결과는 우리의 MN이 투여 이후 종양에서 aPD1의 유지를 향상시켜, aPD1 체크포인트 억제에 의한 향상된 암 면역요법을 초래하였다는 것을 명확히 나타냈다.
항-CTLA4는 T-세포 활성화를 촉진시키는 그리고 T 조절 세포 (Tregs)를 망가뜨리는 또 다른 체크포인트 항체이다 (Pardoll, D. M. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, (4), 252-264; Wang, C. 등. Adv . Mater. 2014, 26, (48), 8154-8162). aPD1 치료후 TILs에서 관측된 증가된 CTLA4 발현으로 인해 (Lussier, D. M. 등. J. Immunother. Cancer 2015, 3, (1), 1-11; Curran, M. A. 등. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 2010, 107, (9), 4275-4280), MNs에 의한 항-CTLA4 항체 (aCTLA4) 및 aPD1 공-전달의 조합은 항체의 절반 용량으로 이들 요법의 효능에서 증가에 대하여 검사되었다. B16F10 흑색종을 갖는 마우스는 IgG (1mg/kg, 아이소타입 대조군), aCTLA4 (1mg/kg), aPD1 (1mg/kg)으로 장입된, 또는 aCTLA4 및 aPD1 (0.5mg/kg, 각각)으로 공-장입된 MN-GOx 패치로 처리되었다. 도 22A에서 나타낸 바와 같이, 현저한 상승작용 효과는 aCTLA4 단독, aPD1 단독, 또는 IgG MNs 처리된 마우스에 비교하여 MNs를 통해 공-전달된 aCTLA4 및 aPD1의 조합에 의해 달성되었다. 또한, MNs에 의해 전달된 aCTLA4 및 aPD1의 조합은 60 일 지나 aCTLA4 및 aPD1의 조합으로 처리된 마우스의 거의 70%에서 장기간 무질환 생존을 가진 흑색종의 완전한 대조군을 초래하였다 (도 22B).
요약하면, MN 패치-보조된 면역요법은 피부 암의 향상된 치료를 위하여 aPD1을 전달할 수 있다. 패치는 표피를 무통증으로 침투할 수 있고 종양 미세환경에 그것의 적재물을 효율적으로 전달하기 위해 간질액에서 담겨질 수 있다. 각각의 니들에서 나노입자 (NPs)는 aPD1 및 글루코스 옥시다제 효소를 함유하고, 이는 NPs의 "자기-해리"를 촉진시키고 지속된 방식으로 aPD1의 방출을 후속적으로 용이하게 한다. 흑색종을 가진 마우스 모델을 이용하는 생체내 　연구는 MN 패치의 단일 투여가 동일한 용량의 종양내 (i.t.) 주사로 수득된 것보다 우월한 종양 성장을 억제시켰다는 것을 보여주었다. 또한, aCTLA-4 및 aPD1로 공-장입된 MN은 흑색종의 상승작용 치료를 초래하였다. 종합하여, 이들 결과는 MN-보조된 전달 시스템이 개선된 안전성, 면역원성 및 수송 작업으로 암 면역치료제의 투여에 신규한 플랫폼 기술을 제공한다는 것을 보여준다.
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달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용된 공보 그리고 이들이 인용되는 물질은 참고로 구체적으로 편입된다.
당해 분야의 숙련가는 수많은 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 구현예에 실시될 수 있다는 것 그리고 그와 같은 변화 및 변형이 본 발명의 사상의 이탈 없이 실시될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 해당하는 경우 첨부된 청구항이 모든 그와 같은 등가 변화를 포함한다는 것이 의도된다.

Claims (41)

  1. 하기를 포함하는, 대상체의 생물학적 장벽에서 물질의 수송용 디바이스:
    베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들
    상기 마이크로니들의 상기 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
    산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 디바이스.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체인, 디바이스.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 니볼루맙인, 디바이스.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 펨브롤리주맙인, 디바이스.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체인, 디바이스.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항-CTLA4 항체가 이필리무맙인, 디바이스.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체와 조합으로 항-PD1 항체인, 디바이스.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 변경제가 글루코스 옥시다제인, 디바이스.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 변형된 덱스트란을 포함하는, 디바이스.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 계면활성제를 추가로 포함하는, 디바이스.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 계면활성제가 알긴산염인, 디바이스.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로니들이 히알루론산을 포함하는, 디바이스.
  14. 하기 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법:
    마이크로니들 패치를 대상체에 제공하는 단계, 상기 마이크로니들 패치는 하기를 포함함:
    베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
    상기 마이크로니들의 상기 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질;
    산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴;
    상기 마이크로니들을 생물학적 장벽 속에 삽입시키는 단계, 상기 pH 변경제는 상기 pH를 상기 산-분해성 나노입자 안에서 감소시키고, 여기서 pH에서 상기 감소는 상기 나노입자를 분해시키고 상기 면역치료제를 상기 대상체 속에 제어된-방출 방식으로 방출시킴.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 질환이 암인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 암이 흑색종인, 방법.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 니볼루맙인, 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 펨브롤리주맙인, 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체인, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 항-CTLA4 항체가 이필리무맙인, 방법.
  23. 청구항 17에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체와 조합으로 항-PD1 항체인, 방법.
  24. 청구항 14 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 변경제가 글루코스 옥시다제인, 방법.
  25. 청구항 14 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 변형된 덱스트란을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 14 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 계면활성제를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 계면활성제는 알긴산염인, 방법.
  28. 청구항 14 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로니들이 히알루론산을 포함하는, 방법.
  29. 하기를 포함하는, 생물학적 장벽에서 면역치료제의 전달용 부품의 키트:
    하기를 포함하는 마이크로니들 패치:
    베이스 단부 및 팁을 각각 갖는 복수의 마이크로니들;
    상기 마이크로니들의 상기 베이스 단부가 부착되거나 통합되는 기질; 및
    산-분해성 나노입자, 상기 나노입자는 면역치료제 및 pH 변경제를 캡슐화시킴.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 키트.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 면역치료제가 항-PD1 항체인, 키트.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 니볼루맙인, 키트.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 펨브롤리주맙인, 키트.
  34. 청구항 30에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체인, 키트.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 항-CTLA4 항체가 이필리무맙인, 키트.
  36. 청구항 30에 있어서, 상기 면역치료제가 항-CTLA4 항체와 조합으로 항-PD1 항체인, 키트.
  37. 청구항 29 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 변경제가 글루코스 옥시다제인, 키트.
  38. 청구항 29 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 변형된 덱스트란을 포함하는, 키트.
  39. 청구항 29 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-분해성 나노입자가 계면활성제를 추가로 포함하는, 키트.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 계면활성제가 알긴산염인, 키트.
  41. 청구항 29 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로니들이 히알루론산을 포함하는, 키트.
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