KR20180110417A - 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents

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KR20180110417A
KR20180110417A KR1020170039926A KR20170039926A KR20180110417A KR 20180110417 A KR20180110417 A KR 20180110417A KR 1020170039926 A KR1020170039926 A KR 1020170039926A KR 20170039926 A KR20170039926 A KR 20170039926A KR 20180110417 A KR20180110417 A KR 20180110417A
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Abstract

본 발명은 이하의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 자외선 B가 조사되어 광노화가 발생한 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)에서 콜라게나제 활성을 감소시키고 프로콜라겐의 생합성을 증가시켜, 피부의 탄력 증진 및 주름 방지에 효과가 있다. 나아가 향후 피부 노화 방지용 기능성 화장품 관련 산업의 발전에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Figure pat00009

Description

3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물{COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR IMPROVING SKIN WRINKLE CONTAINING 3,5,6,7,8,3',4'-HEPTAMETHOXYFLAVONE}
본 발명은 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 귤피 유래의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본(이하의 화학식 1 참고)을 유효 성분으로 함유하는 광노화에 의한 피부 주름의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
Figure pat00001
피부는 직접 외부환경에 노출되어 있어 생물학적, 화학적, 물리적 자극, 뿐만 아니라 외부환경인자에 의해서도 노화가 진행된다. 피부의 노화는 시간의 경과에 따른 생리적 노화(chronologic aging)와 외재적 요인에 의한 노화(extrinsic aging)로 나누어지며, 피부 노화에 영향을 미치는 외부 인자들은 바람, 온도, 습도, 담배 연기, 공해, 자외선 등이 있다. 그 중 자외선에 의한 노화를 광노화(photo-aging)라고 하며, 특히 자외선 B(UVB, 290∼320㎚)가 광노화의 주요 요인으로 보고되었다.
만성적 일광 손상을 입은 피부에는, 진피의 상부쪽 교원질에의 비정상적인 탄성 물질의 침착(solar elastosis)과 프로테오글리칸의 증가, 및 진피의 주 단백질인 콜라겐의 현저한 감소가 일어난다. 일반적으로, 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며, 진피층의 90%를 차지하고 있어, 콜라겐의 감소는 피부의 노화와 매우 밀접한 관계가 있다.
피부 노화로 인한 주름은, 진피층에서 매트릭스를 형성하는 콜라겐의 분해에 기인한다. 피부의 콜라겐은 노화, 또는 자외선 등의 외부 자극에 의해 콜라겐 분해 효소(Matrix Metallo Proteinase, MMP-1)의 활성도가 높아지면, 콜라겐이 쉽게 분해되어 주름의 생성이 증가되는 임상 연구결과가 보고되었다. 따라서, 최근에는 MMP-1의 생성의 저해 및 활성을 억제하여 근본적으로 생성되는 콜라겐의 분해를 억제하는 제품들이 많이 개발되고 있다.
자외선이 피부 세포에 지속적으로 노출될 경우, 진피층의 섬유아세포에서는 활성 산소(ROS)가 증가하고, 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β)의 발현이 감소되어, 콜라겐 합성이 저해한다. 구체적으로 TGF-β가 섬유아세포 표면의 TGF-β 수용체와 결합하면, 세포내 단백질, 대표적으로 Smad2/Smad3가 활성화되고, 핵 내의 전사인자의 활성화를 통해 콜라겐의 생성이 촉진된다. 과도한 콜라게나제(collagenase, MMP-1) 활성을 억제하는 물질을 이용하여, 콜라게나제 관련 질병 또는 질환을 치료하려는 시도가 계속적으로 이루어지고 있다. 이러한 콜라게나제는 1회의 UV 조사 시에도 피부 내의 활성이 증가하여, 콜라겐을 현저하게 감소시킬 수 있으므로 광노화의 주요 인자로 보고되어 있으며, 이에 주름 개선용 화장품 산업에서는 이러한 콜라게나제의 활성 억제에 초점을 맞추어 연구가 많이 진행되고 있는 실정이다.
콜라겐 합성 촉진 및 콜라게나제 활성 억제를 위해, 종래에는 레티노이드, TGF-β, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산, 클로렐라 추출물 등을 사용했었고, 최근 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저 박피술, 보톡스 주사, 레스틸렌 주사 요법을 이용하기도 한다. 그러나, 제형이 불안정하고 피부적용 시 자극, 발적 등을 일으킬 수 있고, 시술 비용 및 지속성 면에도 큰 효과를 발휘하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 생체내 콜라겐 합성 촉진 효과가 우수한 신규 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.
귤(Citrus Unshiu Markovich)의 과피를 귤피라고 하고, 귤피를 건조시킨 것을 진피라 하는데, 한약재로서 특이한 향과, 약간의 자극성이 있고, 맛은 맵고 쓰며 성질은 따듯하다. 약리 작용으로는, 정유 성분이 소화촉진, 궤양 억제, 위액 분비 억제, 강심, 혈압상승, 항알레르기, 항균작용 등이 밝혀져 있다.
감귤류 과일은 비타민 C 뿐만 아니라, 항산화 작용을 하는 플라보노이드 화합물도 다양하게 함유하는 것으로 알려졌다. 특히 메톡시기를 갖는 플라본 계열은 히드록시기를 갖는 플라보노이드 물질보다 생물학적 활성이 더욱 높다. 감귤류에서 발견되는 폴리메톡시플라보노이드로는 본 발명에 포함되는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 외에도, 하기 화학식 2의 구조를 갖는 노빌레틴(nobiletin)과 하기 화학식 3의 구조를 갖는 탄저레틴(tangeretin) 등이 있다. 노빌레틴과 탄저레틴은 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본과 유사한 구조를 가지나, 본 발명에서는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본이 노빌레틴과 탄저레틴보다 더욱 우수한 콜라게나제 저해 활성 및 프로콜라겐 생합성 증가 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
한국 특허등록 제10-1546336호 한국 특허공개 제10-2017-0000068호
Pharmacognosy Res. 2016 Jul-Sep; 8(3): 160168. Brain Sci. 2015 5(2): 118129. 생명과학회지 제23권 제12호, 2013.12, 1553-1556.
이러한 배경하에 본 발명자들은 귤피 유래의 폴리메톡시플라본 계열의 화합물로부터 여러 가지 생리활성을 갖는 미량 소재에 대해 연구하던 중 콜라게나제 저해 활성이 있는 물질을 분리하였다. 따라서, 본 발명에서는 귤피 유래의 상기 화합물을 포함하여 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 콜라겐 분해 억제와 콜라겐 합성을 향상시키는 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하고자 하였다.
본 발명은 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
일 실시예에서, 상기 피부 주름의 원인은 광노화일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 50~200 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 1형 프로콜라겐(type Ⅰ procollagen)의 생성량을 4배 이상 증가시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 MMP-1(Matrix Metallo Proteinase-1) 콜라게나제의 발현 수준을 30%~85% 저해시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 에멀젼, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 스틱, 자외선 차단제로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 실시예에서, 상기 피부 주름의 원인은 광노화일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 식품 조성물은 음료수, 건강 보조 식품, 드링크제, 껌, 차, 비타민 복합제 및 식품 첨가제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 조성물은 자외선 B 조사에 의해 광노화된 피부섬유아세포(HDFn)에서 콜라게나제 활성을 저해하고, 콜라겐 합성량도 증가시키는 것으로 확인되었다. 특히 콜라게나제 저해 활성은 아스코르브산, 카테킨, 노빌레틴 및 탄저레틴의 콜라겐 저해 활성에 비해 20~370% 높아서, 향후 피부 노화 방지용 기능성 화장품 관련 산업에 본 발명의 조성물이 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1는 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)에서의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른 콜라게나제 저해 활성을 노빌레틴 및 탄저레틴의 저해 활성과 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리 농도에 따른 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4은 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리가 1형 프로콜라겐(Type Ⅰ procollagen) 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른 UVB가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 기질-메탈로프로테나아제(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 단백질 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른 UVB가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 SMAD 3 단백질 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
일 실시예에서, 상기 피부 주름의 원인은 광노화일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 50~200 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 100~200 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 1형 프로콜라겐(type Ⅰ procollagen)의 생성량을 4배 이상 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 4~6배 이상 증가시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 MMP-1 콜라게나제의 발현 수준을 30%~85% 저해시킬 수 있고, 바람직하게는 50~80% 저해시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 에멀젼, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 스틱, 자외선 차단제로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 실시예에서, 상기 피부 주름의 원인은 광노화일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 식품 조성물은 음료수, 건강 보조 식품, 껌, 차, 비타민 복합제, 드링크제 및 식품 첨가제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 식품 조성물에는 필요에 따라 통상적으로 사용되는 안정제, 교미제, 보존제, 감미제 등을 첨가할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 귤피( Citrus unshiu peel)로부터 3,5,6,7,8,3',4'- 헵타메톡시플라 본 분리 및 동정
건조 귤피 시료 20g을 분쇄하여, 50% 에탄올 5ℓ를 추출 용매로 하여 7일간 정치 추출하였으며, 상기 추출액을 감압 농축하여, 조추출물 2g을 확보하였다. 상기 조추출물을 증류수 1ℓ에 용해 후 헥산(hexane) 용매 분배를 실시하여, 840㎎의 분배물을 얻었다. 상기 용매 분배는 증류수와 용매의 질량비가 1:1이 되도록 하여, 4회 반복하였다. 단일물질 분리를 위해 충진제(실리카겔 60, 0.063~0.200㎜, 순상) 150g을 첨가한 컬럼(2.5㎝×60㎝)으로 순상 컬럼 크로마토그래피(normal phase column chromatography)를 수행하였으며, 헥산 분배물을 컬럼에 분주하여 흡착 후, 헥산과 에틸 아세테이트를 용출 용매로 2㎖/분의 유속으로 전개하였다. 용출 용매의 전개는 헥산과 에틸 아세테이트의 질량비가 4:1에서 순차적으로 1.5:1, 1:1.5, 1:2, 1:4 순서가 되도록, 각각 500㎖씩 조제하여 전개하였다. 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 통해 총 160개의 시험관을 분석하였으며, 1에서 9까지의 분획물(fraction)을 얻었다. 순상 컬럼 크로마토그래피 분획을 통하여 분리된 43.5㎎의 분획물 6을, 단일 물질 분리를 위해 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography)를 수행하였다. 분획물 6은 2㎖의 DMSO(디메틸 설폭시드, dimethyl sulfoxide)에 용해하였으며, 충진제(C-18, YMC 겔, 75㎛)를 60g 첨가한 컬럼(2㎝×30㎝)에 흡착 후, 메탄올과 물을 용출 용매로 1.5㎖/분의 유속으로 전개하여, 시험관에 분리하였다. 용출 용매의 전개는 메탄올과 물의 질량비가 6:1에서 순차적으로 9:1, 13:1, 19:1 순서가 되도록, 각각 300㎖씩 조제하여 전개하였다. 박층 크로마토그래피를 통해 총 52개의 시험관을 분석하여, 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 분리하였다. 이후 400MHz NMR 스펙트로미터를 이용한 1H, 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통해, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 동정하였다:
[화학식 1]
Figure pat00006
.
실시예 2. 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 의 이화학적 특성
3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본은 백색의 결정 분말(white crystalline powder)로 C22H24O9의 분자식을 가지며, 이하와 같은 NMR 데이터를 갖는다:
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) : δ 3.79, 3.81, 3.84, 3.85, 3.86, 3.95, 4.02 (각각 3H, s, OCH3), 7.19 (1H, d, J=11.6 Hz, H-5′), 7.65 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2'), 7.70 (1H, dd, J =2.4 Hz, 11.2 Hz, H-6');
13C-NMR : C2 (150.9), C3 (140.0), C4(172.3), C5 (143.3), C6 (137.4), C7(150.9), C8 (137.4), C9 (147.3), C10(114.5), C1'(122.5), C2'(110.7), C3'(148.5), C4'(152.4), C5'(111.7), C6'(121.5), 3-OCH3 (61.9), 5-OCH3 (61.8), 6-OCH3 (61.6), 7-OCH3 (61.4), 8-OCH3 (59.3), 3'-OCH3 (55.6), 4'-OCH3 (55.4).
실시예 3. 3,5,6,7,8,3',4'- 헵타메톡시플라본의 인간 유래 피부섬유아세포 (HDFn) 콜라게나제 활성 저해 효과
인간 유래 피부섬유아세포 HDFn 세포주는 ATCC(American Type Culture collection)로부터 분양받아 사용하였다. 이 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 실험과정의 모든 세포는 80 ~ 90%의 밀집도에서 실험하였다. PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 세포를 세척한 후 회수하여, 5분간 1,000rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 제거 후 0.1% Triton-X 및 1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드를 함유하는 0.1M Tris-HCl(pH 7.6) 용액을 첨가하여 5분간 초음파 처리를 수행하였고, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 수득하여, 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 콜라게나제 효소액으로 사용하였다. 4mM 칼슘 클로라이드를 함유하는 0.1M Tris-HCl 용액(pH 7.5)에 4-페닐아조-벤질옥시-카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3㎎/㎖)을 첨가하여 기질액을 조제하였고, 상기 기질액 125㎕ 및 상기 효소액 75㎕와, 최종 농도가 각각 100, 200㎍/㎖이 되는 실시예 1의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 50㎕를 각각 혼합한 후, 37℃에서 20분간 반응하였다. 양성 대조군으로, 동일 농도의 아스코르브산과 카테킨을 이용하였다. 혼합액에 6% 시트르산을 250㎕ 가하여 반응을 정지시켰으며, 에틸 아세테이트 750㎕를 첨가 후 혼합하였다. 이 액에서 상등액만을 수득하여, 그 중 200㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 320㎚에서 흡광도를 측정하여, 콜라게나제 저해활성을 확인하였다(표 2 및 도 4).
콜라게나제 저해율( % ) = ( 실험군의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도 × 100
귤피 유래 화합물인 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른 인간 유래 피부섬유아세포 HDFn 세포주의 콜라게나제 저해율(%)
시험 물질 처리농도(㎍/㎖)
100 200
아스코르브산 59.04 ± 3.28 124.35 ± 3.85
카테킨 50.66 ± 9.83 103.95 ± 6.84
3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 171.33 ± 16.76 367.03 ± 7.21
표 1는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 농도별 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 콜라게나제 저해 효과를 나타낸 표이다. 표 1과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에서 분리한 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본의 농도가 100㎕/㎖에서 200㎕/㎖로 증가함에 따라 콜라게나제 저해 효과가 약 114% 증가함을 확인할 수 있었으며, 200㎕/㎖의 농도에서 양성 대조군인 아스코르브산에 비해 약 195%, 카테킨에 비해 약 253% 높은 저해 효과를 나타내었다.
실시예 4. 3,5,6,7,8,3',4'- 헵타메톡시플라본의 콜라게나제 효소 활성 저해능 비교 시험
4mM 염화칼슘을 함유하는 0.1M Tris-HCl 용액(pH 7.5)에 4-페닐아조-벤질옥시-카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3㎎/㎖)과 콜라게나제(0.2㎎/㎖)를 각각 첨가하여 기질액과 효소액을 조제하였고, 상기 기질액 125㎕ 및 상기 효소액 75㎕와, 최종 농도 100, 200㎍/㎖의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본, 노빌레틴, 탄저레틴 50㎕를 각각 혼합한 후, 37℃에서 20분간 반응하였다. 양성 대조군으로 동일 농도의 아스코르브산과 카테킨을 이용하였다. 혼합액에 6% 시트르산을 250㎕ 가하여 반응을 정지시켰으며, 에틸 아세테이트 750㎕를 첨가 후 혼합하였다. 이 액에서 상등액만을 수득 후 200㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 320㎚에서 흡광도를 측정하여, 콜라게나제 저해 활성을 확인하였다(표 2과 도 1 참고).
콜라게나제 저해율( % ) = ( 실험군의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도 × 100
귤피 유래 화합물 처리에 따른 인간 유래 피부섬유아세포 HDFn 세포주의
콜라게나제 저해율(%)
시험 물질 처리농도(㎍/㎖)
100 200
아스코르브산 1.56 ± 6.36 9.10 ± 4.39
카테킨 10.50 ± 8.72 13.98 ± 5.97
3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 372.83 ± 28.94 415.89 ± 16.59
노빌레틴 278.92 ± 8.80 331.30 ± 0.73
탄저레틴 226.10 ± 0.41 274.63 ± 0.44
표 2는 귤피 유래 화합물 농도별 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 콜라게나제 저해 효과를 나타낸 표이다. 표 2과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본과 노빌레틴, 탄저레틴 순으로 콜라게나제 활성 억제능이 양성 대조군인 아스코르브산과 카테킨에 비해 모든 농도에서 상대적으로 높게 평가되었다. 200㎍/㎖의 농도에서 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리군은, 양성 대조군인 아스코르브산, 카테킨에 비해 각각 약 4468%, 2875% 높은 저해 효과를 나타내었으며, 노빌레틴, 탄저레틴에 비해 각각 약 26%, 51% 높은 콜라게나제 활성 억제능을 나타내었다.
실시예 5. 인간 유래 피부섬유아세포 ( HDFn ) 세포주 배양
세포는 인간 유래 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDFn)를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다. 구입한 세포를 둘베코 개질 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 배지에 10% 소태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여, 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다.
실시예 6. 3,5,6,7,8,3',4'- 헵타메톡시플라본이 피부섬유아세포(HDFn)의 세포 생존율에 미치는 영향
상기 실시예 5에서 배양한 세포는 80 ~ 90%의 밀집도에서 실험에 사용하였다. HDFn 세포에 대한 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본의 세포독성 유무를 확인하기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-5-디메틸테트라졸륨 브로마이드(MTT) 에세이를 시행하였다. 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24 웰 플레이트에 5×104 세포/웰에 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 동안 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고, 25, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 처리하여 각 그룹당 3회 반복 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 배양한다. 배양 후 시험액이 포함된 배지에 5㎎/㎖의 MTT 시약을 1 웰당 0.5㎎/㎖씩 분주한 다음, 24 웰 플레이트의 빛을 차단하여 3시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, DMSO 1㎖를 가하여 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 용해시키고, 570㎚ 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다(도 2).
세포 생존율( % ) = ( 실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100
도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본은 25 ~ 200㎍/㎖의 농도 범위에서 HDFn 세포에 대하여 세포독성이 나타나지 않았다.
실시예 7. 자외선 조사된 인간 유래 피부섬유아세포 ( HDFn )에 대한 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본의 1형 프로콜라겐 (type Ⅰ procollagen ) 생합성 유도능 분석
1형 프로콜라겐 합성은 1형 C-펩타이드(PIP) 키트(타카라 사)를 이용하여 측정하였다. HDFn 세포를 7×105 세포/웰 농도로 6웰 플레이트에 접종하여 24시간 전배양하고, 각 웰에 실시예 1에서 분리한 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 24시간 후 세포에 자외선(UVB)을 20mJ/㎝2 조사한 후, 5% CO2 농도에서 24시간 배양하였다. 5분간 10,000 rpm로 원심분리한 배양 여액을 1/5로 희석 후, 항체-퍼록시다제-컨쥬게이트 용액 100㎕와 혼합하고, 이를 96 웰 EIA 키트에 분주하여, 37℃에서 3시간 방치하였다. PBS(pH 7.4)를 이용하여 각 웰을 4회 세척한 후 기질 용액(TMBZ) 100㎕를 첨가하여, 상온에서 15분간 암반응하였다. 이후, 1N H2SO4 100㎕을 분주하여 반응을 정지한 후, 450㎚에서 흡광도를 측정하고, 콜라겐 표준액을 이용한 표준곡선과 비교하여, 1형 프로콜라겐 생성량을 정량하였다(표 3, 도 4).
귤피 유래 화합물인 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리에 따른
1형 프로콜라겐 생성량
3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 처리농도(㎍/㎖) UV 조사량(mJ/㎠) 1형 프로콜라겐 함량(㎎/㎖)
- - 0.70 ± 0.02
- 20 0.10 ± 0.00
50 20 0.46 ± 0.01
100 20 0.56 ± 0.04
200 20 0.61 ± 0.01
표 3는 UVB가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)에 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 농도별 처리에 따른 1형 프로콜라겐 생성량을 나타낸 표이다. 표 3와 도 4에서 나타낸 바와 같이, 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본이 처리되지 않은 대조군의 HDFn 세포는, UVB 처리 시, 1형 프로콜라겐 함량이 약 629% 감소하였다. 반면, UVB 처리군에서 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본의 농도가 증가함에 따라, 1형 프로콜라겐 함량이 각각 386%, 482%, 540% 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 자외선 조사된 인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)에 대한 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본의 콜라게나제 ( MMP -1) 단백질 발현 억제능 및 SMAD 3 단백질 발현 유도능 분석
피부 진피내 콜라겐의 수준을 측정하기 위하여, 인간 유래 피부섬유아세포에 실시예 1의 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 처리하고, 20 mJ/㎝2 UVB를 조사하여 48시간 배양한 후, 세포에 RIPA 용리 및 추출 버퍼(Thermo ScientificTM)를 사용하여 세포를 용해하였다.
인간 유래 피부섬유아세포(HDFn)의 MMP-1과 SMAD 3의 효소 발현을 측정하기 위하여, 웨스턴블로팅을 시도하였다. 세포추출물의 단백질을 6% SDS-PAGE 겔 상에서 80V로 전기영동하였다. 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이시킨 다음, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 3% BSA와 함께 배양하였다. MMP-1과 SMAD 3의 1차 항체(염소 항-인간 다중 항체(polyclonal goat anti-human antibody, 산타 크루즈 바이오테크사)]를 각각 1,000배로 희석하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 더해주고, 이를 교반하면서 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 이차 항체인 염소 항-마우스 고추냉이 퍼록시다제(goat anti-mouse horseradish peroxidase)(산타 크루즈 바이오테크사)를 5,000배 희석하여, 상기 멤브레인에 더해주고 1시간 동안 배양하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨진 단백질은 ECLTM 프라임 웨스턴 블로팅 탐지 시약(Prime Western Blotting Detection Reagent) (GE 헬스케어사)로 검출하여, 발광 이미지 분석기(Luminescent Image Analyzer) LAS-3000(후지필름 라이프 사이언스사)로 촬영하였다(도 5, 6).
도 5에서 나타낸 바와 같이, 대조군의 UVB 처리 군은 UVB 무처리군보다 MMP-1의 발현이 약 26% 증가하였으나, 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 200㎍/㎖ 처리한 경우에는 MMP-1의 효소 발현이 79% 감소함을 확인하였다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, UVB 처리만 한 경우에도 SMAD 3의 발현이 증가하기는 하나, 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본 200㎍/㎖를 처리한 경우 UVB 처리만 한 경우보다 SMAD 3의 효소 발현이 277% 증가함을 확인하였다.
따라서, 상기 도 5 및 도 6의 결과를 종합하면, 자외선에 의한 광노화 피부에서 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본은 MMP-1 발현을 약 80% 억제시키고, SMAD 3의 발현을 3배 가까이 증가시키는 것을 알 수 있었다. 이 결과로 볼 때, 본 발명의 조성물은 광노화에 의한 피부 탄력 저하 및 피부 주름에 효과적인 화장료 및 식품으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 9. 통계 처리
상기 실시예 3, 4, 5, 6, 7, 8에서 수행된 각 실험은 3회 이상 반복하였으며, 각각의 시료 농도에 대한 평균값과 표준편차값을 얻었다. 각 실시예에서 도출된 결과의 통계분석은 one-way ANOVA 분석후 터키 사후 검정(Tukey's post test) 을 수행하였다(*P<0.05, ***P<0.001).

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00007
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피부 주름이 광노화에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물이 에멀젼, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 스틱 및 자외선 차단제로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본이 50~200 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 1형 프로콜라겐(type Ⅰ procollagen)의 생성량을 4배 이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 100~200 ㎍/㎖의 농도에서 자외선 B가 조사된 인간 유래 피부섬유아세포주(HDFn)의 MMP-1(Matrix Metallo Proteinase-1) 콜라게나제의 발현 수준을 30%~85% 저해시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 3,5,6,7,8,3',4'-헵타메톡시플라본을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00008
    .
  8. 제7항에 있어서,
    상기 피부 주름이 광노화에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 식품 조성물이 음료수, 건강 보조 식품, 드링크제, 껌, 차, 비타민 복합제 및 식품 첨가제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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