KR20180106795A - 한우 저분자 추출물 또는 한우 유래 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
한우 저분자 추출물 또는 한우 유래 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 분자량이 3 kDa 이하인 한우 저분자 추출물 또는 서열목록 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 분자량이 3 kDa 이하인 한우 저분자 추출물은 우수한 항산화 활성, 대장암 세포주 생존 저해능, 대장암 세포주 내 글루타치온 함량 감소능 및 암세포 증식 관련 유전자 발현 억제능을 발휘하여 우수한 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과를 발휘하며, 서열목록 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수한 한우 저분자 추출물로부터 분리 및 정제한 것으로, 한우 저분자 추출물의 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 발휘하며, 대장암 세포주 생존 억제 효과를 발휘하여, 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 한우 저분자 추출물 또는 한우 유래 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 한우로부터 수득한 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드 또는 이로부터 분리 및 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대장암은 그 발생에 있어 가장 급격하게 증가하고 있는 암종의 하나로 전세계적으로 전체 암 발생의 약 9.4%를 차지하며 남성에서는 4번째, 여성에서는 3번째로 흔한 암으로서, 매해 약 1백만명 정도의 대장암 환자가 발생하며 그 중 50만 명 정도가 대장암으로 사망하는 것으로 알려져있다. 대장암의 발생은 유전적 소인과 식이요인, 흡연이나 음주 또는 신체활동과 같은 생활 방식 그리고 비만과 인슐린 저항성 등의 대사 질환이 관련되어 있다.
정상세포는 외부로부터 여러 가지 자극을 받으며, 이러한 자극들로 인하여 세포 내 활성산소를 발생하게 된다. 생성된 세포 내 활성산소는 세포의 생존, 분화 등을 조절하는 긍정적인 기능을 할 수 있지만 반대로 세포 내의 유전자나 단백질과 반응하여 세포의 변이 즉, 암 발생을 유도하기도 한다. 또한, 활성산소는 여러 유전자 발현 인자들을 증가시켜 염증을 일으키기도 하고 염증은 암을 유도하는데 결정적인 역할을 한다. 특히 만성 장염은 대장암의 큰 위험요소이다.
암환자는 체내 항산화물질이나 관련 유전자가 적은 것으로 알려져 있으며 활성산소의 조절이 잘되지 않아 암세포화 되는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 항산화 활성을 가진 물질들은 암을 억제하고 예방하는데 도움을 줄 수 있다.
대장암은 wnt/β-catenin signaling이 활성화되는 돌연변이에 의해 발생한다고 알려져 있는데, 이때 베타-카테닌(β-catenin)은 주로 단백질가수분해 효소의 파괴와 관계하는 부위에 돌연변이가 일어나면서 결론적으로 베타-카테닌(β-catenin)이 핵 내에 많이 존재하게 되어 대장암을 일으키는 반응을 촉진시키게 된다. 베타-카테닌(β-catenin)의 과발현은 발암과정을 분석할 수 있는 주요지표로 사용되고 있으며, 베타-카테닌(β-catenin)의 발현 억제는 대장암 세포주의 성장 억제 및 암 억제 효과를 분석하는데 주요기전으로 작용할 수 있다. 또 다른 인자로 Bcl2는 세포 사멸을 억제하는 유전자로서 암세포의 증식을 촉진시키는 단백질이다. 따라서 Bcl2의 발현을 억제시키는 것은 대장암의 성장을 억제하는 주요한 기전으로 작용할 수 있다.
한편, 한우는 우리나라 고유의 품종으로 마블링이 우수한 특징을 가지고 있다. 또한 한우육 내 소고기 풍미에 긍정적인 영향을 미치며 혈중 콜레스테롤을 낮춰 주는 올레인산 함량이 높다고 알려져 있다. 또한, 한우육은 인체에 유익한 영향을 미치는 생리활성기능 물질을 다량 함유하고 있는데, 그 중 L-카니틴(L-carnitine)은 지방 산화에 필수적인 물질이며 비만을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 카르노신(carnosine)은 항산화 기능을 가진 펩타이드로 알려져 있다. 이외에 항암효과를 가지고 있다고 알려져 있는 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)와 크레아틴(creatine) 등이 있다.
한편, 한우의 부위 중 특히 우둔 부위는 단백질이 풍부한 부위로 단백질 공급원으로 이용될 수 있으며, 한우 우둔살 단백질을 효소 분해하여 얻은 펩타이드가 혈압저하효과가 있음이 보고되었다. 다만, 아직까지 한우 우둔 저분자 추출물 및 이로부터 분리 및 정제된 펩타이드의 항산화 활성 및 암세포 성장 억제 효능에 대해서는 알려진바 없다.
본 발명은 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 대장암 개선용 식품 조성물 또는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드는, 바람직하게 한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 균질화 및 원심분리하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계 (b); 상기 여과액에 클로로포름을 첨가한 다음 원심분리한 후, 하등액을 수득하는 단계 (c); 및 상기 수득된 하등액을 원심분리하여 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드를 수득하는 단계 (d);로 부터 수득되는 것이 좋다.
한편, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 개선용 식품 조성물 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 대장암 개선용 식품 조성물 또는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는, 바람직하게 한우로부터 수득된 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드로부터 분리 및 정제된 것이다.
본 발명의 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드는 우수한 항산화 활성, 대장암 세포주 생존 저해능, 대장암 세포주 내 글루타치온 함량 감소능 및 암세포 증식 관련 유전자 발현 억제능을 발휘하여 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
또한, 본 발명의 서열목록 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수한 한우 저분자 추출물로부터 분리 및 정제한 것으로, 한우 저분자 추출물의 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 발휘하여 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
도 1은 한우 저분자 추출물의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주 내 글루타치온 함량을 나타낸 그래프이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 4는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 베타-카테닌(β-catenin) 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 5는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 Bcl2 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 6은 HPLC를 이용한 한유 저분자 추출물 유래 펩타이드의 크로마토그램과 해당 분획의 항산화 활성(ORAC) 결과를 나타낸 그래프로, 도 6의 (A)는 한우 저분자 추출물의 HPLC를 이용한 크로마토그램이고, 도 6의 (B)는 한우 저분자 추출물의 분획물(F1 내지 F15)의 ORAC 활성을 측정한 결과이며, 도 6의 (C)는 한우 저분자 추출물의 분획물 중 F2 및 F3의 혼합물을 재분획한 크로마토그램이고, 도 6의 (D)는 재분획된 분획물(FF5-1 내지 FF5-8)의 ORAC 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주 내 글루타치온 함량을 나타낸 그래프이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 4는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 베타-카테닌(β-catenin) 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 5는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 Bcl2 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 6은 HPLC를 이용한 한유 저분자 추출물 유래 펩타이드의 크로마토그램과 해당 분획의 항산화 활성(ORAC) 결과를 나타낸 그래프로, 도 6의 (A)는 한우 저분자 추출물의 HPLC를 이용한 크로마토그램이고, 도 6의 (B)는 한우 저분자 추출물의 분획물(F1 내지 F15)의 ORAC 활성을 측정한 결과이며, 도 6의 (C)는 한우 저분자 추출물의 분획물 중 F2 및 F3의 혼합물을 재분획한 크로마토그램이고, 도 6의 (D)는 재분획된 분획물(FF5-1 내지 FF5-8)의 ORAC 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
현대 의학에서 암을 치료하는 방법은 수술요법, 화학요법, 방사선 요법 등 여러가지가 있는데, 화학요법은 암의 종류나 시기에 관계없이 시행할 수 있지만 치료과정에서 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 손상시켜, 여러 가지 부작용을 초래하는 것이 한계점이었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 항암효과를 발휘하는 천연 유래 식품에 대해 예의 연구한 결과, 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드가 우수한 항산화 활성 및 대장암 개선, 예방 또는 치료효과가 있음을 확인하였다.
상기 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드는, 바람직하게 한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 균질화 및 원심분리하는 단계 (a); 상기 균질화 및 원심분리 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계 (b); 상기 여과액에 클로로포름을 첨가한 다음 원심분리한 후, 하등액을 수득하는 단계 (c); 및 상기 수득된 하등액을 원심분리하여 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드를 수득하는 단계 (d);를 통해 제조될 수 있다.
더욱 바람직하게는 한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 13,000~14,000 rpm으로 균질화 및 1,224 ~ 2,399 xg으로 원심분리하는 단계 (a); 상기 균질화 및 원심분리 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계 (b); 상기 여과액에 클로로포름을 첨가한 다음 1,244 ~ 2,399 xg으로 원심분리하여 지방층을 분리시키고, 지방층이 포함되지 않은 하등액을 수득하는 단계 (c); 및 상기 수득된 하등액을 3 kDa 원심분리형 멤브레인 여과장치를 이용하여 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드를 수득하는 단계 (d);를 통해 제조될 수 있다.
한편, 한우의 우둔은 지방과 단백질로 구성된 부위로 상기와 같이 한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 균질화 및 원심분리하여 한우 추출물을 추출한 다음 여과하여 수득된 여과액에 클로로포름을 첨가하면 지방층이 분리된다. 본 발명에서는 지방층이 제거된 하등액만을 수득한 후, 3 kDa 원심분리형 멤브레인 여과장치를 이용하여 분자량 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물을 수득할 수 있다. 상기 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물은 지방이 제거되고 단백질만 남은 것으로, 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드와 의미가 동일한 것이다. 이에, 하기의 실시예 및 실험예에 기재된 '3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물'은 '3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드'와 동일한 것을 의미한다.
한편, 본 발명은 항산화 활성 및 대장암 개선, 예방 또는 치료효과가 우수한 한우 우둔의 저분자 추출물을 더욱 분획하여 항산화 활성이 가장 우수한 펩타이드를 분리 및 정제하였는데, 분리된 펩타이드의 서열을 분석한 결과 서열번호 1의 아미노산 서열을 가짐을 확인할 수 있었다.
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 대장암 세포주 생존 억제 효과를 나타내어 대장암 개선, 예방 또는 치료 효과를 발휘한다.
본 발명의 한우 유래 펩타이드는 밝혀진 서열을 토대로 대량 생산이 용이하며, 한우라는 동물성 식품으로부터 펩타이드를 추출하였기 때문에 인체 무해하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 대장암 개선용 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDSAND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 페이스트제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때, 1일 0.000001 ㎎/㎏(체중) 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1 : 한우
저분자
추출물 제조]
도축 후 24시간 이내의 1+등급 한우 우둔을 식육포장처리장에서 구입하여 추출물 제조에 이용하였다. 한우 우둔 2 g에 20 ㎖의 증류수를 첨가하여 13,500 rpm에서 30초 동안 균질 후 1,763 xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 여과지(filter paper) No.4를 이용하여 여과한 뒤 여과액을 취하였다. 이후 클로로포름(chloroform) 8 ㎖를 첨가하고 1,340 xg에서 10분 동안 원심분리하여 지방층을 분리한 후 지방 성분인 상등액을 제거하고 하등액을 추출물 제조에 사용하였다. 지방을 제거한 추출물 15 ㎖를 3 kDa 원심분리형 멤브레인 여과 장치에 넣어 3,000 xg에서 40분간 원심분리하여 필터를 통과한 하등액을 회수하였다. 회수된 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물은 동결건조하여 분말의 형태로 이용하였다 (도 1 참고). 도 1은 한우 저분자 추출물의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
[
실험예
1: 한우
저분자
추출물의 항산화 활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물의 항산화 활성을 확인하고자 DPPH 라디칼 소거 활성(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity)과 FRAP 활성(ferric reducing antioxidant power activity)을 측정하였다.
시료로서 3 mg/㎖ 농도의 한우 저분자 추출물을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 100 ㎕와 시료 100 ㎕를 혼합하여 암소에서 30분간 반응시킨 뒤, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 하여 μM TE(trolox equivalent (TE)로 계산하여 나타내었다.
또한, FRAP 활성은 300 mM 아세테이트 버퍼(acetate buffer) (pH 3.6), 40 mM 염화수소(HCl)로 용해시킨 10 mM TPTZ 용액(2,4,6-tripyridyl-S-triazine)과 20 mM 염화제이철(FeCl36H2O)을 각각 10:1:1의 비율로 혼합하여 사용하였다. 시료 25 ㎕와 혼합액 175 ㎕를 넣어 37℃에서 30분간 방치 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 트롤록스(trolox)를 표준물질로 하여 μM TE(trolox equivalent)로 계산하여 나타내었다.
한우 저분자 추출물의 항산화 효과는 하기 표 1과 같았다.
| 구분 | 항산화 활성 (μM TE) |
| DPPH 라디칼 소거능 | 42.25 |
| FRAP 활성 | 19.90 |
측정결과, 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 한우 저분자 추출물은 42.25 μM TE의 DPPH 라디칼 소거 활성과 19.92 μM TE의 FRAP 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과로부터, 한우 저분자 추출물은 항산화 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
[실험예 2: 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116)의 생존율 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물의 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 MTT 방법(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
대장암 세포주(HCT116)를 96 웰 세포 배양 플레이트(well cell culture plate)에 2×104 cells/well의 농도로 배양한 후 한우 저분자 추출물을 0.1~5 mg/㎖ 농도로 48시간 동안 처리 후 PBS로 세척한 다음 MTT(5 mg/㎖) 용액을 세포에 2시간 동안 처리하여 염색시켰다. 염색된 세포에 DMSO를 넣어 세포를 녹여낸 후 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이후 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 산출하였다.
실험결과, 한우 저분자 추출물을 2.5 mg/㎖로 대장암 세포주에 처리했을 때 생존율이 82.2%로 감소하였으며, 가장 저농도인 0.1 mg/㎖로 처리하였을 때도 79.5%로 생존율이 감소함을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
상기와 같은 결과로부터, 한우 저분자 추출물의 대장암 세포주의 생존 억제 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 3: 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 글루타치온 함량 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물의 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 세포 내 항산화 물질인 글루타치온의 함량을 측정하였다.
한우 저분자 추출물을 처리한 세포에 RIPA 용액을 이용하여 전체 단백질을 분리 후 BCA 정량법을 통해 단백질 정량을 하였다. 그 후, 96 웰 플레이트(well plate)에 표준물질과 샘플(한우 저분자 추출물 0.25, 2.5 mg/㎖)을 각각 20 ㎕씩 넣고 1:1 비율의 'DTNB+Glutathione reductase solution'을 120 ㎕씩 넣어주어 30초 동안 반응시켰다. 그 후, β-NADPH를 60 ㎕씩 넣어주어 반응시켰다. 그 후, 분광광도계를 이용해 450 nm의 흡광도를 측정하였고, 표준물질(글루타치온)을 이용하여 표준곡선을 그린 후 결과값을 산출하였다.
실험결과, 대장암 세포주에 처리되는 한우 저분자 추출물의 농도가 증가할수록 세포 내 글루타치온 함량이 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주 내 글루타치온 함량을 나타낸 그래프이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
상기와 같은 결과로부터, 한우 저분자 추출물은 글루타치온 함량 저하능을 발휘하고, 이를 통해 세포 내 산화적 스트레스가 증가하며, 결과적으로 대장암 세포주 성장 억제 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[
실험예
4: 한우
저분자
추출물 처리에 따른 대장암 세포주(
HCT116
) 내 베타-
카테닌
(β-
catenin
) 단백질 발현 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 한우 저분자 펩타이드의 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 대장암 세포주에서 과발현되는 베타-카테닌(β-catenin)의 세포 내 발현양을 측정하였다.
대장암 세포주(HCT116)에 3 ㎖ 차가운 PBS를 넣어준 후 스크래퍼를 이용하여 붙어있는 세포주를 긁어내고 원심분리한 후, 침전물에 500 ㎕ 1×하이포토틱 버퍼(Hypotonic buffer)를 넣고 15분 후 25 ㎕의 계면활성제를 넣어 세포질만을 용해시켰다. 6,260 xg에서 30초간 원심분리한 후 침전물에 50 ㎕의 용균액(complete lysis) (10 mM DTT + Lysis buffer + Protease inhibitor cocktail)를 첨가하여 30분 동안 진탕한 후, 6,260 xg에서 10분간 원심분리하여 분리된 핵을 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하였다.
웨스턴 블랏(Western blot) 분석은 분리한 핵에 RIPA 용액을 넣어 전체 단백질을 용해시켜 이용하였다. BCA 정량법을 통해 단백질 정량 후, 샘플은 전기영동을 하여 단백질을 크기별로 분리하였고, 전기영동 젤을 나이트로셀룰로스 막에 이동시켰다. 이후 베타-카테닌(β-catenin)과 특이적인 일차항체(primary antibody)와 이차항체(secondary antibody)를 반응시켜 발현되는 단백질을 검출하였다.
실험결과, 한우 저분자 추출물을 1.25, 2.5 mg/㎖ 농도로 대장암 세포주에 처지 하였을 때 베타-카테닌(β-catenin)의 발현량이 감소하여 대장암 세포주의 베타-카테닌(β-catenin) 과발현을 억제함을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 베타-카네틴(β-catenin) 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
상기와 같은 결과로부터, 한우 저분자 추출물의 베타-카테닌(β-catenin)의 발현량 저하를 통해 대장암 세포주 성장 억제 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[
실험예
5: 한우
저분자
추출물 처리에 따른 대장암 세포주(
HCT116
) 내 세포사멸 관련
Bcl2
단백질 발현 분석]
본 실험예에서는 한우 저분자 추출물의 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 세포사멸을 억제하는 Bcl2 단백질의 세포 내 발현량을 측정하였다.
대장암 세포주(HCT116)에 3 ㎖ 차가운 PBS를 넣어준 후 스크래퍼를 이용하여 붙어있는 세포주를 긁어내고 원심분리한 후 침전물에 500 ㎕ 1X 하이포토닉 버퍼(Hypotonic buffer)를 넣고 15분 후 25 ㎕의 계면활성제를 넣어 세포질만을 용해시켰다. 그 후, 6,260 xg에서 30초간 원심분리한 후 침전물에 50 ㎕의 용균액(complete lysis) (10 mM DTT + Lysis buffer + Protease inhibitor cocktail)을 첨가하여 30분 동안 진탕한 후, 6,260 xg에서 10분간 원심분리하여 분리된 핵을 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하였다.
웨스턴 블랏(Western blot) 분석은 분리한 핵에 RIPA 용액을 넣어 전체 단백질을 용해시켜 이용하였다. BCA 정량법을 통해 단백질 정량 후, 샘플은 전기영동을 하여 단백질을 크기별로 분리하였고, 전기영동 젤을 나이트로셀룰로스 막에 이동시켰다. 이후 Bcl2와 특이적인 일차항체(primary antibody)와 이차항체 (secondary antibody)를 반응시켜 발현되는 단백질을 검출하였다.
실험결과, 한우 저분자 추출물을 2.5 mg/㎖ 농도로 대장암 세포주에 처리한 경우 세포의 사멸을 억제하는 Bcl2의 발현량이 감소함을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5는 한우 저분자 추출물 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116) 내 Bcl2 단백질 발현량을 나타낸 도이다. 'CTL'은 한우 저분자 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
[실험예 6: 한우 저분자 추출물로부터 항산화성 펩타이드의 분리]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물로부터 항산화성 펩타이드를 분리한 후 동결 건조하여 분말상태로 만들었다 (도 1 참조).
상기 실시예 1에서 제조한 3 kDa 이하의 한우 저분자 추출물을 50 mg/㎖로 녹인 후 RP-HPLC을 이용하여 정제하였다. RP-HPLC는 'Zorbax Eclipse XDB-C18 (250mm, 5.0 ㎛)' 컬럼을 사용하였으며, 유속은 1.0 ㎖/min로 40분 동안 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유한 아세토니트릴을 선형구배(0~40%) 방법으로 진행하였다.
분리된 각각의 분획의 항산화 활성은 ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) 활성 측정을 통해 확인하였다.
ORAC 활성은 블랙 96 웰 플레이트(black 96 well plate)에 25 ㎕ 표준시약(trolox) 또는 시료를 넣고, 150 ㎕ 플루오레세인(fluorescein) (80 nM)을 넣어 혼합한 뒤 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 15분 동안 방치하였다. 이후 25 ㎕ AAPH (150 mM)을 넣고 혼합한 뒤 형광분광광도계를 사용하여 37℃에서 485~520 nm 파장으로 60분 동안 1분 간격으로 형광도의 감소율을 측정하였다. 표준시약(trolox)과 시료의 AUC(area under the curve)를 측정하였으며, 표준시약 농도와 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 μM trolox equivalent으로 나타난 뒤 전체 활성 대비 비율로 나타내었다.
실험결과, 2분 간격으로 15개의 분획물을 획득하였으며 (도 6의 (A)), F2와 F3 분획에서 각각 30.76과 33.73%의 항산화 활성(ORAC)을 확인할 수 있었다 (도 6의 (B)).
또한, 정제된 분획 획득을 위해 항산화 활성이 높았던 F2과 F3을 혼합한 후 동일한 방법으로 0.2분 간격으로 재분획한 결과, 8개의 분획물을 획득하였으며 (도 6의 (C), FF5-7 분획에서 28.05%의 가장 높은 항산화 활성(ORAC)을 확인할 수 있었다 (도 6의 (D)). 도 6은 HPLC를 이용한 항산화성 펩타이드의 크로마토그램과 해당 분획의 항산화 활성(ORAC) 결과를 나타낸 그래프로, 도 6의 (A)는 한우 유래 저분자 추출물의 HPLC를 이용한 크로마토그램이고, 도 6의 (B)는 한우 유래 저분자 추출물의 분획물(F1 내지 F15)의 ORAC 활성을 측정한 결과이며, 도 6의 (C)는 한우 유래 저분자 추출물의 분획물 중 F2 및 F3의 혼합물을 재분획한 크로마토그램이고, 도 6의 (D)는 재분획된 분획물(FF5-1 내지 FF5-8)의 ORAC 활성을 측정한 결과이다.
또한, 한우 저분자 추출물로부터 분리한 펩타이드 중 가장 높은 항산화 활성을 보인 FF5-7분획에 대해 아미노산 서열 분석을 수행한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열(Cys Cys Cys Cys Ser Val Gln Lys)을 갖는 것으로 확인되었고, 분자량이 888.3 Da으로 확인되었다.
[실험예 7: 한우 유래 펩타이드 처리에 따른 대장암 세포주(HCT116)의 생존율 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 6에서 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 MTT 방법(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
대장암 세포주(HCT116)를 96 well cell culture plate에 2×104 cells/well의 농도로 배양한 후 한우 유래 펩타이드(서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드)를 50~500 ㎍/㎖ 농도로 24시간 동안 처리 후 PBS로 세척한 다음 MTT(5 mg/㎖)용액을 세포에 2시간 동안 처리하여 염색시켰다. 염색된 세포에 DMSO를 넣어 세포를 녹여낸 후 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이 후 상기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 산출하였다.
실험결과, 한우 유래 펩타이드를 500 ㎍/㎖로 대장암 세포주에 처리했을 때 생존율이 75.95%로 감소하였으며, 대장암 세포주를 약 24% 억제하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 7). 도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 한우 유래 펩타이드 처리에 따른 대장암 세포주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 대장암 세포주의 생존 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation
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colorectal cancer of the low molecular weight extract and peptide
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<151> 2017-03-17
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Bostaurus L
<400> 1
Cys Cys Cys Cys Ser Val Gln Lys
1 5
Claims (8)
- 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드는,
한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 균질화 및 원심분리하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계 (b);
상기 여과액에 클로로포름을 첨가한 다음 원심분리한 후, 하등액을 수득하는 단계 (c); 및
상기 수득된 하등액을 원심분리하여 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드를 수득하는 단계 (d);로 부터 수득되는 것을 특징으로 하는 대장암 개선용 식품 조성물.
- 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 한우로부터 수득한 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드는,
한우 우둔에 증류수를 첨가한 후, 균질화 및 원심분리하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계 (b);
상기 여과액에 클로로포름을 첨가한 다음 원심분리한 후, 하등액을 수득하는 단계 (c); 및
상기 수득된 하등액을 원심분리하여 분자량 3 kDa 이하의 저분자 폴리펩타이드를 수득하는 단계 (d);로 부터 수득되는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 개선용 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는,
한우로부터 수득된 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드로부터 분리 및 정제된 것임을 특징으로 하는 대장암 개선용 식품 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는,
한우로부터 수득된 분자량이 3 kDa 이하인 저분자 폴리펩타이드로부터 분리 및 정제된 것임을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116425830A (zh) * | 2023-05-08 | 2023-07-14 | 浙江大学 | 一种具有抗癌活性的小分子肽及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100059866A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-06-04 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | Ｂ－타입 나트륨이뇨 펩티드 및 인간 성장 호르몬 １－４３의 치료적 용도 |
-
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- 2017-07-12 KR KR1020170088386A patent/KR101944083B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20100059866A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-06-04 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | Ｂ－타입 나트륨이뇨 펩티드 및 인간 성장 호르몬 １－４３의 치료적 용도 |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 대한민국 등록특허 제10-1709032호 (등록일자: 2017.02.13)에는 Cys Lys Lys Leu Leu Trp Leu Cys Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly의 아미노산 서열로 이루어진 CysA5W 펩타이드를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 내용이 기재되어 있다. |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116425830A (zh) * | 2023-05-08 | 2023-07-14 | 浙江大学 | 一种具有抗癌活性的小分子肽及其应用 |
| CN116425830B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-03-26 | 浙江大学 | 一种具有抗癌活性的小分子肽及其应用 |
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| KR101944083B1 (ko) | 2019-01-30 |
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