KR20180103955A - 종양-침윤 t 세포의 모집단의 생성 방법 - Google Patents

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KR20180103955A
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Abstract

본 발명은 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법으로서, 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체를 대상체에 투여하고 그 다음 상기 대상체 내에서 종양으로부터 세포 샘플을 수집하고 거기로부터 T 세포를 분리시키는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 본 발명은 종양-침윤 T 세포의 모집단 생성 방법으로서, 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 처리된 대상체로부터 취득된 세포 종양 샘플로부터 T 세포를 분리시키고 상기 T 세포를 선택적으로 배양시키는 것을 포함하는, 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립, 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소에서 사용을 위하여 상기 기재된 종양-침윤 T 세포를 제공한다.

Description

종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법
본 발명은 암 요법 및 관련된 조사의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 과학적, 진단적 또는 치료적 관련성의 T 세포 모집단의 생성 방법을 제공한다.
인간 및 동물 모집단에서 암의 유병률 및 사망률에서 그것의 역할은 종양 및 종양 세포와 싸우기 위한 신규한 요법이 계속해서 필요하다는 것을 의미한다. 종양의 제거, 그것의 크기에서 감소, 그것의 지지 맥관구조의 파괴, 또는 혈액 또는 림프계에서 순환하는 암 세포의 수 감소는 다양한 방식으로; 예를 들면 통증 또는 불편의 감소, 전이 예방, 외과적 개입 촉진 또는 생명 연장에 의해 유익할 수 있다.
종양 또는 종양으로부터 전이하는 세포와 싸우도록 설계되는 암 요법은 전형적으로 세포독성 활성에 의존한다. 그 활성은 활성제가 자체 갖는 세포독성 효과일 수 있거나 활성제에 의해 간접적으로 이용된 효과, 예를 들면 종양에 대한 숙주 면역 반응의 상향조절일 수 있다. 더 큰 또는 더 작은 정도로 이들 요법은 정상 건강한, 또는 적어도 비-암성, 세포 및 조직보다 상기 표적 (종양 또는 종양 세포)에 선택적이다. 저조하게 선택적인 그들 요법은 활성제가 그것의 치료 효과를 발휘하기 위해 의존하는 세포독성 활성에 정상 세포가 노출됨에 따라 심각한 부작용과 관련된다.
암의 특징인 유전적 및 후성적 변이는 면역계가 종양 세포와 그들의 건강한 등가물 사이 분화하기 위해 사용 및 인식할 수 있는 항원을 초래한다. 원칙적으로, 이것은 면역계가 종양 제어에서 강력한 무기가 될 수 있다는 것을 의미한다. 하지만, 현실은 면역계가 일반적으로 종양 세포에 강한 반응을 제공하지 못한다는 것이다. 암에 대한 싸움에서 면역계를 조종하고 따라서 활용하는 것이 대단한 치료적 관심이다 (Mellman 등 Nature 2011, vol. 480, 480-489).
다양한 시도가 종양과 싸우기 위해 면역계를 돕도록 실시되어 왔다. 하나의 초기 접근법은, 예를 들면 종양에 또한 관련될 일반적인 면역 반응을 유도하기 위해 (살아있는 또는 죽은) 박테리아의 투여를 통해, 면역계의 일반적인 자극을 포함하였다. 이것은 또한 소위 비특이적 면역력이다.
종양-특이적 항원을 구체적으로 인식하기 위해 면역계를 돕는 것을 목표로 하였던 최근 접근법은, 대상체에 전형적으로 아쥬반트 (면역 반응을 야기 또는 향상시키기 위해 공지되는 서브스턴스)와 조합된, 종양-특이적 항원의 투여를 포함한다. 종종 모든 종양-특이적 항원이 확인되지 않았고, 예를 들면 유방 암에서 공지된 항원은 총 종양의 20-30%에서 발견된다. 종양-특이적 백신, 암 백신의 용도는 지금까지 제한된 성공으로 충족시켜 왔다.
종양의 대안적 치료 방법 및 2차 종양의 성장 또는 형성의 대안적 억제 방법에 대한 요구가 남아 있다.
종양 관련된 항원 (TAAs)에 대한 강력한 면역 반응의 부족이 인자의 조합때문인 것이 인식된다. T 세포는, T 세포 수용체 (TCR)에 의한 항원 인식을 통해 매개되는, 면역 반응에서 핵심 역할을 하고, 이들은 면역 체크포인트로서 공지된 공통자극과 억제성 신호 사이 밸런스를 조정한다 (Pardoll, Nature 2012, vol. 12, 252-264). 억제성 신호는 자기-내성의 유지에 그리고 면역계가 병원성 감염에 반응하는 경우 손상으로부터 조직을 보호하기 위해 중요한 면역계를 억제시킨다. 하지만, 면역 억제는 종양의 발생에 대해 바디에 의해 달리 도움이 되는 반응이 될 수 있는 것을 감소시킨다. 사이토카인, 다른 자극 분자 예컨대 CpG (자극 수지상 세포), Toll-유사 수용체 리간드 및 다른 분자 아쥬반트는 면역 반응을 향상시킨다. T 세포를 포함하는 공통자극 상호작용은 직접적으로 OX40, CD28, CD27 및 CD137을 포함하는 수용체에 작용적 항체를 이용하여 향상될 수 있다. 이들은 모두 암 면역요법에 대한 "푸시"형 접근법이다.
상보적 '풀' 요법은 억제성 세포 또는 분자를 차단 또는 고갈시킬 수 있고 면역 체크포인트로서 공지되는 것에 대해 길항적 항체의 용도를 포함할 수 있다. 면역 체크포인트는 CTLA-4 및 PD-1을 포함하고 이들에 대한 항체는 당해 기술에 공지되어 있고; 이필리무맙은 전이성 흑색종의 치료에 대하여 허가된 제1 FDA-승인된 항-면역 체크포인트 항체이었고 이것은 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4)를 차단시킨다 (Naidoo 등 British Journal of Cancer (2014) 111, 2214-2219). 하위-세포독성 용량에서 면역 억제를 감소시킬 수 있는 고전적 화학치료제로 고려될 다른 제제가 있고, 이들은 사이클로포스파마이드 및 독소루비신을 포함한다.
T 세포는 암에 대한 면역 반응에 중심이고 암의 치료 및 이해에서 종양 침윤 림프구 (TILs) 사용의 분야에서 관심이 있다. 그들의 T 세포 수용체 (TCRs)를 통해, T 세포는 종양 내에서 특이적 항원에 반응성이다. 종양 세포는 유전적 돌연변이를 운반하고, 이들의 다수는 직접적으로 또는 간접적으로 악성종양에 기여한다. 발현된 서열에서 돌연변이는 신생항원, 면역계에 공지되지 않고 따라서 면역 반응을 유도할 수 있고 외래로서 인식되는 항원을 전형적으로 초래할 것이다.
신생항원 및 그들의 책임있는 돌연변이는 종양 유형 사이 그리고 동일한 종양을 가진 환자 사이 다양하고; 어느 정도의 유전적 돌연변이는 돌연변이 하중으로서 지칭된다. 다수의 돌연변이를 가진 종양은 더욱 면역원성인 것으로 기대되고 면역원성으로 "뜨거운"으로 고려될 수 있다. 작은 돌연변이 하중을 가진 종양은 전형적으로 덜한 면역원성 및 따라서 "차가운" 것이다. 면역계가 그것의 신생항원에 접근할 수 없다면 종양은 또한 "차가운"처럼 보일 수 있다. TILs의 치료 잠재성에서 관심이 있는 것처럼, 그렇게 암 면역요법에서 신생항원 이해 및 이용에 관심이 있다 (Schumacher and Schreiber, Science 2015, vol 348, issue 6230, pp 69-74).
따라서, 특정한 신생항원에 특이적인 많은 TILs로, 종양에서 접근가능한 신생항원과 TIL 모집단 사이 관계가 있다. 이것은 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법의 몇 개의 수단을 개시하고, 여기에서 종양 샘플은 취득되고 거기로부터 단리된 T 세포 및 그 다음 TILs의 이러한 레퍼토리 내에서 클론은 시험관내 배양되고 그 다음 천연 면역 반응을 부스팅하기 위해 바디로 돌아간다. TILs의 수집에 의존하는, 그와 같은 기술은 Immunological Reviews 2014, Vol 257:77-82에서 Linnemann 등에 의해 기재된다.
본 발명자들은, 세포 막의 방해 및 삼투화를 통해 종양 세포를 용해시킨다고 공지된, 일부 펩타이드가 소기관 예컨대 미토콘드리아 및 리소좀 공격에서 또한 고도로 효과적이고 이의 용해를 야기할 수 있다는 것을 확립시켰다. 세포 막 완전성의 손실이 저용량의 투여에서 결국 동등하게 보이더라도, 이것은 세포 막의 직접적인 용해를 야기시키지 않는 저 농도에서 달성될 수 있다. 더 높은 용량에서, 이들 분자는 세포 막 및 그 다음 소기관의 막의 용해를 야기시킬 수 있다. 이것이 TAAs의 더욱 완전한 레퍼토리의 방출을 초래한다고 믿어진다.
소기관 막의 이러한 파괴는 또한 강력한 면역자극성 기능을 갖는 거기로부터 제제의 방출을 초래하고, 그와 같은 제제는 일반적으로 DAMPs (손상-관련된 분자성 패턴 분자)로서 공지되고 ATP, 사이토크롬 C, 미토콘드리아 CpG DNA 서열, 미토콘드리아 포르밀 펩타이드, (리소좀으로부터) 카텝신 및 (핵으로부터) HMGB1을 포함한다. 이러한 효과는, 신생항원을 포함하는, TAAs에 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, DAMPs는 항원 제시 세포의 활성화, 동원 및 후속적인 성숙에서 핵심 역할을 한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 항원 제시 세포의 성숙 및 림프절에 그와 같은 세포의 이동은 T 세포에 종양 항원의 제시를 위하여 전제조건이다.
본 발명자들은 막활성화 용해 화합물로 처리된 종양으로부터 단리될 수 있는 TIL 모집단의 분석이 종양 내에서 유용한 신생항원을 확인할 수 있다는 것을 이제 상정한다. 따라서 막 활성화 용해 화합물로 처리된 종양으로부터 단리된 TIL 모집단은 놀랍게도 미처리된 종양으로부터 수득된 TIL 모집단보다 훨씬 더 유용하다. 이러한 제안된 유용성은, 특히, 막 활성화 용해 화합물로 처리된 종양으로부터 수득된 TIL 모집단이 미처리된 종양으로부터 TIL 모집단에 비교된 경우 증가된 클론형성능을 갖는다는, 본 명세서에서 실시예에서 기재된, 관찰에 기반된다. 클론형성능은 상이한 클로노타입을 거쳐 T 세포의 상대 존재비가 고르게 분포되지 않은, 즉 특정 클로노타입이 총 TIL 모집단을 지배하는 경우 높다. TIL 모집단에서 양호하게 표시되는 클로노타입이 종양 세포의 종양 치료 및 용해의 결과로서 더욱 쉽게 이용가능해진 신생항원에 반응성일 수 있다는 것이 믿어진다 (이와 관련하여 참조 도 1). 그와 같은 클로노타입은, 예를 들어, 백신접종 요법에서 또는 신생항원 라이브러리의 생성에서 사용될 수 있는 신생항원의 확인을 위하여 또는 자가조직 T 세포 요법에서 사용될 수 있다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법을 제공하고, 상기 방법은 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체를 대상체에 투여하고 그 다음 상기 대상체 내에서 종양으로부터 세포 샘플을 수집하고 거기로부터 T 세포를 분리시키는 것을 포함한다.
T 세포의 또는 개별 클로노타입의 분리가 다른 세포 유형 또는 세포 잔해로부터 단리 또는 부분적인 단리를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 수득한 모집단은 세포 유형에 관하여 80, 90, 95, 98 또는 99% 순수할 수 있다.
추가 측면에서 본 발명은 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법을 제공하고, 상기 방법은 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 처리된 대상체로부터 취득된 세포 종양 샘플로부터 T 세포의 분리 및 선택적으로 상기 T 세포의 배양을 포함한다.
수집된 T 세포 모집단은 전형적으로 복수의 T 세포 클로노타입을 포함한다. 선택적으로 수득한 T 세포 모집단은 그 다음 모집단을 유지 또는 팽창시키기 위해 배양된다. 선택적으로 T 세포 모집단은 특정 클로노타입에 대하여 풍부할 수 있고/있거나 1 이상 클로노타입, 예를 들면 1-10, 1-5 또는 1, 2 또는 3 클로노타입 / 하위-모집단을 포함하는 하위-모집단 속으로 별개의 클로노타입에 분획화될 수 있다.
세포 종양 샘플은 고체 종양 병변의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 전형적으로 종양 세포 뿐만 아니라 TILs를 포함할 것이고, 이들 중 일부는 T 세포일 것이다. 종양 샘플로부터 T 세포의 수확 방법, 즉 그와 같은 샘플로부터 T 세포의 분리 방법은 당해 기술에 공지되어 있다.
T 세포의 생성된 모집단은, 예를 들어 클론형성능을 평가하기 위해, 본 실시예에서 기재된 바와 같이, 분석될 수 있다. T 세포는 그들의 T 세포 수용체 (TCRs)의 특성, 예를 들면 결합 친화도 또는 서열을 조사하기 위해 분석될 수 있다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, T 세포 모집단 내에서 클로노타입의 일부가 종양 신생항원에 반응성 (특이적)일 것, 구체적으로 가장 고도로 표시되는 클론의 일부가 종양 신생항원에 반응성일 것이 믿어진다. 따라서 본 발명의 방법은 그들의 상응하는 종양 신생항원을 확인하기 위해 생성된 T 세포 분석의 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 상기 논의된 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법은 생체외 T 세포 팽창의 추가 단계를 포함한다. 이러한 팽창은 당해 분야에서 공지된 표준 세포 배양 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 수득된 단리된 T 세포를 제공한다.
상기 정의된 방법으로부터 생성되는 종양-침윤 T 세포는 종양을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 입양 세포 이식 요법 전략의 일부로서 치료적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상체에 생성된 및 선택적으로 팽창된 T 세포 투여의 추가 단계를 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립, 확산 또는 전이의 예방 또는 감소에서 사용을 위하여 상기 정의된 T 세포의 모집단을 제공한다.
따라서, 예를 들어, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립, 확산 또는 전이의 예방 또는 감소에서 상기 정의된 생체외 방법으로부터 생성된 팽창된 T 세포의 모집단을 제공한다.
그와 같은 전략은, Schumacher & Schreiber, Science 2015, 348: 69-74에서 기재된 바와 같이, 당해 분야에서 공지된다. 작은 선택의 클로노타입, 예를 들면 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10 또는 1 내지 5 클로노타입은 바람직하게는 투여된다.
대안적으로 보면, 본 발명은 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소 방법을 제공하고, 상기 방법은 필요로 하는 대상체에 상기 정의된 방법으로부터 생성된 T 세포의 치료적 유효량 투여를 포함한다.
대안적으로 보면, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소를 위하여 약제의 제조에서 상기 정의된 방법으로부터 생성된 T 세포의 용도를 제공한다.
처리된 대상체는 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 투여되는 대상체와 상이할 수 있지만, 바람직하게는 대상체는 동일하다. 그와 같은 전략은 종양의 표면에 존재한 항원 또는 신생항원에 대해 대상체의 면역계의 감수성을 증가시킬 것이고 따라서 면역계가 종양 조직을 청소하는 가능성을 증가시킬 것이다. 이러한 전략은 또한 발생할 수 있는 후속적인 전이에 대해 면역계의 감수성을 증가시킬 것이다.
T 세포는 또한 T 세포에 결합하는 종양-특이적 항원 또는 신생항원을 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 종양-특이적 항원 또는 신생항원의 확인의 추가 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 T 세포가 생체외 팽창된 후 수행될 수 있거나, 대안적으로 이러한 방법은 생체내 생성되는 T 세포상에 직접적으로 수행될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 T 세포에 결합할 수 있는 종양-특이적 항원 또는 신생항원 확인에서 상기 정의된 방법으로부터 생성된 T 세포의 용도를 제공한다. 그와 같은 신생항원의 확인 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 Linnemann C 등, Immunol. Rev. 2014, 257: 72-82에서 기재된다. 간단히, 신생항원은 돌연변이를 결정하기 위해 건강한 환자 엑솜과 암 엑솜의 비교, 그 다음 암 엑솜에서 존재한 돌연변이에 기반된 돌연변이된 펩타이드의 합성, 그 다음 생성된 T 세포에 대한 돌연변이된 펩타이드의 스크리닝을 통해 확인될 수 있다. 대안적으로, 항원 또는 신생항원은 T 세포 수용체에 결합할 것 같은 펩타이드 모티프를 확인하기 위해 T 세포 모집단의 수용체의 서열분석을 통해 확인될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 풍부한 (예를 들면 최상부 10, 20 또는 30) 클로노타입의 TCR 서열분석을 포함하는 방법은 본 발명의 바람직한 추가 측면이다.
추가 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 수득된 항원 또는 신생항원을 제공한다.
바람직하게는, 종양-특이적 항원 또는 신생항원의 확인 방법은 확인된 항원 또는 신생항원의 합성 및 선택적으로 필요한 대상체에 항원 또는 신생항원의 투여, 이로써 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소의 추가 단계를 포함할 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명은 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소에서 사용을 위하여 상기 정의된 방법을 이용하여 확인된 항원 또는 신생항원을 제공한다. 항원 또는 신생항원의 투여는 종양의 표면에 존재한 동일한 항원 또는 신생항원에 대해 대상체의 면역계를 재차 준비시킬 것이고 따라서 면역계가 종양 조직을 청소하는 가능성을 증가시킬 것이다. 이러한 전략은 또한 발생할 수 있는 후속적인 전이에 대해 면역계의 감수성을 증가시킬 것이다.
항원 또는 신생항원은 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 투여되는 대상체, 뿐만 아니라 종양을 앓고 있는 다른 대상체에 투여될 수 있다. 하지만, 많은 항원 및 신생항원은 환자간 종양 불균질성으로 인해 개별 환자에 특이적이고, 매우 바람직하게는 항원 또는 신생항원은 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 초기에 투여되는 대상체에 투여된다.
확인된 항원 또는 신생항원은, 특정한 종양에 특이적인 면역 반응을 자극시키는, 백신으로서 작용할 것이다. 따라서, 항원 또는 신생항원은 이들을 더욱 면역원성으로 만들기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 신생항원은 항원 또는 신생항원의 면역원성을 증가시키기 위해 주요 조직적합성 복합 단백질에 결합될 수 있다. 또한, 항원 또는 신생항원, 또는 상기 논의된 팽창된 T 세포는 면역원성을 재차 증가시키는 백신 아쥬반트로 투여될 수 있다.
대안적으로 보면, 본 발명은 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 정의된 방법을 이용하여 확인된 항원 또는 신생항원의 치료적 유효량의 투여를 포함한다.
대안적으로 보면, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 치료 또는 종양의 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소용 약제의 제조에서 상기 정의된 방법을 이용하여 확인된 항원 또는 신생항원의 용도를 제공한다.
상기 치료 방법은 바람직하게는 체크포인트 억제제와 공-투여를 포함한다.
상기 방법은 개체에 또는 특정한 종양 유형에 특이적인 신생항원 또는 T 세포 클론 (클로노타입)의 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 T 세포 모집단의 생성을 포함하고 상기 T 세포 모집단으로부터 하나 이상의 T 세포 클로노타입의 확인 및/또는 단리를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 방법은 상기 T 세포 모집단으로부터 복수의 T 세포 클로노타입의 확인 및/또는 단리를 포함한다.
본 명세서에서 정의된 막 활성 분자에 의해 나타난 특성의 특유의 조합은 특히 유용한 T 세포 모집단을 초래한다. 분자는 바람직하게는 세포내 막의 완전성의 손실을 야기시킬 수 있고, 예를 들면 미토콘드리아 또는 리소좀 막 또는 핵 막, 미토콘드리아 및 리소좀 막이 바람직하다. 완전성의 이러한 손실은 소기관의 함량의 적어도 일부의 방출을 야기하는데 충분하고 막의 붕해를 포함할 수 있다. 이 공정에서 항원은 그들 항원에 결합할 수 있는 특이적 T 세포의 성숙을 유발시키는 수지상 세포에 의한 인식에 이용가능해진다. 이것은 이들 신규한 항원에 대하여 특이적인 T 세포에 의한 종양의 증가된 침윤을 초래한다. 신생항원에 T 세포 반응은 강하고 침윤 T 세포가 종양 내에서 신생항원을 인식할 수 있는 클로노타입의 큰 분율을 포함한다는 것을 의미한다. 이전에 단지 약하게 면역원성이었던 종양에 대하여, 세포 및, 특히, 세포내 막의 이러한 파괴는 넓은 범위의 TAAs, 특히 이전에 '숨겨진' 종양 신생항원의 방출을 초래한다. 차례로 이것은 더 큰 T 세포 반응을 초래한다.
세포내 막의 완전성의 손실에 대하여 시험, 예를 들면 사이토크롬 c의 방출용 시험 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 적합한 방법은 실시예에서 기재된다. 세포 용해 시험 방법은 당해 분야에서 또한 공지되고, 투과 전자 현미경검사의 사용을 포함하여, 실시예에서 기재된다.
이러한 예외적으로 넓은 범위의 방출된 및 인식가능한 TAAs는 본질적으로 종양을 훨씬 더 면역원성으로 만들고 따라서 그 다음 바디에서 존재한 초기에 처리된 및 다른 종양의 퇴행에 기여할 수 있는 면역계에 의해 검출가능하게 만든다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 종양의 치료에서 사용을 위하여 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생체내 생성에서 사용하는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체를 제공한다. 아미노산, 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 종양을 가진 대상체에 투여되고, 바람직하게는 투여는 종양내이다. 생성된 T 세포의 모집단은 바람직하게는 대상체의 면역계에 의해 (치료적으로 관련된 정도로) 이전에 인식되지 않은 항원에 클로노타입을 포함한다.
종양 세포 용해후 생성된 TIL 모집단은 더욱 면역원성으로 만들기 위해 변형될 수 있다, 즉 종양-특이적 항원 검출시 적응성 면역 반응을 더욱 활성화시킬 것 같다. TIL 모집단의 변형 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 연구는 T-세포 특이성을 변경시킬 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)의 유전자적으로 변형에 수행되고 있다. 이것은 관심 종양 항원에 특이적인 TCR α 및 β 사슬 확인, 형질도입 벡터에 상응하는 핵산 서열의 단리 및 클로닝 그리고 T 세포의 형질도입을 통해 수행된다. 이러한 기술은 TCR과 항원 사이 상호작용 (결합능)을 더욱 개선하기 위해 α 및 β 사슬의 시험관내 변형을 허용한다.
대안적 전략은 키메라성 항원 수용체 (CAR) T 세포를 형성하는 것이다. 이들 CAR T 세포는 T-세포 활성화 기능과 항체-유사 인식 모두를 조합시킨다. CARs는, 전형적으로 단클론성 항체로부터 유래된, 항원-결합 도메인, T 세포에 CAR을 고정시키는 막관통 도메인 및 종양 항원이 CAR에 결합되어 있다면 지속, 이동조절 및 효과기 기능을 유도하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인으로 구성된다. 세포내 신호전달 도메인은 T 세포의 오래 지속되는 활성화로 이어진다. 상기 기재된 TIL 모집단의 면역원성 개선의 개념은, Sharpe & Mount in Dis. Model Mech. 2015, 8: 337-50에서 검토된 바와 같이, 당해 기술에 공지되어 있다.
막-활성 용해 화합물로 치료는 종양 내에서 유용한 신생항원을 확인하는 TILs로 이어질 수 있고; 이들 TILs가 유용한 TCRs 및 CARs의 개발을 도울 수 있다는 것이 또한 인식된다. 특히, 예를 들어 x-선 결정학을 이용하여, TILs의 수득한 TCR의 분석은 항원-결합 영역의 구조를 결정하기 위해 수행될 수 있고, 이러한 구조적 분석은 그 다음 항원 결합시 모방, 또는 심지어 개선하는 신규한 TCRs 및 CARs를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 신규한 TCRs 및 CARs는 신생항원의 구조 분석을 통해 개발될 수 있다. 이들 TCRs 및 CARs는 상기 논의된 바와 같이 면역 세포 활성화를 개선하기 위해 변형될 수 있다. 이들 신규한 TCRs 및 CARs는 그 다음 세포가 세포 막에서 이들을 발현시키도록 (종양-특이적일 수 있거나 아닐 수 있는) T 세포에 유전자적으로 도입될 수 있다. 이들 신규한 TCRs 및 CARs는 또한 자연 살해 (NK) 세포에 유전자적으로 도입될 수 있다. 이들 T 세포는 유용한 신생항원을 확인하는데 사용된 TILs와 동일할 수 있다.
이들 유전자적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 그 다음 종양을 치료하기 위해 환자에 투여될 수 있다. 유전자적으로 도입된 TCRs 또는 CARs는 치료를 위하여 유전자적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포로 투여되는 동일한 환자로부터 유래되고 있을 수 있거나, 대안적으로 환자는 상이할 수 있다 (바람직하게는 환자는 동일하다).
본 발명의 방법에서 사용하는 분자는 이들이 친수성, 즉 양이온성 부분 또는 부분들, 그리고 소수성 부분 또는 부분들을 갖는다는 점에서 양친매성이다. 따라서 분자는 인지질 막의 음전하에 유인되고 그들의 소수성 그룹(들)을 가진 지질 막의 지방 사슬과 상호작용할 수 있다.
세포 또는 세포내인, 인지질 막을 용해시키는 능력을 가진 양친매성 분자는 당해 기술에 공지되어 있고 일명 용해 분자일 수 있다. 용해는 그것의 기능성 완전성 및 삼투압 또는 pH 구배 또는 다른 농도 구배를 구획화하는, 예를 들면 유지하는 정상 능력을 손실하는 정도로 막의 탈안정화를 포함한다. 전형적으로 용해는, 현미경으로 보여질 수 있고 세포질의 손실 및 총 세포 벽 구조의 손실을 포함하는, 지질 이중층의 부분적인 또는 완전한 붕해를 초래할 것이다.
사용될 수 있는 아미노산은 이들이 자연 발생 아미노산이 아니고 전형적으로 표준 아미노산 구조에 변형, 예를 들면 변형된 카복실 기를 포함함에 따라 유도체이다.
본 발명에 따라 사용하는 분자는 양이온성 항미생물 펩타이드 (CAPs)로서 통상적으로 공지된 펩타이드의 그룹을 포함한다. 이들은 양으로 하전된 양친매성 펩타이드이고 이러한 유형의 펩타이드는 많은 종에서 발견되고 타고난 면역계의 일부를 형성한다. CAP 락토페리신 (LfcinB)은 미토콘드리아상에 효과를 갖는 것으로 나타났던 25 아미노산 펩타이드이다 (Eliasen 등 Int. J. Cancer (2006) 119, 493-450). (WO　2010/060497에서 기재된 유형의) 9 아미노산 펩타이드인, 훨씬 더 작은 펩타이드 LTX-315가 또한 미토콘드리아를 표적하는 것이 또한 밝혀졌다.
각각의 분자는 바람직하게는 적어도 2개의 환식 기를 함유한다. 환식 기는 바람직하게는 지방족 또는 방향족, 바람직하게는 방향족일 수 있고, 치환될 수 있는 (더 큰 고리, 예를 들면 7, 8, 9 또는 10 비-수소 원자의 고리가 사용될 수 있어도) 5 또는 6 원 고리이고, 치환기는 헤테로원자 예컨대 산소, 질소, 황 또는 할로겐, 특히 불소, 브롬 또는 염소를 포함할 수 있다. 바람직한 치환기는 C1-C4 알킬 (특히 t-부틸), 메톡시, 플루오로 및 플루오로메틸 기를 포함한다. 환식 기는 호모- 또는 복소환식, 바람직하게는 탄소 원자의 동소환식 고리일 수 있다. 환식 기는 연결 또는 융합, 바람직하게는 융합될 수 있다. 특히 바람직한 측-쇄는 나프탈렌 또는 인돌 기를 포함한다. 친유성 측쇄의 추가 바람직한 기는 단일 치환된 또는 미치환된 환식 기, 바람직하게는 페닐 또는 사이클로헥실 기를 갖는다.
단일 아미노산 유도체는 이들이 필요한 양친매성을 갖는다면 사용될 수 있다. 이들은 적어도 1개의, 바람직하게는 적어도 2 양전하를 운반할 것이고 적절한 양이온성을 나타내기 위해 전형적으로, 가능하게는 6 이상의 비-수소 원자의 친유성 기의 첨가로, 예를 들면 아미드화된 또는 에스테르화된, 변형된 C 말단을 가질 것이다. 단일 아미노산 유도체는 인지질 막을 교란시킬 수 있는 친유성 기(들), 예를 들면 10 이상 또는 12 이상 비-수소 원자의 단일 기 예컨대 트리-부틸 트립토판을 함유해야 할 것이다. 아미노산은, 각각 적어도 6 비-수소 원자의 2 이상 친유성 기를 포함할 수 있다. 바람직한 아미노산 유도체는, 아래 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 이치환되는 β 아미노산이다.
바람직한 펩타이드는 2 내지 25 (바람직하게는 2 내지 20 또는 2 내지 15, 더 일반적으로 6 내지 10) 아미노산으로 구성될 수 있고 pH 7.2-7.6에서 순 양전하를 가질 수 있다. 바람직하게는 (i) 2 이상 (예를 들면 2 또는 3 내지 15 또는 18)의 아미노산은 양이온성 측쇄를 갖고, (ii) 하나 이상의 (예를 들면 1 또는 2 내지 6) 아미노산은, 예를 들면 적어도 1개의 환식 기 및 적어도 7 비-수소 원자를 편입시키는, 친유성 측쇄를 갖는다.
펩타이드는 전형적으로 (환식 기를 포함하는) 적어도 7 비-수소 원자 및 적어도 1개의 환식 기를 편입시키는 친유성 측쇄를 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는 펩타이드는 1 내지 6, 더욱 바람직하게는 1 내지 4, 예를 들면 1, 2 또는 3 친유성 측쇄를 포함한다. 모든 그와 같은 아미노산 및 이의 측쇄는 편리하게 "큰 부피의 및 친유성" 아미노산/측쇄로서 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 측쇄는 적어도 8, 더욱 바람직하게는 적어도 10 비-수소 원자를 함유한다. 바람직한 친유성 측쇄는, 상기 정의된 바와 같이, 2 또는 3 환식 기, 바람직하게는 2 환식 기를 편입시킨다.
유전적으로 코딩된 아미노산 중에서 페닐알라닌 (7 비 수소 원자), 트립토판 (10 비 수소 원자) 및 티로신 (8 비 수소 원자)가 적합한 큰 부피의 및 친유성 아미노산이다. 트립토판은, 그것의 2 융합 고리 구조 및 추가의 벌크 때문에, 특히 바람직하다. 자연 발생될 수 있는, 비-유전적 아미노산, 및 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신 유사체 그리고 상기 정의된 바와 같이 친유성 기를 편입시키기 위해 변형된 아미노산, 예를 들면 인돌 고리의 1-, 2-, 5- 및/또는 7-위치에서 치환된, 위치 1- 또는 2-가 바람직한 트립토판 잔기 예를 들면 5' 하이드록시 트립토판은 또한 사용될 수 있다. 큰 부피의 및 친유성 특징을 갖는 다양한 다른 아미노산 유도체는 당해 분야에서 숙련된 사람에게 공지된다.
바람직한 비-유전적으로 코딩된 큰 부피의 및 친유성 아미노산은 하기를 포함한다: 아다만틸알라닌; 3-벤조티에닐알라닌; 바이페닐알라닌, 예를 들면 4,4'-바이페닐알라닌; 디페닐알라닌, 예를 들면 3,3-디페닐알라닌; 바이페닐알라닌 유도체, 예를 들면 Bip (4-(2-나프틸)), Bip (4-(1-나프틸)), Bip (4-n-Bu), Bip (4-Ph) 또는 Bip (4-T-Bu) 또는 Phe (4-(2'-나프틸)), Phe (4-(1'-나프틸)), Phe (4-n-부틸페닐), Phe (4-4'-바이페닐) 또는 Phe (4'-t-부틸페닐); 호모페닐알라닌; 2,6-디클로로벤질티로신, 사이클로헥실티로신; 7-벤질옥시트립토판; 트리부틸 트립토판 (Tbt), 예를 들면 트리-tert.-부틸트립토판; 호모트립토판; 3-(-안트라세닐)-L-알라닌; L-p-이소-프로필페닐알라닌; 티록신; 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌; 트리아이오도-티로신; 2-아미노-3-(안트라센-9-일)프로판산 산; 2-아미노-3-(나프탈렌-2-일)프로판산 산; 2-아미노-3-(나프탈렌-1-일)프로판산 산; 2-아미노-3-[1,1':4',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산 산; 2-아미노-3-(2,5,7-트리-tert-부틸-1H-인돌-3-일)프로판산 산; 2-아미노-3-[1,1':3',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산 산; 2-아미노-3-[1,1':2',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산 산; 2-아미노-3-(4-나프탈렌-2-일-페닐)-프로피온산 산; 2-아미노-3-(4'-부틸바이페닐-4-일)프로판산 산; 2-아미노-3-[1,1':3',1"-테르페닐-5'-일]-프로피온산 산; 및 2-아미노-3-(4-(2,2-디페닐에틸)페닐)프로판산 산.
바람직한 펩타이드는 적어도 1개의, 예를 들면 1-4, 전형적으로 1 또는 2 비-유전적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 바이페닐알라닌 또는 디페닐알라닌을 포함한다.
친유성 분자는, 필연적으로 친유성 분자 사이 상호작용이 친유성 분자와 물 사이보다 더욱 강하기 때문이 아니라 친유성 분자와 물 사이 상호작용이 물 분자 자체 사이 훨씬 더욱 강한 상호작용이기 때문에, 수성 용액에서 그것의 고유 종류와 회합하는 것이다. 친유성 측쇄가 많은 극성 작용기 예를 들면 4 이하, 바람직하게는 2 이하, 예를 들면 1 또는 0을 함유하지 않는 것이 따라서 바람직하다. 그와 같은 기는 수성 환경과 결합 상호작용을 증가시킬 것이고 따라서 분자의 친유성을 저하시킬 것이다. 트립토판 같은 측-쇄의 약간의 극성은 용인되고 사실상, 트립토판은 제2 펩타이드에서 발견된 바람직한 큰 부피의 및 친유성 아미노산이다.
아미노산 측쇄에 부착된 경우 표준 화학 보호기는 적합한 큰 부피의 및 친유성 측쇄를 제공할 수 있다. 적합한 아미노산 보호기는 당해 분야에서 잘 알려지고, 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신의 벌크 및 친유성을 편리하게 증가시킬 수 있는, Pmc (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐), Mtr (4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐) 및 Pbf (2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란설포닐)을 포함한다. 또한, tert.-부틸 기는 광범위한 아미노산용 공통 보호기이고, 특히 방향족 측쇄를 변형시키는 경우 아미노산 측쇄에 큰 부피의 및 친유성 기를 제공할 수 있다. Z-기 (카복시벤질)은 큰 부피의 및 친유성 기를 제공하는데 사용될 수 있는 추가 보호기이다.
적어도 1개의 환식 기 및 적어도 7 비-수소 원자를 편입시키는 추가 친유성 기는 N 또는 C-말단 변형으로서 존재할 수 있고 바람직한 큰 부피의 및 친유성 기의 상기 논의는, 필요한 부분만 약간 수정하여, 이러한 기에 적용한다.
추가 큰 부피의 및 친유성 기를 제공하는 N-말단 변형은 모노-, 디- 및 가능하게는 양이온성 트리알킬화된 N-말단 아민을 형성하기 위한 임의의 편리한 수단에 의해 N-말단 아민에 직접적으로 부착될 수 있다. 대안적으로, 추가 큰 부피의 및 친유성 기 (다음과 같은 단락에서 "R")은 연결 모이어티 예를 들면 카보닐 기 (RCO) 예를 들면 아다만틸 또는 벤질, 카바메이트 (ROCO), 또는 우레아 (RNHCO) 또는 (R2NCO)를 형성하는 링커를 통해 또는 설폰아미드, 붕소아미드 또는 포스폰아미드를 형성하는 링커에 의해 부착될 수 있다. 설폰아미드 형성 링커는 더욱 안정적인 펩타이드가 요구되는 경우 특히 유용할 수 있다.
상기 정의된 바와 같이 큰 부피의 및 친유성 기는 또한 C-말단 변형 기에 의해 제공될 수 있다. 큰 부피의 및 친유성 기는 케톤을 형성하기 위해 C-말단 카복시 기에 직접적으로 부착될 수 있다. 대안적으로, 큰 부피의 및 친유성 기는 연결 모이어티, 예를 들면 C-말단에서 에스테르를 형성하는 (OR), C-말단에서 1차 및 2차 아미드 기 각각을 형성하는 (NH-R) 또는 (NR2, 여기서 상기 2개의 R 기는 동일할 필요가 없다) 또는 붕산 에스테르 또는 인 유사체를 형성하는 기 (B-(OR)2)를 통해 부착될 수 있다. Dae (디아미노에틸)은 C-말단에 큰 부피의 및 친유성 기, 예를 들면 카보벤즈옥시 (Z)를 부착시키는데 사용될 수 있는 추가 연결 모이어티이다.
양이온성 잔기의 수가 펩타이드의 길이에 비례할 것 같다는 것이 인정될 것이고, 예를 들면 잔기의 ⅓ 내지 ¾은 양이온성이다. 마찬가지로, 잔기의 ¼ 내지 ⅔는 (바람직하게는 7 이상 비-수소 원자로) 친유성이다.
특정 구현예에서 펩타이드는 양이온성 측쇄를 가진 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 아미노산을 함유할 수 있다. 참고의 편의를 위하여, 이들 아미노산은 하기 부문에서 "양이온성 잔기"로서 지칭될 것이다.
펩타이드가 8, 9, 10 또는 11 아미노산으로 구성되는 추가 구현예에서, 3 내지 10, 예를 들면 4 내지 9, 5 내지 8, 6 내지 7 또는 5 양이온성 잔기를 포함할 수 있다. 펩타이드가 4, 5, 6 또는 7 아미노산으로 구성되는 또 추가의 구현예에서, 2 내지 6, 예를 들면 3 또는 4 양이온성 잔기를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 펩타이드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 큰 부피의 및 친유성 아미노산을 함유할 수 있다.
펩타이드가 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산으로 구성되는 특정 구현예에서, 3 내지 17, 4 내지 16, 5 내지 15, 6 내지 14, 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11 또는 10 큰 부피의 및 친유성 잔기를 포함할 수 있다. 펩타이드가 8, 9, 10 또는 11 아미노산으로 구성되는 추가 구현예에서, 3 내지 8, 예를 들면 4 내지 7, 큰 부피의 및 친유성 잔기를 포함할 수 있다. 펩타이드가 4, 5, 6 또는 7 아미노산으로 구성되는 또 추가의 구현예에서, 2 내지 5, 예를 들면 3 또는 4 큰 부피의 및 친유성 잔기를 포함할 수 있다.
펩타이드에서 큰 부피의 및 친유성 및 양이온성 잔기 그리고 추가 큰 부피의 및 친유성 기의 배열은 본 발명의 기능화에 최고 중요하지 않다.
"양이온성 측쇄를 가진 아미노산"은 종양 세포의 세포내 pH, 예를 들면 대략 pH 7.4에서 순 양전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 유전적으로 코딩된 아미노산 중에서 이것은 라이신 및 아르기닌을 포함할 것이지만 그것의 측쇄에서 그와 같은 순 양전하를 운반하는 임의의 비-유전적으로 코딩된 또는 변형된 아미노산, 예를 들면 구아니디노 기 또는 아민 기 또는 또 다른 양이온성 모이어티를 가진 측-쇄를 운반하는 그들 아미노산, 예를 들면 라이신, 및 양성자화 수소를 제외한, 측쇄에서 임의의 수소가 할로겐 원자, 예를 들면 불소, 염소 또는 브롬, 또는 선형, 분지형 지방족 불포화된 또는 포화된 C1-C4 알킬 또는 알콕시 기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 하이드록시, 메톡시, 에틸옥시, 프로필옥시, 이소-프로필옥시, 부틸옥시 기, 이소-부틸옥시, sec-부틸옥시, tert-부틸옥시 또는 이의 할로겐 치환된 버전으로 치환되는 아르기닌의 유도체는 사용될 수 있다.
양이온성 측쇄를 가진 적합한 비-유전적으로 코딩된 아미노산은 호모라이신, 오르니틴, 디아미노부티르산 산, 디아미노피멜 산, 디아미노프로피온산 산 및 호모아르기닌 뿐만 아니라 트리메틸리신 및 트리메틸오르니틴, 4-아미노피페리딘-4-카복실산, 4-아미노-1-카밤이미도일피페리딘-4-카복실산 및 4-구아니디노페닐알라닌을 포함한다.
글리신을 예외로 한, 아미노산은 2 이상 입체이성질체로서 실재할 수 있다. 특히 글리신 이외 아미노산의 α-탄소는 키랄 중심이고 그래서 각각의 아미노산의 2개의 거울상이성질체 형태를 발생시킨다. 이들 형태는 종종 D 및 L 형태, 예를 들면 D-알라닌 및 L-알라닌으로서 지칭된다. 추가 키랄 중심을 가진 아미노산은 4 이상 가능한 입체이성질체에서 실재할 것이고, 예를 들면 트레오닌은 2개의 키랄 중심을 갖고 그래서 4개 입체이성질체 형태 중 하나에서 실재할 수 있다. 아미노산의 임의의 입체이성질체는 본 발명의 분자에서 사용될 수 있다. 용어 "비-유전자적으로 인코딩된"이 아미노산에 적용되는, 본 발명 기재의 목적으로, 이것은 L 형태에서 사실상 발생하는 아미노산의 D 형태를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 아래 부문에서 설명된 바와 같이 추가로 정의된다.
용해 노나펩타이드
특허 공보 WO2010/060497에서 기재된 바와 같이, 용해 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 다음과 같은 특징을 가질 수 있다:
a) 선형 배열에서 9 아미노산으로 구성됨;
b) 그들 9 아미노산 중, 5개는 양이온성이고 4개는 친유성 R 기를 가짐;
c) 상기 9 아미노산 중 적어도 1개가 비-유전적으로 코딩된 아미노산 또는 유전적으로 코딩된 아미노산의 변형된 유도체임; 그리고 선택적으로
d) 친유성 및 양이온성 잔기가 배열되어 이로써 서로에 인접한 잔기의 어느 한쪽 유형 중 2개 이하가 있음; 및 추가로 선택적으로
e) 분자가 인접한 양이온성 아미노산의 2개 쌍 및 인접한 친유성 잔기의 1개 또는 2개 쌍을 포함함.
동일 또는 상이할 수 있는, 양이온성 아미노산은 바람직하게는 라이신 또는 아르기닌이지만 pH 7.0에서 양전하를 운반하는 임의의 비-유전적으로 코딩된 또는 변형된 아미노산 또는 히스티딘일 수 있다.
적합한 비-유전적으로 코딩된 양이온성 아미노산 및 변형된 양이온성 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 유사체 예컨대 호모라이신, 오르니틴, 디아미노부티르산 산, 디아미노피멜 산, 디아미노프로피온산 산 및 호모아르기닌 뿐만 아니라 트리메틸리신 및 트리메틸오르니틴, 4-아미노피페리딘-4-카복실산, 4-아미노-1-카밤이미도일피페리딘-4-카복실산 및 4-구아니디노페닐알라닌을 포함한다.
동일 또는 상이할 수 있는, 친유성 아미노산 (즉 친유성 R 기를 가진 아미노산)은 모두 적어도 7, 바람직하게는 적어도 8 또는 9, 더욱 바람직하게는 적어도 10 비-수소 원자를 가진 R 기를 보유한다. 친유성 R 기를 가진 아미노산은 본 명세서에서 친유성 아미노산으로서 지칭된다. 전형적으로 친유성 R 기는, 융합 또는 연결될 수 있는, 적어도 1개의, 바람직하게는 2개의 환식 기를 갖는다.
친유성 R 기는 헤테로 원자 예컨대 O, N 또는 S를 함유할 수 있지만 전형적으로 1 이하 헤테로원자, 바람직하게는 질소이다. 이러한 R 기는 바람직하게는 2개 이하 극성 기, 더욱 바람직하게는 0 또는 1, 가장 바람직하게는 극성 기가 없을 것이다.
트립토판은 바람직한 친유성 아미노산이고 분자는 바람직하게는 1 내지 3, 더욱 바람직하게는 2 또는 3, 가장 바람직하게는 3 트립토판 잔기를 포함한다. 편입될 수 있는 추가 유전적으로 코딩된 친유성 아미노산은 페닐알라닌 및 티로신이다.
바람직하게는 친유성 아미노산 중 하나는 비-유전적으로 코딩된 아미노산이다. 가장 바람직하게는 분자는 3 유전적으로 코딩된 친유성 아미노산, 5 유전적으로 코딩된 양이온성 아미노산 및 1 비-유전적으로 코딩된 친유성 아미노산으로 구성된다. 이러한 문맥에서, D 아미노산은, 엄격히 유전적으로 코딩되지 않는 한편, 20 유전적으로 코딩된 L 아미노산과 상이한, 단지 입체구체적으로가 아닌, 구조적으로 될 수 있는, "비-유전적으로 코딩된 아미노산"인 것으로 고려되지 않는다. 본 발명의 분자는 D 형태에서 존재하는 일부 또는 모든 아미노산을 가질 수 있고, 바람직하게는 하지만 모든 아미노산은 L 형태이다.
분자가 비-유전적으로 코딩된 친유성 아미노산 (또는 아미노산 유도체)를 포함하는 경우, 그 아미노산의 R 기는 바람직하게는 35 이하 비-수소 원자, 더욱 바람직하게는 30 이하, 가장 바람직하게는 25 이하 비-수소 원자를 함유한다.
바람직한 비-유전적으로 코딩된 아미노산은 하기를 포함한다: 2-아미노-3-(바이페닐-4-일)프로판산 (바이페닐알라닌), 2-아미노-3,3-디페닐프로판산 (di페닐알라닌), 2-아미노-3-(안트라센-9-일)프로판산, 2-아미노-3-(나프탈렌-2-일)프로판산, 2-아미노-3-(나프탈렌-1-일)프로판산, 2-아미노-3-[1,1':4',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산, 2-아미노-3-(2,5,7-트리-tert-부틸-1H-인돌-3-일)프로판산, 2-아미노-3-[1,1':3',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산, 2-아미노-3-[1,1':2',1"-테르페닐-4-일]-프로피온산, 2-아미노-3-(4-나프탈렌-2-일-페닐)-프로피온산, 2-아미노-3-(4'-부틸바이페닐-4-일)프로판산, 2-아미노-3-[1,1':3',1"-테르페닐-5'-일]-프로피온산 및 2-아미노-3-(4-(2,2-디페닐에틸)페닐)프로판산.
바람직한 구현예에서 본 발명의 화합물은 아래 열거된 식 I 내지 V 중 하나를 갖고, 여기에서 C는 상기 정의된 바와 같이 양이온성 아미노산을 나타내고 L은 상기 정의된 바와 같이 친유성 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는 진정한 펩타이드를 초래하는 펩타이드 결합에 의해 또는 펩타이드모방체를 초래하는 다른 연결기에 의해 공유결합된 아미노산. 이들 분자의 자유 아미노 또는 카복시 말단은 변형될 수 있고, 카복시 말단은 음전하를 제거하기 위해 바람직하게는 변형되고, 가장 바람직하게는 카복시 말단은 아미드화되고, 이러한 아미드 기는 치환될 수 있다.
CCLLCCLLC (I) (서열 식별 번호: 1)
LCCLLCCLC (II) (서열 식별 번호: 2)
CLLCCLLCC (III) (서열 식별 번호: 3)
CCLLCLLCC (IV) (서열 식별 번호: 4)
CLCCLLCCL (V) (서열 식별 번호: 5)
β 및 γ 아미노산 뿐만 아니라 α 아미노산은, N-치환된 글리신처럼, 용어 '아미노산' 내에서 포함된다. 본 발명의 화합물은 베타 펩타이드 및 뎁시펩타이드를 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 적어도 1개의, 및 바람직하게는 1개의, 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 편입시킨다. 이러한 잔기가 L'로 지시되는 경우, 바람직한 화합물은 다음과 같은 식으로 표시된다:
CCL'LCCLLC (I') (서열 식별 번호: 6)
CCLLCCLL'C (I") (서열 식별 번호: 7)
CCLL'CCLLC (I"') (서열 식별 번호: 8)
LCCLL'CCLC (II') (서열 식별 번호: 9)
식 I 및 II의 펩타이드가 특히 바람직하고, 이들 중, 식 I"의 펩타이드가 특히 바람직하다.
표 1에서 나타낸 바와 같이 다음과 같은 펩타이드는 가장 바람직하다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 명세서에서 기재된 분자의 모두는 염, 에스테르 또는 아미드 형태일 수 있다.
따라서, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화합물은 본 발명에 따라 또한 제공된다: LTX-301, LTX-303 내지 LTX-310, LTX-312 내지 LTX-321, LTX-323 - LTX-327, LTX-329, LTX-331 - LTX-336, 및 LTX-338, 또는 이의 염, 에스테르 또는 아미드. 따라서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 식을 갖는 화합물을 제공한다: 서열 식별 번호: 10 및 12 내지 42, 또는 이의 염, 에스테르 또는 아미드. 화합물 LTX-315가 특히 바람직하다.
분자는 바람직하게는 펩타이드이고 바람직하게는 변형된, 특히 아미드화된, C-말단을 갖는다. 아미드화된 펩타이드는 자체 염 형태일 수 있고 아세테이트 형태는 바람직하다. 적합한 생리적으로 허용가능한 염은 당해 분야에서 잘 알려지고 무기 또는 유기 산의 염을 포함하고, 트리플루오르아세테이트 뿐만 아니라 아세테이트 및 HCl과 형성된 염을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 분자는 사실상 양친매성이고, α-나선을 형성하는 경향이 있을 수 있거나 아닐 수 있는, 그들의 2o 구조는 생리적 병태에서 양친매성 분자를 제공한다.
이치환된 β 아미노산을 갖는 분자
특허 공보 WO2011/051692에서 기재된 바와 같이, 펩타이드, 펩타이드모방체 또는 아미노산 유도체는 적어도 +2의 순 양전하를 가질 수 있고 이치환된 β 아미노산을 편입시키고, 동일 또는 상이할 수 있는, β 아미노산에서 치환기의 각각은 적어도 7 비-수소 원자를 포함하고, 친유성이고 적어도 1개의 환식 기를 갖고, 치환기 내에서 하나 이상의 환식 기는 다른 치환기 내에서 하나 이상의 환식 기에 연결 또는 융합될 수 있고 여기에서 환식 기는 2 치환기에 대하여 비-수소 원자의 조합된 총 수가 적어도 12인 이런 식으로 융합된다. β 아미노산에서 2 치환기는 바람직하게는 동일하다.
친유성은 2상 시스템, 예를 들면 액체-액체 예컨대 1-옥탄올/물에서 분자의 분포에 의해 측정될 수 있다. 극성 치환체 예컨대 하이드록시, 카복시, 카보닐, 아미노 및 에테르가 이들이 친유성을 감소시킴에 따라 2상 시스템 예컨대 1-옥탄올/물에서 분배 계수를 감소시킨다는 것이 당해 분야에서 잘 알려지고; 친유성 치환기는 따라서 바람직하게는 2 이하, 더욱 바람직하게는 1 또는 0개의 그와 같은 극성 기를 함유할 것이다.
β 아미노산은 β 탄소 원자에 부착된 아미노 기를 갖고; 유전적으로 코딩된 아미노산은 아미노 기가 탄소 원자에 부착되는 α 아미노산이다. 이러한 배열은 하나 이상의 β 아미노산을 편입시키는 펩타이드의 골격을 β 아미노산당 1개의 원자씩 길어진다. 이러한 배열에서 α 및/또는 β 탄소 원자는 치환될 수 있다. α 또는 β 탄소 원자는 이치환될 수 있고; α 탄소 원자가 이치환되는 경우 β2,2 아미노산이 생기고 β 탄소 원자가 이치환되는 경우 β3,3 아미노산이 생성된다. 각각의 α 또는 β 탄소 원자에서 1개의 치환기는 β2,3 아미노산을 초래한다. β2,2 및 β3,3 이치환된 아미노산은 바람직하고, β2,2 이치환된 아미노산이 특히 바람직하다.
β 아미노산은 적어도 7 비-수소 원자를 편입시키는 2개 기에 의해 치환된다. 바람직하게는 1개, 더욱 바람직하게는 치환기 모두는 적어도 8, 더욱 바람직하게는 적어도 10 비-수소 원자를 함유한다. 이들 기는 사실상 친유성이고 한편 이들은 상이할 수 있고, 바람직하게는 동일하다. 각각은, 전형적으로 지방족 또는 방향족, 바람직하게는 방향족일 수 있고, 치환될 수 있는 6 원 고리인, 적어도 1개의 환식 기를 함유하고, 치환기는 헤테로 원자 예컨대 산소, 질소, 황 또는 할로겐, 특히 불소 또는 염소를 포함할 수 있다. 바람직한 치환기는 C1-C4 알킬 (특히 t-부틸), 메톡시, 플루오로 및 플루오로메틸 기를 포함한다. 환식 기는 호모- 또는 복소환식일 수 있고, 바람직하게는 이들은 탄소 원자의 동소환식 고리이다. 바람직한 친유성 치환기는, 연결 또는 융합, 바람직하게는 융합될 수 있는, 2 또는 3 환식 기, 바람직하게는 2 환식 기를 편입시킨다. 특히 바람직한 치환기는 나프탈렌 기를 포함한다.
친유성 치환기의 추가 바람직한 기는 단일 치환된 또는 미치환된 환식 기, 바람직하게는 페닐 또는 사이클로헥실 기를 갖는다.
환식 기 또는 기들은 1 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3 원자의 사슬에 의해 펩타이드 골격으로부터 (즉 β 아미노산의 α 또는 β 탄소 원자로부터) 전형적으로 이격 분리되고; 이들 연결 원자는 질소 및/또는 산소를 포함할 수 있지만 전형적으로 탄소 원자일 것이고, 바람직하게는 연결 원자는 미치환된다. 이들 스페이서는 물론 본 명세서에서 정의된 바와 같이 치환기의 부분이다.
이치환된 β 아미노산의 각각의 치환 모이어티는 전형적으로 7 내지 20 비-수소 원자, 바람직하게는 7 내지 13, 더욱 바람직하게는 8 내지 12, 가장 바람직하게는 9-11 비-수소 원자를 포함할 것이다.
이들 분자는 바람직하게는 1 또는 2 내지 12 아미노산 또는 등가 하위단위 길이의 펩타이드 또는 펩타이드모방체일 것이다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 '아미노산'에 대한 참조는 펩타이드모방체에서 등가 하위단위를 포함한다. 바람직한 분자는 어느 한쪽 1 내지 3 또는 4 아미노산을 갖지만, 대안적으로 3 내지 12, 바람직하게는 5 내지 12 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명에 따른 용도의 분자는 단일 아미노산을 포함할 수 있을 뿐이지만 이것은 전하용 요건을 이행하기 위해 '변형된' 아미노산이 될 것이다.
단일 아미노산 뿐만 아니라 펩타이드 및 펩타이드모방체는 바람직하게는 변형된 C 말단을 편입시킬 것이고, C 말단 변경 기는, 예를 들면 아미노 기의 존재를 통해, 전형적으로 전하 역전을 초래한다, 즉 카복실 기의 음전하를 제거하고 양전하를 첨가한다. N 말단이 변형되지 않는 것을 가정하는, 이러한 변형 단독은 전반적으로 +2의 순전하 분자를 제공할 것이다. C 말단이 변형되어 전하 역전을 제공하거나 단순히 카복실 기의 음전하를 제거하든 아니든, 분자는 바람직하게는 또한 하나 이상의 양이온성 아미노산을 함유한다. 따라서 분자의 총 전하는 더 큰 분자에 대하여 +3, +4 또는 더 높을 수 있다.
바람직하게는 사실상 양이온성인, 적합한 C-말단 기는 전형적으로 15 비-수소 원자의 최대 크기를 가질 것이다. C-말단은 바람직하게는 아미드화되고 아미드 기는 N-알킬 또는 N,N-디알킬 아미드를 형성하기 위해 추가로 치환될 수 있다. 1차 및 2차 아미드 기는 바람직하다. 아미드 기를 치환시키기 위한 적합한 기는 아미노알킬, 예를 들면 아미노 에틸 또는 디메틸아미노에틸을 포함하고; 아미드 기의 질소 원자는 환식 기의 일부 예를 들면 피라졸리딘, 피페리딘, 이미다졸리딘 및 피페라진을 형성할 수 있고, 피페라진이 바람직하고, 이들 환식 기는, 예를 들어 알킬 또는 아미노알킬 기에 의해 자체 치환될 수 있다.
펩타이드는 바람직하게는 하나 이상의 양이온성 아미노산을 편입시키고, 라이신, 아르기닌, 오르니틴 및 히스티딘은 바람직하지만 pH 7.0에서 양전하를 운반하는 임의의 비-유전적으로 코딩된 또는 변형된 아미노산은 편입될 수 있다.
적합한 비-유전적으로 코딩된 양이온성 아미노산 및 변형된 양이온성 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 유사체 예컨대 호모라이신, 오르니틴, 디아미노부티르산 산, 디아미노피멜 산, 디아미노프로피온산 산 및 호모아르기닌 뿐만 아니라 트리메틸리신 및 트리메틸오르니틴, 4-아미노피페리딘-4-카복실산, 4-아미노-1-카밤이미도일피페리딘-4-카복실산 및 4-구아니디노페닐알라닌을 포함한다.
디펩타이드는 전형적으로 1개의 양이온성 아미노산을 편입시킬 것이고 더 긴 펩타이드는 일반적으로 추가의 양이온성 아미노산을 편입시킬 것이고, 따라서 4 또는 5 아미노산의 펩타이드는 2 또는 3 양이온성 아미노산을 가질 수 있고 6 내지 9 아미노산의 펩타이드는 3 내지 6 양이온성 아미노산을 가질 수 있다.
분자의 바람직한 기는 C-말단 L-아르기닌 아미드 잔기에 커플링된 β2,2 이치환된 아미노산을 포함하고 이러한 배열을 갖는 디펩타이드는 특히 바람직하다.
3 이상 아미노산을 가진 펩타이드는 전형적으로 하나 이상의 추가의 친유성 아미노산, 즉 친유성 R 기를 가진 아미노산을 가질 것이다. 전형적으로 친유성 R 기는, 융합 또는 연결될 수 있는, 적어도 1개의, 바람직하게는 2개의 환식 기를 갖는다. 친유성 R 기는 헤테로 원자 예컨대 O, N 또는 S를 함유할 수 있지만 전형적으로 1 이하 헤테로원자, 바람직하게는 질소이다. 이러한 R 기는 바람직하게는 2 이하 극성 기, 더욱 바람직하게는 0 또는 1, 가장 바람직하게는 0을 가질 것이다.
트립토판은 바람직한 친유성 아미노산이고 펩타이드는 바람직하게는 1 내지 3 트립토판 잔기를 포함한다. 편입될 수 있는 추가 유전적으로 코딩된 친유성 아미노산은 페닐알라닌 및 티로신이다.
변형된 R 기를 가진 유전적으로 코딩된 아미노산을 포함하여, 친유성 아미노산은 비-유전적으로 코딩될 수 있다.
특히 바람직한 펩타이드, 펩타이드모방체 또는 (변형된) 아미노산은 적어도 +2의 순 양전하를 갖고 하기 식 I의 기를 편입시킨다:
Figure pct00003
여기서 R1, R2, R3 및 R4로부터 임의의 2개는 수소 원자이고 2개는, 동일 또는 상이할 수 있는, 적어도 7 비-수소 원자를 포함하는, 친유성인 그리고 환식 기를 포함하는, 치환기이고, 상기 환식 기는 어느 한쪽 α 또는 β 탄소 원자에 직접적으로 부착되지 않지만 선택적으로 다른 치환기에서 환식 기에 연결 또는 융합되고, 여기에서 환식 기는 융합되고 2개 치환기에 대하여 비-수소 원자의 조합된 총 수는 적어도 12이고, 여기서 X는 O, C, N 또는 S를 나타낸다.
각각의 모이어티의 환식 기가 융합되는 경우 R1-4의 2개 기에서 조합된 총 비-수소 원자에 대하여 12의 최소 수치가 비융합된 기에 대하여 최소 수 첨가 (7+7 = 14) 및 비-수소 원자의 2개가 각각의 기내 고리 형성에 효과적으로 참가하기 때문에 2 공제에 의해 달성되는 것이 인정될 것이다. 바람직하게는 각각의 모이어티의 환식 기가 융합되는 경우 R1-4의 2개 기에서 조합된 총 비-수소 원자는 14이다. 복합체 융합된 및 연결된 기는 Cα 또는 Cβ에 부착된 2개 기가 한 쌍 초과의 융합된 환식 기를, 치환기 사이 추가의 연결 결합과 무관하게, 함유할 수 있는 경우에 구상될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 기가 운동의 최대 가요성을 갖는 분자가 바람직함에 따라 2개 치환기는 바람직하게는 융합 또는 연결되지 않는다.
식 (I)의 기에서 질소 원자는 바람직하게는, 물론, 간접적으로 Cβ 또는 Cα를 통해 기 R1-4의 임의의 원자에 결합되지 않는다. 바람직하게는 상기 골격 (N- Cβ- Cα-C-X)내 5 원자는 환식이 아닌, 선형 방식에서만 서로에 대해서 연결된다. 식 (I)에서 X 및 N이 그들의 정상 원자가를 갖고 따라서 이들이 화합물의 다른 부분, 예를 들면 추가 아미노산 또는 N- 또는 C- 말단 캡핑 기에 결합됨에 따라 전형적으로 추가로 치환될 것이 인정될 것이다.
R1-4의 치환기는 사실상 일반적으로 친유성이고 바람직하게는 전하를 운반하지 않고 바람직하게는 2 이하, 더욱 바람직하게는 1 이하 극성 기를 갖는다. R1-4의 치환기의 1개 또는 모두는 바람직하게는 적어도 8, 더욱 바람직하게는 적어도 9 또는 10 비-수소 원자, 예를 들면 7-13, 7-12, 8-12 또는 9-11 비-수소 원자를 함유한다. 이들 2개 치환기는, 합성의 편리성만을 위해서라면, 바람직하게는 동일하다. 바람직하게는 2개 치환기는 R1 및 R2 또는 R3 및 R4이고, R3 및 R4가 가장 바람직하다.
상기에서 언급된 바와 같이, R1-4의 환식 기는 이들이 1 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3 원자의 사슬에 의해 거기로부터 이격되기 때문에 어느 한쪽 α 또는 β 탄소 원자에 직접적으로 부착되지 않고; 이들 연결 원자는 질소 및/또는 산소를 포함할 수 있지만 전형적으로 탄소 원자일 것이고, 바람직하게는 연결 원자는 미치환된다. X는 치환 또는 미치환될 수 있고 바람직하게는 N 원자이고 바람직하게는 치환된다. X가 N인 경우 추가 아미노산으로 아미드 결합의 부분을 형성할 수 있다. 대안적으로, N 원자는, 예를 들어 아미노알킬 기, 예를 들면 아미노에틸 또는 아미노프로필 또는 디메틸아미노에틸에 의해 치환될 수 있다. 추가 대안에서 N 원자는, 알킬 또는 아미노알킬 기에 의해 자체 치환될 수 있는, 환식 기의 부분 예컨대 피페라진을 형성할 수 있다.
식 I의 기를 편입시키는 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 바람직하게는, 바람직하게는 아미드화되고 상기 기재되는, 변형된 C 말단을 가질 것이다.
β 아미노산의 바람직한 치환기를 정의하는 이전의 구절은, 필요한 부분만 약간 수정하여, R1-4의 2개 치환기에 적용한다. 식 I의 기를 편입시키는 펩타이드 및 펩타이드모방체는 본원에서 일찍이 기재된 분자의 바람직한 하위-세트이고 그래서 분자의 바람직한 특징, 예를 들어 그들의 길이 및 이들이 함유하는 다른 아미노산을 정의하는 모든 이전의 구절은 또한 식 I의 기의 그들의 편입, 및 그 반대에 의해 정의된 이들 분자에 적용한다. 특히 바람직한 분자는 1 내지 7 또는 8 (예를 들면 1 내지 5), 더욱 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 아미노산 길이이다. 펩타이드모방체 분자는 동일한 수의 하위단위를 포함할 것이지만 이들 하위단위는 전형적으로 아미드 결합 모방체에 의해 연결될 것이고; 바람직한 연결기는 상기에 논의되어 있고 에스테르 및 아미노메틸 및 케토메틸렌을 포함한다.
본 발명의 펩타이드, 펩타이드모방체 및 아미노산은 염 형태, 환식 또는 에스테르화된, 뿐만 아니라 상기 논의된 바람직한 아미드화된 유도체일 수 있다.
분자의 바람직한 부류는 상기 정의된 바와 같이 2개 친유성 측쇄를 편입시키는 단일 β2,2-아미노산을 갖는 β, 바람직하게는 β2,2-아미노산 유도체이고, 이치환된 β-아미노산은 2개 양이온성 기에 의해 측접된다. 이전에 기재된 바와 같이, 2개 치환기는 바람직하게는 동일하고, 6 원 환식 기 및 적어도 8, 바람직하게는 적어도 10 비-수소 원자를 포함한다.
바람직하게는, 분자는 LTX-401이다.
펩타이드모방체
상기 논의된 바와 같이, 상기 정의된 분자는 펩타이드모방체의 형태일 수 있다. 펩타이드모방체는 전형적으로 그것의 펩타이드 등가물의 극성, 3차원 크기 및 기능성 (생물활성)을 보유함을 특징으로 하지만 여기서 상기 펩타이드 결합은, 종종 더욱 안정적인 연결기에 의해, 재배치되고 있다. '안정적인'은 가수분해의 효소에 의해 효소 분해에 더욱 저항성인 것을 의미한다. 일반적으로, 아미드 결합을 대체하는 결합 (아미드 결합 대리)는 아미드 결합의 많은 특성, 예를 들면 형태, 입체 부피, 정전 특징, 수소 결합용 가능성 등을 보존한다. Chapter 14 of "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pub는 펩타이드모방체의 설계 및 합성용 기술의 일반적인 논의를 제공한다. 적합한 아미드 결합 대리는 다음과 같은 기를 포함한다: N-알킬화 (Schmidt, R. 등, Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47), 레트로-인버스 아미드 (Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), 티오아미드 (Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌 (Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐 (Allmendinger, T. 등, Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), 비닐, 메틸렌아미노 (Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), 메틸렌티오 (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), 알칸 (Lavielle, S. 등, Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) 및 설폰아미도 (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).
펩타이드모방체 화합물은 등가 용해 펩타이드의 하위단위에 크기 및 기능에서 대략 등가인 많은 하위단위를 가질 수 있다. 용어 '아미노산'은 따라서 편리하게 펩타이드모방체 화합물의 등가 하위단위를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드모방체는 아미노산의 R 기에 등가인 기를 가질 수 있고 본 명세서에서 적합한 R 기의 그리고 N 및 C 말단 변경 기의 논의는, 필요한 부분만 약간 수정하여, 펩타이드모방체 화합물에 적용한다.
"Drug Design and Development", Krogsgaard 등, 1996, 뿐만 아니라 아미드 결합의 대체에서 논의된 바와 같이, 펩타이드모방체는 디- 또는 트리펩타이드모사체 구조로 더 큰 구조적 모이어티의 대체를 포함할 수 있고 이 경우에, 펩타이드 결합을 포함하는 모방체 모이어티, 예컨대 아졸-유래된 모방체는 디펩타이드 대체로서 사용될 수 있다. 바로 아미드 결합이 상기 논의된 바와 같이 재배치된 펩타이드모방체 및 따라서 펩타이드모방체 골격은, 하지만, 바람직하다.
적합한 펩타이드모방체는 아미드 결합이 환원제 예를 들면 보란 또는 수소화물 시약 예컨대 리튬 알루미늄-수소화물로 치료에 의해 메틸렌 아민에 대해 감소되고 있는 감소된 펩타이드를 포함한다. 그와 같은 감소는 분자의 전반적인 양이온성 증가의 부가된 이점을 갖는다.
다른 펩타이드모방체는, 예를 들어, 아미드-기능화된 폴리글리신의 단계적인 합성에 의해 형성된 펩토이드를 포함한다. 일부 펩타이드모방체 골격은 그들의 펩타이드 전구체, 예컨대 퍼메틸화되고 있는 펩타이드로부터 쉽게 이용가능할 것이고, 적합한 방법은 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 11138-11142에서 Ostresh, J.M. 등에 의해 기재된다. 강 염기성 조건은 O-메틸화보다 N-메틸화를 선호할 것이고 펩타이드 결합 및 N-말단 질소에서 일부 또는 모든 질소 원자의 메틸화를 초래한다.
바람직한 펩타이드모방체 골격은 폴리에스테르, 폴리아민 및 그들의 유도체 뿐만 아니라 치환된 알칸 및 알켄을 포함한다. 펩타이드모방체는 바람직하게는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있는 N 및 C 말단을 가질 것이다.
바람직한 것으로 기재된 모든 펩타이드의 펩타이드모방체 등가물은 또한 바람직하다.
분자의 합성
본 명세서에서 기재된 용해 분자는 임의의 편리한 식으로 합성될 수 있다. 일반적으로 존재한 반응성 기 (예를 들어 아미노, 티올 및/또는 카복실)은 전반적인 합성 동안 보호될 것이다. 합성에서 최종 단계는 따라서 본 발명의 보호된 유도체의 탈보호일 것이다.
펩타이드 강화에서, C-말단 시작 절차가 바람직하여도 어느 한쪽 C-말단 또는 N-말단에서 원칙적으로 시작할 수 있다.
펩타이드 합성의 방법은 당해 분야에서 잘 알려지지만 본 발명에 대하여 고상 지지체상에 합성을 실시하는 것이 특히 편리할 수 있고, 그와 같은 지지체는 당해 분야에서 잘 알려진다.
아미노산용 보호기의 광범위 선택은 공지되고 적합한 아민 보호기는 (또한 Z로 지정된) 카보벤질옥시 (또한 Boc로 지정된) t-부톡시카보닐, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠 설포닐 (Mtr) 및 (또한 Fmoc로 지정된) 9-플루오레닐메톡시-카보닐을 포함할 수 있다. 펩타이드가 C-말단 단부로부터 강화되는 경우, 아민-보호기가 첨가된 각각의 신규한 잔기의 α-아미노 기상에 존재할 것이고 다음 커플링 단계에 앞서 선택적으로 제거되어야 할 것이 인정될 것이다.
예를 들어 이용될 수 있는 카복실 보호기는 쉽게 절단된 에스테르 기 예컨대 벤질 (Bzl), p-니트로벤질 (ONb), 또는 t-부틸 (OtBu) 기 뿐만 아니라 고형 지지체, 예를 들어 폴리스티렌에 연결된 링크 아미드상의 커플링 기를 포함한다.
티올 보호기는 p-메톡시벤질 (Mob), 트리틸 (Trt) 및 아세트아미도메틸 (Acm)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 펩타이드는 편리하게 Lys, Orn, Dab 및 Dap의 아민 측쇄용 t-부틸옥시카보닐 (Boc) 보호기를 사용할 뿐만 아니라 트립토판 잔기의 인돌 질소의 보호를 위하여 제조될 수 있다. Fmoc는 알파-아미노 기의 보호를 위하여 사용될 수 있다. Arg를 함유하는 펩타이드에 대하여, 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐은 구아니딘 측쇄의 보호를 위하여 사용될 수 있다.
광범위한 절차는 아민- 및 카복실-보호기 제거를 위하여 실재한다. 이들은, 하지만, 이용된 합성 전략과 일치되어야 한다. 측쇄 보호기는 다음 커플링 단계에 앞서 일시적 α-아미노 보호기를 제거하는데 사용된 조건에 대해 안정적이어야 한다.
아민 보호기 예컨대 Boc 및 카복실 보호기 예컨대 tBu는, 예를 들어 트리플루오로아세트산으로 산 치료에 의해 동시에 제거될 수 있다. 티올 보호기 예컨대 Trt는 산화 제제 예컨대 요오드를 이용하여 선택적으로 제거될 수 있다.
펩타이드모방체 화합물의 합성용 참조 및 기술은 상기 제공되고 숙련된 사람에 공지된다.
대상체는 전형적으로 인간 환자일 것이지만 비-인간 동물, 예컨대 가정용 또는 가축 동물도 또한 처리될 수 있고 실험실 또는 시험 동물도 처리될 수 있다.
바람직한 암 표적은 림프종, 백혈병, (예를 들면 뇌로부터) 신경교세포종 및 교모세포종, (특히 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선 및 피부로부터) 암종 및 선암종 그리고 흑색종이다.
투여된 분자는, 예를 들어, 경구, 국소, 비강, 비경구, 정맥내, 종양내, 직장 또는 영역 (예를 들면 단리된 팔다리 관류) 투여에 적합한 형태로 나타날 수 있다. 투여는 전형적으로 비경구 경로, 바람직하게는 주사로 피하로, 근육내로, 관절내로, 척수내, 종양내로 또는 정맥내로이다. 종양내 투여가 바람직하다.
본 명세서에서 정의된 분자는 투여의 종래의 약리적 형태, 예컨대 정제, 코팅된 정제, 비강 스프레이, 용액, 에멀젼, 리포좀, 분말, 캡슐 또는 지속된 방출 형태로 나타날 수 있다. 종래의 약제학적 부형제 뿐만 아니라 일반 생산 방법은 이들 형태의 제조에 이용될 수 있다. 장기 특이적 캐리어 시스템은 또한 사용될 수 있다.
주사 용액은, 예를 들어, 종래의 방식에서, 예컨대 보존 제제, 예컨대 p 하이드록시벤조에이트, 또는 안정화제, 예컨대 EDTA의 첨가에 의해 생산될 수 있다. 용액은 그 다음 주사 바이알 또는 앰풀에 충전된다.
바람직한 제형은 염수내이다. 그와 같은 제형은, 예를 들면 종양내, 예를 들면 주사로 또는 관류/주입으로 국부 투여에 적합하다.
활성 분자를 함유하는 투약량 단위는 바람직하게는 0.1-10mg, 예를 들어 1.5mg의 본 발명의 항종양 분자를 함유한다.
전신으로 그와 같은 조성물 사용에서, 활성 분자는 적어도 약 5 μg/ml의 활성 분자의 혈청 수준을 달성하는 양으로 존재한다. 일반적으로, 혈청 수준은 500 μg/ml를 초과할 필요 없다. 바람직한 혈청 수준은 약 100 μg/ml이다. 그와 같은 혈청 수준은 1 내지 약 10 mg/kg의 용량에서 전신으로 투여되도록 조성물에서 생물활성 분자를 편입시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 분자(들)은 100 mg/kg을 초과하는 용량에서 투여될 필요 없다.
본 발명의 분자는 염 형태를 포함한다. 펩타이드에 적절한 약제학적으로 허용가능한 염 및 유사한 분자는 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다.
본 발명은 다음과 같은 실시예에서 하기 도와 관련하여 추가로 기재된다:
도 1은 상기 기재된 용해 화합물의 T-세포 클론형성능 작용 기전을 보여준다. 1) 차가운 종양에 용해 화합물의 투여는 강력한 면역-자극제의 방출 및 종양-특이적 항원의 넓은 레퍼토리를 유발시키고; 2) 항원 제시 세포의 활성화 및 종양 특이적 항원의 휩씀; 3) 종양-특이적 항원의 넓은 레퍼토리의 제시는 림프절에서 발생하고; 4) 종양-특이적 T 세포의 클론형성능은 향상되고, 이들 T 세포는 혈액 시스템을 통해 분포되고; 5) 증가된 T-세포 침윤 및 클론형성능은 양쪽 본래 주사된 종양, 및 다른 원위 비-주사된 종양을 뜨겁게 만든다.
도 2는 LTX-315로 치료후 골육종(osteoscarcoma) 세포의 세포질 막의 붕해를 보여준다. (A)는 용해전 세포를 보여주고, (B)는 용해후 세포를 보여준다.
도 3은 미토콘드리아에 가까운 LTX-315의 내재화 및 축적을 보여준다. 1.5 mM 형광-표지된 LTX-315로, 및 표지된 미토콘드리아 및 핵으로 30 분 처리된 A375 세포. 펩타이드는 미토콘드리아에 가깝게 근접하여 내재화 및 검출되었다. A: 오버레이 채널, B: 클로즈업, C: 미토콘드리아. D: 펩타이드
도 4는 비-용해 모의 펩타이드 LTX-328에서가 아닌 용해 9-mer 화합물 예컨대 LTX-315에서만 내재화가 발생하는 것을 보여준다. 3 μM LTX-315 또는 LTX-328 펩타이드로 60 min 동안 처리된 A375 세포. LTX-315는 세포질에서 검출되었고, 한편 LTX-328은 내재화되지 않았다. A: LTX-315 60 min 인큐베이션, B: LTX-328 60 min 인큐베이션.
도 5는 LTX-315 치료가 초미세구조적 변화를 야기한다는 것을 보여준다. 대조군 세포에 비교하여 60 분 동안 LTX-315로 처리된 A375 세포의 TEM 이미지. A&D: 미처리된 대조군 세포, B&E: 3,5 μM로 처리된 세포, C:&F 17 μM로 처리된 세포. 배율 10 000X A-C, 30 000 D-F, 기준자 5 μm.
도 6은 LTX-315가 미토콘드리아 막을 붕해하는 것을 보여준다. 대조군 세포에 비교하여 60 분 동안 LTX-315 (10 mg/ml)로 처리된 인간 A547 흑색종 세포의 TEM 이미지.
도 7은 LTX-315 치료 이후 세포외 ATP 수준을 보여준다: A375 세포는 상이한 농도에서 5 분 동안 LTX-315로 처리되었거나 제어된 조건하에 유지되었고, 상청액은 루시퍼라아제 생물발광에 의해 ATP 분비의 정량화를 위하여 분석되었다. 하나의 대표적인 실험에 대하여 정량적 데이터 (평균 +- S.D.)는 보고된다.
도 8은 상청액에서 LTX-315 방출 사이토크롬-C로 처리된 그 인간 흑색종 세포를 보여준다. 지정된 시점 (5, 15, 45 min) 후 A375의 LTX-315 치료후 상청액에서 사이토크롬-C 방출은 ELISA 검정에 의해 결정되었다.
도 9는 HMGB1이 LTX-315 치료후 상청액에서 방출되는 것을 보여준다. A375 인간 흑색종 세포는 35 μM LTX-315 (상단부) 또는 LTX-328 (하단부)로 처리되었고, 세포 용해물 (L) 및 상청액 (S)는 웨스턴 블랏으로 분석되었고, LTX-315-처리된 세포는 세포 용해물부터 세포 상청액까지 점진적인 전좌를 보여주었다. 대조군 세포는 배지 단독으로 처리되었고, 60 분후 전좌 없음을 보여주었다.
도 10은 LTX-315 유도된 세포사에서 그 ROS 생성을 보여준다. A375 세포는 15 분 동안 상이한 농도에서 LTX-315로 처리되었다. 펩타이드 치료후, 카복시-H2DCFDA는 샘플에 첨가되었고 형광은 형광 플레이트 리더로 분석되었다. 실험은, 평균 형광 +- S.D.를 나타내는 바로, 반복하여 수행되었다.
도 11은 작은 양친매성 β(2,2)-아미노산-유래된 항종양 분자 LTX-401 (Mwnet = 367.53)의 화학 구조를 보여준다.
도 12는 LTX-401이 B16F1 흑색종 세포에서 세포사를 빠르게 유도하는 것을 보여준다. LTX-401의 2개의 상이한 농도에서 짧은 인큐베이션후 세포 생존력의 결정은 지정된 시점 (5, 15, 30, 60, 90, 120 및 240 분)후 분석되었고, 이는 60 분의 인큐베이션후 감소된 생존력을 드러냈다. 데이터는 평균 ± 표준오차로서 각각의 시점에 대하여 나타난 3중으로 수행된 3개 실험을 대표한다.
도 13은 LTX-401 치료가 공포화로 초미세구조적 변화를 유도한다는 것을 보여준다. LTX-401 (108 mM)로 처리된 B16F1 세포의 대표적인 TEM 현미경사진. 미처리된 대조군 세포 (a, b)는 실험 종점 (60 분)까지만 무혈청 RPMI 1640에서 유지되었고, 양쪽 5 min (c, d) 및 60 min (e, f)에 대하여 처리된 세포와 비교되었다; 기준자 = a, c, e에 대하여 10 mm, b, d, f에 대하여 5 mm.
도 14는 LTX-401이 위험 신호의 방출을 유도한다는 것을 보여준다. (a) 웨스턴 블랏으로 결정된 바와 같이 LTX-401-처리된 세포의 상청액 속에 HMGB1의 방출. 세포 용해물 (L)로부터 배양 상청액 (S)까지 핵 단백질 HMGB1의 전좌는 LTX-401 (108 mM)로 30 분의 치료후 분명하였고, 전좌는 90 분의 인큐베이션후 절대적이었다. 대조군 세포는 240 분후 전좌를 보여주지 못했다. 실험은 3회 수행되었고, 이 도는 대표적인 블랏의 디지털 이미지이고; (b) B16F1 세포는 상이한 시점 (30, 60, 90, 120 및 240 분)에 대하여 LTX-401 (108 mM)로 처리된 다음 ELISA 검정을 이용하여 상청액내 사이토크롬 c의 양을 결정하였다. 결과는 평균 +/- SEM으로서 나타나고; (c) B16F1 세포는 지정된 시점 (10, 30, 60, 90 및 120 min)에 대하여 LTX-401 (54 mM)로 처리되었다. ATP 수준의 정량화는 루시퍼라아제 생물발광으로 수행되었고, 결과는 평균 +/- SEM으로서 나타난다.
도 15는 클론형성능의 다양한 수준을 가진 T 세포 모집단용 빈도 분포의 예를 보여준다. (A)는 0.05의 클론형성능을 가진 모집단의 분포 곡선을 보여준다. (B)는 0.32의 클론형성능을 가진 모집단의 분포 곡선을 보여준다.
도 16은 LTX-315로 치료 이후 종양에서 클론형성능 (A) 및 유핵의 세포당 T 세포의 수 (B)의 증가를 보여준다. 0.008의 p-값은 U 시험을 이용하여 계산되었다.
도 17은 LTX-315로 치료 이후 종양에서 T 세포 클론 카운트의 증가를 보여준다. 0.008의 p-값은 U 시험을 이용하여 계산되었다.
도 18은 LTX-315로 치료 이후 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)내 클론형성능의 약간의 증가를 보여준다. p-값 (0.15)은 p<0.05이면 유의미하지 않다.
도 19는 하나의 예 처리된 (도 19a) 및 미처리된 (도 19b) 마우스 대상체로부터 종양 (y-축)과 PBMCs (x-축) 사이 레퍼토리 비교를 보여준다. 흑색 점은, 종양에서 비교된 PBMCs에서 상당히 더 큰 존재도를 가졌던, 도 19a에서 표지된 하나의 특이점과 별도로, PBMCs에서 비교된 종양에서 상당히 더 큰 존재도를 갖는 클론을 대표한다. 회색 점은 종양 또는 PBMCs에 대하여 상당한 선호를 보여주지 않는 클론을 대표한다.
도 20은 하나의 추가 예 처리된 (도 20b) 및 미처리된 (도 20a) 마우스 대상체로부터 종양 조직 (y-축)과 PBMCs (x-축) 사이 레퍼토리 비교를 보여준다. 어두운 회색 점은 PBMCs에서 비교된 종양에서 상당히 더 큰 존재도를 갖는 클론을 대표하고, 밝은 회색 점은 종양 또는 PBMCs에 대하여 상당한 선호를 보여주지 못하는 클론을 대표하고 할로를 가진 어두운 회색 점은 종양에서 비교된 PBMCs에서 상당히 더 큰 존재도를 갖는 클론을 대표한다.
도 21은 LTX-315 치료가 B16 흑색종에 대해 면역 보호를 유도한다는 것을 보여준다. 비-처리된 대조군 동물내 종양 성장 (a)는 LTX-315 치료 (b) 및 (d)에 의해 이전에 치유된 동물에 비교되었다. 동물은 제1 종양 부위에 반대측 5 Х 104 생존가능한 B16F1 세포 (b)로 진피내로 또는 2 Х 105 생존가능한 B16F1 세포 (d)로 정맥내로 재-공격받았다. 진피내로 재-공격받은 동물의 생존 곡선 (c)는 로그-순위 (Mantel-Cox) 시험을 이용하여 분석되었고 상당히 상이한 것으로 나타났다 (p < 0.0001). 폐 종양 병소의 수는 짝짓기되지 않은 t 시험을 이용하여 분석되었고 비-처리된 대조군 동물 (d)로 LT X-315에 의해 이전에 치유된 정맥내로 재-공격받은 동물을 비교하는 경우 상당히 상이한 것으로 나타났다 (p = 0.003). 디지털 이미지는 상이한 그룹 (e)로부터 대표적인 폐를 설명한다. LT X-315에 의해 이전에 치유된 동물의 종양 병소는 항-CD3 (f)로 면역표지됨으로써 보여진 바와 같이 대조군 동물에 비교하여 CD3+ T 세포에 의해 고도로 침윤되었다.
도 22는 LTX-315가 종양 층에서 세포독성, CD4+ 종양 침윤 T 림프구 (CD4+ TILs)를 현저하게 증가시켰다는 것을 보여준다. (PBS에 대하여) LTX-315후 신선한 MCA205 육종 7 일의 해리후 살아있는 세포의 게이트에서 인터페론 γ 양성 (IFNγ+) CD4+ TILs (A), 인터류킨 17 양성 (IL-17+) CD4+ TILs (B) 및 이중-양성 IFNγ+ IL-17+ CD4+ TILs (C)의 유세포측정 결정. 각각의 점은 하나의 마우스의 데이터를 대표하고; 적어도 2개의 실험은 각각의 그래프에서 모여졌다. 스튜던트 t-시험: * = P<0.05 및 *** = P<0.001.
도 23은 LTX-315가 종양 층에서 세포독성, CD8+ TILs를 현저하게 증가시켰다는 것을 보여준다. (PBS에 대하여) LTX-315후 신선한 MCA205 육종 7 일의 해리후 살아있는 세포의 게이트에서 IFNγ+ CD8+ TILs (A), 종양 괴사 인자 α 양성 (TNFα+) CD8+ TILs (B) 및 이중-양성 IFNγ+ TNFα+ CD8+ TILs (C)의 유세포측정 결정. 각각의 점은 하나의 마우스의 데이터를 대표하고; 적어도 2개의 실험은 각각의 그래프에서 모여졌다. 스튜던트 t-시험: * = P<0.05.
도 24는 C57BL/6 면역적격 마우스에서 진화하는 20-25mm2 확립된 MCA205 육종내 LTX-315의 살종양 활성에서 CD4 및 CD8a 분자를 표적하는 항체 고갈의 효과를 보여준다. 주사된 그와 같은 특이적 항체 (GK1.5 및 53-6.72, 200μg / 마우스) 또 아이소타입 대조군 mAbs의 존재 또는 부재하에 종양 성장 동력학. 300μg의 LTX-315의 3개 종양내 매일 연속적인 주사는 그 다음 수행되었다. 그룹 당 6 또는 7 마우스를 포함하는 2개 중에서 대표적인 실험은 보여진다. 스튜던트 t-시험: * = P<0.05 및 NS = 유의미하지 않음.
도 25는 (흑색 점으로 보여진 바와 같이) 전이성 흑색종 환자에서 LTX-315 투여후 (T 림프구를 나타내는) CD3+ 양성 세포 및 (세포독성 T 림프구를 나타내는) CD8+ 양성 세포의 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색 및 침윤을 보여준다.
도 26은 (흑색 점으로 보여진 바와 같이) 악성 흑색종 환자에서 LTX-315 투여후 (세포독성 T 림프구를 나타내는) CD8+ 양성 세포의 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색 및 침윤을 보여준다.
도 27은 (흑색 화살표로 보여진 바와 같이) 근상피종 환자에서 LTX-315 투여후 (T 림프구를 나타내는) CD3+ 양성 세포 및 (세포독성 T 림프구를 나타내는) CD8+ 양성 세포의 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색 및 침윤을 보여준다.
도 28은 (흑색 점으로 보여진 바와 같이) 유방 암종 환자에서 LTX-315 투여후 (T 림프구를 나타내는) CD3+ 양성 세포 및 (세포독성 T 림프구를 나타내는) CD8+ 양성 세포의 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색 및 침윤을 보여준다.
도 29는 (흑색 점으로 보여진 바와 같이) 데스모이드 종양 환자에서 LTX-315 투여후 (T 림프구를 나타내는) CD3+ 양성 세포 및 (세포독성 T 림프구를 나타내는) CD8+ 양성 세포의 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색 및 침윤을 보여준다.
도 30은 침윤 림프구가 LTX-315 치료후 종양 속에 동원되는 것을 보여준다. LTX-315 치료후 종양내 세포 조성물의 변형 및 세포 침윤을 연구하는 실험의 스케줄은 도 30a에서 보여진다. 랫트는 일 ÷2에 한쪽 옆구리에서 200,000 랫트 형질전환된 간엽 줄기 세포-유래된 육종 모델 세포 (rTMSCs)로 그리고 일 0에 반대편 옆구리에서 20,000 rTMSCs로 피하로 접종되었다. 미리 확립된 종양을 가진 랫트 (n=8)은 3 후속 일 동안 매일 1 mg LTX-315의 병소내 주사가 제공되었다. 대조군 그룹 (n=6)에서 종양-보유 랫트는 염수 주사를 병렬적으로 받았다. 단일-세포 현탁액은 LTX-315 치료후 1주 동안 상이한 시점에서 신선한 종양 조직으로부터 제조되었다. 도 30b는 대조군 그룹 (흑색 막대)로부터 병변과 비교된 처리된 랫트의 1차 처리된 병변 (밝은 회색 막대), 2차 병변 (어두운 회색 막대)에서 TIL 서브셋의 백분율을 보여준다. 그래프는 평균 ± SD를 보여준다. 스튜던트t 시험으로 *P < 0.5, **P < 0.1.
도 31은 DAPI로 대조염색된 및 CD3 또는 CD8 (갈색)용 염색된 미처리된 대조군에 대하여 처리된 랫트로부터 1차 및 2차 종양의 대표적인 이미지를 보여준다.
실시예 1
LTX-315는 골육종 세포의 세포질 막을 붕해시킨다
1 물질 및 방법
세포질 막 붕해는 FORVEILLE S. 등, Cell Cycle 2015, 14: 3506-12에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
1.1 화학물질 및 세포 배양액
Lytix Biopharma (Tromsø, Norway)에 의해 제공되었던 LTX-315 (K-K-W-W-K-K-W-Dip-K-NH2)를 예외로 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 화학물질인, 배지 및 세포 배양용 보충물은 Gibco-Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)로부터 수득되었고; 플라스틱용기는 Greiner Bio-One (Monroe, CA, USA)로부터 수득되었다.
인간 골육종 U2OS 세포는 10% 소태아 혈청 (FCS), 및 10 MM HEPES 버퍼로 보충된 Glutamax-함유 DMEM 배지에서 배양되었다. 세포는 5% CO2 분위기하에 가습된 인큐베이터에서 37℃에 성장되었다.
1.2 투과 전자 현미경검사
초미세구조적 연구를 위하여, 인간 골육종 U2OS 세포는 1시간 동안 1.6 % 글루타르알데하이드 (0.1 M 포스페이트 버퍼내 v/v)에서 고정되었고, 스크레이핑에 의해 수집되었고, 원심분리되었고 펠렛은 사후-고정된 1 % 오스뮴 테트록사이드 (0.1 M 포스페이트 버퍼내 w/v)이었다. 단계적인 에탄올 시리즈를 통한 탈수 이후, 세포는 EponTM 812에서 포매되었고 초박 절편은 표준 아세트산우라닐 및 시트르산납으로 염색되었다. 이미지는 Tecnai 12 전자 현미경 (FEI, Eindhoven, the Netherlands)를 이용하여 취득되었다.
2 결과
LTX-315의 투여후, 다수의 세포는 세포질 막의 붕해와 괴저성 형태학을 채택하였다 (도 2).
실시예 2
LTX-315는 미토콘드리아로 내재화하고 상호작용한다
이 연구에서, 우리는 인간 흑색종 세포에서 LTX-315의 살종양 효과를 조사하였다. 펩타이드는 내재화하였고 미토콘드리아와 관련하여 보여졌고, 궁극적으로 용해 세포사로 이어졌다. LTX-315 펩타이드는 2단계 작용 방식을 통해 종양내 주사로 고체 종양을 처리한다: 첫째는 종양 자체의 붕괴이고, 한편 둘째는, 재발 및 전이에 대해 후속적인 면역 보호를 유도할 수 있는, 사망하는 종양 세포로부터 방출된 손상-관련된 분자성 패턴 분자 (DAMPs)이다.
1 물질 및 방법
연구는 EIKE L-V 등, Oncotarget 2015, 6:34910-23에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
1.1 시약
LTX-315 및 LTX-328 (K-A-Q-Dip-Q-K-Q-A-W-NH2)는 요청시 Bachem AG (Bubendorf, Switzerland) 및 Innovagen (Lund, Sweden), 각각에 의해 만들어졌다. LTX-315 퍼시픽 블루 및 LTX-328 퍼시픽 블루는 요청시 Innovagen (Lund, Sweden) Norud (Tromsø, Norway), 각각으로부터 구매되었다.
1.2 세포 배양
A375 세포주 A375 (ECACC, 88113005)는 환자 물질로부터 유래된 인간 악성 흑색종이고, Public Health England (PHE Culture Collections, Porton Down, Salisbury,UK)로부터 구매되었다. 세포는, 항생제 (완전 배지)로서가 아닌, 10% FBS 및 1% L-글루타민으로 보충된 고 글루코스 4.5% DMEM내 단일층 배양액으로서 유지되었다. 세포주는 가습된 5% CO2 분위기에서 37℃에 성장되었고, MycoAlert (Lonza)로 마이코플라스마의 존재에 대하여 규칙적으로 시험되었다.
1.3 공초점 현미경검사
비표지된 세포를 가진 살아있는 세포 이미지형성 - A375 세포는 밤새 부착하게 되었던 25 μg/ml 인간 파이브로넥틴 (Sigma)으로 사전코팅된 Nunc Lab-Tec 8-웰 챔버화된 커버 글라스 (Sigma)내 완전 배지에서 10,000 세포/웰로 씨딩되었다. 세포는 무혈청 RPMI로 2회 세정되었고, RPMI에 용해된 펩타이드로 처리되었고, 63X/1.2W 대물렌즈를 가진, Bright on a Leica TCS SP5 공초점 현미경을 이용하여 조사되었다. 현미경은 CO2 및 온도 제어를 가진 인큐베이션 챔버로 구비되었다.
고정된 세포, 미토트랙커 - 세포는 살아있는 세포 이미지형성에 관하여 씨딩되었고, 펩타이드 처리에 앞서 15 분 동안 100 nm에 Mitotracker CMH2XROS (Invitrogen)으로 처리되었다. 세포는, 음성 대조군 무혈청 RPMI 단독으로, 17μM LTX-315로 처리되었다. 60 min의 인큐베이션후, 세포는 Zeiss 현미경을 이용하여 분석되었다.
모든 공초점 이미지형성 실험은 유사한 결과로 적어도 2회 후속적으로 수행되었다.
고정된 세포, 형광-표지된 펩타이드 - 하위융합성 A375 세포는 상기에서와 같이 8,000 세포/웰에 씨딩되었고, 제조자의 프로토콜에 따라 플러스 형질감염 시약 (Invitrogen)과 리포펙타민 LTX를 이용하여 제2 일에서 형질감염되었다. 미토콘드리아는 pDsRed2-Mito를 이용하여 표지되었고, 핵은 GFP-Histon2B 플라스미드 (Imaging Platform, University of Tromsø)를 이용하여 표지되었다. 형질감염 다음 날, 세포는 무혈청 RPMI로 2회 세정되었고, 상이한 농도 및 인큐베이션 기간에서 LTX-315 퍼시픽 블루 또는 LTX-328 퍼시픽 블루로 처리되었다. LTX-315 PB는 MTT 검정에 의해 결정된 경우 비표지된 LTX-315와 유사한 세포독성 프로파일을 나타냈다. 대조군 세포는 비표지된 LTX-315로 그리고 또한 무혈청 RPMI 단독으로 처리되었다. 인큐베이션후, 세포는 PBS내 4% 파라포름알데하이드로 고정되었고, 웰들은 Prolong Gold antifade (Invitrogen)로 피복되었다. 세포는, 693, 1.2 W 대물렌즈를 가진, Leica TCS SP5 공초점 현미경의 이용에 의해 추가로 분석되었다. 퍼시픽 블루, GFP 및 Ds 레드는, 488 및 561 레이저를 가진, UV를 이용하여 여기되었고, 형광 채널은 다음과 같은 통과 대역을 이용하여 순차적으로 검출되었다: UV: 420-480nm (감쇠하면서), 488: 501-550nm 및 561: 576-676nm.
1.4 TEM 전자 현미경검사
A375 세포는 6-웰 플레이트에서 1x105 세포 / 웰로 씨딩되었고 배양액에서 막 구조를 최적화하기 위해 3 일 동안 성장하게 되었고, 배지는 제2 일에서 변화되었다. 세포는 무혈청 RPMI에서 2회 세정된 다음, 음성 대조군으로서 무혈청 RPMI로, 5, 10 및 25 μg/ml에서 무혈청 RPMI에 용해된 LTX-315로 처리되었다. 세포는 그 다음 2회 PBS로 세정된 다음 pH 7.8에 Hepes 버퍼에서 4% 포름알데하이드 및 1% 글루테랄알데하이드로 4℃에 24 시간 동안 고착되었다. 탈수 및 사후-고착 프로토콜은 5% 완충된 탄닌산에서 인큐베이션 및 1% 오스뮴-환원된 페로시아나이드에서 인큐베이션을 포함하였다. 초박 절편은 제조되었고, 아세트산우라닐 (5%) 및 레이놀즈 시트르산납은 염색 및 콘트라스팅에 사용되었다. 샘플은 JEOL JEM-1010 투과 전자 현미경에서 검사되었고, 이미지는 Olympus Morada 측면-실장된 TEM CCD 카메라 (Olympus 소프트 이미지형성 용액, GmbH, Germany)로 취득되었다.
1.5 반응성 산소 종 (ROS)의 형광 측정
DCFDA 세포 반응성 산소 종 검출 검정 키트는 abcam®로부터 구매되었고, A375 세포는 DCFDA 검정에 앞서 37℃ 16 시간에서 인큐베이션된 20,000 세포 / 웰을 가진 96-웰 코스타 흑색 맑은 최하부 플레이트에서 씨딩되었다. 세포는 100 μL/웰의 사전-가온된 PBS로 1회 세정되었고, 45 min 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에 키트와 함께 공급된 버퍼 용액에서 20 μM의 DCFDA로 인큐베이션되었고, 그 다음 100 μL/웰의 버퍼 용액으로 재차 세정되었다. 세포는 그 다음 30 min 동안 17 μM의 농도에서 버퍼 용액에 용해된 100 μL/웰 LTX-315 펩타이드로 자극되었고, 처리되지 않은 세포는 음성 대조군으로서 사용되었다. 형광 강도는 FLUOstar Galaxy 플레이트 리더상에서 485nm의 여기 파장 및 530 nm의 방사 파장에서 결정되었다.
1.6 고 이동도-그룹 박스-1 (HMGB1)의 방출
A375 세포는 완전 배지에서 6-웰 플레이트내 3x105 세포/웰로 씨딩되었고, 밤새 부착하게 되었다. 세포는 35 μM에서 LTX-315 또는 LTX-328로 처리되었고, 상이한 시점 (5, 10, 15, 30, 60 min)에 대하여 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션되었고, 음성 대조군은 무혈청 RPMI-1650이었다. 상청액 (S)는 수집되었고 5 분 동안 1,400g에서 원심분리되었고, 세포 용해물 (L)은 2회 PBS로 세정후 수확되었고 그 다음 4X 샘플 버퍼 (Invitrogen, number), 0.1 M DTT (Sigma number) 및 물을 이용하여 후속적으로 용해되었다. 상청액은 Amicon Ultra 50K 원심 필터 (Millipore UFC505024)를 이용하여 농축되었고, 세포 용해물은 초음파처리되었다. 양쪽 상청액 및 용해물은 비등되었고 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에서 분해되었고, 그 다음 폴리빈딜린 디플루오라이드 (PVDF) 막 (Millipore)에 전기 전달되었다. 막은 5% 밀크에서 차단되었고 HMGB1 항체 (토끼, 다클론성, abcam ab 18256)으로 인큐베이션되었고; 막은 그 다음 TBST로 몇 번 린스되었고, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP)-접합된 2차 항체 (abcam ab6721)로 인큐베이션되었고, TBST로 재차 린스되었고 그 다음 WB 루미놀 시약 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany)를 이용하여 개발되었다.
1.7 사이토크롬-C의 방출
A375 세포는 HMGB1 연구와 같이 씨딩되었고, 상이한 시점 (5, 15, 45)에 대하여 35 μM로 처리되었다. 상청액은 HMGB1 연구와 같이 수집 및 농축되었고, 상청액으로부터 샘플은 제조자의 설명에 따라 4.5 시간 고형 형태 사이토크롬 C- Elisa 키트 (R&D Systems, USA, #DCTC0)를 이용하여 분석되었다. 그 직후에, 50% 희석된 샘플은 분석되었고 광학 밀도는 450nm에서 마이크로플레이트 판독기 세트를 이용하여 결정되었고, 이러한 판독은 그 다음 540nm에서 판독으로부터 공제되었다. 표준 곡선은 분석된 샘플의 각각의 세트에 대하여 생성되었다. 샘플은 4 병렬로 실시되었고, 상청액 속에 방출된 사이토크롬-c는 미처리된 세포의 상청액에서 사이토크롬-c의 수준에 대해 배수로서 표현되었다.
1.8 ATP의 방출
LTX-315-처리된 A375 세포의 상청액은 Enliten ATP 루시퍼라아제 검정 키트 (Promega, USA)를 이용하여 분석되었다. 세포는 그 다음 ROS 검정과 같이 씨딩되었고, LTX-315로 상이한 인큐베이션 시간, 1 내지 15 분에서 2개 병렬로 처리되었고, 이것은 그 다음 3회 수행되었다. 음성 대조군은 무혈청 배지 단독에 노출된 미처리된 A375 세포이었다. 샘플은 1:50 및 1:100에서 희석되었고, 제조자의 프로토콜에 따라 Luminoscan RT 발광분석기로 분석되었다.
1.9 통계적인 분석
모든 데이터는, 평균 ± SD로서 표현되었던, 적어도 2개의 병렬로 적어도 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 사이토크롬-C 방출 및 ATP 방출 데이터는 1원 ANOVA 및 다중 비교 시험을 이용하여 비교되었고, 우리는 통계적 유의도를 나타내기 위해 P-값 <0.05를 고려하였다.
2 결과
2.1 LTX-315는 미토콘드리아를 내재화하고 표적한다
세포 내에서 펩타이드의 내재화 및 운명을 조사하기 위해, LTX-315는 퍼시픽 블루로 표지되었고 3 mM 및 1.5 mM, 각각의 농도에서 세포로 인큐베이션되었다. 표지된 LTX-315는 혈장 막을 빠르게 침투하였고 1.5 mM에서, 펩타이드는 30 분의 인큐베이션후 미토콘드리아 주변 축적을 보여주었지만 세포 핵에서 검출되지 않았다 (도 3). 표지된 비-용해 모의-서열 펩타이드 LTX-328은 시험된 임의의 농도 또는 인큐베이션 시간에서 임의의 내재화를 입증하지 못했다 (도 4).
2.2 LTX-315는 세포에서 초미세-구조적 변화를 유도한다
우리는 투과 전자 현미경검사 (TEM) 수행에 의해 처리된 세포에서 초미세구조적 변화를 추가로 평가하였고, 여기에서 A375 세포는 직접적으로 배지에서 또는 배지 단독에서 용해된 어느 한쪽 펩타이드로 처리되었다. 60 분 동안 저 농도 (3.5 μM)의 LTX-315 펩타이드로 처리된 세포의 상당수는 공포화, 뿐만 아니라 미토콘드리아 형태학의 일부 변경을 보여주었다 (도 5). 미토콘드리아는 덜 전자 치밀한 것으로 보였고, 또한 추가로 떨어져서 놓인 또는 전혀 가시적이지 않은 크리스테로, 어느 정도의 재구성을 나타냈다. 이들 샘플내 괴저성 세포의 수는 5% 미만이다. 이들 저 농도에서, 세포질의 공포화는 관측되었다. 이들 샘플에서 또 다른 공통 발견은, 균질한 물질을 함유하는 단일 막 층으로 라이닝된, 주변에 배치된 공포이었다 (도 5B). 세포가 더 높은 농도 (17 μM)로 60 min 동안 처리된 경우, 이들 중 대략 40%는 혈장 막 완전성의 손실을 가진 괴저성 형태학을 표시하였다 (도 5C&E). 여전히 온전하였던 세포는, 명확히 영향받은 미토콘드리아로, 미세융모를 가진 정상 외관부터 둥근 외관까지, 대단한 불균질성을 표시하였다. 이러한 고 농도에서, 조사된 세포의 단지 4%가 공포화를 표시하였고, 염색질 응축은 시험된 임의의 펩타이드 농도에서 이러한 물질에 가시적이지 않았다. 이들 결과는 LTX-315가 용해 작용 방식으로 종양 세포를 사멸시키고, 한편 더 낮은 농도가 세포를 초미세구조 변화, 예컨대 공포화 및 변경된 미토콘드리아 형태학을 겪게 한다는 것을 입증한다. 또한, 세포자멸적 세포사를 시사하는 상당한 형태적 변화는 관측되지 않았다.
별개의 실험에서, 인간 A547 세포 (난소 흑색종 세포주)에 10mg/ml로 LTX-315의 노출이 미토콘드리아 막의 붕해를 유발시켰다 (도 6).
2.3 LTX-315 치료는 세포외 ATP 방출을 유발시킨다
DAMPs는 세포 손상 동안 세포내 공급원으로부터 방출되는 분자이다. DAMPs는 항원 제시 세포 (APCs)에서 패턴 인식 수용체 (PRRs)에 결합을 통해 면역 반응을 개시 및 영속시킬 수 있다. 통상적으로 공지된 DAMPs 중에는 ATP, HMGB1, 칼레티큘린, 사이토크롬 C, 미토콘드리아 DNA 및 반응성 산소 종 (ROS)가 있다. 우리는 다음으로 ATP가 LTX-315로 처리된 세포로부터 상청액 속에 방출되었는지를 조사하기 원했다. 그러므로, 처리된 및 비-처리된 세포로부터 상청액은 루시퍼라아제 검출 검정을 이용하여 분석되었다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, ATP는 LTX-315로 치료의 5 분후 만큼 일찍 상청액에서 검출되었고, 방출은 농도-의존적이었다.
2.4 LTX-315 치료는 상청액에서 사이토크롬-C 방출을 유도한다
LTX-315-처리된 세포가 배지 속에 사이토크롬-C를 방출시켰는지를 평가하기 위해, A375 세포는 상이한 시점 (5, 15, 45 min)에서 35 μM에 LTX-315로 처리되었다. 상청액은 ELISA 검정을 이용하여 후속적으로 분석되었다. 35 μM 값으로 처리된 세포는 미처리된 대조군 세포에 비교된 상청액에서 사이토크롬-C를 3배 더 가졌다. 사이토크롬-C에서 증가는 치료의 단지 5 분후 검출되었고, 펩타이드 치료, 각각의 15 및 45 분후 증가가 또한 있었다 (도 8).
2.5 LTX-315 치료는 세포외 HMGB1 방출을 유발시킨다
HMGB1은 비-히스톤, 염색질-결합 핵 단백질이다. 일단 괴저성 세포로부터 수동적으로 방출되면, HMGB1은 몇 개의 면역잠재화 효과 중에서 수지상 세포의 기능성 성숙, 사이토카인 자극 및 화학주성을 유발시킬 수 있다.
HMGB1은 세포 핵에서 정상적으로 발견되고, 배양 배지 (상청액)에서가 아니어도, 건강한 세포의 세포 용해물에서 기대될 것이다. LTX-315-처리된 세포로부터 HMGB1의 방출을 평가하기 위해, 우리는 세포 상청액 속에 세포 용해물 내에서 핵 구획으로부터 전좌 및 자유 HMGB1을 측정하였다.
LTX-315- 및 LTX-328-처리된 A375 흑색종 세포의 양쪽 세포 용해물 및 세포 상청액은 웨스턴 블랏을 이용하여 분석되었다. 세포는, 모의 서열 펩타이드 LTX-328 또는 무혈청 배지 단독으로 처리된 세포에서가 아닌, LTX-315-처리된 흑색종 세포에서 검출된 상청액까지 세포 용해물로부터 점진적인 전좌로, 어느 한쪽 LTX-315 또는 LTX-328의 35 μM로 처리되었다 (도 9).
2.6 LTX-315 치료는 A375 흑색종 세포에서 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 야기한다
LTX-315 치료 이후 ROS 생성은 CH2DCFDA 형광 검정에 의해 측정되었다. ROS의 상당한 양은 LTX-315로 15 분의 인큐베이션후 생성되었고, ROS 수준은 농도-의존적이었다 (도 10).
3 논의
형광 분자 퍼시픽 블루로 표지된 LTX-315는 A375 흑색종 세포로 인큐베이션후 몇분 이내에 내재화되었고, 세포질에서 분포화되었다 (도 3). 저 농도에서, 미토콘드리아 주변 펩타이드의 축적은 분명하였고, 반면에 더 높은 농도에서 펩타이드는 세포질 내에서 더욱 확산되었고 세포 막에 더욱 가까운 원형 구조로 축적되었다. 펩타이드가 미토콘드리아 막을 공격하면, 미토콘드리아 막 잠재력의 감소 또는 심지어 총 붕괴는 기대될 것이다. 막 잠재적인-의존적 미토콘드리아 염색 Mitotracker CMXh2ROS를 가진 세포의 공초점 이미지형성은 펩타이드 치료후 단시간 미토콘드리아 신호의 손실을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음). 신호의 손실은 미토콘드리아와 펩타이드 상호작용이, 미토콘드리아의 가장 중요한 세포 기능에 결정적인, 미토콘드리아 막 잠재력의 손실을 야기한다는 것을 보여준다. 변경된 미토콘드리아 형태학은 TEM으로 또한 실증되었다. 60 분 동안 LTX-315로 처리된 세포는 크리스테의 변경된 조직화를 가진 덜 전자 치밀한 미토콘드리아, 뿐만 아니라 미처리된 세포에 비교된 미토콘드리아 내에서 공포화를 가졌다 (도 6). 더욱이, 공포화는 3.5 μM의 LTX-315로 처리된 세포의 대략 20%에서 분명하였다. 미토콘드리아가 기능이상인 경우, 자유 산소 라디칼 (ROS)는 형성될 수 있고, 형광 검정 이용에 의해 우리는 펩타이드 치료후 몇 분 내에 ROS 형성을 실증하였다 (도 10).
이 연구에서, 우리는 LTX-315 펩타이드로 치료가 치료후 A375 흑색종 세포내 ROS 수준의 증가를 야기한다는 것을 입증한다. 펩타이드 치료 이후 ROS의 이들 더 높은 수준에 대하여 하나의 설명은 펩타이드가 세포에 진입하고 미토콘드리아를 표적하고, 기능이상 미토콘드리아가 그 다음 ROS를 방출한다는 것일 수 있다. ELISA 검정을 통해, 우리는 치료의 단지 몇 분후 펩타이드-처리된 세포의 상청액에서 사이토크롬-C의 방출을 검출하였다 (도 8). 사이토크롬-C는 외부 미토콘드리아 막이 혼란되는 경우 사이토졸 속으로 그리고 막간 공간으로부터 방출된 미토콘드리아 단백질이고, 세포자멸적 프로테아제 활성 인자-1 (Apaf-1)에 결합에 의해 또한 세포자멸사로 세포사를 결국 유발시키는 세포자멸적 캐스케이드의 일부이다. 하지만, 사이토크롬-C가 세포외 공간에서 발견되면, 전-염증 매개체로서 작용하는 것, 따라서 NF-kB 활성화 그리고 사이토카인 및 케모카인 생산의 유도가 보고되고 있다. 세포 구획부터 세포외 구획까지 HMGB1의 전이는 웨스턴 블랏을 이용하여 검출되었다 (도 9). 핵 단백질 HMBG1이 세포외 유체 속으로 방출되는 경우, DAMP로서 기능하고, 양쪽 PRR TLRs 및 RAGE 수용체에 결합할 수 있고; 이들의 활성화는 수많은 염증 반응 예컨대 전-염증 사이토카인의 전사로 이어질 수 있다. 우리는 또한 DC에서 퓨린성 P2RX7 수용체 활성화에 의해 DAMP로서 기능하는 세포외로 제시된 그리고, 펩타이드 인큐베이션후 상청액에서 방출된 ATP를 검출하였다 (도 7). 이러한 수용체는 ATP에 결합후 작은 양이온성 및 나중에 더 큰 분자에 대하여 개방하는 기공으로서 기능할 뿐만 아니라, 그것의 활성화는 또한 전-염증 사이토카인 IL-1β의 가공 및 방출을 야기시킨다.
요약하면, 우리의 데이터는 LTX-315가, 혈장 막에서 직접적인 공격에 의해, 뿐만 아니라 혈장 막 완전성의 즉각적인 손실을 야기시키기에 너무 낮은 농도에서 펩타이드의 내재화후 생명 유지 관련 세포내 소기관에 손상의 결과로서 암 세포에서 용해 세포사를 유도하는 것을 시사한다. 우리는 펩타이드 치료가 몇 개의 DAMPs 예컨대 CytC, ATP, HMGB1 및 ROS의 방출을 야기한다는 것을 입증한다. DAMPs는 몇 개의 방식으로 손상된 세포의 세포 완전성에 영향을 줄 수 있지만, 소위 면역원성 세포사와 또한 관련된다. 강력한 면역 자극 분자 (DAMPs) 예컨대 ATP, CytC 및 HMGB1과 함께, 세포외 구획 속에 종양-특이적 항원의 방출은 강한 면역 반응을 제공할 수 있다. 차례로, 이들 인자는 적응성 면역계의 DCs 및 다른 부속 세포의 성숙 및 활성화로 이어질 것이다.
실시예 3
LTX-401은 흑색종 세포에서 DAMP 방출을 유도한다
본 연구에서 우리는 암 세포주에서 세포사를 유도하기 위한 아미노산 유도체 LTX-401의 능력, 뿐만 아니라 쥣과 흑색종 모델에서 퇴행을 유도하기 위한 수용력을 검사하였다. 시험관내 작용 방식 연구는, 처리된 세포내 절충된 리소좀 및 엄청난 세포질 공포화에 의해 선행된 위험-관련된 분자성 패턴 분자의 방출 및 용해 세포사를 드러냈다. 쥣과 흑색종 모델의 용도는 LTX-401의 종양내 주사로 처리된 다수의 동물이 완전한 및 오래 지속되는 차도를 보여주었다는 것을 실증하였다. 종합하면, 이들 결과는 고체 종양의 치료용 면역치료적 제제로서 LTX-401의 잠재력을 입증한다.
1 물질 및 방법
1.1 시약
LTX-401 (Mwnet = 367.53)은 요청시 Synthetica AS (Oslo, Norway)에 의해 합성되었다. 화학 구조는 도 11에서 보여진다.
1.2 세포 배양액
JM1, 랫트 간세포 암종, HEPG2 및 BEL7402, 양쪽 인간 간세포 암종은 Dr. Pal-Dag Line, Director, Department of Transplantation Medicine, Oslo University Hospital에 의해 친절하게 제공되었다. B16F1 (ATCC, CRL-6323), 쥣과 피부 악성 흑색종, MDA-MB-435S (HTB-129), 유방 전이에서 비롯되는 인간 악성 흑색종, Malme-3M (HTB-64), 폐 전이에서 유래된 인간 악성 흑색종, MRC-5 (ATCC, CCL-171), 정상 인간 폐 섬유아세포, SK-N-AS (ATCC, CRL-2137), 골수 전이에서 유래된 인간 신경교세포종 세포주, HT-29 (ATCC, HTB-38), 인간 결장직장 선암종 및 HUV-EC-C (ATCC, CRL-1730), 인간 혈관 내피 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Rockville, MD, USA)로부터 모두 구매되었다. HaCat, 인간 케라틴생성세포 세포주는 Dr. Ingvild Pettersen, Department of Host Microbe Interactions, University Tromsø에 의해 친절하게 제공되었다. A375, 인간 기원의 악성 흑색종 세포주는 Public Health England (PHE Culture Conditions, Porton, Down, Salisbury, UK)로부터 구매되었다. JM1, A375, BEL7402, HEPG2 및 B16F1은 DMEM (고 글루코스)로 구성되는 배양 배지에서 모두 유지되었고, 한편 SK-N-AS, HT-29 및 MDA-MB-435S는 2mM L-글루타민 및 중탄산나트륨을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. Malme-3M은, 4 mM L-글루타민 및 20% FBS (우태 혈청)을 함유하는, RPMI-1640에서 배양되었다. 마지막으로, 3개 비-악성 세포주, HUV-EC-C, MRC-5 및 HaCat는, 각각, 기초 배지 및 성장 인자를 함유하는, EGM-2 BulletKit (Lonza, MA), 2mM L-글루타민 및 1% 비-필수 아미노산을 또한 함유하는 MEM (정상 글루코스) 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 DMEM (정상 글루코스)를 이용하여 배양되었다. 모든 배지는, 용액내 2% FBS의 최종 농도를 산출하기 위해 10 ml FBS의 분취량으로 전달되는, EGM-2 BulletKit를 예외로, 10% FBS로 (달리 특정되지 않으면) 보충되었다.
1.3 시험관내 세포독성, MTT 검정
MTT 검정은 양쪽 암 및 비-악성 세포주의 선택에 대해 LTX-401의 시험관내 세포독성을 조사하는데 이용되었다. 사전-배양된 세포는 1 x 104 - 1.5 x 104 세포/웰 사이 밀도에서 씨딩되었고, 실험은 Camilio K.A., 등, Cancer Immunol. Immunother, 2014, 63: 601-13에서 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는, 각각 3중 웰들로, 3개 실험의 평균을 이용하여 계산되었고, 50% 억제성 농도 (IC50)으로서 표현되었다.
1.4 치사 동력학
LTX-401의 치사 동력학은, 54 mM 및 108 mM, 각각에 상응하는 양쪽 2 x IC50 4h 및 4 x IC50 4h 값을 이용하여, B16F1 흑색종 세포에 대해 연구되었다. 세포는 MTT 검정을 위하여 이전에 기재된 바와 같이 씨딩되었고, LTX-401 용액으로 5, 15, 30, 60, 90, 120 및 240 분 동안 인큐베이션되었다. 세포는 인큐베이션후 100 ml의 무혈청 RPMI-1640으로 1회 세정되었고, 추가의 2 h 동안 (무혈청 RPMI-1640에서 희석된) 10% MTT 용액에서 추가로 인큐베이션되었다.
1.5 TEM 전자 현미경검사
B16F1 세포는 2 mL의 배양 배지의 용적으로 1 x 104 세포의 밀도에 35 mm 멸균된 조직 배양 접시에서 씨딩되었고 37℃, >95% 습도 및 5% CO2 조건에 세포 인큐베이터에서 부착 및 성장하게 되었다. 배양된 세포가 허용가능한 합류점 (~80-90%)를 달성하였던 경우, 이들은 상이한 시점 (5, 15, 30 및 60 분)에 대하여 LTX-401 (108 mM)의 4 x IC50 4h 값으로 인큐베이션되었고 0.05% 말라카이트 녹색 옥살레이트 (Sigma), 0.5% 글루타르알데하이드 (GA, Electron Microscopy Sciences) 및 4% 포름알데하이드 (FA, Electron Microscopy Sciences)를 함유하는 PHEM 완충된 (0.1 M) 용액에서 후속적으로 고정되었다. 말라카이트 그린은 샘플 가공과 통상적으로 관련된 지질 추출을 감소시키기 위해 1차 고착에 첨가제로서 더 자주 사용되고 있다. 샘플은 즉시 장입되었고, 수일 내지 수시간 샘플 제조를 감소시키기 때문에, 종래의 벤치 프로토콜보다 유리한 것으로 고려된 새로 도입된 방법인, PELCO Biowave Pro Laboratory Microwave (Ted Pella, Inc.)를 이용하여 일괄적으로 가공되었다. 모든 마이크로웨이브 단계에 대하여, 샘플은 23℃에서 50℃ 컷-아웃 온도로 마이크로웨이브처리되었다. 양쪽 말라카이트 그린/GA/FA 및 오스뮴-환원된 페로시아나이드 (0.8% K3Fe(CN)6/1% OsO4) 고착 단계는, 진공으로, 2 분 온, 2 분 오프의 "파워 온/오프" 사이클 (100 W)에서 실시되었다. 샘플은 각각의 단계 (40 초 동안 250 W에서 2개 벤치 린스 및 2개 최종 린스) 사이 0.1 M PHEM 버퍼로 4회 린스된 다음, 진공으로, 1 분 온, 1 분 오프의 "파워 온/오프" 사이클 (150 W)하에 1% 탄닌산 (Electron Microscopy Sciences, PA, USA) 및 1% 수성 아세트산우라닐 (Electron Microscopy Sciences, PA, USA)로 염색되어 있었다. 샘플은, 250 W (진공 오프)에 물에서 2회 마이크로웨이브처리된 것에 더하여, 각각의 염색 절차 사이 이전에 기재된 바와 같이 린스되었다. 샘플의 탈수는, 50% Epon 수지 (AGAR, DDSA, MNA 및 DNP-30)으로 일괄적으로 액침되기 전 각각의 등급 (진공 오프)에서 40 초 동안 250 W에 마이크로웨이브처리하는, 단계적인 에탄올 시리즈 (25%, 50%, 70%, 90% 및 100%)를 거쳐 발생하였고, (진공 사이클로; 20 초 온, 20 초 오프) 250 W에서 2개 최종 침윤 단계, 3 분 각각에 대하여 100%로 증가하였다. 샘플은 그 다음 밤새 60℃에서 중합되었다. 초박 절편 (70 nm)는 제조되었고 표준 포름바르, 탄소-안정화된 구리 그리드상에 배치되었다. 다음으로, 샘플은 JEOL JEM-1010 투과 전자 현미경에서 검사되었고, 이미지는 Olympus Morada 측면-실장된 TEM CCD 카메라 (Olympus 소프트 이미지형성 용액, GmbH, Germany)로 취득되었다.
1.6 고 이동도 그룹 박스 1 (HMGB1)의 방출
B16F1 세포는 완전 배지에서 6-웰 플레이트내 2 x105 세포/웰의 밀도로 씨딩되었고, 밤새 부착하게 되었다. 세포는 108 mM의 LTX-401 (4 x IC50 4h)로 처리되었고, 상이한 시점 (10, 30, 60, 90 및 120 분)에 대하여 37℃ (>95% 습도 및 5% CO2)에서 인큐베이션되었다. 무혈청 RPMI 1640은 음성 대조군으로서 사용되었고, 상청액 (S)는 수집되었고 1,400g에서 5분 동안 원심분리된 다음 Ultracel-50 막 (Milipore, Norway)를 가진 Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter 유닛을 이용하여 상향-농축되었다. 세포 용해물 (L)은 2 mL의 무혈청 RPMI-1640으로 세정후 수확되었고 2x NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (Invitrogen, Norway), 1x NuPAGE 샘플 환원제 (Invitrogen, Norway) 및 50% 멸균된 H20를 함유하는 용해 버퍼 (mastermix)에 적용되었다. 양쪽 상청액 및 용해물은 70℃에서 10분 동안 비등되었고 NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gels (Millipore, Norway)상에 분해된 다음 폴리빈딜린 디플루오라이드 (PVDF) 막 (Millipore, Norway)에 전기전달되었다. 막은 TBS-T내 5% 비-지방 건조 밀크를 이용하여 1시간 동안 차단되었고 그 다음 4℃에서 밤새 HMGB1 항체 (HMGB1에 다클론성 토끼 - ChIP Grade, Abcam, UK), 이어서 홀스래디쉬 페록시다아제- (HRP) 접합된 2차 항체 (염소 다클론성 항-토끼 IgG, Abcam, UK)로 추가의 2 h 동안 실온에서 혼성화된 다음 WB 루미놀 시약 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany)를 이용하여 개발되었고, ImageQuant LAS 4000 및 ImageQuant 소프트웨어 (GE Healthcare)를 이용하여 이미지화/스캐닝되었다.
1.7 사이토크롬 c의 방출
B16F1 세포는 MTT 검정을 위하여 이전에 상기 기재된 바와 같이 96-웰 배양판상에 플레이팅되었다. 세포는 지정된 시점 (30, 60, 90, 120 및 240 분)에 대하여 108 mM (4 x IC50 4h)로 처리되었고, 한편 대조군 세포는 실험 종점까지만 무혈청 RPMI-1640에서 보존되었다. 상청액은 수집되었고 무혈청 RPMI 1640에서 1/5 희석된 다음, 제조자의 지침에 따라, Rat/Mouse Cytochrome c Quantikine ELISA 키트 (R&D 시스템, USA)를 이용하여 평가되었다. 사이토크롬 c의 농도는 제공된 표준 곡선에서 보간 값에 의해 계산되었다.
1.8 ATP의 방출
B16F1 세포는 MTT 검정을 위하여 이전에 기재된 바와 같이 씨딩되었고, 상이한 시점 (10, 30, 60, 90 및 120 분)에 대하여 LTX-401 (54 mM)의 2 x IC50 4h 값으로 처리되었다. 무혈청 RPMI 1640 처리된 세포는 음성 및 공시험 대조군, 각각으로서 기능하였다. ATP의 세포외 수준은 루시페린계 ENLITEN ATP 검정 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 실험의 마지막에 측정되었고, 여기에서 ATP-유도된 화학발광은 발광 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Luminoskan®, Finland)에서 기록되었고, 상대 광 단위 (RLU)로서 표현되었다.
1.9 LysoTracker
유세포측정: B16F1 세포는 6-웰 플레이트에서 씨딩되었고 밤새 부착하게 되었다. 세포는 그 다음, 마지막 5 분 지나서 첨가된 40 nM LysoTracker DND-26 (Invitrogen)으로, 60 분 동안 1 x IC50 4h의 LTX-401 (27 mM)로 처리되었다. 미처리된 세포는 대조군으로서 사용되었다. 세포는 트립신화되었고 FACS Calibur 흐름 세포측정기에서 조사되었고, 결과는 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)를 이용하여 가공되었다. PI는 절충된 혈장 막으로 세포를 금지시키기 위한 일부 실험에서 이용되었다.
공초점 현미경검사: B16F1 세포는 8-웰 플레이트 (Nunc)에서 1 x 104 세포/웰로 씨딩되었고 밤새 부착하게 되었다. 다음으로, 세포는 60 분 동안 27 mM의 LTX-401로 처리되었고 5 분 동안 LysoTracker DND-26으로 그리고 핵 염색을 위하여 Hoecsht33342로 표지되었다. 세포는 제어된 온도 및 분위기로 Zeiss 공초점 현미경에서 즉시 조사되었다.
1.10 통계적인 분석
결과는 적어도 2개의 독립적인 실험의 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM) 또는 표준 편차 (SD)로서 표현된다. MTT 검정은 3 병렬로 2회 수행되었고 사이토크롬 c 검정은 2 병렬로 2회 수행되었고, 한편 ATP 검정은 2 병렬로 3회 수행되었다. 사이토크롬 c 방출- 및 ATP 방출 데이터는 1원 ANOVA 및 다중 비교 시험을 이용하여 비교되었고, 우리는 통계적으로 유의미한 것으로 P-값 ≤0.05를 고려하였다.
2 결과
2.1 LTX-401은 세포사를 빠르게 유도한다
이 연구에서, LTX-401은 시험관내 몇 개의 종양 세포주의 생존력을 효과적으로 감소시켰다 (데이터 도시되지 않음). LTX-401은 인간 악성 흑색종 세포주 MDA-MB-435S (13.5 mM)에 대해 최고 세포독성 활성을 표시하였고, 인간 간세포 암종 세포주 HEPG2 (35.4 mM)에 대해 최소 활성이었다. 잔존 세포주에 대하여, LTX-401은, 19-32 mM의 범위 내에서 약간 다양한, 유사한 IC50 값을 나타냈다.
동력학 실험은 B16 흑색종 세포에 대해 LTX-401의 세포독성 활성의 시간 경과를 결정하기 위해 수행되었다. LTX-401의 2 x IC50 4h 및 4 x IC50 4h를 나타내는 2개의 상이한 농도, 즉 54 mM 및 108 mM, 각각은 용량-의존적 효과를 평가하는데 사용되었다. 초기 파일럿 연구에 의해 드러난 바와 같이, 이들 2개 농도는, 다수의 시험관내 실험에 대하여, 그리고 특히 DAMPs의 방출을 연구하는 경우, 그와 같은 양식을 유도하는데 실패하였던 더 낮은 농도로서 또한 이용되었다.
LTX-401 (108 mM)은, 15 min후 50%의 치사 비, 이어서 치료의 시작 2 시간후 거의 100% 세포사를 가진, 급속 치사 동력학을 나타냈다. 그에 반해서, LTX-401의 54 mM로 인큐베이션된 세포는, 2 시간후 50% 세포 생존으로, 세포 생존력의 점진적인 억제를 따랐다 (도 12).
2.2 LTX-401 치료는 흑색종 세포에서 초미세구조적 변화를 야기한다
LTX-401의 세포독성 활성을 기초하는 작용 방식을 추가로 조사하기 위해, B16F1 세포는 5 및 60 min, 각각 동안 LTX-401 (108 mM)의 4 x IC50 4h로 인큐베이션되었다. 미처리된 세포는 대조군으로서 작용하였고, 실험 종점 (60 min)때까지 무혈청 RPMI 1640에서 인큐베이션되었다. 인큐베이션후, 모든 세포는 고정되었고 TEM 연구를 위하여 제조되었다. 미처리된 B16F1 세포의 TEM 이미지는 혈장 막상의 빈번한 미융모-유사 돌출을 특징으로 하는 굴곡 표면을 드러냈다 (도 13a, b). 세포질은 몇 개의 전자 치밀 미토콘드리아, 및 가시적으로 부드러운 ER 및 골지 장치로 구성되었다 (도 13a, b). 다수의 LTX-401 처리된 세포는 5 min후 그들의 표면 형태학을 손실하였고, 다수의 세포는 세포질의 약간 공포화를 제외하고 상당한 변경이 없었다 (도 13c). 60 분의 인큐베이션후, 처리된 배양액은, 양쪽 심하게 공포화된 및 큰 비-공포화된 세포를 포함하는, 세포의 불균질 모집단을 실증하였다 (도 13e). 세포의 큰 분율은, 혈장 막 완전성의 손실 및 세포 구성요소의 누출에 의해 명확히 보여진 바와 같이, 괴저성이었다 (도 13e, f). 염색질 구조는, 수많은 세포에서 약간 응축되었긴 하지만, LTX-401 치료에 의해 다소 영향을 받지 않았다. 더욱이, 더 높은 배율은 대조군 (도 13g)에 비교된 LTX-401 처리된 세포 (도 13h)의 다수의 미토콘드리아에서 상당한 초미세구조적 변화를 드러내지 않았다. 60 분 동안 처리된 세포 (도 13h)는, 어느 정도의 미토콘드리아 팽윤이라 할지라도, 온전한 내부 및 외부 미토콘드리아 막을 표시하였다. 전반적으로, 이들 관찰은 LTX-401이, 세포 팽윤에 의해 동반된, 용해 작용 방식, 미토콘드리아 팽윤 및 세포질의 공포화를 사멸시킨다는 것을 입증한다.
2.3 LTX-401 치료는 흑색종 세포에서 DAMPs의 방출을 초래한다
다음으로, 우리는 DAMPs의 방출을 유도하는 LTX-401의 능력을 특성화하기 원했다. HMGB1은 비-히스톤 핵 단백질이고, 세포외로 방출된 경우 toll-유사 수용체 (TLRs) 또는 진전된 당화반응 최종 산물용 수용체 (RAGE)에 결합에 의해 DAMP로서 작용할 수 있다. 세포 배양 상청액 속에 B16F1 세포로부터 HMGB1의 방출은 웨스턴 블랏 분석에 의해 평가되었다. HMGB1의 전좌는, 30 min의 치료후 발생하는 HMGB1의 방출로, 검출되었다. 비-처리된 대조군 세포는, 용해물 내에서 단백질의 완전한 구금에 의해 보여진 바와 같이, 상청액 속에 HMGB1의 방출을 표시하지 않았다 (도 14a).
사이토크롬 c는 미토콘드리아-유래된 DAMP로 간주되고, 세포외 사이토크롬 c는 전염증 사이토카인의 방출 및 NF-kB 활성화를 유도하는 것으로 보고되고 있다. LTX-401이 LTX-401-처리된 B16F1 세포로부터 사이토크롬 c의 방출을 유도할 수 있는지를 연구하기 위해, ELISA 검정은 치료후 세포 배양 배지에서 사이토크롬 c의 양을 측정하는데 이용되었다. 정량적 분석은 120 min의 치료후 LTX-401 (108 mM)의 4 x IC50 4h 값으로 LTX-401 치료에 따른 상청액에서 사이토크롬 c의 존재를 실증하였다 (도 14b). 사이토크롬 c의 방출은 점진적인 증가를 경시적으로 따랐고, 실험 종점에서 대략 40 ng/ml의 피크에 도달하였다 (도 14b).
ATP는, 종래의 화학요법에 굴복하는 암 세포를 포함하는, 사망하는 및/또는 스트레스 받은 세포로부터 방출된 경우 면역원성 특성을 갖는다고 보고된다. LTX-401이 B16F1 세포로부터 ATP의 방출을 유도할 수 있는지를 조사하기 위해, 루시페린-루시퍼라아제계 반응 검정은 이용되었다. ATP의 세포외 농도는 120 min을 향한 점진적인 증가와 함께 치료 개시후 60 min 빠르게 상승하였다 (도 14c).
2.4 흑색종 세포에서 리소좀 완전성의 LTX-401-유도된 손실로 치료
다음으로, 우리는 LTX-401이 리소좀 완전성에서 임의의 변화를 야기시켰는지를 조사하기 원했다. LTX-401로 치료는, 유세포측정 및 공초점 현미경검사로 보여진 바와 같이, 호산성 염료 LysoTracker DND-26으로부터 신호의 손실을 초래하였다. 이러한 염료는 산성 소기관 예컨대 리소좀 및 멜라로솜을 축적시킨다. 유사한 결과가 림프종 세포에서 또한 수득되었음에 따라, 효과는 세포-유형 특이적이지 않은 것처럼 보였다 (데이터 도시되지 않음). 양쪽 유세포측정 및 공초점 현미경검사에 의해 실증된 바와 같이, 27 mM의 LTX-401은 60 분의 인큐베이션후 B16F1 흑색종 세포에서 감소된 신호를 유도하였다.
3 논의
면역감시를 회피하는 암 세포의 능력은 암의 부상하는 특질로서 최근에 인정되고 있다. 면역원성 세포사 (ICD)는 면역-강화 분자 일명 위험-관련된 분자성 패턴 분자 (DAMPs)의 방출로서 정의되고, 따라서 암 세포에 대한 면역 반응 확립에서 핵심이다. ICD를 유도하는 일부 세포증식억제성 화합물의 능력으로 인해, 면역계가 종래의 치료에 대한 반응으로서 암 박멸에서 중요한 역할을 한다는 것이 또한 밝혀졌다. ICD는 항암 요법의 장기간 성공용 결정인자로서 추가로 제안되고 있다. 종양용해 요법은, 암 세포가 DAMPs의 후속적인 방출로 원 위치에서 용해되는, 고형 종양에 대한 신규한 및 유망한 치료 접근법이다.
최근에 설계된 아미노산 유도체 LTX-401은 항암 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서, 우리는 LTX-401이, B16 흑색종을 포함하는, 암 세포주의 범위에 대해 항암 활성을 발휘한다는 것을 입증한다. 우리는 소 락토페리신 (LfcinB) 유도체에서 구조-활성 관계 연구 (SAR)에 기반하여 α-나선 코일 구조를 채택하기 위한 잠재력을 가진 더 짧은 펩타이드를 이전에 설계하였다. 이들 펩타이드는 양쪽 시험관내 및 생체내, 자연 발생 LfcinB (25-mer)보다 더 효과적으로 암 세포를 사멸시킨다는 것으로 밝혀졌다. SAR 연구는 방향족 절편, 및 따라서 전반적인 더 높은 소수성의 크기가 펩타이드의 항암 활성을 강력하게 할 중요한 인자인 것을 드러냈다 (도 11).
동력학 실험은 경시적으로 B16F1 흑색종 세포에 대한 LTX-401의 상이한 농도의 영향을 연구하기 위해 수행되었다. 동력학 연구에서 사용된 농도는 2 x IC50 4h 및 4 x IC50 4h 값을 표시하였다. 세포 생존은 4 x IC50 4h 값 (108 mM) 이용의 90-120 min후 최소로 감소되었다 (도 12). 반대로, 통상적으로 사용된 화학치료제는 상당한 항암 효과를 발휘하기 위해 더 긴 인큐베이션 기간을 요구한다.
LTX-401 처리된 암 세포의 형태적 변화를 연구하기 위해, 투과 전자 현미경검사 (TEM) 연구는 수행되었다. 이들 연구는 표면 형태학의 초기 손실 및 처리된 B16F1 세포의 세포질의 약간의 공포화를 드러냈다 (도 13c, d). 세포 크기의 증가는 LTX-401 치료의 시작 직후 또한 분명하였다. (60 min까지) 처리된 세포의 인큐베이션 기간을 연장시킴으로써, TEM 이미지는 증가된 공포화를 실증하였고, 세포가 세포 막 완전성의 손실 및 세포외 환경 속에 세포내 내용물의 후속적인 누출을 초래하였던 용해 작용 방식에 의해 사멸되었던 것을 드러냈다 (도 13e, f).
세포질 물질을 함유하는 공포의 형성은 세포가 상이한 소기관상의 LTX-401에 의해 발휘된 급성 세포내 스트레스에 반응하는 과도기적 상태를 구성할 수 있다. 미토콘드리아는 치료후 5 분 정상 형태학을 표시하였고, 한편 실험 종점 (60 min)에서 팽윤의 증거를 보여주었다. B16 세포주로부터 유래된 세포주는 양쪽 스핀들-형상화된 및 상피성-유사 세포의 불균질 모집단으로 구성된다고 공지된다. 이들 상이한 표현형은 가능하게는, 처리된 세포의 불균질 형태학을 부분적으로 설명할 수 있는, LTX-401을 포함하는, 항암 서브스턴스로 치료에 상이하게 반응할 수 있다.
면역원성 세포사 (ICD)의 개념이 도입되었던 경우, 암 세포사의 방식이, 방사선요법 및 몇 개의 통상적으로 사용된 화학치료 레지멘을 포함하는, 선택된 항암 요법의 성공 및 결과 결정에서 중요한 역할을 한다는 것이 인식되었다. 강력한 항-종양 면역 반응의 활성화는, 표면-노출된 칼레티큘린 (CRT), 분비된 아데노신 삼인산 (ATP) 및 수동적으로 방출된 고 이동도 그룹 박스-1 단백질 (HMGB1)을 포함하는, 사망하는 및/또는 스트레스 받은 종양 세포로부터 DAMPs의 방출에서 정점을 이루는 일련의 세포 및 생화학적 사건에 의존하는 것으로 나타났다. 이들 3 분자는 ICD의 특질로 고려된다. 그들의 각각의 수용체와 상호작용하는 경우, 종양 항원과 함께, DAMPs는, 활성 종양-특이적 CD8+ T 세포에 배출 림프절로 나중에 돌아올 수 있는, 종양 층 속에 수지상 세포 (DCs)의 동원 및 활성화를 조율할 수 있다. 본 연구에서, 시험관내 LTX-401로 처리된 B16F1 흑색종 세포는 루시퍼라아제 검정 및 웨스턴 블랏 분석, 각각을 이용하여 ATP 및 HMGB1의 방출용으로 선별되었다. 이들 실험은 LTX-401 치료가 B16F1 세포에서 HMGB1 및 ATP의 방출을 유도하였다는 것을 드러냈다 (도 14a, c). 상청액 속에 세포내 구획으로부터 HMGB1의 전좌는 LTX-401로 처리된 B16F1 세포에서 분명하였다. 후-세포자멸적 및/또는 괴저성 세포로부터 HMGB1의 세포외 방출은 염증성 백혈구의 인력 및 전-염증 사이토카인 예컨대 TNF-α 및 IL-6의 자극에 의한 항종양형성성 환경을 지속 및 확대시킬 수 있다. 또한, HMGB1은 DCs의 성숙에서 중추적 역할을 하고 미접촉 T 세포에 종양 항원의 제시 및 가공 양쪽을 선호하고, 이로써 타고난 및 적응성 항-종양 면역 반응 사이 연결을 확립시킨다.
ATP가 종양 세포에 의해 세포외 환경 속으로 방출 또는 분비되는 경우, 종양 층 속에 면역 세포의 동원을 용이하게 하는데 돕기 위해 퓨린성 수용체에서 작용한다. 또한, DCs상의 P2X7 수용체에 결합하는 경우, ATP는 NLRP3 인플라마솜의 어셈블리를 자극시키고, 종양-특이적 CD8+ T 세포를 생산하는 IFN-γ의 프라이밍에 요구된 사이토카인인, IL-1β의 생산 및 방출을 궁극적으로 초래하는 일련의 다운스트림 사건을 개시한다. ATP는 실험 기간 동안 증가 방식으로 B16F1로부터 방출되었다.
미토콘드리아 DAMPs (mtDAMPs)는 ATP, 미토콘드리아 DNA, 포르밀 펩타이드, 산화된 카디올리핀 및 사이토크롬 c를 포함한다. 이들 분자는, 미토콘드리아가 박테리아에 놀라운 유사성을 가짐에 따라, 강력한 면역 활성제인 것으로 고려된다. 사이토크롬 c는 세포자멸적 세포사 동안 초기 사건 중 하나를 마크하고, 여기에서 사이토졸 속으로 미토콘드리아 막간 공간으로부터 그것의 방출은 아폽토솜의 어셈블리 및 프로카스파제-9의 활성화를 제어하고, 따라서 세포내 위험 신호처럼 작용한다. 사이토크롬 c의 방출은 괴사에 굴복하는 세포로부터 발생한다고 또한 보고된다. 더욱이, 세포외 사이토크롬 c는 NF-kB의 활성화 및 다른 전염증 사이토카인 및 케모카인의 방출을 포함한다. 사이토크롬 c의 상승된 혈청 수준은 SIRS 환자에서 관측되고 있고 좋지 못한 생존에 연결된다. 사이토크롬 c ELISA 검정은 mtDAMPs를 방출시키는 LTX-401의 능력 평가를 돕기 위해 수행되었다. LTX-401로 치료는 시험관내 B16F1 흑색종 세포로부터 사이토크롬 c의 세포외 방출을 유도하는 것으로 나타났다 (참조 도 14b). 흥미롭게도, TEM 현미경사진이 60 min후 B16F1 세포의 용해를 확인하였던 동안, 사이토크롬 c의 방출은 120 min후까지 대조군과 상당히 상이하지 않았고, 이것은 미토콘드리아가 여전히 어느 정도 온전하고 세포 용해후 잠시 동안 그것의 사이토크롬 c를 계속해서 보유한다는 것을 나타낼 수 있다.
전자 현미경검사 연구는 B16F1 세포내 미토콘드리아가 LTX-401 치료에 의해 초기에 영향받지 않는다는 언급을 지지하고, 사이토크롬 c 방출의 타이밍은 미토콘드리아의 용해가 세포의 용해 다음인 것을 암시할 수 있다. Ausbaucher 등에 의한 이전의 작용 방식 연구는 이들 발견을 지지하고, 여기에서 LTX-401은 TMRE에 의해 측정된 바와 같이 미토콘드리아 막 잠재력을 포함하지 않았다.
하지만, LTX-401은 양친매성 구조를 가진 작은 분자이고, 따라서 혈장 막을 우회하는 잠재력을 소유하고, 후속적으로 세포내 구조를 표적화한다. 우리는 따라서 관여된 다른 잠재적인 세포내 표적을 조사하기를 원했다. 산성 소기관에서 LTX-401 치료의 효과는, 심지어 총 형태적 변화가 발생하기 전, LTX-401 치료가 호산성 염료 LysoTracker의 형광을 상당히 변경시켰다는 것을 실증하는 살아있는 세포의 공초점 이미지형성과 함께, 리소좀 염료 LysoTracker DND-26의 사용에 의해 평가되었다. 이러한 관찰은 동일한 농도 및 인큐베이션 시간으로 유세포측정 분석을 이용하여 확인되었다 (데이터 도시되지 않음). 형광의 손실은 세포에서 산성 소기관이 치료 때문에 절충되는 것을 나타낸다. 그렇기는 하지만, B16F1 세포는 또한, 산성 리소좀-관련된 소기관인, 멜라로솜을 갖는다. 결과적으로, 우리는 비-멜라닌세포 세포주 (A20, 쥣과 림프종)에서 실험을 반복하였고, 유사한 결과를 달성하였다 (데이터 도시되지 않음). 이들 발견은 리소좀이 LTX-401의 세포내 표적 중에 있다는 것을 시사한다.
면역치료적 전략은 종양 세포에 대한 특이적 T-세포 반응을 탑재하는 것을 목표로 한다. 흑색종용 종양내 면역요법은, 흥미진진한 결과를 보고하는 몇 개의 전임상 및 임상시험을 가진, 유망한 접근법이다. 우리의 연구에서, 우리는 작은 용해 아미노-산 유도체 LTX-401의 항암 효능 및 작용 방식을 조사하였다. LTX-401로 처리된 흑색종 세포는, DAMPs 예컨대 ATP, HMGB1 및 사이토크롬 c의 방출에 의해 보여진 바와 같이, 면역원성 세포사의 피쳐를 실증하였다. 더욱이, LTX-401은 고도로 공격성 및 저조하게 면역원성 쥣과 B16 흑색종의 완전한 퇴행을 유도하였다. 결론적으로, 우리의 결과는 LTX-401의 잠재력을 유망한 면역치료적 제제로서 입증한다.
실시예 4
LTX-315는 쥣과 흑색종 모델에서 T 세포 클론형성능을 증가시킨다
1. 물질 및 방법
이 연구는 Adaptive BiotechnologiesTM에 의한 "immunoSEQTM" T 세포 수용체 (TCR) 레퍼토리 특성화 플랫폼을 이용하여 수행되었다. 플랫폼은 신규한 멀티플렉스 PCR1을 고도로 최적화된 프라이머 세트 및 TCR 유전자를 배타적으로 표적하는 심도 서열분석 기술과 조합시킨다. immunoSEQ 플랫폼은 연구자가 적응성 면역계를 예외적인 깊이 및 특이성으로 분석하는 것을 가능하게 한다.
대부분의 TCR 서열은 개체에서 단 하나의 또는 몇몇 세포에서 발견될 것이다. 면역학적 메모리의 형성 동안, 하지만, 세포는 클론 팽창을 겪는다. 결과적으로, 팽창 및 메모리 세포로 전환후, 과거 병원체에 대한 수용체 서열은 수 천의 세포에서 존재할 수 있다. 수용체 서열의 큰 잠재적인 다양성은 대개의 경우, 뉴클레오타이드-동일한 서열이 클론 팽창을 제외하고 세포 사이 공유되지 않는 것을 의미한다.
관측된 서열에 기여하는 투입 세포의 정확한 수를 정량화함으로써, immunoSEQ 검정은 연구자가 고도로 팽창된 클론 및 또한 드문 (특유의) 세포의 피쳐를 분석하게 한다.
1.1 종양 치료
쥣과 B16 흑색종 세포는 10 마우스에서 수확되었고, 세정되었고 진피내로 주사되었다. 종양 주사 8 일후, 펩타이드 치료는 5 마우스에서 1회 또는 2회 LTX-315 (1.0 mg LTX-315/50 μl 염수)의 단일 종양내 주사를 이용하여 개시되었다. 염수 단독의 비히클 대조군 (멸균된 H2O내 0.9 % NaCl)은 다른 5 마우스에 투여되었다. 동물은 그 다음 일 15에서 안락사되었다.
1.2 TCR 레퍼토리 특성화
종양 조직 (10mg) 및 전혈 (150-200ml)은 TCR 레퍼토리 특성화 분석용 각각의 마우스로부터 취득되었다. 혈액 샘플은 주변에서 면역 레퍼토리에 관한 정보를 제공하고, 한편 종양 샘플은 레퍼토리의 집중적인 면을 제공한다.
서열 분석은 조직 샘플에 대하여 조사-수준 해상도에서 그리고 혈액 샘플에 대하여 심도-수준 해상도에서 Adaptive BiotechnologiesTM에 의해 수행되었다.
1.3 데이터 분석
클론형성능은 클론 빈도 분포의 형상 측정에 의해 모노- 또는 올리고클론성 팽창의 정도를 정량화한다. 값은 0 내지 1 범위이고, 여기에서 1 접근하는 값은 거의 단클론성 모집단을 나타낸다. 도 15는 0.05 (A) 및 0.32 (B)의 클론형성능을 가진 모집단의 예 분포 곡선을 제공한다.
클론형성능은 다음과 같은 식을 이용하여 계산된다:
다양성
Figure pct00004
클론형성능
Figure pct00005
p 값은 Mann-Whitney U 시험을 이용하여 계산되었다.
2 결과
결과의 요약은 아래 표 2에서 보여진다.
Figure pct00006
강력한 데이터세트는 혈액에서 검출된 100,000 초과 분자로 생산되었다. 유의미한 증가는 클론형성능 (도 16A)이고, T 세포의 수 / 유핵의 세포 (도 16B) 및 T 세포 클론 카운트 (도 17)은 대조군 (p<0.05)에 비교된 LTX-315로 치료 이후 종양에서 보여졌다. 클론형성능에서 유의미한 증가가 대조군 (도 18, p<0.05)에 비교된 치료 이후 혈액에서 보여지지 않았어도, 도 19 및 20은, 치료 이후, T 세포 클론이 종양 조직에 비교된 주변에서 더욱 풍부하다는 것을 보여준다. 이러한 관찰은 도 20에서 더욱 두드러진다.
실시예 5
LTX-315는 보호성 면역 반응을 유도한다
LTX-315 치료에 의해 치유된 동물은 양쪽 진피내로 및 정맥내로 살아있는 B16 종양 세포로 재-공격에 대해 보호되었다. 함께, 데이터는 LTX-315로 종양내 치료가 국부 종양 제어 이어서 보호성 면역 반응을 제공할 수 있고 신규한 면역치료적 제제로서 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다.
1 물질 및 방법
연구는 CAMILIO KA 등, Cancer Immunol. Immunother. 2014, 63: 601-13에 기재된 바와 같이 수행되었다.
1.1 시약
LTX-315 및 LTX-328 (K-A-Q-Dip-Q-K-Q-A-W-NH2)는 요청시 Bachem AG (Bubendorf, Switzerland) 및 Innovagen (Lund, Sweden), 각각으로부터 구매되었다. 다카바진 (D2390), 테모졸로마이드 (T2577) 및 cis디암민백금 이염화물 (P4394)는 모두 Sigma-Aldrich로부터 구매되었다.
1.2 세포주
B16F1 (AT CC, CRL-6323), C57BL/6 쥣과 기원의 피부 악성 흑색종, MRC-5 (AT CC, CCL-171), 인간 배아 폐 섬유아세포 세포주 및 HUV-EC-C (AT CC, CRL-1730), 인간 배꼽 정맥 내피 세포주는 모두 American Type Culture 수집 (AT CC-LGC Standards, Rockville, MD, USA)로부터 구매되었다. A375 (ECACC, 88113005)는 Public Health England (PHE Culture Collections, Porton Down, Salisbury, UK)로부터 구매된 환자 물질로부터 유래된 인간 악성 흑색종이다. B16F1 및 A375 세포는 DMEM (고 글루코스)에서 배양되었고 MRC-5 세포는 2 mM I-글루타민 (모두) 및 1 % 비-필수적인 아미노산 (A375 단독)을 함유하는 MEM (정상 글루코스)에서 배양되었다. 1차 표피 멜라닌세포 (AT CC, PCS-200-013)은 성인 멜라닌세포 성장 키트 (ATCC, PCS-200-042)로 보충된 진피 기초 배지 (ATCC, PCS-200-030)에서 배양되었다. HUV-EC-C는 Lonza로부터 EGM-2 BulletKit를 이용하여 배양되었고, 모든 성장 배지는 항생제가 없었고 10 % FBS로 보충되었다 (무혈청 1차 멜라닌세포 예외). 세포 배양물은 37 ℃에서 5 % CO2 및 >95 % 습도의 가습된 분위기에서 유지되었고 양쪽 마이코플라스마 및 다른 병원체 (Rapid-MAPTM-27, Taconic, Europa) 또는 마이코플라스마 단독 어느 한쪽에 대하여 시험되었다.
1.3 동물
암컷 C57BL/6 야생형 마우스, 5-6 주령은 영국, 찰스 리버로부터 수득되었다. 모든 마우스는 지역 및 유럽 윤리 위원회 지침에 따라 무병원체 동물 설비에서 케이지내 하우징되었다.
1.4 종양 치료
종양 세포는 C57BL/6 마우스 (마우스당 5 Х 104 B16F1 세포 /50 μl RPMI-1640)에서 수확되었고, RPMI-1640에서 세정되었고 복부의 우측에 진피내로 (i.d.) 주사되었다. 촉지가능한 종양 (20-30 mm2)은 3 연속 일 동안 1일 1회 염수 (1.0 mg 펩타이드/50 μl 염수)에 용해된 LTX-315 또는 LTX-328의 단일 용량으로 i.t. 주사되었고, 비히클 대조군은 염수 단독 (멸균된 H2O내 0.9 % NaCl)이었다. 종양 크기는 전자 캘리퍼스를 이용하여 측정되었고 타원의 면적 [(최대 치수/2) Х (최소 치수/2) Х ㅠ]으로서 표현되었다. 동물은 그 다음 수직 종양 치수의 산물이 130 mm2를 달성한 경우 또는 종양 궤양화가 발생한 경우 안락사되었다.
1.5 2차 종양 공격
LTX-315 치료후 종양의 완전한 퇴행 (CR)을 가진 동물은 이들이 LTX-315에 의해 치유된 4-5 주 후 복부의 좌측 편 (제1 종양 부위의 반대측)에 제2 i.d. 종양 세포 공격 (5 Х 104 B16F1 세포)가 제공되었다. i.d. 종양 재-공격을 생존한 동물은 꼬리 정맥에 정맥내로 (i.v.) 제2 종양 재공격 (2 Х 105 세포)가 나중에 제공되었다. 폐는 i.v. 재-공격후 일 19에서 수확되었다. 모든 마우스는 종양 크기 및 생존에 대하여 모니터링되었다.
1.6 통계적인 분석
모든 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 나타내고 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 오차 (SEM)으로서 표현된다. 동물 생존 곡선 (카플란-마이어 플롯)은 로그-순위 (Mantel-Cox) 시험을 이용하여 비교되었다. 우리는 통계적 유의도를 나타내기 위해 p 값 ≤0.05를 고려하였다.
2 결과
LTX-315로 치료가 적응성 면역 반응을 유도할 수 있는지를 검사하기 위해, 비-처리된 대조군 동물 (n = 6)과 함께, 치유된 동물 (n = 25)는 CR이 획득된 4-5 주후 제1 종양 부위의 복부 반대측에서 5 Х 104 생존가능한 종양 세포 i.d.로 재-공격되었다. i.d. 종양 재-공격 이후 CR을 달성하는 동물은 나중에 다시 i.v. 재-공격되었다. LTX-315에 의해 치유된 다수의 동물은 성장 억제를 보여주었고, 종양 성장은 25 동물 중 15에서 부재이었고, 한편 모든 대조군 동물은 i.d. 재-공격의 후속적인 종양을 발생시켰다 (도 21c). LTX-315 i.t. 주사 (n = 7)에 의해 이전에 치유된 동물은, 비-처리된 대조군 동물 (n = 7)에 비교하여, i.v. 재-공격 이후 B16 흑색종에 대해 전신 면역 보호를 보여주었다 (도 21d, e). LTX-315-치유된 동물 (평균 # 종양 병소 = 15.86)은 비-처리된 대조군 동물 (평균 # 종양 병소 = 123.3)에 비교하여 폐 종양 병소의 상당히 더 낮은 수를 표시하였다. 추가로, 조직학적 시험은 LTX-315에 의해 이전에 치유된 동물의 폐 종양 병소가, 비-처리된 대조군 동물의 덜 침윤된 폐 종양 병소에 비교하여, CD3+ T 세포에 의해 상당히 더 침윤되었다는 것을 드러냈다 (도 21f).
특허 공보 WO 2007/107748에서 나타난 바와 같이, 유사한 적응성 면역력 반응은 용해 펩타이드 LfcinB (N2N-FKCRRWQWRMKKL갭ITCVRRAF-COOH), 모델 28 (H2N-KAAKKAAKAbipKKAAKbipKKAA-COOH), D 및 L 형태로 모델 39 (H2N-WKKWdipKKWK-COOH) 및 C12 (H2N-KAAKKAbipKAAKAbipKKAA-COOH)로 투여후 관측되었다. Bip = 바이페닐알라닌.
3 논의
생체내 LTX-315의 면역-조절 특성이 장기간 보호성 면역 반응으로 이어졌는지를 조사하기 위해, 동물은 살아있는 종양 세포로 재-공격되었다. 모든 이전에 치유된 동물은 상당한 종양 성장 억제를 실증하였고 종양 섭취는 i.d. 생존가능한 세포 제공된 동물의 60 %에서 관측되지 않았다 (도 21a-c). i.d. 재-공격을 생존한 동물은 실험적 폐 전이 모델에서 암에 대해 가능한 오래 지속되는 전신 보호 및 그것의 효과를 검사하기 위해 LTX-315 치료 9 개월 후 i.v. 생존가능한 B16 흑색종 세포로 재-공격되었다. i.v. 재-공격된 모든 동물은, 항-CD3으로 면역표지화에 의해 보여진 바와 같이 (도 21f), 재-공격된 폐 종양 병소 속에 침윤 CD3+ T 세포의 양에서 증가에 더하여 비-처리된 대조군 동물에 비교하여 B16 흑색종에 대해 전신 면역 보호를 실증하였다 (도 21d, e). 이것은 LTX-315가, T 세포-매개된 항종양 면역력의 지속 및 따라서 종양의 재발에 대해 그리고 폐 종양 병소에 대해 장기간 보호로, 전신 항종양 면역 반응을 유도하였다는 것을 나타낸다. LTX-315의 기전은 막-유도된 용해 및 DAMPs의 세포외 방출 (HMGB1)을 통해 B16 흑색종에 대해 장기간, 특이적 세포 면역력을 유도함으로써 되는 것으로 생각된다. 종합하여, 시험관내 및 생체내 우리 관찰은 LTX-315의 i.t. 투여가 종양 세포의 혈장 막에서 펩타이드의 직접적인 분열성 효과에 의해 개시된 광범위한 종양 괴사로 유발시킨다는 것을 나타낸다. 또한, LTX-315의 괴저성 효과는, 오래 지속되는 종양 면역 보호 유도에서 그들의 가능한 역할로 인해 고형 B16 흑색종의 박멸에서 핵심일 수 있는, 종양 실질 속에 TILs의 침윤 및 면역 반응을 자극시키는 DAMPs의 방출을 유발시킨다.
실시예 6
LTX-315 투여후 생성된 T 세포는 T 세포 퇴행에서 핵심 역할을 한다
여기에서, 우리는 LTX-315가 다작용성 T 헬퍼 유형 1/유형 1 세포독성 T 세포의 빈도 증가에 의해 종양 미세환경을 빠르게 재프로그램하는 것을 보여준다. 이러한 증가는 종양 퇴행에서 중요한 역할을 한다.
1 물질 및 방법
1.1 화학물질 및 세포 배양액
Lytix Biopharma (Tromsø, Norway)에 의해 제공되었던 LTX-315를 예외로 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 화학물질인, 배지 및 세포 배양용 보충물은 Gibco-Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)로부터 수득되었고; 플라스틱용기는 Corning BV Life Sciences (Amsterdam, The Netherlands)로부터 수득되었다. MCA205는 10% 소태아 혈청, 및 2mM l-글루타민, 100IU/ml 페니실린 G 나트륨 염, 100μg/ml 스트렙토마이신 설페이트, 1mM 나트륨 피루베이트 및 1mM 비-필수 아미노산으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. 세포는 5% CO2 분위기하에 가습된 인큐베이터에서 37℃에 성장되었다.
1.2 마우스
마우스는 12-h 명, 12-h 암 사이클을 가진 온도-제어된 환경에서 특이적 무병원체 조건에 유지되었고 선택적으로 음식 및 물을 받았다. 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹 (FELASA) 지침을 따른 동물 실험은 EU Directive 63/2010에 순응하였고 Ethical Committee of the Gustave Roussy Cancer Campus (Villejuif, France)에 의해 승인되었다. 마우스는 7과 14 주령 사이 사용되었다. WT-특이적 무병원체 (SPF) C57BL/6J는 Envigo (Gannat, France)로부터 수득되었고 Gustave Roussy, Villejuif, France에서 SPF 조건에 유지되었다.
1.3 종양 모델
마우스는 1 Х 106 MCA205 세포로 오른쪽 옆구리에 피하로 주사되었다. 종양 세포주는 C57BL/6 마우스에 접종되었다. 종양 표면 (최장 치수 Х 수직 치수)는 캘리퍼스로 일상적으로 모니터링되었다. 종양이 20-25mm2의 크기를 달성하였던 경우 (일 0), 마우스는 300μg LTX-315의 3 연속 매일 주사로 종양내로 투여되었다. T-세포 고갈 실험에서 (도 24), 항-CD4 및 항-CD8 단클론성 항체 (mAbs) (GK1.5 및 53-6.72, 각각; 200μg / 마우스) 또는 그들의 아이소타입 대조군 (LTF-2 및 2A3, 각각)은 제1 LTX-315 주사 3 및 4 일전 복강내로 주사되었고 매 다른 7 일 계속되었다. 생체내 용도용 모든 mAbs는, 권고된 아이소타입 대조군 mAbs를 이용하여, BioXcell (West Lebanon, NH, USA)로부터 수득되었다.
1.4 유세포측정
종양 및 비장은 LTX-315의 제1 주사 7 일후 수확되었다. 절개된 종양은 작은 조각으로 절단되었고 37℃에서 30min 동안 25μg/ml로 리베라제 (Roche, Boulogne-Billancourt, France) 및 150UI/ml로 DNase1 (Roche)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 소화되었다. 혼합물은 100μm 세포 스트레이너를 통해 후속적으로 통과되었다. 2 Х 106 비장세포 (적혈구 용해후) 또는 종양 세포는, 막 염색전, 4℃에서 15min 동안 정제된 항-마우스 CD16/CD32 (93; eBioscience, San Diego, CA, USA)로 사전인큐베이션되었다. 세포내 염색을 위하여, FoxP3 염색 키트 (eBioscience)는 사용되었다. 죽은 세포는 Live/Dead Fixable Yellow 죽은 세포 염색 키트 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제외되었다. 사이토카인 염색을 위하여, 세포는 4시간 동안 37℃에서 50ng/ml의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA; Calbiochem, San Diego, CA, USA), 1μg/ml의 아이오노마이신 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 및 BD Golgi STOP (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 자극되었다. 항-IFN-γ (XMG1.2) 및 항-TNF-α (MP6-XT22)는 eBioscience로부터 구매되었다. 항-CD4 (GK1.5)는 항-CD8β (YTS1567.7)은 Biolegend (San Diego, CA, USA)로부터 구매되었다. 8-색상 유세포측정 분석은 플루오레신 이소티오시아네이트, 파이코에리트린, 파이코에리트린 시아닌 7, 페리디닌 클로로필 단백질 시아닌 5.5, 알로피코시아닌 시아닌 7, 퍼시픽 블루 또는 알로피코시아닌에 접합된 항체로 수행되었다. 모든 세포는 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) 소프트웨어를 가진 CyAn ADP (Beckman Coulter, Marseille, France) 흐름 세포측정기에서 분석되었다.
1.5 통계적인 분석
데이터는 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Co., Redmont, WA, USA) 및 Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA, USA)로 분석되었다. 데이터는 짝짓기되지 않은 스튜던트 t-시험 또는 1원 ANOVA 이어서 해당하는 경우 터키 시험에 의해 계산된 평균±S.E.M. 및 P-값으로서 나타난다. 카플란-마이어 생존 곡선의 비교는 로그-순위 Mantel-Cox 시험을 이용하여 수행되었다. 모든 보고된 시험은 2측이었고 P-값 <0.05에서 유의미한 것으로 고려되었다.
2 결과
우리는 피하 육종 모델에서 LTX-315 7 일후 형상화된 종양 미세환경을 구성하는 주요 효과기의 동력학을 탐구하였다. 우리는 IFNγ+ (T 헬퍼 유형 1, Th1), IL-17+ (Th17) 및 이중-양성 IFNγ+ IL-17+ (pTh17) CD4+ TILs (도 22), 뿐만 아니라 다작용성 IFNγ+ TNFα+ CD8+ T 세포 (도 23)의 축적을 관측하였다.
LTX-315-매개된 항암 효과는 항종양 효과를 완전히 폐지시킨 항체 고갈 CD4+ 및 CD8+ T 세포만큼 많이 T-세포 의존적이었다 (도 24).
3 논의
이러한 전임상 연구에서, 우리는, 전형적인 세포자멸적 또는 조절된 괴저성 세포사를 유도하지 않으면서, LTX-315가 조절되지 않는, 면역원성 종양 세포사를 야기한다는 것을 알아내었다. 이러한 세포사의 적어도 일부는 다작용성 CD4+ 및 CD8+ TILs의 축적 촉진을 포함한다. 면역원성 작용 기전은 항종양 효과가 T 림프구의 부재하에 폐지되었다는 사실에 의해 중요한 것으로 나타난다.
실시예 7
LTX-315 투여후 종양 속에 T 세포 침윤의 임상 조직학 증거
1 물질 및 방법
환자로부터 포르말린-고정된 및 파라핀-포매된 종양 조직 절편은 자일렌 및 단계적인 알코올에서 탈파라핀화되었고, 수화되었고 PBS에서 세정되었다. 전자렌지 오븐에서 시트르산나트륨 버퍼 (pH 6)에서 항원 회수후, 내인성 페록시다아제는 15 min 동안 0.3% H2O2에 의해 차단되었다. 절편은 밤새 4 ℃에서 1차 기본적인 항체; 토끼 다클론성 항-CD3 (클론 A0452 Dako) 또는 마우스 단클론성 항-CD8 (클론 OX8, ab33786, Abcam)으로 인큐베이션되었다. 2차 항체로서, 항-토끼-홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) SuperPicTure Polymer 검출 키트 (Invitrogen) 또는 Envision 시스템 HRP-항-마우스 (Dako)는 사용되었다. 매칭된 아이소타입 대조군은 비특이적 배경 염색용 대조군으로서 사용되었다.
2 결과
도 25 내지 29는 전이성 흑색종, 악성 흑색종, 근상피종, 유방 암종 및 데스모이드 종양 환자의 종양 속에 세포독성 T 세포의 침윤을 보여준다.
실시예 8
LTX-315 치료는 2차 뿐만 아니라 1차 종양 속에 세포독성 T 세포 침윤을 유발시킨다
하나의 종양 병변에서 LTX-315의 종양내 주사가 또한 전이성 질환에서 효과를 가질 수 있는지를 명확하게 하기 위해, 복강내 종양 및 2개의 피하 종양은 랫트 육종 모델에서 확립되었다. 그 후에, LTX-315는 살아있는 이미지형성에 의해 평가된 피하 병변 및 종양 성장 중 하나에 주사되었다. 결과는 LTX-315 치료가 모든 3개 병변을 박멸시켰고 동물이 견딜 수 있는 완전한 차도가 되었다는 것을 보여주었다.
1 물질 및 방법
1.1 동물 실험
근친교배한 Piebald Virol Glaxo (PVG.RT7a, 축약 PVG) 균주의 랫트는 PVG.RT7b 균주 (이 연구에서 축약 PVG)와 상호교환적으로 사용되었다. 균주는 백혈구 공통 항원 (LCA/CD45) 계열의 하나의 무관한 에피토프를 제외하고 동일하다. PVG 랫트는 Harlan (네덜란드)로부터 구매되었고 PVG.7B 랫트는 Institute of Basic Medical Sciences (IMB, University of Oslo, Norway)에서 인하우스 교배로부터 수득되었다. 실험 동안, 240-270 g 중량, 수컷 랫트는, 12 h 명/암 사이클 및 주위 온도로, 기후-제어된 조건하에 케이지당 2 내지 3 동물의 그룹으로 유지되었다. 랫트는 선택적으로 표준 설치류 음식 및 물에 자유 접근하면서 풍부한 개별적으로 환기된 케이지 (IVC) 시스템에서 하우징되었다. 동물은 실험 절차 동안 어느 한쪽 2.5% 이소플루란 가스 (Baxter Medical AB)로 마취되었거나 펜타닐/플루아니소논 (Hypnorm; VetaPharma Ltd.)의 피하 주사 (0.4 ml/kg)를 받았고, 이것은 충분한 정도의 진정상태 및 통각상실증을 제공하였다. 동물은 매일 모니터링되었고 큰-종양-보유 랫트는 CO2로 안락사되었다. 수행된 모든 절차는 FOTS 번호 1957 및 5917하에 수행되었고 노르웨이 농업부하에 그리고 실험적 및 다른 과학적 목적에 사용된 척추동물의 보호를 위한 유렵 조약에 순응하여 실험 동물 위원회에 의해 승인되었다. 실험실 동물 설비는 일상적인 건강 모니터링 프로그램에 적용되고 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹 권고의 변형에 따라 공통 병원체에 대하여 선별되었다.
1.2 종양 치료
사전-배양된 랫트 형질전환된 간엽 줄기 세포-유래된 육종 모델 세포 (rTMSCs)는 무혈청 RPMI-1640에서 수확되었고 200,000 rTMSCs는 일 ÷2에 PVG 랫트 속에 오른쪽 옆구리에 그리고 일 0에 반대편 옆구리에서 20,000 rTMSCs 피하로 접종되었다. 확립된 종양 (25 mm2 평균 종양 크기)는 (0.9% NaCl을 가진 멸균된 H2O에 용해된) LTX-315 (n=8)로 또는 비히클 (0.9% NaCl을 가진 멸균된 H2O) (n=6)으로 병소내로 주사되었다. 20 mg/ml (1mg)으로 LTX-315, 50μl의 치료 용량은 1ml 주사기 (Myjector U-100, Terumo) 바늘 0,5x16 mm (Fine-Ject; Henke-Sass, Wolf GmbH를 이용하여 제공되었다. 주사는 3 후속 일 동안 매일 제공되었다. 종양 크기는 캘리퍼스를 이용하여 1주 3회 측정되었고 타원의 면적 [(최대 치수/2) x (최소 치수/2)]으로서 표현되었다. 종양이 400 mm2를 초과하였던 경우 동물은 죽었다.
1.3 고형 종양으로부터 단일 세포 현탁액의 제조
단일-세포 현탁액은 LTX-315 치료후 1주 동안 상이한 시점에서 신선한 종양 조직으로부터 제조되었다. 종양은 면도날로 부드럽게 다져졌고 작은 조각 (4mm2)으로 절단되었다. 종양 조직은 부드럽게 진탕하면서 60 min 동안 37 ℃에서 10 ml MEM 배지 (Sigma-Aldrich)내 0.18 Wunsch 단위/ml의 농도에서 리베라제 TM (Thermolysin Medium; Roche Diagnostics)으로 인큐베이션되었다. 효소 소화는 2 ml 4 ℃ FCS (Invitrogen, Thermo Fischer)의 첨가에 의해 종결되었다. 세포 현탁액은 70 μM 메쉬 (세포 스트레이너; BD)를 통해 여과되었고, PBS에서 세정되었고 세포는 그 다음 유세포측정 염색에 직접적으로 사용되었다.
1.4 항체 및 FACS 분석
CD4 (OX38) 및 CD8 (OX38)에 대한 마우스 단클론성 항체는 하이브리도마에서 배양 상청액으로부터 단리되었고 MRC Cellular Immunology Unit, Oxford, UK로부터 관대한 답례품이었다. 이들은 표준 프로토콜에 따라 IMB에서 접합되었다. PerCP 스트렙타비딘을 포함하는, CD3 (G4.18)에 대해 형광색소-접합된 mAbs는 BD Biosciences로부터 수득되었다. FITC/ Al488, PE, PerCP 스트렙타비딘 및 Al647내 시약으로 구성되는 4-색상 패널은 적용되었고 CellQuest 소프트웨어 (BD) 구비된 FACS Calibur (BD)에서 분석되었다. 닷 플롯 및 히스토그램 게이트는 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 설정되었다.
1.5 면역조직화학
포르말린-고정된 및 파라핀-포매된 조직 절편은 자일렌 및 단계적인 알코올에서 탈파라핀화되었고, 수화되었고 PBS에서 세정되었다. 전자렌지 오븐에서 시트르산나트륨 버퍼 (pH 6)내 항원 회수후, 내인성 페록시다아제는 15 min 동안 0.3% H2O2에 의해 차단되었다. 절편은 밤새 4 ℃에서 1차 항체; 토끼 다클론성 항-CD3 (클론 A0452 Dako) 또는 마우스 단클론성 항-CD8 (클론 OX8, ab33786, Abcam)으로 인큐베이션되었다. 2차 항체로서, 항-토끼-홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) SuperPicTure Polymer 검출 키트 (Invitrogen) 또는 Envision 시스템 HRP-항-마우스 (Dako)는 사용되었다. 매칭된 아이소타입 대조군은 비특이적 배경 염색용 대조군으로서 사용되었다.
1.6 통계
데이터는 평균 ± SD로서 표현된다. 2 그룹 사이 통계적인 차이는 2측 스튜던트t 시험에 의해 분석되었고, P < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다. 통계적인 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 (버전 6, GraphPad)를 이용하여 수행되었다.
2 결과
LTX-315-매개된 퇴행 및 장기간 보호성 면역 반응을 기초하는 세포 기전을 조사하기 위해, 우리는 유세포측정 및 면역조직화학에 의해 처리된 종양의 세포 조성물을 분석하였다. 마지막 치료후 1주 동안, 종양은 상이한 시점에서 절제되었고 그 후에 종양 침윤 백혈구는 양쪽 LTX-315-처리된 및 미처리된 동물에서 표현형이 되었다 (도 30a).
성장하는 종양에 반응하여 종양 침윤 T 림프구는 미처리된 랫트에서 관측되었다 (도 30b). 림프구의 자발적인 침윤은 종양 성장을 억제시키는데 불충분하였고 종양 제어는 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포의 축적 및 적응성 면역력에 의존적이었다. T 세포의 백분율은 미처리된 종양에 비교하여 LTX-315 치료후 상당히 증가되었다 (처리된; 28.35 ± 11.78, 미처리된; 13.58 ± 7.84, P < 0.5). 유사하게, 2차 종양 조직 내에서 T 세포의 백분율은 미처리된 랫트에 비교하여 3배 증가시켰다 (처리된; 39.83 ± 17.4, 미처리된; 11.83 ± 10.25, P < 0.01). CD3+T 세포 모집단 내에서, CD8+세포는 미처리된 대조군에 대하여 처리된 랫트의 1차 및 2차 종양에서 주요 분획을 설명하였다 (처리된 랫트의 1차 종양; 62.77± 13.3, 미처리된 랫트; 37.33 ± 3.48, P < 0.01, 처리된 랫트의 2차 종양; 45.8 ± 5.4, 미처리된 랫트; 34.67 ± 3.36, P < 0.1).
미처리된 랫트에 비교하여, LTX-315 처리된 랫트의 FACS 분석은, 종양 퇴행과 상관되었던, 주요 면역 효과기 세포 모집단인, CD3+ 및 CD8+ 종양 침윤 T 세포의 상당히 상승된 수준을 드러냈다. 면역조직화학 분석은 LTX-315 처리된 랫트로부터 1차 및 2차 종양 조직에서 관측된 CD3+ 및 CD8+ 세포의 증가된 침윤을 실증하는 유세포측정 데이터와 일치하였다 (도 31).
<110> Lytix Biopharma AS <120> Methods of generating populations of tumour-infiltrating T cells <130> 59.127363/02 <150> GB 1601868.1 <151> 2016-02-02 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Cationic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(4) <223> Lipophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Cationic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Lipophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Cationic amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Lipophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Cationic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Lipophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Cationic amino acid <220> 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Lys Trp Xaa Lys Xaa 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Orn <400> 26 Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Trp Trp Xaa 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Dpr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Dpr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Dpr <400> 27 Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Trp Trp Xaa 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Arginine <400> 28 Arg Arg Trp Xaa Arg Arg Trp Trp Xaa 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 29 Lys Trp Trp Lys Lys Xaa Trp Lys Xaa 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Tryptophan <400> 30 Lys Xaa Lys Lys Trp Trp Lys Lys Xaa 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 31 Lys Lys Xaa Trp Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> D-amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 32 Lys Trp Trp Lys Lys Xaa Trp Lys Xaa 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> biphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Arginine <400> 33 Arg Arg Xaa Trp Arg Arg Trp Trp Xaa 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Arginine <400> 34 Arg Arg Xaa Trp Arg Arg Trp Trp Xaa 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> D-amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> biphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 35 Lys Lys Xaa Trp Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> D-amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> 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Xaa Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> 2-naphthylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 40 Lys Lys Trp Xaa Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> 2-amino-3-(anthracen-9-yl)propanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 41 Lys Lys Trp Xaa Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> 2-amino-3-[1,1':4',1"-terphenyl-4-yl]propionic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Lysine <400> 42 Lys Lys Trp Xaa Lys Lys Trp Trp Xaa 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Amidated Tryptophan <400> 43 Lys Ala Gln Xaa Gln Lys Gln Ala Xaa 1 5 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 44 Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 20 25 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> biphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> biphenylalanine <400> 45 Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Ala Xaa Lys Lys Ala Ala Lys Xaa 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ala 20 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> diphenylalanine <400> 46 Trp Lys Lys Trp Xaa Lys Lys Trp Lys 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> D-amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> diphenylalanine <400> 47 Trp Lys Lys Trp Xaa Lys Lys Trp Lys 1 5 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> biphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) <223> biphenylalanine <400> 48 Lys Ala Ala Lys Lys Ala Xaa Lys Ala Ala Lys Ala Xaa Lys Lys Ala 1 5 10 15 Ala

Claims (17)

  1. 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법으로서, 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체를 대상체에 투여하고 그 다음 상기 대상체 내에서 종양으로부터 세포 샘플을 수집하고 거기로부터 T 세포를 분리시키는 것을 포함하는, 방법.
  2. 종양-침윤 T 세포의 모집단의 생성 방법으로서, 종양 세포 막을 용해시킬 수 있는 양으로 하전된 양친매성 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체로 처리된 대상체로부터 취득된 세포 종양 샘플로부터 T 세포를 분리시키고 상기 T 세포를 선택적으로 배양시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 생체외 상기 T 세포 팽창의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 모집단으로부터 하나 이상의 클로노타입의 확인 및/또는 단리를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 그들의 상응하는 종양-특이적 항원 또는 신생항원을 확인하기 위해 상기 생성된 T 세포 분석의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, (a) 상기 T 세포가 생체외 팽창된 후, 또는 (b) 직접적으로 생체내 생성되는 상기 T 세포상에서 상기 분석이 수행되는, 방법.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6의 상기 방법에 의해 수득가능한, 항원 또는 신생항원.
  8. 상기 T 세포, 항원 또는 신생항원이 이들을 더욱 면역원성으로 만들기 위해 변형되고 있는, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 방법 또는 청구항 7에 있어서, 항원 또는 신생항원.
  9. 종양 세포의 치료 또는 종양의 상기 성장, 확립, 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소에서 사용을 위하여, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 청구항 7 또는 8에 따른 항원 또는 신생항원에 의해 수득가능한, T 세포.
  10. 종양 세포의 치료 또는 종양의 상기 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소 방법으로서, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 청구항 7 또는 8에 따른 항원 또는 신생항원에 의해 수득가능한 T 세포의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 대상체에서 종양 세포의 치료 또는 종양의 상기 성장, 확립 확산, 또는 전이의 예방 또는 감소를 위한 약제의 상기 제조에서 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 청구항 7 또는 8에 따른 항원 또는 신생항원에 의해 수득가능한, T 세포의 용도.
  12. 상기 T 세포, 상기 항원 또는 상기 신생항원이 체크포인트 억제제와 투여되는, 청구항 9에서 있어서, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원, 청구항 10에 있어서, 방법 또는 청구항 11에 있어서, 용도.
  13. 상기 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체가 적어도 2개의 환식 기를 함유하는, 청구항 1 내지 6, 8, 10 또는 12 중 어느 한 항에 따른, 방법, 청구항 7 또는 청구항 8에 따른, 항원 또는 신생항원, 청구항 9 또는 청구항 12에 따른, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원 또는 청구항 11 또는 청구항 12에 따른, 용도.
  14. 상기 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체가 10 이상의 비-수소 원자의 적어도 1개의 친유성 기 및 적어도 1개의 양전하를 포함하는, 청구항 1 내지 6, 8, 10, 12 또는 13 중 어느 한 항에 따른, 방법, 청구항 7, 8 또는 13 중 어느 한 항에 따른, 항원 또는 신생항원, 청구항 9, 12 또는 13 중 어느 한 항에 따른, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원 또는 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 따른, 용도.
  15. 상기 펩타이드 또는 펩타이드모방체가 2 내지 25 아미노산으로 구성되는, 청구항 1 내지 6, 8, 10 또는 12 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 방법, 청구항 7, 8, 13 또는 14 중 어느 한 항에 따른, 항원 또는 신생항원, 청구항 9 또는 12 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원 또는 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 용도.
  16. 상기 펩타이드 또는 펩타이드모방체가 하기인, 청구항 1 내지 6, 8, 10 또는 12 내지 15 중 어느 한 항에 따른, 방법, 청구항 7, 8 또는 13 내지 15 중 어느 한 항에 따른, 항원 또는 신생항원, 청구항 9 또는 12 내지 15 중 어느 한 항에 따른, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원 또는 청구항 11 내지 15 중 어느 한 항에 따른, 용도:
    a) 선형 배열에서 9 아미노산으로 구성되고;
    b) 그들 9 아미노산 중, 5개는 양이온성이고 4개는 친유성 R 기를 갖고;
    c) 상기 9 아미노산 중 적어도 1개가 비-유전적으로 코딩된 아미노산 또는 유전적으로 코딩된 아미노산의 변형된 유도체이고; 선택적으로
    d) 상기 친유성 및 양이온성 잔기가 배열되어 이로써 서로에 인접한 잔기의 어느 한쪽 유형 중 2개 이하가 있고; 추가로 선택적으로
    e) 상기 분자가 인접한 양이온성 아미노산의 2개 쌍 및 인접한 친유성 잔기의 1개 또는 2개 쌍을 포함함.
  17. 상기 아미노산 유도체, 펩타이드 또는 펩타이드모방체가 적어도 +2의 순 양전하를 갖고 이치환된 β 아미노산을 편입시키고, 동일 또는 상이할 수 있는, 상기 β 아미노산에서 각각의 상기 치환기가 적어도 7 비-수소 원자를 포함하고, 친유성이고 적어도 1개의 환식 기를 갖고, 치환기 내에서 하나 이상의 환식 기가 상기 다른 치환기 내에서 하나 이상의 환식 기에 연결 또는 융합될 수 있고 환식 기가 상기 2개 치환기용 비-수소 원자의 상기 조합된 총 수가 적어도 12인 이런 식으로 융합되는, 청구항 1 내지 6, 8, 10 또는 12 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 방법, 청구항 7, 8 또는 12 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 항원 또는 신생항원, 청구항 9 또는 12 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 사용을 위한 T 세포, 항원 또는 신생항원 또는 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 따른, 용도.
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