KR20180099493A - 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단맛이 증가된 신규한 브라제인 다중 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 A1 ins. 다중 변이체는 동일한 양의 수크로오스(설탕)과 비교하여 약 2,960,000만 배 이상 단맛이 높다. 야생형의 브라제인 및 종래 개발된 브라제인 변이체와 비교하여도 단맛의 증가가 월등히 우수하다. 따라서, 본 발명의 브라제인 변이체는 매우 적은 양을 사용하여 원하는 단맛을 낼 수 있으며, 식품에서 설탕을 비롯한 다른 감미제를 대체하여 사용될 수 있다.

Description

높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법{Method for preparing novel multi-mutated Brazzein having higher sweetness}

본 발명은 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

식품 및 음료에 첨가되는 정제 설탕은 영양적 가치가 없고, 에너지 섭취 증가에만 기여한다. 이러한 설탕의 과도한 소비는 세계적인 비만율을 야기하였다. 따라서, 비만 문제를 해결하기 위한 방법 중 하나로 설탕을 고강도 감미료로 대체하여 에너지 섭취를 줄이는 것이 고안되었다. 현재 설탕을 대체하기 위해 사용되고 있는 대체 감미료로는 크게 아스파탐, 사카린 등을 포함한 인공감미료와 감미단백질, 당알콜, 올리고당 등을 포함한 천연감미료로 나눌 수 있다. 그 중에서도 감미단백질은 식물의 열매에서 유래한 천연 물질로서 그 종류로는 타우마틴(thaumatin), 모넬린(monellin), 마빈린(mabinlin), 컬큘린(curculin), 미라큘린(miraculin), 브라제인(brazzein) 등이 있다. 감미단백질은 상대적으로 낮은 칼로리를 가지고 있으면서도 설탕보다 훨씬 강한 단맛을 가지고 있기 때문에 합성 인공 감미료의 대체제로 주목받고 있다.

단맛수용체의 리간드로 사용한 브라제인은 54개 아미노산 잔기로 이루어진 감미단백질로 현재까지 알려진 감미단백질 중 가장 작은 크기를 가지고 있고, 설탕과 유사한 단맛을 지닌 것으로 알려져 있다. 야생형 브라제인은 N-말단에 pyro-glutamate의 존재 유무를 기준으로 주 형태(major form)과 부 형태(minor form)로 분류할 수 있다. N-말단에 pyro-glutamate를 보유하고 있는(pyrE) 주 형태는 야생형의 80%를 차지하고 있다. 나머지 20%를 차지하는 부 형태는 N-말단에 pyro-glutamate가 결핍되어 있으며(des-pyrE), 주 형태보다 단맛 활성이 2배 더 강하다. 브라제인은 3개의 역평행 베타 사슬(strand I, residues 5-7; strand II, residues 44-50; strand III, residues 34-39)과 1개의 작은 알파 나선(residues 21-29) 구조를 가지고 있는데, 이 3개의 베타 사슬들은 중심의 수소 결합과 4개의 이황화 결합으로 연결되어 있어 안정한 구조를 유지한다(도 1). 이러한 구조적 안정성으로 인해, 브라제인은 다른 감미단백질에 비해 넓은 범위의 온도 및 pH에서 안정하다.

이러한 구조적 안정성을 유지하면서 야생형 브라제인 보다 높은 단맛을 나타내는 변이체에 대해 본 발명자들은 계속 연구 중에 있다 (특허문헌 1~3).

한국특허출원 제2007-0117013호 한국특허출원 제2008-0019008호 한국특허출원 제2010-0016660호

본 발명자들은 종래의 야생형 브라제인과 비교하여 단맛이 증가되어 있는 새로운 형태의 브라제인 변이체 단백질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 야생형 브라제인의 4가지의 다른 부위에서의 아미노산 변이를 동시에 갖는 다중변이체를 성공적으로 제조하였으며, 이 변이체가 야생형 브라제인 및 종전에 개발된 변이체에 비해 훨씬 높은 단맛을 가진다는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 단맛이 증가된 브라제인 다중 변이체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 브라제인 다중 변이체[A1 ins_H30R_E35D_E40A]에 관한 것이다.

본 발명의 브라제인 다중 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 3차 변이체 H30R_E35D_E40A(브라제인 부타입 단백질(서열번호 1)의 30번째 아미노산인 히스티딘(histidine) 잔기가 아르기닌(arginine) 잔기로, 35번째 아미노산인 글루타민산(glutamic acid) 잔기가 아스파르트산(aspartic acid) 잔기로(서열번호 3), 40번째 글루타민산(glutamic acid) 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 브라제인 3차 변이체[국내 등록 특허 제 981087호]에서, 1번째 위치에 알라닌(alanine)이 삽입된 다중 변이체로서, 서열번호 5로 표시된다.

특히, 본 발명의 브라제인 다중 변이체 단백질은 야생형 브라제인에 비해 약 2038배 단맛이 향상되었다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 핵산 분자는 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ⅱ) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 브라제인 다중 변이체 코딩 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 재조합 벡터에서 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열을 코딩하는 핵산분자에 연결될 수 있다.

상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열을 서열번호 7의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 알파-메이팅 서열은 본 발명의 브라제인 뉴클레오티드 서열의 5' 상단에 단백질로의 번역 시 동일한 프레임을 가지도록 연결된다.

또한, 상기 재조합 발현벡터에 작동 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

상기 용어 "프로모터"는 단백질 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

상기 '작동 유전자'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 작동 유전자로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 효모 LAC 프로모터, GAL 프로모터(Rosaura Rodicio et al.,Microbiology 152 (2006), 2635-2649), KlADH4 프로모터(Michele Saliola et al., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65(1): 53-60), 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터(미국 특허 제6,596,513호), PGK1 프로모터(V. Melvydas et al., BIOLOGIJA, 4:1-4, 2006) 등이 있다. 이외에도 미국 특허 제227,326호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 프로모터는 LAC4 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 브라제인 변이체 발현을 위한 재조합 발현벡터로 pKLAC2-브라제인 변이체, pKLAC2-브라제인 변이체::LAC4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 클루이베로마이세스 락티스 유래의 PDI 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 pKLAC2-PDI일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다. 본 발명에서는 바람직하기로 숙주세포로 효모 일종인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 사용하였다. 상기 효모는 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 이때 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 초산화 리튬(LiCH₃COO)법, 염화 리튬(LiCl)법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion),운반 DNA 융합법(Carrier-DNA mediated fusion)등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상술된 브라제인 다중 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포로부터 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 단계.

본 발명의 브라제인 다중 변이체를 발현하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 브라제인 다중 변이체의 발현을 유도할 수 있는 적절한 배지를 사용하여 적합한 배양 조건 하에서 배양한다. 숙주세포 배양을 위한 배지 및 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 당업자는 공지된 배지 및 배양 조건을 본 발명에 적합하게 변형하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 배양하는 단계를 포함하는 브라제인의 대량 생산 방법을 포함한다.

이러한 본원발명에서의 브라제인의 발현은 젖당(lactose), 갈락토오스 (galactose), 글로코오스(glucose), 녹말(starch)과 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물에 의해 이루어진다. 발현된 알파-메이팅(α-Mating) 신호서열을 포함하는 브라제인은 신호서열에 의해 효모의 소포체로 이동하게 되고, 효모의 시그널 펩티다제(signal peptidase)와 Kex 펩티다제(Kex peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 브라제인이 합성되게 된다. 따라서, 본 발명의 브라제인 발현 재조합 발현벡터를 포함하도록 형질전환된 효모는 브라제인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이는 질소 공급원으로 효모 추출물을 0.5 내지 5%, 펩톤을 0.5 내지 5%로 단독 또는 혼합하여 사용하고, 탄소 공급원 및 발현 유도제로 갈락토오스 1 내지 4%, 글루코오스 1 내지 4%, 젖당 1 내지 4% 및 전분 1 내지 4%로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 특히, 효모 추출물 0.5 내지 5%, 펩톤 0.5 내지 5% 및 갈락토오스 1 내지 4%를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브라제인 다중 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement),건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 포함한다.

본 발명의 브라제인 다중 변이체를 함유하는 식품 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 전체 조성물 중량에 대해 0.01 - 10 중량％의 함유량 범위로 포함될 수 있다.

본 발명은 단맛이 증가된 신규한 브라제인 다중 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 변이체를 생산하는 방법 및 상기 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 동일한 양의 수크로오스(설탕)과 비교하여 약 2백만배 이상 단맛이 높다. 야생형의 브라제인 및 종래 개발된 브라제인 변이체와 비교하여도 단맛의 증가가 월등히 우수하다. 따라서, 본 발명의 브라제인 변이체는 매우 적은 양을 사용하여 원하는 단맛을 낼 수 있으며, 식품에서 설탕을 비롯한 다른 감미제를 대체하여 사용될 수 있다.

도 1은 야생형 브라제인의 구조를 나타낸 것이다[4개의 분자 내 이황화 결합이 황색으로 시각화됨].
도 2는 SIAM yes-no task에 사용되는 테스트 시트를 나타낸 것이다.
도 3은 브라제인 변이체의 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 브라제인 다중변이체를 전기영동으로 확인한 것이다[Lane M, Polypeptide SDS-PAGE molecular weight marker; Lane 1, des-pE1M(des-pE1MBRZ); Lane 2, H30R/E35D/E40A(3M); Lane 3, A1 ins/ H30R/E35D/E40A(3M-A1 ins)].
도 5는 T1R2 및 T1R3 서브유닛의 상동성 기반 모델링된 세포 외 도메인 구조를 나타낸 것이다[(a) T1R2 서브유닛의 세포 외 도메인, (b) T1R3 서브유닛의 세포 외 도메인].
도 6은 상동성 기반의 브라제인 다중변이체를 모델링한 것이다[(a) des-pE1M 브라제인; (b) H30R/E35D/E40A; (c) A1 ins/H30R/E35D/E40A].
도 7은 T1R2-T1R3 이종이합체 복합체에 대한 브라제인 des-pE1M에서 발견된 7가지 최고의 도킹 방향을 나타낸 것이다[모든 구조는 백본 리본으로 표현됨. 오렌지: T1R2 서브유닛; 청색: T1R3 서브 유닛; 녹색, 브라제인, (a) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #1, (b) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #2, (c) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #3, (d) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #4, (e) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #5, (f) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #6, (g) 브라제인 des-pE1M의 복합체 모델 #7].
도 8은 T1R2-T1R3 이종이합체 복합체에 대한 브라제인 H30R/E35D/E40A에서 발견된 7가지 최고의 도킹 방향을 나타낸 것이다[모든 구조는 백본 리본으로 표현됨. 오렌지: T1R2 서브유닛; 청색: T1R3 서브 유닛; 녹색, 브라제인, (a) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #1, (b) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #2, (c) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #3, (d) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #4, (e) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #5, (f) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #6, (g) 브라제인 H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #7].
도 9는 T1R2-T1R3 이종이합체 복합체에 대한 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A에서 발견된 7가지 최고의 도킹 방향을 나타낸 것이다[모든 구조는 백본 리본으로 표현됨. 오렌지: T1R2 서브유닛; 청색: T1R3 서브 유닛; 녹색, 브라제인, (a) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #1, (b) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #2, (c) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #3, (d) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #4, (e) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #5, (f) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #6, (g) 브라제인 A1 ins/H30R/E35D/E40A의 복합체 모델 #7].
도 10은 des-pE1M 브라제인과 T1Rs 서브유닛 간의 소수성 및 친수성 상호작용의 도식적 표현을 나타낸 것이다[체인 A, T1R2 서브유닛; 체인 B, T1R3 서브유닛; 체인 C, 브라제인; 녹색의 점선: 수소 결합, 붉은 색의 점선: 소수성 상호 작용, (a) Lys14와 Asn24 사이의 수소 결합, (b) Tyr23과 Leu112 사이의 수소 결합, (c) Arg32와 Arg123 사이의 수소 결합, (d) Tyr53과 Met162 사이의 수소 결합].
도 11은 des-pE1M 브라제인과 T1Rs 서브유닛 간의 소수성 및 친수성 상호작용의 도식적 표현을 나타낸 것이다[체인 A, T1R2 서브유닛; 체인 B, T1R3 서브유닛; 체인 C, 브라제인; 녹색의 점선: 수소 결합, 붉은 색의 점선: 소수성 상호 작용, (a) Lys2와 Asn130 사이의 수소 결합, (b) Arg32와 Tyr28 사이의 수소 결합, (c) Arg30과 Asp26 사이의 수소 결합, (d) Asn43과 Asp419 사이의 수소 결합, (e) Asp39와 Ser122 사이의 수소 결합].
도 12는 A1 ins/H30R/E35D/E40A 브라제인과 T1Rs 서브유닛 간의 소수성 및 친수성 상호작용의 도식적 표현을 나타낸 것이다[체인 A, T1R2 서브유닛; 체인 B, T1R3 서브유닛; 체인 C, 브라제인; 녹색의 점선: 수소 결합, 붉은 색의 점선: 소수성 상호 작용, (a) Arg33과 Asn24 사이의 수소 결합, (b) Gln53과 Ile132 사이의 수소 결합, (c) Glu9와 Trp424 사이의 수소 결합].
도 13은 원형 이색성에 의한 T1R2, T1R3 서브유닛 및 T1R2-T1R3 이종이합체의 평균 잔류 타원도(Mean residue ellipticity, MRE)를 나타낸 것이다[점선: T1R2 서브유닛, 파선: T1R3 서브유닛, 실선, T1R2-T1R3 이종이합체].
도 14는 원편광 이색성에 의한 브라제인 다중변이체의 평균 잔류 타원도 (MRE)를 나타낸 것이다[실선: des-pE1M 브라제인; 점선: H30R/E35D/E40A 브라제인; 짧은 파선: A1 ins/H30R/E35D/E40A brazzein)
도 15는 원편광 이색성에 의한 T1R2-T1R3 이종이합체에 도킹된 브라제인 다중 변이체의 복합체 사이의 평균 잔류 타원도(MRE)를 비교한 것이다[실선: T1R2-T1R3 이종이합체; 점선: T1R2-T1R3-des-pGlu 브라제인 복합체; 파선: T1R2-T1R3-H30R/E35D/E40A 브라제인 복합체].
도 16은 원편광 이색성에 의한 T1R2-T1R3 이종이합체에 도킹된 브라제인 다중 변이체의 복합체 사이의 평균 잔류 타원도(MRE)를 비교한 것이다[실선: T1R2-T1R3 이종이합체; 점선: T1R2-T1R3-A1 ins/ H30R/E35D/E40A 브라제인 복합체].
도 17은 브라제인 다중변이체들의 평균 열 지속 시간을 나타낸 것이다[실선: des-pE1M 브라제인, 점선: A1 ins/H30R/E35D/E40A].
도 18은 열 변성 브라제인 다중변이체의 원자외선 원편광 이색성 스펙트럼 결과이다[청색: 브라제인, 적색: 80℃ 브라제인, 녹색, 83℃ 브라제인, 자색: 86℃ 브라제인, 밝은 청색, 89℃ 브라제인, 오렌지, 92℃ 브라제인, 진한 청색, 95℃ 브라제인].
도 19는 pKLAC2-브라제인 변이체 발현 벡터를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 ]

I. 브라제인 구조 연구

1.1 브라제인 변이체 및 안정성 연구

브라제인의 단맛은 크게 두 가지 요인에 의해 영향을 받는다. 첫 번째는 단백질의 구조인데, 브라제인의 구조를 지탱하는 결합이 끊어지거나 브라제인의 접힘에 오류가 생기는 경우 단백질의 구조가 크게 변성되어 단맛 활성이 크게 감소하거나 사라지는 결과를 야기한다. 예를 들어, 브라제인의 4개의 이황화 결합은 Cys3-Cys51, Cys15-Cys36, Cys21-Cys46, Cys25-Cys48에 존재하는데(Kohmura et al., 1996), 이 이황화 결합을 제거하거나 옮긴 변이체 모두가 단맛 활성이 사라짐을 관찰할 수 있었다(Assadi-Porter et al., 2010). 또한, N-말단 혹은 C-말단의 잔기를 변이시키거나 새로운 잔기를 추가, 제거하였을 때도 단맛활성이 없어지거나 변하는 것이 확인되었다(표 1)(Assadi-Porter et al., 2000). 그리고 브라제인의 42번 잔기인 아르기닌을 포함한 flexible loop의 잔기를 변이시켜 구조를 붕괴하였더니 단맛활성이 크게 감소한 것을 확인하였고, 이 결과를 통해 브라제인의 37-44번 잔기로 구성된 flexible loop는 단맛수용체와 브라제인의 상호작용에 관여할 것이라고 예측하였다(Assadi-Porter et al., 2000). 브라제인의 단맛을 결정하는 두 번째 요인은 단백질의 표면전하이다. 브라제인은 다섯 개의 아스파르트산(aspartic acid), 두 개의 아르기닌(arginine), 네 개의 글루탐산(glutamic acid), 한 개의 히스티딘(histidine), 일곱 개의 리신(lysine), 여섯개의 타이로신(tyrosine), 두 개의 세린(serine) 잔기를 보유하고 있으며 이는 브라제인의 약 50% 이상을 구성하는 비율이다. 이 잔기들을 반대 전하 혹은 전하를 가지고 있지 않은 아미노산으로 변이시켜 브라제인의 전체 전하를 바꾸었더니 단맛이 감소하거나 증가하는 결과가 나타났다. 예를 들어 브라제인의 28번 잔기인 아스파르트산(aspartate)을 중성 잔기나 반대 전하인 양전하로 변이시킨 결과 단맛활성이 증가한 반면, 35번 잔기인 글루탐산(glutamate)을 중성 잔기인 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine)으로 변이시키거나 반대 전하인 리신(lysine)으로 변이시킨 결과 단맛 활성이 사라진 것을 확인하였다. 이 결과는 28번, 35번 잔기의 경우 곁사슬의 방향이나 길이보다는 해당 잔기의 전하가 단맛 활성에 중요한 역할을 한다는 점을 시사한다(Jin et al., 2003).

선행연구에서는 이러한 연구들을 기반으로 브라제인 변이체들을 제작하여 그 활성을 연구하였다. 먼저, 브라제인의 28-31번 잔기를 포함한 flexible loop의 30번 히스티딘(histidine) 잔기를 더 큰 양전하를 지닌 아르기닌(arginine)으로 변이시킨 변이체는 단맛 활성이 증가한 반면, 중성 아미노산인 알라닌(alanine)으로 변이시켜 30번 잔기의 양전하를 제거한 변이체는 단맛활성이 감소하였다. 따라서 30번 잔기의 양전하가 브라제인의 단맛활성에 중요한 영향을 미치는 것을 확인하였다(Yoon et al., 2011). 또한, 브라제인의 33-38번 잔기를 포함한 β-strand Ⅲ에 위치한 35번 글루탐산(glutamate) 잔기를 아스파르트산(aspartate)으로 변이시켜 음전하를 강화시킨 결과 단맛 활성이 증가하였다(Do et al., 2011). 그리고 브라제인의 37-44번 잔기를 포함한 flexible loop의 40번 잔기인 글루탐산을 중성 아미노산인 알라닌, 염기성 아미노산인 리신, 아르기닌으로 각각 변이시킨 결과 모두 단맛 활성이 증가하였다. 브라제인과 단맛수용체의 상호작용 모델링 연구를 통해 브라제인과 단맛수용체가 결합할 때 브라제인의 40번 글루탐산 잔기가 T1R2의 252번 글루탐산 잔기에 근접한 위치에 있다는 것을 발견하였는데, 이 두 잔기가 잠재적으로 반발작용을 할 것이라 여겨진다(Walters & Hellekant, 2006). 따라서, 브라제인 40번 잔기의 변이체의 단맛 활성이 모두 증가한 것은 브라제인의 40번 잔기의 전하를 중성 혹은 반대 전하로 바꾸면서 이 전기적 반발작용을 제거하였기 때문이라고 예상된다(Yoon et al., 2011). 위 연구결과들을 바탕으로 30번 히스티딘(histidine)을 아르기닌(arginine)으로, 35번 글루탐산(glutamate)을 아스파트산(aspartate)으로, 40번 글루탐산(glutamate)을 알라닌(alanine)으로 다중 변이시킨 변이체인 H30R/E35D, H30R/E40A, E35D/E40A, H30R/E35D/E40A를 각각 작성하여 단맛 활성을 비교하였다. 그 결과 H30R/E35D/E40A의 단맛 활성이 가장 강한 것으로 나타났다(Lee et al., 2013). 최근에는 브라제인의 C-말단 부분의 52번 글루탐산 잔기의 영향을 보기 위해 52번 잔기를 변이시킨 변이체들을 작성하여 실험한 결과, 52번 잔기의 양전하가 수용체와의 상호작용에 중요한 역할을 할 것이라는 결론을 얻었다(Lim et al., 2015). 또한, N-말단의 β-strand Ⅰ에 속한 4번 리신 잔기가 브라제인의 단맛 활성에 영향을 미치며, 구조적 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 함을 입증하였다(Lim et al., 2016).

위의 연구 결과를 토대로 브라제인 다중변이체에 대한 연구를 진행하기 위해 H30R/E35D/E40A 변이체를 기반으로 하였으며, 한 브라제인의 N-말단의 작용을 알아보고자 N-말단에 알라닌을 삽입하여 길이를 연장한 변이체를 작성하였다.

2.1 컴퓨터 모델링 및 도킹 시뮬레이션

결정 구조가 밝혀지지 않은 단백질의 고차 구조는 상동성 기반 구조 모델링을 통해 예측할 수 있다. 단백질의 구조를 예측하는 프로그램 중에서도 SWISS-MODEL EXPASY (http://swissmodel.expasy.org/) 프로그램은 아미노산 서열의 상동성을 기반으로 단백질의 3차 구조를 예측한다. SWISS-MODEL을 통한 전체적인 구조 모델링은 주형(template) 식별, 적절한 주형 선택, 단백질 모델 구축, 구축된 모델의 품질 측정의 4가지 단계를 거친다(Biasini et al ., 2014).

SWISS_MODEL 주형 목록(SWISS_MODEL template library, SMTL)은 실험적으로 구조가 밝혀진 33,000개의 단백질에 대한 정보를 보유하고 있다(Biasini et al ., 2014). 원하는 단백질의 고차 구조를 예측하기 위한 첫 단계로 우선 적절한 주형 후보를 SMTL에서 검색한다. 이때, HHblits by hidden markov model(HMM)과 basic local alignment search tool(BLAST)를 함께 비교하며 사용한다(Arnold et al ., 2006). 단백질 모델을 구축하기 위한 주형을 선택하고 나면, ProMod-Ⅱ를 이용하여 모델링을 하고자 하는 단백질의 모든 원소 구조 모델을 생성하기 위해 완성된 주형 단백질의 모델링 결과를 사용한다(Guex et al ., 1997). 이에 맞춰, 다른 단백질 모델들에서 추정된 올리고머 구조에 기반한 예측 단백질 모델들을 구축한다. 최종적으로 구축된 단백질 모델들의 품질은 정성 모델 에너지 분석(qualitative model energy analysis, QMEAN)을 통해 평가한다(Biasini et al ., 2014).

단백질-단백질 도킹 시뮬레이션은 두 개의 다른 단백질들의 결합(docking) 방향이나 결합 양상을 측정하기 위해 사용하며, 다양한 소프트웨어를 이용하여 진행할 수 있다. 그 중에서도 전반적인 범위의 분자 매칭 소프트웨어인 GRAMM-X는 상대 번역 및 단백질 분자의 배향을 통해 완벽한 검색을 수행한다는 특징을 가지고 있다(Vakser et al ., 1995). 결합 결과의 질은 입력한 단백질의 정확도에 크게 영향을 받기 때문에 최소한의 구조적 변화를 갖는 고 해상도 구조들 간의 도킹 시뮬레이션은 정확한 예측 결과를 나타내는 반면, 저 해상도 구조의 단백질 간의 도킹 시뮬레이션은 총체적인 특징만 가지고 있는 단백질 복합체만을 얻을 수 있다(Vakser et al ., 1995). 그러나 단백질 결합 시 큰 구조적 변화가 있는 경우 총 구조의 정보만 알려져 있는 낮은 정확도의 구조가 활용될 수 있다. GRAMM-X는 단백질-단백질 도킹 결과 뿐 아니라 단백질-소단위체와 같은 분자 쌍을 예측할 수 있다.

2.2 원편광 이색성

원편광 이색성(Circular dichroism, CD)은 어떠한 분자가 구조적으로 비대칭 요소를 지니고 있거나 chiral일 때 좌회전 원형 편광(left circularly polarized light)과 우회전 원형 편광(right circularly polarized light)에 대한 흡수도의 차이가 일어나면서 생기는 현상이다. CD 측정기기는 좌회전 원형 편광과 우회전 원형 편광의 흡광차를 측정하고, 이 값은 타원율(ellipticity, θ)로 나타내어진다. 좌회전 원형 편광의 흡광도(A_L)가 우회전 원형 편광의 흡광도(A_R)보다 높을 경우 양성 CD 스펙트럼이 나타나게 되며, 그 반대일 경우 음성 CD 스펙트럼이 나타난다. 만약 두 편광의 흡광도가 같다면 이는 해당 분자가 대칭적 발색단임을 의미하며, CD 효과가 생기지 않기 때문에 스펙트럼이 나타나지 않는다(Kelly et al., 2005). CD 측정으로 얻을 수 있는 단백질의 정보는 다양하다. 예를 들어 방향족 아미노산은 근 자외선 영역(near UV area)에 해당하는 250 ~ 350 nm의 파장을 흡수하는데, 이 방향족 아미노산을 다른 잔기로 치환함으로써 특정 잔기의 CD 스펙트럼의 특징을 파악할 수 있으며 단백질의 3차 구조를 파악하는 데 유용한 정보를 제공하여 야생형 단백질과 변이체에 대한 구조적 차이를 분석할 수 있다(Kelly et al., 2005). 또한, 단백질의 펩티드 결합 사이의 아마이드 골격은 원 자외선 영역(far UV area)에 해당하는 260 ~ 178 nm의 파장을 흡수한다. 이 영역에서는 두 가지 유형의 CD로 인한 전자전이가 일어나는데, 첫 번째로는 222 nm 부근에서 일어나는 n → π^* 전이이며 두 번째는 190 ~ 208 nm 범위에서 일어나는 π → π^* 전이이다 (Miles and Wallace 2016).

단백질의 2차 구조는 그 형태에 따라 각각 다른 범위의 파장을 흡수하며, 결과적으로 각각 고유의 CD 스펙트럼 형태를 가진다(Miles and Wallace, 2016). 이러한 CD 스펙트럼 결과를 non-constrained multilinear regression(MLR)이나 K2D3(http://kal-el.ugr.es/k2d/)과 같은 상업적인 계산 소프트웨어를 이용하여 분석하면 단백질 2차 구조의 구성요소를 추정할 수 있다(Andrade et al ., 1993). 원 자외선 영역에 대한 흡광도 분석은 단백질의 2차 구조 함량 파악뿐 아니라, 리간드-단백질 상호작용 및 단백질의 접힘을 관찰하는 데 유용한 정보를 제공한다(Miles and Wallace, 2016). CD는 단백질 분석을 위한 정량적인 방법이기 때문에 분광 변화는 단백질의 구조 변화와 직결될 수 있다. 따라서 단백질 상호작용의 양상을 분광 변화로 추정할 수 있다(Kelly et al ., 2005). 게다가 단일 단백질과 복합체 간의 분광변화를 통해 해리상수와 결합상수를 계산할 수 있다. 단백질이 다른 단백질 혹은 리간드와 결합할 때, 단백질의 구조변화 혹은 리간드의 광학 활성으로 인해 고유의 CD의 변화가 나타날 수 있다(Greenfield, 1996). 결합상수는 직접 적정, 연속 희석, 변성제에 대한 민감도 변화, 열 안정성 변화의 네 가지 방법으로 구할 수 있다. 이들 중에서도 직접 적정은 특정 A 단백질을 다른 단백질인 B를 이용한 A와 B가 만나서 이루는 AB 복합체가 자유 단백질 A, B와 평형을 이루는 구간을 적정하고 포화를 이루는 지점(saturation fraction, S)을 계산하여 진행되며, 적정에 사용된 단백질 B에 대한 해리상수의 근사값을 구할 수 있게 된다(Greenfield, 1996).

브라제인 변이체의 단맛 활성을 설탕 역치 실험으로 검증 된 SIAM yes-no task 방법으로 측정하고, 기존에 확립된 브라제인 다중변이체의 단맛 활성과 비교하였다(Hautus et al., 2010). 이와 더불어 야생형 브라제인을 포함한 브라제인 다중변이체들의 열 및 pH 안정성을 비교하여 각 잔기가 구조적인 안정성에 미치는 영향을 알아보았다.

본 연구는 감미단백질 브라제인의 다중변이체 연구를 통해 미각신호 전달 과정의 개시단계인 단맛수용체의 구조변화 연구 및 감미단백질 브라제인의 단맛 활성에 중요하게 영향을 미치는 잔기나 결합에 관한 중요한 결과를 얻을 것으로 기대된다.

Ⅱ. 기기 및 시약

1. 기기

균을 다루기 위한 무균작업대는 Vision Biotech. (Incheon, Korea)의 VB-700H1 Clean bench를 이용하였고, 고압멸균을 위해 VB-125A60 Autoclave를 이용하였다. 균을 배양하기 위해 Vision Scientific (Daejeon, Korea)사의 VS-1203P3N Incubator와 LAB house (Gyeonggi, Korea)사의 SI-220R Shaking incubator를 사용하였다. 균체 집균을 위한 원심분리기는 Hanil (Seoul, Korea)사의 Supra 22K, Micro-12, Smart-R17 을 이용하였고, 막 단백질 정제를 위한 초원심 분리기는 Beckman Coulter (Indianapolis, IN, USA)사의 Optima L-100K를 이용하였다. pH 측정은 Thermo Scientific (Pittsburgh, PA, USA)사의 ORION STAR A211 pH meter를 사용하였다. Vortex Mixer는 Barnsted-Thermolyne (Dubuque, IA, USA) 사의 Maxi Mix Ⅱ를 이용하였고, 교반기는 MTOPS사의 MS300 Hotplate & Magnetic Stirrer를 이용하였다. 저울은 Sartorius (Goettingen, Germany)사의 Analytical Balance CPA224S를 이용하였다. 단백질 정제를 위한 연동펌프로는 Pharmacia Biotech. (Uppsala, Sweden) Pump P-1를 사용하였고, 분별 수집기는 Fraction Collector FRAC-100를 이용하였다. 콜드 챔버는 Vision Scientific (Daejeon, Korea)사의 KMC-1302L를 이용하였고, 동결건조기와 초저온냉동고는 Ilshin Lab Co. (Gyeonggi, Korea)의 TFD5505 Freeze Dryer와 DF8503S Ultra Low Temperature Freezer를 이용하였다. 유전자의 Agarose gel 전기영동(electrophoresis) 장치는 Takara (Tokyo, Japan)의 mupid-2plus를 이용하였고, 단백질 전기영동 장치는 EIDO (Tokyo, Japan) NA-1010 Protein Electrophoresis를 이용하였다. 단백질 열 안정성 실험을 위한 Dry Bath Heating Block은 대한과학(Seoul, Korea)의 MaXtableTMH10을 사용하였다. PCR과 real time PCR 장치는 Bio-Rad (Berkeley, CA, USA)사의 Gene Cycler^TM와 CFX96을 이용하였고, 유전자 합성은 GenScript(Piscataway, NJ, USA)사에 의뢰하였다. 단백질 정량과 세포 수 측정을 위해 UV/VIS Spectrophotometer는 MECASYS (Daejeon, Korea)사의 OPTIZEN POP을 이용하였고, 단백질 2차 구조 분석을 위한 원편광 이색성 분광기(Circular Dichroism)는 Jasco (Easton, MD, USA)사의 J-815를 이용하였다. 항온조는 대한과학 (Seoul, Korea)사의 DH.WB000106을 사용하였다.

2. 시약

DNA 정제를 위한 Plasmid miniprep kit와 Gel extraction kit는 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)사의 CMG 0112, CMP 0112를 이용하였다. DNA 절단 과정은 제한효소 Sac Ⅰ, Sac Ⅱ와 Takara (Shiga, Japan)사에서 제공된 완충용액을 이용하였고, 유전자의 크기를 확인하기 위한 DNA marker는 Doctor protein (Seoul, Korea)사의 1kb Plus DNA Ladder Marker를 사용하였다. 대장균과 효모균을 배양하기 위한 yeast extract, Bacto peptone, Bacto tryptone, Bacto agar는 Difco laboratories(Sparks, NV, USA)의 제품을 사용하였다. P. pastoris 효모균주의 형질전환을 위한 시약으로 Pichia EasyComp^TM Kit, G418은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)의 제품을 사용하였다. 그 외 Yeast nitrogen base, Tris-base, agarose, ampicillin, TEMED, sodium dodecyl sulfate(SDS), glass beads, sucrose,dimethyl sulfoxide(DMSO)등은 Sigma Chemical co.(St. Louis, USA)의 제품을 사용하였다. 30%, 40%-Acryl amide solution과 polypeptide protein marker, coomassie brilliant blue R-250은 Bio-Rad (CA, USA)사의 제품을, Real-time PCR에 사용되는 SYBR은 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA USA)사의 SYBR® Green Real-Time PCR Master Mixes를 사용하였다. 단백질 정제 시 사용한 CM Sepharose Fast flow는 GE healthcare (Buckinghamshire, UK)의 제품을 사용하였다. Butanol,acetic acid, sodium chloride는 Duksan Pure Chemical co.(Gyeonggi, Korea)의 제품을 사용하였으며 potassium chloride, L-ascorbic acid는 Daejung(Incheon, Korea)의 제품을, sodium phosphate, sodium acetate, sodium hydroxide, D-galactose, methanol, ethanol, glycine, tricine은 Samchun(Seoul, Korea)의 제품을 사용하였다. 그 외 완충용액을 만들기 위한 시약과 사용한 모든 시약은 일급 및 특급 시약을 사용하여 실험하였다.

3. 사용 균주와 발현벡터

유전자 복제를 위해 Escherichia coli 균주인 TOP10을 Novagen (Madison, WI, USA)사에서 구입하였다. 감미단백질 브라제인을 발현하기 위한 균주 Kluyveromyces lactis GG799와 pKLAC2 벡터(vector)는 New England Biolab. (Ipswich, MA, USA)사로부터 구입하였다. 단맛수용체 T1R2, T1R3의 발현 균주 Pichia pastoris GS115는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사로부터, pPIC9K 벡터는 GenScript(Piscataway, NJ, USA)사로부터 구입하였다.

Ⅲ. 실험방법

1. K. lactis 발현계를 이용한 브라제인 다중변이체의 발현 및 특성 연구

1.1 브라제인 다중변이체의 제작, 발현 및 정제

브라제인의 단맛 활성에 영향을 미치는 주요 잔기를 도출하기 위해 3M 브라제인 변이체(H30R/E35D/E40A)를 주형으로 3M A1 ins(A1 ins/H30R/E35D/E40A)를 제작하였다. 상보적 서열을 갖는 부위 특이적 돌연변이유발에 사용되는 oligonucleotide primer(표 1)를 이용하여 Cosmo genetech 사에 의뢰하여 합성하였다.

선행 연구(국내 등록번호 제1536683호)에서 Kluyveromyces lactis의 발현벡터로 이용한 pKLAC2에는 분비발현을 유도하는 α-mating factor 신호서열 다음에 Kex protease가 인식하는 Kex cleavage site가 위치하여 목표 단백질이 제대로 분비발현 되도록 디자인되어 있다. 이 벡터의 multi cloning site에 포함된 Xho Ⅰ, Stu Ⅰ 제한효소 자리에 브라제인 변이체 서열을 삽입하였다. 브라제인 서열이 삽입된 pKLAC2 벡터는 K. lactis 의 genomic DNA에 존재하는 LAC4 프로모터의 말단에 상동성을 갖기 위해 Sac Ⅱ 제한효소 처리하였다 (도 19). 상동성 재조합의 원리로 브라제인 유전자를 K. lactis에 다중 삽입시킨 뒤, 실시간 PCR을 통해 브라제인 유전자가 가장 많이 삽입된 균주를 선별해낸다(Jo et al., 2013; Yun et al. 2016).

브라제인 유전자가 삽입된 K. lactis는 기존에 확립된 방법으로 배양을 진행하였다.

우선, 백금이를 이용하여 브라제인 변이체의 유전자가 형질전환 된 K. lactis cell의 20% glycerol stock에서 소량을 취하여 YPD-Agar(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, 2% Agar) 고체배지에 도말하고 30 ℃에서 약 72 시간 동안 배양하였다. YPD-Agar에서 형성된 단일 colony를 5 mL의 YPD(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose) 당 1개씩 접종하여 OD₆₀₀의 값이 약 20~22에 도달할 때까지 30 ℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 이 배양액은 유도제인 Galactose를 포함한 YPGal(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Galactose at pH 5.0, using acetic acid) 배지에 2%가 되도록 접종하여 30 ℃에서 200rpm으로 96시간 동안 진탕배양하였다.

배양이 완료되면 8650g, 4 ℃의 조건에서 30분 동안 원심분리 하여 균과 배양 상층액을 분리하여 상층액을 취한다. 브라제인 정제에는 양이온 교환수지인 CM Sepharose Fast flow를 이용하였다. 배양 상층액을 로딩하기 전, 해당 수지를 컬럼에 충진한 뒤 충진된 수지의 부피의 20배 정도에 해당하는 평형 완충용액(50 mM sodium acetate, pH 4.0, using acetic acid)을 흘려주어 수지를 평형상태로 맞춘다. 브라제인의 등전점(pI)은 5.4이기 때문에 acetic acid를 이용하여 상층액을 양이온 교환수지가 안정한 pH 범위 내에서 브라제인의 등전점 보다 충분히 낮은 pH인 4.0으로 맞추고, 평형상태의 수지에 1 mL/min의 유속으로 로딩하였다. 로딩이 완료되면, 세척완충용액(50 mM sodium acetate, 40 mM sodium chloride, pH 4.0, using acetic acid)을 OD₂₈₀값이 0이 될 때까지 충분히 흘려준 뒤 용출완충용액(50 mM sodium acetate, 400 mM sodium chloride, pH 4.0, using acetic acid)을 이용하여 5 mL씩 분획 용출을 받았다. 분획 용출액은 OD₂₈₀ 측정 후, 일정 구간 별로 2 mL 가량 취하여 증류수에 투석 후 OD₂₈₀값을 측정한 뒤 동결건조 하여 투석 후의 OD₂₈₀값을 기준으로 단백질 총량을 통일시켜 16.5% Tris-Tricine Gel에 브라제인이 용출된 구간을 확인하여 분리하였다. 브라제인 용출액은 증류수에 투석하여 용출 완충용액을 증류수로 교환한 뒤 동결건조하였다. 최종적으로 얻어낸 브라제인 분말은 바이알에 담아 입구를 봉한 뒤 -80 ℃에 보관하였다.

1.2 수정된 SIAM yes - no task에 의한 브라제인의 단맛 절대 역치 측정

브라제인의 감미도를 객관적으로 평가하기 위해 설탕 역치 실험으로 그 효용성이 증명된 SIAM yes-no task 방법을 도입하였다(Hautus et al ., 2010). 본 실험의 주요 특징은 암맹 평가로 진행되며, 총 30회의 테스트 중 절반이 Blank라는 것이다. 실험에는 등차희석 된 10개의 샘플을 사용하게 되는데, 희석을 해야 하는 가장 진한 용액의 농도를 적절하게 맞추어야 다음 과정에서 적절한 실험 결과를 얻게 되어 절대 역치 값을 정확히 구할 수 있다. 그렇기 때문에 최소 3~5명의 참여자를 통해 실험에 사용할 단백질 용액 농도의 상한선을 결정하였다. 처음에는 범위를 10배, 100배, 1000배 희석 등으로 격차를 크게 두어 시작하고 참여자의 응답에 따라 그 범위를 점차적으로 좁혀가는 방향으로 진행하였다. 이렇게 결정된 농도의 단백질 용액은 최초의 단백질 용액(Stock)으로부터 부피 플라스크를 이용하여 10배씩 희석하여 100 mL에 해당하는 단백질 용액을 제조한다. 이 용액은 단맛 측정 실험의 10번 샘플이 되며, 이 용액을 등차희석 하여 1~10 번에 해당하는 단백질 용액을 각각 10 mL씩 제조하였다.

실험의 참여자는 비흡연자로 구성되었으며, 실험 전 날 금주, 실험하기 2~3시간부터 금식하는 등 철저히 실험 조건을 제한하였다. 절대 역치 실험은 1 세트 당 총 30회 진행되며, 이 중 15회는 3차 증류수이다. 실험자는 처음과 끝을 제외한 항에 증류수를 임의로 배치하되 연속해서 3회 이상 증류수 혹은 단백질 용액을 맛보게 하지 않도록 하였다. 시작 농도는 1번 샘플로 지정하고 참여자에게 해당 샘플을 200 μL 투여한 뒤 단맛이 느껴지는지에 대해 대답하도록 하였다. 이 때, 단맛이 난다고 응답(Yes)하면 참여자가 단백질 용액을 제대로 인지한 것이기 때문에 Hit 으로 간주하고, 실험자는 해당 농도에서 한 단계 낮은 농도(-1)의 샘플을 준비하였다. 반대로 단맛이 나지 않는다고 응답(No)하면 참여자가 단백질 용액을 인지하지 못했기 때문에 Miss로 간주하고, 실험자는 해당 농도에서 한 단계 높은 농도(+1)의 샘플을 준비하였다. 만약 증류수 샘플을 투여하게 된다면 직전까지 맛보게 한 샘플로 인한 결과를 그대로 유지하였다. 참여자가 증류수 샘플에서 단맛이 난다고 응답(Yes)하면 이 경우 잘못된 인지가 일어났기 때문에 False alarm으로 간주하고, 실험자는 해당 숫자에서 두 단계 높은 농도(+2)의 샘플을 준비하였다. 반대로 단맛이 나지 않는다고 응답(No)하면 참여자가 옳게 대답하였기 때문에 Correct rejection으로 간주하고, 실험자는 직전까지 맛보게 한 샘플로 인한 결과를 다음 회수의 실험에 그대로 반영하였다. 이때, 농도가 증가(+)하다가 감소(-) 혹은 감소하다가 증가하는 지점에서의 샘플 숫자를 turnaround number로 정의하였다. 실험이 모두 끝난 후, 실험자는 turnaround number의 수가 짝수가 되도록 처음 2~3개의 turnaround number를 제외하였다. 이 turnaround number의 평균값이 바로 참여자의 절대 역치가 된다.

1.3 브라제인 다중변이체의 열 안정성 연구

브라제인 야생형 부타입을 포함하여 H30R/E35D/E40A, A1 ins/ H30R/E35D/E40A 변이체의 열 및 pH 안정성을 진행하고 각각을 비교하였다. 단맛 활성이 감소하는 것을 직접 측정하기 위해 단맛 활성이 가장 약한 야생형 부타입을 기준으로 농도를 통일하였다.

우선, CD 측정 및 단맛활성 측정을 위해 각 변이체들을 40 μM의 농도로 15 mL씩 준비하였다. 이 샘플을 10배 희석한 4 μM 샘플은 야생형 부타입 기준으로 0.025 mg/mL에 해당하며, 이 값은 실제 단맛테스트 시 Stock(0.022 mg/mL)의 농도와 유사하다. 15 mL의 용액 중 5 mL는 pH 안정성 실험에 사용하고 9 mL는 열 안정성 실험에 사용하기 위해 따로 분취하여 20 μM로 희석하였다. 남은 1 mL의 용액은 단백질 정량에 사용하였다.

브라제인의 열 안정성 시험을 위해 80~95 ℃의 온도 범위를 3 ℃ 간격으로 세분화 하여 실험을 진행하였다. 우선, 20 μM 브라제인 샘플을 변이체 별로 3 mL씩 분취하여 해당 온도를 유지하고 있는 Dry bath에 총 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 시간 동안 30분 간격으로 단맛 활성을 측정하는데, 240 μL의 브라제인 샘플을 취하여 960 μL의 3차 증류수와 섞어 4 μM 로 희석시켰다. 이 용액을 준비된 바이알에 등차 희석하여 0 μM, 0.8 μM, 1.6 μM, 2.4 μM, 3.2 μM 의 브라제인 희석용액을 제조하였다. 3명의 피험자를 고정시키고 희석용액을 낮은 농도부터 200 μL씩 투여하여 단맛이 나는지 아닌지 응답하도록 한다. 인큐베이션이 끝난 브라제인 샘플은 원편광 이색성 분광 측정을 위해 밀봉 후 4 ℃에 보관하였다.

2. 단백질 정량

모든 정제된 단맛수용체 단량체 및 브라제인 변이체들은 205 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 대부분의 단백질은 1 mg/mL 용액 기준으로 205 nm에서 고유의 흡광 계수를 가지고 있으며, 이 흡광 계수는 단백질 측정을 위한 최적의 파장이 205 nm가 되도록 한다(Scopes 1974).

UV/Vis 흡광 광도계의 기준 흡광도는 단맛수용체 단량체와 브라제인 샘플을 용해시킨 용매로 측정하여 고정시켰다. 각 단백질 샘플은 미광 효과(stray effect)를 최소화시키기 위해 205 nm 에서의 흡광도 값이 0.3에 근접할 때까지 점차적으로 희석시켰다. 희석시킨 단백질 용액은 205 nm 와 280 nm에서의 흡광도를 각각 3회 측정하여 평균값을 구하였다. 그 후, 하기 수학식 1을 이용하여 각 단백질 샘플의 고유 몰 흡광계수를 구하였다. 본래의 단백질 샘플 농도는 다음 수학식 2를 이용하여 구한 값에 희석배수를 곱하여 구하였다.

[수학식 1]

ε₂₀₅ ^1mg/mL=120×(A₂₈₀/A₂₀₅)+27

[수학식 2]

Concentration(mg/mL) = A₂₀₅/ε₂₀₅ ^1mg/mL

3. 단백질-단백질 상호작용 연구

3.1 컴퓨터 모델링 및 도킹 시뮬레이션

브라제인(NCBI Reference Sequence : ACK76425.1) 및 단맛수용체 T1R2(NCBI Reference Sequence: NP_689418.2)와 T1R3(NCBI Reference Sequence: NP_689414.1)의 아미노산 서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 참고하였다. T1R2와 T1R3는 각각 막 관통 부위를 제외한 extracellular domain의 서열(T1R2: #1~566, T1R3 : 1~570)만을 사용하였다. 브라제인 야생형 부타입 및 다중변이체들과 단맛수용체의 컴퓨터 구조 모델링은 아미노산 서열의 상동성에 기반한 자동 단백질 모델링 소프트웨어인 ‘SWISS-MODEL EXPASY'(http://swissmodel.expasy.org) 프로그램을 이용하였고, 서열 일치도(sequence indentity), 정량적 모델 에너지 분석(Qualitative model energy analysis, QMEAN)값, 뒤틀림 인자(torsion factor) 및 용해 인자(solvation factor)등의 기준들로 각각의 단백질 모델을 비교하여 최적의 모델을 선정하였다. 1차적으로 선정한 단백질 모델은 ‘Autodock Tools’ 소프트웨어를 이용하여 수소 및 gasteiger 전하를 부여하는 과정을 진행하였다. 이를 통해 단백질 구조 내의 회전 가능한 결합을 수정하고 주위에 존재할 수도 있는 물 분자를 제거함으로써 구현된 단백질 모델에서 부족한 구조적 요소를 보충하였다. 수정이 완료된 최종 단백질 모델은 protein data bank(pdb) 파일로 저장하였다.

컴퓨터로 모델이 구현된 T1R2와 T1R3은 ‘GRAMM-X’ 도킹 시뮬레이션 소프트웨어를 이용하여 단백질-단백질 결합 분석을 진행하였다. 10개의 결합모델은 ‘UCSF Chimera’ 소프트웨어로 구현하여 각각을 pdb 파일로 저장하였다. 각각의 결합모델은 ‘DIMPLOT’으로 T1R2와 T1R3의 결합에 관여하는 아미노산 간의 상호작용 분석을 진행하고, ‘SEQMOL’ 소프트웨어를 이용하여 해리상수 및 친화 에너지를 계산하였다. 이 분석결과를 참고하여 최적의 T1R2-T1R3 결합모델을 선정하였다.

브라제인 야생형 부타입 및 변이체의 단백질 모델들은 ‘GRAMM-X’ 도킹 시뮬레이션 소프트웨어를 이용하여 T1R2-T1R3 이종이합체 결합모델과의 결합 분석을 진행하였다. ‘GRAMM-X’로 예측한 10개의 결합모델은 T1R2-T1R3 결합모델을 선정할 때와 같이 각각을 pdb 파일로 저장하였다. T1R2-T1R3 이종이합체와 브라제인의 상호작용에 관여하는 아미노산 간의 상호작용은 ‘DIMPLOT’을 이용하여 분석하고, ‘SEQMOL’ 소프트웨어를 이용하여 해리상수 및 친화 에너지를 계산하였다. 최종적으로 선정한 결합모델은 ‘UCSF Chimera’를 이용하여 3차 구조를 확인하였다.

3.2 원편광 이색성 분광법

T1R2-T1R3 단맛수용체, 브라제인 다중변이체들 및 단맛수용체-브라제인 복합체의 원편광 이색성(Circular dichroism) 스펙트라 측정은 인하대학교의 표준분석연구원에 위치한 J-815 spectrometer(Jasco co., Ltd.)를 이용하였다. 광원으로는 150W 제논 램프를 사용하였으며, High performance UV_Vis_IR avalache photo-diode fluorescence monochro 검출기를 이용하여 측정하였다. 실시간 측정되는 데이터는 Spectra ManagerTM II 소프트웨어로 기록, 분석하였다. 측정 전 scan 범위를 180 nm에서 260 nm로, scan 속도를 100 nm/min으로 설정한 뒤 시료를 넣지 않은 채 baseline의 흡광을 측정하였다. 이후 브라제인 샘플은 TDW 용매에 20 μM 농도로 맞추어 측정하고 T1R2, T1R3 단량체 및 이합체는 0.9 mM Tween 20, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 용매에 5 μM 농도로 맞추어 측정하였다.

Ⅳ. 결과

1. K. lactis 발현계를 이용한 브라제인 다중변이체의 발현 및 정제

3M 브라제인 변이체(H30R/E35D/E40A)를 주형으로 1번째 자리에 알라닌(alanine)을 도입하여 3M A1 ins.을 작성하였다 (도 3).

제작된 브라제인 야생형 부타입(des-pE1MBRZ) 및 브라제인 변이체 H30R/E35D/E40A (3M), A1 ins/H30R/E35D/E40A(3M A1 ins)의 유전자가 삽입된 K. lactis GG799 균주를 YPGlu에 배양하여 세포를 생장시키고, 이를 유도제인 Galactose가 포함된 YPGal 배지에 접종, 배양하여 브라제인 변이체의 분비발현을 유도하여 평균 15 mg/L의 브라제인을 생산하였다. 배양이 완료된 배양액은 저속 원심분리를 통해 세포를 분리하고 상층액을 carboxymethyl sepharose 양이온 교환수지를 통해 정제하였다. 분획 용출이 완료된 브라제인 샘플은 투석을 통해 용출 평형용액에 포함된 염을 제거하고 동결건조한 뒤 SDS-PAGE를 통해 순도를 파악하였다(도 4). 다른 단백질들이 포함되어 순도가 낮을 경우, Sephacryl S-100 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 브라제인을 분리하였다. 최종 정제 후의 브라제인은 약 7 mg/L의 수율로 얻어졌다.

2. 단맛 활성 및 상호작용 분석

2.1 컴퓨터 모델링 및 도킹 시뮬레이션

2.1.1 단백질 구조 모델링

단맛수용체의 단량체인 T1R2, T1R3는 대사성 글루탐산 수용체(metabotropic glutamate receptor, mGluR)와의 아미노산 서열 유사성을 바탕으로 다음과 같이 3개의 구조적 영역으로 분류할 수 있다. 세포 막 바깥에 위치한 Venus Flytrap Module(VFTM)은 lobe 1과 2로 구성되어 있으며 두 lobe의 위치에 따라 ‘open’, ‘closed’ 구조를 나타내고 그 다음으로 이어지는 Cystein-rich domain(CRD)은 9개의 보존된 시스테인 잔기를 보유하고 있으며, Transmembrane domain(TMD)는 막을 통과하는 7개의 나선구조로 이루어져 있다(Assadi-Porter et al ., 2010). T1R2, T1R3의 세포 외부 영역의 상동성 기반 모델링은 mGluR3을 주형 구조로 하였다. 상동성 기반 구조 모델링의 결함으로 인해 모델링이 이루어진 구조의 N-, C-말단에서 소량의 잔기가 부족한 것으로 나타나는데, 이는 상호작용에 큰 영향을 미치지 않으므로 무시할 수 있다. 또한, 모델링이 이루어진 T1R2, T1R3는 서열 상동성, 서열 적용범위, QMEAN 값, 용해 인자 및 비틀림 인자 등을 고려하여 최적의 예측 모델을 선정하였다(도 6, 표 3). T1R2, T1R3의 예측된 모델은 mGluR3과의 평균 서열 상동성을 26.5% 나타내었는데, 이는 구조가 알려진 다른 단백질들 중에서 가장 높은 값이다. 또한 평균 90%의 높은 서열 적용범위를 나타내었다. 브라제인의 다중변이체는 단맛수용체와 마찬가지로 서열 상동성, 서열 적용범위, QMEAN 값, 용해 인자 및 비틀림 인자 등을 고려하여 최적의 예측 모델을 선정하였다(도 5, 표 2).

T1R2와 T1R3 서브유닛의 가장 좋은 예측 모델의 평가

Subunit	Seq . queried	Seq . modeled	Seq . identity	Seq . coverage	QMEAN	Solvation factor	Torsion factor
T1R2	#1~566	#24~556	27.08	0.89	-12.82	-8.84	-8.27
T1R3	#1~570	#26~559	25.97	0.91	-9.91	-7.58	-5.90

브라제인 다중변이체의 최적 예측 모델 평가

Brazzein mutant	Seq . queried	Seq . modeled	Seq . similarity	Seq . coverage	QMEAN	Solvation factor	Torsion factor
des-pE1M	#1~53	#1~53	93.26	1.00	-1.25	-0.75	-1.39
H30R/E35D/E40A	#1~53	#1~53	94.34	1.00	-2.67	-1.26	-2.48
A1 ins/ H30R/E35D/E40A	#1~54	#1~54	92.59	1.00	-5.62	-2.01	-7.20

2.1.2. T1R2 - T1R3와 브라제인 다중변이체의 도킹 시뮬레이션

T1R2-T1R3 이종이합체 모델을 형성하기 위해 ‘GRAMM-X’를 이용하여 T1R2와 T1R3의 결합 예측 모델을 작성하였다. 총 10가지의 예측된 배향 중에서도 선행 연구결과를 일차적으로 고려하여 가장 가능성이 높은 모델을 선정하였다. 대사성 글루탐산 수용체(metabotropic glutamate receptor, mGluR)의 결정구조 연구에 따르면, mRluR은 이합체를 이룰 때 세포막 외부에서 VFTM과 CRD가 나란히 배치되고 두 단량체의 TMD가 세포막으로 이어지는 배향을 가지고 있다(Kunishima et al ., 2000). T1R2, T1R3는 mGluR을 주형으로 하여 상동성 기반 모델링을 진행하였기 때문에 이 결과는 단맛수용체 모델링에서도 적용할 수 있다(Assadi-Porter et al ., 2010)). 이를 바탕으로 선정한 최적의 이종이합체 모델의 T1R2와 T1R2간 Gibbs 자유 에너지와 해리상수를 ‘SEQMOL’ 소프트웨어를 통해 예측하였다. 이종이합체 결합모델의 Gibbs 자유에너지는 -2.69 kcal/mol, 해리상수는 1.09E-02 M로 나타났다.

브라제인과 수용체의 상호작용에 중요한 역할을 하는 아미노산을 찾기 위해 야생형 부타입인 des-pE1M 브라제인을 포함하여 다중변이체 브라제인 H30R/E35D/E40A, A1 ins/H30R/E35D/E40A을 각각 T1R2-T1R3 이종이합체와 결합시켜 복합체 모델을 작성하였다(도 7~9). 그 후 각각의 복합체 모델을 ‘SEQMOL’ 소프트웨어를 통해 Gibbs 자유에너지 및 해리상수를 도출하였다(표 4). 또한, ‘DIMPLOT’ 소프트웨어를 이용하여 브라제인 변이체들과 이종이합체의 상호작용에 관여하는 아미노산을 분석하였다(도 10~12, 표 5~7). 그 결과 브라제인의 Ser13, Gln16, Tyr38, Arg42, Leu44 아미노산 잔기가 단맛수용체와 강한 수소결합 혹은 다중 소수성 상호작용을 함으로써 단맛수용체와의 상호작용에 중요한 역할을 할 것이라는 예측을 할 수 있었다.

브라제인 다중변이체의 T1R2-T1R3 이종이합체로 도킹된 모델 평가.

Brazzein variant	Complex model	Gibbs binding energy ( kcal / mol )	Dissociation constant ( μM )
des - pE1M	#1	- 5.46	1.04E+02
	#2	- 5.30	1.36E+02
	#3	-7.17	5.87E+00
	#4	-8.49	6.39E-01
	#5	-10.84	1.23E+02
	#6	-12.88	4.00E-04
	#7	-4.91	2.62E+02
H30R / E35D / E40A	#1	-2.93	7.28E+03
	#2	-3.48	3.48E+02
	#3	-5.31	1.34E+02
	#4	-5.82	5.67E+01
	#5	-7.44	3.73E+00
	#6	-15.32	6.64E+06
	#7	-2.77	9.53E+03
A1 ins / H30R / E35D / E40A	#1	-16.01	1.15E-06
	#2	-8.12	1.19E+00
	#3	-15.05	1.05E-05
	#4	-13.88	7.46E-05
	#5	-14.15	4.74E-05
	#6	-8.64	4.97E-01
	#7	-8.85	3.49E-01

T1R2-T1R3 이종이합체와 des-pE1M 브라제인 사이의 친수성 및 소수성 상호 작용에 관련된 대표 아미노산 잔기

Model	Type	T1R2 subunit	T1R3 subunit	Brazzein	Distance
#1	Hydrophilic	Ile424		Leu17	3.28 Å
		Ser155		Tyr38	2.43 Å
		Leu158			2.79 Å
			Ser59	Glu8	2.54 Å
				Tyr10	3.26 Å
			Lys111	Lys41	2.54 Å
	Hydrophobic	Lys174, Pro178, Pro417, Tyr418, Leu421, Glu422	Leu51, Val61	Ser13, Cys15, Gln16, Ala18, Glu35, Cys36, Leu44	within 5 Å
#2	Hydrophilic	Leu521		Asn43	2.88 Å
		Gln536		Ser13	1.93 Å
		Ala537			2.78 Å
			Glu525	Lys4	2.70 Å
			Ser528		2.60 Å
			Arg530	Glu40	2.77 Å
			Trp546	Lys2	2.49 Å
	Hydrophobic	Cys517, Asp519, Pro522, Thr524	Gln507, Ala526, Glu549, Asp520, Val522, Asp523	Val6, Glu8, Pro11, Val12, Tyr38, Asp39, Arg42	within 5 Å
#3	Hydrophilic	Leu156		Ser13	3.24 Å
	Hydrophobic	Phe157, Tyr416, Trp418, Leu158	Leu51	Pro11, Val12, Phe37	within 5 Å
#4	Hydrophilic	Ser155		Ser13	3.30 Å
		Glu422		Asn43	2.82 Å
			Ala49	Asn19	2.94 Å
			Ser59	Gln16	3.19 Å
	Hydrophobic	Val175, Pro178, Trp418, Ile424, Trp425	Glu48, Gly50, Leu51	Pro11, Gln16, Leu17, Lys41, Arg42	within 5 Å
#5	Hydrophilic	Asn24		Tyr7	2.66 Å
			Ala120	Tyr53	2.52 Å
			Ala417	Lys2	3.15 Å
	Hydrophobic	Ala116	Phe159, Pro420, Val421, Lys422, Pro423, Trp424	Cys3, Tyr50, Cys51, Gln52	within 5 Å
#6	Hydrophilic	Asn24		Lys14	2.29 Å, 3.06 Å
		Leu112		Tyr23	2.96 Å
			Arg123	Arg32	2.80 Å
			Met162	Tyr53	2.51 Å
	Hydrophobic	Tyr113, Ala116	Phe159, Ala120, Ser122	Asp28, His39, Cys51, Glu52	within 5 Å
#7	Hydrophilic	Lys174		Gln16	3.33 Å
		Leu421		Ser13	3.33 Å
	Hydrophobic	Asp173, Val175, Ile424, Pro440, Gln441	Ser58, Pro246, Arg247	Val12, Tyr38, Glu40, Arg42, Asn43	within 5 Å

T1R2-T1R3 이종이합체와 H30R/E35D/E40A 브라제인 사이의 친수성 및 소수성 상호 작용에 관련된 대표 아미노산 잔기

Model	Type	T1R2 subunit	T1R3 subunit	Brazzein	Distance
#1	Hydrophilic	Ser155		Gln16	3.09 Å
			Ser59	Lys14	2.13 Å
	Hydrophobic	Leu156, Leu158, Pro178, Tyr416, Trp418	Glu48, Leu51, Val61, Lys111, Leu114	Asn9, Tyr10, Val12, Ser13, Try38, Asn43	within 5 Å
#2	Hydrophilic	Asn24		Val6	3.12 Å
			Ser122	Lys26	1.87 Å
					3.01 Å
				Arg32	2.67 Å
	Hydrophobic	Tyr113, Ile132, Ala116, Tyr131	Phe159, Val421, Lys422, Pro420, Pro423, Trp424	Asn9, Leu27, Asp28, Tyr50, Cys51, Glu52	within 5 Å
#3	Hydrophilic	Tyr28		Tyr38	3.19 Å
		Asn83		Ser13	3.33 Å
		Asn84		Lys14	2.96 Å
	Hydrophobic	Leu29, Pro30, Arg76, Glu80, Leu93, Phe338, Trp341		Val12, Gln16, Leu17, Asn19	within 5 Å
#4	Hydrophilic		Ser59	Tyr38	3.22 Å
	Hydrophobic	Pro178, Trp418, Leu421, Ile424, Pro440	Arg52	Lys4, Val6, Leu17, Arg42, Asp39, Ala40, Lys41	within 5 Å
#5	Hydrophilic	Asp124		Lys41	3.28 Å
		Ser413		Gln16	2.72 Å
		Cys415		Tyr38	2.97 Å
	Hydrophobic	Arg123, Ala126, Tyr128, Arg137, Pro416, Asp419		Cys15, Asp39, Ala40, Arg42, Leu44	within 5 Å
#6	Hydrophilic	Asp26		Arg30	3.32 Å
		Tyr28		Arg32	2.85 Å
		Asn130		Lys2	3.09 Å
			Ser122	Asp39	3.12 Å
			Asp419	Asn43	2.99 Å
	Hydrophobic	Asn42, Tyr113, Tyr131, Ile132	Phe159, Pro420, Lys422, Pro423, Trp424	Lys5, Asp9, Pro11, Ser13, Lys41, Tyr50	within 5 Å
#7	Hydrophilic	Arg30		Lys4	3.30 Å
				Glu52	2.87 Å
		Ile83		Tyr38	3.15 Å
		Lys86			2.23 Å
		Thr346		Arg32	2.74 Å
		Asp347		Ser33	2.00 Å
	Hydrophobic	Lys32, Pro91, Gly92, Arg94, Ala345, Pro348, Ala439		Cys36, Phe37, Leu44, Arg42,	within 5 Å

T1R2-T1R3 이종이합체와 A1 ins/H30R/E35D/E40A 브라제인 변이체 사이의 친수성 및 소수성 상호 작용에 관련된 대표 아미노산 잔기

Model	Type	T1R2 subunit	T1R3 subunit	Brazzein	Distance
#1	Hydrophilic	Asn24		Arg33	2.92 Å
		Ile132		Glu53	2.93 Å
			Trp424	Glu9	3.33 Å
	Hydrophobic	Tyr113, Ala116	Phe159, Trp424	Ala1, Lys3, Glu9, Arg33, Glu53, Tyr54	within 5 Å
#2	Hydrophilic	Asn24		Lys5	3.05 Å
		Tyr96		Tyr54	3.11 Å
			Ser122	Ala19	3.27 Å
			Pro181	Arg43	2.91 Å
			Ser182		2.50 Å
			Val421	Gln17	3.08 Å
	Hydrophobic	Tyr28, Tyr113	Ala120, Ser122, Leu161, Pro420, Val421, Trp424	Ser14, Gln17, Leu18, Asn20, Tyr39, Ala41, Leu45, Glu53, Tyr54	within 5 Å
#3	Hydrophilic		Ser66	Ala1	3.11 Å
			Asp249	Tyr54	3.16 Å
			Gly314	Tyr39	3.30 Å
			Gln368	Tyr51	3.11 Å
	Hydrophobic		Leu308, Leu312, Met315, Ala316, Arg357, Leu361,	Asp2, Arg33, Asp40, Ala41, Cys52	within 5 Å
#4	Hydrophilic	Asn24		Asp40	3.28 Å
		Tyr357		Arg43	3.18 Å
		Thr358		Ser14	2.86 Å
				Gln17	3.25 Å
			Ser182	Asp2	2.23 Å
			Ser446	Arg33	3.03 Å
	Hydrophobic	Ser25, Val56,	Arg177, Pro181, Gln425, Leu426, Met430,	Ala1, Cys4, Tyr30, Phe38, Ala41, Lys42, Cys52, Gln53	within 5 Å
#5	Hydrophilic	Gln265		Asp50	3.28 Å
		Asn292		Tyr39	2.57 Å
	Hydrophobic	Asp262, Thr268, Arg270, Thr294, Thr485, Val486, Met492	Lys512, Gly513, Phe514	Glu17, Leu18, Asn20, Tyr24, Phe38, Arg43, Leu45, Glu53	within 5 Å
#6	Hydrophilic	Asp307		Tyr54	2.96 Å
				Arg33	3.18 Å
		Met310			1.96 Å
		Glu358		Lys5	2.01 Å
		Gln379		Asn23	2.99 Å
	Hydrophobic	Leu312, Arg369, Ser464, Ala383, Val405		Lys27, Tyr39, Glu53	within 5 Å
#7	Hydrophilic		Tyr128	Tyr39	2.83 Å
			Cys129	Gln17	3.18 Å
			Gly414	Gln46	2.20 Å
	Hydrophobic		Tyr35, Gly92, Ile125, Ala127, Leu408, Cys415, Pro416, Asp419	Lys5, Val7, Leu18, Ala19, Asp40, Ala41, Lys42, Asn44, Ile48	within 5 Å

3.2 수정된 SIAM yes-no task 에 의한 브라제인의 단맛 활성 측정

고순도로 정제된 브라제인 변이체는 몰 흡광 계수를 정확히 구하기 위해 205 nm 에서의 흡광도(A205)가 0.3 에 근접하도록 희석하였다. 그 후 희석된 단백질 용액을 280 nm에서의 흡광도(A280)를 측정하였다. 모든 흡광도 측정은 최소 3회 이상 반복 측정하여 평균값을 구하였고, A205및 A280값을 통해 브라제인 변이체의 고유 몰 흡광계수를 구하였다(표 8).

브라제인 다중변이체의 단맛활성은 15명의 고정된 참여자에게 SIAM yes-no task 역치 실험을 최소 2회 이상 진행하여 통계를 구함으로써 측정 및 비교하였다(표 9). 그 결과, 야생형 브라제인과 비교했을 때 H30R/E35D/E40A 변이체는 10.2배, A1 ins/H30R/E35D/E40A 변이체는 2038배 높은 단맛 활성을 나타냄을 확인하였다.

브라제인 다중변이체의 추정된 몰 흡광계수(ε205)

Brazzein mutants	Abs205	Abs280	ε205
des-pE1M	0.322	0.023	35.57
H30R/E35D/E40A	0.314	0.024	36.17
A1 ins/ H30R/E35D/E40A	0.304	0.011	31.34

브라제인 다중변이체의 단맛 강도 비교

Sweet tasting molecule	Molecular mass(Da)	Experimental taste threshold	Sweetness in comparison to sucrose	Sweetness in comparison to wild type brazzein
		(g(100mL)-1)	(g/g)
Sucrose	342.3	2.0	1
des-pE1M- brazzein	6370	0.0013720	1458	1
H30R/E35D/E40A	6317	0.0000133	15,000	10.2
A1ins/ H30R/E35D/E40A	6388	0.00000067	2,971,428	2038

상기 표 9로부터, 브라제인 다중 변이체 A1ins/H30R/E35D/E40A는 동일한 양의 수크로오스(설탕)과 비교하여 약 2,970,000배 이상 단맛이 높았다. 이러한 단맛은 설탕 역치 실험으로 검증된 SIAM yes-no task 방법으로 측정하여 결과를 도출할 수 있다.

또한, 브라제인 다중 변이체 A1ins/ H30R/E35D/E40A는 야생형 브라제인에 비해 약 2038배 단맛이 증가되었다. 이러한 단맛 활성은 선행 특허(10-1795573, 10-1416892)를 참고하여 브라제인 야생형 대비 브라제인 변이체 단맛 활성도를 도출하였다.

3.3 원편광 이색성 분광법

3.3.1 단맛수용체와 브라제인의 상호작용 분석

원편광 이색성 분광 측정을 통해 단맛수용체 T1R2, T1R3 그리고 브라제인 변이체들의 2차구조를 분석하였다. 또한, T1R2-T1R3 이종이합체가 브라제인과 단백질-단백질 상호작용을 하여 생기는 구조적 변화를 측정하였다.

우선, T1R2와 T1R3 단량체와 T1R2-T1R3 이종이합체, 그리고 브라제인 변이체들의 평균 타원율(mean residue ellipticity(MRE), [θ] (degㆍcm^{2 ㆍ}dmol^-1))을 250 ~ 190 nm 범위에서 측정하였다(도 13). K2D3 소프트웨어를 통해 α-나선 구조와 β-가닥 구조의 함량을 구한 결과, T1R2는 69.43%의 α-나선 구조와 11.26%의 β-가닥 구조를 포함하고 있으며 T1R3은 65.87%의 α-나선 구조와 12.13%의 β-가닥 구조를 포함하고 있는 것으로 나타났다. 또한, 각 브라제인 변이체는 야생형 부타입의 경우 10.27%의 α-나선 구조와 28.93%의 β-가닥 구조를, H30R/E35D/E40A 변이체의 경우 10.11%의 α-나선 구조와 31.89%의 β-가닥 구조를, A1 ins/H30R/E35D/E40A 변이체의 경우 8.46%의 α-나선 구조와 32.1%의 β-가닥 구조를, 각각 포함하고 있는 것으로 나타났다(도 14, 표 10).

T1R2-T1R3 이종이합체와 브라제인 변이체는 1:1 몰비율로 혼합하여 복합체를 형성한 뒤 원편광 이색성 분광 측정을 진행하였다(도 15, 16). 측정 결과를 통해 T1R2-T1R3와 브라제인 간의 해리상수를 구하는 과정은 다음과 같다.

T1R2-T1R3 이종이합체를 R, 브라제인 변이체를 B, 이종이합체와 브라제인의 복합체를 RB라 정의했을 때의 해리상수(K_d)는 [R][B]/[RB]로 나타낼 수 있다(Martin and Schilstra 2008). 이때, T1R2-T1R3 이종이합체와 브라제인 변이체들의 농도에 따라 나타나는 원편광 이색성 분산의 스펙트라 신호는 다음 수학식 3과 같이 표현할 수 있다(Martin and Schilstra 2008).

[수학식 3]

S = Δε_R[R] + Δε_B[B] + Δε_RB[RB]

= Δε_R[R₀]+Δε_B[B₀]+(Δε_RB- Δε_R- Δε_B)[RB]

([X₀]=X의 초기농도, Δε = 흡광계수)

상기 수학식 3에서 (Δε_RB- Δε_R- Δε_B)[RB]는 T1R2-T1R3와 브라제인 복합체의 상호작용으로 나타나는 원편광 이색성 신호의 변화량을 의미한다(Greenfield 2004). 따라서 (Δε_RB- Δε_R- Δε_B)[RB] = Δ[θ] = ε[RB]로 표현할 수 있으며 신호의 최대 변화량 Δ[θ]_max는 T1R2-T1R3 이종이합체와 용액 내의 모든 브라제인 변이체가 반응하여 복합체를 이루었을 때, 즉 T1R2-T1R3와 브라제인 변이체의 복합체 농도와 브라제인 변이체의 초기농도가 같을 때 나타난다(Greenfield 2004). 이때의 Saturation fraction 은 다음과 수학식 4로 구할 수 있으며, 이를 통해 해리상수를 도출해 내었다(Greenfield 2004)(표 11).

[수학식 4]

K2D3에 의한 T1R2-T1R3 및 브라제인 다중 변이체의 2차 구조 조성 예측.

Protein sample	Wavelength Range (nm)	α-helix	β-sheet
T1R2 subunit	240-190	69.43 %	11.26 %
T1R3 subunit		65.87 %	12.13 %
des-pGlu-brazzein		10.27 %	28.93 %
H30R/E35D/E40A		10.11 %	31.89 %
A1 ins/H30R/E35D/E40A		8.46 %	32.1 %

T1R2-T1R3 이종이합체에 대한 브라제인 다중 변이체의 추정된 해리 상수

Brazzein variant	Dissociation constant by docking simulation (μM)	Dissociation constant by CD (μM)
des-pGlu-brazzein	4.00E-04	3.81E-02
H30R/E35D/E40A	6.64E-06	6.44E-03
A1 ins/H30R/E35D/E40A	1.15E-06	2.69E-03

3.3.2 온도에 의한 브라제인의 구조 변화 분석

브라제인의 열 안정성은 단맛활성 측정을 통한 활성 변화 및 원편광 이색성을 이용한 분광학적 측정을 통한 이차구조 변화를 확인함으로써 분석하였다. 각 온도에서 30분 간격으로 단맛활성을 측정한 결과 브라제인 야생형을 포함한 모든 변이체들은 평균적으로 80 ℃에서 5.5 시간, 83 ℃에서 5 시간, 86 ℃에서 4.7 시간, 89 ℃에서 3.6 시간, 92 ℃에서 2.7 시간, 95 ℃에서 2.4 시간 동안 단맛 활성이 유지됨을 확인하였다(도 17). 또한 원편광 이색성 분광법을 통해 브라제인의 2차구조 변화를 관찰함으로써 열안정성을 측정하였다(표 12, 도 18). 그 결과 모든 변이체들은 평균적으로 80 ℃에서 5.5시간 95 ℃에서는 2.4시간 열을 가하여도 단맛 활성을 유지하는 것을 확인하였다.

다중변이체 H30R/E35D/E40A는 야생형 브라제인 보다 구조적 안정성이 다소 낮지만 어느 정도 유사한 비율의 2차구조를 유지하고 있었다. 즉, 다중변이체 H30R/E35D/E40A는 브라제인 야생형만큼 구조적으로 높은 안정성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 이 다중변이체에서 변이의 대상이 된 아미노산 잔기 중에서도 36번 글루탐산 잔기는 브라제인의 33-38번 잔기를 포함한 β-strand 에 위치하고 있는데, 이를 아스파르트산으로 변이시켜 음전하를 강화시킨 것이 β-strand의 구조적 안정성에 큰 영향을 미치지 않으면서도 단맛활성을 증진시키는 구조(단맛수용체에 더 강하게 결합하는 구조)를 취하고 있다는 것으로 해석할 수 있다. H30R/E35D/E40A 변이체를 기반으로 변이시킨 N-말단 변이체을 비교해 보았을 때, H30R/E35D/E40A에 비하여 β-sheet의 잔여 함량은 상대적으로 높고 α-helix의 잔여 함량은 상대적으로 큰 감소를 보이는 것으로 나타났다.

K2D3에 의한 열 변성 브라제인 다중 변이체의 2차 구조 조성 예측

Brazzein mutant	Temperature ( ˚C )	α- helix	β- sheet
des-pGlu-brazzein	control	10.27	34.41
	80	8.95	32.87
	83	7.48	32.35
	86	7.45	31.93
	89	6.47	28.93
	92	5.16	22.47
	95	3.01	22.34
H30R/E35D/E40A	control	8.11	31.89
	80	6.93	30.84
	83	6.84	31.46
	86	6.44	19.69
	89	6.22	18.85
	92	3.86	18.63
	95	2.11	18.43
A1 ins/ H30R/E35D/E40A	control	8.46	32.1
	80	5.91	30.39
	83	5.42	30.17
	86	4.94	30.07
	89	3.21	29.05
	92	3.14	28.84
	95	2.98	21.75

Ⅴ. 고 찰

1. 브라제인 다중변이체의 단맛 활성 및 안정성 연구

브라제인의 X-선 결정 구조 해석 연구에 의하면 브라제인의 N-말단과 C-말단으로 구성된 부분은 브라제인 구조의 중심 요소 중 하나이며, 해당 부분에서 브라제인의 N-, C-말단과 중심 부분이 많은 상호작용을 하고 있으며 이 상호작용들은 브라제인의 활성 및 안정성에 큰 기여를 할 것이라고 시사되고 있다(Nagata et al., 2013).

본 발명에서의 단맛 활성 실험 결과, A1 ins/H30R/E35D/E40A 변이체의 경우 H30R/E35D/E40A 변이체에 비해 약 198배 단맛이 증가하였다. 이는 브라제인의 N-말단과 C-말단에 속하는 아미노산 잔기들이 브라제인의 단맛 활성에 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.

단맛 역치 측정을 통해 얻어낸 변이체 브라제인들의 역치 결과는 원편광 이색성 측정 및 컴퓨터 도킹 시뮬레이션을 통해 도출해낸 브라제인과 단맛수용체간의 해리상수 값과 동일한 경향성을 나타낸다. 즉 역치값이 낮아 단맛 활성이 강한 브라제인 변이체 일수록 단맛수용체와의 해리상수가 낮음을 확인할 수 있었다. 따라서 브라제인의 단맛 활성은 단맛수용체와 얼마나 강하게 상호작용 하느냐에 따라 그 세기가 결정되었다.

2. 브라제인 다중변이체와 T1R2 - T1R3의 상호작용 연구

단맛 신호 전달을 개시하는 단맛물질과 단맛 수용체의 상호작용에 관해서는 현재까지 3가지 이론이 시사되고 있다. 첫 번째는 AH-B 이론으로, 모든 단맛이 나는 물질의 맛 단위체는 수소결합 공여체와 수소결합 수용체를 포함한 이작용기 그룹(bifunctional group)이라는 가정을 기반으로 하였다(Khan, 1979). 이 이론에서, 단맛은 A-H와 B, 그리고 혀에 위치한 단맛수용체의 비슷한 그룹과의 분자 간 수소 결합으로 시작된다고 가정하였다(Khan, 1979). 두 번째 이론은 Wedge model이다. 단맛 수용체 구조 예측의 기반이 되는 대사성 글루탐산 수용체(metabotropic glutamate receptor, mGluR)는 결정 구조 연구에서 VFTM은 lobe1과 lobe2로 구성되어 있음이 밝혀졌으며, 이 두 lobe의 위상차로 인하여 단량체를 open, close form으로 구분할 수 있었다(Kunishima et al., 2000). 이 특성을 단맛수용체에 적용해 보았을 때 리간드가 붙지 않은 단맛수용체는 ‘두 가지 열린 기본단위체 (open protomer)로 이루어진 불활성 구조인 free form I(resting open-open form, Roo)’, ‘활성 복합체에 이상적으로 가까운 free form II(active open-closed form, Aoc)’의 두 리간드가 붙지 않은 형태의 혼합물이 평형을 이루는 상태로 존재한다고 가정하였다(Temussi, 2009). 활성 형태의 안정화는 글루탐산과 같은 집단의 작은 몰 질량의 감미료의 복합체 형성 또는 감미단백질이 free form II의 표면의 이차 결합부위에 붙었을 때 이루어질 수 있는데, 실제로 이러한 형태의 결합 가능성은 브라제인, 모넬린, 타우마틴과 모델 수용체의 docking calculations를 통해 확인되었다(Temussi, 2002). 이 세 가지 감미단백질은 구조 내에 쐐기(wedge) 형태의 표면을 가진 단맛 수용체의 큰 여백에 결합하는 것으로 여겨진다. 마지막으로 Sweet finger model은 감미단백질의 단맛의 원인은 단백질의 특정 돌출부위가 단맛수용체와 구조적으로 상호작용하기 때문이라는 가정을 기반으로 하였다(Tancredi et al ., 2004). 감미단백질의 어떤 돌출된 부위가 단맛수용체의 안쪽으로 들어간 부분과 구조적으로 알맞게 들어가면서 단맛의 자극이 일어나는 것이다. 최근에는 이러한 세 이론 중에서도 wedge model과 sweet finger model이 유력한 후보로 시사되고 있다.

본 발명에서는 단맛 신호 전달의 개시과정을 규명하기 위해 단맛수용체 T1R2-T1R3와 기질인 브라제인 다중변이체의 상호작용을 분석하는 실험을 진행하였다. 상호작용 연구는 컴퓨터 소프트웨어를 기반으로 한 구조 모델링 및 도킹 시뮬레이션, 그리고 원편광 이색성 분광법을 통한 실제 단백질-단백질 상호작용 측정을 실행하였다.

단맛수용체의 구조는 지금까지 정확히 알려진 바가 없기 때문에 상동성 기반 구조 모델링을 통해 서열이 유사하다고 알려진 대사성 글루탐산 수용체(metabotropic glutamate receptor, mGluR)의 구조를 참고하여 T1R2, T1R3의 구조 모델을 구축하였다. mGluR의 결정구조 연구에 따르면, mRluR은 이합체를 이룰 때 세포막 외부에서 VFTM과 CRD가 나란히 배치되고 두 단량체의 TMD가 세포막으로 이어지는 배향을 이룬다고 보고되고 있다(Kunishima et al ., 2000). 컴퓨터 도킹 시뮬레이션을 통해 얻은 T1R2-T1R3의 이종이합체는 이러한 선행연구를 기반으로 나란히 연결된 배향으로 구성된 모델을 우선 선발한 뒤, 각 모델에서 도출한 해리상수를 비교하여 가장 낮은 값을 가진 결합모델을 선정하였다. 그 후, T1R2-T1R3 이종이합체와 브라제인 변이체들의 도킹 시뮬레이션을 진행하였다. 그 결과 브라제인 변이체들은 T1R2-T1R3의 VFTM과 다중 상호작용함을 확인하였다. 또한, 도킹 시뮬레이션의 결과로 얻어진 해리상수 값은 원편광 이색성 분광 측정을 통해 계산한 해리상수 값과 매우 큰 차이를 보였지만, 브라제인 다중 변이체 별로 유사한 경향성이 나타남을 확인하였다. 각 실험방법으로 도출한 해리상수 값을 SIAM yes-no task 단맛 측정법을 통해 구한 브라제인 변이체들의 절대 역치 값과 비교해 보았을 때, 상대적으로 강한 단맛활성을 가진 변이체가 단맛수용체와의 해리상수가 낮음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 결과는 브라제인의 절대 역치 값이 낮을수록, 즉 브라제인 변이체의 단맛 활성이 강할수록 단맛 수용체와 강하게 상호작용함을 입증한다. 또한 본 연구결과는 분광학적 측정으로도 감미단백질의 단맛 정도를 측정할 수 있다는 것을 시사한다.

브라제인과 수용체 간의 상호작용에 대한 선행연구에서는 Wedge model을 기반으로 브라제인과 수용체의 변이체를 각각 작성하여 브라제인과 수용체의 다중 상호작용에 기여하는 핵심 아미노산을 유추하였다(Assadi-Porter et al ., 2010). 반면에, 본 연구에서의 브라제인 다중변이체는 주로 sweet finger model에 기반한 flexible loop의 잔기를 위주로 변이시켰다. 예를 들어, 30번 히스티딘 잔기의 경우, 29에서 32번 잔기로 이어지는 flexible loopⅡ에 속해있다. 이러한 flexible loop의 잔기를 변이시킨 다중변이체를 통해 얻은 본 연구의 결과는 단맛 물질과 단맛 수용체의 상호작용 모델 중 하나인 sweet finger model을 뒷받침하는 좋은 자료가 될 것이다.

단맛 수용체 - 브라제인 상호 작용 연구의 총 비교

Brazzein mutants	Sweetness in comparison to sucrose		Circular dichroism	Computer docking simulation
	(g/g)	(molecular)	Dissociation constant (M)	Gibbs binding energy (kcal/mol)	Dissociation constant (μM)
des-pE1M-brazzein	693.38	1.29E+04	3.81E-02	-12.88	4.00E-04
H30R/E35D/E40A	2638.84	4.85.E+04	6.44E-03	-15.32	6.64E-06
A1ins/ H30R/E35D/E40A	3217.03	6.00E+04	2.69E-03	-16.01	1.15E-06

Ⅵ. 결론

본 발명에서는 감미단백질 브라제인 다중변이체의 단맛 활성 및 구조적 안정성에 미치는 아미노산 잔기의 영향과 단맛수용체와의 단백질-단백질 상호작용을 분석하였다. 우선, SIAM yes-no task 법을 통한 단맛 역치 실험을 진행하여 브라제인 다중변이체의 단맛 활성을 비교해 보았다. 그 결과 N-말단과 C-말단의 아미노산 잔기들이 다른 위치의 아미노산 잔기들에 비해 브라제인의 단맛 활성에 더 큰 영향을 미침을 확인하였다.

단맛수용체와 브라제인의 상호작용을 예측하기 위해 컴퓨터 모델링을 통한 브라제인 다중변이체들과 단맛수용체의 도킹 시뮬레이션을 진행하여 각 변이체와 단맛수용체의 결합양상을 분석하고 해리상수를 예측하였다. 또한, 효모발현계를 이용하여 브라제인 다중변이체들과 단맛수용체를 각각 발현, 정제한 뒤 복합체를 형성하여 원편광 이색성 분광법을 통해 측정하였다. 그리고 이를 통해 도출해낸 타원율을 이용하여 해리상수를 계산하였다. 그 결과, 컴퓨터 모델링을 통해 예측한 브라제인 다중변이체들과 단맛수용체 간의 해리상수는 원편광 이색성 분광 측정으로 계산한 해리상수와 다른 값을 나타내었다. 그러나 각 방법으로 도출해낸 해리상수들은 다중변이체의 유형에 따라 비슷한 경향성을 보였으며, 결과적으로 브라제인 다중변이체가 평균적으로 브라제인 야생형 부타입에 비해 훨씬 낮은 해리상수를 가지고 있음을 확인하였다. 이는 단맛수용체와 더 강한 상호작용을 하기 때문에 더 강한 단맛 신호전달이 진행되어 결과적으로 강한 단맛 활성으로 이어진다는 점을 시사한다.

한편, 브라제인 다중변이체는 브라제인 야생형 못지않게 고온의 조건에서도 장기간 단맛활성을 유지하였다. 이를 통해 다중변이로 인해 생긴 구조적 변화는 브라제인의 안정성을 유지하는 골격 구조에 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

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Claims (5)

1. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 브라제인 다중 변이체.
   
2. 청구항 1의 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
   
3. (i) 프로모터 및 (ⅱ) 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 청구항 2의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
   
4. 청구항 3의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
   
5. 다음의 단계를 포함하는 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법:
   (a) 청구항 4의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 배양된 숙주세포로부터 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 단계.

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