KR20180099144A

KR20180099144A - 구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180099144A
Application number: KR1020170026192A
Authority: KR
Inventors: 홍성빈
Original assignee: 홍성빈; (주)바이오믹스
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2018-09-05

Abstract

본 발명은 구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 복합 조성물은 남성 갱년기 증상의 발생을 예방하고, 발생 시기를 지연시킬 수 있으며, 증세를 치료할 수 있는 효과를 가진다.

Description

구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물{Composition preventing or treating andropause symptoms comprising the extract of chinese matrimony vine, schizandra and acanthopanax}

본 발명은 구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

여성은 폐경기가 오면 여성 호르몬이 급격히 감소하여 여러 가시적인 변화가 일어나게 되는데, 이를 갱년기라고 한다. 통상 갱년기란 용어는 여성에 한정되어 사용되었으나, 근래에는 남성에서도 노화에 따른 체내 남성 호르몬의 점진적 감소로 인한 내분비 변화로 남성 갱년기 증후군의 개념이 대두되고 있다. 정식 용어로는 2004년 국제남성노화학회(International Society for the Study of the Aging Male)에서 결정된 용어인 '후기 발현 남성 성선기능저하증(late-onset hypogonadism, LOH)', '가령성 테스토스테론결핍증후군(ageassociated testosterone deciency syndrome, TDS)'이 있다. 남성 갱년기 장애(Andropause)는 연령의 증가와 관련된 임상적 및 생화학적 증후군으로 전형적인 증상 및 혈청 테스토스테론 수준의 결핍으로 정의되고 있으며, 여러 신체기관의 기능에 부정적인 영향을 초래할 수 있다. 동반되는 증상으로는 성욕 및 발기 기능의 저하, 밤 시간 동안의 우울, 인지 능력의 감소, 피로, 체중 및 근육량의 감소, 피부위축 등의 예를 들 수 있다.

치료를 위해서는 폐경기 여성에 에스트로겐 대체 요법을 사용하는 것과 유사한 방식으로 남성 호르몬 대체 요법의 사용 가능성이 주장되고 있다.

한 연구에 따르면, 남성 갱년기 환자들을 테스토스테론 운데카노에이트 40 X 2㎎/일로 치료하는 경우 상당한 개선 효과가 얻어지는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 남성 호르몬의 투여는 간, 지질 상태, 심혈관 및 전립선 질환 등에 역효과를 미칠 수 있다는 위험성이 보고되어 있다. 또한, 선종 및 선암종에 비추어 남성 갱년기에 기인하는 증상들을 갖는 환자의 약 30%는 남성 호르몬 대체 요법을 받을 수 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 의약품 개발 분야에서 천연물 유래 약학적 조성물의 이용이 전 세계적으로 증가하는 추세이다.

관련 특허로는 한국등록특허 제10-576130호가 있으며, 상기 특허에서는 호로파 추출물을 유효성분으로 하여 성장호르몬 분비를 촉진하는 약학적 조성물에 대한 용도가 개시된 바 있다. 또한, 한국등록특허 제10-848213호는 백질려 즉 남가새의 성장호르몬 분비 촉진 작용에 대해 개시된 바 있다.

국내 설문조사에 따르면 남성 갱년기 증상을 호소하는 40대 이상 남성의 비율이 64.6%로 보고되어, 우리나라 중년 남성이 절반 이상이 남성 갱년기를 겪고 있는 것으로 나타났다(Park MG 외, Aitude of Korean males toward late-onset hypogonadism : survey of males in their 40s and above 2007).

이와 같은 소위 남성 갱년기 증상의 개선을 위해 현재 시행되고 있는 치료법은 주사나 경구투여제, 패치형 제제를 통해 직접적으로 남성 호르몬을 보충하는 방법이 주를 이룬다. 그러나, 남성 호르몬을 직접 보충하는 요법을 사용하는 경우 체내 허용되는 범위를 넘어서서 해당 호르몬 수치가 과도하게 높아질 수 있는 부작용이 예상된다. 또한, 남성 혈중 테스토스테론 농도가 높아지면 혈액이 끈적끈적해져 혈관의 폭을 줄이게 되고 혈류 흐름을 방해해 뇌경색이나 심혈관질환 등에 노출될 위험이 커질 뿐만 아니라, 전립선의 크기를 증가시켜 이미 발생한 전립선암을 악화시킬 수 있다. 또한 피지 분비가 활발해져 여드름 등 피부 질환이 심해지는 부작용이 따를 수 있다.

한국등록특허 제10-576130호(공개일: 2005년 7월 7일) 한국등록특허 제10-848213호(공고일: 2008년 7월 24일)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물은 구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 복합 조성물은 남성 갱년기 증상의 발생을 예방하고, 발생 시기를 지연시킬 수 있으며, 증세를 치료할 수 있는 효과를 가진다.

도 1은 실험예 1-(2)에 따른 testosterone 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1-(2)에 따른 estradiol 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1-(3)에 따른 triglyceride 수치 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1-(3)에 따른 총 콜레스테롤, HDL, LDL의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1-(5)에 따른 SOD 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 1-(5)에 따른 8-OHdG 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1-(5)에 따른 AKT, P-AKT, ERK, P-ERK 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1-(6)에 따른 Bcl-2 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 1-(6)에 따른 BAX 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 2-(1)에 따른 발기능 측정 방법을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 2-(1)에 따른 발기능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 2-(2)에 따른 eNOS 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 2-(3)에 따른 nNOS 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 2-(4)에 따른 cGMP 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 2-(5)에 따른 평활근과 콜라겐의 분포 비율 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명의 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물은,

구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

구기자(chinese matrimony vine)는 통화 식물목 가지 과의 구기나무의 열매로 장기간 많이 먹어도 중독성이 없는 상약(上藥)중의 상약이다. 구기자는 신(腎)을 보(補)하고, 폐를 윤택하게 하며 신장을 보호하고 체액을 생성하여 정기를 점차 번창하게 하고 내분비의 기능을 높이고 피로에 의한 내열을 제거하고 양분을 보충하여 근육과 뼈의 발달을 튼튼히 하고 정력을 증진시켜주며 노화방지와 항산화작용, 간 기능개선 및 혈압을 내려주며 시력을 보호하고 머리를 검게 한다. 또한 구기자는 불포화지방산이 80％ 이상이기 때문에 콜레스테롤제거 및 지방과 당질을 용해 및 제거하여 순환성 성인병에 효과가 있다. 예부터 정(精)을 늘리고 양(陽)을 돕는다 하여 보양(補陽), 강장(强壯)제로서 탁월한 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 구기자 추출물의 유효성분으로는 베타인, 제약산틴(Zeaxanthin), 피살린(Physalien), 베타카로틴(β-carotene) 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 베타인을 사용할 수 있다.

오미자는 오미자과(Schizandraceae)에 속하는 다년생 덩굴짓는 나무이다. 맛이 달고(甘), 시고(酸), 쓰고(苦), 맵고(辛), 짜고 이 다섯 가지의 맛이 있다고 해서 오미자(五味子)라고 한다. 오미자의 유효 성분으로는 수분80％, 지방1%, 담백질1.2％, 총당함량14％로 구성되어 있어며 과즙내 당은 fructose, sucrose, glucose, maltose가 유기산은 citric acid, tartartic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, acetic acid, lactic acid가 함유되어 있으며 잘 익은 오미자 일수록 아스코르빈산이 많다. 환원형 아스코르빈산은 581㎎％, 총 비타민C는 762㎎％의 범위에 있다. 오미자에 들어 있는 비타민A 물질의 양은 0.1809％이며 오미자 열매와 씨에는 레몬산 외에 사과산, 포도산, 탄수화물(다당류)수지(6.8％), 사포닌(약5％), 지방유, 정유, 그리고 철(Fe), 망간(Mn), 인(P), 칼슘(Ca) 등의 성분이 함유되어 있다. 오미자는 신(腎)을 보(補)하고 열을 내리며 진액을 생겨나게 하며 갈증을 멈추고 설사, 이질을 낫게 하고 몸을 튼튼하게 하며 자양, 강장(强壯)약으로 간을 보호하며 남자의 정액을 보충한다. 원기가 모자랄 때 쓰면 원기를 크게 보(補)하며 정을 간직하여 유정(성행위 없이 자기도 모르게 정액이 나오는 증세)을 멈춘다. 신허(腎虛)로 인한 유정, 몽설에 쓰이며 성기능을 높이는데 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 오미자 추출물의 유효성분으로는 시잔드린(Schizandrin), 시잔드롤(Schizandrol), 시잔드렐(Schizandrel), 고미신 A(Gomisin A), 고미신 N(Gomisin N) 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 시잔드린(Schizandrin), 고미신 A(Gomisin A), 고미신 N(Gomisin N)을 사용할 수 있다.

오가피는 동의보감, 본초강목과 같은 한의학 서적에 의하면 오가피를 꾸준히 섭취했을 경우 기력을 보충하고 심신이 가벼워진다고 한다. 이러한 효능 덕분에 오가피는 '제2의 인삼'으로도 불린다. 오가피를 꾸준히 섭취하시면 뼈와 힘줄을 강화해주며 관절통을 완화시켜주기 때문에 관절염 환자에게 좋다.

오가피의 '쿠마린'이라는 성분이 혈압을 낮춰주어, 고혈압 환자가 섭취하면 좋다. 오가피는 당뇨병 증세의 개선을 기대하실 수 있다. 또한, 오가피에 풍족하게 함유된 '하이레핀'이 혈관을 확장시켜주어 협심증, 심근경색과 같은 질환을 개선시켜주며, '세사민'이라는 성분이 기침을 멎게 하는데 탁월한 효능을 발휘하고, 어지러움증을 완화시켜준다. 오가피에 함유되어 있는 배당체는 신진대사를 자극하기 때문에 지방이 쌓이지 않도록 예방해주며 수분과 당질의 균형을 바로 잡아 건강한 체중감량을 할 수 있도록 해준다.

본 발명에서 사용된 오가피 추출물의 유효성분으로는 스테로이드, 세사민(I-sesamin), 쿠미란(coumarin), 시린진(syringin), 쿠에루세틴, 포리사카라이드 및 엘레우테로사이드 A-G(Eleutheroside A-G) 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 Eleutheroside E를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물은, 당귀, 천궁, 계피 및 황기 중 적어도 하나 이상의 추출물을 더 포함할 수 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

in vivo 실험 방법

실험 동물

실험 동물은 생후 8주된 250-300g의 SD 수컷 흰쥐를 1주일간 적응기간을 거친 뒤 폴리설폰 케이지에 3마리씩 사육한다.

사육 조건

사육실은 인공조명에 의하여 아침 8시부터 저녁 8시까지 12시간으로 조절하며, 실내온도는 18-23℃와 40-60%의 습도를 유지하고, 정수된 식수와 사료를 10주 동안 먹였다. 생후 18주가 되면 OLD RAT 남성 갱년기 모델을 확립하였다.

실시예 1

구기자, 오미자 및 가시오가피 추출물을 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다. 그리고, 제조된 복합 추출물을 남성 갱년기 모델이 확립된 OLD RAT에게 6주간 150 mg/kg을 투여하였다.

실시예 2

구기자, 오미자 및 가시오가피 추출물을 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다. 그리고, 제조된 복합 추출물을 남성 갱년기 모델이 확립된 OLD RAT에게 6주간 300 mg/kg을 투여하였다.

비교예 1

구기자 추출물을 남성 갱년기 모델이 확립된 OLD RAT에게 6주간 150 mg/kg을 투여하였다.

비교예 2

구기자 추출물을 남성 갱년기 모델이 확립된 OLD RAT에게 6주간 300 mg/kg을 투여하였다.

실험예 1. 갱년기 관찰

(1) 고환의 무게 측정

1) 측정방법

노령쥐 모델 확립하고, SD rat을 희생시킨 후 testis, epididymis 분리하여 각각의 무게를 측정하였다.

2) 측정결과

체중은 10일 간격으로 한번 씩 기록하였으며 무게변화 결과를 표 1에 기재하였다.

	testis	epididymis
Normal(Old Rat)	1.742	0.840
실시예 1	1.766	0.842
실시예 2	1.803	0.949
비교예 1	1.760	0.853
비교예 2	1.831	0.875

표 1을 살펴보면, 노령쥐군의 정소 및 부정소의 무게보다 구기자 단독, 복합 추출물 150mg/kg 투여군에서 정소 및 부정소의 무게가 약간 높게 나타났으며 300mg/kg 투여군에서는 확연한 차이를 나타내었으나 통계적인 유의성은 보이지 않았다.

(2) 호르몬 지표 변화 측정(Testosterone, Estradiol)

1) 측정방법

호르몬 및 혈청생화학적 검사는 쥐를 마취 후 복대정맥에서 채혈한 혈액을 3000rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 혈청에서 각각의 지표를 측정한다.

테스토스테론 농도는 테스토스테론 kit를 사용하여 효소 면역측정법으로 정량하였다. well에 sample 50㎕넣고 conjugate working solution 100㎕ 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응을 시킨다. 다음 washing solution 으로 3회 washing 한 후 TMB substrate 150㎕ 첨가한 후 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 stopping solution 을 50㎕ 넣고 450nm에서흡광도 측정한다. kit 제조사의 계산법을 준용하여 농도를 계산한다. 항원의 양은 ELISA kit에 포함된 표준 재조합 항원의 반응표준곡선을 이용하여 산술 비례적으로 구하였다.

Phytoestrogen도 estrogen 처럼 작용하여 estrogen receptor 에 binding 가능하다. 따라서 구기자 lignan성분이 인체에서 bacteria에 의해 mammalian lignan인 enterodiol, enterolactone 로 변형된 후 마치 estrogen 처럼 작용 할 수 있다. 그러나 activity는 낮음.

2) 측정결과

테스토스테론 농도 실험결과는 표 2 및 도 1에 나타내었다.

	Testosterone in serum(ng/dL)	p value
Normal(Old Rat)	1.866±0.039
실시예 1	2.970±0.038	p<0.05
실시예 2	3.324±0.049	p<0.05
비교예 1	2.078±0.064
비교예 2	2.394±	p<0.05

표 2를 살펴보면, normal(old rat)그룹에 비해 단독, 복합 용량별로 테스토스테론 수치가 증가함을 알 수 있었다. 구기자 단독 150mg/kg 그룹은 유의성이 없으며 단독 300mg/kg, 복합 150mg/kg, 복합 300mg/kg 그룹은 통계적으로 유의한 것으로 나타났다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

estradiol 농도 실험결과는 표 3 및 도 2에 나타내었다.

	Estradiol	p value
Normal(Old Rat)	26.246
실시예 1	22.300	0.1
실시예 2	20.620	0.03
비교예 1	23.313	0.1
비교예 2	23.208	0.1

표 3을 살펴보면, 노령쥐군의 Estradiol 농도보다 구기자 단독, 복합 추출물 150, 300 mg/kg을 투여한 군에서 Estradiol 농도가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

(3) 지질대사 지표 측정(TG, TC, HDL, LDL)

1) TC, HDL, LDL 측정방법

체중은 10일 간격으로 한번 씩 기록하였으며 고지혈증이 유도되었는지 확인하기 위하여 안와정맥에서 채혈하였고 실험이 완료된 후에는 복부대동맥으로부터 혈액을 채혈하였다. 채혈시 12시간 동안 금식시키고 37℃에서 2시간 응고시킨 후 혈청을 15,000rpm 원심분리하여 상등액을 사용하였다.

혈중 중성지방의 함량은 하기와 같이 측정하였다. 먼저 혈장 중성지방 측정용 kit (ASAN pharmaceutical coLtd. Korea)를 이용한 enzymatic method으로 분석 후 흡광도를 측정하였다.

콜레스테롤 함량은 콜레스테롤 측정용 kit(ASAN pharmaceutical co Ltd. Korea)를 이용한 enzymatic method으로 분석 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였고 혈중 high-density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤 함량은 혈장 HDL 측정용 kit (ASAN pharmaceutical co Ltd. Korea)를 이용한 enzymatic method으로 분석 후 흡광도를 측정하였다.

저밀도지질콜레스테롤은 Fridewald formula에 따라 다음식으로 계산하였다.

LDL-Cholesterol=Total Cholesterol-[(HDL-Cholesterol)-(Trigltceride/5)]

2) TG 측정방법

Triglyceride ELISA kit에 포함된 각 농도의 표준 triglyceride 또는 각 serum 50㎕를 96 well plate에 넣고 kit에 포함되어 있는 lipase 2㎕ 첨가 후 20분간 반응시킨다. 미리 준비한 triglyceride reaction solution을 50㎕ 첨가 후 570 nm 에서 흡광도를 측정하고 kit 제조사의 계산법을 준용하여 serum내 triglyceride 농도를 계산하였다. 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타내며, t-test로 통계 처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

3) 측정결과

시료의 중성지방, 콜레스테롤 및 고지혈증 결과는 표 4 및 5와 도 3 및 도 4에 나타내었다.

	Triglyceride(TG) in serum(mM)	p value
Normal(Old Rat)	8.977±0.075
실시예 1	10.155±0.03	p<0.001
실시예 2	10.284±0.254	p<0.001
비교예 1	9.404±0.08	p<0.05
비교예 2	9.882±0.047	p<0.005

	HDL(uM)	LDL(uM)	testosterone(TC) in serum(uM)	p value
Normal(Old Rat)	38.732±0.059	18.463±0.007	1.866±0.039
실시예 1	34.919±0.002	13.546±0.001	2.970±0.038	p<0.01
실시예 2	35.922±0.007	16.255±0.004	3.324±0.049	p<0.01
비교예 1	33.012±0.027	14.048±0	2.078±0.064	p<0.05
비교예 2	34.618±0.014	13.345±0.019	2.394±	p<0.01

결과를 살펴보면, 노령쥐군에 비해 구기자 단독, 복합 추출물 150, 300 mg/kg을 투여 한 군에서 혈중 중성지방 수치는 용량 의존적으로 증가하였고 총 콜레스테롤, LDL의 수치는 감소한 것을 확인하였다.

(4) 정자의 질에 미치는 영향 측정(정자수의 변화 및 운동성 측정)

1) 측정방법

테스토스테론은 정자형성 및 운동성에 중요한 영향을 미친다. 시료의 투여가 테스토스테론을 증가시킨 것은 다의 결과에서 확인하였다. 이를 근거로 구기자의 투여가 정자 수에 미치는 영향을 측정하기 위해 실험동물들의 총 정자수를 측정하였다.

부고환 미부 내 정자의 숫자, 형태 및 운동성을 검사하기 위하여 좌측 부고환 미부를 절제한 후 무게를 측정한다. 좌측 정관을 절제한 후, 3ml modified Tyrode's 배지가 들어있는 petri dish에 조직을 넣은 후 10분간 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한다. 배양액중의 조직을 제거한 다음 배양액 0.1ml은 2% eosin과 3% citric acid 혼합액과 1:1로 혼합하여 도말검체를 만들어 검체 당 100마리의 정자를 200배율이 현미경하에서 운동성이 정자수를 계산하여 총 정자수의 %로 나타낸다. 정자 운동성은 Makler counting chamber를 이용하여 움직이는 정자를 고정시켜 미부나 꼬리의 움직임을 통하여 운동성 여부를 확인하여 움직이는 정자를 양성/움직임이 없는 정자를 음성으로 육안적 검사로 구분하여 총 정자수에서 양성 반응을 나타내는 것에 대한 %로 나타낸다. 정자의 형태 이상은 두부의 각도이상, 미부의 꼬림 및 접힘 등과 갈고리 형태의 정자모양에서 갈고리의 각도가 비교적 낮은 경우 등을 정자행태 이상으로 판별하였으며 이를 전체적으로 두부의 단소로 표현한다.

분리한 부정소를 10ml DMEM 배지에 homogenization 한 다음 1ml을 24well에 분주하고 7℃ 세포배양기(5% CO2)에서 10분간 배양한 후 400 배율의 현미경 상에서 전체 정자수 및 운동하는 정자수를 측정하여 그 비율을 구하였다. old rat 그룹에 단독, 복합 농도별 운동성이 증가하는 것을 확인 할 수 있다.

: 정자운동성 (%) = 운동하는 정자수/총 정자수 X 100

2) 측정결과

정자수와 운동성 결과는 표 6에 나타내었다.

	정자수	운동성
Normal(Old Rat)	11200000	35.58%
실시예 1	11400000	53.59%
실시예 2	11400000	54.02%
비교예 1	11633333	34.93%
비교예 2	11040000	49.32%

표 6을 살펴보면, Total sperm count에서 대조군은 1.12×107의 정자수를 가졌으나 구기자 단독, 복합 추출물 150, 300 mg/kg을 투여 한 군에서 정자수가 약간 증가한 것을 확인하였다. 이는, 테스토스테론 분비 증가에 의한 효과로 판단되었다.

(5) 항산화 지표 관련 측정(SOD, 8-OHdG, AKT, P-AKT ,ERK, P-ERK)

1) SOD 측정방법

항산화 바이오 마커인 SOD 측정은 SOD assay kit를 사용하여 측정하였으며, 실험 방법 및 산출방법은 다음과 같다. 측정은 SOD assay kit (dojindo) 를 사용하여 측정하였으며, 실험 방법 및 산출방법은 다음와 같다. 96 well plate에 혈청 20㎕를 sample과 blank2 well에 넣고 blank1, 3은 ddH2O 를 20㎕ 넣는다. kit에 포함된 WST working solution 200㎕를 모든 well에 첨가, Dilution buffer 20㎕ blank2, 3 첨가 Ezyme working solution을 sample, blank 1에 20㎕ 각각 첨가한 후 37도에서 20분 반응 후 450nm 흡광도를 측정하고 kit 제조사의 계산법을 준용하여 농도를 계산한다.

산출방법: SOD activity (inhibition rate%)=(Blank1-blank3)-(sample-blank2)/(blank1-blank3) X 100

2) SOD 측정결과

노화에서 구기자추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 rat의 고환 조직에서 SOD 활성을 측정하였으며 결과를 표 7 및 도5에 나타내었다.

생체 내 항산화 효소중 하나인 SOD는 세포내 활성산소를 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소이며 SOD에 의해 생성된 과산화수소는 catalase 또는 peroxidase에 의해 물 분자와 산소 분자로 전환되는 중요한 효소 중의 하나이다. SOD 소거능 측정방법에 이 방법이 많이 사용되고 있는데 이 superoxide anion의 활성을 억제시키는 물질 즉, SOD를 소거하는데 이 실험 방법이 적용되고 있다. 또한 이 superoxide anion은 세포막의 지방산화를 쉽게 유도하며 지방산화물을 축적시켜 생체 내 많은 세포에 손상을 준다고 알려져 있다.

통계처리에서 p값이 0.01 미만, 0.05 미만일 경우(p<0.01, p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

	SOD Activity	p value
Normal(Old Rat)	24.451±3.196
실시예 1	35.182±2.101	p<0.01
실시예 2	40.279±6.516	p<0.01
비교예 1	34.584±5.626	p<0.05
비교예 2	37.328±8.378	p<0.01

표 7을 살펴보면, anti oxidative stress marker 인 SOD 경우 old rat 그룹에 비해 단독, 복합, 농동별로 SOD activity 가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 구기자 단독, 구기자 복합 천연물은 oxidative stress에 항산화 작용에 영향을 미치는 것으로 보여진다.

3)8-OHdG 측정방법

항산화 바이오 마커인 8-OHdG(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine)실험 방법은 well에 sample 50㎕ primary antibody 50㎕ 첨가 한 후 4℃에서 over night으로 반응시킨다. Over night 후 wash solution 250㎕으로 3회 washing 한 후 secondary antibody 100㎕첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨다. 1시간 후 wash solution 250㎕으로 3회 washing 한다. Reaction termination solution 100㎕ 넣고 450nm에서 흡광도를 측정하고 kit 제조사의 계산법을 준용하여 농도를 계산한다.

4)8-OHdG 측정결과

8-OHdG 측정결과를 표 8 및 도 6에 나타내었다. 통계처리에서 p값이 0.01미만, 0.05 미만일 경우(p<0.01, p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

	8-OHdG(ng/mL)	p value
Normal(Old Rat)	9.859±0.074
실시예 1	7.789±0.178	p<0.01
실시예 2	7.618±0.466	p<0.01
비교예 1	8.799±0.017	p<0.05
비교예 2	7.908±0.12	p<0.01

표 8을 살펴보면, oxidative stress marker 인 8-OHdG 경우 산화적 스트레스 old rat 그룹에서는 9.859 ng/ml 이며, 구기자 복합 300 mg/ml 그룹에서는 7.618 ng/ml으로 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다. 구기자 단독, 구기자 복합 천연물은 oxidative stress에 항산화 작용에 영향을 미치는 것으로 보여진다.

5) AKT, P-AKT ,ERK, P-ERK 측정방법

조직 속에 함유되어 있는 P-AKT, P-ERK를 분석하기 위하여 -80℃에 보관하고 있던 조직 50mg에 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 2 nM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100) 200ul를 가하고 Homogenizer (Tissue tearor, Biospec, Korea)를 이용하여 분쇄하고 원심 분리 후 Lowly법을 이용하여 단백질을 정량한다. 50ug의 protein을 4-12% SDS-PAGE gel에 전기영동하고 PVDF paper로 이동시킨 다음, 5% skim milk로 1시간 동안 blocking하고, primary antibody (P-AKT, P-ERK)는 5% skim milk에 각각 1：1000로 희석하여 4℃에서 overnight하였다. 이후 1X PBST로 세척 후 secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG)를 5% skim milk에 1：1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고, ECL solution (Amersham, Arlington height, IL, USA)을 이용하여 이미지 분석기 (Image Analiyzer system, Syngene, UK)로 분석한다.

6) AKT, P-AKT ,ERK, P-ERK 측정결과

측정결과를 도 7에 나타내었으며, 도 7을 살펴보면 old rat 보다는 구기자 단독, 복합 그룹에서 Erk, Akt 발현이 증가하는 것으로 구기자는 Erk, Akt의 발현을 증가시켜 세포 사멸를 억제하며, 항산화에 영향을 미치는 것으로 보여진다.

(6) Apoptotic parameter(Bax, Bcl-2)

1) 측정방법

수술시 얻은 음경해면체 조직을 중성 포르말린용액에 고정하여 파라핀에 포매하고 4μm 두께로 잘라 슬라이드에 부착시키고, xylene으로 5분간 3회 담구어 파라핀을 제거한 후 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 알코올에 3분씩 처리 후 증류수에 넣어 함수화 하였다. 0.01 M sodium citrate 용액(pH7.4)에 넣고 microwave로 5분간 끓인 후 충분히 식혔다. 0.5% H₂O₂를 이용하여 peroxidase를 blocking 시키고 1차 항체 anti-Bcl-2, Bax (1 : 500)를 부착하고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS를 이용하여 5분씩 3회 세척후 2차항체인 fluorescein goat anti-mouse (green)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 이차항체 처리하였다. 처리 후 PBS를 이용하여 5분씩 3회 세척하였다. 그 후 mounting 하여 현미경으로 관찰한다. 관찰한 결과 세포사멸을 억제하는 Bcl-2는 증가하며, 세포사멸을 유도하는 Bax의 발현은 감소하는 것으로 나타났다.

2) 측정결과

측정결과를 도 8 및 도 9에 나타내었고, 도면을 살펴보면, 세포사멸을 억제하는 Bcl-2는 증가하며, 세포사멸을 유도하는 Bax의 발현은 감소하는 것으로 나타났다. 구기자 단독 그룹보다는 복합 그룹에서 더 많이 Bcl-2가 증가하고 Bax 발현이 감소하는 것으로 복합 그룹에서 세포사멸에 영향을 미치는 것 같다.

실험예 2. 비임상 (In vivo ) 실험- 발기부전 지표관련 측정

(1) 발기능(ICP/MAP) 측정

1) 측정방법

Tiletamine(ZoletilR) 0.2 ml을 복강 내에 주사하여 전신마취 후 앙와위에서 음경을 박리하여 음경해면체와 음경각을 노출시키고 복부정중절개를 통하여 골반 내에서 우측 전립선 외측의 골반 신경절을 박리하여 노출시켰다. 우측 내경동맥을 박리하여 24G 폴리에틸렌관을 삽입하여 전신혈압(Mean arterial pressure: MAP)을 측정하였다. 음경해면체내압(Intracavernosal pressure, ICP)측정을 위해 23G 나비침을 음경 해면체 내에 유치시키고 박리된 신경절에 양극성 전기자극기를 위치시킨 후, 10 volt, 2.4 mA, 0.5 msec의 조건으로 음경해면체 신경을 50초간 자극하였다. 음경해면체 신경자극은 최소 3회 이상 실시하였고 신경자극 시간간격은 10분 이상을 유지하였다. 자극 검사 후 음경해면체를 적출하여 2개로 나누어 하나는 액체질소에 냉동 보관하였고 다른 하나는 포르말린으로 고정하였다. 대조군과 실험군의 발기능을 비교하는 지표로 최대음경해면체내압(peak ICP), 최대음경해면체내압/평균동맥혈압 (ICP/MAP)을 측정하였다.(도 10 참조)

2) 측정결과

대조군과 실험군의 발기능을 비교하는 지표로 최대음경해면체내압(peak ICP), 최대음경해면체내압/평균동맥혈압 (ICP/MAP)을 측정하였으며 그 결과를 도 11에 나타내었다. old rat 그룹에 비해 구기자 단복, 복합 그룹에서의 ICP 수치가 올라갔으며, 이러한 결과로 구기자는 음경해면체의 신경 또는 혈관에 영향을 미치는 것으로 볼 수 있었다.

(2) eNOS 측정

1) 측정방법

조직 속에 함유되어 있는 P-eNOS를 분석하기 위하여 -80℃에 보관하고 있던 조직 50mg에 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 2 nM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100) 200ul를 가하고 Homogenizer (Tissue tearor, Biospec, Korea)를 이용하여 분쇄하고 원심 분리 후 Lowly법을 이용하여 단백질을 정량한다. 50ug의 protein을 4-12% SDS-PAGE gel에 전기영동하고 PVDF paper로 이동시킨 다음, 5% skim milk로 1시간 동안 blocking하고, primary antibody (P-eNOS)는 5% skim milk에 각각 1：1000로 희석하여 4℃에서 overnight 하였다. 이후 1X PBST로 세척 후 secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG)를 5% skim milk에 1：1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고, ECL solution (Amersham, Arlington height, IL, USA)을 이용하여 이미지 분석기 (Image Analiyzer system, Syngene, UK)로 분석한다.

2) 측정결과

음경이 발기되기 위해서는 먼저 음경해면체 동맥과 음경평활근이 완전히 이완되고 음경해면체내 동상 혈관강 (sinusoidal space)에 혈액이 축적되어야 한다. 해면체 내피세포에서 분비되는 내피 의존성 이완인자가 음경해면체를 이완시켜 음경발기를 일으키며 이러한 작용을 하는 내인성 물질이 NO라고 알려져 있다. 또한 해면체 신경자극에 의한 음경 발기 현상이 NO 생합성 효소인 NOS 억제제에 의해서 억제됨으로서 NO가 음경발기와 관련된 강력한 신경전달 물질로 밝혀지게 되었다. NO는 체내에서 guanylate cyclase를 활성화시켜서 c-GMP의 생합성을 촉진시키게 된다. 이때 생성된 c-GMP는 혈관 평활근의 이완을 촉진시켜서 음경해면체내로 혈액의 유입을 왕성하게 하여 음경 발기를 일으키는 가장 중요한 인자로 알려져 있다.

구기자추출물이 음경해면체 조직 중의 nitric oxide synthase 활성에 미치는 영향을 평가하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12를 살펴보면, P-eNOS의 발현을 통한 해면체내 혈관내피세포의 apoptosis를 저하시키는 효과를 확인할 수 있었다. 단독보다는 복합그룹에서 많이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

(3) nNOS 측정

1) 측정방법

수술시 얻은 음경해면체 조직을 중성 포르말린용액에 고정하여 파라핀에 포매하고 4μm 두께로 잘라 슬라이드에 부착시키고, xylene으로 5분간 3회 담구어 파라핀을 제거한 후 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 알코올에 3분씩 처리 후 증류수에 넣어 함수화 하였다. 0.01 M sodium citrate 용액(pH7.4)에 넣고 microwave로 5분간 끓인 후 충분히 식혔다. 0.5% H₂O₂를 이용하여 peroxidase를 blocking 시키고 1차 항체 anti-nNOS (1 : 500)를 부착하고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS를 이용하여 5분씩 3회 세척후 2차항체인 fluorescein goat anti-mouse (green)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 이차항체 처리하였다. 처리 후 PBS를 이용하여 5분씩 3회 세척 하였다. 그 후 mounting 하여 현미경으로 관찰한다.

2) 측정결과

측정결과를 도 13에 나타내었다. 도 13을 살펴보면, 단독 150mg/kg 보다는 300mg/kg 그룹에서 nNOS가 더 많이 발현하는 것을 확인할 수 있으며, 복합 그룹에서도 150mg/kg보다는 300mg/kg 그룹에서 nNOS의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다. 단독그룹과 복합그룹을 비교 했을 때에도 단독보다는 복합에서 nNOS의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 보아 구기자는 음경 내의 no를 활성에 영향을 미치는 것 같다.

(4) cGMP 측정

1) 측정결과

음경발기부전에 관여하는 신경전달물질에는 아세틸콜린, ATP, NO등이 알려져 있으며 이 중 발기부전에 중요한 물질인 NO는 혈관확장작용, 혈액응고작용, 항산화작용, 항염증 작용등의 역할을 통해서 혈관의 항상성을 유지한다.

표 9 및 도 14를 살펴보면, cGMP는 음경해면체 혈관을 이완시켜서 혈류를 증가시키고 결과적으로 발기하는데, 구기자 단독, 복합 그룹에서 cGMP 농도가 단독보다는 복합그룹에서 각각의 150mg/kg 그룹보다는 300mg/kg가 더 많이 증가하는 것으로 보아 발기부전기전에 영향을 미치는 것 같다.

	Concentration(pmol/g)	p value
Normal(Old Rat)	47.553±3.7
실시예 1	66.263±4.741	p<0.0001
실시예 2	74.874±8.605	p<0.0001
비교예 1	57.925±4.421	p<0.003
비교예 2	61.325±3.582	p<0.0002

(5) 평활근과 콜라겐의 비율 측정

1) 측정방법

Masson stain은 고정된 음경해면체 조직절편은 PBS로 세척하고 순차적 농도의 ethanol로 탈수시킨 후 paraffin 절편으로 만들어 4μm 절편으로 잘라 gelatine-coated glass 슬라이드에 올려 Masson's trichrome 염색을 하여 관찰한다. Masson's trichrome 염색된 슬라이드를 컴퓨터를 이용한 조직형태학적 영상분석기로 분석하여 각 슬라이드에서 100배 및 400배 배율하에 10～15회 시야에서 평균음경해면체 조직 내의 평활근의 비율을 백분율로 나타낸다.

2) 측정결과

발기 장애는 음경해면체에 해부학적으로 섬유조직이 증식되거나 평활근육질환, 교원질(Collagen)의 변화의 복합작용에 의하여 발생한다. 이중 한 개 이상에 결함이 있으면 정맥의 폐쇄기능이 장애를 일으켜 해면체내 혈액을 저장하지 못하므로 발기 장애가 나타나므로 평활근과 교원질의 분포비율을 측정하였다.

결과는 도 15에 나타내었고, 구기자 단독, 복합추출물 투여군에서 대조군에 비해 평활근의 비율이 증가하였으며, 특히 300mg/kg 투여군에서는 확연한 차이를 나타내었으나 통계적인 유의성은 보이지 않았다.

Claims

구기자, 오미자 및 오가피 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 당귀, 천궁, 계피 및 황기 중 적어도 하나 이상의 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증상의 예방 및 치료용 조성물.