KR20180068233A - 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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김남은
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제주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 가금류 원육의 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 가금류 원육의 품질 판별용 키트 및 가금류 원육으로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 COX2 유전자의 변이 수준을 측정하는 단계를 포함하는 가금류 원육의 품질을 판별하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 통해 소비자들은 보다 안전한 닭고기를 소비할 수 있으며, 본 발명의 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물은 향후 연관분석을 통해 안전성이 높은 계군을 교배 집단으로 사용하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

Description

가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물 및 이의 용도{Composition for discriminating quality of poultry raw meat and uses thereof}
본 발명은 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
COX(cyclooxygenase) 단백질은 프로스타노이드(prostanoid)로 불리우는 중요한 생물학적 매개체의 생합성 과정에 있어 중요한 역할을 하는 효소이다. COX-1 유전자가 다양한 조직 및 세포에서 항존유전자(housekeeping gene)로 발현되는 것에 반해, COX-2 유전자는 염증 반응 및 염증 관련 질환에 참여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생산 매개에 관여하는 유도성 발현 유전자이다. 또한, COX-2는 특정 암, 알츠하이머, 동맥경화 및 뇌졸중, 허혈성 뇌출혈 및/또는 트라우마에 의해 야기되는 중추신경계 질환에도 관여하는 것으로 보고되었다.
세계 1인당 연간 육류 소비량은 2010년 40.9kg에서 2030년 48.5kg으로 증가하고 있는 추세이며, 특히, 동물성 식품 중 가금육의 시장은 매우 밝은 전망이다.
본 발명에서는 식습관-유전자 상호관계의 평가에 의해 발암유발의 위험성과 연관되어 있는 동물성 고기의 섭취에 있어서, 안전한 육류의 소비를 위해, 가금류에서 COX2 유전자의 변이 수준을 분석하였다.
한편, 한국등록특허 제1474284호에는 '재래닭의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체식별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1590035호에는 '가금류의 환경 스트레스에 특이적인 유전자 바이오마커, 환경 스트레스 진단용 조성물, 진단용 키트 및 이를 이용한 스트레스 가능성, 산란율 예측방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한국 토종닭과 브로일러 닭의 가슴육으로부터 핵산을 추출하고 총 RNA를 이용하여 라이브러리를 제작한 후, 각 닭 품종의 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 서열을 토대로 아미노산 서열을 번역하고 분석한 결과, 상기 COX2 단백질의 아미노산 서열 내 다양한 비동의 SNP(nsSNP, nonsyonymous SNP)를 발견하였으며, 상기 비동의 SNP로 인한 아미노산의 치환이 COX2 단백질의 구조 변형을 유발하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 가금류 원육의 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가금류 원육의 품질 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 가금류 원육으로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 단계를 포함하는 가금류 원육의 품질을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 가금류 원육의 품질을 판별하는 방법을 통해, 소비자들은 보다 안전한 닭고기를 소비할 수 있으며, 본 발명의 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물은 향후 연관분석을 통해 안전성이 높은 계군을 교배 집단으로 사용하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 토종닭(KNC), 브로일러(brolier) 및 COX2 참조 서열의 아미노산 서열 비교 분석 결과이다.
도 2는 참조 서열과 토종닭간의 COX2 아미노산 보존 정도를 분석한 결과이다.
도 3은 참조 서열과 브로일러간의 COX2 아미노산 보존 정도를 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가금류 원육의 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 가금류 원육은 닭고기, 오리고기 또는 칠면조 고기일 수 있고, 바람직하게는 닭고기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 COX2 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 COX2 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질은 가금류 원육으로부터 추출한 핵산 시료 내에서 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 COX2 유전자 내의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 확인 또는 검출할 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 COX2 유전자의 SNP에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
COX2 유전자의 변이 수준의 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 SNP 위치의 염기를 포함하는 염기서열을 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 COX2 유전자 내의 변이 수준을 측정할 수 있다. PCR 조건, 정방향 및 역방향 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 상기 가금류 원육의 품질은 COX2 유전자의 변이 수준이 높지 않은 상태의 안전성을 의미하며, 이는 소비자가 안심하고 소비할 수 있는 상태의 원육을 말한다.
본 발명은 또한, 상기 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물을 포함하는 가금류 원육의 품질 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, 가금류 원육으로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 단계를 포함하는 가금류 원육의 품질을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 COX2 유전자의 변이 수준은 가금류 원육으로터 핵산을 분리하여, 핵산 시료 내 COX2 유전자 내의 SNP(single nucleotide polymorphism) 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 상기 가금류 원육으로부터 핵산의 추출은 당업계에 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 또는 상업적으로 판매되는 추출 키트 등을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 유전자 내의 SNP 수준을 확인하는 방법은 SNP에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 이용하여 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소 반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등의 다양한 방법으로 측정할 수 있으나, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 실험 재료
본 발명에 이용된 토종닭과 브로일러 닭은 약 10~12개월 령으로 각각 제주 축산진흥원과 한라육계조합에서 외부 한경에 의한 영향을 최소로 줄일 수 있도록 온도와 점등(light)을 조절할 수 있는 계사에서 사육하였다. 물과 사료는 자유 채식 하였으며, 사양관리는 일반적으로 행해지고 있는 방법에 준하여 실시하였다. 토종닭과 브로일러 닭을 각각 3두씩 동일한 날짜에 도계하여 가슴육을 분리하여 시료를 채취하였다.
2. SNP(single nucleotide polymorphism) 분석
토종닭과 브로일러닭의 가슴육으로부터 총 RNA는 TRIzolTM 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 추출하였으며, 추출한 RNA의 질과 양은 RNA 6000 Nano Lapchip을 이용하여 Bioanalyzer 2100으로 측정하였다.
상기 추출한 총 RNA 서열 라이브러리는 일루미나 사의 표준 프로토콜에 따라 90bp paired-end 서열을 가지고 제작하였다. 다른 지표를 가진 라이브러리를 모아 100 paired-end 시퀀싱의 일루미나 HiSeq 2000을 사용하여 one lane으로 서열화하였다. 저품질의 paired-end 리드들은 CASAVA(Consensus Assessment of Sequence and Variation) 버전 1.7을 이용한 추가 분석 진행 전에 제거하였으며, 모든 paired-end 리드들은 Tophat2(v 2.0.2)를 사용하여 닭(Gallus gallus) 게놈에 정렬하였으며, 리드들은 HTseq(v 0.5.3p3)을 이용하여 계산되었다.
SNP의 분석은 대사활성 및 단백질 입체구조(conformation)에 영향을 미치는 아미노산 치환을 확인하기 위해 수행되었다. 단백질 기능에 영향을 미치는 아미노산 치환인지를 예측하기 위해 SIFT(http://www.blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) 프로그램을 사용하였다. 또한, 단백질의 구조적 특징 및 기능성 특성에 아미노산 치환이 미치는 영향을 예측하기 위해 PROVEAN(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php) 소프트웨어를 사용하였다.
실시예 1. 토종닭 및 브로일러 닭의 COX2 서열비교 및 SNP 분석
토종닭과 브로일러 닭의 가슴육으로부터 분리한 총 RNA를 이용하여 각 닭 품종들의 COX2(cyclooxygenase 2) 단백질의 아미노산 서열과 NCBI의 참조서열을 정렬하여 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 확인되는 것과 같이 참조서열의 아미노산 서열과 토종닭 및 브로일러 닭의 COX2 단백질의 아미노산 서열 간의 유사성은 각각 19.69 및 18.90%로 그리 높지 않은 것으로 확인되었다. 또한, 참조서열과 토종닭, 그리고 참조서열과 브로일러 닭의 COX2 단백질의 아미노산 컨시스턴시(consistency)를 비교해 본 결과 역시 아미노산 보존성이 높지 않은 것으로 분석되었다(도 2 및 도 3). 상기의 결과를 통해, 토종닭과 브로일러 닭의 COX2 단백질에서 아미노산 치환이 많이 일어났음을 유추할 수 있었다.
하기 표 1과 표 2는 각각 토종닭과 브로일러 닭에서 가장 비보존된 잔기로부터 선택된 nsSNV(nonsyonymous Single Nucleotide Variation)의 목록을 정리한 것이다.
토종닭 유래 nsSNV
nsSNV SIFT PROVEAN nsSNV SIFT PROVEAN
S81P 0.00 Neutral S179V 0.00 -6.00
I82A 0.00 Neutral C188D 0.00 Neutral
Q83I 0.00 Neutral Q196W 0.00 -7.00
S84V 0.00 Neutral K198V 0.00 -7.00
G85L 0.00 Neutral H199P 0.00 Neutral
S88L 0.00 Neutral L200A 0.00 -5.00
Y90L 0.00 Neutral P202G 0.00 Neutral
F91P 0.00 Neutral N203V 0.00 -4.00
R92S 0.00 Neutral K205T 0.00 Neutral
D95I 0.00 Neutral L206D 0.00 Neutral
S96L 0.00 Neutral Q207A 0.00 Neutral
R102I 0.00 Neutral L209P 0.00 -4.00
L106D 0.00 -3.00 R210G 0.00 Neutral
L123W 0.00 Neutral L218Q 0.00 -3.00
T124Y 0.00 Neutral C219T 0.00 Neutral
L125W 0.00 Neutral L220S 0.00 -6.00
C128E 0.00 Neutral S221F 0.00 -3.00
S129Y 0.00 Neutral L223T 0.00 Neutral
H131D 0.00 Neutral H224T 0.00 Neutral
G133K 0.00 Neutral C225R 0.00 Neutral
M134D 0.00 -4.00 W226R 0.00 Neutral
V139S 0.00 -3.00 W227G 0.00 Neutral
L140Y 0.00 -5.00 H229F 0.00 -9.00
H141M 0.00 -3.00 I232Q 0.00 -5.00
I142T 0.00 -5.00 F239E 0.00 -6.00
I143P 0.00 -5.00 I241T 0.00 -3.00
F144I 0.00 Neutral L242P 0.00 Neutral
Y147L 0.00 Neutral A243L 0.00 Neutral
L148P 0.00 -3.00 S245H 0.00 -3.00
S152L 0.00 Neutral Q246F 0.00 -8.00
Y153G 0.00 Neutral F247E 0.00 -3.00
Q154H 0.00 Neutral K248A 0.00 Neutral
S157L 0.00 -6.00 L249W 0.00 Neutral
C158L 0.00 Neutral P250S 0.00 Neutral
K161D 0.00 -6.00 L251S 0.00 Neutral
L163R 0.00 -6.00 Q252L 0.00 Neutral
V176P 0.00 -6.00 S253L 0.00 Neutral
T177I 0.00 Neutral L254S 0.00 Neutral
D178R 0.00 Neutral
브로일러 닭 유래 nsSNV
nsSNV SIFT PROVEAN nsSNV SIFT PROVEAN nsSNV SIFT PROVEAN
M5D 0.00 -7.715 S86R 0.00 -4.999 T179F 0.00 -4.496
Q10T 0.00 -5.613 I89D 0.00 -6.592 D185C 0.00 -6.755
L11R 0.00 -5.283 L90S 0.00 -5.997 L187H 0.00 -6.606
A16K 0.00 -4.931 I96R 0.00 -5.967 W193Q 0.00 -12.477
S17C Neutral D100L 1.00 Neutral V195K 0.00 -5.685
S18I 0.00 -5.981 T102K 0.00 -5.822 P196H 0.00 -8.518
P19H 0.00 -8.913 K104M 0.00 -5.916 A197L 0.00 -2.959
I20Q 0.00 -5.955 A105C 0.00 -2.822 G199P 0.00 -7.340
L24T 0.00 -4.919 I106S 0.00 -4.248 V200N 0.00 -5.625
F27Q 0.00 -8.657 G107T 0.00 -7.873 T202K 0.00 -3.702
H28R 0.00 -7.933 Q109V 0.00 -6.903 D203L 0.00 -9.617
H30S 0.00 -8.955 W110A 0.00 -13.804 A204Q 0.00 -4.817
A35F 1.00 Neutral Y111T 0.00 -8.868 P206L 0.00 -9.695
Y44G 0.00 -9.736 W112I 0.00 -12.836 G207R 0.00 -7.756
L45R 0.00 -4.145 Y117L 0.00 -7.885 F214H 0.00 -5.526
L46R 0.00 -4.729 E118T 0.00 -5.916 T216C 0.00 -2.545
T47C 1.00 Neutral Y119L 0.00 -7.545 T217L 0.00 -2.871
M49A 0.00 -4.073 D121F 0.00 -5.916 G226W 0.00 -6.651
L50W 0.00 -4.538 F122C 0.00 -5.263 Q227I 0.00 -7.589
M51S 1.00 Neutral D124T 0.00 -3.787 C228H 0.00 -11.371
K53A 0.00 -4.650 S126P 1.00 Neutral S229F 0.00 -5.623
T60Y 0.00 -3.489 P133A 0.00 -6.671 E244F 0.00 -7.577
V61G 0.00 -4.059 D136V 0.00 -6.792 T246I 1.00 Neutral
A63E 0.00 -3.649 P138H 1.00 Neutral P247L 0.00 -8.184
E65T 0.00 -4.655 L149S 1.00 Neutral L248A 0.00 -4.092
L68S 0.00 Neutral G150Y 0.00 -6.890 H250S 0.00 -4.885
W70T 0.00 -12.701 H151Q 1.00 Neutral F251Q 0.00 -8.505
L74R 0.00 -4.464 L154S 0.00 -5.829 E252F 0.00 -6.204
P75S 0.00 -7.857 L155C 0.00 -4.864 A253K 1.00 Neutral
I77Q 0.00 -5.428 D158K 0.00 -6.383 W254L 0.00 -11.655
V78S 0.00 -4.827 R160L 0.00 -6.755 S255P 0.00 -3.096
L79G 0.00 -7.751 P173V 0.00 -5.539 S256L 1.00 Neutral
L82S 0.00 -4.047 I174T 0.00 -3.314 L257Q 1.00 Neutral
L84Y 0.00 -4.522 R175D 0.00 -6.705 L258L 1.00 Neutral
P85F 0.00 -10.929 V176S 0.00 -3.032 S259L 1.00 Neutral

Claims (7)

  1. 가금류 원육의 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 COX2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 COX2 유전자의 변이 수준을 측정하는 물질은 상기 COX2 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism)에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가금류는 닭인 것을 특징으로 하는 가금류 원육의 품질을 판별하기 위한 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 가금류 원육의 품질 판별용 키트.
  6. 가금류 원육으로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 COX2(cyclooxygenase 2) 유전자의 변이 수준을 측정하는 단계를 포함하는 가금류 원육의 품질을 판별하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 변이 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소 반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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