KR20180066850A - 조정가능한 뉴런망 및 의안 - Google Patents

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Abstract

측정 장치 (100)는 줄기 세포로부터 성장한 뉴런, 특히 망막, 조직 (110)이며, 뉴런 세포에 작용하는 영향에 반응하여 뉴런 조직 (110)의 세포에서의 전위를 변화시키는 3차원 형상 뉴런 세포를 갖는 것인 뉴런 조직 (110), 및 뉴런 세포에 의해 생성된 전위의 변화를 통해 뉴런 조직 (110)의 뉴런 반응을 측정하도록 구성된 판독 장치 (130)를 포함한다.

Description

조정가능한 뉴런망 및 의안 {A TUNABLE NEURONAL NETWORK AND AN ARTIFICIAL EYE}
본 발명은 조정가능한 뉴런망, 및 줄기 세포로부터, 특히 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장한 이러한 뉴런망, 특히 망막 조직을 포함하는 측정 장치, 의안 및 광학 소자, 및 조정가능한 뉴런망, 특히 망막 조직을 생산하는 방법에 관한 것이다.
망막은 시각을 가능하게 함에 있어 주요 역할을 한다: 이는 유입되는 광자를 뉴런 신호로 전환시킨 후 그들을 뉴런망을 사용하여 고도의 병렬 방식으로 프로세싱하고 필터링한다. 인간을 포함하는 많은 종에서, 그들은 광수용체를 포함하는 5종의 상이한 유형의 망막 뉴런에 의해 형성된다. 동물 망막 외식편으로의 실험이 망막 신호 프로세싱의 원리에 대한 통찰을 망 파라미터 (뉴런 유형, 뉴런 밀도, 뉴런 크기 및 시냅스 커플링 강도)의 기능으로서 제공하였지만, 그들은 종에 걸쳐 정량적으로 상이하다. 특히, 이들은 주로 조직 외식편의 이용가능성의 결여 및 법적으로 허용되는 유전적 접근법에서의 제한으로 인해 인간 조직 내에서 체계적으로 정량화되지 않았다.
최근에, 인간 배아 또는 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 유사기관은 그들의 생체내 대응부와 비교하여 그들의 세포 유형 및 조직 형태에서의 유사성으로 인해 광범위한 관심을 받았다. 그러나, 그들의 뉴런망의 기능성을 시험하는 것은 아직 가능하지 않았다. 유사하게, 망막 뉴런망보다 더 복잡한 구조를 갖는 뉴런망, 예컨대 뇌의 기능성을 시험하는 것은 아직 가능하지 않았다.
(I) 망막 인간 조직 또는 다른 뉴런 조직에서의 뉴런망의 기능을 측정하고 (II) 신호 프로세싱을 위한 조정가능한 뉴런망을 생성하기 위해, 적어도 하기 4개의 미해결 과제가 해결될 필요가 있다.
과제 I: 뉴런 판독 기술에 대한 인간 망막 조직 조성, 이용가능성 및 접근성
전체 인간 망막 또는 심지어 인간 뇌 또는 척수에서의 뉴런 반응의 측정은 심각한 실험적 장애로 인해 수행되지 못하였다. 뉴런망의 정량적 특징화는 다수의 개별 뉴런이 어떻게 그들의 이웃들과 상호작용하여 기능적 뉴런망을 생성하는 지에 대한 측정을 필요로 한다. 이는 단일 뉴런 해상도 (10 마이크로미터 공간적 해상도)에서의 전체 망 내에서의 뉴런 반응 (ms x 해상도)의 측정을 필요로 한다. 이러한 요구사항의 조합은 최신 기술의 능력을 넘어선다. 따라서, 망막 뉴런망을 연구하기 위해 2개의 모델 시스템이 사용된다.
한편으로는, 망막 조직 외식편 (예를 들어 마우스 망막)은 2D 층으로 평탄화되고 전극 어레이의 상부에 탑재되어 뉴런 신호를 측정한다 (Gollisch, T., & Meister, M. (2010), "Eye Smarter than Scientists Believed: Neural Computations in Circuits of the Retina", Neuron, 65(2), 150-164). 최신 기술 장치는 수백 개의 뉴런의 동시 판독을 가능하게 한다.
다른 한편으로는, 전체 뇌의 뉴런 반응은 작은 뇌를 갖는 동물 모델, 주로 드로소필라, 제브라피쉬 및 씨. 엘레간스를 사용하여 기록되어 왔으며 (Ahrens, M. B., & Engert, F., (2015), "Large-scale imaging in small brains", Current Opinion in Neurobiology, 32, 78-86; Borst, A., (2014), "Fly visual course control: behaviour, algorithms and circuits", Nature Publishing Group, 15(9), 590-599), 이는 이들이 전체적으로 이미징될 수 있기 때문이다.
동물 망막 및 망막 외식편을 사용하는 실험이 망막 기능의 이해를 얻는 것을 도왔다. 그러나, 뉴런망의 실제 파라미터는 이들이 종의 생태학적 환경 및 행동 반응에 따라 최적화됨에 따라 동물에서부터 인간까지 차이가 나타난다. 예를 들어, 망의 시냅스 커플링 강도는 도파민성 무축삭 세포의 분포에 의해 제어되는 국부 도파민 농도에 의해 결정된다 (Bloomfield, S. A., & Voelgyi, B., (2009), "The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina", Nature Publishing Group, 10(7), 495-506). 이러한 분포는 종에 걸쳐 상이하며 (Toerk, l. et al., (1995), "Neurotransmitters in the human brain", Plenum Press) 이로 인해 동물 모델을 사용하여 획득한 뉴런망에 대한 지식을 인간에게 전달하는 경우에 많은 주의가 필요하다.
따라서 인간 망막 또는 인간 뇌에 의해 수행되는 신호 프로세싱을 이해하는 것은 유사한 뉴런망 파라미터를 갖는 조직을 사용하는 실험을 필요로 한다. 그러나, 이러한 조직은 살아있는 인간에서 용이하게 접근가능하지 않으며 망막 외식편도 용이하게 이용가능하지 않다. 더욱이, 그들 망을 프로빙하고 조작하기 위한 도구로서의 유전자 변형은 법적 제한으로 인해 이용가능하지 않다.
따라서, 뉴런 조직의, 특히 인간 망막 조직의 특정한 형태를 사용하는 측정 장치, 및 이러한 망막 조직을 시험관내에서 형성하는 방법이 필요하다.
과제 II: 뉴런망 조정가능성
인간 및 동물로부터의 망막 또는 다른 뉴런 조직은 그들의 최종 뉴런망의 파라미터를 결정하는 그들의 유전적 프로그램에 따라 성장한다. 그들은 종의 생태학적 환경에 따라 최적화된다. 종 내에서의 뉴런망의 재현성으로 인해 그의 지속성이 소모된다. 이는 망 파라미터 (뉴런 유형, 크기, 밀도 및 커플링 강도)를 변화시키는 것을 기술적으로 매우 어렵게 한다. 시냅스 커플링 강도는 광-유전자 기술을 사용하여 제어가능하지만 (Boyden, E. S. et al., (2005), "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity", Nature Neuroscience, 8(9), 1263-1268), 뉴런 크기 및 밀도는 특히 제어하기 어렵다. 이러한 제한은 진보된 신호 프로세싱 적용을 위한 맞춤 뉴런망을 설계하고 연구하는 데 망막 및 망막 외식편을 사용하지 못하게 한다. 연구원은 상이한 뉴런 유형 및 크기에 의해 주어진, 마우스 망막 내에 구현된 30종 초과의 상이한 이미지 프로세싱 필터가 존재하는 것으로 추정한다. 이들 파라미터를 변화시키는 능력은 그들 망을 사용한 맞춤 프로세싱 알고리즘의 구현을 가능하게 할 것이다.
따라서, 제어가능한 방식으로 뉴런 조직 예컨대 망막 또는 뇌 내에서의 뉴런망의 형성에 대한 이해를 가능하게 하는 측정 장치가 필요하다. 더욱이, 뉴런망의 성장을 이들이 특정한 원하는 특징을 발생시키도록 조정할 수 있는 장치 및 방법이 필요하다.
과제 III: 유사기관 형상
최근 수년간, 연구원은 유사기관, 즉 그들의 생체내 대응부와 동일한 세포 유형 및 유사한 조직 형태를 갖는 기관-유사 구조를 페트리 디쉬에서 성공적으로 성장시킬 수 있었다. 그러나, 이들 유사기관의 전체 형상은 샘플에 따라 실질적으로 달라진다. 심지어 최신 기술 프로토콜에서도 유사기관의 형상은 이들을 예를 들어 겸자로 절단함으로써 거칠게 조정된다 (Hiler, D. J. et al., (2016), "Reprogramming of mouse retinal neurons and standardized quantification of their differentiation in 3D retinal cultures", Nature Protocols, 11(10), 1955-1976). 약 1 밀리미터의 그들의 작은 크기로 인해 이 기술은 임의적 형상을 생성하는 데 실현가능하지 않게 된다.
특히 뇌 및 망막의 경우에, 기관의 기능이 기관 형상에 따라 크게 달라지기 때문에, 이는 시험관내에서 기능적 기관의 제어된 제조를 못하게 한다.
따라서, 미리 결정된 형태로의 유사기관 조직의 성장을 가능하게 하는 장치 및 방법에 대한 필요가 존재한다. 유사기관을 임의적 형태로 형상화하는 본 발명의 능력은 망막 유사기관과 관련하여 개발되었지만, 또한 다른 유사기관, 예컨대 뇌 유사기관에 대해서도 사용될 수 있다.
과제 IV: 뉴런 반응의 3D-판독
망막, 망막 유사기관, 및 다른 뉴런 조직은 원리적으로 3차원 구조이다. 다중 뉴런의 뉴런 반응을 3D로 측정하는 것은 기술적으로 어렵다. 따라서, 실험은 2D 기하구조로 제한된 망막 외식편 (Obien, M. E. J., (2014), "Revealing neuronal function through microelectrode array recordings", 1-30) 또는 3D로 작은-뇌 동물 예컨대, 드로소필라, 제브라피쉬 및 씨. 엘레간스 (Ahrens, M. B., & Engert, F., (2015), "Large-scale imaging in small brains", Current Opinion in Neurobiology, 32, 78-86)를 사용하여 수행되었다. 세포 해상도에서 mm-크기 망막 또는 다른 뉴런 조직의 뉴런 신호의 완전 3D 판독을 수행하는 것은 아직 가능하지 않았다.
따라서 이러한 판독을 가능하게 하는 측정 장치를 제공하고 이러한 측정 장치에서 필요한 조정가능한 뉴런 (망막) 조직을 생산하는 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 하기 가이딩 원리에 기초하여 이들 과제에 대한 해결책을 제공한다.
(a) 인간-유사 뉴런 또는 망막 조직은 인간 배아 또는 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장할 수 있다. 기능적 광수용체 세포를 갖는 망막 유사기관을 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 성공적으로 성장시키는 것이 가능하다. 여기서, 시스템 내의 뉴런 유형은 망막 발생 동안 특정한 전사 인자의 적용에 의해 간단한 방식으로 제어될 수 있다. 이는 예를 들어 문헌 [Zhong, X. et al.: "Generation of three dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs" (Nature Communications, 5, 4047 EP-, 2014), Voelkner, M. et al.: "Retinal Organoids from Pluripotent Stem Cells Efficiently Recapitulate Retinogenesis" (Stem Cell Reports, 6(4), 525-538, 2016), Eiraku, M. et al.: "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture" (Nature 472, 51 - 56, 2011)], WO 2015/109148 A1, CN 103 409 363 A, 및 US 2016/0333312 A1에 기재되어 있으며, 이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
(b) 유사기관의 형상은 발생하는 유사기관, 예컨대 망막 유사기관 또는 또 다른 뉴런 유사기관을, 제어되는 기계적 특성을 갖는 환경 내에 내장시킴으로써 제어될 수 있다. 이전에 기재된 바와 같은 환경의 국부 연화 또는 강화에 의해 (Stowers, R. S. et al., (2015), "Dynamic phototuning of 3D hydrogel stiffness", Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(7), 1953-1958), 망막 성장 속도는 국부적으로 증가될 수 있다. 다른 기계적 특성 예컨대 점도 또는 응력 완화 상수의 패터닝이 또한 가능할 수 있다. 물질은 또한 확립된 기술, 예컨대 레이저 절제, 3D 레이저 절단을 사용하거나 또는 예를 들어, 광-조정가능한 점탄성 히드로겔을 사용하여 패터닝될 수 있다.
임의적 유사기관 형상을 생성하기 위해, 실제 유사기관 형상을 입력 파라미터로서 및 주위 물질의 시공간적 기계적 특성을 출력 파라미터로서 사용하여 피드백 루프가 구현될 수 있다.
(c) 뉴런 반응을 3D로 판독하는 것은 칼슘 민감성 염료/형광단을 사용하는 최신 기술 형광 현미경검사를 사용함으로써 전체 뉴런 또는 망막 유사기관에서 3차원으로 수행될 수 있다. 한 예는 확립된 기술인 광시트 현미경검사이다. 기술은 밀리초 획득 속도 (Mickoleit, M. et al.: "High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart", Nature Methods 11, 919-922, 2014) 및 단일 뉴런 해상도로의 뉴런 반응의 이미징 (Wolf S. et al.: "Whole-brain functional imaging with two-photon light-sheet microscopy" Nature Methods 12, 379-380, 2015), (Grienberger, C. & Konnerth, A. "Imaging Calcium in Neurons", Neuron 73, 862-885, 2012) (이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 대해 최적화되었기 때문에 이상적으로 적합하다. 뉴런 유사기관의 뉴런 반응을 이미징하기 위해, 맞춤 광시트 현미경이 요구되는데, 이는 상업적으로 입수가능한 해결책이 3D로 충분히 빠르게 이미징할 수 없기 때문이다.
이들 가이딩 원리를 사용하여 선행 기술에 비해 하기 이점을 개별적으로 또는 조합적으로 달성할 수 있다:
(1) 인간-유사 조직의 사용으로 인해 모델 시스템은 뉴런 반응 (예를 들어 광 유도된 신호)이 어떻게 인간 시스템에 가까운 뉴런 조직 예컨대 망막 조직에서 생성되고 프로세싱되는지의 연구를 가능하게 한다. 이러한 유사기관은 선행 기술로부터 공지된 인간 조직 외식편에 비해 유의하게 더 우수한 이용가능성 및 접근성을 갖는다. 따라서, 그에 기초하여 인간 뉴런망 기능의 체계적인 연구가 수행될 수 있다.
(2) 뉴런 유사기관은 예를 들어 전사 인자의 제어된 적용을 사용하여 제어될 수 있는 세포 유형, 밀도 및 연결 정도의 변화에 의해 뉴런 회로의 조정을 가능하게 한다. 게다가, 망막 유사기관에 대해 또한 광-유전자 접근법이 사용되어 예를 들어 시냅스 커플링 강도를 조정할 수 있다.
(3) 제한된 양의 형상을 갖는 선행 기술로부터 공지된 망막 또는 뉴런 유사기관 외식편 및 제어되지 않은 형상으로 성장하는 유사기관과 대조적으로 임의적으로 형상화된 망막/유사기관이 제공될 수 있다.
(4) 고속 형광 현미경검사, 특히 광시트 현미경검사의 사용으로 인해, 전체 뉴런 유사기관/망막 조직의 뉴런 반응의 3차원 판독이 달성될 수 있다.
망의 특성을 추가로 연구하기 위해 측정 장치에 구현될 수 있는 뉴런망 예컨대 망막의 시험관내 모델 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 이를 위해, 줄기 세포로부터, 예를 들어 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된 뉴런 유사기관을 사용하여 미리 결정된 영향에 민감성인 고도로 조정가능한 뉴런망을 제공할 필요가 있다. 추가로, 예를 들어 유사기관에 작용하는 외부 영향의 공간적 및/또는 시간적 제어에 의해, 유사기관의 형상을 제어할 필요가 있다. 게다가, 미리 결정된 영향에 대한 뉴런망의 반응을 3차원적으로 및 높은 획득 속도로 검출할 수 있는 판독 장치가 제공될 필요가 있다.
추가로 의학적 진단 및 치료에 사용하거나 또는 그의 개발을 위한 및/또는 신호 프로세싱에 사용될 수 있는 진보된 생체모방형 전기-광학 소자의 개발 및/또는 생산을 위한 이러한 측정 장치를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
독립항의 청구 대상에 의해 상기 이점이 달성되고 상기 과제가 해결된다.
측정 장치는 줄기 세포로부터 성장한 뉴런, 특히 망막, 조직이며, 3차원 형상 및 뉴런 세포에 작용하는 영향에 반응하여 뉴런 조직의 세포에서의 전위를 변화시키는 뉴런 세포를 갖는 것인 뉴런 조직, 및 뉴런 세포에 의해 생성된 전위의 변화를 통해 뉴런 조직의 뉴런 반응을 측정하도록 구성된 판독 장치를 포함한다.
이러한 측정 장치는 상기 이점을 얻기 위해 2개의 필수 구성요소를 포함한다. 줄기 세포로부터 성장한 완전 기능적 뉴런, 특히 망막, 조직은 원리적으로 공지된 방법에 따라 전체 조직에 걸쳐 뉴런 조직의 뉴런 세포의 반응에 의해 생성된 전위의 변화를 해결하는 것을 가능하게 하는 판독 장치와 함께 사용된다. 이는 최초로 원리적으로 자유롭게 설계가능한 3차원 뉴런 조직의 뉴런 반응에 대한 상세한 통찰, 즉 뉴런 신호에 기초한 상이한 활성이 생명체에 의해 수행된다는 것에 기초하여 뉴런 신호의 출력에 이르게 하는 전기화학 프로세스에 대한 통찰을 얻을 수 있게 한다.
뉴런 세포는 망막 조직의 광수용체일 수 있다. 이어서 뉴런 세포에, 즉 광수용체에 작용하는 영향은 광수용체에 입사되는 광일 수 있다. 광수용체에 의해 생성된 뉴런 반응은 이어서 이미지 형성 능력, 특히 광-유도된 신호의 생성 및 그들의 현장 프로세싱일 수 있다. 이는 어떤 광학 현상의 지각이 생명체에 의해 수행되는지에 기초하여 프로세스에 대한 상세한 통찰을 얻는 것을 가능하게 한다.
예를 들어 망막 조직을 형성하는 뉴런망은 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장할 수 있다. 이는 인간 뉴런망 예컨대 눈 또는 뇌에서 수행되는 뉴런 신호의 프로세싱에 대한 통찰을 얻을 수 있게 하며 이는 새로운 유형의 진단 및 요법의 개발에 이르게 할 수 있다. 더욱이, 뉴런 조직은 원리적으로 임의의 종류의 줄기 세포로부터 성장할 수 있으나, 유도된 만능 줄기 세포의 사용으로 인해 배아 줄기 세포를 사용하는 것이 불필요하게 된다.
전위의 관찰된 변화는 뉴런 조직의 세포에서의 세포질 칼슘 이온 농도의 변화에 의해 유발된다. 이들 뉴런 신호는 뉴런 세포에 의해, 특히 망막 광수용체에 의해 개시된다. 뉴런 조직의 세포는 또한 칼슘-민감성 형광 염료 또는 단백질을 포함할 수 있고 판독 장치는 고속 형광 현미경검사에 의해, 특히 광-시트 현미경검사에 의해 뉴런 조직의 세포의 측정된 부분 내에서의 칼슘 민감성 형광 염료 또는 단백질의 분포를 측정하고, 칼슘 민감성 형광 염료 또는 단백질의 측정된 분포로부터 세포의 측정된 부분 내에서의 세포질 칼슘 이온의 농도의 변화를 결정하고, 세포질 칼슘 이온의 농도의 결정된 변화로부터 세포의 측정된 부분 내에서의 전위의 변화를 결정하도록 구성될 수 있다.
전위의 판독을 위한 고속 형광 현미경검사, 예를 들어 광시트 현미경검사의 기술을 사용함으로써, 전체 뉴런 조직으로부터 데이터를 추출하는 신뢰할만한 방법이 제공될 수 있다. 실제로, 뉴런 조직의 세포 내로 칼슘 민감성 형광 염료를 도입함으로써, 세포질 칼슘 이온의 움직임은 칼슘 이온에 결합한 형광 염료의 추적에 의해 추적될 수 있다. 판독은, 오직 한 방향으로만, 즉 "광 시트"에 포커싱된 레이저 빔이 망막 조직의 전체를 스캐닝하여 형광 염료의 형광을 여기시킬 수 있는 광 시트 현미경검사에 의해 공지된 방식으로 수행된다. 이러한 형광은 광학 장치, 예컨대 현미경, 광전자증배관, 광 증폭기 및/또는 카메라에 의해 판독될 수 있으며, 이는 광 시트의 면에 수직으로 배열된다. 이 방법은 전기화학 반응에 의해, 즉 칼슘 이온의 농도의 변화에 의해 뉴런 조직에서 수행되는 이미지 프로세싱을, 전체 뉴런 조직에 걸쳐 또는 적어도 특히 관심있는 세포 영역 예컨대 예를 들어 망막 조직의 광수용체 세포, 신경절 세포 및/또는 연결 뉴런 (무축삭 세포, 수평 세포 및 양극 세포)에서 밀리초 시간 해상도로 판독하는 것을 가능하게 한다. 따라서 예를 들어 망막의 이미지 형성 능력, 즉 광 흡수 (광수용체 세포)로부터 시신경으로의 신호의 전송 (신경절 세포)까지의 망막을 통한 신호 수송 및 -프로세싱을 높은 공간적 및 시간적 해상도로 측정하는 것이 가능하다.
인간-유사 조직에서의 이 프로세스에 대한 지식은 의학적 치료의 개발에 사용될 수 있다. 예로서, 뉴런 조직에 의해 형성된 뉴런망의 작업은 약물, 예를 들어 신경전달물질의 활성화제 및 억제제의 기능으로서 직접적으로 측정될 수 있다. 더욱이, 망막 조직을 사용함으로써 시스템은 진보된 현장 이미지 필터링 및 프로세싱 장치를 설계하고 구현하는 데 사용될 수 있다.
측정 장치는 뉴런 조직에 외부적, 즉 물리적, 특히 기계적 및/또는 광학적, 및/또는 화학적 영향을 가하도록 구성된 영향 수단을 추가로 포함할 수 있다. 판독 장치는, 영향 수단에 의해 가해진 영향에 대한 반응에서의, 뉴런 조직의 뉴런 반응, 특히 망막 조직의 이미지 형성 능력을 측정하도록 구성될 수 있다. 이는 측정 장치로 전용 실험을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 영향 수단은 미리 결정된 세기, 파장 및 시간적/공간적 패턴의 광의 망막 조직 상으로의 투사를 가능하게 하는 원리적으로 공지된 광학 시스템으로서 설계될 수 있다. 이어서 판독 장치에 의해 측정된 신호의 의존성 및 그에 따른 입사광에 대한 망막 조직의 이미지 형성 능력은 상세히 분석될 수 있다. 그러나, 영향 수단은 또한 망막 조직 또는 다른 뉴런 조직 예컨대 뇌 조직에 기계적 힘을 가하여 이들 기계적 힘에 대한 반응에서의 각 뉴런 조직의 성능의 변화를 분석할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 화학적 영향은 또한 특정한 화학 물질 예컨대 의약이 뉴런 조직에 제공된 후 뉴런 조직의 성능을 분석함으로써 측정될 수 있다.
이러한 실험을 수행함으로써, 실험적으로 제어가능한 영향 하에서의 눈, 특히 인간 눈, 또는 다른 뉴런 유사기관 예컨대 뇌 또는 척수의 발생에 대한 통찰이 시험관내에서 획득될 수 있다. 이는 뉴런 조직이 통상적으로 다른 원하지 않는 영향과의 혼합 없이는 생체내에서 각 유사기관에 적용될 수 없는 특정한 조건에 노출될 수 있다는 특정한 이점을 갖는다. 이는 상이한 영향의 효과의 구분 및 분류를 가능하게 하며, 이는 다시 진단 도구 및 의학적 치료의 개발에 사용될 수 있다. 또한, 유전자 편집 기술은 시험관내 시스템에 적용가능하다. 이는 유전적 결함이 어떻게 유사기관 기능 예컨대 망막 기능에 영향을 미치는지 그리고 이들 질환을 다루기 위한 유전적 및 화학적 접근법을 발견하는 것을 돕는지를 이해하는 것을 가능하게 한다.
영향 수단은 뉴런 조직의 형상을 결정하도록 구성될 수 있다. 이는 예를 들어 뉴런 조직의 광학적 감독에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 예에 따르면 이는 이어서 영향 수단, 예컨대 고체 물질, 액체 또는 매트릭스-유사 구조의 부분을 형성하는 주위 환경 또는 물질과 뉴런 조직의 기계적 상호작용을 모니터링함으로써 수행될 수 있다.
따라서, 측정 장치를 사용하여 뉴런 조직의 뉴런 반응, 예컨대 망막 조직의 이미지 형성 능력을 관찰할 수 있다는 가능성 이외에도, 뉴런 조직의 형상을 관찰하는 것이 또한 고려가능하다. 이는 또한 외부 영향에 대한 반응에서의 뉴런 조직의 형상의 변화가, 필요한 경우 뉴런망 성능의 상응하는 변화와 함께 관찰될 수 있다는 이점을 갖는다. 이는 뉴런 조직 예컨대 망막의 성장과 외부 영향, 특히 망막 상의 광 사이의 상관-관계를 추가로 조사하는 데 사용될 수 있다.
실제로, 망막 조직을 형성하는 뉴런망에서의 커플링이 망막에 대한 외부 영향, 예컨대 광에 따라 달라질 뿐만 아니라, 망막 조직의 형상화가 이러한 영향에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 망막에의 광의 입사 시에 생성되는 신경전달물질 예컨대 도파민의 존재는 그것이 또한 특정한 영역에서의 망막의 성장을 촉발하기 때문에 근시의 발생에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 실험적으로 제어되는 외부 영향과 망막 조직의 형상화 사이의 관계를 관찰하는 것은 눈의 및 눈 질환의 발생 프로세스에 대한 더 깊은 이해에 이르게 할 수 있으며 이는 새로운 유형의 의학적 진단 및 치료의 개발을 위해 필수적일 것이다.
여기서, 영향 수단은 공지된, 제어가능한 형태를 가질 수 있고, 뉴런 조직은 뉴런 조직 및 영향 수단이 서로 기계적으로 상호작용하고, 뉴런 조직의 형상이 영향 수단에 대한 기계적 상호작용의 영향으로부터 또는 광학 기술을 통해 결정될 수 있도록 영향 수단에 내장될 수 있다. 이를 위해, 이어서 영향 수단, 예컨대 고도로 점성인 액체 또는 매트릭스의 부분을 형성하는 주위 환경 또는 물질과 뉴런 조직의 기계적 상호작용이 모니터링될 수 있다.
그러나 예를 들어, 뉴런 조직을 둘러싸는 영향 수단의 물리적 상태, 예컨대 예를 들어 압력 분포의 변화는 뉴런 조직에 직접 적용되지 않을 수 있는 원리적으로 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는데, 이는 예를 들어 이들이 조직 그 자체에 영향을 미치거나 또는 심지어 그를 파괴할 수 있기 때문이다. 측정된 기계적 상호작용으로부터, 이어서 뉴런 조직의 형상은 공지된 알고리즘을 적용함으로써 재계산될 수 있다. 예를 들어, 영향 수단에서의 압력 분포 및/또는 그의 변동은, 뉴런 조직이 이 압력 분포를 적어도 부분적으로 유발하므로, 뉴런 조직의 형상에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 따라서, 뉴런 조직에 의해 유발된 압력을 전체 압력 분포로부터 필터링하는 것은 뉴런 조직의 형상에 대한 통찰을 제공한다.
주요 안질환 예컨대 녹내장은 망막에 작용하는 물리적 투입 예컨대 기계적 응력에 의해 유발된다. 본 발명에 따라 측정 장치를 사용하여, 예를 들어 외부 응력을 변화시키면서 망막의 기능을 측정하는 것이 가능하다. 이는 망막 질환에 대한 물리적 영향을 더 잘 이해하고 가능한 치료를 발견하기 위한 기회를 열어준다.
영향 수단의 형태는 미리 결정될 수 있고, 예를 들어 3차원 현탁 배양물일 수 있다. 뉴런 조직을 둘러싸는 물질을 국부적으로 연화시키거나 또는 강화시킴으로써 망막 조직에 대한 기계적 상호작용 또는 영향을 변화시키는 것이 가능할 수 있다. 이는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 물질을 확립된 기술 예컨대 레이저 절제로 패터닝함으로써 또는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된 US 2016/0116394 A1에 제시된, 연질의 물질의 기계적 특성을 변화시키는 데 적합한 방법 및 물질을 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 공지된 초기 또는 중간 형상과 관련하여 뉴런 조직의 형상의 변화가 관찰될 수 있으며, 이는 측정 결과를 개선시킨다.
측정 장치는 뉴런 조직의 측정된 뉴런 반응 및/또는 결정된 형상을 망막 조직의 미리 결정된 뉴런 반응 및/또는 미리 결정된 형상과 비교하고, 그 비교에 기초하여 제어 신호를 생성하고, 제어 신호를 영향 수단에 전송하도록 구성된 제어 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 영향 수단은 제어 신호에 기초하여 뉴런 조직에 물리적 및/또는 화학적 영향을 가하도록 구성된다. 제어 유닛을 사용함으로써 측정 장치는 뉴런 조직을 미리 결정된 형상 또는 미리 결정된 뉴런 반응을 갖도록 하기 위해 제어 루프를 설정하는 데 사용될 수 있다. 이를 위해, 제어 유닛은 어떤 외부 영향이 뉴런 조직의 실제 형태/형상 및/또는 뉴런 반응/성능과 원하는 값 사이의 차이의 감소에 이르게 하는지를 제어 유닛이 인식하는 것을 가능하게 하는 기계 학습 기술을 사용할 수 있다. 따라서, 다양한 상이한 외부 영향을 시도함으로써 제어 유닛은 원하는 결과에 이르게 하는 영향을 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제어 유닛은 단지 외부 영향의 미리 결정된 세트, 예를 들어 광 세기, 파장 및/또는 패턴, 또는 조정가능한 기계적 특성을 갖는 주위 환경에 의해 가해진 기계적 힘만을 조정하도록 구성될 수 있다.
이러한 제어 루프를 사용하는 것은 뉴런 반응의 미리 결정된 특성 예컨대 형상 및 형태를 갖는 뉴런 조직의 생산 및 그의 성능의 연구를 가능하게 한다. 따라서, 망막 조직에 대한 이러한 제어 루프를 사용함으로써 인간의 것들과 유사하거나 또는 동일한 특성을 갖는 의안을 연구하고/거나 생성하는 것이 가능할 수 있다. 또한, 특정한 파장 및/또는 세기의 광에 적응하고 이에 따라 광을 전기 신호로 전환시키는 광학 소자의 구성성분으로서의 역할을 할 수 있는 망막 조직의 특수 형태를 설계할 수 있다. 또한, 망막 질환을 갖는 환자로부터의 유도된 만능 줄기 세포를 사용하여 망막 유사기관을 성장시키는 것은 시험관내에서 질환을 모델링하는 한편 환자의 망막 뉴런망의 기능성을 측정하는 것을 가능하게 할 것이다. 이어서 제어 루프는 생리학적 성능이 회복될 수 있는 조건을 발견하는 데 사용될 수 있다.
측정 장치 내에서의 뉴런 조직은 미리 결정된 초기 형상을 가질 수 있고/거나 단지 상이한 세포 유형의 미리 결정된 초기 혼합만을 포함할 수 있으며, 특히 망막 조직은 단지 망막 광수용체의 미리 결정된 혼합만을 포함할 수 있다. 이는 공지된 초기 특성을 갖는 뉴런 조직을 연구하는 것을 가능하게 하며, 초기 조건이 정밀하게 고정될 수 있기 때문에 뉴런 조직에 대한 영향을 더 잘 이해하도록 도와줄 것이다. 예를 들어, 줄기 세포로부터의 망막의 발생 동안 올바른 전사 인자를 사용함으로써 단지 단일 유형의 광수용체 세포만을 갖는 망막 조직을 생산할 수 있다. 이들 조건이 인간 망막에서는 발생하지 않기 때문에, 예를 들어 단일 종의 광수용체 세포에 대한 외부 영향의 영향을 분석할 수 있다.
줄기세포로부터 유사기관, 특히 뉴런 또는 망막, 조직을 망막 형상에 대해 제어하면서 형성하는 방법은 줄기 세포로부터 유사기관, 특히 뉴런 또는 망막, 세포를 발생시키는 단계, 유사기관 세포를 제어가능한 기계적 특성을 갖는 환경 내에 내장시키는 단계, 광학 기술을 사용하거나 또는 환경에 대한 유사기관 세포와 환경 사이의 기계적 상호작용의 영향으로부터 유사기관 세포의 형상을 측정하는 단계, 유사기관 세포의 측정된 형상을 미리 결정된 형상과 비교하는 단계, 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 비교에 기초하여 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 차이가 최소화되도록 환경의 기계적 특성을 조정함으로써 미리 결정된 영역에서의 조직 성장 및/또는 변형을 유도하는 단계, 및 측정된 형상 및 미리 결정된 형상 사이의 차이가 미리 결정된 역치 미만인 후 조직 성장 및/또는 변형을 종결시키는 단계를 포함한다.
상기 설명과 유사하게, 유사기관, 특히 뉴런 또는 망막, 조직은, 예를 들어 US 2016/0116394 A1에 기재된 물질에서와 같이 유사기관 조직이 제어가능한 기계적 특성을 갖는 환경에 투입되는 경우, 미리 결정된, 제어가능한 형태로 생성될 수 있다. 이러한 물질을 유사기관 세포에 대한 기재로서 및 성장하는 유사기관 세포의 형상에 대한 제어 루프로서 사용함으로써, 미리 결정된 형상을 갖는 유사기관 조직을 생성하는 것이 가능하다. 기술은 망막 유사기관에의 그의 적용에 제한되지는 않지만, 또한 예를 들어 뇌-, 폐-, 장 유사기관의 경우에 적용될 수 있다.
유사기관 세포 유형을 발생시킴에 있어 단지 세포 유형의 미리 결정된 혼합만이 발생될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 이는 예를 들어 줄기 세포의 망막 세포로의 전환 동안 특정한 전사 인자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 형상 이외에도 뉴런 조직의 세포 혼합이 또한 제어될 수 있다.
측정 장치에서의 뉴런 조직의 미리 결정된 초기 형상 및 상이한 세포 유형의 미리 결정된 초기 혼합은 상기 기재된 방법에 의해 얻어질 수 있다.
뉴런 유사기관은 뉴런 조직의 형상 및/또는 뉴런 반응을 추가로 적응시키기 위해 상기 기재된 측정 장치 내에서 뉴런 조직으로서 유사기관 세포의 성장을 종결시킨 후 수득된 뉴런 유사기관 세포를 사용함으로써 형성될 수 있다. 이는 뉴런 조직의 원하는 특성이 얻어질 수 있도록 뉴런 세포의 형상의 적응 또는 뉴런망의 상호연결을 수행함으로써 뉴런 조직의 형상 및/또는 뉴런 반응을 정밀하게 조정할 수 있게 한다.
의안은 상기 기재된 방법 중 하나에 따라 형성된 망막 조직을 포함할 수 있다. 유사하게, 입력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 전기-광학 소자는 상기 언급된 방법에 따라 형성된 망막 조직을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 방법 및 측정 장치는 의약에 사용될 수 있는 의안, 및 신호 프로세싱을 위한 전기-광학 소자를 제조하거나, 또는 적어도 이러한 장치를 어떻게 제조하는지에 대한 이해를 개선시키는 데 사용될 수 있다.
하기에서 본 발명의 상세한 설명이 첨부된 도면에 기초하여 제공될 것이다. 이는
도 1 한 실시양태에 따른 측정 장치의 개략도;
도 2 한 실시양태에 따른 측정 장치의 개략도;
도 3 한 실시양태에 따른 측정 장치의 개략도;
도 4 한 실시양태에 따른 영향 수단의 개략도;
도 5 한 실시양태에 따른 측정 장치의 개략도;
도 6 한 실시양태에 따른 망막 조직을 형성하기 위한 방법의 프로세스 흐름의 개략도;
도 7 한 실시양태에 따른 망막 조직을 형성하기 위한 방법의 프로세스 흐름의 개략도;
도 8 한 실시양태에 따른 의안의 개략도; 및
도 9 한 실시양태에 따른 광학 소자의 개략도
에 도시된다.
하기 설명에서는 광수용체에 입사되는 광에 반응하여 망막 조직의 세포에서의 전위를 변화시키는 광수용체를 포함하는 망막 조직을 참조한다. 이 전위는 망막 조직의 이미지 형성 능력을 결정하기 위해 판독된다.
그러나, 망막 조직에의 이러한 제한은 단지 설명의 용이성만을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지는 않는다. 망막 조직 대신에 줄기 세포로부터 성장할 수 있는 임의의 뉴런 조직이 사용될 수 있다.
더욱이, 이러한 뉴런 조직에 작용하는 임의의 영향은 이 영향에 반응하여 세포 내에서의 전위를 변화시킬 뉴런 조직 내의 뉴런 세포에 대한 효과를 가질 것이다. "변화"는 여기서 영향 (예컨대 광이 입사된 광수용체의 신호)에 의해 직접적으로 유발된 전위의 직접적이고 단기적인 변동 뿐만 아니라, 영향에 의해 유발된 뉴런 조직의 뉴런망의 상호연결 (예컨대 화학물질 및/또는 약물의 영향 하에 또는 기계적 영향 하에 형성된 상호 연결)에 의해 유발된 전위의 변동을 포함한다.
따라서, 망막 조직의 이미지 형성 능력은 전위의 변화로부터 결정될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 일반적으로 영향에 의해 유발된 전위의 이들 변화에 의해 구성된 뉴런 반응으로부터 결정될 수 있다. 하기 기재되는 이미지 형성 능력의 판독은 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 다른 뉴런 조직의 능력에 대해 용이하게 일반화될 수 있는 구체적 예이다.
따라서, 망막 조직과 관련하여 하기에 상세히 기재되어 있지만 본 발명은 보다 일반적으로 또한 임의적 뉴런 조직의 특성의 모니터링 및/또는 조정에 적용가능하며, 이러한 특성은 예를 들어 뉴런 조직의 형상 또는 뉴런 반응이다.
도 1은 측정 장치 (100)의 개략도를 보여준다. 측정 장치 (100)는 시험관내 망막 조직 (110) 및 판독 장치 (130)를 포함한다.
망막 조직 (110)은 임의적 3차원 형태를 갖고 망막 조직이 광 (L)을 수용하고 광을 전기 신호로 전환시키는 것을 가능하게 하는 망막 세포를 포함한다. 망막 조직 (110)은 광 (L)이 입사되는 완전 기능적 망막 광수용체 (120), 즉 광수용체 세포를 포함한다. 입사광 (L)에 반응하여 망막 광수용체 (120)는 망막 조직 (110)의 세포, 즉 망막 조직 (110) 내에서의 전위를 변화시킨다. 특히, 망막 광수용체 (120)는 이들 내의 세포질 칼슘 이온의 농도를 조정함으로써 입사광 (L)에 반응하고 따라서 그들의 세포 막을 가로질러 전위를 변화시킨다. 전위의 이러한 변화는 광수용체 (120)로부터 전송된 초기 전기 신호에 상응하며, 즉 이는 망막 조직 (110)에 의해 수행된 신호 프로세싱의 제1 상을 구성하고 이는 수용된 전자기 방사선으로부터의 이미지의 재구성을 가능하게 한다. 광수용체 (120)에 의해 발생된 초기 전기 신호는 칼슘 신호전달을 통해 망막 조직 (110)의 다른 세포 층에, 즉 연결 뉴런 (양극 세포, 무축삭 세포 및 수평 세포) 및 신경절 세포에 추가로 전송되며, 여기서 신호는 시신경을 거쳐 뇌로 전달될 준비가 될 때까지 추가로 프로세싱되고 필터링된다. 그러나, 망막 조직 (110)이 시험관내에서 제공되고 생체내에서는 제공되지 않기 때문에 시신경에 의한 어떠한 판독도 제공되지 않는다. 하기 상술된 바와 같이 망막 조직 (110) 내에서, 즉 망막 조직 (110)의 세포 내에서 변화하는 전위에 의해 구성된 신호는 판독 장치 (130)에 의해 판독될 것이다.
망막 조직 (110)은 줄기 세포로부터 성장한다. 측정 장치 (100)는 임의의 생명체의 임의의 종류의 망막 조직 (110)으로 작동될 것이지만, 망막 조직은 바람직하게는 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장하며, 이는 살아있는 인간으로부터 망막 세포를 추출하거나 또는 배아 줄기 세포를 사용할 필요 없이 인간 망막 조직 (110)의 분석을 가능하게 한다. 망막 조직 (110)은 예를 들어, 문헌 [Zhong, X. et al.: "Generation of three dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs" (Nature Communications, 5, 4047 EP-, 2014), Voelkner, M. et al.: "Retinal Organoids from Pluripotent Stem Cells Efficiently Recapitulate Retinogenesis" (Stem Cell Reports, 6(4), 525-538, 2016), Eiraku, M. et al.: "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture" (Nature 472, 51 - 56, 2011)], WO 2015/109148 A1, CN 103 409 363 A, 및 US 2016/0333312 A1 (이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 확립된 기술에 따라 유도된 만능 줄기 세포로부터 생성될 수 있다.
여기서, 간략하게, 줄기 세포는 2차원 배양물 중에서 유지되고 3차원 현탁 배양물로 전달되어 응집체를 형성한다. 이어서 신경상피로의 분화는 결절 및 라미닌 단백질의 조합을 사용하여 분화 경로를 활성화시킴으로써 유도된다. 망막 분화 인자의 첨가는 망막 전구체로의 분화 및 그들의 후속 자기-조직화를 유발하여 광학 컵-유사 구조를 형성한다. 망막 세포의 성숙은 이어서 완전 기능적 망막 광수용체 (120)의 발생에 이르게 한다. 이는 한 예이며, 다른 프로토콜이 또한 가능하다.
이러한 프로세스에서, 특정한 전사 인자를 사용함으로써, 세포 유형의, 특히 광수용체 세포 유형의 혼합은 측정 장치 (100)에 의해 수행될 원하는 측정에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어 간상 및 원추 광수용체 세포의 밀도는 장치의 스펙트럼 반응을 결정한다 (색각 대 그레이 스케일). 인간에서 망막의 중심은 더 높은 밀도의 원추 세포를 가져 색각을 가능하게 하는 반면에 망막 주변부는 간상 광수용체 세포로 주로 이루어진다. 이 조합은 중심 색각, 및 주변부에서의 그레이 스케일에서의 높은 신호 대 잡음을 가능하게 한다. 간상-대-원추 광수용체 세포의 비 및 그에 따른 발명된 측정 장치의 스펙트럼 반응은 유사기관 발생의 특정한 단계에서 분자 신호에 대한 억제제를 적용함으로써 조정될 수 있다.
한 예는 유사기관 발생의 특정한 시간에서의 노치(Notch) 억제제의 적용이다.
무축삭 및 신경절 세포의 크기 및 밀도는 뉴런망 내에 구현된 공간적 필터링 프로세스에 대한 길이 스케일을 결정한다. 더 큰 무축삭 세포는 예를 들어 추가로 분리된 광수용체로부터의 출력 신호를 프로세싱할 수 있으며 이는 더 큰 공간적 특색을 프로세싱하는 것을 가능하게 한다. 한 예는 망막 상에 투사된 크고 느리게 움직이는 이미지로부터 오는 뉴런 신호의 억제이다. 따라서, 그들 세포의 크기 및 밀도를 조정하는 것은 구현된 필터의 조정을 가능하게 한다.
줄기 세포로부터 망막 세포를 성장시키는 확립된 방법 이외에, 하기 기재되는 바와 같은 방법을 또한 사용하여 망막 조직 (110)을 수득할 수 있으며 이는 망막 세포의 미리 결정된 혼합 뿐만 아니라, 순수한 자기-조직화에 의해 얻은 형상과 상이할 수 있는 미리 결정된 형상을 갖는다. 따라서, 측정 장치 (100)는 또한 조직 형상에 따라 망막 조직 (110)의 특성을 분석하는 것을 가능하게 한다.
광수용체 (L)에의 광 (L)의 입사 후에 망막 조직 (110)에서 발생하고/거나 이에 퍼지는 전기 신호, 즉 이들 전기 신호를 구성하는 망막 조직 내에서의 전위의 변화는 판독 장치 (130)에 의해 측정된다. 전위의 변화가 최종적으로 뇌에서 형성될 이미지를 결정하기 때문에, 판독 장치 (130)는 망막 조직 (110)의 이미지 형성 능력을 전위를 측정함으로써 측정한다. 실제로, 망막 조직 (110)의 이미지 형성 능력은 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 광수용체 (120)의 유형의 조성 및 망막 조직 (110)의 형태 또는 형상 이외에, 이미지 형성 능력은 또한 망막 조직의 세포에 의해 형성된 뉴런망의 상호연결에 크게 의존한다.
예를 들어, 인간 눈은 광범위한 조명 조건에 적응할 수 있으며 심지어 그의 망막은 단일 광자를 검출할 수 있다. 이러한 광 수준 감소에 적응하기 위해 망막 내의 "픽셀 크기"는 인접 광수용체 세포의 신호를 조합함으로써 증가하고 그에 따라 공간적 해상도는 감소한다. 따라서, 비닝은 망막에 의해 수행된다. 이를 실현하기 위해, 인접 광수용체 세포는 그들의 간극 연접을 통해 커플링되며 커플링 강도는 신경전달물질, 예컨대 예를 들어 도파민의 농도에 의해 결정된다. 따라서, 인간 눈의 뉴런망의 상호연결은 이미지 형성 능력을 상이한 수준의 광 조명에 적응시키는 것을 가능하게 한다.
판독 장치로 전위의 변화를 측정함으로써 이에 따라 이미지 형성 능력에 대한 정보를 얻을 수 있고 이는 다시 망막 조직 (110)의 뉴런망, 및 특정 부류의 망막 세포, 조직의 형상 및 외부로부터 망막 조직 (110)에 작용하는 영향에 대한 그의 의존성을 더 잘 이해하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 측정 장치 (110)는 망막 조직 (110)의 기능에 대한, 특히 달리 얻을 수 없고 새로운 진단적 및 치료적 적용의 개발 및/또는 적용을 가능하게 할 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 얻은 인간 망막 조직 (110)에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 특히, 장치는 광 조명의 반응 기능 및 많은 안질환 예컨대 근시에서 또한 역할을 하는 신경전달물질 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
판독 장치 (130)는, 원리적으로, 망막 조직 (110) 내에서의 전위에 대한 정보를 임의적 방식으로, 예를 들어 전위를 고도로 민감한 전극에 의해 직접적으로 측정함으로써 얻을 수 있다. 그러나, 도 2와 관련하여 상세히 설명되는 바와 같이 판독 장치 (230)는 또한 전위를 고속 형광 현미경검사, 예를 들어 광시트 현미경검사 또는 레이저-스캐닝 2-광자 현미경검사를 사용함으로써 측정하는 것을 가능하게 할 수 있다.
도 2는 상기 기재된 바와 같은 망막 조직 (210) 및 광시트 현미경검사를 수행하도록 구성된 판독 장치 (230)를 포함하는 측정 장치 (200)를 보여준다. 이를 위해, 판독 장치 (230)는 광원 (232) 및 수광기 (234)를 포함한다. 광원 (232)은, 예를 들어 원통 렌즈 등에 의해, 오직 한 방향으로만 포커싱된 광 (S)을 방출하도록 구성되며, 광 (S)은 각각 미리 결정된, 바람직하게는 조정가능한, 세기 및 파장을 갖는다. 광원 (232)은 예를 들어 발생하는 레이저 광을 오직 한 방향으로만 포커싱시켜 "광시트" 또는 광 평면 (S)을 형성하는 레이저 광원일 수 있다. 도 2에서 광 평면 (S)은 상면도로 도시되며, 즉 광 평면은 도 2의 투사면으로부터 연장된다. 광 (S)의 좌측으로의 및 우측으로의 연장은 도 2에 무시가능한 것으로서 도시되지만, 광시트는 위에서 보는 경우 또한 "나비넥타이 형상"을 가질 수 있으며 나비넥타이의 목은 광시트 현미경검사를 위한 관심 영역에 위치한다.
광시트 현미경검사에 필수적인 것은 분석될 대상이 관심 영역에서 광원 (232)에 의해 대상을 통과하는 (가상의) 2차원 섹션을 가로질러 조명되어야 한다는 것이다. 측정 장치 (200)는 따라서 판독 장치 (230)의 광원 (232)으로부터 방출된 광 (S)이 망막 조직 (210)을 통과하는 2차원 평면에서 망막 조직 (210)의 세포의 부분과 교차하도록 구성된다. 이러한 세포의 부분은 관찰되거나 또는 측정된 세포의 부분을 구성한다.
측정 장치 (200)에서 하나의 또는 여러 칼슘 민감성 형광 염료 (214)가 망막 조직 (210) 내에 도입된다. 대안적으로, 유전자 코딩된 칼슘-민감성 지시자가 사용될 수 있다 (GCaMP). 염료 또는 형광 단백질 (214)은 망막 조직 (210)의 세포의 칼슘 이온 (212)의 이동을, 예를 들어 칼슘 이온에 결합함으로써, 추적할 수 있다. 칼슘 민감성 염료에 대한 예는 Fluo-4 (써모피셔(ThermoFisher)) 또는 Rhod-2 (써모피셔)이고, 유전자 코딩된 칼슘 지시자의 예는 GCaMP5이다.
광원 (232)으로부터 방출된 광 (S)의 파장은 이것이 칼슘 민감성 형광 염료 (214)의 형광을 여기시키도록 설정된다. 따라서, 광 (S)의 망막 조직 (210)과의 교차부를 따라 형광 광 (F)이 염료 (214)에 의해 방출될 것이다. 광 (S)과 망막 조직 (210)의 2차원 교차면 내에서의 형광 광 (F)의 세기 분포로부터 칼슘 이온의 분포가 결정될 수 있다. 전위의 변화에 이르게 하는 칼슘 이온의 분포의 변화는 따라서 형광 광 (F)의 세기 분포의 관찰을 통해 검출가능하다.
이를 위해, 판독 장치는 수광기 (234)를 포함한다. 수광기 (234)는 그의 검출 방향이 망막 조직 (210)과 광 (S) 사이의 교차부에 의해 형성된 평면에 수직이 되도록 배열되며, 이는 수광기 (234)가 이 평면을 관찰하도록 구성된다는 것을 보장하기 위한 것이다. 예를 들어 수광기 (234)는 광학 경로가 광시트 (S)에 실질적으로 수직인 광학 현미경, 광전자증배관, 광 증폭기 및/또는 CCD-카메라와 같은 카메라 시스템, 및 방출된 형광 광을 검출하기 위한 필수 광학 구성요소를 포함할 수 있다. 수광기 (234)의 초점은 광시트 (S)의 평면 상에 설정될 수 있다. 초점은 또한 광시트 (S)에 근접한 층에 조정가능한 방식으로 설정될 수 있고 예를 들어 광시트로부터 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 500 μm 또는 그 초과만큼 광시트에 수직인 방향으로 떨어질 수 있다. 이는 또한 광시트 주위의 망막 조직 (210)을 통과하는 섹션을 시스템의 구성요소의 이동 없이 분석하는 것을 가능하게 한다. 대안적으로, 펄스 펨토초 레이저를 사용하는 맞춤-제작 고속 레이저 스캐닝 현미경이 사용될 수 있다.
칼슘 민감성 형광 염료 (214)의 분포에 대한 수신된 정보는 이어서 수광기로부터 측정 장치 (200)의 (미도시된) 프로세싱 유닛으로 포워딩된다. 거기서, 광 시트 (S)를 따라 위치한 망막 조직 (210)의 세포의 전위의 변화가 이 정보로부터 결정된다. 프로세싱 유닛이 측정 장치 (200)의 다른 구성요소에 근접하게 위치할 필요는 없다는 것에 주목한다. 프로세싱 유닛은 또한 수광기 (234)로부터 획득된 데이터가 전송되는 컴퓨터 또는 서버일 수 있다.
망막 조직 (210) 또는 광원 (232) 및 수광기 (234)를 이동시킴으로써 완전한 망막 조직 (210)은 2차원 절편으로 스캐닝될 수 있다. 여기서, 상대 이동은 선형일 수 있거나 또는 회전을 또한 포함할 수 있다. 획득된 2차원 절편으로부터 망막 조직의 완전한 이미지가 획득될 수 있다. 그러나, 망막 조직의 특정한 부위에, 예를 들어 망막 조직 (210)의 광입사측 (광 (L))에 위치한 광수용체의 층에, 망막 조직 (210)의 반대 측에 위치한 신경절 세포에, 또는 사이의 연결 뉴런 세포에 포커싱하는 것이 가능하다. 이미징 목적을 위해, 망막 유사기관은 배양 배지 및/또는 영양소에 대해 투과성인 중합체 겔, 예컨대 아가로스 또는 메틸셀룰로스가 내장된 페트리 디쉬에 탑재될 것이다. 충분한 양의 영양소를 제공하면서 다른 연질의 물질에 탑재하는 것이 또한 가능하다.
따라서 광시트 현미경검사를 사용함으로써 전체 망막 조직 (210)에서의 세포질 칼슘 이온 농도의 변화에 의해 유발된 전기 신호의 전파로 인한 망막 이미지 프로세싱을 시각화 하는 것이 가능하다. 광시트 현미경검사의 시간적 및 공간적 해상도가 예를 들어 약 100 프레임/s (80 내지 120 프레임/s) 및 1 마이크로미터 (0.8 내지 1.2 마이크로미터)이므로 망막 조직 (210)의 뉴런망을 통한 신호의 전파 및 이에 따른 망막 조직 (210)의 이미지 형성 능력을 연구하는 것이 가능하다. 이는 다시 의약에 또는 뉴런 신호 프로세싱의 분야에 유용한 새로운 통찰에 이르게 될 것이다.
여기서, 망막 조직의 세포가 전체 망막 조직 (210) 전체에 걸쳐 형광 광 (F)의 여기 및 판독을 가능하게 하기 위해 여기 광 (S)에 뿐만 아니라 형광 광 (F)에 충분히 투과성이어야 한다는 것이 명백하다. 그러나, 이 조건은 사용된 망막 조직, 여기 및 형광 파장에 충족된다.
도 2는 단지 광시트 현미경검사의 개략적 다이어그램만을 나타낸다. 그러나, 이는 본 발명을 도 2와 관련하여 기재된 광시트 현미경검사의 방법 및 시스템에 제한하도록 의도하지 않는다. 실제로, 속도 및 해상도 요구사항을 충족시키는 임의의 다른 현미경검사 기술이 사용될 수 있다. 특히, 망막 세포 내에서의 및 그를 가로지르는 전위의 변경을 검출하게 하는 임의의 현미경검사 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mickoleit, M. et al.: "High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart" (Nature Methods 11, 919-922, 2014), Wolf S. et al.: "Whole-brain functional imaging with two-photon light-sheet microscopy" (Nature Methods 12, 379-380, 2015), 또는 Grienberger, C. & Konnerth, A. "Imaging Calcium in Neurons" (Neuron 73, 862-885, 2012)] 및/또는 WO 2011/036094 A1 (이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법 중 하나, 또는 그의 변경이 사용될 수 있다.
도 3은 측정 장치 (300)를 개략적으로 도시하며 이는 각각 상기 기재된 것들에 상응하는 망막 조직 (310) 및 판독 장치 (330) 옆에 영향 수단 (340)을 포함한다. 영향 수단 (340)은 외부 영향, 즉 망막 조직 (310)에서 생성되지 않은 영향을, 망막 조직 (310)에 제어가능한 방식으로 가하는 것이 가능하도록 망막 조직 (310)과 커플링된다. 다시, 판독 장치 (330)는 도 1 및 2와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 망막 조직 (310)에서의 전위의 변화를 측정하고 그로부터 외부 영향에 따라 이미지 형성 능력의 변화를 결정할 수 있다.
측정 장치 (300)는 따라서 특정한 외부 영향 하에서 망막 조직 (310) 및 그의 이미지 형성 능력을 시험하기 위한 전용 실험을 설정하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 도파민 농도와 상관되는 뉴런 신호의 공간적 비닝이 측정 장치 (300)에 의해 분석될 수 있다. 실제로, 예를 들어 망막 조직 (310) 상에서의 시공간적 광 패턴에 의해 영향을 받는 국부 도파민 활성화는 뉴런 신호의 프로세싱 및 눈 발생에서 주요 역할을 하는 것으로 가정된다. 이러한 실험은 망막 조직의 구조 및 작업에 대한 더 깊은 이해에 이르게 하고 새로운 진단 및/또는 치료 수단의 개발 및/또는 사용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 조명 패턴이 어떻게, 예를 들어 인간의, 망막 조직에서 분자 인자를 단일 세포 수준에서 제어하는지를 측정 장치 (300)에 의해 정량적으로 특징화할 수 있다. 인간-유사 조직 내에서의 용량-반응 곡선 (예를 들어 광-신경전달물질 농도)을 아는 것은 특정한 약물 설계를 가능하게 한다.
외부 영향은 임의의 물리적 또는 화학적 영향일 수 있다. 특히, 영향 수단 (340)은 전체 망막 조직 또는 그의 부분을 특정한 패턴, 파장 및/또는 세기를 갖는 광으로 원리적으로 공지된 방식으로 조명하는 것을 가능하게 하는 광학 장치로 이루어질 수 있다. 이는 망막 조직 (310)의 특정한, 실험적으로 제어가능한 광 조건에 대한 반응을 분석하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 예를 들어 특정한 광 조건에 대한 반응에서의 망막 조직 (310) 내에서의 뉴런 연결의 형성이 분석될 수 있다. 이는 조명 광 패턴과 감소된 이미지 형성 능력 사이의 상관관계가 가정되는, 다양한 안질환의 발생에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 광학 장치는 예를 들어 합성 렌즈 시스템, 특히 그에 따라 적응된 광각 렌즈 시스템을 포함할 수 있으며, 이는 임의적 광 패턴, 특히 임의적 시공간적 광 패턴을 망막 조직 (310)에 투사하는 것을 가능하게 한다.
영향 수단 (340)은 또한 망막 조직 (310)에 광학 영향보다 다른 전자기 영향을 가할 수 있다. 예를 들어, 또한 전기장 및/또는 자기장의 또는 가시 광선의 스펙트럼의 외부의 전자기 방사선의 영향이 분석될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로 영향 수단 (340)은 망막 조직에 화학적 영향을 제공하게 할 수 있다. 예를 들어, 영향 수단 (340)은 화학적 성분 예컨대 의약 및/또는 의학적 물질의 망막 조직 (310)에의 제공을 가능하게 할 수 있으며 이는 이들 화학적 성분에 대한 망막 조직 (310)의 뉴런망의 반응 및 그의 이미지 형성 능력을 연구하기 위한 것이다. 이는 망막 조직의 의학적 시험을 시험관내에서 가능하게 하며 이는 살아있는 생명체의 손상 없이 수행된다. 더욱이, 이는 또한 생체내에 존재할 수 있는 다양한 화학적 성분과 망막 조직의 상호작용에 대한 더 나은 이해, 이에 따라 눈의 발생 및 기능에 대한 더 나은 이해를 가능하게 한다.
영향 수단 (340)은 추가적으로 또는 대안적으로 또한 망막 조직 (310)에 기계적인 힘을 가하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 영향 수단 (340)은 3차원 구조일 수 있으며 이는 망막 조직 (310)에 상이한 압력 값을 가하게 한다. 이러한 압력을 가하기 위한 간단한 수단은 망막 조직 (310) 상에서 누르는, 예를 들어 고정된 비-가요성 기계적 구성요소 예컨대 핀 또는 바늘이다. 망막 조직 (310)은 또한 도 4에 제시된 바와 같은 환경 내로 이동되고 이것이 망막 조직 (310)을 특정한 미리 결정된 영역에서 누르는 한편, 다른 영역에는 어떠한 압력도 가하지 않는다. 이는 망막 조직 (310) 내에서의 이미지 형성 능력 및 뉴런망 형성을 특정한 미리규정된 기계적 상호작용의 영향 하에 측정하게 하며, 이는 또한 눈 발생 및 기계적으로 유도된 안질환 예컨대 녹내장에 대한 더 깊은 이해에 기여한다.
여기서, 영향 수단 (340)은 망막 조직 (310)의 형상이 영향 수단 (340)에 의해 측정될 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 광학 또는 전자기 영향은 광학 또는 전자기 수단에 의해 망막 조직 (310)의 형상을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 영향 수단 (340)은 망막 조직 (310)에 의해 반사되거나 또는 전송된 광을 검출함으로써 망막 조직의 크기 및 형상을 측정하게 할 수 있다. 3차원 형태는 예를 들어 구조화된 광 스캐너의 널리 공지된 기술을 사용함으로써 결정될 수 있으며 이는 또한 망막 조직 (310)의 이미지 형성 능력의 반응을 시험하는 데 사용된 패턴에 의해 직접적으로 구현될 수 있다. 대안적으로, 망막 조직 (310)의 형상의 이러한 광학적 검출은 또한 판독 장치 (330)에 의해 수행될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로 영향 수단 (340)은 망막 조직 (310)의 영향 수단 (340)에 대한 기계적 역반응에 의해 망막 조직 (310)의 형상을 검출할 수 있다. 실제로, 영향 수단 (340)으로부터 망막 조직 (310) 상에 가해진 압력은 또한 망막 조직 (310)으로부터 영향 수단 (340) 상에 가해진다. 따라서, 망막 조직 (310)의 형태의 변화는 또한 망막 조직 (310)과 영향 수단 (340) 사이의 기계적 상호작용을 변경시킬 것이다. 기계적 상호작용에서의 이러한 변화의 영향 수단 (340)에 대한 효과는 망막 조직 (310)의 형태의 변화를 추론하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, 압력이 바늘 또는 핀에 의해 망막 조직 상에 가해지는 경우, 바늘 및 핀의 위치 또는 형태의 변화는 망막 조직 (310)의 형태의 실제 변화보다 검출하기 더 용이할 수 있다.
망막 조직 (310)은 또한 기계적 특성, 예컨대 예를 들어 환경 내에서의 응력 분포가 모니터링될 수 있는 환경에 내장될 수 있다. 그의 변형장에 의해 제시된, 공간 및 시간의 기능으로서 물질의 형상은 물질에 작용하는 시공간적 응력장 및, 추가적으로, 이들 응력에 대한 물질의 반응에 의해 결정된다. 응력 및 기계적 특성의 양 둘 다가 공지된 경우, 물질의 변형이 계산될 수 있다. 따라서, 유사기관을 기지의 탄성 계수 및 기지의 응력 분포를 갖는 물질에 내장시키는 것은 시스템의 기계학 (힘, 응력)이 외부 환경에 의해 지배되는 제한에서 그의 형상의 결정을 가능하게 한다. 대안적으로, 형상은 광학 기술 예컨대 형광 현미경검사 또는 명시야 현미경검사를 사용하여 3D로 직접적으로 이미징될 수 있다.
따라서, 기계적 상호작용을 사용함으로써, 한편으로는 망막 조직의 형상이 영향을 받을 수 있는 반면, 다른 한편으로는 생성된 변화가 바로 측정될 수 있다. 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이 망막 조직 (410)은 환경을 구성하는 영향 수단 (440), 예컨대 고형체, 액체, 매트릭스 또는 상 변화 물질에 내장될 수 있으며, 그의 기계적 특성, 예컨대 탄성 계수 및/또는 점도 및/또는 응력 완화 상수는 제어가능하다. 예를 들어, 환경은, 본원에 참조로 포함된 US 2016/0116394 A1에 기재된 바와 같은 자성유체 액적으로 제공되는 연질의 물질일 수 있다. 그러나, 환경의 형태는 또한 원리적으로 고정되나, 시간 경과에 따라 비가역적으로 변화되거나 또는 패터닝될 수 있다. 예를 들어, 망막 조직 (410)이 내장된, 고정된 초기 형태의 고형체 또는 매트릭스의 국부 기계적 특성은 펄스 UV 및/또는 펄스 펨토초 IR 레이저를 사용하는 레이저 절제 또는 -절단에 의해 변화될 수 있다. 더욱이, 영향 수단 (440)을 구성하는 환경의 국부 연화 또는 강화는 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Stowers, R. S. et al., (2015), "Dynamic phototuning of 3D hydrogel stiffness" (Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(7), 1953-1958)]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
기계적 특성을 국부적으로 조정하기 위한 다른 확립된 기술이 사용될 수 있다. 예는 가교가 광학 또는 화학 기술을 사용하여 조정될 수 있는 중합체 겔이다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 PEG 히드로겔의 강성은 겔을 가교하는 UV 광을 사용하여 제어될 수 있다. 이 방식으로, 겔의 탄성 계수는 약 100에서부터 10kPa까지 국부적으로 증가될 수 있다. 중합체 겔의 탄성 계수를 제어하기 위한 또 다른 방식은 그의 메쉬의 망 강도를, 열-민감성 가교와 조합하여 겔의 국부 가열을 통해 제어하는 것이다. 이 방식으로, 겔의 탄성 계수는 약 1kPa에서부터 10kPa까지 조정될 수 있다. 또 다른 방식은 UV 조명 시 절단되는 광분해성 가교의 사용이다. 탄성 계수는 약 5%의 정밀도를 가지며 그의 초기 값의 10%로 제어된 방식으로 감소될 수 있다.
영향 수단 (440)을 구성하는 환경의 기계적 특성의 변화는 망막 조직 (410)의 상이한 부분이 상이한 기계적 환경에 의해 영향을 받는 상황을 일으킬 수 있다. 이는 망막 조직 (410)의 상부 및 하부 부분은 강성 고체 영향 수단 (440)과 접촉하는 한편, 그의 좌측 및 우측 부분은 영향 수단의 액체 구성요소와 접촉하는 것을 보여주며 개략적인 방식으로 도 4에 도시된다. 그러나, 이는 단지 단순화된 예시도일 뿐이고 상이한 기계적 상호작용이 또한 영향 수단 (440)의 각 이웃 부분과 동일한 거리를 갖는 망막 조직 (410)의 부분에 존재할 수 있다는 것에 주목해야 한다.
망막 조직 (410)이 그의 형태를 변화시키는 경우, 이는 주위 환경 또는 영향 수단 (440)과의 기계적 상호작용을 불가피하게 변화시킨다. 상기 기재된 바와 같이 기계적 상호작용의 변화는 영향 수단 (440)의 물리적 특성 예컨대 그의 형태, 그의 내부 응력 분포 또는 영향 수단 (440)의 다른 기계적 파라미터가 변화하도록 영향 수단 (440)에 영향을 미친다. 이러한 변화는 이어서 검출되고 망막 조직 (410)의 형상이 그로부터 결정된다. 이 단계를 위해 필수적인 프로세싱은 영향 수단 (440)의 내부 또는 외부의 그것이 가능한 임의의 프로세서에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 도 4에서 강한 기계적 상호작용이 망막 조직 (410)의 상부 및 하부 영역에서 관찰된다. 따라서, 이 영역 옆의 영향 수단 (440)에서의 압력은 높을 것이고 변형 또는, 측정될 수 있는 영향 수단의 굴절률과 같은, 물리적 특성의 변화에 이르게 할 수 있다. 물질 내에서의 국부 응력을 측정하기 위해 US 2016/0116394 A1에 제시된 바와 같이 오일 액적이 사용될 수 있다. 물질의 국부 응력은 또한 예를 들어 형광 비드를 내장시킴으로써 3D 견인력 현미경검사를 사용하여 측정될 수 있다.
다른 한편으로는, 영향 수단 (440)이 그의 형태 또는 적어도 망막 조직 (410)과의 기계적 상호작용을 변화시키도록 그의 기계적 특성을 제어 하는 것이 또한 가능할 수 있다. 따라서, 망막 조직 (410)을 제어가능한 기계적 특성을 갖는 적합한 환경에 내장시키는 것은 망막 조직 (410)의 형상을 결정하는 것 및 망막 조직 (410)에 기계적 영향을 가하는 것 둘 다를 가능하게 한다. 실제로, 도 4에서 영향 수단 (440)의 형태는 좌측 및 우측으로의 망막 조직의 용이한 성장 및/또는 이동을 가능하게 하며, 여기서 망막에 작용하는 탄성 응력은 비교적 작고 (망막-액체 계면), 그리고 상향 및 하향 성장을 억제하는데, 이는 거기서 탄성 응력이 이들 영역에서의 조직 이동에 대해 작용하기 때문이다 (망막-고체 계면). 이 방식으로, 영향 수단 (440)에 의해 가해진 외부 기계적 힘은 망막 조직 (410)을 실질적으로 임의의 원하는 3차원 형상으로 가져올 수 있다.
도 5에 도시된 바와 같이 측정 장치 (500)는, 상기 기재된 장치에 상응하는 망막 조직 (510), 판독 장치 (530), 및 영향 수단 (540) 이외에도, 또한 제어 유닛 (550)을 포함할 수 있다. 제어 유닛 (550)은 판독 장치 (530) 및 영향 수단 (540)과 통신하도록 구성된다. 제어 유닛 (550)은 컴퓨터 또는 서버 또는 하기 기능을 수행하는 데 적합한 임의의 다른 프로세서에 의해 구현될 수 있다. 이는 측정 장치 (500)의 다른 구성요소에 근접하게 또는 그로부터 멀리 배열될 수 있다. 더욱이, 제어 유닛 (550)은 또한 측정 장치 (500)의 다른 구성요소의 임의의 다른 프로세싱 요소와 조합될 수 있다. 예를 들어, 측정 장치 (500)의 모든 프로세싱 기능은 단일 프로세서 등에 의해 수행될 수 있다.
측정 장치 (500)에 의해 획득된 모든 측정 결과, 즉 적어도 망막 조직 (510)의 전위에 대한 및/또는 망막 조직 (510)의 형상에 대한 결과는, 제어 유닛 (550)에 의해 수신된다. 제어 유닛 (550)은 획득된 측정 결과를 미리 결정된 값과 비교하고 영향 수단 (540)에 공급되는 제어 신호를 생성하여, 영향 수단 (540)이 망막 조직 (510)에 영향을 가하도록 하며 이는 이후의 획득된 측정 결과를 제어 유닛 (550)에서 설정되거나 또는 저장된 미리 결정된 값에 더 근접하게 하는 데 적합하다. 따라서, 제어 유닛 (550)은 망막 조직의 측정된 특성을 이들 특성에 대해 미리 결정된 설정 값에 적응시키는 데 사용되는 제어 루프를 닫는다.
예를 들어, 예를 들어 특정 스펙트럼 영역에서의 특정 광 민감성 및/또는 뉴런망의 특정 기능 및 성능과 같은, 미리 결정된 이미지 형성 능력을 갖는 제어 유닛 (550)이 공급될 수 있다. 이어서 판독된 이미지 형성 능력은 판독 장치 (530)로부터 제어 유닛 (550)에 공급되고 제어 유닛 (550)에 의해 미리 결정된 이미지 형성 능력과 비교된다. 비교의 결과는 예를 들어 미리 결정된 스펙트럼 영역에서의 광 민감성이 특정 백분율, 예를 들어 20%만큼 너무 낮다는 것일 수 있다. 제어 유닛 (550)은 이어서 제어 신호를 영향 수단 (540)에 공급하여 측정된 이미지 형성 능력 및 미리 결정된 이미지 형성 능력을 서로에게 더 근접하게 하는, 즉 측정된 및 미리 결정된 이미지 형성 능력 사이의 차이를 최소화하는 영향을 촉발할 수 있다. 상기 예에서 제어 신호는, 예를 들어 단지 원하는 파장을 갖는 광만을 공급함으로써 또는 임의의 다른 적합한 수단에 의해, 원하는 파장 영역에서의 광 민감성의 증가에 이르게 하는 영향을 촉발할 수 있다. 측정된 및 미리 결정된 이미지 형성 능력 사이의 차이가 미리 결정된 역치 미만인 후, 영향의 생성은 종결된다. 상기 예에서 이는 예를 들어 1%, 5%, 10% 등의 원하는 및 획득된 광 민감성 사이의 차이일 수 있다.
유사하게, 측정 장치 (500) 내에서 영향 수단 (540) 또는 판독 장치 (530)에 의해 측정된 바와 같은 망막 조직의 형상은 제어 유닛 (550)을 위한 입력 파라미터로서 사용될 수 있다. 제어 유닛 (550)은 이어서 망막 조직 (510)의 형상이 제어 장치 (550)에 저장되거나 또는 그에 공급되는 망막 조직 (510)의 미리 결정된 형상에 더 근접하게 되도록 망막 조직 (510) 상에 가해지는 영향을 변화시키도록 영향 수단 (540)을 촉발하는 제어 신호를 생성한다.
예를 들어, 도 4에서 상부 영역에서의 망막 조직의 성장이 바람직한 경우, 제어 유닛 (550)은 영향 수단 (440)이 그의 기계적 특성을, 예를 들어 이 영역에서 영향 수단을 더 부드럽게 함으로써 이 상부 영역에서 망막 조직 (410)과 영향 수단 (440) 사이의 기계적 상호작용이 더 작게 되도록 변화시키거나 또는 그의 형태를 망막 조직 (410)과 영향 수단 (440) 사이의 거리가 더 크게 되도록 변화시키도록 어드바이스할 수 있다. 이어서 이 영역으로의 성장이 또한 가능하게 된다. 대조적으로, 영향 수단 (440)에서의 간극을 좌-우-방향으로 더 좁게 만드는 것에 의해, 이 영역에서의 망막 조직 (410)의 성장은 추가적으로 억제될 것이다.
따라서, 제어 유닛은 또한 망막 조직 (510)의 형태를 원하는 미리 결정된 형태에 근접하게 하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 망막 조직의 형상이 원하는 형상에 충분히 근접한 경우, 예를 들어 차이가 망막 조직의 전체 크기의 단지 몇 퍼센트, 예컨대 1%, 5%, 10%인 경우, 망막 조직을 생성하는 방법은 종결된다.
제어 유닛 (550)은 또한 측정된 및 미리 결정된 값 사이의 차이의 감소에 대해 올바른 파라미터, 예컨대 이미지 형성 능력 또는 망막 형상을 기계 학습 기술을 사용함으로써 획득하도록 구성될 수 있다. 이를 위해, 제어 유닛 (550)은 망막 조직 (510)에의 다양한 상이한 영향 및 망막 조직 (510)에서의 상응하는 변화를 시험할 수 있다. 이들 결과로부터 제어 유닛 (550)은 통상적으로 공지된 기계 학습 기술에 의해 차이를 최소화하기 위해 어떤 영향이 가해져야 하는지 추론할 수 있다. 이 방식으로 원하는 특성을 갖는 망막 조직 (510)이 획득될 뿐만 아니라, 이들 특성의 형성과 이들을 발생시키는 데 필요한 영향 사이의 상관관계, 예를 들어 망막 형상과 망막 이미지 형성 능력의 상관관계를 이해하는 것이 가능하다. 이러한 통찰은 이어서 안질환을 위한 새로운 의약 또는 요법의 개발에 사용될 수 있다.
도 1 내지 5와 관련하여 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 측정 장치는 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장한 망막 조직을 시험관내에서 깊은 수준으로 분석하는 것을 가능하게 한다. 추가로, 이들은 망막 조직에 특정한 원하는 특성의 형성에 이르게 할 수 있는 특정하게 제어되는 영향을 제공함으로써 망막 조직의 특성을 변형시키는 것을 가능하게 한다.
여기서, 망막 조직의 특성에 영향을 미치기 위한 기술은 상기 기재된 바와 같이 측정 장치에 이미 구현된 망막 조직을 위해서뿐만 아니라, 줄기 세포로부터의 망막 조직 또는 다른 유사기관 또는 뉴런 조직의 초기 성장에 사용될 수 있다. 망막 조직에 관한 그에 따른 방법의 예시적인 프로세스 흐름은 도 6에 개략적으로 도시된다. 이것이 예를 들어 다른 유사기관 또는 뉴런 조직 예컨대 뇌, 폐, 또는 장 유사기관을 형성하는 방법의 사용에 대해 어떠한 제한도 의도하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 이는 하기 망막 세포에 대한 임의의 언급을 각 유사기관 세포에 대한 언급에 의해 대체함으로써 달성된다.
S610에서 망막 세포는 줄기 세포로부터 잘 확립된 기술에 따라 발생된다 (문헌 [Zhong, X. et al.: "Generation of three dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs" (Nature Communications, 5, 4047 EP-, 2014), Voelkner, M. et al.: "Retinal Organoids from Pluripotent Stem Cells Efficiently Recapitulate Retinogenesis" (Stem Cell Reports, 6(4), 525-538, 2016), Eiraku, M. et al.: "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture" (Nature 472, 51 - 56, 2011)], WO　2015/109148 A1, CN 103 409 363 A, 및 US 2016/0333312 A1).
S620에서 수득된 망막 세포는 제어가능한 기계적 특성을 갖는 환경 내에 내장되고 S630에서 망막 세포의 형상은 환경에 대한 망막 세포와 환경 사이의 기계적 상호작용의 영향으로부터 또는 다른 이미징 기술, 예를 들어 광학 이미징 기술에 의해 측정된다. 환경의 특성 및 형상의 측정이 수행되는 방식은 여기서 도 4 및 5와 관련하여 상기 기재되었던 망막 조직과 영향 수단 사이의 상호작용에 상응한다.
S640에서 망막 세포의 측정된 형상은, 예를 들어 도 5와 관련하여 기재된 바와 같은 제어 유닛에 의해 미리 결정된 형상과 비교된다.
S650에서 미리 결정된 영역에서의 망막 세포의 성장 및/또는 망막 조직의 변형은 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 비교에 기초하여 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 차이가 최소화되도록 환경의 기계적 특성을 조정함으로써 유도된다. 이는 도 4 및 5와 관련하여 상기 기재되었던 바와 같이 망막 세포를 둘러싸는 환경의 기계적 특성을 변화시킴으로써 수행된다.
S660에서 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 차이가 미리 결정된 역치 미만인 경우, 망막 세포의 성장 및/또는 망막 조직의 변형은 종결된다. 따라서, 망막 조직의 형상이 원하는 형상에 충분히 근접한 경우, 예를 들어 차이가 망막 조직의 전체 크기의 단지 몇 퍼센트, 예컨대 1%, 5%, 10%인 경우, 망막 조직을 생성하는 방법은 종결된다.
이 방식으로 망막 조직은, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 측정 장치에서의 사용을 위해, 이미 미리 결정된 형태를 갖는 것으로 생산될 수 있다. 더욱이, 줄기 세포로부터의 망막 세포의 발생 동안 망막 세포의, 특히 망막 광수용체의 유형 또는 혼합을, 원하는 유형 또는 혼합으로 선택함으로써, 미리 결정된 형상 뿐만 아니라, 미리 결정된 이미지 형성 능력을 갖는 망막 조직을 발생시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 망막 조직은, 망막 조직의 초기 특성이 명백하게 규정될 수 있으기 때문에 실험의 수행을 위한 이상적인 출발지를 제공하며, 이는 외부 영향에 대한 망막 조직의 반응의 용이한 검출을 가능하게 한다.
도 6과 관련하여 기재된 방법에 따라 초기 망막 조직을 설정한 후에, 이 망막 조직은 도 1 내지 5와 관련하여 기재된 바와 같은 측정 장치에서 사용될 수 있다. 프로세스 흐름이 도 7에 개략적으로 도시된 망막 조직의 생산 방법에 따라, 망막 조직의 특성은 그를 상기 기재된 바와 같은 측정 장치에서 구현함으로써 추가로 조정될 수 있으며, 여기서 제어 루프가 특성을 추가로 조정하는 데 사용된다.
여기서, S710에서 외부 영향이 망막 조직에 가해지고 망막 조직의 특성 예컨대 망막 조직의 이미지 형성 능력 및/또는 형상이 도 3 내지 5와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 S720에서 측정된다. S730에서 이들 측정된 특성은 미리 결정된 특성과, 즉 미리 결정된 형상 및/또는 미리 결정된 이미지 형성 능력과 비교된다. 비교에 기초하여 제어 신호가 생성된다.
S740에서 외부 영향은 제어 신호에 기초하여 도 5와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 측정된 및 미리 결정된 값 사이의 차이가 최소화되도록 변화된다. S750에서, 측정된 및 원하는 특성 사이의 차이가 허용가능한 것인 경우, 즉 차이가 미리 결정된 역치 미만인 경우, 프로세스는 종결된다.
따라서, 상기 방법에 의해 원하는 특성을 갖는 망막 조직을 발생시키는 것이 가능하다. 더욱이, 망막 조직을 수득하는 프로세스는, 예를 들어 기계 학습 기술을 사용할 수 있는 제어 유닛에 의해 수행되는 경우, 추가의 통찰을 제공할 수 있다.
도 8은 상기 언급된 방법 중 하나에 따라 수득되거나 또는 발생된 망막 조직 (810)을 포함하는 의안 (800)을 개략적으로 도시한다. 여기서, "망막 조직"은 또한 상기 기재된 바와 같은 측정 장치에 의해 정밀조사된 망막 조직의 뉴런망에 대한 통찰에 따라 설계된 임의의 전자 뉴런망을 포함한다. 망막 조직 (810)은, 눈 렌즈 (802)를 포함하는 눈 몸체 (801)에서, 광을 눈 렌즈 (802)를 통해 수용하고, 광을 뉴런 신호로 전환시키고 이것이 이어서 시신경 (803)을 통해 뇌에 이르게 되도록 배열된다. 망막 조직 (810)과 같이 의안의 모든 다른 구성요소는 또한 순수하게 생물학적 조직일 필요는 없으며, 전자 부품, 무기 구성요소, 플라스틱 물질 및/또는 유기 구성요소의 임의의 조합일 수 있다.
따라서, 줄기 세포로부터 성장하거나 또는 이러한 망막 조직을 연구함으로써 획득된 뉴런망에 대한 통찰에 따라 설계된 망막 조직 (810)은 의안에 사용될 수 있으며 이는 결국 맹인이 보는 것을 가능하게 할 수 있다.
유사하게, 도 9에 개략적으로 도시된 바와 같이 망막 조직 (910)은 요소 몸체 (901), 진입 윈도우 (902), 및 데이터 라인 (903)을 포함하는 전기-광학 소자 (900)의 부분일 수 있다. 전기-광학 소자 (900)는 진입 윈도우 (902)를 통해 유입되는 광 신호를 망막 조직 (910)에 의해 전기 신호로 전환시키며, 이는 이어서 데이터 라인 (903)을 통해 공급되고 판독된다. 또한 여기서 용어 "망막 조직"은 상기 방법 중 하나에 의해 줄기 세포로부터 성장한 생물학적 망막 조직 또는 이러한 조직에 따라 설계된 전자 뉴런망을 지칭한다.
따라서, 줄기 세포로부터 성장한 망막 조직 (910) 또는 그로부터의 통찰은 또한 신호 프로세싱을 위한 요소에 사용될 수 있고 인간 눈의 원리에 따라 작동하는 광검출기의 구축을 가능하게 할 수 있다.

Claims (15)

  1. 줄기 세포로부터 성장한 뉴런, 특히 망막, 조직 (110)이며, 3차원 형상 및 뉴런 세포에 작용하는 영향에 반응하여 뉴런 조직 (110)의 세포에서의 전위를 변화시키는 뉴런 세포를 갖는 것인 뉴런 조직 (110); 및
    뉴런 조직 (110)의 뉴런 반응을 뉴런 세포에 의해 생성된 전위의 변화를 통해 측정하도록 구성된 판독 장치 (130)
    를 포함하는 측정 장치 (100).
  2. 제1항에 있어서,
    뉴런 세포는 광수용체 (120)이고;
    뉴런 세포에 작용하는 영향은 광수용체 (120)에 입사되는 광 (L)이고;
    뉴런 반응은 이미지 형성 능력, 특히 광-유도된 신호의 생성 및 그의 현장 프로세싱인
    측정 장치 (100).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴런 조직 (110)이 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 성장하는 것인 측정 장치 (100).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    전위의 변화가 뉴런 세포에 의해, 특히 망막 광수용체 (110)에 의해 개시된 뉴런 조직 (210)의 세포에서의 세포질 칼슘 이온 (212)의 농도의 변화에 의해 유발되고;
    뉴런 조직의 세포가 칼슘-민감성 형광 염료 또는 단백질 (214)을 포함하고;
    판독 장치 (230)가
    고속 형광 현미경검사에 의해, 특히 광시트 현미경검사에 의해, 뉴런 조직 (210)의 세포의 측정된 부분 내에서의 칼슘 민감성 형광 염료 또는 단백질 (214)의 분포를 측정하고,
    칼슘 민감성 형광 염료 또는 단백질 (214)의 측정된 분포로부터 세포의 측정된 부분 내에서의 세포질 칼슘 이온 (212)의 농도의 변화를 결정하고,
    세포질 칼슘 이온 (212)의 농도의 결정된 변화로부터 세포의 측정된 부분 내에서의 전위의 변화를 결정하도록
    구성되는 것인 측정 장치 (200).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    외부 영향 예컨대 물리적, 특히 기계적 및/또는 광학적, 및/또는 화학적 영향을 뉴런 조직 (310)에 가하도록 구성된 영향 수단 (340)을 추가로 포함하며; 여기서
    판독 장치 (330)는 영향 수단 (340)에 의해 가해진 영향에 대한 반응에서의 뉴런 조직의 뉴런 반응, 특히 망막 조직 (310)의 이미지 형성 능력을 측정하도록 구성되는 것인
    측정 장치 (300).
  6. 제5항에 있어서,
    영향 수단 (340)이 뉴런 조직 (310)의 형상을 결정하도록 구성되는 것인 측정 장치 (300).
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    영향 수단 (440)이 공지된 제어가능한 형태를 갖고;
    뉴런 조직 (410)이 뉴런 조직 (410) 및 영향 수단 (440)이 서로 기계적으로 상호작용하도록 영향 수단 (440)에 내장되고;
    뉴런 조직 (410)의 형상이 영향 수단 (440)에 대한 기계적 상호작용의 영향으로부터 또는 광학 기술을 통해 결정되는 것인
    측정 장치 (300).
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    뉴런 조직 (510)의 측정된 뉴런 반응 및/또는 결정된 형상을 뉴런 조직 (510)의 미리 결정된 뉴런 반응 및/또는 미리 결정된 형상과 비교하고, 비교에 기초하여, 제어 신호를 생성하고, 제어 신호를 영향 수단 (540)에 전송하도록 구성된 제어 유닛 (550)을 추가로 포함하고; 여기서
    영향 수단 (540)은 제어 신호에 기초하여 뉴런 조직 (510)에 물리적 및/또는 화학적 영향을 가하도록 구성되는 것인
    측정 장치 (500).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런 조직 (110)이 미리 결정된 초기 형상을 갖고/거나 단지 상이한 세포 유형의 미리 결정된 초기 혼합만을 포함하는 것인
    측정 장치 (100).
  10. 줄기 세포로부터 유사기관, 특히 뉴런 또는 망막, 세포를 발생시키는 단계;
    유사기관 세포를 제어가능한 기계적 특성을 갖는 환경 내에 내장시키는 단계;
    광학 기술을 사용하거나 또는 환경에 대한 유사기관 세포와 환경 사이의 기계적 상호작용의 영향으로부터 유사기관 세포의 형상을 측정하는 단계;
    유사기관 세포의 측정된 형상을 미리 결정된 형상과 비교하는 단계;
    측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 비교에 기초하여 측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 차이가 최소화되도록 환경의 기계적 특성을 조정함으로써 미리 결정된 영역에서의 조직 성장 및/또는 변형을 유도하는 단계; 및
    측정된 형상과 미리 결정된 형상 사이의 차이가 미리 결정된 역치 미만인 후 조직 성장 및/또는 변형을 종결시키는 단계
    를 포함하는, 줄기 세포로부터 유사기관, 특히 뉴런 또는 망막, 조직을 형성하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    유사기관 세포의 발생에서 단지 세포 유형의 미리 결정된 혼합만이 발생되는 것인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    뉴런 조직 (510)의 형상 및/또는 뉴런 반응을 추가로 적응시키기 위해 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 측정 장치 (500)에서 뉴런 조직 (510)으로서 유사기관 세포의 성장을 종결시킨 후에 수득한 유사기관 세포를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 뉴런 조직 (110)의 미리 결정된 초기 형상 및 상이한 세포 유형의 미리 결정된 초기 혼합이 각각 제10항 또는 제11항에 따른 방법에 의해 수득되는 것인 측정 장치 (100).
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 망막 조직 (810)을 포함하는 의안 (800).
  15. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 망막 조직 (910)을 포함하는, 입력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 전기-광학 소자 (900).
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