JP6633600B2 - 調整可能なニューロンネットワーク及び人工眼 - Google Patents

Description

本発明は、調整可能なニューロンネットワーク及び測定デバイス、そのようなニューロンネットワーク、特に幹細胞から成長させた網膜組織、特に人工多能性幹細胞から成長させた網膜組織を備える人工眼及び光学素子、並びに、調整可能なニューロンネットワーク、特に網膜組織を生成するための方法に関する。

網膜は視力にとって重要な役割を果たす。即ち、入射光子をニューロン信号に変換した後、ニューロンネットワークを用いてその信号を高度に並列化された方法で処理及びフィルタリングする。ヒトを含む多くの種にとって、網膜は、光受容体を含む五種類の異なる網膜ニューロンによって形成される。動物の網膜外植片での実験が、ネットワークパラメータ（ニューロンタイプ、ニューロン密度、ニューロンサイズ、シナプス結合強度）の関数として網膜信号処理の原理の知見を与えてはいるが、これらは種によって定量的に異なる。特に、ヒト組織については、主に組織外植片が利用可能ではないことや、合法的な遺伝学的研究が制限されていることに起因して、系統的には定量化されていない。

最近、ヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞に由来するオルガノイドが、そのｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）カウンターパートと比較しての細胞タイプや組織形態の類似性に起因して、広く注目を集めている。しかしながら、そのニューロンネットワークの機能性を試験することは未だ可能となっていない。同様に、網膜ニューロンネットワークよりも複雑な構造を有するニューロンネットワーク（脳等）の機能性を試験することも未だ可能となっていない。

（Ｉ）網膜ヒト組織や他のニューロン組織におけるニューロンネットワークの機能を測定するため、また、（ＩＩ）信号処理のための調整可能なニューロンネットワークを生成するためには、少なくとも以下の四つの主要な問題を解決する必要がある。

問題Ｉ：ヒト網膜組織の組成、ニューロン読み出し技術の利用可能性及びアクセス可能性

ヒト網膜全体における、更にはヒトの脳や脊髄におけるニューロン反応の測定は、実験のハードルが高く、行われていない。ニューロンネットワークの定量的な特性評価は、多数の個別ニューロンがどのように近接のニューロンと相互作用して機能的ニューロンネットワークを生成するのかを測定することを要求する。これは、単一のニューロン分解能（１０マイクロメートルの空間分解能）でネットワーク全体におけるニューロン反応（ｍｓの時間分解能）の測定を要求する。これら要求の組み合わせは最先端技術の性能も超えている。そこで、二つのモデルシステムが、網膜ニューロンネットワークを研究するのに用いられている。

一方では、網膜組織外植片（例えば、マウス網膜）を２次元層に平坦化して、電極アレイの上に取り付けて、ニューロン信号を測定する（非特許文献１）。最先端技術のデバイスは、数百のニューロンの同時読み出しを可能にする。

他方では、小さな脳の動物モデル、主にショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ及びシノラブディス・エレガンスを用いて、脳全体のニューロン反応が記録されている（非特許文献２、非特許文献３）。その理由は、これらはｉｎ ｔｏｔｏ（全体）でイメージング可能だからである。

動物の網膜及び網膜外植片での実験は、網膜機能の理解を得るのに役立ってきた。しかしながら、ニューロンネットワークの実際のパラメータは、種の生態学的地位及び行動反応に従って最適化されるものであるので、動物とヒトとで相違を示す。例えば、シナプス結合強度は、ドーパミンアマクリン細胞の分布によって制御される局所的ドーパミン濃度によって決定される（非特許文献４）。この分布は種によって異なり（非特許文献５）、動物モデルで得られたニューロンネットワークの知識をヒトに転用する際には細心の注意を払う必要がある。

従って、ヒトの網膜やヒトの脳で行われる信号処理を理解することは、同様のニューロンネットワークパラメータを有する組織での実験を必要とする。しかしながら、そのような組織は、生きているヒトにおいては容易にアクセス可能なものではなく、網膜外植片は容易に利用可能ではない。更に、そうしたネットワークを調査及び操作するためのツールとしての遺伝子組み換えは、法的規制により利用可能ではない。

そこで、特定の形態のニューロン組織、特にヒト網膜組織を用いる測定デバイス、及びそのような網膜組織をｉｎ ｖｉｔｒｏ（生体外）で形成するための方法が必要とされている。

問題ＩＩ：ニューロンネットワークの調整可能性

ヒト及び動物の網膜や他のニューロン組織は、最終的なニューロンネットワークのパラメータを決定する遺伝的プログラムに従って成長し、種の生態学的地位に従って最適化される。種のニューロンネットワークの再現可能性は、その維持可能性と相反する。これが、ネットワークパラメータ（ニューロンのタイプ、サイズ、密度及び結合強度）を変更することを技術的に極めて困難にしている。シナプス結合強度は光遺伝学的技術を用いて制御可能であるが（非特許文献６）、ニューロンのサイズ及び密度は特に制御が難しい。この限界が、網膜及び網膜外植片を用いて、高度な信号処理応用のためのカスタムニューロンネットワークの設計及び調査を妨げている。研究者の推定によると、３０個を超える異なる像処理フィルタが、異なるニューロンのタイプ及びサイズで与えられるマウスの網膜内で実現されている。こうしたパラメータを変更できれば、そのネットワークでのカスタム処理アルゴリズムを実現できる。

従って、網膜や脳等のニューロン組織内でのニューロンネットワークの制御可能な形成に対する理解を可能にする測定デバイスが必要とされている。更に、特定の所望の特性を発達させるようにニューロンネットワークを成長させることの調整を可能にするデバイス及び方法が必要とされている。

問題ＩＩＩ：オルガノイドの形状

近年、研究者は、オルガノイド、つまり、ｉｎ ｖｉｖｏカウンターパートと同じ細胞タイプ及び同様の組織形態を有する器官状構造体をペトリ皿内に成長させることに成功している。しかしながら、そうしたオルガノイドの全体的な形状はサンプル毎に実質的に異なる。最先端技術のプロトコルでも、オルガノイドの形状は、例えば鉗子を用いて切断することによって粗く調整されている（非特許文献７）。略１ミリメートルというその小さなサイズが、この方法を任意の形状を作り出すのに適さないものとしている。

器官の機能はその器官の形状に大きく依存するため（特に脳及び網膜の場合）、このことが、機能器官のｉｎ ｖｉｔｒｏでの制御された作製の妨げとなっている。

従って、オルガノイド組織を所定の形態で成長させることを可能にするデバイス及び方法が必要とされている。オルガノイドを任意の形態で成形する本発明の性能は、網膜オルガノイドに関して開発されたものであるが、脳オルガノイド等の他のオルガノイドにも使用可能である。

問題ＩＶ：ニューロン反応の３次元読み出し

網膜、網膜オルガノイド、及び他のニューロン組織は原理的には三次元構造体である。３次元において多数のニューロンのニューロン反応を測定することは技術的に困難である。従って、実験は、２次元の幾何学的形状に制限された網膜外植片を用いて行われるもの（非特許文献８）、又は、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ及びシノラブディス・エレガンス等の小さな脳の動物を用いて行われるもの（非特許文献２）のいずれかであった。ｍｍサイズの網膜や他のニューロン組織のニューロン信号の完全な３次元読み出しを細胞分解能で行うことは未だ可能となっていない。

従って、このような読み出しを可能にする測定デバイスを提供すること、また、このような測定デバイスにおいて必要とされる調整可能なニューロン（網膜）組織を生成するための方法を提供することが必要とされている。

国際公開第２０１５／１０９１４８号 中国特許出願公開第１０３４０９３６３号明細書 米国特許出願公開第２０１６／０３３３３１２号明細書 米国特許出願公開第２０１６／０１１６３９４号明細書 国際公開第２０１１／０３６０９４号

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本発明は、以下の指針に基づいて、上記問題への解決策を与える。

（ａ）ヒトのようなニューロン又は網膜組織を、ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から成長させることができる。ヒト人工多能性幹細胞から機能性光受容細胞を有する網膜オルガノイドの成長させることは成功可能である。ここで、網膜の発達中に特定の転写因子を加えることによって、系内のニューロンタイプを簡単に制御することができる。このことは、例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３に記載されており、これら文献はその全体が参照として本願に組み込まれる。

（ｂ）オルガノイドの形状を、制御された機械的特性を有する環境に発達中のオルガノイド（網膜オルガノイドや他のニューロンオルガノイド）を埋め込むことによって制御することができる。以前に報告されているように環境を局所的に軟化又は硬化させることによって（非特許文献１２）、網膜成長速度を局所的に上げることができる。粘度や応力緩和定数等の他の機械的特性のパターン化も可能である。例えば、レーザーアブレーション、３次元レーザー切断等の確立された方法を用いたり、光学的に調整可能な粘弾性ヒドロゲルを用いたりして、物質をパターン化することもできる。

任意のオルガノイド形状を生成するため、実際のオルガノイド形状を入力として用い、周囲物質の時空間機械的特性を出力パラメータとして用いるフィードバックループを実施することができる。

（ｃ）ニューロン反応の３次元読み出しを、カルシウム感受性色素／蛍光体を用いる最先端の蛍光顕微鏡法を用いることによって、三次元でニューロン又は網膜オルガノイド全体において行うことができる。一例は光シート顕微鏡法であり、これは確立された技術である。その技術は、ミリ秒取得速度（非特許文献１３、参照としてその全体が本願に組み込まれる）、及び、単一のニューロン分解能でのニューロン反応のイメージング（非特許文献１４、非特許文献１５、参照としてその全体が本願に組み込まれる）に最適化されたものであるので理想的である。市販のものでは３次元で十分高速なイメージングを行うことができないので、ニューロンオルガノイドのニューロン反応をイメージングするためには、カスタム光シート顕微鏡が必要とされる。

上記指針を用いて、従来技術に対する以下の利点を個別に又は組み合わせで達成することができる：

（１）ヒトのような組織を用いるので、モデルシステムは、ニューロン反応（例えば、光誘起信号）がヒトの仕組みに近い網膜組織等のニューロン組織においてどのように生成及び処理されるのかを研究することを可能にする。このようなオルガノイドは、従来技術で知られているヒト組織外植片と比較して顕著に優れた利用可能性及びアクセス可能性を有する。これに基づき、ヒトのニューロンネットワーク機能の系統的な研究を行うことができる。

（２）ニューロンオルガノイドは、例えば転写因子の制御された適用を用いて制御可能である細胞のタイプ、密度及び接続程度の変化によって、ニューロン回路の調整を可能にする。また、網膜オルガノイドについては、光遺伝学的手法を用いて、例えばシナプス結合強度を調整することもできる。

（３）限られた数の形状を有する従来技術で知られている網膜又はニューロンオルガノイド外植片や、形状が制御されずに成長するオルガノイドとは対照的に、任意の形状の網膜／オルガノイドを提供することができる。

（４）高速蛍光顕微鏡法、特に光シート顕微鏡法を用いるので、ニューロンオルガノイド／網膜組織全体のニューロン反応の三次元読み出しを行うことができる。

本発明の課題は、ネットワークの特性を更に研究するための測定デバイスにおいて実施可能な網膜等のニューロンネットワークのｉｎ ｖｉｔｒｏ（生体外）モデルシステムを提供することである。このため、幹細胞、例えばヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンオルガノイドを用いて所定の影響に対して感度を有する高度に調整可能なニューロンネットワークを提供することが必要とされている。更に、オルガノイドの形状を、例えば、オルガノイドに作用する外的影響の空間的及び／又は時間的制御によって、制御することが必要とされている。また、所定の影響に対するニューロンネットワークの反応を三次元で且つ高取得速度で検出することができる読み出しデバイスを提供する必要がある。

本発明の更なる課題は、医療診断及び治療の使用又は開発のための、並びに／又は、信号処理に使用可能な高度で生物学的にインスパイアされた電気光学素子の開発及び／又は製造のためにこのような測定デバイスを提供することである。

独立請求項の主題によって、上記利点が達成され、また、上記課題が解決される。

測定デバイスは、幹細胞から成長させた三次元形状のニューロン組織、特に網膜組織であって、ニューロン細胞を有し、ニューロン細胞に作用する影響に反応してニューロン組織の細胞内の電位を変化させるニューロン組織と、ニューロン細胞が発生させる電位の変化を介してニューロン組織のニューロン反応を測定するように構成されている読み出しデバイスとを備える。

このような測定デバイスは、上記利点を達成するために必要な二つの構成要素を含む。幹細胞から成長させた完全機能性のニューロン細胞、特に網膜細胞を、原理が知られている方法に従って、読み出しデバイスと共に用いて、組織全体にわたってニューロン組織のニューロン細胞の反応が発生させる電位の変化を求めることができる。これが、原理的には自由に設計可能な三次元ニューロン組織のニューロン反応の詳細な知見、つまり、ニューロン信号の出力をもたらす電気化学的プロセス（これに基づいて、ニューロン信号に基づく多様な活動を生物が行う）の知見を得ることを初めて可能とする。

ニューロン細胞は、網膜組織の光受容体であり得る。そして、ニューロン細胞、つまり光受容体に作用する影響は、光受容体に入射した光であり得る。そして、光受容体が発生させるニューロン反応は、結像性能、特に、光誘起信号の発生及びその現場処理であり得る。これは、そのプロセスに基づいて光学的現象の知覚が生物によって行われるプロセスの詳細な知見を得ることを可能にする。

例えば網膜組織を形成するニューロンネットワークは、ヒト人工多能性幹細胞から成長させたものであり得る。これは、眼や脳等のヒトのニューロンネットワークにおいて行われるニューロン信号の処理の知見を得ることを可能にし、新たなタイプの診断及び治療の開発につながり得る。更に、ニューロン組織は原理的にはあらゆる種類の幹細胞から成長可能ではあるが、人工多能性幹細胞の使用が、胚性幹細胞の使用を不要のものとする。

観測された電位の変化は、ニューロン組織の細胞内の細胞質カルシウムイオンの濃度の変化によって生じる。ニューロン信号は、ニューロン細胞、特に網膜光受容体によって引き起こされる。ニューロン組織の細胞はカルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質も備え得て、読み出しデバイスは、高速蛍光顕微鏡法、特に光シート顕微鏡法によって、ニューロン組織の細胞の測定された部分内のカルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質の分布を測定して、カルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質の測定された分布から、細胞の測定された部分内の細胞質カルシウムイオンの濃度の変化を決定し、細胞質カルシウムイオンの決定された濃度の変化から、細胞の測定された部分内の電位の変化を決定するように構成され得る。

電位の読み出しに高速蛍光顕微鏡法、例えば光シート顕微鏡法の手法を用いることによって、ニューロン組織全体からデータを抽出するための確実な方法を提供することができる。実際には、カルシウム感受性蛍光色素をニューロン組織の細胞内に導入すると、カルシウムイオンに結合する蛍光色素を追跡することによって、細胞質カルシウムイオンの移動を追跡することができる。読み出しは光シート顕微鏡法による既知の方法で行われ、一方向のみに集束させた、つまり「光シート」に集束させたレーザービームで網膜組織全体を走査して蛍光色素の蛍光発光を励起することができる。この蛍光発光は、光シートの平面に垂直に配置された光学デバイス（顕微鏡、光電子増倍管、光増幅器及び／又はカメラ等）によって読み出し可能である。この方法は、電気化学的反応、つまりカルシウムイオンの濃度の変化によって、ニューロン組織全体にわたって、又は、少なくとも細胞の特定の関心領域、例えば網膜組織の光受容細胞、ガングリオン細胞、及び／又は接続ニューロン（アマクリン細胞、水平細胞、及び双極細胞）において、ミリ秒分解能で、ニューロン組織で行われている像処理を読み出すことを可能にする。従って、例えば、網膜の結像性能、つまり、網膜を介する光吸収（光受容細胞）から視神経への信号伝達（ガングリオン細胞）に至るまでの信号の伝達及び処理を、高空間及び時間分解能で測定することを可能にする。

ヒトのような組織におけるこのプロセスについての知識を、治療の開発に用いることができる。例えば、ニューロン組織によって形成されるニューロンネットワークの動作を、薬物、例えば神経伝達物質の活性剤及び抑止剤の関数として直接測定することができる。更に、網膜組織を用いることによって、先進的なオンサイト（現場）像フィルタリング及び処理デバイスを設計及び実現するのにそのシステムを用いることができる。

測定デバイスは、外的影響、つまり、物理的、特に機械的及び／又は光学的及び／又は化学的影響をニューロン組織に及ぼすように構成されている影響手段を更に備え得る。読み出しデバイスは、影響手段が及ぼす影響に反応したニューロン組織のニューロン反応、特に、網膜組織の結像性能を測定するように構成され得る。これは、測定デバイスによる専用の実験を行うことを可能にする。例えば、影響手段は、原理的に知られている光学システムとして設計され得て、所定の強度、波長及び時間／空間パターンの光を網膜組織上に投影することを可能にする。そして、読み出しデバイスによって測定された信号の依存性、つまりは入射光に対する網膜組織の結像性能を詳細に分析することができる。しかしながら、影響手段は、網膜組織、又は脳組織等の他のニューロン組織に機械力を及ぼして、機械力に反応した各種ニューロン組織の性能の変化を分析することもできる。追加的に又は代替的に、薬剤等の特定の化学物質をニューロン組織に与えた後にニューロン組織の性能を分析することによって、化学的影響を測定することもできる。

このような実験を行うことによって、実験的に制御可能な影響下における眼、特にヒトの眼、又は脳や脊髄等の他のニューロンオルガノイドの発達の知見をｉｎ ｖｉｔｒｏで得ることができる。これは、通常ｉｎ ｖｉｖｏでは各種オルガノイドを他の望ましくない影響と混ぜずに適用することができない特定の条件にニューロン組織を晒すことができるという特別な利点を有する。これは、多様な影響の効果の分離及び分類を可能にし、今度はこれを診断ツール及び治療の開発に用いることができる。また、遺伝子編集法をｉｎ ｖｉｔｒｏでシステムに適用可能である。これは、遺伝子欠陥が網膜機能等のオルガノイド機能にどのように影響するかを理解することを可能にし、病気に対処するための遺伝的及び化学的手法を見つけるのに役立つ。

影響手段は、ニューロン組織の形状を決定するようにも構成され得る。これは、例えば、ニューロン組織の光学的監視によって行われ得る。他の例によると、これは、ニューロン組織と、影響手段の一部を形成する周囲環境又は物質（固体物質、液体、マトリクス状構造体等）との機械的相互作用を監視することによって行われ得る。

ここで、測定デバイスを用いて、ニューロン組織のニューロン反応(網膜組織の結像性能)を観測する可能性に加えて、ニューロン組織の形状を観測することも想定可能である。これは、外的影響に反応したニューロン組織の形状の変化を、必要であれば対応するニューロンネットワーク性能の変化と共に観測することもできるという利点を有する。これを用いて、網膜等のニューロン組織の成長と外的影響、特に網膜上の光との間の相互関係を更に調査することができる。

実際には、網膜組織を形成するニューロンネットワークの結合が網膜に対する外的影響（光等）に依存しているだけではなく、網膜組織の成形もこのような影響に依存し得る。例えば、網膜への光の入射で発生するドーパミン等の神経伝達物質の存在は、特定の領域における網膜の成長も誘発させるので、近視の発症に影響を有し得る。そこで、実験的に制御された外的影響と網膜組織の成形との間の関係を観測することが、新たなタイプの医療診断及び治療の開発にとって重要な眼及び眼病の発達プロセスのより深い理解につながり得る。

そして、影響手段は既知の制御可能な形態を有し得て、ニューロン組織及び影響手段が互いに機械的に相互作用するようにニューロン組織を影響手段内に埋め込み得て、ニューロン組織の形状を、影響手段に対する機械的相互作用の影響から、又は光学的方法によって決定し得る。このため、ニューロン組織と、影響手段の一部を形成する周囲環境又は物質（高粘度液体又はマトリクス等）との間の機械的相互作用を監視し得る。

例えば、ニューロン組織を取り囲む影響手段の物理的状態（例えば、圧力分布等）の変化を、原理的に知られている方法によって測定することができるが、そのような方法は、例えば組織自体に影響したり組織を破壊したりさえもし得るものであるので、ニューロン組織に直接適用可能ではないものであり得る。測定された機械的相互作用から、既知のアルゴリズムを適用することによって、ニューロン組織の形状を再計算することができる。例えば、影響手段の圧力分布及び／又はその変動は、ニューロン組織が少なくとも部分的にこの圧力分布を生じさせるものであるので、ニューロン組織の形状の知見を与えることができる。そして、圧力分布全体からニューロン組織が生じさせる圧力をフィルタリングすることで、ニューロン組織の形状の知見が与えられる。

緑内障等の主な眼病は、網膜に作用する物理的入力（機械的応力等）によって生じる。本発明に係る測定デバイスを用いて、例えば、外的応力を変化させながら網膜の機能を測定することができる。これは、網膜疾患に対する物理的影響をより良く理解して、可能な治療を発見するための扉を開く。

影響手段の形態は、所定のものであり得て、また、例えば、三次元浮遊培養であり得る。ニューロン組織を取り囲む物質を局所的に軟化又は硬化させることによって、網膜組織に対する機械的相互作用又は影響を変化させることができる。これは、既知の方法、例えば、レーザーアブレーション等の確立された方法で物質をパターン化することによって、又は、特許文献４（その全体が参照として組み込まれる）に与えられている軟質物質の機械的特性を変化させるのに適した方法及び物質を用いることによって行われ得る。そして、既知の初期又は中間形状に対するニューロン組織の形状の変化を観測することができ、これは測定結果を改善する。

測定デバイスは、測定されたニューロン反応及び／又はニューロン組織の決定された形状を所定のニューロン反応及び／又は網膜組織の所定の形状と比較し、その比較に基づいて制御信号を発生させ、制御信号を影響手段に送信するように構成されている制御ユニットを更に備え得る。そして、影響手段は、制御信号に基づいてニューロン組織に物理的及び／又は化学的影響を及ぼすように構成される。制御ユニットを用いることで、測定デバイスを用いて、ニューロン組織を所定の形状又は所定のニューロン反応にするための制御ループを設定することができる。このため、制御ユニットは、機械学習法を用いて、どの外的影響がニューロン組織の実際の形態／形状及び／又はニューロン反応／性能と所望の値との間の差を減らすのかを制御ユニットに認識させることができる。そして、多様な外的影響を試すことによって、制御ユニットが、所望の結果をもたらす影響を決定し得る。代替的に又は追加的に、制御ユニットは、所定の組の外的影響、例えば、光の強度、波長及び／又はパターン、又は、調整可能な機械的特性を有する周囲環境が及ぼす機械力のみを調整するように構成され得る。

このような制御ループを用いることで、ニューロン反応の形状及び形態等の所定の特性を有するニューロン組織の生成性能を研究することができる。そして、網膜組織についてのこのような制御ループを用いることによって、ヒトのものと同様又は同一の特性を有する人工眼を研究及び／又は生成することができる。また、光の特定の波長及び／又は強度に適合させた特別な形態の網膜組織を設計して、光を電気信号に変換する光学素子の構成要素とすることができる。また、網膜疾患を有する患者からの人工多能性幹細胞を用いて網膜オルガノイドを成長させて、患者の網膜ニューロンネットワークの機能性を測定しながら疾患をｉｎ ｖｉｔｒｏでモデル化することができる。そして、制御ループを用いて、生理機能を回復させることができる条件を見つけることができる。

測定デバイス内のニューロン組織は、所定の初期形状を有し得て、及び／又は、異なる細胞種の所定の初期混合物のみを備え得て、特に、網膜組織は、網膜光受容体の所定の混合物のみを備え得る。これは、既知の初期特性を有するニューロン組織を研究することを可能にし、初期条件が正確に固定可能であるので、ニューロン組織に対する影響をより良く理解するのに役立つ。例えば、幹細胞からの網膜の発達中に適切な転写因子を用いることによって、単一種の光受容細胞のみを有する網膜組織を生成することができる。このような条件はヒトの網膜では生じないので、例えば、単一種の光受容細胞に対する外的影響を分析することができる。

網膜形状を制御して幹細胞からオルガノイド組織、特にニューロン組織又は網膜組織を形成するための方法は、幹細胞からオルガノイド細胞、特にニューロン細胞又は網膜細胞を発達させるステップと、制御可能な機械的特性を有する環境にオルガノイド細胞を埋め込むステップと、光学的方法を用いて、又は、オルガノイド細胞と環境との間の機械的相互作用がその環境に与える影響から、オルガノイド細胞の形状を測定するステップと、オルガノイド細胞の測定された形状を所定の形状と比較するステップと、測定された形状と所定の形状との間の比較に基づいて、測定された形状と所定の形状との間の差を最小にするように、環境の機械的特性を調整することによって、所定の領域における組織の成長及び／又は変形を誘起するステップと、測定された形状と所定の形状との間の差が所定の閾値未満になった後に組織の成長及び／又は変形を終了するステップとを備える。

上記説明と同様に、オルガノイド組織、特にニューロン組織又は網膜組織は、そのオルガノイド組織が制御可能な機械的特性を有する環境、例えば特許文献４に記載されている物質内に投入される場合に、所定の制御可能な形態を有して生成可能である。このような物質をオルガノイド細胞の基質として用い、また、成長しているオルガノイド細胞の形状に対する制御ループを用いることによって、所定の形状を有するオルガノイド組織を発生させることができる。本方法は、網膜オルガノイドへの適用に限定されるものではなく、例えば、脳オルガノイド、肺オルガノイド、腸オルガノイドにも適用可能である。

オルガノイド細胞種の発達において、細胞種の所定の混合物のみを発達させ得る。上述のように、これは、例えば、幹細胞が網膜細胞に変換している間に特定の転写因子を用いることによって達成可能である。そして、形状に加えて、ニューロン組織の細胞混合物も制御可能である。

本測定デバイスにおいて、ニューロン組織の所定の初期形状、及び異なる細胞種の所定の初期混合物を上述の方法によって得ることができる。

上述の測定デバイスにおいて、オルガノイド細胞の成長の終了後にニューロン組織として得られたニューロンオルガノイド細胞を用いて、ニューロンオルガノイドを形成することができ、ニューロン組織の形状及び／又はニューロン反応に更に適合させる。これは、ニューロン組織の所望の特性を得ることができるようにニューロン細胞のニューロンネットワークの形状又は相互接続の適合を行うことによって、ニューロン組織の形状及び／又はニューロン反応を微調整することを可能にする。

人工眼は、上述の方法のうち一つに従って形成された網膜組織を備え得る。同様に、入力光を電気信号に変換するための電気光学素子は、上述の方法に従って形成された網膜組織を備え得る。そして、上記方法及び測定デバイスは、医療用の人工眼、及び信号処理用の電気光学素子を製造するのに使用可能であり、又は、少なくともそのようなデバイスをどのようにして製造するかについての理解を改善するのに使用可能である。

以下、添付図面に基づいて本発明を詳細に説明する。

一実施形態に係る測定デバイスの概略図である。 一実施形態に係る測定デバイスの概略図である。 一実施形態に係る測定デバイスの概略図である。 一実施形態に係る影響手段の概略図である。 一実施形態に係る測定デバイスの概略図である。 一実施形態に係る網膜組織を形成するための方法のプロセスフローの概略図である。 一実施形態に係る網膜組織を形成するための方法のプロセスフローの概略図である。 一実施形態に係る人工眼の概略図である。 一実施形態に係る光学素子の概略図である。

以下の説明では、光受容体に入射した光に反応して網膜組織の細胞中の電位を変化させる光受容体を備える網膜組織について言及する。電位は、網膜組織の結像性能を決定するために読み出される。

しかしながら、網膜組織への言及は、単に説明を簡単にするものであって、限定的なものではない。網膜組織の代わりに、幹細胞から成長可能なあらゆるニューロン組織が使用可能である。

更に、このようなニューロン組織に作用する影響は、その影響に反応して細胞内の電位を変化させるニューロン組織内のニューロン細胞に対する効果を有する。ここで、「変化」は、その影響（光が入射する光受容体の信号等）が直接的に生じさせる電位の直接的で短期間の変動だけではなく、その影響が生じさせるニューロン組織のニューロンネットワークの相互接続（化学物質及び／又は薬物の影響下又は機械的な影響下で形成された相互接続等）が生じさせる電位の変動も含む。

従って、網膜組織の結像性能が電位の変化から決定可能であるだけではなく、より一般的には、こうした電位の変化によって構成されるニューロン反応を、その影響が生じさせる。以下で説明される結像性能の読み出しは、当業者によって他のニューロン組織の性能に容易に一般化可能である特定の一例に過ぎない。

従って、以下の詳細な説明は網膜組織に関するものであるが、本発明は、任意のニューロン組織の特性（例えば、ニューロン組織の形状やニューロン反応）の監視及び／又は調整にもより一般的に適用可能である。

図１は測定デバイス１００の概略図を示す。測定デバイス１００は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ網膜組織１１０と、読み出しデバイス１３０とを備える。

網膜組織１１０は、任意の三次元形態を有し、その網膜組織が光Ｌを受けてその光を電気信号に変換することができるようにする網膜細胞を備える。網膜組織１１０は、完全機能性の網膜光受容体１２０、つまり光受容細胞を備え、それに光Ｌが入射する。入射光Ｌに反応して、網膜光受容体１２０は、網膜組織１１０の細胞内、つまり網膜組織１１０内の電位を変化させる。特に、網膜光受容体１２０は、その内部の細胞質カルシウムイオンの濃度を調整することによって、入射光Ｌに反応し、細胞膜にわたって電位を変化させる。この電位の変化は、光受容体１２０から送信された初期電気信号に対応し、つまり、受信した電磁放射で像を再構築することを可能にする網膜組織１１０が行う信号処理の第一段階に寄与する。光受容体１２０が発生させた初期電気信号は、更に、カルシウム信号伝達を介して、網膜組織１１０の他の細胞層、つまり接続ニューロン（双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞）及びガングリオン細胞に送信され、信号は視神経にわたって脳に伝達される準備が整うまで更に処理及びフィルタリングされる。しかしながら、網膜組織１１０がｉｎ ｖｉｖｏではなくてｉｎ ｖｉｔｒｏで提供されるので、視神経による読み出しは行われない。後述のように、網膜組織１１０内、つまり網膜組織１１０の細胞内で変化する電位によって構成される信号は、読み出しデバイス１３０によって読み出される。

網膜組織１１０は幹細胞から成長させたものである。測定デバイス１００はあらゆる生物のあらゆる種類の網膜組織１１０で動作するものではあるが、好ましくは、網膜組織はヒト人工多能性幹細胞から成長させたものであり、生きているヒトから網膜細胞を取り出したり、胚性幹細胞を用いたりする必要なく、ヒト網膜組織１１０の分析を可能にする。網膜組織１１０は、例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献２、特許文献３（これら文献はその全体が参照として本願に組み込まれる）に記載されているような確立された技術に従って、人工多能性幹細胞から生成可能である。

ここで、簡潔に言うと、幹細胞は二次元培養で維持されていて、凝集体を形成するために三次元浮遊培養に移される。次いで、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）タンパク質及びラミニンタンパク質の組み合わせを用いて分化経路を有効にすることによって、神経上皮への分化を誘起する。網膜分化因子の追加で、網膜前駆体への分化と、その後続の自己組織化とを生じさせて、光学的なカップ状構造体を形成する。次いで、網膜細胞の成熟が、完全機能性の網膜光受容体１２０の発達をもたらす。これは一例であり、他のプロトコルも可能である。

このプロセスでは、特定の転写因子を用いることによって、測定デバイス１００によって行うことが望まれる測定に応じて、複数の細胞種、特に光受容細胞種の混合物を調整することができる。例えば、棹体光受容細胞及び錐体光受容細胞の密度が、デバイスのスペクトル反応を決定する（カラー色覚・対・グレイスケール）。ヒトの場合、網膜の中央が、より高い密度の錐体を有し、カラー色覚を可能にする一方で、網膜周辺部は主に棹体光受容細胞で構成される。この組み合わせが、中央のカラー色覚と、周辺部におけるグレイスケールでの高い信号対雑音比とを可能にする。桿体光受容細胞対錐体光受容細胞の比、つまりは本発明の測定デバイスのスペクトル反応は、オルガノイド発達の特定の段階において分子シグナル用の阻害剤を適用することによって、調整可能である。

一例は、オルガノイド発達の特定の時点におけるノッチ（Ｎｏｔｃｈ）阻害剤の適用である。

アマクリン細胞及びガングリオン細胞のサイズ及び密度は、ニューロンネットワーク内で実現される空間フィルタリングプロセスに対する長さスケールを決定する。例えば、より大きなアマクリン細胞は、更に分離した光受容体からの出力信号を処理することができ、より大きな空間特徴を処理することを可能にする。一例は、網膜上に投影された大きくて低速で移動する像からのニューロン信号の抑制である。従って、細胞のサイズ及び密度を調整することで、実現されるフィルタの調整を可能にする。

幹細胞から網膜細胞を成長させるための確立された方法に加えて、後述の方法を用いても、複数の細胞の所定の混合物を有することができるだけではなく、純粋な自己組織化によって得られる形状とは異なり得る所定の形状も有することができる網膜組織１１０を得ることができる。つまり、測定デバイス１００は、組織形状に依存している網膜組織１１０の特性を分析することも可能にする。

光受容体への光Ｌの入射後に網膜組織１１０に発生して及び／又は網膜組織１１０中を伝播する電気信号、つまり、その電気信号を構成する網膜組織内の電位の変化は、読み出しデバイス１３０によって測定される。電位の変化が最終的には脳に形成される像を決定するので、読み出しデバイス１３０は、電位を測定することによって、網膜組織１１０の結像性能を測定する。実際には、網膜組織１１０の結像性能は多数の因子に依存する。光受容体１２０の種の組成や、網膜組織１１０の形態や形状に加えて、結像性能は、網膜組織の細胞によって形成されるニューロンネットワークの相互接続にも大きく依存する。

例えば、ヒトの眼は、広範な光照射条件に適合可能であり、その網膜は個々の光子を検出することすらできる。このような低い光レベルに適合するため、空間分解能の低下という犠牲を伴うが隣接する光受容細胞の信号を組み合わせることによって、網膜内の「画素サイズ」を増大させる。ここで、ビニングが網膜によって行われている。これを実現するため、隣接する光受容細胞を、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質の濃度によって決定される結合強度を有するギャップ結合を介して結合する。ここで、ヒトの眼のニューロンネットワークの相互接続は、多様なレベルの光照射に対して結像性能を適合させることを可能にしている。

従って、読み出しデバイスで電位の変化を測定することによって、結像性能についての情報を得ることができ、今度はこれを用いて、網膜組織１１０のニューロンネットワーク、更には、その網膜細胞の特定の分類の依存性、組織の形状、網膜組織１１０に外部から作用する影響をより良く理解することができる。

従って、測定デバイス１００は、得ることができなかったような網膜組織１１０の機能、特にヒト人工多能性幹細胞から得られたヒト網膜組織１１０への新たな知見を与え、新たな診断応用及び治療応用を開発及び／又は適用することを可能にする。特に、本デバイスを用いて、近視等の多くの眼病に影響を及ぼす神経伝達物質の濃度や光照射の反応関数を測定することができる。

読み出しデバイス１３０は、原理的には、任意の方法で、例えば、高感度電極による直接的な電位の測定によって、網膜組織１１０内の電位についての情報を得ることができる。しかしながら、図２に関して詳細に説明するように、読み出しデバイス２３０は、高速蛍光顕微鏡法、例えば、光シート顕微鏡法やレーザー走査２光子顕微鏡法を用いることによっても電位を測定することができる。

図２は、上述のような網膜組織２１０と、光シート顕微鏡法を行うように構成された読み出しデバイス２３０とを備える測定デバイス２００を示す。このため、読み出しデバイス２３０は、光源２３２と受光体２３４とを備える。光源２３２は、例えばシリンドリカルレンズ等によって、一方向のみに集束させた光Ｓを放出するように構成されていて、光Ｓはそれぞれ所定の、好ましくは調整可能な強度及び波長を有する。光源２３２は、例えば、放出光を一方向においてのみ集束させて、「光シート」又は光平面Ｓを形成するレーザー光源であり得る。図２において、光平面Ｓは上面図で示されており、つまり、光平面は図２の投影平面外に伸びている。左右への光Ｓの広がりは図２において無視可能なものとして示されているが、光シートは、上から見た場合に「蝶ネクタイ形状」も有し得て、その蝶ネクタイのネックが、光シート顕微鏡法にとっての関心領域に位置する。

光シート顕微鏡法にとって重要なのは、分析される対象が、その対象を通る（仮想的な）二次元断面にわたって、光源２３２によって関心領域内で照らされることである。従って、測定デバイス２００は、読み出しデバイス２３０の光源２３２から放出された光Ｓが網膜組織２１０を通る二次元平面内において網膜組織２１０の細胞の一部を横切るように構成される。この細胞の一部が、細胞の観測又は測定される部分を構成する。

測定デバイス２００において、一つ以上のカルシウム感受性蛍光色素２１４が網膜組織２１０に導入される。代わりに、遺伝的にエンコードされたカルシウム感受性指示剤が使用可能である（ＧＣａＭＰ）。色素又は蛍光タンパク質２１４は、例えばカルシウムイオンに結合することによって、網膜組織２１０の細胞のカルシウムイオン２１２の移動に従うことができる。カルシウム感受性色素の例は、Ｆｌｕｏ‐４（サーモフィッシャー社）やＲｈｏｄ‐２（サーモフィッシャー社）であり、遺伝的にエンコードされたカルシウム指示剤の例はＧＣａＭＰ５である。

光源２３２から放出された光Ｓの波長は、カルシウム感受性蛍光色素２１４の蛍光発光を励起するように設定される。そこで、光Ｓが網膜組織２１０を横切ると、蛍光Ｆが、色素２１４によって放出される。網膜組織２１０と光Ｓとの二次元交差平面内の蛍光Ｆの強度分布から、カルシウムイオンの分布を決定することができる。カルシウムイオンの分布の変化は、電位の変化をもたらすので、蛍光Ｆの強度分布の観測により検出可能である。

このため、読み出しデバイスは受光体２３４を備える。受光体２３４は、その検出方向が網膜組織２１０と光Ｓとの交差によって形成される平面に垂直になるように配置され、受光体２３４がその平面を観測するように構成されることを保証する。例えば、受光体２３４は、その光路が光シートＳに実質的に垂直である光学顕微鏡、光電子増倍管、光増幅器、及び／又はカメラシステム（ＣＣＤカメラ等）、並びに、放出された蛍光を検出するのに必要な光学部品を含み得る。受光体２３４の焦点は、光シートＳの平面上に設定され得る。また、焦点を、光シートＳに近接する層に調整可能に設定することもでき、例えば、光シートに垂直な方向において、光シートから５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、５００μｍ、又はそれ以上で離隔し得る。これは、システムの構成要素を移動させずに、光シート周囲の網膜組織２１０を通る断面も分析することを可能にする。代わりに、フェムト秒パルスレーザーを備えたカスタム構成の高速レーザー走査顕微鏡が使用可能である。

次いで、カルシウム感受性蛍光色素２１４の分布についての受信情報は、受光体から測定デバイス２００の処理ユニット（図示せず）に転送される。そこで、この情報から、光シートＳの周囲に位置する網膜組織２１０の細胞の電位の変化が決定される。処理ユニットは、測定デバイス２００の他の構成要素の近くに必ずしも位置しなくてよいことに留意されたい。処理ユニットは、受光体２３４から得られたデータが送信されるコンピュータやサーバであってもよい。

網膜組織２１０を移動させること、又は、光源２３２及び受光体２３４を移動させることのいずれかによって、完全な網膜組織２１０が、二次元スライスで走査可能である。ここで、その相対的な移動は、直線的なものであり得て、また、回転も含み得るものである。得られた二次元スライスから、網膜組織の完全な像を得ることができる。しかしながら、網膜組織の特定の領域、例えば、網膜組織２１０の光入射側（光Ｌ）に位置する光受容体の層や、網膜組織２１０の反対側に位置するガングリオン細胞の層や、それらの間の接続ニューロン細胞に焦点を合わせることも可能である。イメージング目的の場合、網膜オルガノイドは、ペトリ皿に固定され、培地及び／又はポリマーゲル（栄養素が透過できるメチルセルロースやアガロース等）に包埋される。十分な量の栄養素を提供しながら他の軟質物質に固定することもできる。

従って、光シート顕微鏡法を用いると、網膜組織２１０全体における細胞質カルシウムイオン濃度の変化によって生じる電気信号の伝播による網膜の像処理を可視化することができる。光シート顕微鏡法の時間的分解能、空間的分解能は、例えば、略１００フレーム／秒（８０から１２０フレーム／秒）、１マイクロメートル（０．８から１．２マイクロメートル）であり、網膜組織２１０のニューロンネットワークを介する信号伝播、つまりは網膜組織２１０の結像性能を研究することができる。これは、医薬やニューロン信号処理の分野において有用な新たな知見をもたらす。

ここで、網膜組織２１０全体にわたる蛍光Ｆの励起及び読み出しを可能にするためには、網膜組織の細胞が励起光Ｓ及び蛍光Ｆに対して十分透過性でなければならないことは明らかである。しかしながら、この条件は、使用される網膜組織、励起波長及び蛍光波長については満たされている。

図２は光シート顕微鏡法の概略図を単に例示するものであり、本発明は、図２に関して説明される光シート顕微鏡法の方法及びシステムに限定されるものではない。実際には、速度及び分解能の要求を満たす他のあらゆる顕微鏡法が使用可能である。特に、網膜細胞における電位の変動を検出することができるあらゆる顕微鏡法が使用可能である。例えば、そうした方法は、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、及び／又は特許文献５（これら文献はその全体が参照として本願に組み込まれる）に記載されており、また、そのバリエーションも使用可能である。

図３は、上述のものにそれぞれ対応する網膜組織３１０及び読み出しデバイス３３０の隣に、影響手段３４０を備える測定デバイス３００を概略的に示す。影響手段３４０は、網膜組織３１０に結合されて、外的影響、つまり網膜組織３１０において生じるものではない影響を、制御可能に網膜組織３１０に与えることができる。また、読み出しデバイス３３０は、図１及び図２に関して上述したような網膜組織３１０内の電位の変化を測定して、そこから、外的影響に依存した結像性能の変化を決定することができる。

従って、測定デバイス３００は、特定の外的影響下において網膜組織３１０及びその結像性能を試験するための専用の実験を設定することを可能にする。例えば、ドーパミン濃度と相関しているニューロン信号の空間的ビニングを、測定デバイス３００によって分析することができる。実際には、局所的なドーパミン活性化は、例えば、網膜組織３１０上の時空的光パターンに影響されるものであり、ニューロン信号の処理及び眼の発達において主要な役割を果たすものと考えられる。このような実験は、網膜組織の構造及び動作のより深い理解をもたらし、また、新たな診断手段及び／又は治療手段の開発及び／又は使用において用いられ得る。例えば、測定デバイス３００によって、光照射パターンが、例えばヒトの網膜組織の分子的因子を単一細胞レベルでどのように制御するのかを定量的に特性評価することができる。ヒトのような組織での用量反応曲線（例えば、光‐神経伝達物質濃度）が分かれば、特定の薬物設計が可能となる。

外的影響は、物理的又は化学的な影響であり得る。特に、影響手段３４０は、原理的に知られている方法で、網膜組織の全体又は一部を、特定のパターン、波長及び／又は強度を有する光で照射することができる光学装置で構成され得る。これは、特定の実験的に制御可能な光条件に対する網膜組織３１０の反応を分析することを可能にする。従って、例えば、特定の光条件に反応した網膜組織３１０内のニューロン接続の形成を分析することができる。これは、照射光パターンと結像性能の低下との間の相互関係が想定されている多様な眼病の発症への知見を与えることができる。光学装置は、例えば、合成レンズシステム、特にそのように構成された広角レンズシステムを含み得て、任意の光パターン、特に任意の時空的光パターンを網膜組織３１０上に投影することを可能にする。

また、影響手段３４０は、光学的影響以外の他の電磁的影響を網膜組織３１０に及ぼすこともできる。例えば、電場及び／又は磁場や、可視光スペクトル外の電磁放射の影響が分析可能である。

代替的に又は追加的に、影響手段３４０は、網膜組織に化学的影響を与えることができる。例えば、影響手段３４０は、薬剤及び／又は医薬物質等の化学成分を網膜組織３１０に与えて、そうした化学成分に対する網膜組織３１０のニューロンネットワークの反応及びその結像性能を研究することを可能にする。これは、生きている生物を傷つけずに網膜組織の医療試験をｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことを可能にし、また、ｉｎ ｖｉｖｏでも存在し得る多様な化学成分と網膜組織との相互作用をより良く理解し、目の発達及び機能化をより良く理解することを可能にする。

影響手段３４０は、追加的に又は代替的に、網膜組織３１０に機械力を及ぼすようにも構成可能である。例えば、影響手段３４０は、網膜組織３１０に多様な圧力値を及ぼすことを可能にする三次元構造体であり得る。このような圧力を及ぼす単純な手段は、例えば、網膜組織３１０に対して押される固定非フレキシブル機械部品、例えば、ピンやニードル等である。網膜組織３１０は、図４に示されるような、特定の所定の領域において網膜組織３１０を押すが他の領域には圧力がかかっていない環境にも置かれ得る。これは、特定の所定の機械的相互作用の影響下における結像性能と、網膜組織３１０内のニューロンネットワークの形成とを測定することを可能にし、また、眼の発達及び緑内障等の機械的に誘発される眼病のより深い理解にも寄与する。

ここで、影響手段３４０は、網膜組織３１０の形状が影響手段３４０によって測定可能になるように構成され得る。例えば、光学的又は電磁的影響を用いて、光学的又は電磁的手段により網膜組織３１０の形状を決定することができる。例えば、影響手段３４０は、網膜組織３１０によって反射又は透過される光を検出することによって、網膜組織のサイズ及び形状を測定することができる。例えば、周知技術の構造化光スキャナを用いること（これは網膜組織３１０の結像性能の反応を試験するのに用いられるパターンによって直接実施可能でもある）で、三次元形態を決定することができる。代わりに、このような網膜組織３１０の形状の光学的な検出を、読み出しデバイス３３０によって行うこともできる。

追加的に又は代替的に、影響手段３４０は、影響手段３４０に対する網膜組織３１０の機械的逆反応によって網膜組織３１０の形状を検出することができる。実際には、影響手段３４０から網膜組織３１０に及ぶ圧力は、網膜組織３１０から影響手段３４０にも及ぶ。そこで、網膜組織３１０の形態の変化は、網膜組織３１０と影響手段３４０との間の機械的相互作用も変化させている。この影響手段３４０に対する機械的相互作用の変化の効果を測定して、網膜組織３１０の形態の変化を導出することができる。例えば、ニードルやピンによって網膜組織に圧力を及ぼす場合、ニードルやピンの位置や形態の変化は、網膜組織３１０の形態の実際の変化よりも検出が簡単であり得る。

また、網膜組織３１０を、機械的特性、例えば環境内の応力分布等が監視可能である環境に埋め込むこともできる。空間及び時間の関数としての物質の形状は、その歪み場によって表され、物質に作用している時空間応力場によって、更に、その応力に対する物質の反応によって決定される。応力及び機械的特性の両方の量が分かっている場合には、物質の変形を計算することができる。従って、既知の弾性率及び既知の応力分布を有する物質中にオルガノイドを埋め込むことで、その系の力学（力、応力）が外的環境によって支配されている限界におけるその形状を決定することができる。代わりに、蛍光顕微鏡法や明視野顕微鏡法等の光学的方法を用いて、形状を３次元で直接イメージングすることができる。

従って、機械的相互作用を用いることによって、一方では網膜組織の形状に影響を与えることができ、他方では結果としての変化を直ちに測定することができる。図４に概略的に示されるように、機械的特性（例えば、弾性率及び／又は粘度及び／又は応力緩和定数等）が制御可能である環境（例えば、固体、液体、マトリクス、相変化物質等）を構成する影響手段４４０に網膜組織４１０を埋め込むことができる。例えば、環境は、特許文献４（参照として本願に組み込まれる）に記載されているような強磁性流体の液滴が与えられた軟質物質であり得る。しかしながら、環境の形態は、原理的には固定可能でもあり、時間と共に不可逆的に変化可能であったりパターン化可能であったりもする。例えば、固定された初期形態の固体やマトリクス（その中に網膜組織４１０が埋め込まれる）の局所的な機械的特性は、レーザーアブレーションによって、又は、紫外線パルスレーザー及び／又は赤外線フェムト秒パルスレーザーを用いた切断によって、変更可能である。更に、影響手段４４０を構成する環境の局所的な軟化又は硬化を、例えば非特許文献１２（参照として本願に組み込まれる）のようにして行うことができる。

機械的特性を局所的に調整するための他の確立された方法も使用可能である。その例は、光学的又は化学的方法を用いて架橋が調整可能なポリマーゲルである。例えば、市販のＰＥＧヒドロゲルの硬さは、ゲルを架橋させる紫外線を用いて制御可能である。このようにして、ゲルの弾性率を、略１００から１０ｋＰａで局所的に増加させることができる。ポリマーゲルの弾性率を制御する他の方法は、感熱性架橋と組み合わせたゲルの局所的な加熱によって、そのメッシュのネットワーク強度を制御することである。このようにして、ゲルの弾性率を略１ｋＰａから１０ｋＰａで局所的に変更することができる。他の方法は、紫外線照射で開裂する光分解性架橋を用いることである。弾性率をその初期値の１０％に低下させることを、略５％の精度で制御可能に行うことができる。

影響手段４４０を構成する環境の機械的特性の変化は、網膜組織４１０の異なる部分が異なる機械的環境の影響を受けるという状況をもたらし得る。これが図４に概略的に示されていて、網膜組織４１０の上部及び下部が硬質の固体の影響手段４４０に接触している一方で、その左右の部分が影響手段の液体成分と接触しているものとして示されている。しかしながら、これは例示的な模式図であって、影響手段４４０の隣接する部分に対してそれぞれ同じ距離を有する網膜組織４１０の部分には異なる機械的相互作用も存在し得ることに留意されたい。

網膜組織４１０は、その形態を変化させると、周囲環境又は影響手段４４０との機械的相互作用を必然的に変化させる。上述のように、機械的相互作用の変化は、影響手段４４０に影響して、影響手段４４０の物理的特性、例えば、その形態、その内部応力分布や、影響手段４４０の他の機械的パラメータが変化する。そして、この変化が検出されて、そこから、網膜組織４１０の形状が決定される。このステップに必要な処理は、影響手段４４０の内部又は外部にあるあらゆるプロセッサによって実行可能である。

例えば、図４では、網膜組織４１０の上部及び下部領域において強力な機械的相互作用が観測される。ここで、この領域の隣の影響手段４４０の圧力は高く、測定可能な変形や物理的特性（影響手段の屈折率等）の変化をもたらし得る。物質内の局所的な応力を測定するため、特許文献４に提示されているような油滴が使用可能である。また、物質の局所的な応力は、例えば、蛍光ビーズを埋め込むことによって３次元牽引力顕微鏡法を用いても測定可能である。

他方、影響手段４４０の機械的特性を制御して、その形態、又は少なくとも網膜組織４１０との機械的相互作用を変化させることも可能である。そこで、制御可能な機械的特性を有する適切な環境に網膜組織４１０を埋め込むことで、網膜組織４１０の形状を決定すること、及び、網膜組織４１０に機械的影響を及ぼすことの両方を可能にする。実際には、図４において、影響手段４４０の形態が、左右（網膜に作用する弾性応力が比較的小さい、網膜と液体の界面）への網膜組織の成長及び移動を簡単にし、上下（これら領域では弾性応力が組織移動に反して作用する、網膜と固体の界面）への成長を抑制する。このようにして、影響手段４４０が及ぼす外的機械力は、網膜組織４１０を事実上あらゆる所望の三次元形状にすることができる。

図５に示されるように、測定デバイス５００は、上述のデバイスに対応する網膜組織５１０と読み出しデバイス５３０と影響手段５４０とに加えて、制御ユニット５５０も備える。制御ユニット５５０は、読み出しデバイス５３０及び影響手段５４０と通信するように構成される。制御ユニット５５０は、下記の機能を行うのに適したコンピュータ、サーバ、又は他のプロセッサによって実現され得て、測定デバイス５００の他の構成要素の近傍又は遠隔に配置され得る。更に、制御ユニット５５０は、測定デバイス５００の他の構成要素の他の処理要素と組み合わせ可能でもある。例えば、測定デバイス５００の全ての処理機能を単一のプロセッサ等によって行い得る。

測定デバイス５００が得た全ての測定結果、つまり、少なくとも網膜組織５１０の電位及び／又は網膜組織５１０の形状の結果は、制御ユニット５５０によって受け取られる。制御ユニット５５０は、得られた測定結果を所定の値と比較して、制御信号を発生させ、その制御信号は、影響手段５４０に送られて、影響手段５４０が、制御ユニット５５０に設定又は記憶された所定の値により近い測定結果を後で得るのに適した影響を網膜組織５１０に及ぼすようにする。そこで、制御ユニット５５０は、網膜組織の測定された特性をそうした特性についての所定の設定された値に適合させるのに用いられる制御ループを閉ループにする。

例えば、制御ユニット５５０には、所定の結像性能、例えば、特定のスペクトル領域における特定の光感度、及び／又は、ニューロンネットワークの特定の機能及び性能が送られ得る。次いで、読み出された結像性能が、読み出しデバイス５３０から制御ユニット５５０に送られて、制御ユニット５５０によって所定の結像性能と比較される。比較結果は、例えば、所定のスペクトル領域における光感度が特定のパーセンテージ、例えば２０％で低過ぎるというものである。次いで、制御ユニット５５０は、制御信号を影響手段５４０に送り、測定された結像性能と所定の結像性能を互いに近づける、つまり、測定された結像性能と所定の結像性能との間の差を最小にする影響を発生させる。上記例では、制御信号は、例えば、所望の波長を有する光のみを与えることによって、又は他の適切な手段によって所望の波長領域における光感度の上昇をもたらす影響を発生させ得る。測定された結像性能と所定の結像性能との間の差が所定の閾値未満になった後に、その影響の発生を終了する。上記例では、閾値は、例えば１％、５％、１０％等の所望の光感度と得られた光感度との間の差であり得る。

同様に、影響手段５４０又は読み出しデバイス５３０によって測定デバイス５００内で測定された網膜組織の形状を、制御ユニット５５０用の入力パラメータとして用いることができる。次いで、制御ユニット５５０は制御信号を生成し、その制御信号は、影響手段５４０が網膜組織５１０に及ぼす影響を変化させるようにして、網膜組織５１０の形状が制御ユニット５５０に記録された又は送られた網膜組織５１０の所定の形状に近くなるようにする。

例えば、図４において上部領域の網膜組織の成長を望む場合、制御ユニット５５０は影響手段４４０に指示して、その機械的特性を変化させ、網膜組織４１０と影響手段４４０との間の機械的相互作用がその上部領域において小さくなるようにするが、これは、例えば、この領域において影響手段をより軟らかくすることによって、又は、網膜組織４１０と影響手段４４０との間の距離が長くなるようにその形態を変化させることによって行われる。次いで、この領域における成長が可能となる。対照的に、影響手段４４０のギャップを左右方向において狭くすることによって、この領域における網膜組織４１０の成長が追加的に抑制される。

ここで、制御ユニットを用いて、網膜組織５１０の形態を所望、所定の形態に近づけることもできる。例えば、網膜組織の形状が所望の形状に十分近い場合、例えば、差が網膜組織の全体的なサイズの僅か数パーセント（１％、５％、１０％等）である場合、網膜組織を発生させる方法を終了する。

制御ユニット５５０は、機械学習法を用いて、結像性能や網膜形状等の測定された値と所定の値との間の差を減少させるための適切なパラメータを得るようにも構成され得る。このため、制御ユニット５５０は、網膜組織５１０に対する多様な影響と、対応する網膜組織５１０の変化を試験し得る。それらの結果から、制御ユニット５５０は、公知の機械学習法によって、差を最小にするために、どの影響を及ぼさなければならないのかを推定することができる。このようにして、所望の特性を有する網膜組織５１０が得られるだけではなく、そうした特性の形成とその発達に必要な影響との間の相互関係、例えば、網膜形状と網膜結像性能との間の相互関係を理解することもできる。そして、この知見を、眼病用の新たな薬剤や治療の開発に用いることができる。

図１から図５に関して説明したように、本発明に係る測定デバイスは、ヒト人工多能性幹細胞から成長させた網膜組織をｉｎ ｖｉｔｒｏで深いレベルで分析することを可能にし、更に、特定の、所望の特性の形成をもたらすことができる特定の制御された影響を網膜組織に与えることによって、網膜組織の特性を変更することができる。

ここで、網膜組織の特性に影響を与える方法は、上述のような測定デバイスにおいて既に実現されている網膜組織に対して使用可能であるだけでなく、幹細胞からの網膜組織、他のオルガノイド、又はニューロン組織の初期成長においても使用可能である。網膜組織に関連する対応方法の例示的なプロセスフローを図６に概略的に示す。これは、例えば脳、肺、又は腸オルガノイド等の他のオルガノイドやニューロン組織を形成するための方法の使用を制限するものではないことを理解されたい。以下の網膜細胞についての言及は、各種オルガノイド細胞への言及に置き換え得る。

Ｓ６１０では、十分に確立された方法（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献２、特許文献３）に従って、幹細胞から網膜細胞を発達させる。

Ｓ６２０では、得られた網膜細胞を制御可能な機械的特性を有する環境に埋め込み、Ｓ６３０では、網膜細胞と環境との間の機械的相互作用がその環境に与える影響から、又は他のイメージング法、例えば光学的イメージング法からのいずれかによって、網膜細胞の形状を測定する。ここで、環境の特性と、形状の測定が行われる方法が、図４及び図５に関して上述した網膜組織と影響手段との間の相互作用に対応する。

Ｓ６４０では、例えば図５に関して説明した制御ユニットによって、網膜細胞の測定された形状を所定の形状と比較する。

Ｓ６５０では、測定された形状と所定の形状との間の比較に基づいて、例えば測定された形状と所定の形状との間の差を最小にするように、環境の機械的特性を調整することによって、所定の領域における網膜細胞の成長及び／又は網膜組織の変形を誘起する。これは、図４及び図５に関して上述したように網膜細胞を取り囲む環境の機械的特性を変化させることによって行われる。

Ｓ６６０では、測定された形状と所定の形状との間の差が所定の閾値未満になった時に、網膜細胞の成長及び／又は網膜組織の変形を終了する。ここで、網膜組織の形状が所望の形状に十分近い場合、例えば、差が網膜組織の全体的なサイズの僅か数パーセント（１％、５％、１０％等）である場合に、網膜組織を発生させる方法を終了する。

このようにして、既に所定の形態を有している網膜組織、例えば、上述のような測定デバイス用のものを生成することができる。更に、幹細胞からの網膜細胞の発達中に、網膜細胞、特に網膜光受容体の種や混合物を所望の種や混合物に選択することによって、所定の形状を有するだけではなく、所定の結像性能も有する網膜組織を発達させることもできる。このような網膜組織は、その網膜組織の初期特性を明確に定めることができ、外的影響に対する網膜組織の反応を簡単に検出することができるので、実験を行うための理想的な出発点を与える。

図６に関して説明される方法に従って初期網膜組織を準備した後、この網膜組織を、図１から図５に関して説明したような測定デバイスにおいて用いることができる。図７にプロセスフローが概略的に示されている網膜組織を生成するための方法によると、上述のような測定デバイスにおいてその方法を実施することによって、網膜組織の特性を更に調整することができ、制御ループを用いて特性を更に調整する。

そこで、Ｓ７１０では、外的影響を網膜組織に及ぼし、Ｓ７２０では、結像性能及び／又は網膜組織の形状等の網膜組織の特性を、図３から図５に関して説明したようにして測定する。Ｓ７３０では、測定された特性を所定の特性、つまり、所定の形状及び／又は所定の結像性能と比較する。その比較に基づいて、制御信号を発生させる。

Ｓ７４０では、制御信号に基づいて、外的影響を変化させて、図５に関して上述したように、測定された値と所定の値との間の差を最小にする。Ｓ７５０では、測定された特性と所望の特性との間の差が許容可能である場合に、つまり、差が所定の閾値未満である場合に、プロセスを終了する。

このように、上記方法によって、所望の特性を有する網膜組織を発達させることができる。更に、網膜組織を得るためのプロセスは、例えば機械学習法を用いることができる制御ユニットで行われる場合には、更なる知見を与えることができる。

図８は、上述の方法のうち一つに従って得られた又は発達させた網膜組織８１０を備える人工眼８００を概略的に示す。ここで、「網膜組織」は、上述のような測定デバイスによって精査された網膜組織のニューロンネットワークへの知見に従って設計された電子的ニューロンネットワークも備える。網膜組織８１０は水晶体８０２を備える眼体８０１内に配置され、水晶体８０２を介して光を受けて、その光をニューロン信号に変換し、次いで、ニューロン信号は視神経８０３を介して脳に送られる。網膜組織８１０と同様に、人工眼の他の全ての構成要素は、純粋に生物学的な組織である必要はなく、電子的構成要素、無機構成要素、プラスチック物質、及び／又は有機構成要素の組み合わせであり得る。

ここで、幹細胞から成長させた、又は、網膜組織の研究によって得られたニューロンネットワークの知見に従って設計された網膜組織８１０を、人工眼に用いて、最終的には盲人を目が見えるようにし得る。

同様に、図９に概略的に示されるように、網膜組織９１０は、素子本体９０１と入射窓９０２とデータ線９０３とを備える電気光学素子９００の一部となり得る。電気光学素子９００は、入射窓９０２を通して入射した光信号を網膜組織９１０によって電気信号に変換し、その電気信号がデータ線９０３を介して送られて読み出される。この場合も、「網膜組織」との用語は、上記方法のうち一つによって幹細胞から成長させた生物学的な網膜細胞、又は、そのような組織に従って設計された電子的ニューロンネットワークのいずれかを指称する。

ここで、幹細胞から成長させた網膜組織９１０、又はそこから得られた知見を、信号処理用の素子においても用いることができ、ヒトの眼の原理に従って動作する光検出器を構成することができる。

１００ 測定デバイス
１１０ ニューロン組織
１２０ 光受容体
１３０ 読み出しデバイス

Claims (14)

1. 幹細胞から成長させた三次元形状の網膜組織であるニューロン組織であって、ニューロン細胞を有し、前記ニューロン細胞に作用する影響に反応して該ニューロン組織の細胞内の電位を変化させるニューロン組織と、
   前記ニューロン細胞が発生させた電位の変化を介して前記ニューロン組織のニューロン反応を測定するように構成されている読み出しデバイスと、
   外的影響を前記ニューロン組織に及ぼすように構成された影響手段とを備え、
   前記読み出しデバイスが、前記影響手段が及ぼす影響に反応した前記ニューロン組織のニューロン反応を測定するように構成されている、測定デバイス。
2. 前記ニューロン細胞が光受容体であり、
   前記ニューロン細胞に作用する影響が前記光受容体に入射する光であり、
   前記ニューロン反応が結像性能である、請求項１に記載の測定デバイス。
3. 前記結像性能が光誘起信号の発生及び現場処理である、請求項２に記載の測定デバイス。
4. 前記ニューロン組織がヒト人工多能性幹細胞から成長させたものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の測定デバイス。
5. 前記電位の変化が、前記ニューロン細胞によって引き起こされる前記ニューロン組織の細胞内の細胞質カルシウムイオンの濃度の変化によって生じ、
   前記ニューロン組織の細胞がカルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質を備え、
   前記読み出しデバイスが、
   高速蛍光顕微鏡法によって、前記ニューロン組織の細胞の測定された部分内のカルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質の分布を測定し、
   前記カルシウム感受性蛍光色素又はタンパク質の測定された分布から、前記細胞の測定された部分内の細胞質カルシウムイオンの濃度の変化を決定し、
   前記細胞質カルシウムイオンの決定された濃度の変化から、前記細胞の測定された部分内の電位の変化を決定するように構成されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の測定デバイス。
6. 前記電位の変化が、網膜光受容体によって引き起こされる前記ニューロン組織の細胞内の細胞質カルシウムイオンの濃度の変化によって生じる、請求項５に記載の測定デバイス。
7. 前記高速蛍光顕微鏡法が光シート顕微鏡法である、請求項５又は６に記載の測定デバイス。
8. 前記外的影響が物理的影響及び／又は化学的影響である、請求項１から７のいずれか一項に記載の測定デバイス。
9. 前記物理的影響が機械的影響及び／又は光学的影響である、請求項８に記載の測定デバイス。
10. 前記読み出しデバイスが、前記影響手段が及ぼす影響に反応した網膜組織の結像性能を測定するように構成されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の測定デバイス。
11. 前記影響手段が前記ニューロン組織の形状を決定するように構成されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の測定デバイス。
12. 前記影響手段が既知の制御可能な形態を有し、
    前記ニューロン組織及び前記影響手段が互いに機械的に相互作用するように、前記ニューロン組織が前記影響手段内に埋め込まれ、
    前記ニューロン組織の形状が、前記影響手段に対する機械的相互作用の影響から、又は光学的方法によって決定される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の測定デバイス。
13. 測定されたニューロン反応及び／又はニューロン組織の決定された形状を所定のニューロン反応及び／又はニューロン組織の所定の形状と比較して、比較に基づき制御信号を発生させ、前記制御信号を前記影響手段に送信するように構成されている制御ユニットを更に備え、
    前記影響手段が、前記制御信号に基づいて、前記ニューロン組織に物理的及び／又は化学的な影響を及ぼすように構成されている、請求項１１又は１２に記載の測定デバイス。
14. 前記ニューロン組織が所定の初期形状を有し、及び／又は、異なる細胞種の所定の初期混合物のみを備える、請求項１から１３のいずれか一項に記載の測定デバイス。

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