KR20180066779A - 난청 치료용 복합 주사 제제 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는 약물 방출 조절형 제형으로서, 상기 가교된 히알루론산은 표적 부위에서 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산이 가교되어 히드로겔을 형성하는 것인 약물 방출 조절형 제형, 및 IGF-1과 스테로이드성 항-항염증제를 활성 성분으로 포함하고, 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는, 난청 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

Description

난청 치료용 복합 주사 제제 및 그의 제조 방법{Injectable combination drug for treating hearing loss and method of preparing the same}
본 발명은 난청 치료용 복합 주사 제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 IGF-1(Insulin-Like Growth Factor-1) 및 덱사메타손의 복합 주사 제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
난청은 청력이 부분적으로 또는 완전히 소실되는 증상을 의미하며, 다양한 원인에 의해 발생한다. 난청은 유병률이 매우 높아서, 소수 환자들에 국한된 문제가 아니라 사회적 문제로 대두되고 있다. 18,650명을 대상으로 실시된 2012년 국민건강영상조사사업에 따르면, 12세 이상 대한민국 국민의 22.7%가 난청을 앓고 있는 것으로 나타났다(Jun HJ, Laryngoscope 2014). 난청은 특히, 노년 인구에서 중요한 사회적 문제로서, 70세 이상 국민의 66.1%가 난청을 앓고 있는 것으로 나타났다. 인구 노령화가 가속화되고 있는 점을 고려하면, 향후 난청 인구가 더욱 증가할 것으로 예상된다.
난청은 원인에 따라, 노인성 난청, 이독성 난청, 돌발성 난청 및 메니에르병과 같은 내이질환에 의한 난청, 소음성 난청 등으로 분류된다.
지금까지 가장 표준적인 난청 치료 방법은 전신적 경구 스테로이드 투여이다. 그러나, 건강한 난청 환자들에게 전신적인 스테로이드 투여를 시행한 결과, 33.0%에서 한 가지 이상의 전신 부작용이 발생했고, 약 1%에서 고관절 골절, 독성 간염, 사망 등과 같은 심각한 부작용이 발생한 것으로 보고되었다(Min KH and Suh MW, Kor J Audiol 2012).
한편, 시스플라틴에 의한 항암 치료를 받는 환자에서 이독성 난청의 발생률은 평균 62%로 보고되었고(Marshak T, Otolaryngol Head Neck Surg 2014), 전신성 스테로이드 난청 치료시 항암 치료 효과가 저하된다는 보고도 있다(Herr I, Cancer Res 2003; Rybak LP, Tohoku Journal of Experimental Medicine 2009).
최근에는 전신적 고용량 스테로이드 투여 외에, 고실내 스테로이드 주입술이 돌발성 난청의 치료를 위해 이용되고 있다. 고막을 통해 고실 내에 스테로이드를 주입하고, 주입된 스테로이드가 고실과 내이 사이에 위치한 정원창을 통해 확산될 것을 기대하나, 고실 내로 주입된 약물은 이관을 통해 수 십 분 내에 배출되기 때문에 실제로 약물이 내이로 전달되는 시간은 24시간 보다 짧아서, 충분한 치료 효과를 달성하지 못하고 있다. 따라서, 전신적 스테로이드 투여에 따른 부작용을 감소시키고, 난청의 치료를 위해 충분한 시간 동안 고실내에서 약물을 전달할 수 있는 난청 치료 제제가 요구되고 있다. 본 발명자들은 효과적인 난청 치료를 위해 고실내로 직접 투여되어 충분한 시간 동안 약물을 전달하고 작용할 수 있는 복합 주사 제제를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태는 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는 약물 방출 조절형 제형으로서, 상기 가교된 히알루론산은 표적 부위에서 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산이 가교되어 히드로겔을 형성하는 것인 약물 방출 조절형 제형을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 IGF-1 및 스테로이드성 항-염증제를 활성 성분으로 포함하고, 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는, 난청 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 약학적 조성물을 개체의 고실 내에 투여하는 단계를 포함하는 난청을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산을 제조하는 단계; IGF-1을 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산 각각과 혼합하는 단계; 미소구체를 제조하는 단계; 및 상기 미소구체에 스테로이드성 항-항염증제를 캡슐화시키는 단계를 포함하는 방법.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약물 방출 조절"은 표적 부위에서 최적의 치료 농도를 유지하면서 약물이 재현성 있게 방출되도록 약물 전달체로부터 약물의 방출 및 전달 속도를 조절하는 것을 의미한다. 약물의 체내 잔류 시간을 증가시켜 약물의 투여 빈도를 감소시키는 방법이나, 체내에서 약물을 서서히 방출시키는 서방성 또는 지연형 방출 방법, 용해도가 낮은 약물을 친수성 고분자에 결합시켜 약물의 생체 이용률을 높이는 방법 등이 약물 방출 조절을 위해 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가교된 히알루론산"은 히알루론산 자체 또는 히알루론산과 고분자의 가교 형성을 통해 구조적 안정성이 증가된 물질을 의미한다. 가교된 히알루론산은 생체 적합성이 우수하고, 생체 내에서 분해되는 생분해성을 갖는다. 가교된 히알루론산은 일반적으로 히알루론산과 가교제를 수용액 중에서 교반 혼합하고, 히알루론산 고분자 사슬을 가교제에 의해 화학적으로 결합시키는 것에 의해 제조된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 약물"은 원하는 활성을 갖는 약물을 의미하며, 약물 제형이나 전달체를 통해 전달되는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미소구체"는 직경이 수 마이크로미터 미만인 구형의 미립자로서, 생체적합성 및 생분해성이 우수하여 약물 전달체로 이용되는 입자를 의미한다. 약물 전달체로서 이용되는 미소구체는 주로 PLGA(poly-lactide-co-glycolide), 또는 PCL (polycaprolactone)을 포함하는 고분자 물질, 셀룰로오스 유도체, 인지질 또는 이들의 조합으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "히드로겔"은 수성 환경에서 가교된 히알루론산에 의해 형성된 망상 구조를 갖는 겔을 의미한다. 히드로겔은 화학적 결합이나 정전기적인 힘에 의해 상호작용하는 분자들에 의해 친수성 가교 결합된 중합체를 형성하고 건조중량의 수 백 배 범위의 양으로 물을 흡수할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "속방출성"은 약물이 투여 후 즉시 용해되어 초기 효과가 빠르게 나타나도록 방출되는 특성을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서방출성"은 약물이 서서히, 지속적으로 방출되어 장시간 동안 유효 혈중 농도를 유지할 수 있게 하는 특성을 의미하며, 지속 방출형 또는 지연 방출형이라고도 한다.
본 발명의 일 양태는 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는 약물 방출 조절형 제형을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가교된 히알루론산은 표적 부위에서 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산이 가교되어 히드로겔을 형성하는 것일 수 있다. 상기 표적 부위는 개체의 특정 기관, 관, 기관 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어 귀 (구체적으로 중이 또는 고실 내)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산은 각각 히알루론산 디아미노부탄(HA-diaminobutane) 및 히알루론산 숙신이미드(HA-succinimide)일 수 있고, 서로 교차된 것으로서 제1 히알루론산이 히알루론산 숙신이미드, 및 제2 히알루론산이 히알루론산 디아미노부탄일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가교된 히알루론산은 1:250 내지 1:1,000의 가교도를 가질 수 있다. 용어 '가교도'는 히알루론산 분자들 사이에 공유결합이 형성된 정도를 의미하는 것으로서, 공유결합이 많이 형성된 것일수록 높은 가교도를 가지는 것으로 해석될 수 있다. 즉 예를 들어, 가교도가 1:250일 경우 히알루론산 한 분자당 250개의 공유결합을 갖는 것을 의미하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 가교도는 1:500 내지 1:1,000일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 히알루론산은 분자량이 100,000 내지 5,000,000일 수 있다. 바람직하게는 약 1,000,000일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제형은 활성 약물을 표적 부위에서 소정의 기간 동안 방출할 수 있게 한다. 상기 제형은 활성 약물을 1 내지 5일 또는 7일과 같은 단기, 또는 7일 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 4개월 이상, 6개월 이상, 6개월 내지 12개월, 또는 12개월 이상의 장기간 동안 방출할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방출 기간은 히알루론산의 가교도 정도에 따라 조절할 수 있다. 상기 표적 부위는 개체의 특정 기관을 의미하는 것으로, 눈, 코, 귀, 심장, 심실, 심방, 장관 내, 혈관, 또는 관절 등 제한되지 않는다. 일 구체예에서 상기 표적 부위는 귀일 수 있고, 상기 귀는 중이, 내이, 달팽이관, 전정기관, 유스타키오관 또는 고실을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 활성 약물은 스테로이드성 항-염증제(steroidal anti-inflammatory drug), 항생제, 항산화제, 항염증제, 호르몬, 성장인자 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스테로이드성 항-염증제는 스테로이드 모핵을 가지고 항염증 역할을 하는 제제를 의미하는 것으로서 예를 들어, 덱사메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 히드로코르티손 또는 이들의 조합과 같은 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 IGF-1을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 활성 약물은 스테로이드성 항-염증제 또는 IGF-1일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 IGF-1과 스테로이드성 항-염증제를 활성 성분으로 포함하고, 가교된 히알루론산을 전달체로 포함하는, 난청 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
난청의 표준 치료는 스테로이드를 전신에 투여하는 방법이다. 그러나 환자의 20% 정도는 전혀 청력의 개선을 나타내지 않고, 30% 정도는 청력의 회복 정도가 불충분한 것으로 확인되었다. 스테로이드 전신 투여가 효과를 보이지 않는 난청 환자를 대상으로 내이의 청각에 관여하는 세포를 보호하는 작용을 하는 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Grwoth Factor-1, IGF-1)을 투여한 결과 청각의 개선이 확인되었다는 보고가 있다(Yamamoto N, et al., Front Pharmacol 2014;5:208).
한편, 경구 스테로이드의 복용에 따른 부작용이 있으며, 이러한 부작용을 줄이기 위해 고실 내에 스테로이드를 주입하는 고실내 스테로이드 주입법(intratympatnic steroid or dexamethasone injection, IT-DEXA)이 이용되고 있다. 이 방법에 따르면, 정원창막을 통해 약물를 확산시켜 내이에 도달하게 하며, 상기 스테로이드로서 주로 덱사메타손이나 메틸프레드니솔론을 고실천자 후 주사기를 통해 직접 주입하거나, 수술을 통해 약물을 함유한 고형물질을 정원창막 근처에 설치한다.
난청의 치료 효과가 알려진 스테로이드성 항-항염증제 (예를 들어, 덱사메타손)와 IGF-1은 상이한 기전에 의해 작용하므로, 스테로이드성 항-항염증제는 투여 후 서서히 지속적으로 방출시키고, 반면에, IGF-1은 투여 직후에 효과를 발휘하도록 속방성으로 방출시키는 것에 의해 난청의 치료 효과를 상승적으로 개선할 수 있었다. 스테로이드성 항-항염증제로서 덱사메타손을 사용한 경우, 덱사메타손의 고실내 투여나 IGF-1의 고실내 투여 각각에 의해 수득되는 치료 효과의 합보다 본 발명의 조성물에 의한 투여는 상승적으로 개선된 효과를 가져왔다. 이는 IGF-1의 속방성 방출과 스테로이드성 항-항염증제의 서방성 방출의 상승적 작용에서 기인되는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 투여 후, IGF-1은 가교된 히알루론산에 의해 형성된 히드로겔에 분산되고, 스테로이드성 항-항염증제는 미소구체 내에 캡슐화된 상태로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미소구체는 생체적합성 중합체로 제조될 수 있다.
미소구체를 제조하기 위해 이용될 수 있는 생체적합성 중합체는 히알루론산, 도는 그의 염, 레시틴, 플루로닉(pluronic), 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머, 키토산, 콜라겐, 피브린, 폴리에스테르, 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드) 또는 이들의 공중합체 PLGA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미소구체는 폴리락타이드-co-글리콜라이드(PLGA, poly(lactic-co-glycolic acid))로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미소구체는 분자량이 33,000 g/mol인 PLGA를 에틸 아세테이트에 3 중량%로 용해시키고, 약물로써 스테로이드성 항-염증제로서 지용성 덱사메타손을 미량의 다이메틸설폭사이드(DMSO, dimethyl sulfoxide)를 사용하여 1 중량%로 용해시켜 고분자와 약물의 균일 분산체 용액을 제조하고, 상기 제조된 고분자 및 약물 용액을 주사기에 넣은 후, 4 mL/min의 유속으로 단일축 초음파 분사기에 흘려주며, 0.5 중량% 폴리비닐알코올(PVA) 수용액을 준비하고, 제조된 고분자 및 약물 분산용액을 60 Hz의 진동주파로 분사하여 상기 폴리비닐알코올 수용액에 분산시켜 과립을 형성시키고, 2시간 동안 실온에서 300 rpm으로 교반하여 안정화시킨 후, 생성된 과립을 분리하여 증류수로 세척하고 동결 건조하여, 덱사메타손 약물이 봉입된 고분자 과립을 수득하는 것에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 고실 내로 주사될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 고실 내에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 히알루론산은 고실 내로 투여된 후 가교되어 겔을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가교된 히알루론산은 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산을 각각 고실 내로 주사한 후 체내에서 가교되어 겔을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 히드로겔은 미소구체를 약물 전달체로서 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 고실 내로 주사된 후, IGF-1은 속방출성으로 방출되고, 스테로이드성 항-염증제는 서방출성으로 방출될 수 있다.
덱사메타손이 함유된 미소구체의 벽은 생분해성을 갖는 고분자인 PLGA로 제조되어 시간에 따라 물에 의해 가수분해가 일어나면서 벽의 일부가 깨지거나 분해되고 이를 통해서 미소구체로부터 덱사메타손의 서방출이 일어난다. (Byung Soo Kim, Biomaterials 2009).
본 발명의 약학적 조성물에서 스테로이드성 항-염증제는 미소구체에 캡슐화된 상태로 존재하고, IGF-1은 히알루론산에 의해 형성된 히드로겔에 분산된 상태로 존재하여, IGF-1은 투여된 후 속방출성으로 방출되고, 스테로이드성 항-염증제는 서방출성으로 방출될 수 있다. 약학적 조성물에 포함된 IGF-1과 스테로이드성 항-염증제는 상이한 방출 속도로 상이한 기간 동안 방출될 수 있으며, 방출 속도 및 기간은 미소구체의 크기 및 히알루론산의 가교도의 조절에 의해 결정될 수 있다. 또한, IGF-1 및 스테로이드성 항-염증제의 비율은 치료 대상 환자의 상태, 난청의 종류 및 중증도에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡수율, 독성 감소, 방출 기간 및 속도를 조절하기 위함과 같은 특정한 목적에 따라, 유효 치료량의 활성 성분, 즉, IGF-1 및 스테로이드성 항-항염증제 외에, 약제학적으로 허용가능한 염, 담체 또는 비히클, 완충제, 부형제, 부가제 등의 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 상기 '약제학적으로 허용가능한 염'은 '약학적으로 허용가능한 담체'와 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 활성 성분의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 활성 성분의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 난청의 발생 전이나 후, 또는 난청의 발병 중에 투여될 수 있다. 투여량은 투여법, 치료 기간, 치료 환자의 상태, 난청의 중증도에 따라 달라질 수 있고, 주치의에 의해 결정된다. 치료 기간은 약 1시간 내지 수일, 수주 또는 수개월의 범위일 수 있고, 필요에 따라 장기간 진행될 수 있다. 전달되는 유효 치료량은 시간당 약 0.1 ng 내지 약 100 ㎍의 범위또는 약 100 ㎍ 내지 약 1 mg 범위일 수 있다.
유효 치료량은 치료 개체에서 난청을 개선 또는 감소시키데 유효한 양으로 정의된다. 유효 치료량은 대상 개체의 난청의 중증도, 투여되는 약물, 및 투여 방법에 따라 달라질 수 있다.
치료 기간도 치료 대상 개체의 난청의 형태나 중증도에 따라 달라질 수 있다.
난청은 원인에 따라, 노인성 난청, 항암제, 해열제, 진통제, 항생제 등에 의해 발생하는 이독성 난청, 산업 소음, 총기 소음, 폭발 소음 등에 의해 발생하는 소음성 난청, 메니에르병, 돌발성 난청과 같은 내이 질환에 따른 난청, 외림프누공, 미로진탕, 및 측두골골절과 같은 외상성 난청 등이 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 난청은 소음성 난청, 이독성 난청, 내이 질환에 따른 난청, 및 외상성 난청으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
시스플라틴에 의한 항암 치료를 받는 환자에서 이독성 난청의 발생 비율은 평균 62%인 것으로 보고되었다 (Marshak T, Otolaryngol Head Neck Surg 2014). 또한, 항암 치료가 스테로이드에 의한 전신 치료와 병행되는 경우, 항암 치료 효과가 낮아진다는 보고가 있다 (Herr I, Cancer Res 2003; Rybak LP, Tohoku Journal of Experimental Medicine 2009). 따라서, 항암 치료 전에 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 항암제에 의한 이독성 난청의 발생을 예방하고, 난청 치료에 의한 항암 치료 효과의 감소를 방지하거나 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 상기 약학적 조성물을 개체의 고실 내에 투여하는 단계를 포함하는 난청을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
난청의 치료를 위해 내이에 전달되는 약물은 경구, 정맥내 또는 근내 경로를 통해 전신 투여되어 왔다. 그러나 내이에 국부적인 병리를 위해 전신 투여하면, 전신 독성 및 불리한 부작용 가능성이 증가하고, 혈청에서 높은 수준의 약물이 발견되고 내이에서는 상응하게 낮은 수준이 관찰되는 비-생산적인 약물 분포를 나타낸다. 난청의 치료를 위한 표적 부위에서 치료 효과를 충분히 발휘할 수 있도록 약물을 고실내로 주사할 수 있다.
약물의 고실 내 주사는 약물을 고막 뒤에서 중이 및/또는 내이로 주사하는 방법이다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간일 수 있으며, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 경고막 주사를 통해 중이에 투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 내이로의 비-경고막 접근을 통해 내이에 직접 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 약학적 조성물은 고막을 관통하고, 내이의 정원창막 또는 난형창에 직접 접근할 수 있는 주사기와 바늘을 통해 투여될 수 있다. 주사기의 바늘은 고막 천공을 예방하기 위해 가급적 작은 바늘이 이용되며, 예를 들면, 22 게이지 내지 24 게이지일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 약학적 조성물은 각 활성 약물을 담을 수 있는 2개 이상의 구획을 갖는 본체를 포함하는 주사기를 이용하여 주사되며, 각 활성 약물은 주사 직전에 혼합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 약학적 조성물은 복수의 주사기를 이용하여 주사되며, 각 주사기는 주사 직전에 또는 주사 직후에 혼합될 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 투여 후 가교된 히알루론산을 형성하는 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산(예를 들어, 각각 히알루론산 디아미노부탄 및 히알루론산 숙신이미드)은 각각 상이한 주사기를 이용하여 주사되고, 주사된 후 혼합되어 가교된 히알루론산을 형성할 수 있다. 따라서 상기 난청을 예방 또는 치료하는 방법에서 본 발명의 약학적 조성물을 개체의 고실 내에 투여하는 단계, 히알루론산 부탄 및 히알루론산 숙신이미드를 각각 고실 내로 주사하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 투여 1회당 0.02-50 mg/ml, 바람직하게는 투여 1회당 1-15 mg/ml으로 이용될 수 있다. 목적하는 용량은 동시에(또는 단기간 동안) 또는 적절한 간격을 두고 투여되는 1회 용량 또는 분할 용량으로 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 난청은 소음성 난청, 이독성 난청, 내이 질환에 따른 난청, 및 외상성 난청으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 IGF-1 및 스테로이드성 항-항염증제를 활성 성분으로 포함하고, 가교된 히알루론산을 전달체로 포함하는 난청 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
제1 히알루론산 및 제2 히알루론산(예를 들어, 각각 히알루론산 디아미노부탄 및 히알루론산 숙신이미드)을 제조하는 단계,
IGF-1을 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산 각각과 혼합하는 단계,
생체적합성 중합체로 미소구체를 제조하는 단계,
상기 미소구체에 스테로이드성 항-항염증제를 캡슐화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생체적합성 중합체로 미소구체를 제조하는 단계 및 미소구체에 스테로이드성 항-항염증제를 캡슐화시키는 단계는 생체적합성 중합체, 예를 들면, PLGA 용액과 스테로이드성 항-항염증제 용액을 각각 제조하고, 제조된 생체적합성 중합체 용액과 약물 용액을 주사기에 넣고, 중합체 및 약물 분산 용액을 제조하고, 상기 용액을 0.5 중량% 폴리비닐알코올(PVA) 수용액에 60 Hz의 진동주파로 분사하는 것에 의해 폴리비닐알코올 수용액에 분산시켜 과립을 형성시키고, 2시간 동안 실온에서 300 rpm으로 교반하여 안정화시킨 후에, 이어서 생성된 과립을 분리하고 증류수로 세척한 후 동결 건조에서 스테로이드성 항-항염증제가 봉입된 미소구체를 수득하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 약물 전달체로 이용될 수 있는 가교된 히알루론산을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가교된 히알루론산은 히알루론산 용액을 4-니트로페녹시 클로로포르메이트와 혼합하여 히알루론산 니트로페녹시 클로로포르메이트 용액(HA-NC)을 수득하는 단계,
히알루론산 니트로페녹시 클로로포르메이트 용액에 디아미노부탄 용액을 첨가하고 교반하면서 반응시켜, 히알루론산 디아미노부탄(HA-DAB)을 수득하는 단계,
히알루론산 용액을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드와 혼합하여 히알루론산 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를(HA-EDC)수득하는 단계,
히알루론산 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드 용액과 N-히드록시술포숙신이미드를 반응시켜 히알루론산 숙신이미드(HA-NHS)를 수득하는 단계,
히알루론산 디아미노부탄과 히알루론산 숙신이미드를 반응시켜 가교된 히알루론산을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
가교도는 디아미노부탄과 히드록시술포숙신이미드의 양을 통해 조절될 수 있고, 이에 의해 약물의 방출 속도 및 기간을 조절할 수 있다.
이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는 약물 제형 및 난청 치료용 약학적 조성물은 고실내로 투여되고, 1회 투여로 수주 내지 수개월 동안 치료 효과를 발휘할 수 있으므로, 전신적 부작용을 유발하지 않고, 반복적인 시술 없이 효과적으로 난청을 치료할 수 있게 한다.
도 1A는 경고막 고실 내 국소 약물 전달 과정의 모식도를 나타낸 것이고, 도 1B는 실제 주사기의 사진 이미지이다. 주사를 통해 고막을 뚫고 전달체와 약물은 고막 내측, 즉 고실 내로 주입된다. 주입된 약물은 고실 내에 위치하면서, 서서히 정원창 및 난원창을 통해 내이로 전달된다.
도 2는 완전한 대조군, PCL+dexa, HA+dexa, 식염수+dexa 투여 그룹에서 측정된 평균 청력 역치를 보여준다.
도 3은 약물 투여 후 45일차에 측정된 우수한 치료 효과(35 dB 이하의 청력)를 보이는 개체의 비율을 보여준다.
도 4는 약물 투여 후 60일차(PID60)에 희생시킨 동물로부터 채취된 와우의 첨부, 중간부, 및 기저부에서 관찰된 유모세포의 공초점 현미경 이미지를 보여준다.
도 5는 약물 투여 후 60일차(PID60)에 희생시킨 동물로부터 채취된 와우의 첨부, 중간부, 및 기저부에서 측정된 200 μm 당 유모세포의 평균 개수를 보여준다.
도 6은 고실 내로 약물을 주입하기 위한 기공 및 약물 주입구가 표시된 고막의 모식도이다.
도 7은 가교된 히알루론산의 가교도에 따른 저장 모듈러스를 보여준다.
도 8은 고실 내 이중약물전달체를 주입하는 방법을 도식화한 것이다.
도 9는 기존 통상적치료(식염수 및 덱사메타손), 전달체 없는 약물(식염수, 덱사메타손, 및 IGF-1), 및 이중약물전달체(가교된 히알루론산, 미소구체 덱사메타손, 및 IGF-1)를 개체의 고실 내에 주입한 후 고막 치유까지의 소요 일수를 이미지로 보여준다.
도 10은 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 고막 치유까지의 소요 일수를 그래프로 도식화한 것이다.
도 11은 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 중이 속 약물 및 전달체의 음영 지속 시간을 CT 이미지로 나타낸 것이다.
도 12는 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 중이 속 약물 및 전달체의 음영 지속 시간을 그래프로 도식화 한 것이다.
도 13은 기존 통상적치료, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 청력 역치 회복 과정을 그래프로 도식화한 것이다.
도 14는 ICG를 함유하는 가교된 히알루론산을 이용하여 약물방출 지속률을 평가한 것을 형광 내시경 사진 이미지 및 CT 이미지로 나타낸 것이다.
실시예 1. 난청 치료용 약물의 고실내 투여를 위한 약물 전달체의 선택
전신성 스테로이드 투여에 따른 부작용을 방지하고, 고실내로 약물을 국소 투여하고, 1회 투여로 충분히 약효를 발휘할 수 있게 하는 약물 전달체를 선택하기 위해, 식염수, 폴리카프로락톤(PCL), 및 히알루론산의 약물 전달체로서의 유효성 및 안전성을 테스트하였다.
1-1. 소음성 난청 모델 제작
백색 잡음 116 dB C 소음에 3.0-3.5시간 노출되는 경우 약 50-75 dB SPL의 난청을 유발할 수 있고, 이 역치가 치료 약물을 연구하기에 가장 적합한 난청 수준이다 (Rhee CK and Suh MW, J Biomed Opt 2012).
180 내지 200 g의 6주령 SD 랫트에서 백색 잡음 116 dB C 소음으로 약 50 내지 75 dB SPL의 재현성 있는 난청을 유발하여 소음성 난청 모델로 이용하였다.
1-2. 약물 전달체의 유효성/안전성 테스트
(1) 약물 전달체로서의 유효성
약물 전달체로서의 유효성은 난청 동물모델에서 고실 내로 약물 투여 후, 청력 검사 및 유모세포 수를 관찰함으로써 평가하였다.
실시예 1-1에서 제작된 난청 모델에 한 동물에서 양쪽 귀에 각각 PCL+덱사메타손 및 HA+덱사메타손을 투여하고, 다른 동물에서는 한쪽은 아무것도 투여하지 않고(완전한 대조군) 한쪽은 식염수+덱사메타손을 투여했다. (대조군은 귀 7개, 실험군은 각각 PCL+덱사메타손은 귀 19개, HA+덱사메타손은 귀 13개, 및 식염수+덱사메타손은 귀 15개로 하였다.)
실시예1-1에서 제작된 소음성 난청 모델의 청력을 측정하고, 고막 사진을 찍었다. 그 후, 정상 청력을 보인 쥐에는 120 dB의 소음에 3 내지 3.5시간 동안 노출시키고, 청력 검사 후, 하기 약물을 경고막 주입하였다: 덱사메타손을 PCL에 포함시킨 PCL+덱사메타손, 덱사메타손을 히알루론산에 포함시킨 HA+덱사메타손, 및 식염수 중의 덱사메타손.
약물을 주입한 실험군을 각각 PCL+덱사메타손(dexa), HA+덱사메타손(dexa), 및 식염수+덱사메타손(dexa)으로 명명하고, 아무것도 투여하지 않은 완전한 대조군과 함께 실험에 이용하였다. 투여 후 0일, 4일, 8일, 12일, 30일, 45일 및 60일에 청력 검사 및 유모세포관찰을 수행하였다.
(1)-1. 청력 검사
청력 검사는 ABR(auditory brainstorm response)로 수행하였다. 청력은 각 동물의 청력 역치값을 측정함으로써 평가하였다.
구체적으로, 각 귀에 대하여 ABR(auditory brainstorm response)을 측정하였고, 이를 소음에 노출 시키기 전, 노출 1 내지 4시간 후, 약물 투여 후 1 내지 4시간 후, 및 약물 투여일로 4, 8, 30, 및 45일 후에 각각 수행하였다. ABR은 쥐를 방음 챔버에 넣은 후 피하 주사 전극을 각 두정(vertex) (활성 전극), 주사된 동측 귀 (ipsilateral ear) (기준 전극(reference electrode)) 뒤 및 반대쪽 귀 (contralateral ear) (접지 전극(ground electrode)) 뒤에 삽입하고, Smart EP system (IHS, Miami, USA)을 이용하여 측정하였다. 스피커를 외이 청각 관(external auditory canal)에 배치하고, 이어폰 튜브를 귀 안쪽 관으로 삽입한 후, 클릭 청각 자극을 표적한 귀로 전달하였다. 청력 역치값은 wave III/V 및 SN10 (저속 음성 파)로 90 dB SPL로부터 5 dB SPL씩 감소시키며 동물이 인지하는 가장 낮은 자극 정도를 평가함으로써 결정하였다. 파형(Waveform)은 두 명의 실험자들이 실험군에 대해 무작위로 관찰하여 결정하였고, ABR 역치값은 그 두 값의 평균으로 계산하였다.
난청을 유발하기 전에는 모든 동물의 청력이 10-30 dB SPL로 청력이 정상이었다. 그러나 난청을 유발한 이후 청력 역치가 50 내지 75 dB SPL로 상승하였고, 일부 난청이 유발되지 않거나 난청이 너무 과도한 경우 청력 분석에서 제외시켰다.
도 2는 4개의 그룹에서 측정된 평균 청력 역치를 보여주고, 도 3은 투여 후 45일차에 측정된 청력 개선을 보이는 개체의 비율을 보여준다.
PID(post injection day) 4 청력은 HA+dexa를 주입한 경우 38.5±15.5 dB SPL로 가장 우수했다. 식염수+dexa를 주입한 경우 42.3±10.1 dB SPL로 청력이 HA+dexa 군에 비하면 열등했다. 아무 치료도 시행하지 않은 대조군의 청력역치는 42.5±9.0 dB SPL 이었고 PCL+dexa를 주입한 경우 48.3±16.0 dB SPL 이었다. HA+dexa의 청력이 가장 좋았으며 이러한 경향은 이후 PID 45까지 유지되었다.
PID(post injection day) 45 청력은 HA+dexa를 주입한 경우 35.7±10.3 dB SPL로 가장 우수했고, 식염수+dexa를 주입한 경우 41.6±12.1 dB SPL로 청력이 HA+dexa 군에 비하면 열등했다. 아무 치료도 시행하지 않은 대조군의 청력역치는 42.5±11.0 dB SPL 이었고 PCL+dexa를 주입한 경우 47.8±13.1 dB SPL 이었다.
PID 45에 청력이 정상적인 청력 기준인 35 dB SPL 보다 우수한 귀의 비율을 산정한 결과 HA+dexa를 주입한 경우 63.6%로 가장 높았다. 반면 식염수+dexa를 주입한 경우 그 비율이 27.3%로 유의하게 낮았으며, 대조군의 경우 25.0%으로 HA+dexa를 주입한 것보다 낮았다. PCL+dexa를 주입한 경우 25.0%로 역시 HA+dexa를 주입한 것보다 성공적인 치료 확률이 유의하게 낮았다.
전술된 결과는 히알루론산이 고실내 약물 투여를 위한 전달체로서 안전하고 효과적이라는 것을 보여주었다.
(1-2) 유모세포 관찰
약물 투여 후 60일차(PID60)에 동물을 희생시키고, 공초점 현미경(confocal microscope, Leica TCS SP8)을 통한 관찰을 위해 약물을 주입한 랫트의 와우를 적출하였다. 4% 파라포름알데히드로 4℃에서 12시간 동안 1차 고정 후 1M PBS로 5분간 3회 세척하였다. 그 후, 페트리 디쉬(petri dish)에서 실체현미경(stereoscopic microscope, DONGWON DSZ-40T)하에서 와우를 분리하였다. 팔로이딘(Phalloidin)과 Triton X 100을 1:100 비율로 희석한 용액에 와우를 1시간 동안 염색하였다. 같은 방법으로 세척한 후 목표로 하는 주파수 별로 분리하여 슬라이드를 제작하였다. 공초점 현미경으로 8, 16, 및 32 kHz(Apical, Middle Basal)의 Z 스택(stack) 사진을 촬영했다. 각 군에서 200μm내 에서의 외 유모세포 수를 총합하여 정량적으로 분석하였다. 도 4 및 5는 각각 와우의 첨부, 중간부, 및 기저부에서 관찰된 유모세포의 이미지 및 200 μm 당 세포의 수를 도시한다.
유모세포의 수를 정량적으로 산출한 결과 아무런 치료도 시행하지 않은 대조군인 HA control은 64.1±5.9개로 치료를 시행한 경우에 비해 유의하게 생존 유모세포수가 유의하게 적었다. 또한 HA+dexa를 주입한 경우 생존 유모세포의 수는 72.1±5.9개로 다른 군에 비해 많았다. 생존 유모세포의 수는 PCL+dexa를 주입한 경우는 71.7±4.2개, 식염수+dexa를 주입한 경우 70.8±5.4개였다.
(2) 약물 전달체로서의 안전성
약물 전달체로서의 안전성은 고막내 투여 후 염증의 발생 여부를 측정함으로써 평가하였다.
구체적으로, 염증이 발견된 PID를 개시 지점으로 계산하고, 염증이 생긴 기준은 "Pars flaccida(이완부)" 부분이 볼록하게 튀어나와 있거나, 색이 불투명하게 변했을 때를 기준으로 계산하고, 염증이 사라진 PID를 종료 지점으로 계산했다. 염증이 사라졌는지 여부는 "Pars tensa(긴장부)" 부분이 평평해졌는지 여부로 판단했다. 염증이 마지막 측정일, 즉, 고막의 채취 당일까지 사라지지 않는 경우, "LI(long term infection)"로 표시했다.
측정 결과, PCL+dexa 염증발생율 70.8%, 식염수+dexa 염증발생율 0%, HA+dexa 염증발생율 0%, 및 HL control 염증발생율 8.2% 로서 PCL+dexa의 경우 대조군 및 다른 실험군에 비해 염증발생률이 가장 높은 것으로 나타났다.
따라서, PCL이 지속성에서 우수하더라도 염증을 유발하므로 약물 전달체로 활용하기에는 HA보다 적절하지 않을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2. 가교된 히알루론산의 제조 및 그에 의한 히드로겔의 형성
히알루론산을 약물의 지속적 방출을 위한 전달체로 이용하기 위해 가교된 히알루론산을 형성할 수 있는 히알루론산 유도체를 제조하고 이를 이용한 약물 전달 및 방출을 조사하였다.
(1) 히알루론산 유도체의 제조
-HA-DAB(히알루론산 디아미노부탄)의 제조
분자량이 1,000,000인 히알루론산을 3차 증류수에 1 wt%로 녹인 용액 5 mL에 4-니트로페톡시 클로로포르메이트(Sigma Aldrich, 160210)를 투입한 후, 상온에서 상기 용액에 트리메틸아민(Sigma Aldrich, T0886)을 4-니트로페녹시 클로로포르메이트와 같은 몰 농도가 되도록 투입하고 72 시간 동안 상온에서 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석하여 영하 80℃의 온도로 냉각시키고 동결 건조하였다. 4-니트로페녹시 클로로포르메이트와 트리에틸아민의 양은 표 2에 표시된다. 제조한 HA-니트로페녹시 클로로포르메이트를 3차 증류수에 0.1 wt%로 녹인 용액 50 mL을 제조했다. 디아미노부탄(Sigma Aldrich, D13208)을 3차 증류수 10 mL에 녹인 후 적하 깔때기(dropping funnel)를 사용하여 HA-니트로페녹시 클로로포르메이트 용액에 적가했다. 72 시간 동안 상온에서 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석하여 영하 80의 온도로 냉각시키고 동결 건조하였다. 디아미노부탄의 양은 각 가교도에 따라 표 3에 표시된다.
-HA-NHS (히알루론산 숙신이미드)의 제조
분자량이 1,000,000인 히알루론산을 3차 증류수에 1 wt%로 용해시킨 용액 5mL에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(TCI, D1601)를 투입한 후, N-히드록시술포숙신이미드(Sigma Aldrich, 56485)를 투입하고 상온에서 72시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72시간 동안 투석하여 영하 80℃의 온도로 냉각시키고 동결 건조하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드와 N-히드록시술포숙시니미드의 양은 각 가교도에 따라 표 3에 표시된다.
구분 1:250 1:500 1:1000
4-니트로페녹시 클로로포르메이트 25.2 mg 50.4 mg 100.8 mg
트리에틸아민 12.7 mg 35.4 mg 70.8 mg
디아미노부탄 11.1 mg 22.2 mg 44.4 mg
구분 1:250 1:500 1:1000
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 19.5 mg 39 mg 78 mg
N-히드록시술포숙신이미드 27.2 mg 54.4 mg 108.8 mg
(2) 가교된 히알루론산의 제조
상기 (1)에서 제조된 HA-DAB 및 HA-NHS를 각각 3차 증류수에 2wt%로 용해시킨 용액을 제조하고, 이들을 혼합하여 HA-DAB의 아민과 HA-NHS의 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 반응시켰다. 상기 반응에 의해 HA-디아미노부탄과 HA-NHS가 가교된 망상구조를 갖는 히드로겔을 수득하였다.
히드로겔을 투석하여 잔류 가교제를 제거하고, 원소 분석을 통해 HA 중 디아미노부탄과 N-히드록시숙신이미드의 비율을 결정하여 가교도를 확인하였다.
(3) 물성(Storage modulus)
가교된 히알루론산의 가교도에 따른 물성의 변화를 확인하기 위해 저장 모듈러스(storage modulus)를 modular compact rheometer (MCR 102, Anton Paar, Austria)를 이용해 측정하였다.
결과가 하기 도 7에 도시된다. 가교도가 증가할수록 저장 모듈러스가 증가한다는 것을 보여준다.
실시예 3. 가교된 히알루론산에 의한 히드로겔의 약물 전달체로서의 이용
실시예 2에서 제조된 가교된 히알루론산 및 미소구체를 약물 전달체로 하는 이중약물전달체의 방출 특성을 조사하였다. 히알루론산 용액과 달리, 가교된 히알루론산은 히드로겔을 형성하여 투여 부위에서 형태를 유지하면서 약물의 서방성 방출을 제공하고, 가교도의 조절에 따라 방출 프로파일을 조절할 수 있다. 또한 미소구체를 약물 전달체로 하는 경우, 덱사메타손 및 IGF-1이 혼합되어 유발될 수 있는 상호작용에 의한 활성 또는 안정성 저하를 예방할 수 있다.
3-1. 대조군 및 이중약물전달체의 형성
먼저, PLGA(poly-lactide-co-glycolide) 300 mg을 에틸아세테이트(EA) 9.9 mL에 녹인 용액과 덱사메타손 100 mg을 DMSO 0.1 mL에 녹인 용액을 각각 주사기에 넣고 4 mL/분의 유속으로 단일 축 노즐 초음파 분사기로 분사시켰다. 진동 주파는 3 W/60 Hz로 설정하였으며, 1분 동안 상온에서 0.5% PVA 200 mL에 분사하여 덱사메타손을 포함하는 미소구체를 제조하였다.
대조군인 '식염수(saline) + 덱사메타손'은 식염수 1mL에 덱사메타손 10mg을 혼합하여 제조하였고, '식염수 + IGF-1 + 덱사메타손(전달체 없는 약물)' 실험군에는 식염수 1mL에 IGF-1 2.5 mg을 혼합한 것을 상기 '식염수(saline) + 덱사메타손'과 동시에 동일 양 주입하였다. 이중약물전달체인 '가교된 히알루론산 + IGF-1 + 미소구체 덱사메타손' 실험군에는 HA-DAB 1mL에 미소구체 덱사메타손 (덱사메타손 5 mg) 및 IGF-1 2.5 mg을 혼합한 것과 HA-NHS 1mL에 미소구체 덱사메타손 (데사메타손 5 mg)을 혼합한 것을 동시에 동일한 양을 주입하여 하이드로겔을 형성하도록 하였다.
3-2. 약물 전달체 유지 기간 및 약물 방출 평가
이중약물전달체에 의한 약물 방출을 관찰하기 위해, CT 조영제와 ICG(indocyanine green, 동인당 제약)을 약물로 이용하여 고막 치유 시간 및 약물 방출을 측정하고, 청력 개선 효과를 평가하였다.
(1) 고막 치유 시간 및 약물 방출 평가
랫트(Sprague-Dawley rat, 170g - 220g, 6 week old, (주)코아텍/KOATECH CO.,LTD)의 양쪽 귀에 각각 CT 조영제와 ICG를 경고막 투여하고, 고실 내에서 방출 여부를 확인하였다. ICG은 5mg/ml을 사용하였으며, 히알루론산은 도 8에 도시된 바와 같이, 체내 주입 직전 바늘 부근에서 제1 히알루론산 및 제2 히알론산인 HA-A 및 HA-B (구체적으로, HA-DAB 및 HA-NHS)가 교반되어 체내에서 1:500의 가교도를 갖도록 하였다. 그 후, 투여 직후, 4일차, 8일차, 12일차, 30일차, 및 45일차에 고막 사진 및 CT 촬영을 통해 고실 내 약물의 존재 여부를 확인하였고, ICG에 의한 고막 사진은 129일까지 촬영하였다.
도 11은 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 중이 속 약물 및 전달체의 음영 지속 시간을 CT 이미지로 나타낸 것이다. 도 12는 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 중이 속 약물 및 전달체의 음영 지속 시간을 그래프로 도식화 한 것이다. 이중약물전달체를 사용하는 경우 적어도 8 내지 12일 이상 음영 상 약물이 지속되는 것으로 관찰됨으로써, 전달체 없이 약물을 주입하는 경우보다 약물 방출 시간을 더 연장시킬 수 있음을 알 수 있으며, 도 7 및 12에서 보인 바와 같이 히알루론산 가교 정도를 조절함으로써 약물 지속시간을 더욱 유리하게 조절할 수 있음을 알 수 있다.
도 14는 ICG를 함유하는 가교된 히알루론산을 이용하여 약물방출 지속률을 평가한 것을 형광 내시경 사진 이미지 및 CT 이미지로 나타낸 것이다. ICG가 30일 이상 히드로겔 내부에 남아있는 것으로 확인되었으며, 이는 히알루론산 히드로겔이 약물의 서방화를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
(2) 청력 개선 평가
청력 개선 평가는 실험군에 식염수 + dexa, 식염수 + IGF-1 + dexa(전달체 없는 약물), 및 IGF-1 + 미소구체 dexa의 이중약물전달체를 사용한 것을 제외하고 실시예 (1)-1의 청력 검사와 같이 수행하였다.
도 13은 기존 통상적치료 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 청력 역치 회복 과정을 그래프로 도식화한 것이다. 그 결과, 45일 째에는 이중약물전달체는 식염수+dexa에 비해 현저히 호전된 것으로 관찰되었다. 특히 12일 째의 경우, 식염수 + dexa는 40.7±9.7 dB SPL로 가장 낮았고, 이중약물전달체는 27.0±2.7 dB SPL 로서 이중약물전달체가 기존의 치료 방법에 비해 현저하게 개선된 효과를 가짐을 알 수 있다.
3-3. 고막 치료 효과
실시예 1-1과 같이 난청 동물 모델을 제작한 후 이중약물전달체가 제형으로서 안전한지 여부 및 약물전달로 인한 치료효과를 CT 촬영을 통한 고막 치유일 수를 관찰 및 측정함으로써 평가하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 약물을 주입하기 위해서는 먼저 공기 구멍(air hole)을 만들고, 이 공기 구멍의 반대 측을 통해 약물을 주입한다. (약물 주입 장치의 경우 한 실험자가 미세하게 바늘을 조작하고, 다른 실험자가 주사기를 조작하기 때문에 손 떨림으로 인한 고막 손상과 바늘 이탈 문제를 해결할 수 있었다. 또한 약물 주입 속도와 양을 미세하게 조정할 수 있도록 하였다) 따라서, 경고막 약물 전달로 인하여 초기 4-8일 정도 고막에 천공의 남을 수 있다. 이러한 잠재적 유해 반응을 점검하고 객관적으로 분석하기 위하여 설치류 고막 내시경 사진을 주기적으로 추적 관찰하였다.
(1) CT 소견
약물 전달체가 장기간 중이에 성공적으로 잔류하는지 확인하기 위하여 주기적인 CT 촬영을 시행하였다. 약물의 잔류되는 기간은 주입된 약물별로 판이하게 차이가 나타남을 알 수 있었다. 동물 모델 및 약물 주입은 상기 실시예 (2-2)와 같았다. 즉 전달체의 종류와 조성, 농도, 안전성 정도에 따라 약물과 약물 전달체 유지 기간을 장기간 또는 단기간으로 조정할 수 있다는 것을 확인하였다.
In-vivo Micro-CT (NFR Polaris-G90)을 이용하여 CT 사진을 찍었다. CT 상에서 bulla 속 약물과 전달체 음영이 관찰되는 기간을 산출하였다.
도 9는 기존 통상적치료(식염수 및 덱사메타손), 전달체 없는 약물(식염수, 덱사메타손, 및 IGF-1), 및 이중약물전달체(가교된 히알루론산, 미소구체 덱사메타손, 및 IGF-1)를 개체의 고실 내에 주입한 후 고막 치유까지의 소요 일수를 이미지로 보여주고, 각 군에서 약물의 잔류 기간은 하기 표 3과 같았다.
(2) 고막 소견
도 10은 기존 통상적치료, 전달체 없는 약물, 및 이중약물전달체를 개체의 고실 내에 주입한 후 고막 치유까지의 소요 일수를 그래프로 도식화한 것이다.
그 결과, 이중약물전달체는 약물 전달 이후 11.6±12.7일째로 가장 빨리 고막 천공이 완전하게 치유되고, 30일째에는 흔적만이 남을 뿐 완전히 정상 고막과 차이가 없음을 확인하였다. 식염수+dexa 약물의 경우 24±9.2일째 이후부터는 고막 천공이 완전하게 치유되었다. 고막 내시경 추적 관찰과정과 분석 방법은 본 연구진 선행 논문(Rhee CK and Suh MW, J Biomed Opt 2013)에 따라 수행하였다.
구체적으로, 고막내 투여시 발생한 고막 천공의 회복 시간을 측정하였다.
고막 천공이 전혀 보이지 않는 PID를 기준으로 평균을 계산했고, 고막 천공이 사라진 후, 다시 발생하는 경우, 최초에 회복된 PID를 기준으로 계산했다.
고막 천공의 평균 회복시간은 3개의 그룹에 대해 하기와 같았다.
그룹 고막 천공 회복까지의 평균 일수
식염수+dexa 24±9.2 일
전달체 없는 약물(식염수+dexa+IGF) 13.2±8.5 일
이중약물전달체 11.6±12.7 일
따라서 이중약물전달체가 약물 전달체로서 안전할 뿐 아니라, 11.6±12.7 일로 고막의 회복 속도가 가장 빠른 것으로 확인되었다.

Claims (21)

  1. 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는 약물 방출 조절형 제형으로서, 상기 가교된 히알루론산은 표적 부위에서 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산이 가교되어 히드로겔을 형성하는 것인 약물 방출 조절형 제형.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산은 각각 히알루론산 디아미노부탄(HA-diaminobutane) 및 히알루론산 숙신이미드(HA-succinimide)인 약물 방출 조절형 제형.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제형은 활성 약물을 표적 부위에서 소정의 기간 동안 방출하는 것인 약물 방출 조절형 제형.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 소정의 기간은 7일 이상인 약물 방출 조절형 제형.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 활성 약물은 스테로이드성 항-항염증제(steroidal anti-inflammatory drug) 또는 IGF-1인 것인 제형.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 스테로이드성 항-항염증제는 덱사메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 히드로코르티손 또는 이들의 조합인 제형.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 100,000 내지 5,000,000 mol/g인 것인 약물 방출 조절형 제형.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 가교된 히알루론산의 가교도는 1:250 내지 1:1,000인 것인 약물 방출 조절형 제형.
  9. IGF-1 및 스테로이드성 항-항염증제를 활성 성분으로 포함하고, 가교된 히알루론산을 약물 전달체로 포함하는, 난청 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 가교된 히알루론산은 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산을 각각 고실 내로 주사한 후 체내에서 가교되어 히드로겔을 형성하는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산은 각각 히알루론산 디아미노부탄 및 히알루론산 숙신이미드인 약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 히드로겔은 미소구체를 약물 전달체로서 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 미소구체는 생체 적합성 중합체로 제조되는 것인 약학적 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, IGF-1은 히드로겔에 분산되고, 스테로이드성 항-항염증제는 미소구체 내에 캡슐화된 상태로 존재하는 것인 약학적 조성물.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 약학적 조성물은 고실 내로 주사되는 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 약학적 조성물은 고실 내로 주사된 후, IGF-1은 속방출성으로 방출되고, 스테로이드성 항-염증제는 서방출성으로 방출되는 것인 약학적 조성물.
  17. 청구항 9에 있어서, 상기 난청은 소음성 난청, 이독성 난청, 내이 질환에 따른 난청, 및 외상성 난청으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
  18. 청구항 9에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암 치료의 개시 전에 투여되어, 이독성 난청을 예방하는 것인 약학적 조성물.
  19. 청구항 9 내지 18 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 개체의 고실 내에 투여하는 단계를 포함하는 난청을 예방 또는 치료하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 약학적 조성물을 개체의 고실 내에 투여하는 단계는,
    제1 히알루론산 및 제2 히알루론산을 각각 고실 내로 주사하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 청구항 9 내지 18 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    제1 히알루론산 및 제2 히알루론산을 제조하는 단계;
    IGF-1을 상기 제1 히알루론산 및 제2 히알루론산 각각과 혼합하는 단계;
    미소구체를 제조하는 단계; 및
    상기 미소구체에 스테로이드성 항-항염증제를 캡슐화시키는 단계를 포함하는 방법.
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