KR20180066247A - 유전자 요법 - Google Patents

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크리스티안 그뢴달
팀 퍼넬
크리스 할로우드
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신코나 인베스트먼트 매니지먼트 리미티드
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Abstract

본 발명은 인자 I 또는 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 벡터는 눈의 보체-매개된 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다.

Description

유전자 요법
발명의 분야
본 발명은 안질환의 유전자 요법에 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연령-관련 황반 변성(AMD)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이고, 벡터는 인자 I 및/또는 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 눈에 전달할 수 있다.
발명의 배경
황반은 시신경에 인접한, 크기가 약 3 내지 5 밀리미터인, 눈 망막의 작은 영역이다. 이것은 망막의 가장 민감한 영역이며, 높은 시력을 허용하고 색각을 담당하는 광수용체인 밀집한 농도의 원추를 함유하는 오목한 영역인 중심와를 함유한다.
연령-관련 황반 변성(AMD)은 선진국의 50세 이상의 인구에서 기능 시각상실의 가장 흔한 원인이다(Seddon, J M. Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T E, et al., eds. Ryan S J, ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001:1039-50). AMD는 맥락막 혈관구조에서 유래하고 망막하 공간으로 확장하는 신생혈관생성과 연관된다. 또한, AMD는 망막, 망막 색소 상피(RPE), 및 밑에 있는 맥락막(망막과 공막 사이에, RPE 아래에 있는 고도의 혈관 조직)의 진행성 퇴행을 특징으로 한다.
산화 스트레스, 가능한 자가면역 성분을 갖는 염증, 유전 배경(예를 들어, 돌연변이), 및 흡연 및 식이와 같은 환경 또는 거동 인자를 포함하는 다양한 인자가 AMD의 발병에 기여할 수 있다.
AMD의 임상 진행은 황반의 변화에 따라 단계별로 특성화된다. 초기 AMD의 특징은 세포외 파편이 망막 아래에 축적되어 임상 시험 및 안저 사진에서 망막의 황색 반점으로 보이기 시작하는 드루젠이다. 드루젠은 크기에 의해 소형(<63 μm), 중간(63-124 μm) 및 대형(>124 μm)으로 분류된다. 이들은 또한 안과 검사에서 이들의 가장자리의 모양에 따라 경질 또는 연질로 간주된다. 경질 드루젠은 명확하게 한정된 가장자리를 갖는 반면, 연질 드루젠은 덜 한정된 유체 가장자리를 갖는다. 연령-관련 안질환 연구(AREDS) 안저 사진의 중증도 척도는 이 병태에 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
AMD는 "건성"및 "습성"(삼출성, 또는 신생혈관) 형태로 분류되었다. 건성 AMD는 습성 AMD보다 일반적이지만, 건성 형태는 습성 형태로 진행될 수 있으며, 둘은 상당수의 경우에 동시에 발생한다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층, 위에 있는 광수용체 세포, 및 종종 또한 맥락막 모세관 층의 밑에 있는 세포에서 세포의 진행성 아폽토시스를 특징으로 한다. 위에 있는 광수용체 위축을 수반하는 RPE 세포 사멸의 컨플루언트(confluent) 영역을 지도모양 위축이라고 한다. 이러한 형태의 AMD를 가진 환자는 중심 시력의 느리고 점진적인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 시력의 갑작스런 무능력 상실의 원인이 될 수 있는, RPE 및 황반 아래에 있는 맥락막 혈관(맥락막모세혈관층)에서 성장한 비정상적인 혈관으로부터의 출혈 및/또는 유체 누출을 특징으로 한다. 환자가 경험하는 시력 상실의 많은 부분은 그러한 맥락막 신생혈관형성(CNV) 및 이의 이차 합병증 때문인 것으로 추정되어 왔다. 신생혈관 AMD의 아형은 망막 혈관종 증식(RAP)이라고 한다. 여기서, 혈관종 증식은 망막에서 유래하고, 망막하 공간으로 후방으로 확장되어, 결국 일부 경우에 맥락막 신생 혈관과 소통하게 된다.
보체 시스템(CS)은 AMD 환자의 눈으로부터의 드루젠에서 CS 성분의 확인에 기반하여 초기 AMD 발병과 연루되어 있다. AMD에서, 상이한 아포지단백질 유형(E, B, 또는 A-I), 여러 아밀로이드 펩티드(P, Aβ, 또는 SA-1), TIMP-3, 혈청 알부민, 및 세포 기능과 관련된 특정 단백질(예를 들어, ATP 신타제 β 서브유닛, 스캐빈저 수용체 B2, 및 레티놀 데하이드로게나제)를 포함하는 적어도 129개 유형의 드루젠-침착된 단백질이 확인되었다. AMD-유래된 드루젠은 또한 조절 단백질(CFH, 보체 수용체 1 (CR1), 비트로넥틴, 및 클루스테린), CS 활성화 및 분해 생성물(C1q, C3, C3a, C3b, 및 C5a), 및 분리된 복잡한 형태로 MAC 구성요소(즉, 5, 6, 8(α, β, 및 γ), 및 9)를 포함하는 말단 CS 경로의 구성원을 포함하는, 거의 모든 보체 단백질을 함유한다. 드루젠의 축적은 CS를 활성화하고, 염증 매개체의 국소 생산을 유발하며, 백혈구를 끌어 당겨 차례로 AMD에 존재하는 국소 염증 상태를 증가시킬 수 있다.
AMD에 대한 현재 치료 옵션은 벤조포르피린에 의한 광역학 요법(Arch Ophthalmol, 1999; 117: 1329-1345) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 경로를 표적화하는 다수의 요법을 포함한다. 그러한 VEGF-표적화된 요법의 예는 앱타머 페갑타닙(aptamer pegaptanib)(N Engl J Med. 2004;351:2805-2816) 및 라니비주맙(ranibizumab)(N Engl J Med. 2006 Oct 5; 355(14):1432-44) 및 베바시주맙(bevacizumab)(BMJ. 2010 Jun 9; 340:c2459.)과 같은 항체를 포함한다. 그러나, 모든 환자가 항-VEGF 항체 치료에 반응하는 것은 아니며, 시력이 회복되거나 등록된 실명으로 진행하는 것도 아니다.
지도모양 위축의 치료를 위한 요법이 개발되었고 현재 3상 임상 연구 중이다(Genentech/Roche에 의한 MAHALO 연구). 람팔리주맙(lampalizumab)은 지도모양 위축의 진행 속도를 막기 위해 유리체내 주사에 의해 투여되는, 보체 인자 D에 대한 인간화된 모노클로날 억제 항체이다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 인자 D는 C3b 피드백( '증폭') 사이클의 일부이다. 인자 D는 매우 낮은 혈청 농도로 존재하며 대체 경로에 필수적인 인자이다. 그럼에도 불구하고, 이의 작은 크기(27 kDa)로 인해, 인자 D는 신장에 의해 신속하게 제거되고 신속하게 재합성된다. 상기 요법은 매달 유리체내 주사를 필요로 한다.
당업계에서는 AMD를 치료하기 위한 새로운 접근법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명자들은 이제, 예를 들어, AMD의 치료에 유용한 보체 시스템을 조절하기 위한 접근법을 제공한다. 본 발명자들은 분해 사이클의 표적화를 통해 보체 C3b 피드백 사이클을 음성적으로 조절할 목적으로 유전자 요법에 의한 전달되는 인자 I를 제공한다(도 1). 결과적인 대체 경로의 피드백 루프의 재조정은 C3b 및 iC3b 분해를 촉진시켜, 보체-매개된 장애, 특히 대체 경로 조절에 근본적인 결함이 있는 장애에서 주요 질병 인자를 제거할 것이다. 대안적으로, 인자 H가 대신 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 항-인자 D 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 항-보체 성분 5(C5) 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다.
한 구체예에서, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 1 또는 9와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO: 2 또는 8과 적어도 70% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) SEQ ID NO: 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열.
바람직하게는, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인자 I의 자연 활성을 갖는 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 9로 표시되는 단백질)을 인코딩한다. 예를 들어, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 C3b 및 iC3b를 불활성 분해 생성물로 처리하는 능력을 갖는 단백질을 인코딩할 수 있다. 다시 말해, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 갖는 단백질을 인코딩한다.
한 구체예에서, 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 3과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO: 4와 적어도 70% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열.
바람직하게는, 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인자 H의 자연 활성을 갖는 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 단백질)을 인코딩한다. 예를 들어, 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 C3b의 인자 I 매개된 절단을 위한 보조인자로서 작용하고 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시키는 능력을 갖는 단백질을 인코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터로 트랜스펙션된 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터 또는 본 발명의 세포를 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 안내 투여용이다.
한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다
한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소를 포함한다.
한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 소 성장 호르몬 폴리-A 신호, 바람직하게는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호를 포함한다.
한 구체예에서, AAV 벡터는, 예를 들어, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE), 바람직하게는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 WPRE를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 바이러스 입자의 형태이다.
바람직한 구체예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 인자 I 또는 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CAG 프로모터, 바람직하게는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 안구 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 눈의 보체- 매개된 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 저-활성과 관련된다(도 1 참조). 한 구체예에서, 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증이다. 바람직한 구체예에서, 장애는 AMD, 바람직하게는 건성 AMD이다.
한 구체예에서, 용도는,
(a) 눈 및/또는 혈청에서 정상 미만의 인자 I 활성 또는 농도를 갖고, 바람직하게는 혈청에서 0-30 또는 0-20 또는 0-10 μg/mL의 농도 또는 그와 동등한 활성을 갖고/거나;
(b) 연령-관련 황반 변성(AMD)-관련 SNP, 바람직하게는 희귀 인자 I 변이체에 대한 이형접합체 또는 동형접합체인 대상체에서 장애를 치료 또는 예방하는 것이다.
한 구체예에서, 용도는,
(a) 눈 및/또는 혈청에서 정상 수준의 인자 I 활성 또는 농도를 갖고, 바람직하게는 혈청에서 적어도 30 μg/mL, 예를 들어, 30-40 μg/mL이고/거나;
(b) 희귀 인자 I 변이체 대립유전자를 갖지 않는 대상체에서 장애를 치료 또는 예방하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다. AMD는, 예를 들어, 건성 AMD일 수 있다. 바람직한 구체예에서, AMD는 건성 AMD이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 당뇨 망막병증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소된다. 또 다른 구체예에서, 지도모양 위축의 양이 감소된다.
한 구체예에서, 지도모양 위축의 진행이 느려진다. 바람직하게는, 대상체의 치료되는 눈에 투여한 지 12개월 동안 지도모양 위축 면적에서의 증가는 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 본원에 개시된 눈 장애와 같은 눈 장애로 고통받는 대상체에서 시야 또는 시력을 개선 또는 회복시키는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 시야 또는 시력 상실, 예를 들어, 본원에 개시된 눈 장애와 같은 눈 장애와 관련된 시야 또는 시력 상실을 완화시키는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 본원에 개시된 눈 장애와 같은 눈 장애로 고통받는 대상체에서 대상체의 읽기 속도를 개선 또는 회복시키는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 읽기 속도의 감소, 예를 들어, 본원에 개시된 눈 장애와 같은 눈 장애와 관련된 읽기 속도의 감소를 완화시키는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 광수용체 및/또는 망막 색소 상피(RPE)의 손실, 예를 들어, 본원에 개시된 눈 장애와 같은 눈 장애와 관련된 광수용체 및/또는 RPE의 손실을 감소 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 안내 투여된다. 본 발명자들은 상기 요법의 국소 투여가 눈의 보체-매개된 장애, 예를 들어, AMD를 치료 또는 예방하기 위한 보체 인자의 필요한 수준을 실질적으로 달성하는 수단을 제공한다는 것을 인지한다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 이로써 대상체에서, 특히 대상체의 눈, 예를 들어, RPE에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 이로써 대상체에서, 특히 대상체의 눈, 예를 들어, RPE에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 눈에서의 정상 수준을 초과하는 수준까지 증가시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 눈의 보체-매개된 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 저-활성과 관련된다. 한 구체예에서, 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증이다. 바람직한 구체예에서, 장애는 AMD, 바람직하게는 건성 AMD이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. AMD는, 예를 들어, 건성 AMD일 수 있다. 바람직한 구체예에서, AMD는 건성 AMD이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨 망막병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
대상체는, 예를 들어, AMD로 진단 받았거나 AMD에 걸릴 위험이 있는 대상체일 수 있다.
바람직한 구체예에서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 안내 투여된다.
한 구체예에서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
특히 바람직한 구체예에서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 눈의 보체-매개된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
한 구체예에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 저-활성과 관련된다. 한 구체예에서, 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증이다. 바람직한 구체예에서, 장애는 AMD, 바람직하게는 건성 AMD이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 바람직한 구체예에서, AMD는 건성 AMD이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 당뇨 망막병증을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 hAAT 프로모터를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 ApoR 인핸서를 포함하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 2개의 ApoR 인핸서를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함하지 않으며, 즉, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2/8 벡터가 아니다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 전신 투여되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 정맥내 투여되지 않는다.
도면의 설명
도 1
척추동물 보체("I" = 인자 I; "H" = 인자 H; "B" = 인자 B; 및 "D" = 인자 D)의 대체 경로의 C3b 피드백(증폭) 및 분해(하향-조절) 사이클.
도 2
CFI 및 CFIco의 제한 분해물의 아가로스 겔. CFI의 1752 bp 밴드를 절제하여 pAAV-CBA-WPRE-bGHpA 백본으로 클로닝하였다.
도 3
CFI(도 3A) 및 GFP(도 3B)의 면역블롯팅. 3A: CFI는 70kDa 밴드(비-환원됨)로 나타나며, ARA-19를 pAAV.CFI 또는 pAAV.CFIco로 트랜스펙션시킨 후 동일한 비율로 발현되었다. CFI는 pAAV로 트랜스펙션시킨 후 발현되지 않았다. 10% 정상 인간 혈청(NHS)을 CFI 면역블롯팅을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 도 3B: 트랜스펙션 효율은 ARPE-19 세포를 pCMV.GFP로 동시-트랜스펙션시킴에 의해 분석되었다. GFP는 30kDa 밴드로 나타나며, 면역블롯은 세포가 유사한 효율로 트랜스펙션되었음을 확인시켜 주었다.
도 4
바이러스의 상청액에서 CFI의 면역블롯팅은 HEK-293 및 ARPE-19 세포주를 형질도입시켰다. 4A: 상청액을 비-환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 마우스 모노클로날 항체(OX21, Thermo Fisher Scientific) 및 당나귀 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(Abcam)로 검출하였다. CFI 및 CFIco는 둘 모두의 세포주에서 발현되었다. AAV.GFP에 의한 세포주의 형질도입은 음성 대조군으로 작용하였고, 한편 0.5μg의 혈장 정제된 인간 CFI(본원에서 "CFIpl"로 불림) (Comptech)는 양성 대조군으로 작용하였다. 4B: 상청액을 환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 염소 항혈청(Comptech) 및 토끼 항-염소 IgG(전체 분자)-퍼옥시다제 항체(Sigma)로 검출하였다. CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)에 나타났다. AAV.GFP는 음성 대조군으로 작용하였고, 한편 0.5μg의 혈장 정제된 인간 CFI(Comptech) 및 10% 정상 인간 혈청(본원에서 "NHS"로 불림)은 양성 대조군으로 작용하였다. CFI 및 CFIco는 둘 모두의 세포주에서 발현되었다.
도 5
C3b 절단 검정의 대표적인 결과. 레인 1은 단지 CFH와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 2는 CFH 및 CFIpl와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. C3b는 CFIpl에 의해 iC3b 및 C3dg로 분해된다. 레인 3은 CFH 및 AAV.CFI로 형질도입된 HEK-293으로부터의 상청액과 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 4-5는 CFH 및 AAV.CFI(레인 4) 또는 AAV.CFIco(레인 5)로 형질도입된 ARPE-19 세포로부터 면역침전된 CFI("IP CFI"로 명명됨)와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 6-7은 CFH 및 AAV.CFI(레인 6) 또는 AAV.CFIco(레인 7)로 형질도입된 HEK-293으로부터 면역침전된 CFI와 함께 인큐베이션된 C3b를 나타낸다.
도 6
트랜스웰 배양된 ARPE-19 세포로부터 분비된 CFI의 면역블롯팅. 세포는 육각형 세포로 분화되지 않았지만 세포의 컨플루언트 단층으로 배양되었고, 세포 분열은 1% 혈청 배지의 첨가에 의해 최소로 감소되었다. 6A: 둘 모두의 구획으로부터의 상청액을 비 환원 조건하에 로딩하고, CFI에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다(Ap = 정점 구획 및 Bl = 측부 구획). CFI가 세포의 컨플루언트 단층에서 발현되고 있고 분비된 단백질이 둘 모두의 구획에서 검출된다는 것이 밝혀졌다. 6B: 세포의 단층의 존재를 확인하기 위해 핵의 Hoechst 염색을 수행하였다(염색은 상청액을 회수한 후 수행됨).
도 7
풀링된 샘플의 CFI 단백질 발현을 면역블롯팅에 의해 분석하였다. CFI는 모든 용량에서 그리고 둘 모두의 AAV.CFI 및 AAV.CFIco로부터 검출 가능한 수준으로 발현된다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 로딩하였다. 7A: 40μg의 단백질 용해물을 환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 폴리클로날 염소 항혈청으로 검출하였다. CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)로 검출된다. 이러한 밴드는 예상되는 CFI의 크기에 상응하고, 처리 과정, 즉, 중쇄 및 경쇄의 존재를 확인시켜 준다. 7B: 109gc/눈의 AAV.CFIco를 주사한 눈 또는 주사하지 않은 눈의 용해물 샘플에 대해서도 같은 양의 단백질 용해물을 로딩하였다. CFI를 CFI에 대한 마우스 모노클로날(좌측, 비-환원 겔) 및 CFI에 대한 염소 항혈청(우측, 환원 겔)으로 검출하였다. 비 환원 겔(좌측)은 주사된 동물에서 75kDa의 밴드로서 CFI를 검출하고, 주사되지 않은 눈에서 밴드는 검출되지 않는다. 환원 겔(우측)에서 CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)로 나타난다.
도 8
qPCR에 의한 유전자 발현 분석.
도 9
모의대조군(A-C), AAV.CFI(D-F) 및 AAV.CFIco(G-H) 주사된 안구에서 hCFI 국소화. 망막 섹션을 피브로넥틴(A, D 및 G) 및 hCFI(B, E 및 H)로 이중 표지하였다. 핵을 DAPI로 염색하고, 병합하여(C, F 및 I) 도시한다. Scl: 공막, RPE: 망막 색소 상피, OS: 광수용체의 외부 세그먼트, IS: 광수용체의 내부 세그먼트, OPL: 외부 얼기층, GCL: 신경절 세포층, NFL: 신경 섬유층, 배율: 20X, 눈금 막대: 50 μm.
도 10
모의대조군(A-C) 및 AAV.CFI(D-F) 주사된 안구에서 hCFI 국소화: RPE의 높은 배율. 망막 섹션을 피브로넥틴(A 및 D) 및 hCFI(B 및 E)로 이중 표지하였다. 핵을 DAPI로 염색하고, 병합하여(C 및 F) 도시한다. Scl: 공막, Bru: 브루크 막, Cho: 맥락막모세혈관층, RPE: 망막 색소 상피, IPM: 광수용체간 매트릭스. 배율: 189X, 눈금 바: 10 μm. 소포 염색은 화살표로 묘사되며, RPE 미세융모는 RPE의 아래쪽 가장자리에 별표로 묘사된다.
도 11
모의대조군(A-C) 및 AAV.CFI(D-F) 주사된 안구에서 hCFI 국소화: 광수용체 층의 높은 배율. 망막 섹션을 피브로넥틴(A 및 D) 및 hCFI(B 및 E)로 이중 표지하였다. 핵을 DAPI로 염색하고, 병합하여(C 및 F) 도시한다. IPM: 광수용체간 매트릭스, OS: 외부 세그먼트, IS: 내부 세그먼트, ONL: 외핵층. 배율: 189X, 눈금 바: 10 μm.
도 12
모의대조군(A-C) 및 AAV.CFI(D-F) 주사된 안구에서 hCFI 국소화: 외부 얼기층(OPL)의 높은 배율. 망막 섹션을 피브로넥틴(A 및 D) 및 hCFI(B 및 E)로 이중 표지하였다. 핵을 DAPI로 염색하고, 병합하여(C 및 F) 도시한다. ONL: 외핵층, INL: 내핵층. 배율: 189X, 눈금 바: 10 μm. 수평 세포 염색은 화살표로 묘사된다.
도 13
모의대조군(A-C) 및 AAV.CFI(D-F) 주사된 안구에서 hCFI 국소화: 신경절 세포층(GCL)의 높은 배율. 망막 섹션을 피브로넥틴(A 및 D) 및 hCFI(B 및 E)로 이중 표지하였다. 핵을 DAPI로 염색하고, 병합하여(C 및 F) 도시한다. IPL: 내부 얼기층, NFL: 신경 섬유층. 배율: 189X, 눈금 바: 10 μm.
도 14
모의대조군(A-C), AAV.CFI(D-F) 및 AAV.CFIco(G-H) 주사된 안구에서 hCFI 국소화. 홀마운트 망막 색소 상피를 피브로넥틴(A, D 및 G) 및 hCFI(B, E 및 H)로 이중 표지하였다. 배율: 40X, 눈금 바: 30 μm.
발명의 상세한 설명
보체 시스템
보체 시스템은 체액성 면역계의 필수적인 부분이며, 조직 염증, 세포 옵소닌화 및 세포용해에 관여한다. 이것은 미생물에 대한 보호를 제공하고, 숙주 조직으로부터 외인성 및 내인성 세포 파편의 제거를 매개한다.
보체 시스템 캐스케이드는 4개의 활성화 경로로 구성된다. 모든 경로는 궁극적으로 C3 인자의 중심 절단 및 이의 활성 단편 C3a 및 C3b의 생성으로 끝난다. C3a는 염증 세포의 동원 및 미세혈관계 투과성 증가와 같은 많은 화학주성 및 전염증 반응을 유발하는 아나필락시스독소인 반면, C3b는 C3b에 공유적으로 부착된 외래 표면의 옵소닌화를 담당한다. 활성화된 C3 단편(C3b 및 iC3b)에 의한 옵소닌화는 3가지 주요 기능을 수행한다: (i) 포식 세포(예를 들어, 대식 세포 또는 미세아교세포)에 의한 세포 파편 제거 및 적응 면역계(B 및 T 세포)의 자극; (ii) 표면-결합 된 C3 전환효소의 형성을 통한 보체 활성화의 증폭; 및 (iii) C5 전환 효소의 조립.
C5 전환효소의 조립은 C5 절단을 책임지며, 이는 세포막에 천공을 생성하여, 세포 용해 및 불필요한 세포의 제거를 촉진할 수 있는 세포용해 막 공격 복합체(MAC)를 형성한다. 이러한 모든 활성을 통해, 선천 보체 캐스케이드는 숙주 조직의 완전성을 보호하는 면역계의 다운스트림 메커니즘의 기능을 지지하고 촉진한다. 전체적으로, 보체 시스템 경로 활성화는 세포 용해를 매개하는 MAC 생성, 염증 세포를 손상 부위로 유도하는 케모카인의 방출, 및 침윤성 백혈구의 혈관밖유출을 촉진시키는 모세혈관 투과성의 향상을 포함하는 전염증 반응을 발생시킨다. 생리학적 조건하에서, 보체 활성화는 가용성 및 막-관련 보체 조절 분자(CRM)의 조정된 작용에 의해 효과적으로 제어된다. C1-억제제, 아나필락시스독소 억제제, C4b 결합 단백질(C4BP), 보체 인자 H(CFH), 보체 인자 I(CFI), 클루스테린, 및 비트로넥틴과 같은 가용성 보체 조절제는 여러 부위의 인간 조직에서 캐스케이드 반응의 보체의 작용을 제한한다. 또한, 각 개별 세포는 보체 수용체 1(CR1, CD35), 막 보조인자 단백질(CD46), 및 글리코실포스파티딜이노시톨-고정 단백질, 예를 들어, 붕괴-촉진 인자(CD55) 또는 CD59 분자와 같은 표면 단백질에 의한 동종 보체의 공격에 대해 보호된다. 주목할 점은, 보체 공격으로부터 부적절하게 보호된 숙주 세포 및 조직은 방관자 세포 용해를 겪을 수 있다는 것이다.
본 발명은 눈의 보체-매개된 장애의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 예를 들어, 보체-매개된 장애는 대체 경로 조절의 결함과 관련된 장애, 및 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 저-활성과 관련된 장애일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여 전에, 대상체는 낮은 수준(예를 들어, 정상 수준보다 낮은)의 인자 I 활성, 예를 들어, 눈에서 낮은 수준의 인자 I 활성 및/또는 낮은 혈청 수준의 인자 I 활성을 갖는다. 정상-이하 수준의 인자 I 활성은 정상-기능 인자 I의 정상-이하 발현, 또는 인자 I의 비기능성 또는 하위기능성 변이체의 적어도 부분적인(예를 들어, 이형접합)(정상 또는 정상-이하 수준의) 발현 때문일 수 있다. (그러한 대상체는 AMD-관련 SNP의 하나 이상의 복사체를 가질 수 있는데, 예를 들어, 대상체는 하기에 더 상세히 논의되는 희귀 인자 I 변이체 중 하나에 대한 동종- 또는 이형접합체일 수 있다). 따라서, 대상체는 눈 및/또는 혈청에서 낮은 농도(예를 들어, 정상 농도보다 낮은)의 인자 I를 가질 수 있다. 인간 대상체의 경우, 정상 수준의 인자 I 활성(C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성)은 대상체의 혈청에서 30-40 μg/mL의 인자 I에 의해 제공되는 것과 동등할 수 있다. 따라서, 낮은 인자 I 활성을 갖는 대상체에서, 혈청 중 인자 I 활성은 30 μg/mL 미만 및 0 μg/mL 초과의 인자 I, 예를 들어, 0-20 또는 0-10 μg/mL에 상응할 수 있다(이들은 낮은 인자 I 농도를 갖는 대상체를 포함할 수 있는 인자 I 혈청 농도의 범위이다).
따라서, 본 발명에 의해 치료되는 대상체는 AMD, 더욱 특히 건성 AMD(예를 들어, 지도모양 위축을 특징으로 함)와 같은 눈의 보체-매개된 장애로 고통받을 수 있거나, 그러한 장애가 발병할 위험이 있을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 보체-매개된 장애와 관련된 하나 이상의 SNP에 대해 감수성이 있는 동형접합체 또는 이형접합체일 수 있다.
한 구체예에서, 대상체는 AMD의 발병 위험이 있다. 예를 들어, 대상체는 AMD와 관련된 하나 이상의 SNP, 예를 들어, 일반적으로 혈청 인자 I 수준을 감소시키는 진행된 AMD와 관련된 인자 I의 희귀 돌연변이에 대해 감수성이 있는 동형접합체 또는 이형접합체일 수 있다(Kavanagh et al., Hum Mol Genet. 2015 Jul 1;24(13):3861-70). 특히 대상체는 하기 희귀 인자 I 변이체 중 하나 이상의 1개 또는 2개의 복사체를 지닐 수 있다: rs144082872(P50A 인코딩); 4:110687847(P64L 인코딩); rs141853578(G119R 인코딩); 4:110685721(V152M 인코딩); 4:110682846(G162D 인코딩); 4:110682801(N177I 인코딩); rs146444258(A240G 인코딩); rs182078921(G287R 인코딩); rs41278047(K441R 인코딩); rs121964913(R474 인코딩).
본 발명은 대상체가 보체-매개된 장애(예를 들어, AMD)의 발병 위험이 있는 지를, 예를 들어, 대상체가 보체-매개된 장애와 관련된 하나 이상의 SNP에 감수성이 있는 동형접합체 또는 이형접합체인지 여부를 결정함으로써(예를 들어, 대상체가 상기 열거된 AMD와 관련된 희귀 인자 I 변이체 중 하나 이상에 감수성이 있는 동형접합체인지 이형접합체인 지를 결정함으로써), 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로, 대상체는, 예를 들어, 눈 및/또는 혈청에서 정상 수준의 내인성 인자 I 활성 또는 농도를 지닐 수 있고/거나 희귀 변이체 인자 I 대립유전자를 보유하지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 이로써 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 이로써 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 눈에서의 정상 수준을 초과하는 수준까지 증가시킨다. 보다 특히, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 눈의 RPE에서 증가한다.
본 발명의 AAV 벡터로부터의 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현 후 대상체에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 대상체의 내인성 인자 I로부터의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성(즉, AAV 벡터로부터의 발현에 의해 생산되지 않은 대상체의 인자 I), 및 본 발명의 AAV 벡터로부터의 발현에 의해 생산된 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 포함할 수 있어, 대상체에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 총 수준은 정상 수준을 초과한다.
한 구체예에서, 대상체에서, 예를 들어, 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 더 높은 수준으로 증가한다.
또 다른 구체예에서, 대상체에서, 예를 들어, 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준의 2배 이하, 또는 정상 수준보다 최대 80%, 60%, 40% 또는 20% 더 높은 수준으로 증가한다.
예를 들어, 대상체에서, 예를 들어, 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준보다 5-100%, 5-80%, 5-60%, 5-40%, 5-20%, 10-100%, 10-80%, 10-60%, 10-40%, 10-20%, 15-100%, 15-80%, 15-60%, 15-40%, 15-20%, 20-100%, 20-80%, 20-60%, 20-40%, 25-100%, 25-80%, 25-60% 또는 25-40% 더 높은 수준으로 증가할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 검출 가능하게 증가시키지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 정상 수준보다 높은 수준으로 검출 가능하게 증가시키지 않는다.
상기 섹션에서, 명백히 적용할 수 없는 경우를 제외하고, 인자 I 및 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성에 대한 언급은 인자 H 및 C3b의 인자 I 매개된 절단을 위한 보조인자로서 작용하고 C3 전환효소와 C5 전환효소의 해리 속도를 각각 증가시키는 능력으로 대체될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여 전에, 대상체는 낮은 수준(예를 들어, 정상 수준보다 낮은)의 인자 H, 예를 들어, 눈에서 낮은 수준의 인자 H 및/또는 낮은 혈청 수준의 인자 H를 갖는다. 인간 대상체의 경우, 인자 H의 정상 수준은 대상체의 혈청에서 약 200-500 μg/mL일 수 있다. 따라서, 낮은 수준의 인자 H를 갖는 대상체에서, 혈청에서의 수준은 200 μg/mL 미만 및 0 μg/mL 초과, 예를 들어, 0-100 μg/mL일 수 있다. 대안적으로, 대상체는, 예를 들어, 눈 및/또는 혈청에서, 정상 수준의 내인성 인자 H를 가질 수 있다.
인자 I
C3b/C4b 불활성화제로도 알려진 보체 인자 I(인자 I, CFI)는 인간에서 CFI 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다.
인자 I은 약 35 μg/mL의 농도로(Nilsson et al; Mol Immunol 2011 , 48 (14): 1611-1620) 효소원-유사 상태로 순환하는(Roversi et al., PNAS; 2011; 108 (31): 12839-12844) 세린 프로테아제이다. 인자 I 단백질은 단일 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 과도하게 N-당화된 헤테로다이머이다. 중쇄(50 kDa)는 N-말단 영역; FI 막 공격 복합체(FIMAC) 도메인; CD5 유사-도메인 또는 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인; 2개의 저밀도 지단백질 수용체(LDLr) 도메인; 및 종을 가로지르는 서열 다양성의 부위인 알려지지 않은 기능의 C-말단 영역을 포함한다(Roversi et al.; 상기와 같음). 경쇄(38 kDa)는 보존된 촉매적 잔기를 갖는 세린 프로테아제(SP) 도메인을 함유한다(Goldberger et al, J Biol Chem 1987, 262 (21): 10065-10071).
인자 I는 C3b를 iC3b, C3d 및 C3d,g로 절단함으로써 이를 불활성화시키고, 유사한 방식으로, C4b를 C4c 및 C4d로 절단한다. 인자 I은 이의 기능을 적절하게 수행하기 위해 C4b-결합 단백질(C4BP), 보체 인자 H(CFH), 보체 수용체 1(CR1/CD35) 및 막 보조인자 단백질(MCP/CD46)과 같은 보조인자 단백질의 존재를 필요로 한다(Degn et al.; Am J Hum Genet 2011, 88(6):689-705).
iC3b는 인자 B와 결합할 수 없으므로, 대체 경로를 통한 보체 캐스케이드의 증폭 또는 활성화를 영속시킬 수 없다. 따라서, 일단 C3b가 iC3b로 절단되면, 대체 경로 개시는 물론 말단 보체 캐스케이드 활성화도 일어나지 않는다.
iC3b는 다형핵 백혈구(주로 호중구), NK 세포, 및 대식세포와 같은 단핵구 식세포에서 보체 수용체 3(CR3)(CD11b/CD18)에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 전염증성 작용을 제공할 수 있다.
인자 I은 보조인자인 CR1을 필요로 하는 프로테아제 활성을 통해 iC3b를 C3d,g로 처리할 수 있다. C3d,g는 CR3에 결합할 수 없다. 보체 수용체 CR3와 반응하는 iC3b는 보체 활성화가 염증을 일으키는 주요 메커니즘이므로, iC3b의 C3d,g로의 분해는 보체-유도된 염증을 감소시키는데 필수적이다(Lachmann (2009), Adv. Immunol., 104:115-149).
C3b의 iC3b로의 절단을 촉진하고 또한 iC3b의 분해를 가속시키는 인자 I의 독특한 능력은 -치료 효능을 위해 전달되어야 하는 양에 대한 시사와 함께, 인간 혈청에서 이의 상대적으로 낮은 농도와 조합하여- 이것을 특히 유리한 표적으로 만든다.
한 구체예에서, 인자 I 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b를 불활성 분해 생성물로 절단할 수 있다. 예를 들어, 인자 I 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b를 iC3b로 절단할 수 있다.
한 구체예에서, 인자 I 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 iC3b를 불활성 분해 생성물로 절단할 수 있다. 예를 들어, 인자 I 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 iC3b를 C3d,g로 절단할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 인자 I 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b를 iC3b로 절단하고 iC3b를 C3d,g로 처리할 수 있다.
인자 I의 단편 또는 유도체는 천연 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유할 수 있다. 인자 I의 단편 또는 유도체, 및 천연 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 인자 I의 단백질분해 활성의 측정은 문헌[Hsiung et al. (Biochem. J. (1982) 203, 293-298)]에 기재되어 있다. FI 활성에 대한 용혈 및 교착 검정 둘 모두는 문헌[Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) "Complement Technology" in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17]에 기재되어 있다. 단백질분해 검정을 또한 포함하는 더 자세한 설명은 문헌[Harrison RA(1996) in "Weir's Handbook of Experimental Immunology" 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A'Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37]에서 제공된다. 교착 검정은 매우 민감하며, 고정된 C3b를 iC3b로 전환시키고 교착소와의 반응성을 획득하는 둘 모두의 제1 (이중) 클립을 검출하고; 고정된 iC3b로 시작하여 교착소와의 반응성 손실을 찾아서 C3dg에 대한 최종 클립을 검출하는데 사용될 수 있다. 용혈 검정은 C3b에서 iC3b로의 전환에 사용되며, 단백질분해 검정은 모든 클립을 검출한다.
한 구체예에서, 인자 I은 인간 인자 I이다.
예시적인 인간 인자 I 단백질은 UniProtKB 수탁 번호 P05156을 갖는 인간 인자 I 단백질이다. 이러한 예시된 서열은 583개 아미노산 길이이며(SEQ ID NO: 1로서 나타냄), 이의 아미노산 1 내지 18은 신호 서열을 형성한다.
한 구체예에서, 인자 I의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 나타낸 서열이다. 한 구체예에서, 인자 I의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 19 내지 583으로 나타낸 서열이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
한 구체예에서, 인자 I의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 나타낸 서열이며, 이는 NCBI 수탁 번호 NP_000195에 상응한다. 한 구체예에서, 인자 I의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9의 위치 19 내지 583으로 나타낸 서열이다.
Figure pct00003
인자 I를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는 NCBI 수탁 번호 NM_000204를 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 한 구체예에서, 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000204를 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
한 구체예에서, 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2로 나타낸 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명에서 사용된 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 종래에 WO 1999/041397호 및 WO 2001/079518호에 기재되었다. 상이한 세포는 특정 코돈의 사용법이 다르다. 이러한 코돈 편차는 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 존재량(abundance)의 편차에 해당한다. 서열의 코돈을 변경시켜 이들이 상응하는 tRNA의 상대적 존재량과 일치하도록 맞춤으로써, 발현을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 특정 세포 유형에서 상응하는 tRNA가 희박하다고 알려진 코돈을 고의적으로 선택함으로써 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 번역 정도의 추가적인 제어가 가능하다.
한 구체예에서, 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8로 나타낸 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00006
인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 8과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 9로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 8의 위치 55 내지 1752로 나타낸 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 9로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 9와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 9로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 9의 위치 19 내지 583으로 나타낸 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 9로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
본 발명의 이점은 인자 I이 정제된 단백질의 형태로 제조되기가 특히 어렵다는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 인자 I-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터의 형태로 인자 I를 투여함으로써, 보체 시스템을 조절하고, 예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료할 수 있는 방법을 고안하였다. AAV 벡터는 인자 I 폴리펩티드의 동일계내(in situ) 번역을 가능하게 하기 위해, 예를 들어, 눈과 같은 관심 부위에 투여될 수 있다.
인자 H
보체 인자 H(인자 H, CFH)는 보체 제어 단백질이다.
이것은 200-300 μg/mL의 전형적인 농도로 인간 혈장에 존재하는 큰(155 kDa) 가용성 당단백질이다(Hakobyan et al., 2008; 49 (5): 1983-90). 인자 H의 주요 기능은 보체 시스템의 대체 경로를 조절하는 것이다.
인자 H는 C3b의 인자 I-매개된 절단을 위한 보조인자 활성을 제공한다. 인자 H는 또한 C3bBb 복합체(C3 전환효소) 및 (C3b)NBB 복합체(C5 전환효소)의 해리 속도를 증가시켜 대체 보체 경로의 활성을 감소시킨다.
인자 H는 짧은 링커(3개 내지 8개 아미노산 잔기의)에 의해 서로 연결되고 연장된 헤드 투 테일 형식으로 배열된 20개의 보체 제어 단백질(CCP) 모듈(짧은 컨센서스 반복부 또는 sushi 도메인으로도 지칭됨)로 구성된다. 각각의 CCP 모듈은 4개의 시스테인 잔기가 1-3 2-4 배열로 디설파이드 결합된 약 60개 아미노산, 및 거의 불변의 트립토판 잔기 주위로 구축된 소수성 코어로 구성된다. CCP 모듈은 1-20으로 넘버링된다(단백질의 N-말단으로부터). CCP 1-4 및 CCP 19-20은 C3b와 맞물리는 한편 CCP 7 및 CCP 19-20은 GAG 및 시알산에 결합한다(Schmidt et al; 2008; Journal of Immunology 181 (4): 2610-9).
인자 H를 이용한 유전자 요법은 마우스에서 유도된 AMD-유사 병리를 개선시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다(Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243). 마우스에 (i) 인간 AMD의 많은 병리학적 특징의 개요를 반복하는 것으로 종래에 밝혀진, 보체 성분 C3을 발현하는 아데노바이러스 벡터; 및 (ii) 인자 H를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 망막하로 공동-주사하였다. 인자 H 대신 GFP를 투여받은 대조 동물과 비교하여, 인자 H-형질도입된 마우스는 내피 세포 증식의 91% 감소 및 RPE 위축의 69% 감쇠를 나타내었다. 망막전위도검사는 인자 H를 투여받은 마우스에서 개선된 망막 기능을 나타내었고, 로돕신 및 RPE65의 면역세포화학은 그러한 동물에서 광수용체 및 RPE의 구제(rescue)와 일치하였다.
한 구체예에서, 인자 H 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b의 인자 I-매개된 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 한 구체예에서, 인자 H 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시킬 수 있다.
바람직한 구체예에서, 인자 H 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b의 인자 I-매개된 절단을 위한 보조인자로서 작용하고 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시킬 수 있다.
한 구체예에서, 인자 H는 인간 인자 H이다.
예시적인 인간 인자 H 단백질은 UniProtKB 수탁 번호 P08603을 갖는 인간 인자 H 단백질이다. 이러한 예시된 서열은 1231개 아미노산 길이이며(SEQ ID NO: 3으로서 나타냄), 이의 아미노산 1 내지 18은 신호 서열을 형성한다.
한 구체예에서, 인자 H의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 나타낸 서열이다. 한 구체예에서, 인자 H의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3의 위치 19 내지 1231로 나타낸 서열이다.
Figure pct00007
인자 H를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는 NCBI 수탁 번호 NM_000186을 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 한 구체예에서, 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000186을 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
한 구체예에서, 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4로 나타낸 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 4와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 4의 위치 55 내지 3696으로 나타낸 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
본 발명의 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
본 발명의 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 3의 위치 19 내지 1231로 나타낸 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
인자 D
보체 인자 D(인자 D, CFD)는 보체 시스템의 대체 보체 경로에 관여한다. 이것은 인자 B를 인자 Bb와 Ba로 절단하는 기능을 한다.
인자 D는 펩티다제의 트립신 패밀리의 구성원이다. 세린 프로테아제의 키모트립신 패밀리의 모든 구성원은 매우 유사한 구조를 갖는다. 인자 D를 포함하는 모든 경우에, 2개의 역평행 β-배럴 도메인이 존재하며, 각 배럴은 모든 효소에서 동일한 유형을 가진 6개의 β-가닥을 함유한다. 인자 D와 키모트립신 패밀리의 다른 세린 프로테아제 간의 백본 구조에서의 주요 차이는 이차 구조적 요소를 연결하는 표면 루프에 있다.
대체 보체 활성화 캐스케이드는 혈장에 풍부한 C3의 자발적 가수분해에 의해 개시된다. "틱오버(tickover)"는 C3의 티오에스테르 결합의 자발적 절단을 통해 발생하여 C3(H2O)를 형성한다.
이러한 형태의 변화는 혈장 단백질 인자 B의 결합을 허용하며, 이는 인자 D가 인자 B를 Ba 및 Bb로 절단하도록 한다. Bb는 C3(H2O)Bb를 형성하기 위해 C3(H2O)의 일부로 남아 있다. 이러한 복합체는 또한 유체상 C3-전환효소로도 알려져 있다. 이러한 전환효소는 단지 소량으로 생산되지만 다수의 C3 단백질을 C3a 및 C3b로 절단할 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 항-인자 D 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
항-인자 D 항체는 인자 D에 결합하여 인자 D의 기능적 활성을 감소시키거나 저지할 수 있다. 예를 들어, 항-인자 D 항체는 인자 B에 대한 인자 D 결합 및/또는 인자 B의 인자 D 절단을 감소시키거나 저지할 수 있다.
적합한 항-인자 D 항체는 당 분야에 공지되어 있다. 그러한 항체는 람팔리주맙(lampalizumab)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
보체 성분 5
보체 성분 5(C5)는 염증 및 세포 사멸 과정에서 중요한 역할을 하는 보체의 다섯 번째 성분이다. C5는 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 알파 및 베타 폴리펩티드 사슬로 구성된다.
C5는 프로테아제 C5-전환효소에 의해 보체 성분 5a(C5a) 및 C5b 단편으로 절단된다. C5b는 보체 캐스케이드의 후기 사건에서 중요한 반면, C5a는 고도의 염증 펩티드로서 작용한다. C5의 기원은 일반적으로 간세포이지만 이의 합성은 또한 대식세포에서 발견될 수 있고 이것은 C5a의 국소적인 증가를 초래할 수 있다. C5a는 화학주성 및 아나필락시스독성 성질을 가지며, 이것은 선천 면역에 필수적이지만 또한 적응 면역과도 관련이 있다. C5a의 생산 증가는 다수의 염증성 질환과 관련이 있다.
C5a는 아나필락시스독소이며, 내피에서 부착 분자의 발현 증가, 평활근의 수축, 및 혈관 투과성 증가를 초래한다. C5a des-Arg(C-말단 아르기닌이 없음)은 훨씬 덜 강력한 아나필락시스독소이다. C5a 및 C5a des-Arg 둘 모두는 비만 세포 탈과립화를 일으켜, 전염증성 분자 히스타민 및 TNF-α를 방출시킬 수 있다. C5a는 또한 효과적인 화학유인물질이며, 감염 부위에서 보체 및 포식 세포의 축적 또는 림프절로 항원-제시 세포의 동원을 개시한다. C5a는 호중구 및 단핵구의 혈관벽으로의 이동 및 부착을 증가시키는데 중요한 역할을 한다. 백혈구는 인테그린 결합력, 리폭시게나제 경로 및 아라키돈산 대사의 상향조절에 의해 활성화된다. C5a는 또한 백혈구에서 억제성 IgG Fc 수용체에 대한 활성화 사이의 균형을 조절하여, 자가면역 반응을 향상시킨다.
본 발명의 AAV 벡터는 항-C5 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
항-C5 항체는 C5에 결합하여 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 방지할 수 있다.
적합한 항-C5 항체는 당 분야에 공지되어 있다. 그러한 항체는 에쿨리주맙(eculizumab)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항체
항체는 부모 항체와 동일한 항원 표적에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 임의의 부분 또는 이의 단편을 지칭한다.
항체는 키메라 항체일 수 있다. 키메라 항체는 한 종(예를 들어, 마우스)으로부터의 항체 가변 도메인을 다른 종(예를 들어, 인간)으로부터의 항체 불변 도메인에 이식함으로써 생산될 수 있다.
항체는 전장의 고전적 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 IgG, IgM 또는 IgA 분자일 수 있다.
항체는 기능성 항체 단편일 수 있다. 특정 항체 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (iv) 단일 가변 도메인으로 구성된 dAb 단편, (v) 분리된 CDR 영역, (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편, (vii) 단일쇄 Fv 분자(scFv), 이 때 VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결된다, (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 다이머, 및 (ix) "디아보디" 또는 "트리아보디", 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지의 혼입에 의해 안정화될 수 있다.
본원에 기술된 항체는 다중특이적 항체, 및 때로 "디아보디"라고도 지칭되는, 특히 이중특이적 항체일 수 있다. 이들은 2개(이상)의 상이한 항원에 결합하는 항체이다. 항체는 미니보디일 수 있다. 미니보디는 CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 최소 항체-유사 단백질이다. 일부 경우에, scFv는 Fc 영역에 결합될 수 있고, 힌지 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
항체는 도메인 항체(또한 단일-도메인 항체 또는 나노보디로서 지칭됨)일 수 있다. 이것은 단일 모노머 단일 가변 항체 도메인을 함유하는 항체 단편이다. 단일-도메인 항체의 예는 원래 낙타과에서 발견되는 VHH 단편 및 원래 연골 어류에서 발견되는 VNAR 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단일-도메인 항체는 또한 일반적인 IgG 분자로부터의 다이머 가변 도메인을 모노머로 분할함으로써 생성될 수 있다.
항체는 합성 항체(또한 항체 모방체로서 지칭됨)일 수 있다. 항체 모방체는 애피보디, DARPin, 안티칼린(Anticalin), 애비머(Avimer), 베르사보디(Versabody) 및 듀오칼린(Duocalin)을 포함하나, 이제 제한되지 않는다.
연령-관련 황반 변성(AMD)
AMD의 임상 진행은 황반의 변화에 따라 단계별로 특성화된다. 초기 AMD의 특징은 세포외 파편이 망막 아래에 축적되어 임상 시험 및 안저 사진에서 망막의 황색 반점으로 보이기 시작하는 드루젠이다. 드루젠은 크기에 의해 소형(<63 μm), 중간(63-124 μm) 및 대형(>124 μm)으로 분류된다. 이들은 또한 안과 검사에서 이들의 가장자리의 모양에 따라 경질 또는 연질로 간주된다. 경질 드루젠은 명확하게 한정된 가장자리를 갖는 반면, 연질 드루젠은 덜 한정된 유체 가장자리를 갖는다. 연령-관련 안질환 연구(AREDS) 안저 사진의 중증도 척도는 이 병태에 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
AMD는 "건성"및 "습성"(삼출성, 또는 신생혈관) 형태로 분류된다. 건성 AMD는 습성 AMD보다 일반적이지만, 건성 형태는 습성 형태로 진행될 수 있으며, 둘은 상당수의 경우에 동시에 발생한다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층, 위에 있는 광수용체 세포, 및 종종 또한 맥락막 모세관 층의 밑에 있는 세포에서 세포의 진행성 아폽토시스를 특징으로 한다. 위에 있는 광수용체 위축을 수반하는 RPE 세포 사멸의 컨플루언트 영역을 지도모양 위축(GA)이라고 한다. 이러한 형태의 AMD를 가진 환자는 중심 시력의 느리고 점진적인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 시력의 갑작스런 무능력 상실의 원인이 될 수 있는, RPE 및 황반 아래에 있는 맥락막 혈관(맥락막모세혈관층)에서 성장한 비정상적인 혈관으로부터의 출혈 및/또는 유체 누출을 특징으로 한다. 환자가 경험하는 시력 상실의 많은 부분은 그러한 맥락막 신생혈관형성(CNV) 및 이의 이차 합병증 때문인 것으로 추정되어 왔다.
본원에 기술된 AMD의 치료 또는 예방은 상기 설명된 AMD 표현형의 출현을 감소시키거나 방지할 수 있다. 바람직하게, AMD의 치료는 시각 기능의 유지 또는 개선을 가능하게 한다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축의 형성을 예방 또는 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축의 진행을 늦춘다. 예를 들어, 대상체의 치료되는 눈에 투여한 지 12개월 동안 GA 면적의 증가는 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소한다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축의 치료, 예를 들어, 지도모양 위축의 양을 감소시킨다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 드루젠 형성을 예방 또는 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존의 드루젠의 감소, 예를 들어, 기존의 드루젠의 크기 및/또는 수의 감소를 발생시킨다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 보체 침착을 예방 또는 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존의 보체 침착을 감소시킨다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 시야 또는 시력의 개선 또는 회복을 가져온다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 시야 또는 시력의 상실을 완화시킨다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 개선 또는 회복을 가져온다. 또 다른 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 감소를 완화시킨다.
한 구체예에서, AMD의 치료 또는 예방은 광수용체 및/또는 망막 색소 상피(RPE)의 손실을 감소 또는 예방한다.
당뇨 망막병증
당뇨 망막병증은 당뇨병과 관련된 높은 혈당 수준에 의해 초래된, 망막 혈관의 손상을 특징으로 하는 병태이다. 치료하지 않은 채로 두면, 당뇨 망막병증은 시각상실을 초래할 수 있다.
경증 당뇨 망막병증이 있는 대상체는 좋은 시력을 가질 수 있지만, 당뇨 망막병증의 두 유형, 즉, 당뇨 황반 부종(DMO) 및 증식성 당뇨 망막병증(PDR)은 대상체의 시력을 위협할 수 있다.
당뇨 황반 부종은 눈 뒤쪽의 손상된 혈관에서 유체가 새어 나오는 특징이 있다. 누출된 유체는 황반에 축적되며, 이는 종창 및 흐린 시력을 발생시킨다. 이것은 결국 불량한 중심 시력을 발생시켜 읽거나 운전할 수 없게 만들 수 있다. 측면 시력은 보통 정상적으로 유지된다.
증식성 당뇨 망막병증은 망막 혈관이 폐쇄되어, 망막 표면에 비정상적인 취약한 혈관의 성장으로 이어지는 특징이 있다. 이는 눈으로의 출혈, 흉터 및 망막 박리로 인해 영구적 시력 상실을 발생시킬 수 있다.
눈의 구조
본원에 설명된 약제는 연령-관련 황반 변성(AMD)의 치료 또는 예방과 관련하여 포유동물, 바람직하게는 인간의 눈에 전달될 수 있다.
눈의 질병을 치료하는데 숙련된 사람은 눈의 구조를 자세하고 철저하게 이해할 것이다. 그러나, 본 발명에 특히 적절한 다음의 구조가 설명된다.
망막
망막은 눈의 내부 후방을 감싸고 시신경을 통해 뇌에 전해지는 시각적 세계의 이미지를 감지하는 다층 막이다. 눈의 내부에서 외부의 순으로, 망막은 망막 색소 상피의 외부에 있는 맥락막과 함께, 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 층을 포함한다.
감각신경 망막 및 광수용체 세포
감각신경 망막은 빛을 직접 감지하는 광수용체 세포를 감싸고 있다. 이것은 다음의 층들을 포함한다: 내경계막(ILM); 신경 섬유층; 신경절 세포층; 내부 얼기층; 내핵층; 외부 얼기층; 외핵층(광수용체의 핵); 외경계막(ELM); 및 광수용체(간상 및 원추상의 내부 및 외부 세그먼트)를 포함한다.
당업자는 광수용체 세포에 대해 자세히 이해하고 있을 것이다. 간단히 말하면, 광수용체 세포는 빛을 생물학적 신호로 변환시키는 망막에 위치한 특수화된 뉴런이다. 광수용체 세포는 망막을 가로질러 상이하게 분포된 간상 및 원추상 세포를 포함한다.
간상 세포는 주로 망막의 바깥 부분에 걸쳐 분포되어 있다. 이들은 매우 민감하고 저조도에서 시력을 제공한다. 정상적인 인간의 망막에는 평균 약 1억 2500만 개의 간상 세포가 존재한다.
원추상 세포는 망막에 걸쳐 발견되지만, 중심 고해상도 시력을 담당하는 감각신경 망막의 오목부인 중심와에 특히 고도로 집중되어 있다. 원추상 세포는 간상 세포보다 덜 민감하다. 정상적인 인간의 망막에는 평균 약 6-700만 개의 원추상 세포가 존재한다.
망막 색소 상피
망막 색소 상피(RPE)는 감각신경 망막의 바로 바깥쪽에 위치한 세포의 색소 층이다. RPE는 광수용체 세포에 영양분 및 다른 물질의 전달, 및 시력을 개선시키기 위해 산란된 빛의 흡수를 포함하는 많은 기능을 수행한다.
맥락막
맥락막은 RPE와 눈의 외부 공막 사이에 위치한 혈관 층이다. 맥락막의 혈관계는 산소와 영양분을 망막에 공급할 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터
한 측면에서, 본 발명은 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체, 및/또는 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공한다.
바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 입자의 형태이다.
바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, AAV로부터 유래되는 것들을 제조하고 변형시키는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
AAV 게놈은 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 AAV 입자의 생산에 필요한 기능을 인코딩한다. 이러한 기능은 AAV 게놈을 AAV 입자로 캡시드화하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작용하는 것들을 포함한다. 자연 발생 AAV는 복제-결핍성이며 복제 및 패키징 사이클을 완료하기 위해 인 트랜스(in trans) 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터의 AAV 게놈은 전형적으로 복제-결핍성이다.
AAV 게놈은 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태이거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계를 우회할 수 있게 하므로, 트랜스진 발현을 가속시킬 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연적으로 유래된 혈청형, 분리물 또는 클레드(clade)로부터 비롯될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생 AAV의 완전한 게놈일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.
일반적으로, AAV는 이들의 혈청형에 관하여 지칭된다. 혈청형은 AAV의 변이체 아종에 상응하는데, 이는 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일 때문에, 다른 변이체 아종으로부터 이를 구별하는데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 가지고 있다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차-반응하지 않는다.
AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌에서 확인된 Rec2 및 Rec3과 같은 재조합 혈청형을 포함한다. 이러한 임의의 AAV 혈청형은 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV 벡터 입자이다.
한 구체예에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
한 구체예에서, AAV는 AAV2 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
캡시드 단백질은 본원에 참조로서 포함되는 WO 2008/124724호에 개시된 바와 같은 돌연변이 캡시드 단백질일 수 있다.
한 구체예에서, AAV 벡터는 Y733F 돌연변이를 갖는 AAV8 캡시드를 포함한다.
AAV 혈청형에 대한 검토는 문헌[Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 and Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 게놈 또는 AAV 게놈의 요소의 서열은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 하기 수탁 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-관련 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-관련 바이러스 2 NC_001401; 아데노-관련 바이러스 3 NC_001729; 아데노-관련 바이러스 3B NC_001863; 아데노-관련 바이러스 4 NC_001829; 아데노-관련 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-관련 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.
AAV는 또한 클레드 또는 클론에 관하여 지칭될 수 있다. 이것은 자연적으로 유래된 AAV의 계통발생학적 관계를 지칭하며, 전형적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 지칭하고, 이의 모든 자손을 포함한다. 추가로, AAV는 특정 분리물, 즉, 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물에 관하여 지칭될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 자연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪은 AAV의 집단을 기술함으로써 유전적 수준에서 인지 가능한 별개의 집단을 정의한다.
당업자는 이들의 공통된 일반적인 지식에 기초하여 본 발명에 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전된 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 증명된 바와 같이 영장류 원추상 광수용체를 효율적으로 형질도입하는 것으로 나타났다(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).
AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염의 조직 특이성(또는 친화성)을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에서 사용하기에 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내 표적 세포에 대한 자연 친화성 또는 높은 감염 효율을 갖는 것들이다. 한 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 형질도입한 것들이다.
전형적으로, AAV의 자연적으로 유래된 혈청형, 분리물 또는 클레드의 AAV 게놈은 적어도 하나의 역전된 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 시스로(in cis)로 작용하여 복제의 기능적 기점을 제공하고 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절제를 허용한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 ITR 서열은 인자 I 및/또는 인자 H(또는 이의 단편 또는 유도체)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 있다. AAV 게놈은 전형적으로 AAV 입자에 대한 패키징 기능을 인코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자와 같은 패키징 유전자를 또한 포함한다. Rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이의 변이체 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 VP1, VP2 및 VP3 또는 이의 변이체와 같은 하나 이상의 캡시드 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기에 논의되어 있다.
프로모터는 각각의 패키징 유전자에 작동가능하게 연결될 것이다. 그러한 프로모터의 구체적인 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 일반적으로 rep 유전자를 발현하는데 사용되는 반면, p40 프로모터는 일반적으로 cap 유전자를 발현하는데 사용된다.
상기 논의한 바와 같이, 따라서, 본 발명의 AAV 벡터에서 사용되는 AAV 게놈은 자연 발생 AAV의 완전한 게놈일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터는 시험관내 AAV 벡터 또는 벡터 입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 그러한 벡터는 환자에게 투여될 수 있지만, 실제로는 거의 수행되지 않을 것이다. 바람직하게는, AAV 게놈은 환자에게 투여하기 위해 유도체화될 것이다. 그러한 유도체화는 당 분야에서 표준적인 것이며, 본 발명은 AAV 게놈의 임의의 공지된 유도체, 및 당 분야에 공지된 기술을 적용하여 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 게놈 및 AAV 캡시드의 유도체화는 상기 언급된 문헌[Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, and in Choi et al. and Wu et al.]에서 검토된다.
AAV 게놈의 유도체는 본 발명의 AAV 벡터로부터 트랜스진의 생체내 발현을 가능하게 하는 AAV 게놈의 임의의 트렁케이션되거나 변형된 형태를 포함한다. 전형적으로, AAV 게놈을 트렁케이션하여 상기 기능을 여전히 보유한 최소의 바이러스 서열을 현저하게 포함하는 것이 가능하다. 이것은 야생형 바이러스와 벡터의 재조합 위험을 감소시키고, 또한 표적 세포에서 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의해 세포의 면역 반응이 유발되는 것을 피하기 위해 안전상의 이유로 바람직하다.
전형적으로, 유도체는 적어도 하나의 역전된 말단 반복부 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예를 들어, 2개 이상의 ITR을 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs(말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이러한 결실은 코딩 및 상보적인 서열 둘 모두를 포함하는 단일-가닥 게놈, 즉, 자기-보완적 AAV 게놈을 생성하기 위해 게놈의 계속적인 복제를 허용한다. 이것은 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 허용하므로, 가속된 트랜스진 발현을 가능하게 한다.
하나 이상의 ITR은 바람직하게는 어느 한쪽 말단에서 인자 I 및/또는 인자 H(또는 이의 단편 또는 유도체)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 있을 것이다. 하나 이상의 ITR을 포함시키는 것은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일-가닥 벡터 DNA를 이중-가닥 DNA로 전환시킨 후, 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 연쇄체(concatamer) 형성을 돕기 위해 바람직하다. 그러한 에피솜 연쇄체의 형성은 숙주 세포의 수명 동안 벡터 작제물을 보호함으로써, 생체내 트랜스진의 연장된 발현을 허용한다.
바람직한 구체예에서, ITR 요소는 유도체 내의 천연 AAV 게놈으로부터 유지된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 천연 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 천연 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기술된 이유, 및 또한 벡터의 숙주 세포 게놈으로의 통합 가능성을 감소시키기 위해 바람직하다. 추가로, AAV 게놈의 크기를 감소시키는 것은 벡터 내에 트랜스진 외에 다른 서열 요소(예를 들어, 조절 요소)를 통합할 때 유연성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 다음 부분은 본 발명의 유도체에서 제거될 수 있다: 하나의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 구체예에서, 유도체는 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 게놈의 다른 바이러스 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 자연 발생 AAV는 인간 염색체 19의 특정 부위에 높은 빈도로 통합되며, 벡터에서의 통합 용량의 유지가 치료 환경에서 용인될 수 있도록 하는 무시할 수 있는 빈도의 무작위 통합을 보여준다.
유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 자연 발생 AAV의 키메라, 셔플(shuffled) 또는 캡시드-변형 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일한 벡터(즉, 슈도형 벡터) 내에 AAV의 상이한 혈청형, 클레드, 클론, 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.
키메라, 셔플 또는 캡시드-변형된 유도체는 전형적으로 AAV 벡터에 대해 하나 이상의 요망되는 기능을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이러한 유도체는 자연 발생 AAV 게놈을 포함하는 AAV 벡터, 예를 들어, AAV2의 것과 비교하여, 유전자 전달의 효율 증가, 면역원성(체액성 또는 세포성) 감소, 변경된 친화성 범위 및/또는 특정 세포 유형의 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 효율 증가는 세포 표면에서 개선된 수용체 또는 공-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내 및 핵으로의 트래피킹 개선, 바이러스 입자의 비코팅 개선 및 단일-가닥 게놈에서 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 영향을 받을 수 있다. 증가된 효율은 또한 필요하지 않은 조직으로의 투여에 의해 벡터 용량이 희석되지 않도록, 변경된 친화성 범위 또는 특정 세포 집단의 표적화와 관련될 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 생성된 것들을 포함한다. 이것은, 예를 들어, 한 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열로 동시-트랜스펙션되고, 지시된 선택이 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하는데 사용되는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 세포 내의 상동성 재조합에 의해 변경되어, 새로운 키메라 캡시드 단백질을 생산할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어, 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이의 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 수송하기 위한 캡시드 단백질 서열의 공학처리에 의해 생성된 것들을 포함한다.
셔플 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 에러-프론(error-prone) PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련 AAV 유전자의 서열, 예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 인코딩하는 것들을 무작위 단편화한 다음 후속하여 단편을 자가-프라이밍 중합효소 반응으로 재조립함으로써 생성될 수 있고, 이들은 또한 서열 상동성의 영역에서 교차를 일으킬 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링하여 이러한 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 요망되는 기능을 갖는 바이러스 클론을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 에러 프론 PCR은 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시켜 이후 요망되는 특성에 대해 선택될 수 있는 변이체의 다양한 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한 천연 야생형 서열에 대해 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 개방 해독틀 내에서, 또는 캡시드 코딩 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 비관련 단백질 또는 펩티드의 서열 삽입에 의해 변형될 수 있다.
비관련 단백질 또는 펩티드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하여, 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하거나 특정 세포 집단에 대한 벡터의 표적화 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 예는 망막 색소 상피 세포에서의 흡수를 차단하고 이에 의해 주변 망막 조직의 형질도입을 향상시키는 RGD 펩티드의 이용을 포함할 수 있다(Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). 비관련 단백질은 또한 생산 공정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 돕는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입 부위는 전형적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 트래피킹을 방해하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 이들의 공통의 일반적인 지식에 기초하여 삽입에 적합한 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위는 상기 참조된 문헌[Choi et al.]에 개시되어 있다.
본 발명은 추가로 천연 AAV 게놈과 상이한 순서 및 배치로 AAV 게놈의 서열을 제공하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자를 또 다른 바이러스로부터의 서열 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자로 대체하는 것을 포함한다. 그러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 유도체를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 인자 I 및/또는 인자 H 트랜스진 또는 이의 유도체를 인코딩하는 서열의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 AAV 입자는 한 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드 내에 패키징된 트랜스캡시드화된 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 비변형된 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 지니는 화학적으로 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 그러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화하기 위한 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것들(AAV2/2), AAV2 게놈 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것들(AAV2/5) 및 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것들(AAV2/8), 뿐만 아니라 AAV2 게놈 및 하나 초과의 혈청형의 캡시드 단백질을 갖는 것들을 포함한다.
AAV 벡터는 본원에서 언급된 뉴클레오티드 서열의 다중 복사체(예를 들어, 2, 3개 등)를 포함할 수 있다.
프로모터 및 조절 서열
본 발명의 AAV 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 인자 I 및/또는 인자 H 트랜스진(또는 이의 단편 또는 유도체)의 발현을 허용하는 요소를 포함할 수 있다. 이들은 발현 조절 서열로 지칭될 수 있다. 따라서, AAV 벡터는 전형적으로 트랜스진을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열 포함)을 포함한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있으며, 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성일 수 있거나(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동가능), 또는 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성일 수 있어서, 특정 세포 유형(예를 들어, 조직-특이적 프로모터)에서 트랜스진의 표적화된 발현을 허용한다. 프로모터는 또 다른 인자, 예를 들어, 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하여 유도적 발현을 나타낼 수 있다. 어떤 경우에도, 벡터가 치료를 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능적이어야 하는 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 프로모터는 망막 세포 집단에서만 트랜스진이 발현되도록 하기 위해 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적일 수 있으며, 예를 들어, 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포에만 국한될 수 있다.
망막-세포 특이적이지 않은 바람직한 프로모터는, 임의로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된, 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 CAG 프로모터, 예를 들어, rAVE 발현 카세트에서 사용되는 프로모터이다(GeneDetect.com). 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 예시적인 프로모터는 다음 서열을 갖는다:
Figure pct00010
한 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 프로모터의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
망막-특이적 유전자 발현을 유도할 인간 서열에 기반한 프로모터의 예는 간상 및 원추상에 대한 로돕신 키나제(Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), 원추상 단독에 대한 PR2.1(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) 및/또는 망막 색소 상피에 대한 RPE65(Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) 또는 VMD2(Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73)를 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터는 전사-전 또는 -후에 작용할 수 있는 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. 조절 서열은 천연 트랜스진 유전자좌의 일부일 수 있거나 이종성 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 천연 트랜스진 전사체로부터의 5'-UTR 또는 3'-UTR의 부분을 포함할 수 있다.
조절 서열은 트랜스진의 발현을 용이하게 하는 임의의 서열, 즉, 전사체의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵 유출을 개선시키거나 이의 안정성을 향상시키도록 작용하는 임의의 서열이다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어, 인핸서 요소, 전사후 조절 요소 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 바람직한 폴리아데닐화 부위는 하기에 나타낸 바와 같을 수 있는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호이다:
Figure pct00011
한 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 폴리아데닐화 부위의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
본 발명의 AAV 벡터와 관련하여, 그러한 조절 서열은 시스-작용성일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가적인 유전자 작제물에 위치한 트랜스-작용성 조절 서열의 사용을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터에서 사용하기에 바람직한 전사후 조절 요소는 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE) 또는 이의 변이체이다. WPRE의 예시적인 서열은 다음에 나타낸다:
Figure pct00012
한 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 전사후 조절 요소를 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 7과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 전사후 조절 요소를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 전사후 조절 요소의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
본 발명은 WPRE가 없는 AAV 벡터와 비교하여 트랜스진의 발현을 증가시키는 WPRE의 임의의 변이체 서열의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 서열은 이의 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7과 적어도 70% 동일성, 보다 바람직하게는 이의 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO: 7과 75%, 80%, 85%, 90% 및 보다 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타낸다.
본 발명의 AAV 벡터에서 사용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역(SAR)이다. 추가의 조절 서열은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
투여 방법
바람직한 구체예에서, AAV 벡터는 안내 투여된다.
용어 "안내"는 눈의 내부를 지칭하며, 따라서 안내 투여는 대상체의 눈의 내부로의 투여에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터는 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되었다. 한 구체예에서, 상기 투여는 로봇에 의해 수행된다.
주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 μL이다.
당업자는 개별 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 익숙하며, 잘 수행할 수 있을 것이다.
바람직하게는, AAV 벡터는 망막하 주사에 의해 투여된다.
한 구체예에서, AAV 벡터 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 대상체의 수명 동안 1회 이하, 또는 2회 이하로 투여된다.
망막하 주사
망막하 주사는 망막하 공간, 즉, 감각신경 망막 아래로의 주사이다. 망막하 주사 동안, 주사되는 물질은 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE) 층으로 유도되어, 그 사이에 공간을 생성한다.
주사가 작은 망막절개를 통해 수행될 때, 망막 박리가 발생할 수 있다. 주사된 물질에 의해 생성되는 망막의 박리된, 상승된 층을 "수포(bleb)"로서 지칭한다.
망막하 주사에 의해 생성된 구멍은 주사된 용액이 투여 후 유리체강으로 유의하게 역류하지 않도록 충분히 작아야 한다. 이러한 역류는 약제의 효과가 표적 영역으로부터 멀리 유도될 것이므로 약제가 주사될 때 특히 문제가 될 것이다. 바람직하게는, 주사는 감각신경 망막에서 자가-밀봉 진입 지점을 생성하며, 즉, 일단 주사 바늘이 제거되면, 바늘에 의해 생성된 구멍은 주사된 물질이 구멍을 통해 거의 또는 실질적으로 전혀 방출되지 않도록 재밀봉된다.
이러한 과정을 용이하게 하기 위해, 전문 망막하 주사 바늘이 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, DORC 41G Teflon 망막하 주사 바늘, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands). 이들은 망막하 주사를 수행하도록 설계된 바늘이다.
주사 중에 망막 손상이 발생하지 않고, 충분히 작은 바늘이 사용되는 한, 실질적으로 주사된 모든 물질은 국소 망막 박리 부위에서 박리된 신경감각 망막 및 RPE 사이에 국한된 채로 유지된다(즉, 유리체강으로 역류하지 않음). 실제로, 짧은 시간틀 동안 수포의 전형적인 지속성은 일반적으로 유리체로 빠져 나가는 주사된 물질이 거의 없음을 나타낸다. 수포는 주사된 물질이 흡수됨에 따라 더 긴 시간틀 동안 소멸될 수 있다.
눈, 특히 망막에서, 예를 들어, 광간섭단층촬영을 이용한 눈의 가시화가 수술 전에 이루어질 수 있다.
주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 μL이다. 부피가 클수록 망막이 늘어날 위험이 커질 수 있는 반면, 부피가 작을수록 보기 어려울 수 있다.
2-단계 망막하 주사
본 발명의 벡터는 국소 망막 박리가 제1 용액의 망막하 주사에 의해 생성되는 2-단계 방법을 사용함으로써 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 제1 용액은 벡터를 포함하지 않는다. 이후, 제2 망막하 주사를 이용하여 벡터를 포함하는 약제를 제1 망막하 주사에 의해 생성된 수포의 망막하 유체로 전달한다. 약제를 전달하는 주사가 망막을 박리하는데 사용되고 있지 않으므로, 특정 부피의 용액이 이러한 제2 단계에서 주사될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 벡터의 망막하 주사는 다음 단계를 포함한다:
(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성하기에 효과적인 양의 망막하 주사에 의해 대상체에게 용액을 투여하는 단계로서, 용액이 벡터를 포함하지 않는, 단계; 및
(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포에 망막하 주사에 의해 약제 조성물을 투여하는 단계로서, 약제가 벡터를 포함하는, 단계.
망막을 적어도 부분적으로 박리시키기 위해 단계 (a)에서 주사되는 용액의 부피는, 예를 들어, 약 10-1000 μL, 예를 들어, 약 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10-500, 50-500, 100-500, 250-500 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 μL일 수 있다.
단계 (b)에서 주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 μL이다. 부피가 클수록 망막이 늘어날 위험이 커질 수 있는 반면, 부피가 작을수록 보기 어려울 수 있다.
약제를 포함하지 않는 용액(즉, 단계 (a)의 "용액")은 하기 기술된 바와 같이 약제를 포함하는 용액과 유사하게 제형화될 수 있다. 약제를 포함하지 않는 바람직한 용액은 평형 염수 용액(BSS) 또는 망막하 공간의 pH 및 삼투압과 일치하는 유사한 완충액이다.
수술 중 망막 가시화
특정 상황하에, 예를 들어, 말기 망막 변성 동안, 망막은 얇고 투명하며 이것이 존재하는 파괴되고 심하게 색소화된 상피에 대해 보기가 어렵기 때문에 망막을 식별하는 것이 곤란하다. 블루 생체 염료(예를 들어, Brilliant Peel®, Geuder; MembraneBlue-Dual®, Dorc)의 사용은 망막 박리 과정(즉, 본 발명의 2단계 망막하 주사 방법의 단계 (a))을 위해 만들어진 망막 구멍의 식별을 용이하게 하여, 약제가 유리체강으로의 역류 위험 없이 동일한 구멍을 통해 투여될 수 있도록 한다.
블루 생체 염료의 사용은 또한 두꺼운 내경계막 또는 망막앞막이 존재하는 망막의 임의의 영역을 식별하는데, 이러한 구조 중 하나를 통한 주사는 망막하 공간으로의 무균 접근을 방해할 것이기 때문이다. 더욱이, 수술 직후 기간에 이러한 구조 중 어느 하나의 수축은 망막 진입 구멍이 늘어지게 할 수 있고, 이는 유리체강으로의 약제의 역류를 발생시킬 수 있었다.
맥락막위 주사
본 발명의 벡터는 미세카테터를 활용한 외부(ab externo) 접근법을 이용하여 망막위 공간으로 전달될 수 있다(예를 들어, Peden et al. (2011) PLoS One 6(2): e17140 참조). 이러한 방법에서 공막 노출법에 노출시키기 위해 윤부 결막 절개술을 수행한 다음 맥락막 노출법에 노출시키기 위해 공막절개술을 수행한다. 미세카테터(예를 들어, iLumin 레이저-다이오드 기반 미세-조명 시스템(예를 들어, iScience Interventional)과 같은 조명 시스템에 임의로 연결된, iScience Interventional로부터의 iTrack 250A)는 맥락막상 공간으로 도입되고 시신경 유두를 향해 후방으로 전진한다. 요망되는 위치로 미세카테터 팁을 조작한 후, 벡터의 주사는 망막 및 맥락막 내에 수포를 형성한다.
따라서, 한 구체예에서, 벡터는 (i) 맥락막상 공간으로 미세카테터의 도입; (ii) 팁이 망막의 질환 부위에 근접할 때까지 상기 공간 내에서 미세카테터의 전진; 및 (iii) 미세카테터 팁으로부터 벡터를 주사하여 수포의 생성을 포함하는 방법에 의해 맥락막위로 전달된다.
한 구체예에서, 상기 투여 절차는 로봇에 의해 직접 수행된다.
약학적 조성물 및 주사액
본 발명의 약제, 예를 들어, AAV 벡터는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 약제 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당 분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 망막하, 직접 망막으로, 맥락막상 또는 유리체내 주사에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
약학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어, 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 마그네슘 클로라이드, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예를 들어, 플루론산(PF68) 0.001%가 사용될 수 있다.
질환 부위에 주사하기 위해, 활성 성분은 무-발열원이고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액 또는 락테이트화 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
지연 방출을 위해, 약제는 서방형을 위해 제형화된 약학적 조성물, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방법에 따라 생체적합성 폴리머로부터 형성된 미세캡슐 또는 리포솜 담체 시스템에 포함될 수 있다.
치료 방법
본원에서 치료에 대한 모든 언급은 치유적, 완화적 및 예방적 치료를 포함하는 것임을 이해하여야 한다; 그러나 본 발명과 관련하여 예방에 대한 언급은 예방적 치료와 더욱 일반적으로 관련된다. 치료는 또한 질병의 중증도에서의 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의적 치료 둘 모두가 본 발명의 범위 내에 있다.
변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드 이외에, 본 발명은 또한 이의 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 용도를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 임의의 주어진 서열의 변이체는 잔기의 특정 서열(아미노산이든 핵산 잔기이든 간에)이 해당 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 기능을 실질적으로 보유는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연-발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 수정, 대체 및/또는 변형에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 초과)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변형, 수정, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함하며, 단, 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 보유한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴레오티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 이것이 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 지니는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 변형된 서열이 요구되는 활성 또는 능력을 실질적으로 보유한다면, 예를 들어, 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개 치환의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 자연적으로 발생하지 않는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 수행될 수 있다 . 두 번째 컬럼의 동일한 블록 및 바람직하게는 세 번째 컬럼의 동일한 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure pct00013
본원에서 사용되는 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 일정한 상동성을 갖는 실체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
동종 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일하고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성의 관점에서 고려될 수 있으나(즉, 유사한 화학적 성질/기능을 갖는 아미노산 잔기), 본 발명과 관련하여 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
동종 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일하고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성이 또한 유사성의 관점에서 고려될 수 있으나, 본 발명과 관련하여 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표혐하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본원에 기술된 SEQ ID NO들 중 어느 하나에 대한 동일성 퍼센트를 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 SEQ ID NO의 전체 길이에 걸쳐 언급된 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 지칭한다.
상동성 비교는 눈으로, 또는 더욱 일반적으로, 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.
상동성 백분율은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있는데, 즉, 하나의 서열을 다른 서열과 정렬하고 한 서열의 각 아미노산을 한 번에 한 잔기씩 다른 서열의 상응하는 아미노산과 직접 비교한다. 이것을 "갭이 없는(ungapped)" 정렬이라고 한다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이것은 매우 간단하고 일관된 방법임에도 불구하고, 예를 들어, 달리 동일한 쌍의 서열에서, 뉴클레오티드 서열에 하나의 삽입 또는 결실은 다음에 오는 코돈이 정렬에서 벗어나게 할 수 있으므로, 전반적인 정렬이 수행될 때 상동성 퍼센트를 잠재적으로 크게 감소시킬 수 있음을 고려하고 있지 않다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수에 부당하게 페널티를 주지 않으며 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생산하도록 설계된다. 이것은 서열 정렬에 "갭"을 삽입하여 국소 상동성을 최대화하려고 노력함에 의해 달성된다.
그러나, 이러한 보다 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 같은 수의 동일한 아미노산에 대해, 비교된 두 서열 간에 더 높은 관련성이 있음을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 가진 서열 정렬이 많은 갭을 가진 서열 정렬보다 높은 점수를 달성하도록 할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 비용 그리고 갭 내의 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 페널티를 부과하는 "Affine 갭 비용"이 전형적으로 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 갭이 더 적은 최적화된 정렬을 생산할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 수정되도록 할 수 있다. 그러나, 서열 비교를 위해 그러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 연장에 대해 -4이다.
따라서, 최대 상동성 백분율의 계산은 갭 페널티를 고려하여 먼저 최적 정렬을 만들 것을 요구한다. 그러한 정렬을 수행하기에 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid-Ch.18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol 403-410) 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 응용에서, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 서열이라고 불리는 또 다른 도구는 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).
최종 상동성 퍼센트는 동일성에 관해 측정될 수 있으나, 정렬 프로세스 자체는 일반적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화 거리에 기반한 각 쌍별 비교에 점수를 할당하는 등급화된 유사성 점수 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 - 프로그램의 BLAST 스위트에 대한 디폴트 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공용 디폴트 값 또는 제공된 경우 맞춤 기호 비교 표를 사용한다(더 자세한 내용은 사용자 설명서 참조). 일부 응용의 경우, GCG 패키지의 공용 디폴트 값을 사용하거나, 다른 소프트웨어의 경우, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 만들어 내면, 상동성 퍼센트, 바람직하게는 서열 동일성 퍼센트를 계산할 수 있다. 소프트웨어는 일반적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수치 결과를 생성한다.
전장 인자 I 또는 인자 H의 "단편"은 또한 변이체이며, 이 용어는 일반적으로 기능적으로 또는, 예를 들어, 검정에서 관심있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
그러한 변이체는 부위-지정 돌연변이유발과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어질 경우, 삽입 부위의 양측의 자연-발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 인접 영역과 함께 삽입을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 인접 영역은 자연-발생 서열 내의 부위에 상응하는 편리한 제한 부위를 함유하여, 서열이 적절한 효소(들)로 절단되고 합성 DNA가 절단물에 라이게이션되게 할 수 있다. 이후 DNA를 본 발명에 따라 발현시켜 인코딩된 단백질을 제조한다. 이러한 방법은 DNA 서열의 조작에 대해 당 분야에 공지된 수많은 표준 기술을 단지 예시하기 위한 것이며, 다른 공지된 기술도 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예는 이제 비제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당업자의 능력 내에 있는 화학, 생화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 채용할 것이다. 그러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press] 참조. 이러한 일반적인 문서는 각각 본원에 참조로서 포함된다.
실시예
실시예 1
인간 CFI cDNA의 클로닝, 및 CBA-CFI-WPRE 발현 카세트의 생성, pAAV-CBA-CFI-WPRE-bGHpA의 작제 및 AAV-CFI 바이러스의 패키징.
가장 일반적인 인간 CFI 서열 변이체의 cDNA는 Genbank, 수탁 번호 NM_000204.4로부터 다운로드하였다. cDNA는 SEQ ID NO: 2의 서열을 가지며, Integrated DNA Technologies의 gBlocks® Gene Fragments로서 주문되었다. CFI 유전자의 cDNA 서열이 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 제2 CFI 작제물도 주문되었다. 코돈-최적화된 서열("CFIco")은 SEQ ID NO: 8의 서열을 가지며, GeneWiz(플라스미드 pUC57의 CFIco)로부터 주문되었다.
이러한 cDNA 서열을 pAM이라 불리는 pAAV cis 플라스미드에 삽입하였다. pAM은 원래 pBR322에서 유래된 높은 복사체 수 플라스미드지만, 선택된 발현 카세트의 측면에 위치하는 안정화된 AAV-2 좌우 역전된 말단 반복부를 포함한다. AAV-CFI 및 AAV-CFIco 벡터에 대하여, 변형된 CBA/CAG 프로모터(CMV 인핸서를 갖는 닭 베타-액틴; 본원에서 "CBA"로 불림)를 사용하여 CFI 및 CFIco의 발현을 유도하였고, 변형된 WPRE 서열 및 bGH 폴리 A를 cDNA의 3'측에 제공하였다. 2개의 플라스미드는 pAAV2.CBA-hCFI-WPRE-bGH, (pAAV-CFI), 및 pAAV2.CBA-hCFIco-WPRE-bGH, (pAAV-CFIco)로 명명되었다.
도 2는 CFI 및 CFIco의 제한 분해물의 아가로스 겔을 보여준다. CFI의 1752bp 밴드를 절제하여 pAAV-CBA-WPRE-bGHpA 백본으로 클로닝하였다.
PAAV.CFI와 pAAV.CFIco의 CFI 발현 수준의 비교, ARA-19 세포주를 pAAV-CFI 또는 pAAV.CFIco 및 pCMV.GFP로 동시-트랜스펙션, 및 CFI의 면역블롯팅.
ARPE-19(ATCC® CRL-2302™)는 자동차 사고의 두부 외상으로 사망한 19세 남성의 정상 눈으로부터 Amy Aotaki-Keen에 의해 1986년에 유래된 자발적으로 발생한 망막 색소 상피(RPE) 세포주이다. 이러한 세포는 안정한 유착성 단층을 형성하며, 이는 낮은 혈청 농도를 갖는 배지에서 라미닌-코팅된 Transwell-COL 필터 상에 플레이팅될 때 형태학적 편광을 나타낸다. ARPE-19 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 획득하였다. 세포를 10% 열-불활성화된 우태아 혈청(Gibco), 1% 200mM L-글루타민(Sigma Aldrich) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma Aldrich, 10,000 유닛 페니실린, 10mg 스트렙토마이신/ml)이 보충된 DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific)에서 성장시켰다.
ARPE-19의 동시-트랜스펙션을 리포펙타민 LTX(Life Technologies)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 0.5 μg의 pAAV-CFI 또는 pAAV.CFIco를 0.5μg의 pCMV.GFP(Plasmid Factory)로 동시-트랜스펙션시켰다. pAAV-CBA-WPRE-bGHpA(pAAV[트랜스진 카세트 없음])의 동시-트랜스펙션은 음성 대조군으로서 사용되었다. 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 PBS(포스페이트 완충된 염수, pH 7.2, Gibco™)로 세척하고, 혈청-비함유 성장 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 취하고, 원심분리에 의해 정화시키고, -80℃에 저장하였다. ARPE-19 세포를 TrypLE Express(Gibco)로 탈착시키고, 계수하여 웰 당 동일한 수의 세포를 확보하였다. 펠렛을 -20℃에서 30분 동안 동결시켰다. cOmplete™ EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)이 보충된 1xRIPA 용해 완충액(Merck Millipore)을 펠렛에 첨가하고, 세포를 초음파처리에 의해 파쇄하였다. 불용성 단백질을 원심분리하고 상청액(=용해물)을 -80℃에 저장하였다.
4 x Laemmli 완충액(250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 8% SDS, 40% 글리세롤, 및 0.02% 브로모페놀 블루)에서 30μl의 희석되지 않은 상청액을 로딩시키고, 10% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad)에서 단백질을 분리함에 의해 CFI의 면역블롯팅을 수행하였다. 단백질을 반-건조 수송에 의해 PVDF 막(Bio-Rad)에 블롯팅하고, 그 후 막을 차단 완충액(1xTBS pH 8 [Sigma], 0.05% Tween-20 및 5% 건조된 탈지 분유[Marvel])에서 차단시켰다. CFI를 차단 완충액에서 희석된 OX21(표 1) 및 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1)로 검출하였다. 단백질 밴드를 Clarity Western ECL 기질(Bio-Rad)을 사용하여 가시화하고, Odyssey® Fc 이미징 시스템으로 분석하였다. 5μl의 희석되지 않은 상청액을 50μl/ml의 β-메르캅토에탄올이 보충된 4x Laemmli 완충액에서 로딩함에 의해 GFP의 면역블롯팅을 수행하였다. 상기와 같이 면역블롯을 수행하였다. GFP를 TurboGFP에 대한 항체(표 1) 및 항-토끼 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1)로 검출하였다.
표 1. 면역블롯팅 또는 면역침전에 사용된 일차 및 이차 항체.
Figure pct00014
도 3은 CFI(도 3A) 및 GFP(도 3B)의 면역블롯팅을 보여준다. 3A: CFI는 70kDa 밴드(비-환원됨)로 나타나며, ARA-19를 pAAV.CFI 또는 pAAV.CFIco로 트랜스펙션시킨 후 동일한 비율로 발현되었다. CFI는 pAAV로 트랜스펙션시킨 후 발현되지 않았다. 10% 정상 인간 혈청(NHS)을 CFI 면역블롯팅을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 도 3B: 트랜스펙션 효율은 ARPE-19 세포를 pCMV.GFP로 동시-트랜스펙션시킴에 의해 분석되었다. GFP는 30kDa 밴드로 나타나며, 면역블롯은 세포가 유사한 효율로 트랜스펙션되었음을 확인시켜 주었다.
AAV.CFI 및 AAV.CFIco의 제조
HEK-293(ATCC® CRL-1573™) 또는 HEK-293T(ATCC® CRL-3216™) 세포주(둘 모두 유착성)를 pAAV.CFI 또는 pAAV.CFIco 및 pDG(Plasmid Factory)로 이중 트랜스펙션시켜 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 패키징 서열(Rep/Cap)을 제공함에 의해 AAV2 바이러스를 제조하였다. HEK-293 및 HEK-293T 세포를 10% 열-불활성화된 우태아 혈청(Gibco), 1% 200mM L-글루타민(Sigma Aldrich) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma Aldrich, 10,000 유닛 페니실린, 10mg 스트렙토마이신/ml)이 보충된 DMEM(Sigma)에서 성장시켰다. 세포를 72시간 후에 회수하고, 바이러스 입자를 정제하기 위해 용해시켰다. AAV 입자를 이오딕사놀 구배에서 정제시키고, 40% 분획으로부터 회수하였다. 바이러스를 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 유닛(Merck Millipore)에 농축시키고, 분취량으로 -80℃에 저장하였다. 바이러스 순도를 SDS PAGE에 의해 평가하고, 역가를 qPCR에 의해 결정하였다.
AAV.CFI, AAV.CFIco 및 AAV.GFP의 시험관내 발현 분석, HEK-293 및 ARPE-19 세포주의 형질도입, CFI 발현을 분석하기 위한 조직 배양 상청액의 면역블롯.
70% 컨플루언트 HEK-293("293") 및 ARPE-19 세포주를 단지 1% 열-불활성화된 우태아 혈청이 보충된 정상적인 성장 배지에서 AAV.CFI, AAV.CFIco 및 AAV.GFP에 의해 1x104의 감염 다중도(MOI)로 형질도입시켰다. 7일 후, 상청액을 회수하고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 상청액을 분취량으로 -80℃에 저장하였다.
면역블롯팅을 상술한 바와 같이 수행하고, 30 μl의 상청액을 4 x Laemmli 완충액과 혼합하고 10% 프리캐스트 폴리아크릴 아미드 겔 상에 로딩하였다. CFI를 차단 완충액에서 희석된 OX21(표 1) 및 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1)(상청액이 비-환원 조건하에 로딩되었을 때) 또는 인간 CFI에 대한 항혈청(표 1) 및 항-염소 IgG(전체 분자)-퍼옥시다제 항체(표 1)(상청액이 환원 조건하에 로딩되었을 때)로 검출하였다.
도 4는 바이러스 형질도입된 HEK-293 및 ARPE-19 세포주의 상청액에서 CFI의 면역블롯팅을 보여준다. 4A: 상청액을 비-환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 마우스 모노클로날 항체(OX21, Thermo Fisher Scientific) 및 당나귀 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(Abcam)로 검출하였다. CFI 및 CFIco는 둘 모두의 세포주에서 발현되었다. AAV.GFP에 의한 세포주의 형질도입은 음성 대조군으로 작용하였고, 한편 0.5μg의 혈장 정제된 인간 CFI(본원에서 "CFIpl"로 불림) (Comptech)는 양성 대조군으로 작용하였다. 4B: 상청액을 환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 염소 항혈청(Comptech) 및 토끼 항-염소 IgG(전체 분자)-퍼옥시다제 항체(Sigma)로 검출하였다. CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)에 나타났다. AAV.GFP는 음성 대조군으로 작용하였고, 한편 0.5μg의 혈장 정제된 인간 CFI(Comptech) 및 10% 정상 인간 혈청(본원에서 "NHS"로 불림)은 양성 대조군으로 작용하였다. CFI 및 CFIco는 둘 모두의 세포주에서 발현되었다.
기능적 활성을 측정하기 위한 CFI 발현의 정성 분석, C3b 절단 검정
정성 분석을 위해, CFI를 Pierce Co-Immunoprecipitation(Co-IP) 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 면역침전시켰다. 30μg의 친화성 정제된 인간 CFI에 대한 모노클로날 항체(Ox21, Thermo Fisher Scientific)를 25μl의 AminoLink Plus Coupling Resin와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. HEK-293 또는 ARPE-19 형질도입된 세포의 상청액을 제조된 수지와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 수지를 제공된 IP 용해/세척 완충액을 사용하여 여러 번 세척하였다. 결합된 CFI를 키트의 용리 완충액(0.1M 글리신, pH 2.7)으로 용리시키고, 1M 트리스(pH 9.5)로 즉시 중화시켰다. 280nm에서의 흡광도를 측정하고 SDS PAGE 분석에 의해 CFI의 면역침전을 평가하였다. CFI를 C3b 절단 검정에 바로 사용하거나 분취량으로 -80℃에 저장하였다.
C3b 절단 검정에서, 1mg의 혈장 정제된 C3b를 37℃에서 1시간 동안 0.5μg의 혈장 정제된 보체 인자 H(CFH) 및 혈장 정제된 보체 인자 I(CFIpl)(모든 혈장 정제된 단백질은 Comptech로부터 획득하였다), AAV.CFI 형질도입된 세포의 세포 배양 상청액 또는 면역침전된 CFI/CFIco와 함께 인큐베이션하였다. 4x Laemmli 완충액을 β-메르캅토-에탄올과 함께 첨가하여 반응을 정지시켰다. 샘플을 희석하고, 10% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 SDS PAGE 겔(Bio-Rad)에 로딩하였다. PVDF 막(Bio-Rad)으로의 전달 및 차단 완충액(1xTBS pH 8 [Sigma]/0.05% Tween-20 및 5% 건조된 탈지 분유 [Marvel])에서의 차단 후, C3b 절단을 비오티닐화된 클론 9(표 1) 및 엑스트라비딘-컨쥬게이션된 HRP(표 1)로 검출하였다. 이러한 항체는 C3g의 에피토프와 반응하며, 환원성 SDS PAGE 상에서 C3의 α-사슬, C3b의 α' 사슬, iC3b 및 C3dg의 C3α'1-사슬을 인지한다. 따라서, 이것은 CFI에 의한 C3b의 분해를 분석하는데 사용될 수 있다. CFH는 C3b 분해를 위한 보조인자로서의 역할을 하며, 검정이 저-이온 강도에서 수행되기 때문에, 이것은 또한 iC3b의 C3dg로의 두 번째 절단을 위한 보조인자로서의 역할을 한다. 사용된 완충액은 1M Tris(pH 9.5)로 중화된 Pierce Co-Immunoprecipitation(Co-IP) 키트(Thermo Fisher Scientific)의 "용리 완충액"이었다.
도 5는 C3b 절단 검정의 대표적인 결과를 보여준다. 레인 1은 단지 CFH와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 2는 CFH 및 CFIpl와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. C3b는 CFIpl에 의해 iC3b 및 C3dg로 분해된다. 레인 3은 CFH 및 AAV.CFI로 형질도입된 HEK-293으로부터의 상청액과 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 4-5는 CFH 및 AAV.CFI(레인 4) 또는 AAV.CFIco(레인 5)로 형질도입된 ARPE-19 세포로부터 면역침전된 CFI("IP CFI"로 명명됨)와 함께 인큐베이션된 C3b를 보여준다. 레인 6-7은 CFH 및 AAV.CFI(레인 6) 또는 AAV.CFIco(레인 7)로 형질도입된 HEK-293으로부터 면역침전된 CFI와 함께 인큐베이션된 C3b를 나타낸다. 형질도입된 세포주로부터 분비된 CFI는 기능적으로 활성이며, C3b의 α-사슬을 iC3b로 절단한다. CFI의 면역침전은 총 CFI 양을 증가시키며, 이는 iC3b의 α'1 단편 밴드에 추가하여 C3dg 밴드의 출현에 의해 반영된다. 이러한 두 번째 절단은 단지 저 이온 강도에서 낮은 속도로만 발생하며, 더 많은 CFI가 존재할 것을 필요로 한다.
투과성 트랜스웰 필터에서 성장한 형질도입된 ARPE-19에서 CFI 발현의 시험관내 분석.
RPE 세포는 혈청 농도가 낮은 배지에서 라미닌-코팅된 Transwell-COL 필터에 플레이팅될 때 형태학적 편광을 나타내는 색소화된, 분열되지 않은 세포이다. Transwell 필터(폴리에스테르 막 삽입, 포어 직경 0.4 μm, 막 직경 12 mm)는 배양 웰을 두 구획으로 분리하는 기능을 하며, 정점(상부) 도메인은 RPE 단층의 망막을 마주보는 면에 상응하고, 측부(하부) 도메인은 RPE 단층의 맥락막을 마주보는 면에 상응한다. 낮은 혈청 배지 조건하에 두면, ARPE-19 세포는 분화되어 육각형의 약간 색소화된 세포가 된다. 트랜스웰 모델을 이용하여 생체내 상황을 반영하기 위해 정지 세포에서의 발현을 평가할 수 있다.
트랜스웰을 8μg/ml의 라미닌(Sigma)으로 코팅하고, ARPE-19 세포를 트랜스웰 상에 단층으로서 10% FBS-배지에 시딩하였다. 48시간 후, 배지를 1% FBS 배지로 바꾸고, 세포를 MOI 105/세포(AAV.CFI, AAV.CFIco 및 AAV.GFP)로 형질도입하였다. 7일 후, 둘 모두의 구획으로부터 상청액을 회수하고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 상부 및 하부 구획의 부피가 다르기 때문에, 즉, 상부는 500μl 배지이고 하부 구획은 1500μl이므로, 상청액을 총 부피로 표준화하여 분석하였다: 하부 구획으로부터의 30μl의 상청액을 4x Laemmli 완충액과 혼합시키고, 상부 구획으로부터의 10μl의 상청액을 4x Laemmli 완충액과 혼합시켰다. 샘플을 10% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. CFI를 차단 완충액에서 희석된 OX21(표 1) 및 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1)로 검출하였다. 핵 염색을 위해, 세포를 PBS (Gibco)로 2회 세척하고, PBS 중 4% 파라포름알데하이드(Sigma)로 15분 동안 고정시키고, PBS 중 1% BSA(Thermo Fisher Scientific)-0.1% Triton X-100(Sigma)과 함께 45분 동안 투과시켰다. Hoechst(Thermo Fisher Scientific)를 15분 동안 투과 완충액에서 1:5000으로 인큐베이션하고, 핵 염색을 평가하였다.
도 6은 트랜스웰 배양된 ARPE-19 세포로부터 분비된 CFI의 면역블롯팅을 보여준다. 세포는 육각형 세포로 분화되지 않았지만 세포의 컨플루언트 단층으로 배양되었고, 세포 분열은 1% 혈청 배지의 첨가에 의해 최소로 감소되었다. 6A: 둘 모두의 구획으로부터의 상청액을 비 환원 조건하에 로딩하고, CFI에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다(Ap = 정점 구획 및 B1 = 측부 구획). CFI가 세포의 컨플루언트 단층에서 발현되고 분비된 단백질이 둘 모두의 구획에서 검출된다는 것이 밝혀졌다. 6B: 세포의 단층의 존재를 확인하기 위해 핵의 Hoechst 염색을 수행하였다(염색은 상청액을 회수한 후 수행됨).
AAV.CFI 및 AAV.CFIco의 생체내 발현 분석, C57/Black 6 마우스의 망막하 주사, 면역블롯팅, qPCR 및 면역조직화학에 의한 CFI 발현의 분석.
망막하 주사
암컷 8-10주령 C57BL/6J 마우스(Charles River Laboratories)를 모든 실험에 이용하였다. 이 연구에 사용된 모든 동물은 프로젝트 라이센스 30/3363 하에 UK Home Office 규정에 따라 인도적으로 취급되었다. 마우스를 12:12-h 명/암 주기에 유지하였다.
마우스를 멸균 염수 중 자일리진(10mg/kg)/케타민(80mg/kg)의 혼합물로 마취시켰다; 페닐레프린 하이드로클로라이드(2.5%) 및 트로픽아미드(1%)로 동공이 확장되었다. 프록시메타카인 하이드로클로라이드(0.5%) 점안제를 추가 국소 마취에 이용하였다. 망막하 주사 전에 멸균된 33G 바늘(TSK Laboratory) 및 카르보머 겔(Viscotears, Novartis Pharmaceuticals Ltd)을 이용하여 전방 천자(anterior chamber tap)를 수행하였고, 안저의 가시화를 좋게 하기 위해 작은 원형 유리 커버슬립을 이용하였다. 주사는 10μl NanoFil 주사기 및 35G bevelled NanoFil 바늘(World Precision Instruments Ltd)을 사용하여 후방 망막을 통해 수행되었다. 멸균 염수 중 아티파메졸(2mg/kg)에 의해 마취에서 회복시켰다.
마우스에게 두 상이한 용량(107개 게놈 복사체(gc)/눈 및 108gc/눈) 및 2개의 AAV 작제물(AAV.CFI 및 AAV.CFIco)을 주사하였다. 3마리의 마우스에게 세 번째 용량인 109gc/눈의 AAV.CFIco를 주사하였다; 이러한 마우스를 면역블롯의 보정에 사용하였다. 바이러스를 PBS(Gibco) 중 0.001% PF68(Gibco)에서 희석시키고, 동일한 희석제를 사용하여 모의대조군 주사를 수행하였다. 병태 당 12개의 눈에 망막하 주사하였다.
CFI의 면역블롯팅을 위한 조직 샘플의 제조
주사한 지 4주 후에 경추 탈구에 의해 마우스를 사망시켰다. 눈을 제거하고 다음과 같이 준비하였다. 해부 현미경을 사용하여 각막에 절개를 내었다. 눈은 각막/홍채(안구 앞부분), 수정체, 및 후방 안구컵으로 나누어진다. 전체 안구컵 샘플의 경우, 후방 안구컵을 멸균 튜브에 넣는다. 일부 눈의 경우, RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 부드럽게 벗겨 냄으로써 망막 및 RPE/맥락막/공막을 분리하였다. 2마리의 마우스의 샘플을 풀링시키고 주사되지 않은 반대쪽 눈과 비교하는 109gc/눈의 AAV.CFIco가 주사된 눈을 제외하고(도 7B), 병태 당 3마리의 마우스의 샘플을 풀링시켰다(도 7A). 단백질 분해를 막기 위해 모든 샘플을 즉시 드라이 아이스에 넣어 -80℃에 보관하였다. 면역블롯팅을 위해, 샘플을 cOmplete™ EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)이 보충된 1xRIPA 용해 완충액(Merck Millipore)에서 균질화하고, 세포를 절구와 절구공이 및 초음파처리에 의해 기계적으로 파쇄하였다. 불용성 단백질을 원심분리하고, 상청액을 분취시키고, -80℃에 저장하였다. 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 결정하였고, 40μg의 단백질 용해물을 4x Laemmli 완충액(250mM Tris-HCl (pH 6.8), 8% SDS, 40% 글리세롤 및 0.02% 브로모페놀 블루)에 로딩시켰다. 단백질을 10% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad)에서 분리하였다. 단백질을 반-건조 수송에 의해 PVDF 막(Bio-Rad)에 블롯팅하고, 그 후 막을 차단 완충액(1xTBS pH 8 [Sigma], 0.05% Tween-20 및 5% 건조된 탈지 분유[Marvel])에서 차단시켰다. CFI를 차단 완충액에서 희석된 a) 환원됨: 인간 CFI에 대한 항혈청(표 1) 및 항-염소 IgG-HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1) 또는 b) 비-환원됨: OX21(표 1) 및 당나귀 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(Abcam)로 검출하였다. β-액틴 검출을 위해, 막을 Restore Western Blot Stripping 완충액(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 스트리핑하고, 차단 완충액에서 희석된 항-β-액틴(표 1) 및 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이션된 항체(표 1)를 사용하여 재프로브하였다. 대안적으로, 마우스 항-β-액틴 항체를 CFI에 대한 염소 항혈청과 함께 사용하였다.
도 7은 면역블롯팅에 의해 분석된 풀링된 샘플의 CFI 단백질 발현을 보여준다. CFI는 모든 용량에서 그리고 둘 모두의 AAV.CFI 및 AAV.CFIco로부터 검출 가능한 수준으로 발현된다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 로딩하였다. 7A: 40μg의 단백질 용해물을 환원 조건하에 로딩하고, CFI를 인간 CFI에 대한 폴리클로날 염소 항혈청으로 검출하였다. CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)로 검출된다. 이러한 밴드는 예상되는 CFI의 크기에 상응하고, 처리 과정, 즉, 중쇄 및 경쇄의 존재를 확인시켜 준다. 7B: 109gc/눈의 AAV.CFIco를 주사한 눈 또는 주사하지 않은 눈의 용해물 샘플에 대해서도 같은 양의 단백질 용해물을 로딩하였다. CFI를 CFI에 대한 마우스 모노클로날(좌측, 비-환원 겔) 및 CFI에 대한 염소 항혈청(우측, 환원 겔)으로 검출하였다. 비 환원 겔(좌측)은 주사된 동물에서 75kDa의 밴드로서 CFI를 검출하고, 주사되지 않은 눈에서 밴드는 검출되지 않는다. 환원 겔(우측)에서 CFI는 80kDa(프로-효소), 50kDa(처리됨; 중쇄) 및 35kDa(처리됨; 경쇄)로 나타난다.
유전자 발현 분석을 위한 조직 샘플의 제조
상술한 바와 같이 마우스를 사망시키고, 후방 안구컵을 무손상인 채로 두거나 망막 및 RPE를 상술한 바와 같이 분리하였다. 조직 샘플을 즉시 RNALater(Thermo Fisher Scientific)를 함유하는 멸균 튜브에 넣었다. 샘플을 추가 처리시까지 4℃에서 보관하였다. RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 분리하고, 조직을 절구와 절구공이를 이용하여 완충액 RLT(키트에 함께 제공됨)에서 균질화시켰다. 게놈 DNA가 없도록 보장하기 위해 RNase-free DNase(Qiagen)에 의한 보완적인 처리를 추가하였다. 100ng의 RNA를 Superscript III First Strand Synthesis 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 역전사 후, 반응물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정화시켰다. CFX Connect™ Real-Time PCR 검출 시스템(Bio Rad)을 이용한 병태(모의대조군, CFI 107gc/눈, CFI 108gc/눈, CFIco 107gc/눈 및 CFIco 108gc/눈) 당 하나의 눈의 cDNA에서 qPCR을 수행하였다. 1.25ng의 cDNA를 SYBR 그린 마스터 믹스(iTaq Universal SYBR Green Supermix, Bio Rad)와 함께 qPCR 반응을 위한 주형으로서 웰 당 이용하였다. 각 조건을 삼중으로 수행하였다; Ct 값은 제공된 소프트웨어를 사용하여 얻었다. 하우스키핑 유전자로서 마우스 β-액틴과의 비교 ΔΔCt 분석을 이용하여 모의대조군에 대한 CFI의 상대적인 발현을 결정하였다.
도 8은 qPCR에 의한 유전자 발현 분석을 보여준다. 예상대로 모의대조군 주사된 마우스에서 인간 CFI 또는 CFIco 발현은 존재하지 않았다. 분석된 병태마다 하나의 눈만 있었기 때문에, 통계 분석은 수행할 수 없었다. CFI는 둘 모두의 AAV 작제물로부터 발현되며, 발현은 명백하게 RPE에서 두드러지게 나타나지만, 108gc/눈의 주사는 망막 조직에서 CFI mRNA 발현을 증가시킨다. 안구컵 샘플에서, 총 안구컵 mRNA에 대한 CFI mRNA의 양은 단지 RPE에 비해서만 작을 것으로 예상되는데, 그 이유는 눈의 많은 영역에서 CFI의 발현이 없을 것이기 때문이다; 이것은 결과에 의해 반영된다.
면역조직화학을 위한 망막 섹션의 제조
경추 탈구에 의해 마우스를 사망시켰다(주사한 지 4주 후). 눈을 제거하고 다음과 같이 준비하였다. 톱니둘레 바로 뒤에 구멍을 만들고, 안구를 0.12 M 포스페이트 완충액(pH 7.2) 중 4%(w/v) 파라포름알데하이드에 실온에서 1시간 동안 두었다. 그런 다음 본 발명자들은 안구 앞부분 및 수정체를 제거하고, 섹션 또는 홀마운트를 위한 눈을 제조하였다. 섹션에 사용된 안구컵을 0.12 M 포스페이트 완충액(pH 7.2) 중 증가하는 농도의 수크로스와 함께 저온보존하고(10%, 실온에서 1시간 동안 및 30% +4℃에서 밤새), OCT(Tissue-tek, Sakura Finetek USA inc, Ca, USA)에 임베딩하고, 몰드에서 -80℃로 동결시켰다. 섹션을 저온유지장치에서 10 μm의 두께로 절단하고, 유리 슬라이드(Super-Frost, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 위에 마운팅하였다. 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 공기 건조시키고, -80℃에 저장하였다. 홀마운트에 사용된 안구컵의 경우, 망막을 RPE로부터 부드럽게 벗겨 내어 망막과 RPE/맥락막을 분리하고, 별도로 PBS에서 +4℃로 저장하였다.
면역염색
PBSGT 용액(PBS 중 0.2%(w/v) 젤라틴, 0.25%(v/v) Triton X-100)에서 실온으로 60분 동안 인큐베이션함으로써 섹션을 차단하고 투과시켰다. PBS 중 0.2%(w/v) 젤라틴, 1.5%(v/v) Triton X-100에서 실온으로 2시간 동안 인큐베이션함으로써 홀마운트를 차단하고 투과시켰다. 이어서, 섹션 및 홀마운트를 PBSGT 용액에서 희석된 일차 항체(표 1 참조)와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. PBST 용액(PBS 중 0.1%(v/v) Triton X-100)에서 세척 후, 섹션 및 홀마운트를 1:5000의 희석율로 Alexa Fluor594(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)에 커플링된 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, PBSGT 용액 중 DAPI로 실온에서 1.5시간 동안 염색하였다. 슬라이드를 PBST 용액으로 세척한 후, 이어서 마운팅 배지(Mowiol, Merck Millipore)로 커버슬립하였다.
표 2. 이 연구에서 면역조직화학에 사용된 일차 항체.
Figure pct00015
도 9는 모의대조군, AAV.CFI 및 AAV.CFIco 주사된 눈 망막 섹션에서 피브로넥틴 및 hCFI의 국소화를 보여준다. 피브로넥틴은 상이한 망막 층을 구별하기 위한 공동-마커로 사용된다. AAV.CFI 및 AAV.CFIco 주사된 눈 둘 모두에서, hCFI는 여러 구획에 국소화된다: 공막(scl)에 약간, RPE, 광수용체의 외부(OS) 및 내부(IS) 세그먼트, 외부 얼기층(OPL) 및 아마도 신경절 세포층(GCL)과 신경 섬유층(NFL)에 강하게. 모의대조군 주사된 눈에 대해 GCL + NFL의 약간의 신호가 보이는데, 이는 항체가 이러한 층에서 완전히 특이적인 것은 아님을 보여준다.
도 10 내지 도 13은 hCFI가 모의대조군 및 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에 대해 국소화된 더 높은 배율의 상이한 영역을 보여준다. 동일한 신호가 AAV.CFIco 주사된 눈 망막 섹션에 대해 관찰되며 이는 도시되지 않는다.
도 10은 모의대조군 및 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에 대한 더 높은 배율의 RPE 영역을 보여준다. hCFI는 전체 RPE 층 및 RPE의 미세융모에 국한되어 있다. 염색은 소포성인데, 이는 hCFI의 분비성 경로의 국소화를 제시한다.
도 11은 모의대조군 및 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에 대한 더 높은 배율의 광수용체 영역을 보여준다. hCFI는 광수용체의 내부 및 외부 세그먼트에 국한되며 광수용체의 핵/세포질그물 영역에는 존재하지 않는다.
도 12는 모의대조군 및 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에 대한 더 높은 배율의 외부 얼기층을 보여준다. hCFI는 세포체에 국한되며, 이는 수평 세포 염색을 제시한다. 수평 세포 마커가 없는 경우, 다음 참고문헌은 수평 세포에서의 발현이 면역조직화학에서 어떻게 나타나는 지를 보여준다: Poche et al (2009), Development, 136:2141-51; Cuenca et al (2010), Exp Eye Res., 91:273-85; Ho et al (2012), PLoS One, 7:e29892.
도 13은 모의대조군 및 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에 대한 더 높은 배율의 신경절 세포층 영역을 보여준다. 비록 AAV.CFI 주사된 눈 망막 섹션에서 hCFI 표지화에 대한 신경 섬유층의 강도는 모의대조군 주사된 눈 망막 섹션에 대한 강도보다 높은 것 같이 보이지만, hCFI가 신경 섬유층에 국한되어 있는 지를 결정하는 것은 어렵다.
도 14는 모의대조군, AAV.CFI 및 AAV.CFIco 주사된 눈 홀마운트 RPE에서 피브로넥틴 및 hCFI의 국소화를 보여준다. AAV.CFI 및 AAV.CFIco 주사된 눈 둘 모두에서, hCFI는 RPE 세포에 국한된다. 염색은 점으로 찍히며, hCFI가 처리되는 분비성 경로의 소포에 국한되어 있는 것으로 보인다.
실시예 2
광-유도된 망막 손상을 완화시키는 AAV.CFI 또는 AAV.CFIco의 능력의 생체내 기능 검정
알비노 BALB/c 마우스를 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하면서 동물 보호 시설에 12-시간 명 및12-시간 암 주기 하에 수용한다. 동물의 눈 높이에서 주변 광 강도는 85 ± 18 lux이다. 모든 실험은 Ophthalmic and Vision Research의 동물 이용을 위한 ARVO 선언에 따라 수행되며 본사에 의해 승인된다.
지도모양 위축 모델의 경우(Barbel Rohrer; Yao Guo; Kannan Kunchithapautham; Gary S. Gilkeson, Investigative Ophthalmology & Visual Science November 2007, Vol.48, 5282-5289), 성체 마우스(약 1세)를 광-처리실로 옮기고, 밤새 어둠에 적응시켰다. 동물은 사료와 물에 자유롭게 접근하면서 투명한 아크릴 유리(Plexiglas, Rohm and Haas, PA, Philadelphia, PA) 케이지에 케이지 당 2마리 동물로 수용되었다. 동물을 케이지의 약 40cm 위에 매달아 놓은 2개의 30-W 형광 전구(T30T12-CW-RS, General Electric, Piscataway, NJ)가 제공하는 1000 lux의 백색 광에 노출시켜 광 손상을 유발한다. 모든 동물에게 동일한 휘도가 제공되도록 보장하기 위해 광 세기를 노출계(Extech Instruments, Waltham, MA)를 사용하여 측정한다. 이러한 양의 광은 알비노 마우스에서 간상체의 수를 2 내지 3주 내에 한 줄로 감소시킨다.
광-유도된 외부 망막 뉴런의 손실에서 보체 인자 I(CFI)의 역할을 조사하기 위해, 마우스를 망막하 경로를 통한 CFI-AAV.CFI(또는 AAV.CFIco), 대조군 GFP-AAV.GFP 또는 모의대조군 주사에 노출시킨다. 일반적으로 6-8마리 마우스의 코호트가 사용된다. 3-4주의 AAV 노출 후, 상술한 대로 광-유도된 손상이 시작된다. 2-3주 후, 망막전위도검사(ERG)를 수행한다. 동물을 자일리진 및 케타민(각각 20 및 80 mg/kg)으로 마취시키고, 1 방울의 페닐레프린 HCl(2.5%) 및 아트로핀 설페이트(1%)로 동공을 확장시키고, 빛이 통하지 않는 Faraday 케이지 내에서 37℃로 유지된 가열된 블록에 두었다. 광 자극은 Micron IV(Phoenix Labs)에 의해 제공되는 ERG 설정을 사용하여 제공된다. 광학 신호는 기계 셔터, 수동으로 작동하는 중성 밀도, 및 500-nm 밴드패스 필터로 제어된다. 자극 경로에서 제공된 10-ms 플래시 당 광 강도는 3.0 × 105에서 3.0 × 1011 양자/mm2까지 0.3 로그 단위의 단계로 변경될 수 있다. 암순응 망막전위도는, 평균 3 내지 5회 반응인, 증가하는 광 강도의 단일-플래시 자극에 반응하여 기록된다. 피크 a-파 진폭은 기저선에서 초기 하강(negative-going) 전압으로 측정되는 반면, 피크 b-파 진폭은 a-파의 골에서 양성 b-파의 피크까지 측정된다. ERG 후, 마우스 눈을 수득하고, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용하여 조직학을 위해 처리하고, 외부 망막핵 층의 두께를 정량한다.
CFI-AAV.CFI/AAV.CFIco 노출을 사용하여 대체 보체 경로의 활성을 감소시키는 것이 ERG 기능을 보존하고 외부 망막 뉴런 손실을 감소시킬 것으로 기대된다.
요약해 보면, 아데노-관련 바이러스는 대체 보체 경로의 조절제인 보체 인자 I의 지속적인 발현을 가능하게 하는 효과적인 수단이다. AAV를 통해 전달된 CFI는 놀랍게도 활성 및 컨플루언트 인간 RPE 세포 둘 모두에서 기능적으로 활성인 형태로 발현되고, 정확하게 처리되며, 분비되는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 인간 RPE가 기능적 형태의 CFI를 분비하는데 필요한 프로-단백질 전환효소를 함유함을 보여준다. 동물 번역 실험에서, CFI.AAV의 망막하 전달은 마우스 RPE 세포에 의해 생산된 hCFI의 기능적으로 처리된 형태의 쉽게 검출 가능한 발현으로 이어졌다. 면역염색은 또한 hCFI의 마우스 광수용체 세포내 발현의 부족에도 불구하고, 단백질이 광수용체의 내부 및 외부 세그먼트 영역에 존재하였음을 제안하고, 이는 RPE 분비된 hCFI가 확산되어 이것이 잠재적으로 맥락막-망막의 광범한 영역에서 보체 경로의 중요한 규제 역할을 할 수 있었음을 제안한다. 연령-관련 황반 변성에 대한 보체 기능장애와 관련된 데이터를 감안할 때, 이러한 새로운 치료적 접근법은 실명 상태의 지속적인 치료에 중추적인 역할을 할 수 있었다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명에서 기술된 벡터, 세포, 조성물, 용도 및 방법의 다양한 수정 및 변경은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으며 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구체예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 구체예에 의해 과도하게 제한되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위한 기술된 형태의 다양한 변형은 하기 청구 범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Syncona Management LLP <120> Gene therapy <130> P108488PCT <140> PCT/GB2016/053343 <141> 2016-10-27 <150> GB 1519086.1 <151> 2015-10-28 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 583 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Leu Leu His Val Phe Leu Leu Phe Leu Cys Phe His Leu Arg 1 5 10 15 Phe Cys Lys Val Thr Tyr Thr Ser Gln Glu Asp Leu Val Glu Lys Lys 20 25 30 Cys Leu Ala Lys Lys Tyr Thr His Leu Ser Cys Asp Lys Val Phe Cys 35 40 45 Gln Pro Trp Gln Arg Cys Ile Glu Gly Thr Cys Val Cys Lys Leu Pro 50 55 60 Tyr Gln Cys Pro Lys Asn Gly Thr Ala Val Cys Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Ser Phe Pro Thr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Leu Glu Cys Leu His Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Cys Thr Ala Glu Gly Lys Phe 100 105 110 Ser Val Ser Leu Lys His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu 115 120 125 Val Lys Leu Val Asp Gln Asp Lys Thr Met Phe Ile Cys Lys Ser Ser 130 135 140 Trp Ser Met Arg Glu Ala Asn Val Ala Cys Leu Asp Leu Gly Phe Gln 145 150 155 160 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aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 120 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 180 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 240 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 270 <210> 7 <211> 588 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 7 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588 <210> 8 <211> 1752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding Factor I <400> 8 atgaagctgc tgcatgtctt tctgctgttt ctgtgcttcc atctgcggtt ctgtaaagtg 60 acctatacta gccaggagga tctggtggag aagaagtgtc tggccaagaa gtacacacac 120 ctgagctgcg acaaggtgtt ctgtcagcct tggcagcggt gcatcgaggg cacctgcgtg 180 tgcaagctgc cttaccagtg cccaaagaac ggcaccgccg tgtgcgccac aaatcggaga 240 tcttttccaa catattgcca gcagaagagc ctggagtgtc tgcaccccgg caccaagttc 300 ctgaacaatg gcacctgcac agccgagggc aagttttctg tgagcctgaa gcacggcaac 360 acagatagcg agggcatcgt ggaggtgaag ctggtggacc aggataagac catgttcatc 420 tgtaagagct cctggtccat gagggaggca aacgtggcat gcctggatct gggattccag 480 cagggagcag acacacagag gcgctttaag ctgtccgacc tgtctatcaa tagcaccgag 540 tgcctgcacg tgcactgtag gggcctggag acatccctgg cagagtgcac cttcacaaag 600 cggagaacca tgggctacca ggactttgcc gacgtggtgt gctataccca gaaggccgat 660 agccccatgg acgatttctt tcagtgcgtg aacggcaagt atatctccca gatgaaggcc 720 tgcgacggca tcaatgactg tggcgatcag tctgacgagc tgtgctgtaa ggcctgtcag 780 ggcaagggct tccactgcaa gagcggcgtg tgcatccctt cccagtacca gtgcaacggc 840 gaggtggatt gtatcacagg agaggacgaa gtgggatgcg caggatttgc atctgtggca 900 caggaggaga cagagatcct gacagccgac atggatgccg agaggcgccg gatcaagtct 960 ctgctgccta agctgagctg tggcgtgaag aatcggatgc acatcagaag gaagcgcatc 1020 gtgggaggca agagggcaca gctgggcgat ctgccatggc aggtggccat caaggacgcc 1080 tctggcatca cctgcggcgg catctacatc ggaggatgtt ggatcctgac cgcagcacac 1140 tgcctgagag caagcaagac acacaggtat cagatctgga ccacagtggt ggattggatc 1200 cacccagacc tgaagagaat cgtgatcgag tacgtggata ggatcatctt tcacgagaac 1260 tacaatgccg gcacatatca gaacgacatc gccctgatcg agatgaagaa ggatggcaat 1320 aagaaggact gtgagctgcc cagatccatc cctgcatgcg tgccatggag cccctatctg 1380 ttccagccca acgatacctg catcgtgtcc ggatggggaa gggagaagga caatgagcgg 1440 gtgttttctc tgcagtgggg cgaggtgaag ctgatctcca actgttctaa gttctacggc 1500 aataggtttt atgagaagga gatggagtgc gccggcacct acgatggcag catcgacgcc 1560 tgtaagggcg attccggagg accactggtg tgcatggacg caaacaatgt gacatacgtg 1620 tggggagtgg tgtcctgggg agagaactgc ggcaagccag agttccccgg cgtatatacc 1680 aaggtggcca attattttga ttggatttcc taccacgtcg gcaggccctt tatttcccag 1740 tataatgtct aa 1752 <210> 9 <211> 583 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Leu Leu His Val Phe Leu Leu Phe Leu Cys Phe His Leu Arg 1 5 10 15 Phe Cys Lys Val Thr Tyr Thr Ser Gln Glu Asp Leu Val Glu Lys Lys 20 25 30 Cys Leu Ala Lys Lys Tyr Thr His Leu Ser Cys Asp Lys Val Phe Cys 35 40 45 Gln Pro Trp Gln Arg Cys Ile Glu Gly Thr Cys Val Cys Lys Leu Pro 50 55 60 Tyr Gln Cys Pro Lys Asn Gly Thr Ala Val Cys Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Ser Phe Pro Thr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Leu Glu Cys Leu His Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Cys Thr Ala Glu Gly Lys Phe 100 105 110 Ser Val Ser Leu Lys His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu 115 120 125 Val Lys Leu Val Asp Gln Asp Lys Thr Met Phe Ile Cys Lys Ser Ser 130 135 140 Trp Ser Met Arg Glu Ala Asn Val Ala Cys Leu Asp Leu Gly Phe Gln 145 150 155 160 Gln Gly Ala Asp Thr Gln Arg Arg Phe Lys Leu Ser Asp Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Ser Thr Glu Cys Leu His Val His Cys Arg Gly Leu Glu Thr Ser 180 185 190 Leu Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Arg Arg Thr Met Gly Tyr Gln Asp 195 200 205 Phe Ala Asp Val Val Cys Tyr Thr Gln Lys Ala Asp Ser Pro Met Asp 210 215 220 Asp Phe Phe Gln Cys Val Asn Gly Lys Tyr Ile Ser Gln Met Lys Ala 225 230 235 240 Cys Asp Gly Ile Asn Asp Cys Gly Asp Gln Ser Asp Glu Leu Cys Cys 245 250 255 Lys Ala Cys Gln Gly Lys Gly Phe His Cys Lys Ser Gly Val Cys Ile 260 265 270 Pro Ser Gln Tyr Gln Cys Asn Gly Glu Val Asp Cys Ile Thr Gly Glu 275 280 285 Asp Glu Val Gly Cys Ala Gly Phe Ala Ser Val Ala Gln Glu Glu Thr 290 295 300 Glu Ile Leu Thr Ala Asp Met Asp Ala Glu Arg Arg Arg Ile Lys Ser 305 310 315 320 Leu Leu Pro Lys Leu Ser Cys Gly Val Lys Asn Arg Met His Ile Arg 325 330 335 Arg Lys Arg Ile Val Gly Gly Lys Arg Ala Gln Leu Gly Asp Leu Pro 340 345 350 Trp Gln Val Ala Ile Lys Asp Ala Ser Gly Ile Thr Cys Gly Gly Ile 355 360 365 Tyr Ile Gly Gly Cys Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Ala 370 375 380 Ser Lys Thr His Arg Tyr Gln Ile Trp Thr Thr Val Val Asp Trp Ile 385 390 395 400 His Pro Asp Leu Lys Arg Ile Val Ile Glu Tyr Val Asp Arg Ile Ile 405 410 415 Phe His Glu Asn Tyr Asn Ala Gly Thr Tyr Gln Asn Asp Ile Ala Leu 420 425 430 Ile Glu Met Lys Lys Asp Gly Asn Lys Lys Asp Cys Glu Leu Pro Arg 435 440 445 Ser Ile Pro Ala Cys Val Pro Trp Ser Pro Tyr Leu Phe Gln Pro Asn 450 455 460 Asp Thr Cys Ile Val Ser Gly Trp Gly Arg Glu Lys Asp Asn Glu Arg 465 470 475 480 Val Phe Ser Leu Gln Trp Gly Glu Val Lys Leu Ile Ser Asn Cys Ser 485 490 495 Lys Phe Tyr Gly Asn Arg Phe Tyr Glu Lys Glu Met Glu Cys Ala Gly 500 505 510 Thr Tyr Asp Gly Ser Ile Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro 515 520 525 Leu Val Cys Met Asp Ala Asn Asn Val Thr Tyr Val Trp Gly Val Val 530 535 540 Ser Trp Gly Glu Asn Cys Gly Lys Pro Glu Phe Pro Gly Val Tyr Thr 545 550 555 560 Lys Val Ala Asn Tyr Phe Asp Trp Ile Ser Tyr His Val Gly Arg Pro 565 570 575 Phe Ile Ser Gln Tyr Asn Val 580

Claims (36)

  1. 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 AAV 벡터:
    (a) SEQ ID NO: 1 또는 9와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (b) SEQ ID NO: 2 또는 8과 적어도 70% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    (c) SEQ ID NO: 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 벡터가 바이러스 입자의 형태인 AAV 벡터.
  4. 제3항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 I 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CAG 프로모터, 바람직하게는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 AAV 벡터로 트랜스펙션된 세포.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 또는 제6항의 세포를 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  8. 눈의 보체-매개된 장애를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증, 바람직하게는 AMD인 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소되고/되거나, 지도모양 위축의 양이 감소되는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지도모양 위축의 진행이 느려지는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 지도모양 위축 면적에서의 증가가 대상체의 치료되는 눈에 투여 후 12개월 동안, 같은 기간 동안의 치료되지 않은 눈에 비해, 적어도 10% 감소하는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여가 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예를 들어, 망막 색소 상피(RPE)에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을, 임의로 대상체, 또는 이의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준까지 증가시키는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 안내 투여되는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 눈의 보체-매개된 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증, 바람직하게는 AMD인 방법.
  20. 제19항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소되고/되거나, 지도모양 위축의 양이 감소되는 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 지도모양 위축의 진행이 느려지는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 지도모양 위축 면적에서의 증가가 대상체의 치료되는 눈에 투여 후 12개월 동안, 같은 기간 동안의 치료되지 않은 눈에 비해, 적어도 10% 감소하는 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물의 투여가 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예를 들어, 망막 색소 상피(RPE)에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을, 임의로 대상체, 또는 이의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준까지 증가시키는 방법.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 안내 투여되는 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 망막하, 직접 망막으로, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물이 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 방법.
  28. 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 AAV 벡터:
    (a) SEQ ID NO: 3과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (b) SEQ ID NO: 4와 적어도 70% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    (c) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 바이러스 입자의 형태인 AAV 벡터.
  31. 제30항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 H 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CAG 프로모터, 바람직하게는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV 벡터.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항의 AAV 벡터로 트랜스펙션된 세포.
  34. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 또는 제33항의 세포를 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  35. 눈의 보체-매개된 장애를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물로서, 바람직하게는 상기 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨 망막병증, 바람직하게는 AMD, 바람직하게는 건성 AMD인 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, AAV 벡터가 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 대로 사용하기 위한 것인 AAV 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
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