KR20180065414A - Cftr 유전자 소실 유도 가이드 rna, cftr 변이를 갖는 t84 세포 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

일 양상에 따른 CFTR 유전자에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이를 포함한 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물, 이를 이용한 CFTR 유전자 변이를 갖는 세포, 및 이들을 이용한 방법을 제공한다. 이에 따르면, 세포 또는 개체의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시킬 수 있고, CFTR 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있으며, CFTR 매개 질환을 치료하기 위한 약물을 스크리닝 하는데 이용할 수 있다.

Description

CFTR 유전자 소실 유도 가이드 RNA, CFTR 변이를 갖는 T84 세포 및 이의 용도 {Guide RNA sequences for CFTR gene deletion, T84 cell having mutated CFTR protein and use thereof}

CFTR 유전자에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 벡터, 이를 포함한 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물, 이를 이용한 CFTR 유전자 변이를 갖는 세포, 및 이들을 이용한 방법에 관한 것이다.

유전체 편집 (genome editing)은 인간세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체 염기서열에 표적화된 돌연변이를 도입할 수 있는 기술로서, 특정 유전자를 넉아웃 (knock-out) 또는 넉인 (knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에 변이를 도입하는 것을 말한다. 유전자 가위는 유전자에 결합하여 특정 DNA 부위를 절단하여 사용하는 효소 또는 이를 이용한 유전체 편집 (genome editing) 기법을 말한다. 유전자 가위를 이용하여 줄기세포 또는 체세포에서 유전병의 원인이 되는 돌연변이 교정, 항암 세포 치료제와 같이 다양한 분야에서 활용할 수 있다. 유전자 가위로서, 1세대 유전자 가위로 ZFN (zinc finger nuclease), 2세대 유전자 가위로서 TALEN (transcriptional activator-like effector nuclease), 3세대 유전자 가위로서 CRISPR/Cas, 및 4세대 유전자 가위로서 CRISPR/Cpf1 등이 알려져 있다. Cas9 뉴클레아제와 적절한 가이드 (Guide) RNA를 세포 내로 전달함으로써, 세포의 유전체는 원하는 위치에서 절단되고 기존 유전자를 제거하고 새로운 유전자를 삽입할 수 있다. 유전자 가위를 이용하여 특정 DNA를 절단할 때, Cas9 뉴클레아제는 가이드 RNA의 서열에 의해 특정된 DNA 표적 서열을 절단한다. 유전자 가위를 이용하여 유전체를 편집하는 방법은 한국 공개 번호 10-2015-0101478 (2015.09.03) 등에 다수의 문헌을 통해 알려져 있다.

낭포성 섬유증 트랜스막 전도도 조절자 (cystic fibrosis conductance transmembrane regulator : CFTR)는 음이온의 수송을 조절하는 전달체의 한 종류로, 호흡기와 위장의 상피 세포에서 HCO3^- 분비 및 상피 세포 분비액의 분비 조절에 중요한 역할을 하고, 막을 통과하는 음이온 유동뿐만 아니라 기타 이온 채널 및 단백질의 활성을 조절하는 역할을 한다. CFTR에 의해 매개되는 질환은 낭포성 섬유증 뿐만 아니라 만성 폐색성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 안구 건조 질환 또는 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)이 있다.

CFTR 단백질의 유전 변이 중 가장 흔한 유전 변이는 CFTR의 508번째 아미노산인 페닐알라닌이 결실된 형태의 CFTR, 즉 △F508-CFTR이다 (William J. Welch/Seminars in Cell & Developmental Biology 15 (2004) 31-38). 낭포성 섬유증을 치료하기 위하여, △F508-CFTR 단백질의 세포막 활성 또는 발현을 증가시키는 약물에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있으나, 치료 효과가 우수한 약물을 스크리닝하기 위하여, △F508-CFTR 단백질을 발현하는 세포주에 대한 연구 및 개발이 미흡한 실정이다. 따라서, 야생형 CFTR 단백질 발현을 억제하고 나아가 △F508-CFTR 단백질을 발현하는 세포주를 제작하기 위한 전단계로서, CFTR 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 개발할 필요가 있다.

일 양상은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 2 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

다른 양상은 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 세포를 제공한다.

다른 양상은 CFTR 폴리펩티드 활성을 조절하는 피검 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 양상은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 2 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

낭포성 섬유증 트랜스막 전도도 조절자 (cystic fibrosis conductance transmembrane regulator : CFTR)는 음이온의 수송을 조절하는 전달체의 한 종류로, 호흡기와 위장의 상피 세포에서 HCO3^- 분비 및 상피 세포 분비액의 분비 조절에 중요한 역할을 하고, 막을 통과하는 음이온 유동뿐만 아니라 기타 이온 채널 및 단백질의 활성을 조절하는 역할을 한다. CFTR 유전자에 돌연변이가 발생하는 경우, 상피 세포 표면에 CFTR이 충분한 수로 존재하지 못하게 되거나 및/또는 상피 세포 표면에 존재하는 CFTR의 이온 채널 활성에 결함이 발생할 수 있다.

상기 CFTR 폴리펩티드는 야생형 CFTR 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드는 인간의 경우, GenBank Accession No. NP_000483.3로 등록된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 상기 GenBank Accession No. NP_000483.3로 등록된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 인간의 경우, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 중에서 엑손 1 또는 엑손 2의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 1 또는 엑손 2의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 5` 말단으로부터 (표적 1) 129 내지 148 번째 뉴클레오티드, (표적 2) 119 내지 138 번째 뉴클레오티드, 또는 (표적 3) 185 내지 204 번째 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5` 말단으로부터 (표적 1) 129 내지 148 번째 뉴클레오티드, (표적 2) 119 내지 138 번째 뉴클레오티드, 또는 (표적 3) 185 내지 204 번째 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 가이드 (guide) RNA인 것일 수 있다. 가이드 RNA는 표적 서열에 특이적인 RNA로서, Cas 폴리펩티드와 결합하여 Cas 폴리펩티드를 표적 핵산 서열로 인도할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-사슬 가이드 RNA (single-chain guide RNA : sgRNA)인 것일 수 있다. 가이드 RNA는 두개의 RNA, 즉 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 포함하는 것, 또는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)의 주요 부분의 융합으로 제조된 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 3 및 4의 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 서열번호 2의 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 1 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 2의 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5` 말단으로부터 (표적 1) 129 내지 148 번째 뉴클레오티드 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 2의 핵산 서열은 5'-GAGGCGACCUCUGCAUGGUC-3' 인 것일 수 있다.

서열번호 3의 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 1 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 3의 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 (표적 2) 119 내지 138 번째 뉴클레오티드 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 3의 핵산 서열은 5'-CUGCAUGGUCUCUCGGGCGC-3`인 것일 수 있다.

서열번호 4의 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 2 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 4의 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 185 내지 204 번째 뉴클레오티드 내 2 이상의 연속 서열과 상보적인 것일 수 있다. 서열번호 4의 핵산 서열은 5'-CAAAAUUGGUCUGGUCCAGC-3'인 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, PNA, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 것일 수 있다.

상기 핵산 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM) 또는 그의 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다. PAM은 구아닌 (guanine : G)이 많은 영역으로서, 유전자 편집이 일어나는 표적 서열을 타깃하는 역할을 한다. 즉 가이드 RNA는 PAM과 인접한 절단된 표적 서열 (프로토스페이서)을 찾아 결합한다. 상기 PAM은 5'-AGG-3', 5'-GGG-3', 5'-CGG-3' 및 5'-TGG-3'로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 뉴클레오티드 내지 40 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 예를 들면, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 뉴클레오티드인 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 유전자 가위 (programmable nuclease)의 구성요소일 수 있다. 유전자 가위는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제를 말한다. 상기 유전자 가위는 예를 들면, 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease : ZFN), TALEN (transcriptional activator-like effector nuclease), CRISPR/ Cas, 또는 CRISPR/ Cpf1이다.

상기 CRISPR/Cas는 RNA 유전자 가위 (RNA-guide engineered nuclease : RGEN)으로도 불리운다. 상기 CRISPR/Cas는 표적 서열을 절단하는 Cas 폴리펩티드와 절단될 서열과 상보적으로 결합하는 RNA로 구성된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/Cas를 구성하는 RNA인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/Cas를 구성하는 가이드 RNA인 것일 수 있다.

프로그래밍된 Cas 폴리펩티드는 PAM 근처에서 표적 서열에 이중 가닥 절단 (double strand break : DSB)을 유도한다. 상기 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 접합(non-homologous end-joining: NHEJ)에 의해 복구되는데, 이러한 복구 과정은 불완전하여 삽입/결실 (indel) 부위를 형성하거나, 또는 삽입/결실 부위를 형성하여 격자 이동 변이 (frame-shift mutation)를 유발할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 PAM 근처에서 CFTR 유전자의 표적 서열에 이중 가닥 절단을 유도한다. 상기 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 접합에 의해 복구되는데, 이러한 과정은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 삽입/결실 부위를 형성하여 격자 이동 변이를 유발할 수 있다. 변이가 유발된 CFTR 유전자는 그의 발현이 증가되거나 또는 억제될 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 세포 또는 개체에 도입되어 CFTR 가이드 RNA를 생성하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 세포 또는 개체에 도입되어 CFTR 가이드 RNA 및/또는 Cas 폴리펩티드를 발현하여, 세포 또는 개체 내에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 삽입/결실 부위를 형성하여 격자 이동 변이를 유발할 수 있다.

상기 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 및 Cong et al Science. 2013 Jan 3.)

상기 벡터는 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터인 것일 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터인 것일 수 있다.

상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 상기 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 벡터가 발현을 위한 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 갖을 수 있다. 한편, 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면 pSC101, ColE1, pBR322, pUC, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지 (예를 들면 λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면 SV40 등)을 조작하여 제작될 수 있다. 상기 벡터는 CBh 프로모터, U6 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

상기 벡터는 항생제 저항성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 퓨로마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜, 블라스티시딘 저항성 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는, 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, CFTR 폴리펩티드, 및 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 전술한 바와 같다.

상기 세포는 분비 기능을 수행하는 기관으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 폐, 기관지, 간, 췌장, 담관, 창자, 장관, 신장, 요관, 방광, 요도, 정소, 요도, 전립선, 방광, 음경, 항문, 요관, 난소, 자궁, 질, 땀샘 및 이의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 상피 세포, 종양 세포, 줄기 세포, 혈관내피 세포, 백혈구, 면역 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 골수 세포, 표피 세포, 골아세포, 신경세포 및 이의 조합인 것일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면 분비 기능을 수행하는 기관의 상피 세포인 것일 수 있다.

상기 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입, 삽입/결실 또는 그에 따른 격자 이동 돌연변이인 것일 수 있다. 상기 "변이"는 "제거" 또는 "돌연변이"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 변이는 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변경됨으로써 CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능이 증가하거나, 없어지거나 또는 감쇄되는 모든 변형을 의미한다.

상기 변이는, 상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 중에서 엑손 1 또는 엑손 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 1 또는 엑손 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 프로토스페이서 인접 모티브 (PAM) 부근 또는 그의 상류 영역에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입, 삽입/결실 또는 그에 의한 격자 이동 돌연변이를 갖는 것일 수 있다.

상기 변이는 한쌍의 상동 염색체 (대립인자, allele)에서 어느 하나, 또는 모두가 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 변이는 예를 들면, 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 (표적 1) 129 내지 148 번째 뉴클레오티드, (표적 2) 119 내지 138 번째 뉴클레오티드, 또는 (표적 3) 185 내지 204 번째 뉴클레오티드에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입, 삽입/결실 또는 그에 의한 격자 이동 돌연변이를 갖는 것일 수 있다. 또는 상기 변이는 예를 들면 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 128 내지 144 번째 뉴클레오티드가 결실되고, 128번째 위치에 구아닌 (G)이 삽입되고, 142, 143, 및 144 번째 위치에 각각 시토신 (C), 구아닌 (G) 및 아데닌 (A)이 삽입된 것일 수 있다. 예를 들면 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 124 내지 138번째 뉴클레오티드가 결실되고, 124, 125, 126, 127, 및 128번째 위치에 각각 구아닌 (G), 아데닌 (A), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)이 삽입되고, 134, 135, 136, 137 및 138번째 위치에 각각 아데닌 (A), 시토신 (C), 시토신 (C), 아데닌 (A) 및 티민 (T)이 삽입된 것일 수 있다.

상기 조성물은 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 투여용일 수 있다.

상기 조성물은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 세포 내로의 도입을 용이하게 할 수 있는 조성물, 및 제작 또는 세포 내로의 도입을 위한 설명서 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물인 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 CFTR 매개 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형 (예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형 (예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal), 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터 또는 이들의 조합을 유효한 양으로 포함하는 것일 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 조성물은 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 CRISPR/Cas는 표적 서열을 절단하는 Cas 폴리펩티드와 절단될 서열과 상보적으로 결합하는 RNA로 구성된다. 상기 Cas 폴리펩티드는 CRISPR/Cas의 구성 요소로서, 엔도뉴클레아제 또는 닉 (nick)을 형성하는 것일 수 있다.

상기 Cas 폴리펩티드는 미생물 유래 Cas 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 예를 들면, 스트렙토코커스 속 (예를 들면, Streptococcus pyogens), 네이세리아 속 (예를 들면, Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 속 (예를 들면, Pasteurella multocida), 프란시셀라 속 (예를 들면, Francisella novicida), 또는 캄필로박터 속 (예를 들면, Campylobacter jejuni)의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 GenBank Accession No. Q99ZW2.1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 GenBank Accession No. KT031982.1의 핵산 서열로부터 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물로부터 유래된 Cas 폴리펩티드는 코돈 최적화되어 인간화 (humanized)된 것일 수 있다.

상기 Cas 폴리펩티드는 재조합 단백질인 것일 수 있다.

상기 Cas 폴리펩티드는 야생형 Cas 폴리펩티드, 또는 돌연변이 Cas 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 돌연변이 Cas 폴리펩티드는 예를 들면 촉매적 아스파라긴산 잔기 (catalytic aspartate residue)가 다른 아미노산 (예를 들면, 알라닌)으로 변경된 Cas 폴리펩티드 변이체인 것일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 활성화된 Cas 폴리펩티드, 불활성화된 Cas (dCas) 폴리펩티드, 또는 Cas 니케이즈 (nickase)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 Cas5 폴리펩티드, Cas7 폴리펩티드, Cas8 폴리펩티드, Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 Cas9 폴리펩티드는 예를 들면, 야생형 Cas9 뿐만 아니라, 불활성화된 Cas9 (dCas9) 폴리펩티드, 또는 Cas9 니케이즈인 것일 수 있다. 상기 불활성화된 Cas9 폴리펩티드은 dCas9 폴리펩티드에 FokI 뉴클레아제 도메인을 연결한 RFN (RNA-guided FokI Nuclease), 또는 dCas9 폴리펩티드에 전사활성인자 (transcription activator) 또는 억제자 도메인 (repressor domain)을 연결한 것일 수 있고, 상기 Cas9 니케이즈는 D10A Cas9 또는 H840A Cas9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능을, 증가 또는 억제시키는 것일 수 있다. 상기 발현, 활성 또는 기능이 억제된 것은, 주어진 유전적 변형을 갖는 세포 (예를 들면, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 세포)에서의 폴리펩티드 활성이, 동일한 타입의 유전적 변형을 갖지 않는 세포 (음성 대조군, 예를 들면, 야생형 세포)에서의 폴리펩티드 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 감소된 것일 수 있다. 상기 발현, 활성 또는 기능이 증가된 것은, 주어진 유전적 변형을 갖는 세포 (예를 들면, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 세포)에서의 폴리펩티드 활성이, 동일한 타입의 유전적 변형을 갖지 않는 세포 (음성 대조군, 예를 들면, 야생형 세포)에서의 폴리펩티드 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드 활성 또는 기능은, 예를 들면 세포막에서 음이온, 예를 들면 Cl^- 의 통로로서의 활성 또는 기능을 의미한다.

다른 양상은 세포와 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키는 방법을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, CFTR 폴리펩티드, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 변이 및 CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능의, 증가 또는 억제는 전술한 바와 같다.

상기 인큐베이션은 세포와 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 배양하는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 세포가 생존 가능한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 생존 가능한 조건은 증식 가능한 조건 또는 휴지 상태로 있게 하는 조건일 수 있다. 상기 생존 가능한 조건은 CO₂, 온도, 습도, 및 배양 시간 등을 적절하게 조절할 수 있다.

상기 인큐베이션은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 외부로부터 세포에 내로 도입하는 것일 수 있다. 상기 세포 내로 도입하는 것은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 형질감염 또는 형질도입에 의해 세포로 유입시키는 것일 수 있다. 형질감염은 칼슘포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등에 의한 것일 수 있다.

상기 인큐베이션은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.

상기 방법은 상기 세포와 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드와 인큐베이션하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계는 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 또는 이들의 조합을 인큐베이션하는 단계와 동시, 그 이전, 또는 그 이후에 수행될 수 있다.

상기 방법은 핵산 서열을 변이시킴으로써 CFTR 폴리펩티드 발현을 음성 대조군에 비해 증가 또는 억제시키는 것일 수 있다. 상기 방법에 따르면, CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능이, 음성 대조군에 비해 증가 또는 억제될 수 있다.

다른 양상은 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 세포를 제공한다.

상기 세포는 인간으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 분비 기능을 수행하는 기관으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 폐, 기관지, 간, 췌장, 담관, 창자, 장관, 신장, 요관, 방광, 요도, 정소, 요도, 전립선, 방광, 음경, 항문, 요관, 난소, 자궁, 질, 땀샘 및 이의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 불멸화 (immortalization)된 것일 수 있다. 상기 세포는 세포주인 것일 수 있다. 상기 세포는 종양 세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 인간 결장 종양으로부터 유래된 세포 (예를 들면 T84), 대장 상피로부터 유래된 세포 (예를 들면 CACO-2, HT29), 기관지 상피로부터 유래된 세포 (예를 들면 Calu-3), 신장 상피로부터 유래된 세포 (예를 들면 MDCK), 코 점막 상피 세포 (Nasal epithelial cell), 췌장관 상피 세포 (예를 들면 CAPAN, PANC)인 것일 수 있다.

상기 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 것은, 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 일 양상에 따른 벡터, 일 양상에 따른 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물, 일 양상에 따른 세포의 유전체로부터 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키는 방법 또는 그의 조합에 의한 것일 수 있다.

상기 세포는 GenBank Accession No. NM_000492.3로 등록된 핵산 서열 중에서 엑손 1 또는 엑손 2의 핵산 서열에서 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면, 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 5` 말단으로부터 (표적 1) 129 내지 148 번째 뉴클레오티드, (표적 2) 119 내지 138 번째 뉴클레오티드, 또는 (표적 3) 185 내지 204 번째 뉴클레오티드에서 변이를 갖는 것일 수 있다.

상기 세포는 프로토스페이서 인접 모티브 (PAM) 부근 또는 그의 상류 영역에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입, 삽입/결실 또는 그에 의한 격자 이동 돌연변이를 갖는 것일 수 있다.

상기 세포는 야생형 CFTR 폴리펩티드 발현, 활성, 또는 기능이 증가 또는 억제된 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, CFTR 폴리펩티드, CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 변이 및 CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능의, 증가 또는 억제는 전술한 바와 같다.

상기 세포는 ΔF508-CFTR 폴리펩티드 발현이 증가된 것일 수 있다. 상기 세포는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 서열번호 5의 N 말단으로부터 508번째 아미노산인 페닐알라닌이 결실된 CFTR (ΔF508-CFTR) 폴리펩티드의 발현이 음성 대조군에 비해 증가된 것일 수 있다. 상기 ΔF508-CFTR 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 ΔF508-CFTR 폴리펩티드는 CFTR 단백질의 유전 변이 중 가장 흔한 유전 변이로서, CFTR의 아미노산 서열에서 508번째 아미노산인 페닐알라닌이 결실된 형태의 CFTR 단백질을 의미한다. CFTR의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산인 이소루신은 TAG에 의해 암호화되며, CFTR의 아미노산 서열에서 508번째 아미노산인 페닐알라닌은 AAA에 의해 암호화된다. 상기 △F508-CFTR 단백질은 상기 TAG 중에서 G, AAA 중에서 최초의 AA가 결실되어, 그 결과 507번째 및 508번째 아미노산을 암호화하는 코돈으로 TAA를 가진다. 상기 TAA는 이소루신을 암호화하지만, 야생형 CFTR의 아미노산 서열에서 508번째 아미노산인 페닐알라닌은 결실된다.

상기 △F508-CFTR 단백질은 구조적으로 미스폴딩된 즉 접힘불량 단백질이다. 이러한 △F508-CFTR 단백질은 소실된 페닐알라닌으로 인해 단백 접힘 현상이 비정상적으로 일어나 세포 내 단백 기능 검사를 통과하지 못하므로 세포막으로 도달이 어렵기 때문에 정상적인 Cl^- 통로 기능을 하지 못한다. 하지만 일단 △F508-CFTR 단백질이 세포막에 도달하면 Cl^- 통로로 기능할 수 있다.

상기 ΔF508-CFTR 폴리펩티드 발현이 증가된 것은 ΔF508-CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 외인성 (exogenous) 유전자를 하나 이상 포함하는 것에 의한 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주 세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 상기 세포의 게놈에 통합되거나, 그와 독립적으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 세포 내에 도입하는 것은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 전술한 바와 간다.

상기 ΔF508-CFTR 폴리펩티드 발현이 증가된 것은 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 ΔF508-CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 유전자를 세포 내로 도입하는 것에 의한 것일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노부속 바이러스 (adeno-associated virus: AAV) 등이 있으며, 그밖에 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV)와 폭스바이러스를 포함하는 것일 수 있다.

상기 ΔF508-CFTR 폴리펩티드 발현이 증가된 것은 레트로바이러스 벡터에 의해 ΔF508-CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 유전자를 세포에 도입하는 것에 의한 것일 수 있다.

표적 세포는 G0 기에 있을 때에는 레트로바이러스로 감염되지 않기 때문에 세포들을 전 처치 (prestimulation)하여 세포 주기로 유도할 수 있다.

상기 레트로바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터인 것일 수 있다. 상기 레트로바이러스 벡터는 복제-결손 재조합 레트로바이러스 벡터인 것일 수 있다. 이러한 벡터는 복제 능력이 약하기 때문에 감염된 세포 내에서 자가 복제할 수 없고 비병원성이다. 벡터가 팩키징되는 레트로바이러스는 척추동물 세포, 포유동물 세포와 같은 숙주 세포로 침투할 수 있으며 벡터 내에 삽입된 외인성 유전자를 염색체 DNA로 안정하게 도입시킨다.

상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것일 수 있다. 렌티바이러스는 렌티바이러스의 캡시드가 핵공을 통해 세포의 핵으로 진입하기 때문에 핵공 (nucleopore)이나 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하여 분열 세포 뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터는 패키징 (packaging) 벡터, 및/또는 외피 (envelope) 벡터를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 패키징 벡터는 gag-pol 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 외피 벡터는 특이적인 세포막 수용체 단백질 (specific cell surface receptor protein)과 결합할 수 있는 env 단백질을 발현하는 것일 수 있다.

상기 세포는 야생형 CFTR 폴리펩티드의 발현, 활성, 또는 기능이 억제되고, 동시에 ΔF508-CFTR 폴리펩티드를 발현하는 것일 수 있다.

상기 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00388인 세포주의 세포인 것일 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계; 인큐베이션된 세포에서의 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 단계; 및 측정된 CFTR 폴리펩티드 활성을 음성 대조군에 비해 증가 또는 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, CFTR 폴리펩티드 활성을 조절하는 피검 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 일 양상에 따른 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 및 인큐베이션에 대하여는 전술한 바와 같다.

피검 화합물은 CFTR 폴리펩티드 활성, 발현 또는 기능을 증가시킬 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 상기 CFTR 폴리펩티드 활성 또는 기능은, 예를 들면 세포막에서 음이온, 예를 들면 Cl^- 의 통로로서의 활성 또는 기능을 의미한다.

상기 CFTR은 폴리펩티드는 야생형 CFTR 폴리펩티드 또는 돌연변이 CFTR 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 돌연변이 CFTR 폴리펩티드는 ΔF508-CFTR 폴리펩티드인 것일 수 있다.

상기 방법은 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 방법은 할로겐화물 이온 퀀칭 (quenching), 세포내 알칼리화에 의한 Cl^-/HCO₃ ^- 교환, pH 변화, 패치-클램프 (patch-clamp) 기술을 이용한 CFTR의 Cl^- 전류 측정, 소포체에서 코어-당화 (ER core glycosylation)된 형태의 CFTR 폴리펩티드 (band B) 또는 골지 (Golgi)를 통해 완전히 당화 (the post-Golgi fully-glycosylation)된 형태의 CFTR 폴리펩티드 (band C)를 확인하는 웨스턴블롯, 면역형광염색 및 PCR 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 방법은 당업계에 알려진 폴리펩티드 활성을 측정하는 방법인 것일 수 있다.

상기 방법은 측정된 CFTR 폴리펩티드 활성을 음성 대조군에 비해 증가 또는 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 피검 화합물과 인큐베이션되지 않은 세포에서 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 단계 및 측정된 CFTR 폴리펩티드 활성을 상기 피검 화합물과 인큐베이션된 세포에서의 CFTR 폴리펩티드 활성과 비교하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 세포와 CFTR 폴리펩티드 활성을 증가시킬 것으로 예상되는 피검 화합물을 배양하고, CFTR 폴리펩티드 활성 또는 발현 수준이 피검 화합물을 처리하지 않은 세포, 즉 음성대조군에 비하여 피검 화합물 처리 세포에서 증가된 경우, 상기 피검 화합물이 CFTR 폴리펩티드 활성을 증가시키는 것으로 판단할 수 있다.

상기 방법은 CFTR 유전자 또는 CFTR 폴리펩티드 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝하기 위한 것일 수 있다. 상기 스크리닝된 피검 화합물은 낭포성 섬유증, 만성 폐색성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease : COPD), 안구 건조 질환, 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증, 천식, 부비동염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 마르판 증후군, 파브리병, 고쉐병, 색소성 망막염, 알츠하이머병, 제II형 당뇨병, 파킨슨병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 후보 화합물인 것일 수 있다.

상기 용어 "예방"은 상기 피검 화합물의 투여에 의해 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 피검 화합물의 투여에 의해 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

일 양상에 따른 세포와 CFTR 폴리펩티드 활성을 증가시킬 것으로 예상되는 피검 화합물을 배양하고, CFTR 폴리펩티드 활성 또는 발현 수준이 피검 화합물을 처리하지 않은 세포, 즉 음성대조군에 비하여 피검 화합물 처리 세포에서 증가된 경우, 상기 피검 화합물이 상기 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것으로 판단할 수 있다.

일 양상에 따른 CFTR 유전자에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 벡터, 이를 포함한 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물, 이를 이용한 CFTR 유전자 변이를 갖는 세포, 및 이들을 이용한 방법에 따르면, 세포 또는 개체의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시킬 수 있고, CFTR 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있으며, CFTR 매개 질환을 치료하기 위한 약물을 스크리닝 하는데 이용할 수 있다.

도 1A는 CFTR 유전자 상에서 표적 후보 서열 1, 2 및 3의 위치를 나타낸 것이다. 도 1B는 표적 서열 2와 상보적인 가이드 RNA 및 Cas9 뉴클레아제가 표적 서열을 2를 절단하는 과정을 나타낸 것이다. 도 1C는 CFTR 유전자 상의 표적 1, 2 및 3에서 변이가 일어난 위치 및 DNA 절편의 크기를 나타낸 것이다. 도 1D는 HEK293T 세포에서 가이드 RNA가 존재하는 경우에만 Cas9이 변이를 유발하고, 표적 1에 대하여 447bp의 DNA 절편, 표적 2에 대하여 457bp의 DNA 절편, 및 표적 3에 대하여 394bp의 DNA 절편이 생성되는 것을 나타낸 것이다. 도 1E는 T84 세포에서 가이드 RNA와 Cas9이 변이를 유발하고, DNA 절편이 생성되는 것을 나타낸 것이다.
도 2A는 대용 리포터 플라스미드의 구조로서, 상기 플라스미드는 구성적으로 발현되는 모노머 적색 형광 단백질 (monomeric Red Fluorescent protein : mRFP), 표적 서열, 및 프레임이 맞지 않는 (out of frame) 2개의 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein : eGFP)를 포함한다. 도 2B는 형질감염 3일 후, 대용 리포터 플라스미드와 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염시킨 T84 세포, 및 대용 리포터 플라스미드, Cas9을 암호화하는 플라스미드 및 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염시킨 T84세포 각각에서, RFP 및 GFP를 발현하는 정도를 형광현미경으로 관찰한 것이다. 도 2C는 형질감염 3일 후, 대용 리포터 플라스미드와 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 T84 세포, 및 대용 리포터 플라스미드, Cas9을 암호화하는 플라스미드 및 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 T84세포 각각에서, RFP 및 GFP를 발현하는 정도를 FACS로 나타낸 것이다. 도 2D는 RFP 양성, GFP 양성을 나타내는 세포군에서, 엑손 1 내 표적 2 영역에서의 변이 빈도를 T7E1 분석으로 나타낸 것이다.
도 3A는 7종의 클론의 DNA 서열 및 대조군인 야생형 T84 DNA 서열을 나타낸 것이다. 도 3B는 삽입/결실 (indel)이 일어난 #34 클론에서 CFTR 발현이 완전하게 억제된 것 및 유전자 편집이 일어나지 않은 #22 클론에서 CFTR 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다. 도 3C는 제작된 세포주에서 ΔF508-CFTR이 발현하는 것을 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다.
도 4A는 T84-ΔF508 세포에서 할로겐화물에 민감한 YFP가 발현하는 것을 형광 이미지로 나타낸 것이다. 도 4B는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, 및 27℃에서 CFTR_inh-172를 처리하여 반응시킨 경우, YFP 발현 정도를 나타낸 것이다. 도 4C는 T84-ΔF508 세포를 각각 VX-809, VX-809와 VX-770, 및 VX-809와 CFTR_inh-172로 처리하여 반응시킨 경우, YFP 발현 정도를 나타낸 것이다. 도 4D는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, VX-809, VX-809와 VX-770, 및 VX-809와 CFTR_inh-172로 처리하여 반응시킨 경우, CFTR 채널의 활성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 4E는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, 및 VX-809를 처리하여 반응시킨 경우, 밴드 C가 형성되는지를 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CFTR 가이드 RNA의 스크리닝, CFTR 가이드 RNA를 이용한 세포 내에서 CFTR 단백질 발현 감소 확인, 및 CFTR 발현이 억제된 안정한 세포주 제작

1. CFTR 유전자에서 표적 부위의 선정 및 CFTR 가이드 RNA를 발현하는 플라 스미드 제작

CFTR 유전자를 제거하기 위하여, CFTR 가이드 RNA (single-chain guid RNA : sgRNA)를 암호화하는 플라스미드를 제작하였다.

가이드 RNA를 발현하는 플라스미드로, BbsI (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) 클로닝 부위, CRISPR RNA (crRNA)/트랜스-활성화 crRNA 키메라 및 인간화된 (humanized) S. pyogenes Cas9을 포함하는 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid #42230) 벡터를 이용하였다.

인간 CFTR 유전자에서 2개의 엑손을 가이드 RNA의 표적 후보로 선정하였다. 상기 엑손은 CFTR 단백질의 N 말단에 위치하는 아미노산 서열을 암호화한다.

온라인 툴 (tool)을 사용하여, 인간 CFTR 엑솜에서 20bp의 표적-3bp의 프로토스페이서 인접 모티브 (protospacer adjacent motif : PAM) 서열을 갖는 부위를 확인하였다. 3종의 표적 후보 서열의 위치를 도 1A에 나타내었다.

3종의 표적 후보 서열에 대한 가이드 RNA는 다음과 같이 설계하였다. 표적 서열과 상보적인 가닥의 3' 서열은 트리뉴클레오티드 PAM, 즉 5'-NGG-3'의 서열을 갖도록 하였다. 또한, 예를 들면 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 말단이 AUG (ATG) 시작 코돈을 포함하고 DNA 표적 2 부위와 쌍을 이루도록 설계하였다. 도 1B를 참조하면, 표적 서열과 상보적인 가닥의 3' 서열은 트리뉴클레오티드 PAM, 즉 5'-AGG-3'의 서열을 갖으며, 가이드 RNA는 AUG 시작 코돈 (붉은 글씨로 기재)을 포함하도록 설계하였다.

엑손 1에 존재하는 5'-gaccatgcagaggtcgcctc-3', 5'-gcgcccgagagaccatgcag-3', 및 엑손 2에 존재하는 5'-gctggaccagaccaattttg-3'를 표적 후보로 하였다. 그와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제작하였다 (엑손 1 내 표적 1과 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열: 5'-GACCATGCAGAGGTCGCCTC-3' (서열번호 6) 및 5'-GAGGCGACCTCTGCATGGTC-3' (서열번호 7); 엑손 1 내 표적 2와 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열: 5'-GCGCCCGAGAGACCATGCAG-3' (서열번호 8) 및 5'-CTGCATGGTCTCTCGGGCGC-3' (서열번호 9); 및 엑손 2 내 표적 3과 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열: 5'-GCTGGACCAGACCAATTTTG-3' (서열번호 10) 및 5'- CAAAATTGGTCTGGTCCAGC-3' (서열번호 11)). 엑손 1 내 표적 1과 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열, 표적 2와 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열, 및 엑손 2 내 표적 3과 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 각각 합성하고 (Cosmo Genetech, Seoul, South Korea), T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (New England Biolabs)를 이용하여 어닐링 (Annealing)하였다.

각 쌍의 올리고 뉴클레오티드를 인산화시키고 어닐링하기 위하여, PCR 반응 혼합물 20㎕를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 반응 혼합물은 100mM의 정방향 올리고 뉴클레오티드 2㎕, 100mM의 역방향 올리고 뉴클레오티드 2㎕, 10x T4 리게이션 (ligation) 버퍼 2㎕, 증류수 11㎕ 및 T4 PNK 1㎕를 포함한다. 어닐링 조건은 37℃에서 45분, 이어서 95℃에서 5분, 이어서 25℃으로 램핑 (ramping)하는 단계 (분당 5℃)로 설정하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 BbsI 제한효소로 절단된 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 벡터에 리게이션하였다. 상기 벡터는 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로서, pX330-CFTR 가이드 RNA 플라스미드로 명명하였다. 상기 pX330-CFTR 가이드 RNA 플라스미드는 표적 1에 대하여 pX330-CFTR 가이드 RNA-1, 표적 2에 대하여 X330-CFTR 가이드 RNA-1, 및 표적 3에 대하여 pX330-CFTR 가이드 RNA-3을 각각 포함한다.

2. 세포 배양, 세포 내에 CFTR 가이드 RNA 도입 및 면역블롯 분석 방법

인간 배아 신장 세포주인 HEK293T 세포 및 인간 결장암 세포주인 T84에 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염 (transfection)시키고, 그 발현 정도를 GFP 및 면역블롯으로 확인하였다.

세포 배양 및 형질감염은 다음의 방법으로 수행하였다. HEK293T 세포를 페니실린 100 유닛/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖ 및 10%의 우태아혈청 (foetal bovine serum : FBS) 를 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)-HG에서, 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. T84 세포를 페니실린 100 유닛/㎖, 스트렙토마이신 100㎍ /㎖ 및 5%의 FBS를 포함하는 DMEM/F-12에서, 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 형질감염시키 하루 전에 배양 플레이트 (plate)에서 세포의 컨플루언시 (confluency)가 약 70 내지 80%가 되도록 세포를 분주하였다.

HEK293T 세포를 리포펙타민을 이용하여 상기 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. HEK293T 세포가 분주된 6웰 플레이트에, 플라스미드 2㎍ 및 리포펙타민 6㎕을 opti-MEM (Invitrogen)과 함께 첨가하였다. T84 세포를 리포펙타민 2000을 이용하여 상기 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. T84 세포가 분주된 6웰 플레이트에, 플라스미드 2㎍ 및 리포펙타민 2000 6㎕을 opti-MEM (Invitrogen)과 함께 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, 혈청을 포함하는 배지로 교환하였다.

형질감염의 효율을 측정하기 위하여, 형질감염 36시간 후 GFP 발현 정도를 확인하였다. 형광 현미경 이미지를 관찰한 결과, HEK293T 세포는 약 80%가 형질감염되었으며, T84 세포는 약 10% 미만으로 형질감염되었다.

면역블롯 (웨스턴블롯) 분석은 다음의 방법으로 수행하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 회수하고, 프로테아제 억제제 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 포함하는 용해 버퍼 (1% NP-40, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM Tris/HCl, pH 7.4)로 용해하였다. 용해된 세포를 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔사를 제거하고, 상층의 용해물을 수득하였다. 수득된 용해물을 2x SDS 샘플 버퍼와 혼합하여, 4 내지 12% (w/v)의 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 (nitrocellulose : NC) 멤브레인으로 이동시키고, 이 멤브레인을 5% (w/v)의 탈지분유를 포함하는 TBST (0.1 % Tween 20을 포함하는 Tris-완충 식염수)와 반응시켜 비특이적인 결합을 차단하였다. 이어서, 멤브레인을 1차 항체, 항-CFTR M3A7 (Millipore Billerica, MA, USA) 및 항-알돌라제 (aldolase) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)) 및 2차 항체와 반응시킨 후, 증강된 화학발광 용액 (Enhanced chemiluminescence solution : ECS) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA))와 반응시켜 단백질 밴드를 검출하였다.

3. T7E1 분석

상기 가이드 RNA 서열을 이용하는 경우 CFTR 유전자에서 변이가 일어나는지 확인하기 위하여, T7E1 분석을 수행하고 변이 빈도를 측정하였다. T7E1 분석 방법은 당업계에 공지된 방법을 따라 수행하였다 (Kim et al. 2009; Ramakrishna et al. 2014).

HEK293T 세포 및 T84 세포에 각각 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염시켰다. HEK293T 세포는 리포펙타민을 이용하여 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드, pX330-CFTR 가이드 RNA-1, X330-CFTR 가이드 RNA-2, 및 pX330-CFTR 가이드 RNA-3 각각으로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 세포를 회수하고, 게놈 (genomic) DNA를 GeneJET 게놈 DNA 정제 키트 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 분리하였다. CFTR 유전자의 엑손 1 및 엑손 2를 게놈 DNA 특이적인 프라이머로 증폭하였다. 엑손 1에 특이적인 프라이머는, 정방향 프라이머 5'-AATTGGAAGCAAATGACATC-3' (서열번호 12), 및 역방향 프라이머 5'-TGAAGAATCATTTACCTGTG-3' (서열번호 13)이다. 엑손 2에 특이적인 프라이머는, 정방향 프라이머 5'-GAGGCTGGACTTCAGTAATTTG-3' (서열번호 14) 및 역방향 프라이머 5'-CAAGTAACCCTCCTGCTTCAG-3' (서열번호 15)이다.

동형이중가닥 (homoduplex) PCR 증폭산물 (amplicon) 10㎕, 10x 반응 버퍼 2㎕ 및 증류수를 혼합하여 20㎕의 혼합물을 만들고, 이 혼합물을 단계-하강 (step-down) 어닐링 조건 (95℃에서 10분; 95℃에서 85℃로 램핑 (ramping) (-2℃/s); 85에서 25℃로 램핑 (-0.25℃/s); 및 25℃에서 1분 동안 유지)에서 변성 (denaturation) 및 재혼성화 (rehybridization)하여 동형이중가닥 및 이형이중가닥 DNA를 생성하였다. 이중가닥 혼합물을 T7 엔도뉴클레아제 1 (New England Biolabs)과 37℃에서 20분 동안 반응시켜 절단 (digestion)하였다. 음성 대조군은 가이드 RNA를 포함하지 않는 것을 사용하였다. 절단된 산물을 2% 아가로스 젤에 옮겨 전기영동을 수행하고 DNA 절편의 크기를 밴드로 확인하였다. 밴드의 강도를 멀티 게이지 v3.1 소프트웨어 (Fuji Photo Film Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하고, 다음의 방정식을 사용하여 삽입/결실 (indel) 변이 빈도를 계산하였다 [변이 빈도 (%) = 100 x (1 -(1-fraction cleaved)^1/2)] (Guschin et al. 2010).

도 1C는 CFTR 유전자 상의 표적 1, 2 및 3에서 변이가 일어난 위치 및 DNA 절편의 크기를 나타낸 것이다. T7E1 분석 결과, 표적 1, 2 및 3에서 미스매치 (mismatch)된 부위가 절단되어, 엑손 1에서 447bp 또는 457bp의 DNA 절편, 엑손 2에서 394bp의 DNA 절편이 생성되는 것을 예상할 수 있다.

도 1D는 HEK293T 세포에서 가이드 RNA가 존재하는 경우에만 Cas9이 변이를 유발하고, 표적 1에 대하여 447bp의 DNA 절편, 표적 2에 대하여 457bp의 DNA 절편, 및 표적 3에 대하여 394bp의 DNA 절편이 생성되는 것을 나타낸 것이다. 붉은색 화살표는 T7E1에 의해 미스매치된 부분이 절단되어 생긴 DNA 절편을 나타낸다. 도 1D에 나타낸 바와 같이, Cas9은 가이드 RNA가 있는 경우에만 표적 DNA 서열을 예상되는 위치에서 변형시켰다. 레인 (lane) 아래에 각각의 표적에 대한 삽입/결실 (Indel) 변이 빈도를 퍼센트로 나타내었다. 표적 1, 2 및 3의 표적 후보에서 삽입/결실 변이가 일어났으며, 그 중에서, 표적 2는 가장 높은 빈도의 변이를 나타내었다. 엑손 1의 표적 2에 대한 CFTR 가이드 RNA 서열이, 내인성 CFTR 유전자에서 가장 효율적으로 삽입/결실 (indel) 변이를 생성하는 것을 확인하였다.

T84 세포를 리포펙타민 2000을 이용하여 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고, 상기한 바와 동일한 실험을 수행하였다. 도 1E는 T84 세포에서 Cas9이 변이를 유발하고, 표적 1,2 및 3에 대하여 DNA 절편을 생산한 결과를 나타낸 것이다. 단, 도 1E에 나타낸 바와 같이, T84 세포의 경우 HEK293T 세포의 경우에 비하여 변이를 갖는 세포를 아가로스 겔 상에서 거의 관찰하지 못하였다. 이로부터, 낮은 형질감염 효율을 갖는 세포, 예를 들면 T84 세포는 Cas9 시스템에서 변이 빈도를 증가시키거나 또는 편집된 세포만을 수득하기 위한 다른 전략을 필요로 함을 알 수 있다.

4. 대용 (surrogate) 리포터 플라스미드를 사용하여 T84 세포에서 CFTR 유전자 변이를 갖는 세포 선별

형질감염된 세포 중에서도, 뉴클레아제에 의해 유도된 게놈 편집은 일부 세포에서만 일어날 수 있다. 따라서, 대용 리포터 플라스미드를 형질감염시켜, Cas9에 의해 유도된 변이를 갖는 세포를 형광표지 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting : FACS)를 이용하여 선별하였다.

대용 리포터 플라스미드를 다음의 원리에 따라 제작하였다 (Ramakrishna et al. 2014). 표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 (Cosmo Genetech), 서모 사이클러 (thermocycler)를 사용하여 인 비트로에서 (in vitro) 어닐링한다 (95℃에서 5분, 이어서 25℃로 램핑 다운 (분당 5℃)). 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 제한효소, 예를 들면 EcoR1 및 BamH1으로 절단된 리포터 벡터, pRG25에 리게이션한다. 상기 벡터는 프레임을 변경하거나 또는 표적 부위의 방향을 변경하여 표적 부위에서 프레임 내 종결 코돈이 생성되는 것을 조절할 수 있다.

도 2A는 대용 리포터 플라스미드의 구조로서, 상기 플라스미드는 구성적으로 발현되는 모노머 적색 형광 단백질 (monomeric Red Fluorescent protein : mRFP), 표적 서열, 및 프레임이 맞지 않는 (out of frame) 2개의 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein : eGFP)를 포함한다. RFP는 CMV 프로모터 (pCMV)로 인해 구성적으로 발현되는 반면, GFP는 GFP의 서열이 Cas9 뉴클레아제 활성이 없는 경우에 격자를 벗어나므로 (out of frame) 발현되지 않는다. 프로그래밍된 Cas9 뉴클레아제에 의해 표적 서열에 이중 가닥 절단 (double strand break : DSB)이 도입되면, 상기 이중 가닥 절단은 NHEJ에 의해 복구되는데, 이러한 과정은 삽입/결실 (indel) 부위를 형성하고, 격자 이동 변이 (frame-shift mutation)를 유발한다. 유발된 격자 이동 변이는 GFP를 발현시킨다. 따라서, GFP가 발광하는 것은 세포의 표적 부위에 변이가 일어난 것을 의미한다.

T84 세포를 리포펙타민 2000을 이용하여 대용 리포터 플라스미드, Cas9을 암호화하는 플라스미드 및 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 공-형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후 상당수의 세포가 RFP를 발현하는 것이 관찰되었으나, GFP를 발현하는 세포는 거의 관찰되지 않았다. 도 2B는 형질감염 3일 후, 대용 리포터 플라스미드와 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염시킨 T84 세포, 및 대용 리포터 플라스미드, Cas9을 암호화하는 플라스미드 및 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드를 형질감염시킨 T84세포 각각에서, RFP 및 GFP를 발현하는 정도를 형광현미경으로 관찰한 것이다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, 형질감염 후 3일에 걸쳐, GFP를 발현하는 세포의 수는 점차적으로 증가하였으며, GFP를 발현하는 세포는 모두 RFP를 발현하였다.

형질감염 3일 후, 플레이트 바닥에 붙어있는 (adherent) 세포에 트립신을 첨가하여 바닥에서 떨어뜨리고, 2%의 FBS를 포함하는 PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 단일 세포로 현탁하고 (single cell suspension), 형광표지 세포 분류를 FACSAria II 세포 분류기 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 뉴클레아제에 의해 유도된 변이를 갖는 세포를 수집하기 위하여, RFP 양성, GFP 양성 신호를 갖는 세포를 96웰 플레이트에 분류하였다. 형질감염되지 않은 세포 및 리포터만으로 형질감염된 세포를 대조군으로 사용하였다.

도 2C는 형질감염 3일 후, 대용 리포터 플라스미드와 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 T84 세포, 및 대용 리포터 플라스미드, Cas9을 암호화하는 플라스미드 및 CFTR 가이드 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 T84세포 각각에서, RFP 및 GFP를 발현하는 정도를 FACS로 나타낸 것이다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 형질감염 3일 후, 3.2%의 세포는 RFP 양성, GFP 양성을 나타내었다.

RFP 양성, GFP 양성을 나타내는 세포군을 분류하고, Cas9에 의해 유도된 변이 정도를 T7E1 분석으로 측정하였다. 도 2D는 RFP 양성, GFP 양성을 나타내는 세포군에서, 엑손 1 내 표적 2 영역에서의 변이 빈도를 T7E1 분석으로 나타낸 것이다. 도 2D에서 나타낸 바와 같이, T84 세포에서 표적 2에 대한 변이 빈도는 약 39.7%로, 가이드 RNA에 의하여 CFTR 유전자에 변이가 유발되었으며, 유전자 편집된 세포가 양호하게 수득되었음을 확인하였다.

5. CFTR 발현이 억제된 클론 선별

분류된 세포에서 각각의 클론을 96웰 플레이트에 분주하였다. 그 중에서 7종의 클론을 24웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 배양된 세포에서 유전자 편집이 일어났는지 여부를 확인하기 위하여, 7종의 클론 집단으로부터 추출된 게놈 DNA에서 엑손 1 영역을 PCR을 사용하여 증폭하였다.

증폭 산물에서 표적 유전자에 변이가 일어났는지 여부를 생거 시퀀싱 (Sanger sequencing)으로 검출하였다 (Ran et al. 2013). 증폭 산물을 정제하고, T-Blunt PCR 클로닝 키트 (SolGent, Daejeon, South Korea)를 사용하여 T-벡터 (T-vector)에 클로닝하였다. 각각의 플레이트에서, 8 또는 10개의 콜로니를 취하고 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니 프렙 (mini-prep)을 수행하였다. 얻어진 DNA를 M13(-20) 역방향 프라이머를 사용하여 시퀀싱하여, Cas9에 의해 유도된 NHEJ 변형을 확인하였다.

도 3A는 7종의 클론의 DNA 서열 및 대조군인 야생형 T84 DNA 서열을 나타낸 것이다. 가이드 RNA와 상보적인 20bp의 표적 서열은 밑줄로 표시하였다. 3bp의 TAM 서열을 파랑색으로 표시하였다. 결실된 서열은 -로 표시하였다. 삽입된 서열은 붉은 색으로 표시하였다. 괄호 ( )안에 결실된 서열의 개수는 -, 삽입된 서열의 개수는 +로 표시하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 7종의 클론 중에서 6종의 클론 (#9, #11, #13, #15, #30 및 #34 클론)은 변이를 가지고 있었다. 반면, 7종의 클론 중에서, 1종의 클론 (#22 클론)은 변이를 가지고 있지 않았다. 특히, 7종의 클론 중에서 #34 클론은, 상동염색체 (대립인자, allele) 1에서 17bp의 뉴클레오티드 결실 (deletion) 변이를 갖고 4bp의 뉴클레오티드 삽입 (insertion) 변이를 갖았으며, 상동염색체 (대립인자, allele) 2에서 15bp의 뉴클레오티드 결실 변이를 갖고 10bp의 뉴클레오티드 삽입 변이를 갖는 것으로 나타났다. 클론 #34에서의 변이는 삽입/결실 (indel)에 의하여 격자 이동 (frame-shift) 변이를 유발하고, 새로운 시작 코돈을 생성하여, 기능이 억제된 CFTR 유전자 산물을 생성하였다.

도 3B는 삽입/결실 (indel)이 일어난 #34 클론에서 CFTR 발현이 완전하게 억제된 것 및 유전자 편집이 일어나지 않은 #22 클론 및 야생형에서 CFTR 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다. HEK293T를 ΔF508-CFTR를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, HEK293T 세포에서 과발현된 ΔF508-CFTR 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다. 알돌라제 발현을 확인하여, 웨스턴 블롯 분석에서 동일한 양의 단백질이 사용된 것을 확인하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, #34 클론에서는 CFTR 단백질이 거의 발현되지 않았다. 반면, 야생형 T84 세포에서와 유전자 편집이 일어나지 않은 #22 클론에서는 CFTR 단백질이 분명하게 발현되었다.

6. 바이러스 (virus) 생성

ΔF508-CFTR를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 다음과 같이 제작하였다 (Lee et al. 2015). ΔF508-CFTR를 암호화하는 바이러스를 제작하기 위하여, ΔF508-CFTR를 암호화하는 유전자를 렌티바이러스 벡터, pLenti6P의 XbaI 제한 효소 부위에 삽입하였다. 상기 ΔF508-CFTR를 암호화하는 유전자는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함한다. 형질감염 1일 전에 미리, 약 0.7 x 10⁶ 개의 HEK293T 세포를 6웰 플레이트에 분주하였다. 렌티바이러스 플라스미드 pLenti6P-ΔF508-CFTR, 패키징 (packaging) 벡터 psPAX2 및 엔벨로프 (envelope) 벡터 pMD2.G를 3:3:1로 혼합하였다. 이어서, HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 포함하는 opti-MEM (Invitrogen)을 이용하여 혼합된 DNA 3㎍로 6시간 동안 형질감염시켰다. 형질감염 후 배지를 DMEM/F-12 1.5㎖로 교환하여 형질감염 시약을 제거하였다. 형질감염 1일 후 렌티바이러스 입자를 포함하는 배지를 수집하고, 24시간 후에 바이러스 수득을 반복하였다. 바이러스 입자를 포함하는 배지를 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 잔사를 제거하고, -80℃에서 보관하였다.

7. 바이러스 감염을 이용하여 ΔF508 - CFTR를 발현하는 갖는 안정한 세포주 (stable cell line), T84- ΔF508 제작

렌티 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 T84 세포 #34 클론을 기반으로 ΔF508-CFTR를 발현하는 안정한 세포주를 제작하였다. 바이러스 감염 전날, T84 세포 #34 클론을 웰 당 약 10⁶개의 세포가 되도록 12웰 플레이트에 분주하였다. 배양 배지를 폴리브렌 8㎍/㎖ (시그마)를 포함하는 신선한 배지로 교환하고 8시간 동안 배양하였다. 이어서, 상층액을 렌티바이러스 입자 0.5㎖를 포함하는 신선한 배지 0.5㎖로 교체하고 밤새 배양하였다. 형질감염 24시간 후, 배지를 신선한 배지로 교환하였다. 바이러스 감염 3일 후, 배지를 퓨로마이신 10㎍/㎖ (시그마)를 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 2주 후, 바이러스가 도입된 (integration)된 퓨로마이신에 저항성을 갖는 클론을 선별 및 배양하였다. 배지가 황색 (yellow)으로 변하기 시작한 때, 신선한 배지를 첨가하였다. 외관상으로 클론을 형성하는 콜로니를 24웰 플레이트에 옮기고 콜로니를 취하였다.

도 3C는 제작된 세포주에서 ΔF508-CFTR이 발현하는 것을 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다. T84 세포주는 대조군으로 사용하였다. HEK293T를 ΔF508-CFTR를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, HEK293T 세포에서 과발현된 ΔF508-CFTR 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다. 알돌라제 발현을 확인하여, 웨스턴 블롯 분석에서 동일한 양의 단백질이 사용된 것을 확인하였다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, T84 세포 #34 클론에 ΔF508-CFTR를 도입하여, ΔF508-CFTR 단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 제작된 안정화된 세포주를 T84-ΔF508로 명명하였다. T84-ΔF508 세포주를 한국세포주은행에 기탁번호 KCLRF-BP-00388로 기탁하였다.

8. T84- ΔF508 세포주의 유용성 평가

T84-ΔF508 세포에서 ΔF508-CFTR의 기능적인 활성이 회복되는지 여부를 할로겐화물에 민감한 황색 형광 단백질 (Yellow fluorescent protein : YFP)의 발현 정도로 모니터링하였다 (Namkung et al.2011, 2013). 이 때, 할로겐화물 음이온이 CFTR을 통하여 세포막을 투과하는 원리를 이용하였다.

T84-ΔF508 세포를 할로겐화물에 민감한 YFP (F46L/H148Q/I152L)로 형질감염시켰다 (Dr. Alan Verkman, University of California, San Francisco). T84-ΔF508 세포를 96웰의 검정색 벽으로 된 (black-walled) 마이크로플레이트 (microplate)에 분주하였다. 세포가 플레이트 바닥에 찬 (confluent) 후에, 세포를 상대적으로 낮은 온도인 27℃에서 24시간 동안 배양하거나 또는 10μM의 VX-809과 함께 24시간 동안 배양하였다.

YFP 퀀칭 (quenching) 분석은 FLUO star Omega 마이크로 플레이트 리더 (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) 및 MARS 데이터 분석 소프트웨어 (BMG Labtech)를 사용하여 수행하였다. 96웰 플레이트의 각 웰을 PBS 200㎕로 3회 세정하였다. PBS 100㎕를 각 웰에 첨가하고, ΔF508-CFTR을 10μM의 포르스콜린 (forskolin)으로 활성화시켰다. 상기의 96웰 플레이트를 37℃로 예열된 마이크로플레이트 리더기에 옮기고, 각각의 웰에서 요오드화물 유입에 따른 YFP 형광 정도를 연속적으로 측정하였다. 구체적으로, 각각의 웰에서 지점 당 500ms로 2초 (기준)동안 형광을 측정하고, 이어서 140mM의 NaI, 5mM의 KCl, 1mM의 MgCl₂, 1mM의 CaCl₂, 10D-글루코스, 및 HEPES (pH 7.4)를 포함하는 140mM의 요오드화물 용액 100㎕를 2초에 첨가하고, YFP 형광을 14초 동안 기록하면서, ΔF508-CFTR 매개 요오드화물 유입을 분석하였다. 초기 요오드화물 유입 속도는, 요오드화물의 주입 후 비선형 회귀 (nonlinear regression)에 의하여, 초기에 형광이 감소되는 기울기에 근거하여 결정하였다.

도 4A는 T84-ΔF508 세포에서 할로겐화물에 민감한 YFP가 발현하는 것을 형광 이미지로 나타낸 것이다. 도 4B는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, 및 27℃에서 CFTR_inh-172를 처리하여 반응시킨 경우, YFP 발현 정도를 나타낸 것이다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 37℃에서 세포를 배양한 경우, YFP 신호는 유의한 변화를 보이지 않은 반면, 상대적으로 낮은 온도인 27℃에서 세포를 배양한 경우, ΔF508-CFTR가 점진적으로 회복되어, YFP 신호가 점진적으로 감소하였다. CFTR_inh-172를 처리한 경우 회복된 ΔF508-CFTR이 요오도화물 유입을 완전히 억제하였다.

ΔF508-CFTR을 발현하는 세포를 30℃ 이하의 저온에서 배양하면 ERQCS (Endoplasmic reticulum (ER) quality control system)를 억제함으로써 ΔF508-CFTR의 세포막 발현을 증가시킬 수 있다 (Randell et. al. J. Clin. Invest. 99:1432-1444, 1997). VX-809는 ΔF508-CFTR의 중화제 (corrector)로서, NBD1에 작용하여 ΔF508-CFTR 단백질에서 폴딩 (folding) 결함을 중화하는 것으로 알려져 있다 (Van Goor et al. 2011). 즉 VX-809는, 단백질 폴딩시에 샤페론과 같은 역할을 하며, 세포 표면으로 수송되는 CFTR 단백질의 수를 증가시키는 물질이다. 한편, VX-770은 CFTR의 강화제 (potentiator)로서, ATP 의존적인 방식으로 아생형 CFTR의 개방 시간 (open time)를 증가시키는 물질이다 (Okiyoneda et al. 2013).

도 4C는 T84-ΔF508 세포를 각각 VX-809, VX-809와 VX-770, 및 VX-809와 CFTR_inh-172로 처리하여 반응시킨 경우, YFP 발현 정도를 나타낸 것이다. VX-809가 T84-ΔF508 세포에서 ΔF508-CFTR의 기능을 회복하는지 확인하기 위하여, T84-ΔF508 세포를 VX-809와 함께 24시간 동안 배양하였다. VX-809를 처리하는 경우 회복된 ΔF508-CFTR를 통하여 요오드화물 유입이 현저하게 증가하였고, VX-770와 함께 처리하는 경우, 회복된 ΔF508-CFTR를 통하여 요오드화물 유입이 더욱 증가하였다. 또한, VX-809에 의해 유도된 요오드화물 유입은 CFTR_inh-172에 의해 완전하게 억제되었다. 도 4D는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, VX-809, VX-809와 VX-770, 및 VX-809와 CFTR_inh-172로 처리하여 반응시킨 경우, CFTR 채널의 활성을 그래프로 나타낸 것이다. ΔF508-CFTR를 발현하지 않는 CFTR이 넉아웃된 T84 세포에서 요오드화물 유입 여부를 확인하였다. 그 결과, 요오드화물 유입은 관찰되지 않았다. 도 4E는 T84-ΔF508 세포를 각각 37℃에서, 27℃에서, 및 VX-809를 처리하여 반응시킨 경우, 밴드 C가 형성되는지를 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다. 알돌라제 발현을 확인하여, 웨스턴 블롯 분석에서 동일한 양의 단백질이 사용된 것을 확인하였다. T84-ΔF508 세포를 각각 상대적으로 낮은 온도인 27℃에서, 및 10μM의 VX-809를 혼합하고 24시간 동안 배양한 경우, ΔF508의 밴드 C가 명확하게 관찰되었다. 이러한 결과로부터 T84-ΔF508 세포주가 회복된 ΔF508-CFTR의 기능을 측정하는데 유용한 모델임을 알 수 있다.

기탁기관명 : 한국세포주연구재단

수탁번호 : KCLRFBP00388

수탁일자 : 20161115

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Guide RNA sequences for CFTR gene deletion, T84 cell having mutated CFTR protein and use thereof <130> PN116634 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6132 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aattggaagc aaatgacatc acagcaggtc agagaaaaag ggttgagcgg caggcaccca 60 gagtagtagg tctttggcat taggagcttg agcccagacg gccctagcag ggaccccagc 120 gcccgagaga ccatgcagag gtcgcctctg gaaaaggcca gcgttgtctc caaacttttt 180 ttcagctgga ccagaccaat tttgaggaaa ggatacagac agcgcctgga attgtcagac 240 atataccaaa tcccttctgt tgattctgct gacaatctat ctgaaaaatt ggaaagagaa 300 tgggatagag agctggcttc aaagaaaaat cctaaactca ttaatgccct tcggcgatgt 360 tttttctgga gatttatgtt ctatggaatc tttttatatt taggggaagt caccaaagca 420 gtacagcctc tcttactggg aagaatcata gcttcctatg acccggataa caaggaggaa 480 cgctctatcg cgatttatct aggcataggc ttatgccttc tctttattgt gaggacactg 540 ctcctacacc cagccatttt tggccttcat cacattggaa tgcagatgag aatagctatg 600 tttagtttga tttataagaa 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His Arg Asn Ser Ser 1445 1450 1455 Lys Cys Lys Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu 1460 1465 1470 Glu Glu Val Gln Asp Thr Arg Leu 1475 1480 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target1 <400> 6 gaccatgcag aggtcgcctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target1 <400> 7 gaggcgacct ctgcatggtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target2 <400> 8 gcgcccgaga gaccatgcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target2 <400> 9 ctgcatggtc tctcgggcgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target3 <400> 10 gctggaccag accaattttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary oligos for target3 <400> 11 caaaattggt ctggtccagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-primer for exon1 <400> 12 aattggaagc aaatgacatc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-primer for exon1 <400> 13 tgaagaatca tttacctgtg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-primer for exon2 <400> 14 gaggctggac ttcagtaatt tg 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-primer for exon2 <400> 15 caagtaaccc tcctgcttca g 21 <210> 16 <211> 6129 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 aattggaagc aaatgacatc acagcaggtc agagaaaaag ggttgagcgg caggcaccca 60 gagtagtagg tctttggcat taggagcttg agcccagacg gccctagcag ggaccccagc 120 gcccgagaga ccatgcagag gtcgcctctg gaaaaggcca gcgttgtctc caaacttttt 180 ttcagctgga ccagaccaat tttgaggaaa ggatacagac agcgcctgga attgtcagac 240 atataccaaa tcccttctgt tgattctgct gacaatctat ctgaaaaatt ggaaagagaa 300 tgggatagag agctggcttc aaagaaaaat cctaaactca ttaatgccct tcggcgatgt 360 tttttctgga gatttatgtt ctatggaatc tttttatatt taggggaagt caccaaagca 420 gtacagcctc tcttactggg aagaatcata gcttcctatg acccggataa caaggaggaa 480 cgctctatcg cgatttatct aggcataggc ttatgccttc tctttattgt gaggacactg 540 ctcctacacc cagccatttt tggccttcat cacattggaa tgcagatgag aatagctatg 600 tttagtttga tttataagaa gactttaaag ctgtcaagcc gtgttctaga taaaataagt 660 attggacaac ttgttagtct cctttccaac aacctgaaca aatttgatga aggacttgca 720 ttggcacatt tcgtgtggat cgctcctttg caagtggcac tcctcatggg gctaatctgg 780 gagttgttac aggcgtctgc cttctgtgga cttggtttcc tgatagtcct tgcccttttt 840 caggctgggc tagggagaat gatgatgaag tacagagatc agagagctgg gaagatcagt 900 gaaagacttg tgattacctc agaaatgatt gaaaatatcc aatctgttaa ggcatactgc 960 tgggaagaag caatggaaaa aatgattgaa aacttaagac aaacagaact gaaactgact 1020 cggaaggcag cctatgtgag atacttcaat agctcagcct tcttcttctc agggttcttt 1080 gtggtgtttt tatctgtgct tccctatgca ctaatcaaag gaatcatcct ccggaaaata 1140 ttcaccacca tctcattctg cattgttctg cgcatggcgg tcactcggca atttccctgg 1200 gctgtacaaa catggtatga ctctcttgga gcaataaaca aaatacagga tttcttacaa 1260 aagcaagaat ataagacatt ggaatataac ttaacgacta cagaagtagt gatggagaat 1320 gtaacagcct tctgggagga gggatttggg gaattatttg agaaagcaaa acaaaacaat 1380 aacaatagaa aaacttctaa tggtgatgac agcctcttct tcagtaattt ctcacttctt 1440 ggtactcctg tcctgaaaga tattaatttc aagatagaaa gaggacagtt gttggcggtt 1500 gctggatcca ctggagcagg caagacttca cttctaatgg tgattatggg agaactggag 1560 ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat tctgttctca gttttcctgg 1620 attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc attggtgttt cctatgatga atatagatac 1680 agaagcgtca tcaaagcatg ccaactagaa gaggacatct ccaagtttgc agagaaagac 1740 aatatagttc ttggagaagg tggaatcaca ctgagtggag gtcaacgagc aagaatttct 1800 ttagcaagag cagtatacaa agatgctgat ttgtatttat tagactctcc ttttggatac 1860 ctagatgttt taacagaaaa agaaatattt gaaagctgtg tctgtaaact gatggctaac 1920 aaaactagga ttttggtcac ttctaaaatg gaacatttaa agaaagctga caaaatatta 1980 attttgcatg aaggtagcag ctatttttat gggacatttt cagaactcca aaatctacag 2040 ccagacttta gctcaaaact catgggatgt gattctttcg accaatttag tgcagaaaga 2100 agaaattcaa tcctaactga gaccttacac cgtttctcat tagaaggaga tgctcctgtc 2160 tcctggacag aaacaaaaaa acaatctttt aaacagactg gagagtttgg ggaaaaaagg 2220 aagaattcta ttctcaatcc aatcaactct atacgaaaat tttccattgt gcaaaagact 2280 cccttacaaa tgaatggcat cgaagaggat tctgatgagc ctttagagag aaggctgtcc 2340 ttagtaccag attctgagca gggagaggcg atactgcctc gcatcagcgt gatcagcact 2400 ggccccacgc ttcaggcacg aaggaggcag tctgtcctga acctgatgac acactcagtt 2460 aaccaaggtc agaacattca ccgaaagaca acagcatcca cacgaaaagt gtcactggcc 2520 cctcaggcaa acttgactga actggatata tattcaagaa ggttatctca agaaactggc 2580 ttggaaataa gtgaagaaat taacgaagaa gacttaaagg agtgcttttt tgatgatatg 2640 gagagcatac cagcagtgac tacatggaac acataccttc gatatattac tgtccacaag 2700 agcttaattt ttgtgctaat ttggtgctta gtaatttttc tggcagaggt ggctgcttct 2760 ttggttgtgc tgtggctcct tggaaacact cctcttcaag acaaagggaa tagtactcat 2820 agtagaaata acagctatgc agtgattatc accagcacca gttcgtatta tgtgttttac 2880 atttacgtgg gagtagccga cactttgctt gctatgggat tcttcagagg tctaccactg 2940 gtgcatactc taatcacagt gtcgaaaatt ttacaccaca aaatgttaca ttctgttctt 3000 caagcaccta tgtcaaccct caacacgttg aaagcaggtg ggattcttaa tagattctcc 3060 aaagatatag caattttgga tgaccttctg cctcttacca tatttgactt catccagttg 3120 ttattaattg tgattggagc tatagcagtt gtcgcagttt tacaacccta catctttgtt 3180 gcaacagtgc cagtgatagt ggcttttatt atgttgagag catatttcct ccaaacctca 3240 cagcaactca aacaactgga atctgaaggc aggagtccaa ttttcactca tcttgttaca 3300 agcttaaaag gactatggac acttcgtgcc ttcggacggc agccttactt tgaaactctg 3360 ttccacaaag ctctgaattt acatactgcc aactggttct tgtacctgtc aacactgcgc 3420 tggttccaaa tgagaataga aatgattttt gtcatcttct tcattgctgt taccttcatt 3480 tccattttaa caacaggaga aggagaagga agagttggta ttatcctgac tttagccatg 3540 aatatcatga gtacattgca gtgggctgta aactccagca tagatgtgga tagcttgatg 3600 cgatctgtga gccgagtctt taagttcatt gacatgccaa cagaaggtaa acctaccaag 3660 tcaaccaaac catacaagaa tggccaactc tcgaaagtta tgattattga gaattcacac 3720 gtgaagaaag atgacatctg gccctcaggg ggccaaatga ctgtcaaaga tctcacagca 3780 aaatacacag aaggtggaaa tgccatatta gagaacattt ccttctcaat aagtcctggc 3840 cagagggtgg gcctcttggg aagaactgga tcagggaaga gtactttgtt atcagctttt 3900 ttgagactac tgaacactga aggagaaatc cagatcgatg gtgtgtcttg ggattcaata 3960 actttgcaac agtggaggaa agcctttgga gtgataccac agaaagtatt tattttttct 4020 ggaacattta gaaaaaactt ggatccctat gaacagtgga gtgatcaaga aatatggaaa 4080 gttgcagatg aggttgggct cagatctgtg atagaacagt ttcctgggaa gcttgacttt 4140 gtccttgtgg atgggggctg tgtcctaagc catggccaca agcagttgat gtgcttggct 4200 agatctgttc tcagtaaggc gaagatcttg ctgcttgatg aacccagtgc tcatttggat 4260 ccagtaacat accaaataat tagaagaact ctaaaacaag catttgctga ttgcacagta 4320 attctctgtg aacacaggat agaagcaatg ctggaatgcc aacaattttt ggtcatagaa 4380 gagaacaaag tgcggcagta cgattccatc cagaaactgc tgaacgagag gagcctcttc 4440 cggcaagcca tcagcccctc cgacagggtg aagctctttc cccaccggaa ctcaagcaag 4500 tgcaagtcta agccccagat tgctgctctg aaagaggaga cagaagaaga ggtgcaagat 4560 acaaggcttt agagagcagc ataaatgttg acatgggaca tttgctcatg gaattggagc 4620 tcgtgggaca gtcacctcat ggaattggag ctcgtggaac agttacctct gcctcagaaa 4680 acaaggatga attaagtttt tttttaaaaa agaaacattt ggtaagggga attgaggaca 4740 ctgatatggg tcttgataaa tggcttcctg gcaatagtca aattgtgtga aaggtacttc 4800 aaatccttga agatttacca cttgtgtttt gcaagccaga ttttcctgaa aacccttgcc 4860 atgtgctagt aattggaaag gcagctctaa atgtcaatca gcctagttga tcagcttatt 4920 gtctagtgaa actcgttaat ttgtagtgtt ggagaagaac tgaaatcata cttcttaggg 4980 ttatgattaa gtaatgataa ctggaaactt cagcggttta tataagcttg tattcctttt 5040 tctctcctct ccccatgatg tttagaaaca caactatatt gtttgctaag cattccaact 5100 atctcatttc caagcaagta ttagaatacc acaggaacca caagactgca catcaaaata 5160 tgccccattc aacatctagt gagcagtcag gaaagagaac ttccagatcc tggaaatcag 5220 ggttagtatt gtccaggtct accaaaaatc tcaatatttc agataatcac aatacatccc 5280 ttacctggga aagggctgtt ataatctttc acaggggaca ggatggttcc cttgatgaag 5340 aagttgatat gccttttccc aactccagaa agtgacaagc tcacagacct ttgaactaga 5400 gtttagctgg aaaagtatgt tagtgcaaat tgtcacagga cagcccttct ttccacagaa 5460 gctccaggta gagggtgtgt aagtagatag gccatgggca ctgtgggtag acacacatga 5520 agtccaagca tttagatgta taggttgatg gtggtatgtt ttcaggctag atgtatgtac 5580 ttcatgctgt ctacactaag agagaatgag agacacactg aagaagcacc aatcatgaat 5640 tagttttata tgcttctgtt ttataatttt gtgaagcaaa attttttctc taggaaatat 5700 ttattttaat aatgtttcaa acatatataa caatgctgta ttttaaaaga atgattatga 5760 attacatttg tataaaataa tttttatatt tgaaatattg actttttatg gcactagtat 5820 ttctatgaaa tattatgtta aaactgggac aggggagaac ctagggtgat attaaccagg 5880 ggccatgaat caccttttgg tctggaggga agccttgggg ctgatgcagt tgttgcccac 5940 agctgtatga ttcccagcca gcacagcctc ttagatgcag ttctgaagaa gatggtacca 6000 ccagtctgac tgtttccatc aagggtacac tgccttctca actccaaact gactcttaag 6060 aagactgcat tatatttatt actgtaagaa aatatcactt gtcaataaaa tccatacatt 6120 tgtgtgaaa 6129 <210> 17 <211> 1479 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gln Arg Ser Pro Leu Glu Lys Ala Ser Val Val Ser Lys Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ser Trp Thr Arg Pro Ile Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Gln Arg Leu 20 25 30 Glu Leu Ser Asp Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Val Asp Ser Ala Asp Asn 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Leu Glu Arg Glu Trp Asp Arg Glu Leu Ala Ser Lys 50 55 60 Lys Asn Pro Lys Leu Ile Asn Ala Leu Arg Arg Cys Phe Phe Trp Arg 65 70 75 80 Phe Met Phe Tyr Gly Ile Phe Leu Tyr Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala 85 90 95 Val Gln Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Ala Ser Tyr Asp Pro Asp 100 105 110 Asn Lys Glu Glu Arg Ser Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Leu Cys 115 120 125 Leu Leu Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Leu His Pro Ala Ile Phe Gly 130 135 140 Leu His His Ile Gly Met Gln Met Arg Ile Ala Met Phe Ser Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Lys Lys Thr Leu Lys Leu Ser Ser Arg Val Leu Asp Lys Ile Ser 165 170 175 Ile Gly Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Lys Phe Asp 180 185 190 Glu Gly Leu Ala Leu Ala His Phe Val Trp Ile Ala Pro Leu Gln Val 195 200 205 Ala Leu Leu Met Gly Leu Ile Trp Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Phe 210 215 220 Cys Gly Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Ala Leu Phe Gln Ala Gly Leu 225 230 235 240 Gly Arg Met Met Met Lys Tyr Arg Asp Gln Arg Ala Gly Lys Ile Ser 245 250 255 Glu Arg Leu Val Ile Thr Ser Glu Met Ile Glu Asn Ile Gln Ser Val 260 265 270 Lys Ala Tyr Cys Trp Glu Glu Ala Met Glu Lys Met Ile Glu Asn Leu 275 280 285 Arg Gln Thr Glu Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ala Ala Tyr Val Arg Tyr 290 295 300 Phe Asn Ser Ser Ala Phe Phe Phe Ser Gly Phe Phe Val Val Phe Leu 305 310 315 320 Ser Val Leu Pro Tyr Ala Leu Ile Lys Gly Ile Ile Leu Arg Lys Ile 325 330 335 Phe Thr Thr Ile Ser Phe Cys Ile Val Leu Arg Met Ala Val Thr Arg 340 345 350 Gln Phe Pro Trp Ala Val Gln Thr Trp Tyr Asp Ser Leu Gly Ala Ile 355 360 365 Asn Lys Ile Gln Asp Phe Leu Gln Lys Gln Glu Tyr Lys Thr Leu Glu 370 375 380 Tyr Asn Leu Thr Thr Thr Glu Val Val Met Glu Asn Val Thr Ala Phe 385 390 395 400 Trp Glu Glu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Glu Lys Ala Lys Gln Asn Asn 405 410 415 Asn Asn Arg Lys Thr Ser Asn Gly Asp Asp Ser Leu Phe Phe Ser Asn 420 425 430 Phe Ser Leu Leu Gly Thr Pro Val Leu Lys Asp Ile Asn Phe Lys Ile 435 440 445 Glu Arg Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys 450 455 460 Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Met Gly Glu Leu Glu Pro Ser Glu Gly 465 470 475 480 Lys Ile Lys His Ser Gly Arg Ile Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ser Trp 485 490 495 Ile Met Pro Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser Tyr Asp 500 505 510 Glu Tyr Arg Tyr Arg Ser Val Ile Lys Ala Cys Gln Leu Glu Glu Asp 515 520 525 Ile Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn Ile Val Leu Gly Glu Gly Gly 530 535 540 Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala Arg Ile Ser Leu Ala Arg Ala 545 550 555 560 Val Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Phe Gly Tyr 565 570 575 Leu Asp Val Leu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Glu Ser Cys Val Cys Lys 580 585 590 Leu Met Ala Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr Ser Lys Met Glu His 595 600 605 Leu Lys Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ile Leu His Glu Gly Ser Ser Tyr 610 615 620 Phe Tyr Gly Thr Phe Ser Glu Leu Gln Asn Leu Gln Pro Asp Phe Ser 625 630 635 640 Ser Lys Leu Met Gly Cys Asp Ser Phe Asp Gln Phe Ser Ala Glu Arg 645 650 655 Arg Asn Ser Ile Leu Thr Glu Thr Leu His Arg Phe Ser Leu Glu Gly 660 665 670 Asp Ala Pro Val Ser Trp Thr Glu Thr Lys Lys Gln Ser Phe Lys Gln 675 680 685 Thr Gly Glu Phe Gly Glu Lys Arg Lys Asn Ser Ile Leu Asn Pro Ile 690 695 700 Asn Ser Ile Arg Lys Phe Ser Ile Val Gln Lys Thr Pro Leu Gln Met 705 710 715 720 Asn Gly Ile Glu Glu Asp Ser Asp Glu Pro Leu Glu Arg Arg Leu Ser 725 730 735 Leu Val Pro Asp Ser Glu Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Arg Ile Ser 740 745 750 Val Ile Ser Thr Gly Pro Thr Leu Gln Ala Arg Arg Arg Gln Ser Val 755 760 765 Leu Asn Leu Met Thr His Ser Val Asn Gln Gly Gln Asn Ile His Arg 770 775 780 Lys Thr Thr Ala Ser Thr Arg Lys Val Ser Leu Ala Pro Gln Ala Asn 785 790 795 800 Leu Thr Glu Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Ser Gln Glu Thr Gly 805 810 815 Leu Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asn Glu Glu Asp Leu Lys Glu Cys Phe 820 825 830 Phe Asp Asp Met Glu Ser Ile Pro Ala Val Thr Thr Trp Asn Thr Tyr 835 840 845 Leu Arg Tyr Ile Thr Val His Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Ile Trp 850 855 860 Cys Leu Val Ile Phe Leu Ala Glu Val Ala Ala Ser Leu Val Val Leu 865 870 875 880 Trp Leu Leu Gly Asn Thr Pro Leu Gln Asp Lys Gly Asn Ser Thr His 885 890 895 Ser Arg Asn Asn Ser Tyr Ala Val Ile Ile Thr Ser Thr Ser Ser Tyr 900 905 910 Tyr Val Phe Tyr Ile Tyr Val Gly Val Ala Asp Thr Leu Leu Ala Met 915 920 925 Gly Phe Phe Arg Gly Leu Pro Leu Val His Thr Leu Ile Thr Val Ser 930 935 940 Lys Ile Leu His His Lys Met Leu His Ser Val Leu Gln Ala Pro Met 945 950 955 960 Ser Thr Leu Asn Thr Leu Lys Ala Gly Gly Ile Leu Asn Arg Phe Ser 965 970 975 Lys Asp Ile Ala Ile Leu Asp Asp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Phe Asp 980 985 990 Phe Ile Gln Leu Leu Leu Ile Val Ile Gly Ala Ile Ala Val Val Ala 995 1000 1005 Val Leu Gln Pro Tyr Ile Phe Val Ala Thr Val Pro Val Ile Val Ala 1010 1015 1020 Phe Ile Met Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Gln Thr Ser Gln Gln Leu Lys 1025 1030 1035 1040 Gln Leu Glu Ser Glu Gly Arg Ser Pro Ile Phe Thr His Leu Val Thr 1045 1050 1055 Ser Leu Lys Gly Leu Trp Thr Leu Arg Ala Phe Gly Arg Gln Pro Tyr 1060 1065 1070 Phe Glu Thr Leu Phe His Lys Ala Leu Asn Leu His Thr Ala Asn Trp 1075 1080 1085 Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Leu Arg Trp Phe Gln Met Arg Ile Glu Met 1090 1095 1100 Ile Phe Val Ile Phe Phe Ile Ala Val Thr Phe Ile Ser Ile Leu Thr 1105 1110 1115 1120 Thr Gly Glu Gly Glu Gly Arg Val Gly Ile Ile Leu Thr Leu Ala Met 1125 1130 1135 Asn Ile Met Ser Thr Leu Gln Trp Ala Val Asn Ser Ser Ile Asp Val 1140 1145 1150 Asp Ser Leu Met Arg Ser Val Ser Arg Val Phe Lys Phe Ile Asp Met 1155 1160 1165 Pro Thr Glu Gly Lys Pro Thr Lys Ser Thr Lys Pro Tyr Lys Asn Gly 1170 1175 1180 Gln Leu Ser Lys Val Met Ile Ile Glu Asn Ser His Val Lys Lys Asp 1185 1190 1195 1200 Asp Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Met Thr Val Lys Asp Leu Thr Ala 1205 1210 1215 Lys Tyr Thr Glu Gly Gly Asn Ala Ile Leu Glu Asn Ile Ser Phe Ser 1220 1225 1230 Ile Ser Pro Gly Gln Arg Val Gly Leu Leu Gly Arg Thr Gly Ser Gly 1235 1240 1245 Lys Ser Thr Leu Leu Ser Ala Phe Leu Arg Leu Leu Asn Thr Glu Gly 1250 1255 1260 Glu Ile Gln Ile Asp Gly Val Ser Trp Asp Ser Ile Thr Leu Gln Gln 1265 1270 1275 1280 Trp Arg Lys Ala Phe Gly Val Ile Pro Gln Lys Val Phe Ile Phe Ser 1285 1290 1295 Gly Thr Phe Arg Lys Asn Leu Asp Pro Tyr Glu Gln Trp Ser Asp Gln 1300 1305 1310 Glu Ile Trp Lys Val Ala Asp Glu Val Gly Leu Arg Ser Val Ile Glu 1315 1320 1325 Gln Phe Pro Gly Lys Leu Asp Phe Val Leu Val Asp Gly Gly Cys Val 1330 1335 1340 Leu Ser His Gly His Lys Gln Leu Met Cys Leu Ala Arg Ser Val Leu 1345 1350 1355 1360 Ser Lys Ala Lys Ile Leu Leu Leu Asp Glu Pro Ser Ala His Leu Asp 1365 1370 1375 Pro Val Thr Tyr Gln Ile Ile Arg Arg Thr Leu Lys Gln Ala Phe Ala 1380 1385 1390 Asp Cys Thr Val Ile Leu Cys Glu His Arg Ile Glu Ala Met Leu Glu 1395 1400 1405 Cys Gln Gln Phe Leu Val Ile Glu Glu Asn Lys Val Arg Gln Tyr Asp 1410 1415 1420 Ser Ile Gln Lys Leu Leu Asn Glu Arg Ser Leu Phe Arg Gln Ala Ile 1425 1430 1435 1440 Ser Pro Ser Asp Arg Val Lys Leu Phe Pro His Arg Asn Ser Ser Lys 1445 1450 1455 Cys Lys Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu Glu 1460 1465 1470 Glu Val Gln Asp Thr Arg Leu 1475

Claims (20)

1. CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 2 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 129 내지 148번째 뉴클레오티드, 119 내지 138번째 뉴클레오티드, 또는 185 내지 204번째 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 3 및 4의 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM) 또는 그의 상보적인 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 PAM은 5'-AGG-3', 5'-GGG-3', 5'-CGG-3' 및 5'-TGG-3'으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 뉴클레오티드 내지 40 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드.
8. 청구항 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
9. 청구항 1의 폴리뉴클레오티드, 청구항 8의 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는, 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키기 위한 조성물.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 투여용인 것인 조성물.
11. 청구항 9에 있어서, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 Cas 폴리펩티드는 Cas5 폴리펩티드, Cas7 폴리펩티드, Cas8 폴리펩티드, Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드인 것인 조성물.
13. 세포와, 청구항 1의 폴리뉴클레오티드, 청구항 8의 벡터, 또는 이들의 조합을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 세포의 유전체에서 CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 변이시키는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 핵산 서열을 변이시킴으로써 CFTR 폴리펩티드 발현을 음성 대조군에 비해 억제 또는 증가시키는 것인 방법.
15. CFTR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 변이된 세포.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 서열번호 1의 5' 말단으로부터 129 내지 148번째 뉴클레오티드, 119 내지 138번째 뉴클레오티드, 또는 185 내지 204번째 뉴클레오티드인 것인 세포.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 세포는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 서열번호 5의 N 말단으로부터 508번째 아미노산인 페닐알라닌이 결실된 CFTR (ΔF508-CFTR) 폴리펩티드의 발현이 음성 대조군에 비해 증가된 것인 세포.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00388로 기탁된 세포주의 세포인 것인 세포.
19. 청구항 15의 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계;
    인큐베이션된 세포에서의 CFTR 폴리펩티드 활성을 측정하는 단계; 및
    측정된 CFTR 폴리펩티드 활성을 음성 대조군에 비해 증가 또는 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는,
    CFTR 폴리펩티드 활성을 증가 또는 감소시키는 피검 화합물을 스크리닝하는 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 스크리닝된 피검 화합물은 낭포성 섬유증, 만성 폐색성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease : COPD), 안구 건조 질환, 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증, 천식, 부비동염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 마르판 증후군, 파브리병, 고쉐병, 색소성 망막염, 알츠하이머병, 제II형 당뇨병, 파킨슨병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 후보 화합물인 것인 방법.

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