KR20180064923A - 미니파이프를 이용한 토양 독성 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미니파이프를 이용한 토양 독성 측정 방법에 관한 것으로, 구체적으로 온실에서 은 나노입자(silver nanoparticle)로 오염된 토양 시료에 미니파이프(mini-pipe)를 설치하고, 상기 미니파이프 내부의 토양 상부에 토양 조류 시험종으로 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)를 접종한 후 상기 토양 조류를 분리하여 토양 독성을 확인할 결과, 은 나노입자 노출 토양에서 클라미도모나스 레인하티의 세포 크기, 클로로필-a(Chlorophyll-a) 에스터가수분해효소(esterase) 활성이 감소하고 지질 함량이 증가하는 것을 확인하였으므로, 파이프를 이용한 토양 독성 측정 방법을 토양 매체가 존재하는 환경에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 미니파이프를 이용한 토양 독성 측정 방법에 관한 것으로, 구체적으로 파이프(pipe)를 토양에 설치하고, 파이프 내부의 토양 상부에 토양 조류를 노출하여 수거한 후, 상기 토양 조류를 이용하여 토양 독성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
조류(Algae)는 대표적인 생태독성 시험종으로 널리 알려진 생물이며, 주로 수중에 서식하나 암석, 토양, 나무, 건물 등 생육 환경에 따라 토양 조류(Soil algae), 기중조류(Aerial algae), 빙설조류(Cryoalgae), 공생조류(Symbiotic algae), 담수조류(Freshwater algae), 해수조류(Marine algae)로 분류된다.
조류는 수서생태계나 토양생태계 내 주요 생산자로서, 소형 수서 또는 토양 생물상 및 중형 수서 또는 토양 생물상에게 피식됨으로써 생태계 내 영양단계에서 주요한 위치를 차지하고 있다. 이에 현재 수서생태계에 대한 위해성평가는 조류, 물벼룩류, 어류와 같은 3개 영양 단계를 중심으로 확장된 수서독성자료를 바탕으로 확률생태위해성평가(Probabilistic Ecological Risk Assessment)나 결정생태위해성평가(Deterministic Ecological Risk Assessment)가 적용되고 있으나, 토양생태계에 대한 위해성평가는 식물류, 지렁이류, 선충류, 곤충류 등 일부 영양 단계로 국한된 토양 독성 자료를 활용하고 있는 실정이다.
토양 조류는 거의 모든 토양 환경의 토양 표면이나 토양 아래에 분포하고 있어, 토양생태위해성평가를 위한 생물지표로 사용되고 있다. 그러나 토양 조류에 대한 제한된 데이터로 인하여 생태위해성평가에 토양 조류의 토양 독성 데이터를 적용하는데 어려움이 있다. 그러한 원인으로 오염된 토양에 노출된 토양 조류의 독성을 평가하는 국제적인 기준은 없고, 현재 존재하는 가이드라인인 ASTM(American Society for Testing and Materials), EC(European Community), ISO(International Organization for Standardization), 및 OECD(Organisation for Economic Co-operation and Development) 등에 의하여 제공되는 것 또한 토양 조류에 대한 오염된 담수 또는 해수의 독성 평가가 대부분이다 (American Society for Testing and Materials (ASTM), 2012. D3978-04 Standard practice for algal growth potential testing with Pseudokirchneriella subcapitata; European Community (EC), 1992. C.3. Algal inhibition test; International Organization for Standardization (ISO), 2006. ISO 10253:2006 Water quality - Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum; Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), 2011. Guideline for testing of chemicals No. 201. In freshwater alga and cyanobacteria, growth inhibition tes).
게다가, 기존에 토양 조류를 이용하여 토양 독성을 평가할 수 있는 기법들은 실험실 규모와 같은 미세규모(microscale)에서 수행될 수 있도록 개발되었다. 또한, 현재까지 보고된 토양 관련 조류독성 연구사례들도 대부분 토양 매체를 채취하여 배지 또는 유기용제 추출한 토양추출액(soil extract), 토양 공극수(Pore water), 한천 배지(Agar medium)에서 실험한 사례들로, 실험실 규모에서 수행되는 사례들이며, 토양생태 환경을 직접적으로 이용하는 연구는 매우 미비한 실정이다. 아울러, 이러한 기법들을 온실에서 수행되는 pot 규모로 확대하여 적용할 경우 토양 독성을 정량적으로 평가하기 위하여 토양 조류를 일정량 수거하기 어렵다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 토양 독성 평가의 적용 가능한 규모를 확장하여, 토양 매체가 존재하는 환경을 유지하면서 정확도를 높인 토양 독성 평가 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 미니파이프(mini-pipe) 내부의 토양 상부에 토양 조류 시험종을 직접 접종한 후 상기 토양 조류 시험종을 수거 및 분리하여 토양 독성 시험을 수행할 수 있음을 확인하였다. 따라서 실험실 규모보다 넓은 규모에 적용 가능하고 유의한 토양 독성 측정 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Gorman, D.S., Levine, R.P., 1965. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence inthe photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54 (6).
Nam, S.-H. and An, Y.-J., 2015. An efficient and reproducible method for improving growth of a soil alga (Chlorococcum infusionum) for toxicity assays. Journal of Microbiological methods 119: 59-65.
Nam, S.-H. and An, Y.-J., 2013. 토양 관련 조류독성 연구동향. J. Kor. Soc. Environ. Eng 35(8): 607~612.
본 발명의 목적은 파이프(pipe)를 이용한 토양 독성 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파이프를 포함하는 토양 독성 측정용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 토양에 파이프(pipe)를 설치하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류를 접종하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 파이프 내부 토양을 수거하여 토양 조류를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분리한 토양 조류의 토양 독성 종말점(endpoint)을 측정하는 단계를 포함하는, 토양 독성 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 토양 조류; 및
b) 파이프
를 포함하는 토양 독성 측정용 키트를 제공한다.
본 발명은 온실에서 은 나노입자(silver nanoparticle, AgNPs)로 오염된 토양 시료에 미니파이프(mini-pipe)를 설치하고, 상기 미니파이프 내부의 토양 상부에 토양 조류 시험종으로 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)를 접종하여 일정 기간 노출시킨 후, 토양을 포함한 미니파이프를 수거하여 토양 조류 시험종을 쉽게 수거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 성장 배지를 이용해 상기 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 토양 조류 시험종을 분리하여 토양 조류 시험종을 획득한 후 토양 독성 종말점(endpoint)으로 세포 크기, 클로로필-a(Chlorophyll-a) 에스터가수분해효소(esterase) 활성 및 지질 함량을 분석하여 토양 독성을 확인하였다.
따라서 본 발명은 실험실 규모보다 넓은 규모에서 토양 독성 측정을 위한 토양 조류의 수거가 용이하고, 토양의 오염도에 따라 일정량의 토양 조류 시험종을 분리할 수 있으므로, 토양 매체가 존재하는 환경에서 정확한 토양 독성 측정이 가능하다.
도 1은 토양 독성 측정을 위한 토양 조류 시험종으로 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)를 준비하는 과정을 나타낸 사진이다:
(A): 클라미도모나스 레인하티 전배양; 및
(B): 클라미도모나스 레인하티 세포 현탁액.
도 2는 미니파이프(mini-pipe)를 이용한 토양 독성 측정을 위해, 미니파이프를 준비하는 과정을 나타낸 사진이다:
(A): 미니파이프의 크기; 및
(B): 미니파이프의 UV 멸균 과정.
도 3은 다양한 농도의 은 나노입자(silver nanoparticle, AgNPs)로 오염된 토양에서 미니파이프를 이용한 토양 독성을 측정하기 위해 준비한 4 토양군을 나타낸 도이다:
Control 군: 오염되지 않은 토양 군 (비오염토양 군);
Low-Layer 군: AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군;
High-Layer 군: AgNPs 고농도(80 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군; 및
Low-Mix 군: AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 전체 혼합된 군.
도 4는 미니파이프를 이용한 토양 독성 측정을 위해, 준비한 4 토양군에 미니파이프를 설치하고 미니 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류 시험종을 접종하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 5는 상기 도 4에서 접종한 토양 조류 시험종을 4 토양군에 1주, 4주, 6주 및 8주 동안 노출한 후 토양을 포함한 미니파이프를 수거하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 6은 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주, 6주 및 8주차에 미니파이프 내부 및 외부에 형성된 토양 조류의 생장을 나타낸 사진이다.
도 7a는 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주 및 8주차에 미니파이프 내부에 형성된 토양 조류를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7b는 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주, 6주 및 8주차에 미니파이프 외부에 형성된 토양 조류를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 4주차에 미니파이프 내부 토양에서 분리한 토양 조류(inner mini-pipe) 및 미니파이프 외부 토양에서 분리한 토양 조류(outer mini-pipe)의 클로로필-a(Chlorophyll-a)를 확인한 도이다.
도 9는 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 세포 크기를 확인한 도이다.
도 10은 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 클로로필-a를 확인한 도이다.
도 11은 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 에스터가수분해효소(esterase) 활성을 확인한 도이다.
도 12는 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 지질 함량을 확인한 도이다.
(A): 클라미도모나스 레인하티 전배양; 및
(B): 클라미도모나스 레인하티 세포 현탁액.
도 2는 미니파이프(mini-pipe)를 이용한 토양 독성 측정을 위해, 미니파이프를 준비하는 과정을 나타낸 사진이다:
(A): 미니파이프의 크기; 및
(B): 미니파이프의 UV 멸균 과정.
도 3은 다양한 농도의 은 나노입자(silver nanoparticle, AgNPs)로 오염된 토양에서 미니파이프를 이용한 토양 독성을 측정하기 위해 준비한 4 토양군을 나타낸 도이다:
Control 군: 오염되지 않은 토양 군 (비오염토양 군);
Low-Layer 군: AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군;
High-Layer 군: AgNPs 고농도(80 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군; 및
Low-Mix 군: AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 전체 혼합된 군.
도 4는 미니파이프를 이용한 토양 독성 측정을 위해, 준비한 4 토양군에 미니파이프를 설치하고 미니 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류 시험종을 접종하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 5는 상기 도 4에서 접종한 토양 조류 시험종을 4 토양군에 1주, 4주, 6주 및 8주 동안 노출한 후 토양을 포함한 미니파이프를 수거하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 6은 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주, 6주 및 8주차에 미니파이프 내부 및 외부에 형성된 토양 조류의 생장을 나타낸 사진이다.
도 7a는 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주 및 8주차에 미니파이프 내부에 형성된 토양 조류를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7b는 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주, 4주, 6주 및 8주차에 미니파이프 외부에 형성된 토양 조류를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 토양 조류 시험종을 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 4주차에 미니파이프 내부 토양에서 분리한 토양 조류(inner mini-pipe) 및 미니파이프 외부 토양에서 분리한 토양 조류(outer mini-pipe)의 클로로필-a(Chlorophyll-a)를 확인한 도이다.
도 9는 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 세포 크기를 확인한 도이다.
도 10은 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 클로로필-a를 확인한 도이다.
도 11은 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 에스터가수분해효소(esterase) 활성을 확인한 도이다.
도 12는 4 토양군의 미니파이프 내부에 접종한 후 노출 1주차에 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 분리한 토양 조류 시험종의 지질 함량을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 토양에 파이프(pipe)를 설치하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류를 접종하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 파이프 내부 토양을 수거하여 토양 조류를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분리한 토양 조류의 토양 독성 종말점(endpoint)을 측정하는 단계를 포함하는, 토양 독성 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 1)의 파이프는 "관", "튜브" 또는 "실린더"로 지칭될 수 있으며, 그 크기에 따라 "미니(mini)-파이프", "미니-관", "미니-튜브" 또는 "미니-실린더"로도 지칭될 수 있다. 상기 파이프는 단면이 보통 원형으로 내부가 비어 있는 관 형태로 구성되며, 예를 들어 비금속 또는 금속 재질의 내부가 비어 있는 관 형태로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 토양에 설치하는 파이프의 깊이는 설치하려는 토양의 표면으로부터 15 mm 내지 25 mm 깊이인 것이 바람직하고, 17 mm 내지 23 mm 깊이인 것이 보다 바람직하고, 20 mm 깊이인 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 토양의 상태에 따라 깊이를 달리할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 2)에서 토양 조류를 0.01 내지 10 ㎖/cm2의 양으로 접종하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 1 ㎖/cm2의 양으로 접종하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 2)의 토양 조류는 접종 후 1일 내지 8주간 토양에 노출되는 것이 바람직하고, 3일 내지 6주간 토양에 노출되는 것이 보다 바람직하며, 1주 내지 4주간 토양에 노출되는 것이 보다 더 바람직하고, 1주간 토양에 노출되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 3)의 토양 조류는, 수거된 파이프 내부 토양에 성장 배지를 넣고 토양 조류를 부유시켜 분리하는 것이 바람직하고, 예를 들어 성장 배지는 TAP 배지, BBM 배지 또는 OECD 배지로 분리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 토양 독성 종말점은 세포 크기, 세포 조밀도, 클로로필-a(Chlorophyll-a), 에스터가수분해효소(esterase) 활성, 산화 스트레스 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 세포 크기, 클로로필-a, 에스터가수분해효소 활성 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 토양 조류는 예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 노스톡 링키아(Nostoc linckia), 세네데스무스 비주가투스(Scenedesmus bijugatus), 시네코코커스 엘롱가테스(Synechococcus elongates), 슈도키르츠네리엘라 서브카피타타(Pseudokirchneriella Subcapitata), 클로로코쿰 인푸지오눔(Chlorococcum infusionum), 세네데스무스 서브카피타타(scenedesmus subspicatus) 또는 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)일 수 있고, 보다 구체적으로 클라미도모나스 레이하티일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 토양 독성은 금속 독성인 것이 바람직하고, 상기 금속은 주기율표 상의 모든 금속을 포함하며, 예를 들어 수은(Hg), 납(Pb), 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 구리(Cu), 니켈(Ni), 아연(Zn), 망간(Mn), 코발트(Co), 주석(Sn), 또는 은(Ag)일 수 있고, 보다 구체적으로 은일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 온실에서 은 나노입자(silver nanoparticle, AgNPs)로 오염된 토양 시료에 미니파이프를 설치하고, 상기 미니파이프 내부의 토양 상부에 토양 조류 시험종으로 클라미도모나스 레인하티를 접종하여 일정 기간 노출시킨 후, 토양을 포함한 미니파이프를 수거하여 토양 조류 시험종을 쉽게 수거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 성장 배지를 이용하여 상기 수거한 미니파이프 내부 토양으로부터 토양 조류 시험종을 분리하여 토양 조류 시험종을 획득한 후 종말점으로 세포 크기, 클로로필-a 에스터가수분해효소 활성 및 지질 함량을 분석하여 토양 독성을 확인하였다. 따라서 파이프를 이용한 토양 독성 측정 방법은 토양 매체가 존재하는 환경에 직접 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은
a) 토양 조류; 및
b) 파이프
를 포함하는 토양 독성 측정용 키트를 제공한다.
상기 토양 조류는 예를 들어, 클로렐라 불가리스, 노스톡 링키아, 세네데스무스 비주가투스, 시네코코커스 엘롱가테스, 슈도키르츠네리엘라 서브카피타타, 클로로코쿰 인푸지오눔, 세네데스무스 서브카피타타 또는 클라미도모나스 레인하티일 수 있고, 보다 구체적으로 클라미도모나스 레이하티일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 파이프는 그 표면에 토양에 설치되어야하는 깊이가 표시될 수 있다. 상기 깊이는 토양의 표면으로부터 15 mm 내지 25 mm 깊이인 것이 바람직하고, 17 mm 내지 23 mm 깊이인 것이 보다 바람직하고, 20 mm 깊이인 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 토양의 상태에 따라 깊이를 달리할 수 있다.
상기 토양 독성은 금속 독성인 것이 바람직하고, 상기 금속은 주기율표 상의 모든 금속을 포함하며, 예를 들어 수은, 납, 카드뮴, 크롬, 구리, 니켈, 아연, 망간, 코발트, 주석, 또는 은일 수 있고, 보다 구체적으로 은일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 토양 독성 측정은 세포 크기, 세포 조밀도, 클로로필-a, 에스터가수분해효소 활성, 산화 스트레스 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 측정하는 것이 바람직하고, 세포 크기, 클로로필-a, 에스터가수분해효소 활성 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 측정하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 온실에서 은 나노입자로 오염된 토양 시료에 미니파이프를 설치하고, 상기 미니파이프 내부의 토양 상부에 토양 조류 시험종으로 클라미도모나스 레인하티를 접종하여 일정 기간 노출시킨 후, 토양을 포함한 미니파이프를 수거하였고, 상기 수거한 미니파이프 내부 토양을 토양 조류 시험종을 성장 배지를 이용하여 분리하여 토양 조류 시험종을 획득한 후 종말점으로 세포 크기, 클로로필-a 에스터가수분해효소 활성 및 지질 함량을 분석하여 토양 독성을 확인하였으므로, 상기 토양 조류 및 파이프를 포함하여 토양 독성 측정 키트로 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 토양 독성 측정을 위한 토양 시료 및 금속 시료의 준비
금속에 의한 토양 독성 측정을 위하여 금속에 오염된 토양 시료를 제작하였다. 구체적으로, 토양은 자연토양인 LUFA 2.2를 이용하였고, 금속 오염물질로서 은 나노입자(Silver nanoparticles, AgNPs)를 선정하였다. AgNPs는 파우더 상태였으며 0.2% 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)이 포함된 크기 ≤ 100 nm의 물질(Sigma-aldrich, USA)을 구매하여 금속 시료로 사용하였다. AgNPs를 상기 토양에 추가한 후 롤러(roller)와 핸드 믹서(hand mixer)를 이용해 20 mg/kg 농도의 AgNPs가 포함된 토양 및 80 mg/kg 농도의 AgNPs가 포함된 토양을 제조하였다.
<
실시예
2> 토양 독성 측정을 위한 토양 조류(Soil algae)의 준비
토양 독성 측정을 위한 토양 조류로 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)를 TAP(tris-acetate-phosphate) 배지(Gorman and Levine, 1965)에서 4일간 배양(24℃, 100 rpm, 16h:8h=낮:밤)하였다(도 1, (A)). 4일간 전배양된 클라미도모나스 레인하티는 분광광도계(Libra S32 PC, Biochrom, UK)의 660 nm 파장에서 흡광도 값이 2.0이 되도록 조정하여 세포 현탁액(cell suspension)을 준비하였다(도 1, (B)).
<
실시예
3> 미니파이프(mini-pipe) 내부 토양에
노출시킨
토양 조류를 이용한 토양 독성 측정
종래 실험실 규모에서 수행되는 토양 독성 측정을 보다 넓은 규모의 환경에 적용하기 위하여, 미니파이프(mini-pipe)를 토양에 설치하고, 상기 미니파이프 내에 토양 조류를 접종 및 수거하여 토양 독성을 측정하였다.
구체적으로, 지름 20 mm의 플라스틱 소재의 얇은 미니파이프를 총 높이 30 mm가 되도록 자르고 10 mm 해당 부위에 표식을 남겼다(도 2, (A)). 그 다음, 상기 미니파이프를 토양에 설치하기 전 30분 동안 자외선으로 살균하여 준비하였다(도 2, (B)). 살균한 미니파이프를 상기 <실시예 1>에서 준비한 토양 사방에 설치하였다. 이 때 미니파이프는 미니파이프의 표식을 기준으로 20 mm는 토양 지하로 들어가도록, 10 mm는 토양 지상으로 노출되도록 설치하였다. 상기 토양에 설치한 미니파이프 내부에 상기 <실시예 2>에서 준비한 토양 조류 클라미도모나스 레인하티를 1 ㎖씩 접종하고 1 내지 8주 동안 토양에 노출시킨 후, 토양이 포함된 미니파이프를 수거하였다. 상기 수거한 미니파이프 내부 토양의 표층에 초록색으로 자라난 토양 조류를 스파츄라(spatular)로 채취하여 12-웰 플레이트에 넣고, 5 ㎖의 BBM 배지를 추가하여 24시간 동안 배양기(24℃, 100 rpm, 16h:8h=낮:밤)에서 토양 조류를 부유하였다. 24시간 후 토양에서 분리된 토양 조류 상등액을 수거하여 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 2,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 BBM 배지를 이용하여 1차례 세척하여 부유성 토양 입자를 제거하여 토양 조류를 획득하였다. 상기 획득한 토양 조류를 이용하여 토양 독성을 측정하였다.
<
비교예
1> 미니파이프 외부 토양에 우점하는 토양 조류를 이용한 토양 독성 측정
종래 실험실 규모에서 수행되는 토양 독성 측정을 보다 넓은 규모의 환경에 적용하기 위하여, 미니파이프를 토양에 설치하고, 상기 미니파이프 외부에 형성된 토양 조류를 수거하여 토양 독성을 측정하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 토양 조류를 미니파이프 내부 토양에 1 내지 8 주 동안 노출시킨 후, 토양이 포함된 미니파이프를 수거할 때 미니파이프 외부 표층에 초록색으로 자라난 토양 조류를 스파츄라로 채취하여 12-웰 플레이트에 넣고, 5 ㎖의 BBM 배지를 추가하여 24시간 동안 배양기(24℃, 100 rpm, 16h:8h=낮:밤)에서 토양 조류를 부유하였다. 24시간 후 토양에서 분리된 토양 조류 상등액을 수거하여 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 2,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 BBM 배지를 이용하여 1차례 세척하여 부유성 토양 입자를 제거하여 토양 조류를 획득하였다. 상기 획득한 토양 조류를 이용하여 토양 독성을 측정하였다.
<
비교예
2> 미니파이프 내부 및 외부에 형성된 토양 조류 확인
미니파이프를 이용하여 다양한 농도의 금속 오염 토양에 노출시킨 토양 조류를 토양 독성 측정 방법에 적용할 수 있는지 확인하기 위해, 다양한 농도의 AgNPs가 오염된 토양에 미니파이프를 설치하고, 미니파이프 내부에 토양 조류를 접종하여 일정기간 노출할 후 미니파이프 내부 또는 외부 토양을 수거하여, 상기 토양에 형성된 토양 조류의 생장을 육안으로 관찰하였다.
구체적으로, 다양한 AgNPs가 노출된 토양 환경을 재현하기 위하여, 도 3에 나타낸 바와 같이 온실에서 화분(pot)에 상기 <실시예 1>에서 준비한 오염되지 않은 토양 시료, AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양 시료, AgNPs 고농도(80 mg/kg) 오염 토양 시료를 상층 또는 전체에 혼합하여 하기 [표 1]과 같이 Control 군, Low-Layer 군, High-Layer 군 및 Low-Mix 군으로 제작하고, 7일 동안 안정화(aging)하였다.
| 그룹 | |
| Control 군 | 오염되지 않은 토양 군 (비오염토양 군) |
| Low-layer 군 | AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군 |
| High-Layer 군 | AgNPs 고농도(80 mg/kg) 오염 토양이 상층에만 복토된 군 |
| Low-Mix 군 | AgNPs 저농도(20 mg/kg) 오염 토양이 전체 혼합된 군 |
상기 안정화된 4 토양군에 상기 <실시예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4 토양군 당 4개의 미니파이프를 사방에 설치하고, 토양 조류 클라미도모나스 레인하티를 1 ㎖씩 접종하여 토양에 노출시킨 후(도 4), 노출 시작 1주차, 4주차, 6주차 및 8주차에 미니파이프를 1개씩 수거하고(도 5), 상기 수거한 미니파이프 내부 토양에서 토양 조류를 스파츄라로 채취하여 12-웰 플레이트에 넣었다. 또한, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 미니파이프 외부 표층에서 토양 조류를 스파츄라로 채취하여 12-웰 플레이트에 넣었다. 그 다음, 상기 <실시예 3> 및 <비교에 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 미니파이프 내부 및 외부 표층의 토양 조류를 획득한 후 현미경으로 토양 조류를 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 미니파이프 내부의 경우 토양 조류 노출 1주차 시 육안으로 Control 군, Low-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부에서 초록색으로 토양 조류가 자라나고, 노출 4주차까지는 육안으로 관찰될 정도로 초록색을 보이며 생장하는 것을 확인하였다. 반면, 미니파이프 외부의 경우 Control 군에서 1, 4, 6, 8주차 토양 조류가 모두 육안으로 관찰될 정도로 초록색을 보이며 생장하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 현미경 관찰을 통해 미니파이프 내부 토양의 경우 노출 1주차 시 토양 독성 측정을 위해 인위적으로 접종한 클라미도모나스 레인하티가 우점하고 있는 것을 확인하였고, High-Layer 군의 경우 AgNPs의 농도가 상대적으로 높아 독성이 발현되어 클라미도모나스 레인하티의 성장이 저해된 것을 확인하였다. 그러나 8주차까지 노출이 장기간으로 진행됨에 따라, Control 군의 미니파이프 내부에서도 측정하고자 하는 클라미도모나스 레인하티 종이 눈에 띄게 자라지 않음을 확인하였다. 한편, 노출 4주차에서는 미니파이프 내부에 초록색의 조류가 생장한 것이 육안으로 보였으나, 현미경으로 관찰한 결과 인위적으로 접종한 실험생물종인 클라미도모나스 레인하티 종 외에 자연적으로 생성된 타 종의 조류들도 일부 섞여 자라는 것을 확인하였다(도 7a). 반면, 미니파이프 외부 토양의 경우 노출 1주차 시, 육안으로 대조군, Low-Layer 군 및 Low-Mix 군에서 초록색으로 토양 조류가 자란 것을 확인하였으며, 현미경 관찰을 통해 미니파이프 내부에 접종한 클라미도모나스 레인하티 종과 형태학적으로 상이한 다양한 종류의 토양 조류가 우점하고 있는 것을 확인하였고, 노출 4주차에도 1주차와 마찬가지로 다양한 종류의 토양 조류가 우점하고 있는 것을 확인하였다(도 7b).
따라서 상기 결과를 통해 금속으로 오염된 토양을 수거하여 토양 조류를 분리할 경우 다양한 종류의 토양 조류가 우점하여 한 종류의 우점종을 선별하는 것이 어려움을 확인하였다. 반면, 미니파이프를 이용할 경우 미니파이프를 원하는 토양에 설치하는 것이 용이하고, 미니파이프 내부에 토양 조류 시험종을 접종하여 일정기간 노출한 후 동일한 양의 토양이 포함된 미니파이프를 수거함으로써, 토양을 일정량 수거할 수 있으며, 상기 접종된 토양 조류 시험종을 쉽게 채취할 수 있음을 확인하였다. 또한, 토양에서 자연적으로 자란 타 종의 조류의 영향을 최소화하기 위하여, 상기 접종된 토양 조류 시험종의 적정 노출기간은 1 내지 4주 사이이며, 상기 노출기간 중 1주일이 가장 적절함을 확인하였다.
<
비교예
2> 미니파이프 내부 또는 외부 토양에 형성된 토양 조류의
종말점(endpoint)으로
클로로필-a(Chlorophyll-a) 분석을 통한 토양 독성 확인
상기 <비교예 1>을 통해 확인한 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류를 토양 독성 평가에 적용 가능한지 확인하기 위하여, 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종이 가장 많이 우점하고 있었던 노출기간 4주 후 4군의 미니파이프 내부 또는 외부에 형성된 토양 조류를 채취하여 토양 조류의 종말점으로 클로로필-a 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Control 군, Low-Layer 군, High-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부 토양에 4주일 간 클라미도모나스 레인하티 종을 노출시킨 후, 미니파이프 내부 토양 및 외부 토양을 수거하여 토양 조류를 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 토양 조류로부터 클로로필-a를 유세포분석기의 FL3 밴드 필터(방출 > 670 nm)에서 나온 강도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 미니파이프 내부 토양의 경우 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종인 클라미도모나스 레이하티 종이 우점하고 있어 클라미도모나스 레이하티에 의해 클로로필-a 피크가 좁고 일정하게 나타나고, AgNPs의 오염 정도에 따라 클로로필-a가 감소함을 확인하였다. 반면, 미니파이프 외부 토양의 경우 다양한 종의 토양 조류 종이 우점하고 있어 클로로필-a 피크가 분산되어 있고 일정하지 않음을 확인하였다(도 8). 따라서, 상기 결과를 통해 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류 시험종을 이용하여 토양 독성 평가를 할 수 있음을 확인하였다.
<
실험예
1> 미니파이프 내부 토양에
노출시킨
토양 조류의
종말점으로
세포 크기 및 세포 조밀도 분석을 통한 토양 독성 확인
상기 <비교예 1>을 통해 확인한 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류의 토양 독성을 측정하기 위하여, 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종이 가장 많이 우점하고 있었던 노출기간 1주 후 4군의 토양 조류를 채취하여 토양 조류의 종말점으로 세포 크기 및 세포 조밀도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Control 군, Low-Layer 군, High-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부 토양에 1주일 간 클라미도모나스 레인하티 종을 노출시킨 후, 토양을 수거하여 상기 토양 조류 시험종을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 클라미도모나스 레인하티 종의 세포 크기를 유세포분석기(flow cytometer)의 FSC(Forward scattered light)에서 나오는 강도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 AgNPs로 오염된 토양에서 농도 의존적으로 클라미도모나스 레인하티 종의 세포 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 9).
<
실험예
2> 미니파이프 내부 토양에
노출시킨
토양 조류의
종말점으로
클로로필-a(Chlorophyll-a) 분석을 통한 토양 독성 확인
상기 <비교예 1>을 통해 확인한 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류의 토양 독성을 측정하기 위하여, 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종이 가장 많이 우점하고 있었던 노출기간 1주 후 4군의 토양 조류를 채취하여 토양 조류의 종말점으로 생장과 관련된 지표인 클로로필-a 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Control 군, Low-Layer 군, High-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부 토양에 1주일 간 클라미도모나스 레인하티 종을 노출시킨 후, 토양을 수거하여 상기 토양 조류 시험종을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 클라미도모나스 레인하티 종으로부터 클로로필-a를 유세포분석기의 FL3 밴드 필터(방출 > 670 nm)에서 나온 강도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 AgNPs로 오염된 토양에서 농도 의존적으로 클로로필-a가 감소하므로, AgNPs에 의한 오염이 심할수록 클라미도모나스 레인하티 종의 생장이 저해됨을 확인하였다(도 10).
<
실험예
3> 미니파이프 내부 토양에
노출시킨
토양 조류의
종말점으로
에스터가수분해효소
(esterase) 활성 분석을 통한 토양 독성 확인
상기 <비교예 1>을 통해 확인한 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류의 토양 독성을 측정하기 위하여, 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종이 가장 많이 우점하고 있었던 노출기간 1주 후 4군의 토양 조류를 채취하여 토양 조류의 종말점으로 에스터가수분해효소(esterase) 활성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Control 군, Low-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부 토양에 1주일 간 클라미도모나스 레인하티 종을 노출시킨 후, 토양을 수거하여 상기 토양 조류 시험종을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 클라미도모나스 레인하티 종을 형광 염료로 염색한 후 유세포분석기로 분석하였다. High-Layer 군의 경우 도 6에 나타낸 바와 같이 육안으로 관찰될 정도로 토양 조류의 생장이 저해되어 염색 기법을 이용한 종말점 분석이 불가하여 에스터가수분해효소 활성 분석에서 제외하였다. 상기 에스터가수분해효소 활성 확인을 위한 형광 염료로 칼세인 아세톡시 메틸 에스터(Calcein acetoxy methyl ester; Calcein-AM, Sigma-Aldrich Corp., Missouri, USA)를 사용하였다. 상기 칼세인-AM은 형광 염료는 아니지만, 에스터가수분해효소에 의해 가수분해되어 녹색 형광인 칼세인으로 전환된다(Teplova et al., 2010). 상기 칼세인-AM을 DMSO에 용해하여 칼세인-AM 저장용액 500 μM을 제조하였다. 상기 토양 조류 시험종 490 ㎕에 칼세인-AM 저장용액 10 ㎕를 첨가하여 총 500 ㎕ 시료(10 μM)를 제작하였다. 상기 시료를 칼세인-AM 염색을 위해 37℃, 암실 조건에서 30분 동안 유지하였다. 그 다음, 전환된 칼세인의 형광 강도를 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. 488 nm 여기 파장을 조사한 후 형광 강도값을 FL1(500-560 nm band pass filter, green fluorescence)로 분석하였다. 결과값은 Flowjo V10을 이용하여 분석하였으며, 토양 조류 시험종의 에스터가수분해효소 활성의 기하평균을 정규화한 후 평균을 구하여 에스터가수분해효소 활성의 상대적 변화를 평가하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 표층에 AgNPs로 오염된 토양군(Low-Layer 군)에서 클라미도모나스 레인하티 종의 에스터가수분해효소 활성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 11).
<
실험예
4> 미니파이프 내부 토양에
노출시킨
토양 조류의
종말점으로
지질 함량 분석을 통한 토양 독성 확인
상기 <비교예 1>을 통해 확인한 적정 노출기간으로 미니파이프 내부 토양에 노출시킨 토양 조류의 토양 독성을 측정하기 위하여, 인위적으로 접종한 토양 조류 시험종이 가장 많이 우점하고 있었던 노출기간 1주 후 4군의 토양 조류를 채취하여 토양 조류의 종말점으로 지질 함량 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <비교예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Control 군, Low-Layer 군 및 Low-Mix 군의 미니파이프 내부 토양에 1주일 간 클라미도모나스 레인하티 종을 노출시킨 후, 토양을 수거하여 상기 토양 조류 시험종을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 클라미도모나스 레인하티 종을 염색 시료로 염색한 후 유세포분석기로 분석하였다. High-Layer 군의 경우 도 6에 나타낸 바와 같이 육안으로 관찰될 정도로 토양 조류의 생장이 저해되어 염색 기법을 이용한 종말점 분석이 불가하여 지질 농도 분석에서 제외하였다. 상기 지질 함량 확인을 위한 염색 시료로 나일 적색(nile red: 5H-Benso[a]phenoxazine-5-one,9-diethylamine, Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 토양 조류 시험종에 나일 적색의 최종농도 1 mg/ℓ가 되도록 혼합하였다. 그 다음, 상온, 암실 조건에서 10분 동안 유지한 후 유세포분석기를 이용하여 FL2 밴드 필터(yellow emission, 564-606 nm)로 분석하였다. 결과값은 Flowjo V10을 이용하여 분석하였으며, 토양 조류 시험종의 지질 함량의 기하평균을 정규화한 후 평균을 구하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 Low-Layer 군 및 Low-Mix 군 모두 AgNPs 오염으로 인해 클라미도모나스 레인하티 종의 중성지방이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 12).
Claims (14)
1) 토양에 파이프(pipe)를 설치하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류를 접종하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 파이프 내부 토양을 수거하여 토양 조류를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분리한 토양 조류의 토양 독성 종말점(endpoint)을 측정하는 단계를 포함하는, 토양 독성 측정 방법.
2) 상기 단계 1)의 파이프 내부 토양 상부에 토양 조류를 접종하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 파이프 내부 토양을 수거하여 토양 조류를 분리하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분리한 토양 조류의 토양 독성 종말점(endpoint)을 측정하는 단계를 포함하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 토양 조류를, 0.01 내지 10 ㎖/cm2의 양으로 접종하는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 토양 조류를, 0.1 내지 1 ㎖/cm2의 양으로 접종하는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 토양 조류는 접종 후 1일 내지 8주간 토양에 노출되는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 토양 조류는 접종 후 3일 내지 6주간 토양에 노출되는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 토양 조류는 접종 후 1주 내지 4주간 토양에 노출되는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 토양 조류는, 수거된 파이프 내부 토양에 성장 배지를 넣고 토양 조류를 부유시켜 분리하는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 토양 독성 종말점은 세포 크기, 세포 조밀도, 클로로필-a(Chlorophyll-a), 에스터가수분해효소(esterase) 활성, 산화 스트레스 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 토양 조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 노스톡 링키아(Nostoc linckia), 세네데스무스 비주가투스(Scenedesmus bijugatus), 시네코코커스 엘롱가테스(Synechococcus elongates), 슈도키르츠네리엘라 서브카피타타(Pseudokirchneriella Subcapitata), 클로로코쿰 인푸지오눔(Chlorococcum infusionum), 세네데스무스 서브카피타타(scenedesmus subspicatus) 및 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 토양 독성은 금속 독성인 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
제 6항에 있어서, 상기 금속은 수은(Hg), 납(Pb), 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 구리(Cu), 니켈(Ni), 아연(Zn), 망간(Mn), 코발트(Co), 주석(Sn) 및 은(Ag)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정 방법.
a) 토양 조류; 및
b) 파이프
를 포함하는 토양 독성 측정용 키트.
b) 파이프
를 포함하는 토양 독성 측정용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 토양 조류는 클로렐라 불가리스, 노스톡 링키아, 세네데스무스 비주가투스, 시네코코커스 엘롱가테스, 슈도키르츠네리엘라 서브카피타타, 클로로코쿰 인푸지오눔, 세네데스무스 서브카피타타 및 클라미도모나스 레인하티로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 토양 독성 측정은 세포 크기, 세포 조밀도, 클로로필-a(Chlorophyll-a), 에스터가수분해효소(esterase) 활성, 산화 스트레스 및 지질 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 토양 독성 측정용 키트.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101974891B1 (ko) | 2018-10-30 | 2019-05-03 | 강원대학교산학협력단 | 조류를 이용한 생태독성 측정 방법 |
| KR20200124486A (ko) * | 2019-04-24 | 2020-11-03 | 건국대학교 산학협력단 | 클로렐라 소로키니아나를 이용한 토양 독성 측정 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101897473B1 (ko) | 2018-09-12 |
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