KR101655654B1 - 토양조류 최적배양을 위한 접종방법 - Google Patents

토양조류 최적배양을 위한 접종방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양조류 최적배양을 위한 접종방법 및 그 방법을 토양 독성 측정에 응용하는 것에 관한 것이다.

Description

토양조류 최적배양을 위한 접종방법{A METHOD FOR INOCULATING OPTIMAL CULTURE OF SOIL ALGAE AND USE OF THE SAME}
본 발명은 토양조류 최적배양을 위한 접종방법 및 그 방법을 토양 독성 측정에 응용하는 것에 관한 것이다.
토양 조류는 거의 모든 토양 환경의 토양 표면이나 토양 아래에 분포하고 있다(Hammel, W., Steubing, L., Debus, R., 1998. Ecotoxicol. Environ. Saf. 40, 173-176).
이 미소식물군(microflora)들은 많은 미소동물군(microfauna) 및 중형동물군(mesofauna) 등에 먹이를 제공하는 1차 생산자이다.
토양 조류에 대한 제한된 데이터로 인하여 생태위해성 평가에 이 토양 조류의 토양독성 데이터를 적용하는 것은 곤란하였다.
오염된 토양에 노출된 토양 조류의 독성을 평가하는 국제적인 기준은 없다. 그러한 가이드라인은 ASTM(American Society for Testing and Materials), EC(European Community), ISO(International Organization for Standardization), 및 OECD(Organisation for Economic Co-operation and Development) 등에 의하여 제공된 것과 같은 토양 조류에 대한 오염된 담수 또는 해수의 독성 평가를 위하여 존재한다(American Society for Testing and Materials (ASTM), 2012. D3978-04 Standard practice for algal growth potential testing with Pseudokirchneriella subcapitata; European Community (EC), 1992. C.3. Algal inhibition test;International Organization for Standardization (ISO), 2006. ISO 10253:2006 Water quality - Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum; Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), 2011. Guideline for testing of chemicals No. 201. In freshwater alga and cyanobacteria, growth inhibition tes).
게다가 토양 조류에 관한 독성 데이터도 제한된다(Hammel, W., Steubing, L., Debus, R., 1998. Ecotoxicol. Environ. Saf. 40, 173-176; Megharaj, M., Venkateswarlu, K., Rao, A. S., 1986a.Environ. Pollut. 40, 121-126; Muralikrishna, P. V. G., Venkateswarlu, K., 1984. Environ. Contam. Toxicol. 33, 241-245).
Hammel, W., Steubing, L., Debus, R., 1998. Ecotoxicol. Environ. Saf. 40, 173-176은 C. infusionum 내 클로로필의 전체 양은 토양을 안티몬(antimony) 화합물로 인공적으로 오염시킬 때 감소한다는 것을 보였다. 이 독성 데이터는 동정되지 않은 실험종 및 일부 오염원에서 사용된 연구에서 나온 것으로 토양 오염에 대한 생태위해성 평가 시 독성값으로 활용되는데 제한된다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 토양 조류 최적배양을 위한 접종방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 토양 조류 최적배양을 통한 토양 독성 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토양 조류 최적배양을 통한 토양 독성 측정용 시스템을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 토양 조류를 토양 상부에 원형으로 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 토양조류 최적배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 토양 조류는 Chlorococcum infusionum인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 토양은 성장 배지를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 토양 조류를 토양 상부에 원형으로 접종하여 배양하고 배양 후 토양 샘플에서 조류 클로로필을 추출하여 형광을 측정하여 형광이 감소하는 경우에 해당 토양이 금속에 오염된 것임을 판단하는 단계를 포함하는 토양의 금속 오염 판단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 토양 조류는 Chlorococcum infusionum인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 토양은 성장 배지를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 금속은 구리 또는 니켈인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 측정은 접종 후 6일째 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 성장 배지를 포함하는 토양, 그 토양의 상부에 원형으로 접종된 토양 조류 및 그 토양을 포함하는 용기로 구성된 토양 독성 테스트 기기를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 토양 조류는 Chlorococcum infusionum인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 토양은 성장 배지를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 독성은 금속 독성인 것이 바람직하고, 상기 금속은 구리 또는 니켈인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 최적 접종 방법을 사용하여 토양 조류 어세이 방법을 개발하고 중금속에 오염된 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 C. infusionum 클로로필의 양을 정량하였다. 이것은 토양 조류 어세이에 대한 최적 접종 방법에 관한 것이고, 생태위해성 평가에서 사용될 수 있는 중금속에 대한 토양 조류 독성 데이터를 제공할 수 있는 최초 연구이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
토양 조류 Chlorococcum infusionum을 사용한 다섯 종류의 토양 접종 방법을 독성 테스트를 위한 토양 조류의 성장을 촉진시키기 위한 가장 효율적이고 재생가능한 방법을 결정하기 위하여 평가하였다. 다섯 가지 방법은 C. infusionum를 토양의 상부에 원형으로, 토양의 상부에 중심 지점에, 토양 차상부(subsurface)에 중앙 지점에, 토양 상부의 한 편(one side)에, 그리고 토양의 상부에 원형 및 중심 지점에 나누어서 각각 위치시켰다.
이들 중 첫 번째 방법이 최대의 클로로필 형광을 발생하고 최고의 재생성을 나타내었다. 본 발명자들은 두 대표적인 토양인 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 C. infusionum에 대한 구리와 니켈의 독성의 평가에 이 방법을 적용하여 평가하였다. 구리와 니켈은 두 토양 타입의 상부에 원형으로 배치한 모두에서 그 접종을 수행한 경우에 C. infusionum 클로로필 형광을 감소시켰다. 이것은 토양 독성 테스트에 대한 토양 조류 접종 방법의 적절성을 평가한 첫 번째 발명이다.
최적 접종 방법의 선택
도 2a 및 2b는 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 각 접종 방법에 대한 C. infusionum의 클로로필 형광 강도의 퍼선트를 나타낸다. 6일에, 두 타입의 토양에서 원형으로 토양 상부에 접종한 방법이 다른 것에 비교하여 C. infusionum의 아주 높은 성장을 나타내었고, 토양 차상부 중심에 접종한 방법은 C. infusionum의 매우 낮은 성장을 나타내었다. 도 3은 C. infusionum의 성장이 어떻게 관찰되는지를 보여주는 테스트 튜브 내의 녹색 토양 조류의 이미지를 나타낸다. 클로로필 형광 강도 측정의 결과를 지지하여 토양 차상부 중심에 접종한 방법은 매우 엷은 녹색을 토양 층에 나타내었다. 도 3에서 Lufa 토양의 이미지는 토양의 상단 부분에 녹색 링을 나타낸다. 어두운 토양 배경 색으로부터 녹색 조류를 구별하는 것은 어렵다.
따라서 본 발명자들은 원형으로 토양 상부에 접종한 방법이 토양 조류 토양 테스트에 대한 최적 방법이라는 결론은 얻었다.
토양 독성 테스트에서 원형으로 토양 상부에 접종한 방법의 효율성의 입증
도 4a-4d는 6일 동안 Cu 또는 Ni에 노출된 C. infusionum의 클로로필 형광의 감소를 나타낸다. 대조군과 비교하여, Cu 또는 Ni에 노출된 C. infusionum는 OECD 및 Lufa 토양 모두에서 클로로필 형광을 크게 감소시켰다. OECD 토양에서, 6-일 EC10 및 EC50 값들은 Cu에 대해서 각각 5 (2-9) 및 26 (22-32) mg/kg, Ni에 대해서 204 (1-285) 및 396 (382-412) mg/kg로 나타내었다(Table 2). Lufa 토양에서, 6-일 EC10 및 EC50 값은 Cu에 대해서 각각 8 (3-13) 및 31 (28-34) mg/kg, Ni에 대해서 13 (2-24) 및 53(48-58) mg/kg로 나타내었다.
따라서 본 발명자들은 토양 조류에 대한 독성 효과의 테스트에서 원형으로 토양 상부에 접종한 방법의 효율을 입증하였다.
도 5a-5d는 C. infusionum의 성장에서 육안적인 차이를 나타내는 테스트 튜브를 나타낸다. 각 증가된 Cu 및 Ni 농도는 조류 성장을 크게 저해하여 녹색을 점차적으로 감소시켰다. C. infusionum는 높은 Cu 및 Ni 농도의 경우를 제외하고는 밝은 토양 배경 색으로 인하여 OECD 토양에서는 전체 토양 층을 뒤 덮은 녹색을 생성하였다. 반면, Lufa 토양에서 C. infusionum는 짙은 토양 배경색으로 인하여 관찰하기가 곤란하였다. 그러나, 높은 Cu 및 Ni 농도의 경우를 제외하고는 토양의 상단 부분에서 녹색 링이 관찰되었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, C. infusionum을 원형으로 토양 상부에 접종한 방법은 다른 방법들에 비하여 C. infusionum의 더 큰 성장을 나타내었으며, Cu 및 Ni은 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 원형으로 토양 상부에 접종한 C. infusionum의 클로로필 형광을 감소시켰다. 따라서 원형으로 토양 상부에 접종한 방법은 토양 조류 토양 독성 테스트에서 가장 적합하다는 것을 입증하고 이것을 C. infusionum에 대한 연구에서 테스트된 다섯 접종 방법 중 가장 효과적이고 재생적인 것으로 추천한다.
도 1은 Chlorococcum infusionum.를 사용한 다섯 가지 접종 방법 (A) 토양 상부에 원형으로 접종, (B) 토양 상부의 중심에 접종, (C) 토양 차상부(subsurface) 중심에 접종, (D) 토양 상층의 한편에 접종, 및 (E) 토양 상부의 원형 및 중심에 접종. 성장 배지(Bold's basal medium)를 15-mL 시험관 내의 토양에 접종. 대수기의 토양 조류 현탁액 대수기에서 조류 현탁액을 각 접종 방법에 따라서 2.5 X105 세포/g 초기 세포 밀도로 접종하였음.
도 2는 다섯 접종 방법에 따른 Chlorococcum infusionum 클로로필 형광을 나타냄. (A) OECD 및 (B) Lufa 2.2 토양. 6일째, 두 토양 모두에서 원형으로 토양 상부에 접종한 방법이 다른 방법들보다 가장 높은 C. infusionum 성장을 나타내었고, 토양하부에 중심에 접종한 방법이 가장 낮은 C. infusionum 성장을 나타내었다. 바는 5-10 반복의 평균의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 원형으로 토양 상부에 접종한 방법과 유의적으로 차이가 있는 결과를 나타낸다(p < 0.05).
도 3은 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 성장한 Chlorococcum infusionum 접종 효과를 나타냄. (A) 원형으로 토양 상부, (B) 토양 상부 중심, (C) 토양하부 중심, (D) 토양 상부 한편, and (E) 토양 상부에 원형 및 중심에 접종.
도 4는 구리(Cu)- 및 니켈(Ni)-오염된 OECD 및 Lufa 2.2 토양에 6일 노출된 후 Chlorococcum infusionum의 클로로필 형광. (A) Cu-오염된 OECD 토양, (B) Ni-오염된 OECD 토양, (C) Cu-오염된 Lufa 2.2 토양, 및 (D) Ni-오염된 Lufa 2.2 토양. 바는 5-15 반복의 평균의 표준 편차를 나타낸다. 모든 실험은 5회 반복으로 2-3회 반복하였다. 별표는 대조군과 유의적으로 다른 결과를 나타냄(p < 0.05).
도 5는 6일 동안 Chlorococcum infusionum 에 노출된 구리(Cu) 및 니켈(Ni)-오염된 OECD 및 Lufa 2.2 토양의 효과를 나타냄. (A) Cu-오염된 OECD 토양, (B) Ni-오염된 OECD 토양, (C) Cu-오염된 Lufa 2.2 토양, 및 (D) Ni-오염된 Lufa 2.2 토양.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 테스트 종과 전( pre )-배양
C. infusionum (SAG No. 10.86)는 독일 Gottingen 대학의 조류 배양기관으로부터 구입하였다. 그 조류를 공기 투과 스톱퍼를 가지는 Bold's Basal Medium (BBM) (Bold, H. C., 1949. Nov. Bull. Torrey. Bot. Club. 76, 101-108)를 함유한 250-mL borosilicate 유리 Erlenmeyer 플라스크에서 성장시켰다. 배양은 냉-백 형광 램프로 제공되는 약 4000 lux의 16h:8h (명:암) 조사 하에서 100 rpm 및 24 2 ?C 조건에서 교반기(Vision, Korea)에서 수행하였다.
실시예 2. 토양
OECD 및 Lufa 2.2 토양을 대표적인 표준 토양으로 사용하였다. OECD 토양은 사양토(sandy loam)로 분류되고 주된 토양 특성은 69.5% 모래, 20% 고령토(kaolin clay), 10% 물이끼 토탄(sphagnum peat moss), 및 0.5% CaCO3이고, 마지막 것은 초기 pH를 6.0±0.5로 조절하기 위하여 첨가하였다. 멸균 OECD 토양 pH를 pH 프로브로 1:2 (w/v) 토양:물 혼합액에서 측정하였고 5.6±0.1이었다. Gravimetric 보수력(water-holding capacity;WHC)을 2시간 동안 포화 및 자연배수(free drainage) 후에 측정하였고 0.31±0.02 mL/g 건조 토양이었다. 멸균된 Lufa 2.2 토양을 Landwirtschaftliche Untersuchungs 및 Forschungsanstalt Speyer로부터 구입하였다. Lufa 2.2 토양은 양질 사토(loamy sand)로 분류되고 주된 토양 특성은 93.04% 모래, 6.8% 실트(silt), 및 and 0.16% 진흙(clay)이었다. Lufa 토양 pH는 5.6±0.2, WHC는 0.46±0.01 mL/g 건조 토양이었다.
실시예 3.조류 접종 방법
C. infusionum을 토양 배지에 첨가하는 최적 접종 방법을 결정하기 위하여, 다섯 종류 접종 방법을 OECD 및 Lufa 2.2 토양을 사용하여 비교하였다. 이 방법들은 토양 상부에 원형으로 접종, 토양 상부의 중심에 접종, 토양 차상부 중심에 접종, 토양 상층의 한편에 접종, 및 토양 상부에 원형 및 중심에 나누어 접종하는 방법을 포함한다(도 1).
테스트 토양을 조제하기 위하여, OECD 토양 및 Lufa 2.2 토양 각각에 대해 0.8 mL 및 0.7 mL의 테스트 용액을 15-mL 시험관 내의 2.5 g 토양에 첨가하였다. 다음, 대수기의 0.2 mL 및 0.175 mL의 C. infusionum 을 OECD 및 Lufa 2.2 토양에 각각 초기 세포 밀도 2.5X105 cells/g로 접종하였다. 시험관을 교반만을 제외하고는 6일 동안 전 배양 조건과 동일하게 배양하였다. C. infusionum 는 수평으로는 잘 성장하지 않아서(데이터 도시 안함), 시험관을 수직으로 위치시키고 3일 후에 위치변경시켜서 모든 것이 동일한 빛을 받게 하였다.
토양에 접종된 C. infusionum 의 정량화는 에탄올 추출 후(5 mL, 3 시간), 형광 마이크로플레이트 리더(Gemini EM, Molecular Devices, USA; 여기 420 nm 및 방출 671 nm)를 사용하여 클로로필 형광에 의하여 평가하였다. 대조군을 가지고 토양의 배경 형광을 보정하기 위하여 본 발명자들은 비접종된 샘플(조류 현탁액 대신 탈이온수를 사용)에 대해서 동일한 과정을 수행하였다. 모든 접종 방법의 형광 강도는 통계 분석에서 토양 상부에 원형으로 접종한 방법의 형광 강도로 표준화하였다.
토양 상부에 원형으로 접종
C. infusionum 을 토양 상부에 원형으로 접종하였다. 조류 현탁액을 팁이 토양의 상부에 보일 때까지 시험관으로 삽입된 긴 피펫 팁을 사용하여 운반하였다. 그 접종물을 1번에 한 방울씩 제공하고 그 한 방울은 토양에 흡수된다(도 1A).
토양 상부의 중심에 접종
토양 상부의 중심에 접종 방법은 토양의 상부 중심지점에 그 접종물을 제공하는 것을 제외하고는 상기 1A 방법과 동일하였다(도 1B).
토양 차상부 중심에 접종
토양 차상부 중심에 접종 방법은 피펫 팁을 토양 표면 5 mm 아래 깊이에 삽입하는 것을 제외하곤 상기 1A와 동일하였다(도 1C).
토양 상부 한편에 접종
토양 상부에 시험관의 한편에 한 지점에 그 접종물을 놓는 것을 제외하고는 1A와 동일한 과정으로 수행하였다 (도 1D).
토양 상부에 원형 및 중심부에 접종
조류 현탁액의 절반을 토양 상부에 원형으로 위치시키고 나머지 절반은 토양의 상부 중심 지점에 위치시키는 것을 제외하고는 1A와 동일한 과정으로 수행하였다(도1E).
실시예 4. 토양 조류 독성 실험에서 원형으로 토양 상부에 위치시키는 것의 효율성 평가
시험 화합물의 조제
구리(Cu) 및 니켈(Ni)은 Sigma-Aldrich (Louise, MO, USA)로부터 copper chloride (CuCl2.2H2O; 순도 98%) 및 nickel chloride (NiCl2 순도 98%)로 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. 5000 mg Cu2 +/L 및 5000 mg Ni2 +/L 원액을 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)를 제외한 BBM에서 조제하였다. 그 원액을 킬레이트 효과를 저해하기 위하여 EDTA가 없는 BBM 에서 희석하여 시험 용액을 조제하였다(Huebert, D. B., Dyck, B. S., Shay, J. M., 1993. Aquat. Toxicol. 24, 183-194).
클로로필 형광의 효과 및 통계분석
Cu 및 Ni에 대한 토양 조류 시험은 OECD 및 Lufa 2.2 토양에서 수행하였다. OECD 토양에 대해서, 0-75 mg Cu2 +/kg dw 토양 및 0-500 mg Ni2 +/kg dw 토양의 시험 농도가 EDTA없는 BBM에서 조제되었다. Lufa 2.2 천연 토양에 대해서, 0-60 mg Cu2 +/kg dw 토양 및 0-100 mg Ni2 +/kg dw 토양의 시험 농도가 EDTA 없는 BBM에서 조제되었다. 시험 용액 및 조류 현탁액의 부피는 동일하였다. 다음, 그 접종물을 다섯 가지 방법 중에서 최고의 방법인 토양 상부에 원형으로 접종하는 방법을 사용하여 적용하였다. 샘플에서 조류 클로로필을 추출하고 조류 접종 방법을 수행한 후 6일째 측정하였다. 모든 실험은 5회 반복으로 2-3회 반복하였다.
통계 분석을 위해, 조류 클로로필의 형광 강도를 대조군과 표준화하였다. Probit 프로그램을 10% (EC10)에서 효과적인 농도를 계산하기 위하여 사용하였고(Finney, 1952), TSK 프로그램을 50% (EC50)에서 효과적인 농도를 계산하기 위하여 사용하였다(USEPA, 1999). 차이를 p < 0.05에서 통계적으로 유의적이라고 판단하였다.

Claims (13)

  1. 토양 조류의 현탁액을 토양을 포함한 수직 형태의 원형 시험관 면을 따라서 토양 표면에 원형 형태로 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 토양조류 최적배양 방법으로,
    상기 토양 조류는 Chlorococcum infusionum인 것을 특징으로 하는 토양 조류 최적배양 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 토양은 사양토(sandy loam) 또는 양질 사토(loamy sand)인 것을 특징으로 하는 토양 조류 최적배양 방법.
  4. 토양 조류의 현탁액을 토양을 포함한 수직 형태의 원형 시험관 면을 따라서 토양 표면에 원형 형태로 접종하여 배양한 후 토양 샘플에서 조류 클로로필을 추출하여 형광을 측정하여 형광이 감소하는 경우에 해당 토양이 금속에 오염된 것임을 판단하는 단계를 포함하는 토양의 금속 오염 판단 방법으로,
    상기 토양 조류는 Chlorococcum infusionum인 것을 특징으로 하는 토양의 금속 오염 판단 방법.
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  6. 제4항에 있어서, 상기 토양은 사양토(sandy loam) 또는 양질 사토(loamy sand)인 것을 특징으로 하는 토양의 금속 오염 판단 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 금속은 구리 또는 니켈인 것을 특징으로 하는 토양의 금속 오염 판단 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 측정은 접종 후 6일째 수행하는 것을 특징으로 하는 토양의 금속 오염 판단 방법.


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