KR20180056270A - 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물 및 이의 검출 방법 - Google Patents

루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물 및 이의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이토카인 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트, 마이크로어레이 및 이를 이용하여 유방암 진단 정보를 제공하기 위한 마커 검출 방법을 제공한다.

Description

루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물 및 이의 검출 방법{Composition for diagnosing Luminal subtype of breast cancer and method for detecting the same}
본 발명은 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 신규 마커, 이를 포함하는 유방암 진단용 조성물, 키트 및 마이크로 어레이, 상기 마커를 이용하여 유방암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
유방암은 유방 내 유선 조직의 상피세포에서 발생하는 악성 종양을 통칭한다. 지역에 따라 다르지만, 유방암은 전 세계적으로 25%를 차지하는 암으로 여성 암 중 가장 흔히 발병한다. 2015년에 발표된 국가암등록사업 연례 보고서(2013년 암등록통계; 보건복지부 중앙암등록본부)에 의하면, 현재 대한민국에서 발병하는 여성 암 중 갑상선암(30.5%)에 이어 유방암(15.4%)이 2위를 차지한 것으로 밝혀졌다.
유방암은 가장 많이 연구가 된 암 종임에도 불구하고, 발병의 원인이 아직 명확하게 밝혀진 것은 없다. 그러나, 유방암의 발병에는 특정한 하나의 원인이 아닌 유전적 요인과 환경적 요인(연령, 이른 초경, 늦은 폐경, 임신 여부, 피임약 복용, 호르몬 치료, 식생활 및 음주 등)이 복합 작용하여 발병할 것으로 추정되고 있다. 특히, 여성 호르몬인 에스트로겐은 세포의 증식과 분화를 촉진하는 역할을 하기 때문에 발암 과정에 중요하다. 즉, 여성들은 일생 동안 에스트로겐의 영향을 많이 받으므로, 유방암 발병의 위험도가 커진다.
유방암은 분자적 아형에 따라 암의 진행 정도와 치료 방법이 크게 다르고, 그에 따라 예후가 매우 다르다. 유방암의 분자적 아형은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor; ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor; PR)과 같은 호르몬 수용체(hormone receptor)의 발현 유무 및 상피 세포 증식 인자 수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2)의 과발현에 따라 정의된다.
임상에서는 면역조직화학 염색법으로 위의 분자 표지자의 발현량을 확인하여 유방암의 분자적 아형을 분류할 수 있다. 따라서, 유방암의 분자적 아형은 ER+ 및/또는 PR+ 및 HER2-인 Luminal A, ER+ 및/또는 PR+ 및 HER2+인 Luminal B, ER- 및 PR- 및 HER2+인 HER2-enriched 및 ER- 및 PR- 및 HER2-인 Basal-like로 분류된다. 여러 임상 연구에서 밝혀진 것은 호르몬 수용체를 포함하고 있는 분자적 아형이 그렇지 않은 분자적 아형보다 예후가 좋고, 생존율이 더 높게 나타났다는 것이다.
The Cancer Genome Atlas (TCGA)는 어떤 유전적 변이가 암에 기인하는지 확인하고자 하는 목적으로 시작된 프로젝트로, 대규모 유전체 분석 기술을 통해 암의 분자생물학적 이해를 촉진하기 위해 2006년에 시작되었다. 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute; NCI)와 국립 인간 게놈 연구소(National Human Genome Research Institute; NHGRI)에서 33 암 종 환자들의 유전자 발현, 체세포 돌연변이, 복제 수 변이, DNA 메틸화 및 마이크로 RNA 발현 등의 암 유전체 데이터와 일치되는 환자들의 임상 정보를 수집, 통합 및 표준화하여 운영 관리하고 있다. TCGA Data Portal은 연구자들이 생물 정보학을 기반으로 암 유전체를 분석할 수 있도록 데이터를 검색, 다운로드 및 분석할 수 있는 플랫폼을 제공한다.
TCGA 유방암 데이터 세트(TCGA-BRCA)는 TCGA의 단일 암 종 가운데 가장 큰 데이터 세트이고, 1,000명 이상의 샘플 수를 보유하고 있으므로, TCGA 유방암 데이터 세트는 유방암 환자의 유전체 변화를 대표할 수 있는 좋은 표본이다. 그러나, TCGA의 암 유전체 데이터 세트는 고형 종양 조직 혼합물을 사용하여 염기서열을 결정하였으므로, 암세포 이외에 간질세포, 면역세포, 내피세포 및 상피세포 등의 주변 정상 조직을 포함한 비 암세포의 특징도 포함되어 있다. 이러한 종양 미세 환경은 유전체 데이터를 해석하는데 많은 영향을 미치므로, 종양 순도를 고려해야 할 필요가 있다.
유방암의 분자적 아형을 확인하기 위해서는 조직을 채취하여 현미경으로 관찰하는 조직학적 검사가 필요하다. 일반적인 조직 검사는 피부를 절개하여 병변 부위의 조직을 채취하기 때문에 환자에게 고통과 시술 이후 상처를 남기는 침습적 검사법이다. 이를 보완하기 위해 고통과 상처를 최소화 할 수 있는 비침습법 검사법이 개발되었다. 그러나, 비침습법 검사법은 침습적 검사법의 여러 단점을 보완하지만 검사법의 종류에 따라 오진의 위험도 존재한다. 최근에는 기존 진단 방법과는 다르게 환자의 혈액 또는 다른 체액에서 종양 표지자의 농도를 측정하여 진단하고 있으나, 이러한 종양 표지자들은 아직까지 제한적으로 사용되고 있는 실정이다.
종양 미세 환경에서는 암세포 이외에 다양한 비 암세포들도 존재하므로, 서로 다른 세포에서 분비되는 다양한 사이토카인들이 있다. 그러나, 이러한 환경에서는 면역 반응을 촉진하는 요인들과 억제하는 요인들 간의 균형이 깨지고, 효과적인 항 종양 면역반응이 이루어지지 않을 뿐만 아니라, 변형된 세포들과 직접적으로 상호작용하여 종양 형성을 촉진하기도 한다. 따라서, 이러한 사이토카인들이 분비 단백질로서 세포에서 분비되어 혈액을 통해 검출되면 암의 진단과 암의 분자적 아형을 확인할 수 있는 분자 진단 마커로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명은 IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 유방암 진단용 키트 또는 마이크로 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자의 시료로부터 상기 조성물을 통해 IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단 정보를 제공하기 위한 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 TCGA-BRCA 데이터 세트를 분석하여 원발성 종양(Primary Tumor)의 분자적 아형에 따라 분류된 루미날 A(Luminal A), 루미날 B(Luminal B), HER2 과발현(HER2-enriched) 및 기저양(Basal-like) 유방암 그룹과 정상 조직(Solid Tissue Normal) 그룹 간의 유전자 발현 차이를 활용하여 신규한 유방암 진단 마커를 발굴하였다.
구체적으로 데이터 세트에 포함된 20530개 유전자의 발현량 값을 모두 추출하고, 66개 사이토카인 유전자의 발현량 값을 재 추출하였으며, 상기 66개 사이토카인 유전자의 발현량에 대하여 폐경 전/ 폐경 후 각 유방암 분자적 아형 그룹과 Solid Tissue Normal 그룹 간의 통계 분석(실시예 1.4 참고)을 수행하고, 통계적으로 유의한 차이가 있었던 유전자들에 대하여 유방암의 어떤 분자적 아형에 특이적으로 분포하는지 확인하기 위하여 벤 다이어그램(실시예 1.5 참고)을 그렸을 때, 루미날 A 및 루미날 B에 속하는 s2, s5 구역에서 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 존재하는 것을 확인하였고(표 6 및 표 7 참고), 상기 IL19, IL20 및 IL24 유전자는 IL-20 서브패밀리(subfamily)에 속하는 유전자(Rutz S, et al. 2014 Dec;14(12):783-95)로서, 인간 1번 염색체의 같은 유전자위(1q32.1)에 존재하는 유전자이므로 루미날 서브타입의 유방암 진단 마커로서 선정하였다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예에서, IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
사이토카인은 면역 시스템에서 세포 간에 소통하는 분자를 통칭한다. 사이토카인은 다양한 세포에서 생산 및 분비되고, 표적 세포의 세포막에 존재하는 특이적인 수용체와 결합하여 수용체 하위 신호전달 경로를 활성화하여 효소 활성이나 유전자의 발현을 변화시킨다. 따라서, 표적 세포의 민감성은 특정 사이토카인 수용체의 존재 유무에 의해 결정된다. 사이토카인은 다양한 세포의 증식, 분화 및 사멸을 조절 할 수 있다. 주요 사이토카인으로는 집락-자극인자(colony-stimulating factor; CSF), 인터페론(interferon; IFN), 인터루킨(interleukin; IL) 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF) 등이 있다. 상기 루미날 서브타입은, 예를 들어 루미날 A 및/또는 루미날 B 서브타입일 수 있다.
본 발명에 따른 일에 따른 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 마커는 루미날 서브타입 유방암에서 유전자의 mRNA 및/또는 단백질의 발현 수준이 높은 것으로서, 인터루킨 사이토카인에 대한 IL-20 서브패밀리(subfamily)에 속하는 유전자이다. 바람직하게는, 상기 마커 유전자는 IL19, IL20 및/또는 IL24를 사용할 수 있다.
상기 IL19, IL20 및 IL24 유전자는 IL-20 서브패밀리(subfamily)에 속하는 유전자인 동시에 인간 1번 염색체의 같은 유전자 좌위(1q32.1)에 존재하며 루미날 서브타입의 유방암에서 발현 수준이 높은 것을 특징으로 한다. 상기 유전의 mRNA 또는 이의 단백질은 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열서열정보를 확인할 수 있다. 예를 들어 상기 IL19는 HGNC: 5990; Entrez Gene: 29949, 상기 IL20은 HGNC: 6002; Entrez Gene: 50604 및 상기 IL24는 HGNC: 11346; Entrez Gene: 11009의 HGNC 등록번호(accession number)를 가질 수 있다.
유방암의 분자적 아형, 즉 서브타입은 분자 표지자의 발현량을 확인하여 분류할 수 있는데, ER+ 및/또는 PR+ 및 HER2-인 Luminal A, ER+ 및/또는 PR+ 및 HER2+인 Luminal B, ER- 및 PR- 및 HER2+인 HER2-enriched 및 ER- 및 PR- 및 HER2-인 Basal-like로 분류된다. 본 발명의 유방암 진단 마커는 상기 서브타입 중 루미날 서브타입, 바람직하게는 루미날 A 및/또는 루미날 B 서브타입의 유방암을 더욱 특이적으로 진단할 수 있다.
이에 따라, 상기 마커는 대상 환자가 폐경 전 또는 폐경 후인 경우 모두 사용될 수 있으며, 바람직하게는 폐경 전의 여성에 사용되는 경우 더욱 높은 민감도로 진단할 수 있다.
본 발명의 용어, "마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"는 대상체의 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위하여, 대상체 시료에서 상기 마커 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 마커 유전자 중 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제는 마커 유전자 중 1종 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 마커 유전자의 발현 수준은 해당 유전자의 mRNA의 발현수준 또는 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 대상의 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 알룰로스의 반응성을 예측 또는 검정할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 대상의 시료에서 마커 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로서, IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물을 포함하는 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 유방암 진단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공한다.
상기 유방암 진단용 조성물에 관한 사항은, 유방암 진단용 키트 또는 마이크로어레이에 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 키트는 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명에서 키트는 루미날 서브타입의 유방암 여부에 따라 발현이 증가되는 마커 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수적 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유전자 검출용 키트일 수 있다. 마이크로어레이, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이에서 선택된 10개 이상의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, DNA 마이크로어레이일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로서, 환자의 시료로부터 상기 유방암 진단용 조성물을 통해 IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단 정보를 제공하기 위한 검출방법을 제공한다.
상기 유방암 진단용 조성물에 관한 사항은, 유방암 진단 정보를 제공하기 위한용 검출방법에 동일하게 적용될 수 있다.
상기 비교 단계에서 마커 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계는, 시료 내 상기 마커 유전자의 발현량이 정상 대조군 시료의 발현량 대비 높은 경우, 루미날 서브타입, 예를 들어 루미날 A 및/또는 루미날 B 서브타입의 분자적 아형으로서, 루미날 서브타입의 유방암인 것으로 진단할 수 있다.
예를 들어 환자 시료의 mRNA 발현량 기준으로, 상기 IL19 마커 유전자 발현량이 -10.500 또는 -10.154 이상, 바람직하게는 -7.500 또는 -7.958 이상으로 측정되는 경우, 상기 IL20 마커 유전자 발현량이 -10.000 또는 -9.752 이상, 바람직하게는 -8.000 또는 -7.723 이상으로 측정되는 경우, 및/또는 상기 IL24 마커 유전자 발현량이 -10.500 또는 -10.404 이상, 바람직하게는 -8.500 또는 -8.415 이상으로 측정되는 경우 루미날 서브타입의 유방암인 것으로 진단할 수 있다.
상기 마커 유전자의 발현 수준이 mRNA, DNA 또는 단백질에 의해서 측정될 수 있으며, 예를 들면, 상기 mRNA가 역전사효소 중합효소연쇄반응, 핵산 하이브리드화, 전기영동, 노던 블럿팅 또는 질량분광법에 의해서 측정될 수 있으며, 구체적으로 마커 유전자의 발현 수준 측정은, 상기 시료에서 RNA를 수득하고, 상기 RNA를 역전사하여 cDNA를 수득하고, 상기 cDNA에 검출가능한 표지를 부착하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 측정하는 것인 방법으로서, 상기 검출가능한 표지가 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광성 분자, 방사선 물질, 리포좀 또는 햅텐 분자일 수 있다.
또한, 상기 DNA가 정량적 폴리머라제 연쇄반응, 게놈 DNA-칩, 전기영동, 서던블랏팅 또는 질량 분광법에 의해 측정될 수 있으며, 상기 단백질이 면역학적 검정법, 웨스턴 블랏, ELISA 또는 질량분광법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 신규한 유방암 진단용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로서, 유전자의 발현 정도에 따라 유방암을 진단할 수 있어 조직 검사와 같이 고통 및 상처 없이 혈액을 통해 높은 민감도로 유방암을 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유방암의 분자적 아형(폐경 전; pre-menopause)에 따라 유전자의 분포를 나타낸 벤 다이어그램이다.
도 2는 본 발명에 따른 유방암의 분자적 아형(폐경 후; post-menopause)에 따라 유전자의 분포를 나타낸 벤 다이어그램이다.
도 3은 본 발명에 따른 IL19 유전자의 상자 수염 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 IL20 유전자의 상자 수염 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 IL24 유전자의 상자 수염 그림이다.
도 6은 루미날 A 및 루미날 B 분자적 아형을 판단할 수 있는 각 마커 유전자의 보정된 발현량의 한계치를 나타낸 것이다.
하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 유방암 진단용 마커 발굴
1.1 데이터 세트 준비 및 분석
데이터 세트로서, TCGA breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA)의 데이터 세트(version; 2015-02-24)는 UCSC Cancer Genomics Browser (https://genome-cancer.ucsc.edu/)에서 다운로드 했다. 데이터 세트는 Illumina HiSeq 2000 플랫폼으로 생성된 RNAseq gene expression 데이터로, 모든 데이터 값은 RSEM normalized 및 log2 transformed되어 있다. 상기 데이트 세트에서 'genomicMatrix'는 1215명의 유방암 환자에 대하여 20,530개 유전자의 발현량 값이 tab으로 구분되어 있는 파일이고, 'clinical_data'는 'genomicMatrix'와 일치되는 유방암 환자의 다양한 임상 정보(clinical information)가 포함되어 있는 파일이다.
1.2 데이터 전처리
실시예 1.1의 데이터 세트 중 'clinical_data' 파일은 필요한 정보만 추출하여 'sampleID', 'gender', 'sample_type', 'PAM50Call_RNAseq' 및 'menopause_status'로 칼럼을 재구성하고, 파이썬(version; 3.5.2, Python Software Foundation, https://www.python.org/)을 이용해 파이썬 스크립트를 작성하여 다음과 같이 데이터를 처리하였다.
첫 번째, 'gender' 칼럼에서 'FEMALE', 'MALE' 및 'NA'의 값을 갖는 sample ID를 각각 분류 했다. 'FEMALE' 값을 갖는 sample ID만 구분하여 별도로 취하고 'MALE'과 'NA'는 버렸다. 두 번째, 'sample_type' 컬럼에서 'Primary Tumor', 'Solid Tissue Normal' 및 'Metastatic'의 값을 갖는 sample ID를 각각 분류 했다. 'Primary Tumor' 및 'Solid Tissue Normal' 값을 갖는 sample ID만 구분하여 별도로 취하고 'Metastatic'은 버렸다. 세 번째, 'PAM50Call_RNAseq' 컬럼에서 'LumA', 'LumB', 'Her2', 'Basal' 및 'NA'의 값을 갖는 sample ID를 각각 분류 했다. 'LumA', 'LumB', 'Her2' 및 'Basal' 값을 갖는 sample ID만 구분하여 별도로 취하고 'NA'는 버렸다. 네 번째, 'menopause_status' 컬럼에서 'Pre', 'Peri', 'Post', 'Indeterminate' 및 'NA'의 값을 갖는 sample ID를 각각 분류했다. 'Pre' 및 'Post' 값을 갖는 sample ID만 구분하여 별도로 취하고 'Peri', 'Indeterminate' 및 'NA'는 버렸다. 위와 같이 유방암 환자의 다양한 임상 정보를 기반으로 sample ID를 범주에 따라 각각 분류한 뒤, sample ID에 해당하는 20,530개 유전자의 발현량 값을 추출하였다.
상기 TCGA-BRCA의 데이터 세트의 구성 중 유방암 환자의 임상 병리학적 특성을 표 1에, 유방암 환자의 폐경 상태에 관한 내용을 표 2에 나타내었다.
특징 구분 환자 수 %
전체 환자군 1215 100
성별 전체 1215 100
남성 12 0.99
여성 1184 97.45
N/A 19 1.56
서브타입(subtype) 전체 1184 100
Primary Tumor 1065 89.95
Solid Tissue Normal 112 9.46
Metastatic 7 0.59
분자적 서브타입
(molecular subtype)		 전체 1065 100
루미날 A 417 39.15
루미날 B 187 17.56
HER2-enriched 67 6.29
Basal-like 141 13.24
N/A 253 23.76
폐경 여부 전체 924 100
Pre-menopause 213 23.05
Peri-menopause 31 3.35
Post-menopause 582 62.99
Indeterminate 35 3.79
N/A 63 6.82
상기 표 1에서 확인할 수 있듯 연구대상은 여성 유방암 환자이므로, gender 컬럼에서 전체 1215명 중 Female 값을 갖는 Sample ID 1184명을 선별하고, sample type 컬럼에서 비교 대상인 Primary Tumor 및 Solid Tissue Normal 값을 갖는 Sample ID를 각각 1065명 및 112명 선별하였다.
또한, 유방암의 분자적 아형을 Luminal A, Luminal B, HER2-enriched 및 Basal-like의 네 가지 그룹으로 분류하고, PAM50Call_RNAseq 컬럼에서 1065명의 Primary Tumor인 여성 유방암 환자 중 Luminal A는 417명; Luminal B는 187명; HER2-enriched는 67명; Basal-like는 141명 선별하였다.
특징 구분 환자 수 %
전체 환자군 924 100
루미날 A 전체 417 100
Pre-menopause 99 23.74
Peri-menopause 13 3.12
Post-menopause 270 64.75
Indeterminate 15 3.60
N/A 20 4.80
루미날 B 전체 187 100
Pre-menopause 40 21.39
Peri-menopause 6 3.21
Post-menopause 129 68.98
Indeterminate 4 2.14
N/A 8 4.28
HER2-enriched 전체 67 100
Pre-menopause 14 20.90
Peri-menopause 3 4.48
Post-menopause 43 64.18
Indeterminate 4 5.97
N/A 3 4.48
Basal-like 전체 141 100
Pre-menopause 31 21.99
Peri-menopause 7 4.96
Post-menopause 85 60.28
Indeterminate 11 7.80
N/A 7 4.96
Solid Tissue Norma; 전체 112 100
Pre-menopause 29 25.89
Peri-menopause 2 1.79
Post-menopause 55 49.11
Indeterminate 1 0.89
N/A 25 22.32
상기 표 2에서, 임상적으로 예후를 판단하는데 매우 중요한 요소인 환자의 폐경 여부, 즉 menopause_status 컬럼에서 Pre 및 Post 값을 갖는 Sample ID를 선별하고, 여기서 Luminal A 환자는 417명으로 그 중 Pre(Luminal A_pre)는 99명; Post(Luminal A_post)는 270명이고, Luminal B 환자는 187명으로 그 중 Pre(Luminal B_pre)는 40명; Post(Luminal B_post)는 129명이며, HER2-enriched 환자는 67명으로 그 중 Pre(HER2-enriched_pre)는 14명; Post(HER2-enriched_post)는 43명이고, Basal-like 환자는 141명으로 그 중 Pre(Basal-like_pre)는 31명; Post(Basal-like_post)는 85명이며, Solid Tissue Normal은 112명으로 그 중 Pre(Normal_pre)는 29명; Post(Normal_post)는 55명이었다.
1.3 유전자 세트 준비
분석에 사용되는 유전자 세트로서, Janeway's Immunobiology 9th Edition (Kenneth Murphy, Casey Weaver. Garland Science. 2016.)의 Appendix III. Cytokines and Their Receptors. (p811-813)에 기술된 66개 사이토카인을 준비하였다. 집락-자극인자(colony-stimulating factor; CSF), 인터페론(interferon; IFN), 인터루킨(interleukin; IL) 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF) 등으로 범주가 나뉘어져 있고, 사이토카인과 상응하는 유전자의 발현량 값을 재 추출했다. 상기 66개의 사이토카인은 아래 표 3에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
1.4 통계 분석
상기 66개 사이토카인의 유전자에 대하여 Primary Tumor의 분자적 아형에 따라 분류한 Luminal A, Luminal B, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 tumor mass의 주변에 분포한 정상 조직인 Solid Tissue Normal 그룹 간의 유전자 발현량의 차이를 비교하기 위하여 상기 실시예 1.2에서 준비한 데이터에 대하여 t-test 분석하였다. 통계적 유의성의 기준은 p-value가 0.05일 때, Bonferroni correction을 통과하고, t-statistic 값은 양수로서, 통계적 유의성을 만족하는 유전자들을 분류했다. 모든 수학적 계산 및 통계 분석은 파이썬 스크립트를 작성하여 처리 했고, 분석에 사용된 파이썬 모듈은 numpy (version 1.11.1; NumPy developers, http://www.numpy.org/)와 scipy (version 0.17.1; SciPy developers, http://www.scipy.org/)이다.
분석 결과, Pre-menopause 그룹에서 Luminal A_pre는 14개 유전자; Luminal B_pre는 11개 유전자; HER2-enriched_pre는 12개 유전자, Basal-like_pre는 20개 유전자가 Normal_pre보다 유의한 차이가 있었고, Post-menopause 그룹에서 Luminal A_post는 12개 유전자; Luminal B_post는 15개 유전자; HER2-enriched_post는 17개 유전자; Basal-like_post는 20개 유전자가 Normal_post보다 유의한 차이가 있었다.
상기 t-test 분석에 대한 결과로서 Luminal A의 Pre-menopause 그룹에서 유의한 차이가 있는 유전자 중 IL19, IL20 및 IL24의 발현량 및 Post-menopause 그룹에서 유의한 차이가 있는 유전자 중 IL19, IL20 및 IL24의 발현량을 표 4에 나타내었다.
구분 유전자 루미날 A Normal Log2FC t-statistic p-value
폐경 전 IL19 1.942 0.264 1.678 5.023 1.70.E-06
IL20 6.232 2.146 4.086 8.233 1.98.E-13
IL24 3.816 1.740 2.076 6.384 3.02.E-09
폐경 후 IL19 1.207 0.157 1.050 4.975 1.06.E-06
IL20 4.352 2.024 2.327 6.528 2.58.E-10
IL24 2.892 1.875 1.017 4.952 1.19.E-06
또한 상기 t-test 분석에 대한 결과로서 Luminal B의 Pre-menopause 그룹에서 유의한 차이가 있는 유전자 중 IL19, IL20 및 IL24의 발현량 및 Post-menopause 그룹에서 유의한 차이가 있는 유전자 중 IL19, IL20 및 IL24의 발현량을 표 5에 나타내었다.
구분 유전자 루미날 B Normal Log2FC t-statistic p-value
폐경 전 IL19 2.891 0.264 2.627 5.0303 3.86.E-06
IL20 6.997 2.146 4.850 10.363 1.48.E-15
IL24 4.232 1.740 2.493 7.424 2.63.E-10
폐경 후 IL19 2.176 0.157 2.019 6.034 8.76.E-09
IL20 5.095 2.024 3.071 7.796 4.75.E-13
IL24 3.241 1.875 1.366 5.391 2.15.E-07
1.5 벤 다이어그램 분석
실시예 1.3의 t-test 분석에서 통계적 유의성을 만족하는 유전자가 유방암의 어떤 분자적 아형에 특이적으로 분포하는지 확인하기 위하여, 벤 다이어그램 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 웹 사이트 툴은 Venny (version 2.1; BioinfoGP Service, CNB-CSIC, http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)이다.
Pre-menopause 그룹에서 유방암의 분자적 아형에 따라 Luminal A_pre, Luminal B_pre, HER2-enriched_pre 및 Basal-like_pre의 유전자의 분포를 나타낸 벤 다이어그램 결과를 도 1에, Post-menopause 그룹에서 유방암의 분자적 아형에 따라 Luminal A_post, Luminal B_post, HER2-enriched_post 및 Basal-like_post의 유전자의 분포를 나타낸 벤 다이어그램 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 1 및 도 2의 벤 다이어그램에서 s1-s15까지의 각 구역이 의미하는 바를 아래 표 6에 나타내었다.
구역 설명
s1 "루미날 A"만 포함하는 구역
s2 "루미날 A" 및 "루미날 B"의 공통 구역
s3 "루미날 B"만을 포함하는 구역
s4 "루미날 A" 및 "HER2-enriched"의 공통 구역
s5 "루미날 A", "루미날 B" 및 "HER2-enriched"의 공통 구역
s6 "루미날 B" 및 "HER2-enriched"의 공통 구역
s7 "HER2-enriched"만을 포함하는 구역
s8 "루미날 A", "HER2-enriched"및 "Basal-like"의 공통 구역
s9 "루미날 A", "루미날 B", "HER2-enriched"및 "Basal-like"의 공통구역
s10 "루미날 B", "HER2-enriched" 및 "Basal-like"의 공통 구역
s11 "HER2-enriched" 및 "Basal-like"의 공통 구역
s12 "루미날 A" 및 "Basal-like"의 공통 구역
s13 "루미날 A", "루미날 B" 및 "Basal-like"의 공통 구역
s14 "루미날 B" 및 "Basal-like"의 공통 구역
s15 "Basal-like"만을 포함하는 구역
상기 도 1 및 도 2의 벤 다이어그램에서 Pre-menopause 그룹과 Post-menopause 그룹에서 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 분포하는 구역은 표 7에 나타내었고, Pre-menopause 그룹의 IL19, IL20 및 IL24 유전자는 s2 구역(Luminal와 Luminal B의 공통 구역)에 속하고, Post-menopause 그룹의 IL19 유전자는 s5 구역(Luminal A, Luminal B 및 HER2-enriched의 공통 구역); IL20 및 IL24 유전자는 s2 구역(Luminal A와 Luminal B의 공통 구역)에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
유전자 구역
Pre-menopause
　		 IL19 s2
IL20 s2
IL24 s2
Post-menopause
　		 IL19 s5
IL20 s2
IL24 s2
실시예 2. 유방암 진단용 마커의 발현수준 확인
2.1 유방암 진단용 마커 유전자의 발현량 확인
실시예 1에서 선정된 유방암 진단용 마커, IL19, IL20 및 IL24 유전자에 대하여, Luminal A 그룹과 HER2-enriched 및 Basal-like 그룹 간의 유전자 발현량의 차이를 확인하기 위하여 비교 분석을 수행했고, Luminal B 그룹과 HER2-enriched 및 Basal-like 그룹 간의 유전자 발현량의 차이를 확인하기 위하여 비교 분석을 수행했다. 도 3 내지 도 5는 상기 마커 유전자의 발현량을 상자 수염 그림(boxplot)으로 나타낸 결과이다.
2.2 유방암 진단용 마커 유전자 발현량의 t-test 분석
실시예 2.1의 유전자 발현량 결과를 t-test 분석하였다. t-test 분석에서 통계적 유의성을 만족하는 기준은 p-value가 0.05일 때, Bonferroni correction을 통과하고, t-statistic 값은 양수일 경우이다.
Luminal A와 HER2-enriched 및 Basal-like의 유전자 발현량을 비교한 결과를 아래 표 8에, Luminal B와 HER2-enriched 및 Basal-like의 유전자 발현량을 비교한 결과를 아래 표 9에 나타내었다.
구분 유전자 루미날 A HER2-enriched Basal-like log2FC t-statistic p-value
Pre-menopause
　
　
　		 HER2-enriched
　		 IL20 6.232 2.798 - 3.434 4.874 3.66.E-06
IL24 3.816 2.233 - 1.583 3.301 1.29.E-03
Basal-like
　		 IL19 1.942 - 1.02 0.923 2.584 1.09.E-02
IL20 6.232 - 1.269 4.963 10.645 2.41.E-19
IL24 3.816 - 2.338 1.478 4.544 1.26.E-05
Post-menopause
　
　
　		 HER2-enriched
　		 IL20 4.352 2.515 - 1.837 4.519 8.83.E-06
IL24 2.892 1.827 - 1.065 4.555 7.53.E-06
Basal-like
　		 IL19 1.207 - 0.65 0.557 3.112 2.01.E-03
IL20 4.352 - 0.994 3.357 11.84 1.83.E-27
IL24 2.892 - 2.087 0.805 4.423 1.30.E-05
구분 유전자 루미날 B HER2-enriched Basal-like log2FC t-statistic p-value
Pre-menopause
　
　
　		 HER2-enriched
　		 IL19 2.891 0.917 - 1.974 2.636 1.10.E-02
IL20 6.997 2.798 - 4.199 6.478 3.36.E-08
IL24 4.232 2.233 - 2 3.908 2.70.E-04
Basal-like
　		 IL19 2.891 - 1.02 1.871 3.347 1.33.E-03
IL20 6.997 - 1.269 5.728 13.801 1.58.E-21
IL24 4.232 - 2.338 1.895 5.41 8.57.E-07
Post-menopause
　
　
　		 HER2-enriched
　		 IL20 5.095 2.515 - 2.581 5.711 4.91.E-08
IL24 3.241 1.827 - 1.413 4.89 2.33.E-06
Basal-like
　		 IL19 2.176 - 0.65 1.526 5.427 1.56.E-07
IL20 5.095 - 0.994 4.101 13.202 1.93.E-29
IL24 3.241 - 2.087 1.153 4.977 1.34.E-06
상기 IL19, IL20 및 IL24 유전자에 대하여 t-test 분석을 수행했을 때, Pre-menopause 그룹에서 Luminal A_pre와 HER2-enriched_pre 비교 시 IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Luminal A_pre와 Basal-like_pre 비교 시 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Post-menopause 그룹에서 Luminal A_post와 HER2-enriched_post 비교 시 IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Luminal A_post와 Basal-like_post 비교 시 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었다.
또한 상기 IL19, IL20 및 IL24 유전자에 대하여 t-test 분석을 수행했을 때, Pre-menopause 그룹에서 Luminal B_pre와 HER2-enriched_pre 비교 시 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Luminal B_pre와 Basal-like_pre 비교 시 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Post-menopause 그룹에서 Luminal B_post와 HER2-enriched_post 비교 시 IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었고, Luminal B_post와 Basal-like_post 비교 시 IL19, IL20 및 IL24 유전자가 유의한 차이가 있었다.
실시예 3. 유방암 진단용 마커의 검출 조건 확립
실시예 1 및 실시예 2의 결과를 바탕으로 루미날 A 또는 루미날 B 서브타입의 유방암 진단용 조성물 및 검출을 위한 조건을 아래 표 10에 나타내었다.
서브타입 폐경 여부 조건
루미날 A
　
　		 Pre-menopause
　		 IL19, IL20, IL24 > Solid Tissue Normal
IL20, IL24 > HER2-enriched
IL19, IL20, IL24 > Basal-like
Post-menopause
　		 IL19, IL20, IL24 > Solid Tissue Normal
IL20, IL24 > HER2-enriched
IL19, IL20, IL24 > Basal-like
루미날 B
　		 Pre-menopause
　		 IL19, IL20, IL24 > Solid Tissue Normal
IL19, IL20, IL24 > HER2-enriched
IL19, IL20, IL24 > Basal-like
Post-menopause IL19, IL20, IL24 > Solid Tissue Normal
IL20, IL24 > HER2-enriched
IL19, IL20, IL24 > Basal-like
Luminal A의 Pre-menopause 그룹에서 IL19 유전자는 Solid Tissue Normal 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었고, IL20 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었으며, IL24 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었다.
Luminal A의 Post-menopause 그룹에서 IL19 유전자는 Solid Tissue Normal 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었고, IL20 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었으며, IL24 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었다.
Luminal B의 Pre-menopause 그룹에서 IL19 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었고, IL20 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었으며, IL24 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었다.
Luminal B의 Post-menopause 그룹에서 IL19 유전자는 Solid Tissue Normal 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었고, IL20 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었으며, IL24 유전자는 Solid Tissue Normal, HER2-enriched 및 Basal-like 그룹과 비교 시 유의한 차이가 있었다.
따라서, 상기 표 10에 도시한 바와 같이 루미날 A 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 마커로서 IL19, IL20 및 IL24의 유전자를 사용할 수 있고, 루미날 B 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 유용한 마커로서 IL19, IL20 및 IL24의 유전자를 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 마커 유전자의 한계치 설정
유방암의 Luminal A 및 Luminal B 분자적 아형을 판단할 수 있는 각 마커 유전자들의 발현량의 한계치를 설정하기 위하여 아래와 같은 분석을 진행 하였다. 분석을 진행하기에 앞서, 유전자 및 단백질의 발현 수준을 측정하는 측정법은 매우 다양하므로, 여러가지 플랫폼에 적용하여 측정할 수 있도록 데이터 세트의 절대적인 발현량 대신 housekeeping 유전자의 발현량으로 보정하여 분석을 진행하였다. 상기 절차에 의하여, 다른 플랫폼에서 유방암의 Luminal A 및 Luminal B 분자적 아형을 판단할 시, 사용된 플랫폼에 따라서 절대적인 발현량의 차이를 정확하게 판단할 수 있다.
상기 실시예 1 내지 3에서 사용된 유전자의 절대적 발현량은 log2 transformed된 값이므로, 각각의 마커 유전자의 발현량 값에서 housekeeping 유전자의 발현량 값을 감해줌으로써 보정하였다. 알려진 housekeeping 유전자 중에서 B2M (Beta-2-Microglobulin) 유전자는 유방암의 각 분자적 아형 간의 비교에서 유전자 발현량 차이가 가장 적었으므로, 본 발명은 B2M 유전자 발현량 값에 의해 보정된 발현량 값을 이용하여, Luminal A의 폐경 전/후 그룹 및 Luminal B의 폐경 전/후 그룹을 각각 non-luminal 분자적 아형 그룹과의 probit 분석을 진행하였고, LD80 기준으로 검출 한계치(limit of detection)를 측정하여 아래 표 11에 나타내었다. 상기 보정된 발현량의 한계치는 아래 수학식 1으로 산출하였다.
Figure pat00003
유전자 루미날 A 루미날 B
폐경 전 폐경 후 폐경 전 폐경 후
IL19 -9.977 -10.154 -7.958 -9.502
IL20 -8.42 -9.752 -7.723 -8.616
IL24 -9.646 -10.404 -8.415 -8.895
상기 표 11의 결과로부터 시료 내 마커 유전자의 발현량이 상기 표 11의 수치보다 높게 측정되는 경우 폐경 전/후의 루미날 A 또는 루미날 B 분자적 아형이라고 판단할 수 있다.
상기 수치를 이용하여 각각의 폐경 전/후의 루미날 A 및 루미날 B 분자적 아형에서의 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 도출하였다. : 민감도(sensitivity)는 질병이 있는 환자가 양성인 검사 결과 확률을 의미하고, 특이도(specificity)는 질병이 없는 사람이 음성인 검사 결과 확률을 의미한다. 진단 검사법의 타당도는 아래 표 12의 조건과 같이 검사 결과가 양성(예, 표 11의 한계치를 넘는 경우) 및 음성(예, 표 11의 한계치를 넘지 않는 경우) 및 질병 유무에 따른 군을 나누어 민감도(감수성, sensitivity)는 "A/(A+C)"의 계산식으로, 특이도(특이성, specificity)는 "D/(B+D)"의 계산식으로 계산하였다(http://www.slideshare.net/cyberdoc73/20130320-lems-colloquium 웹 사이트 참고).
검사 결과 질병 상태 전체 (명)
있음 (명)
<Luminal A (또는 B)>		 없음 (명)
<Luminal B (또는 A) 및 그 외 서브타입>
양성 A B A+B
음성 C D C+D
전체 A+C B+D A+B+C+D
그 결과를 도 6에 나타내었으며, 그 결과 특이도는 모두 90%를 이상으로 매우 우수하고 폐경 전/후 비교 시 폐경 전에서 폐경 후 보다 민감도가 더욱 높은 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 루미날 서브타입은 루미날 A 또는 루미날 B 서브타입인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 폐경 전 여성의 루미날 서브타입의 유방암을 진단하는 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 유방암 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 폐경 전 여성의 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 유방암 진단용 키트.
  7. IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암을 진단하기 위한 마이크로어레이.
  8. 환자의 시료로부터 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 유방암 진단용 조성물을 통해 IL19, IL20 및 IL24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 루미날 서브타입의 유방암 진단 정보를 제공하기 위한 검출방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 환자 시료의 mRNA 발현 수준이
    상기 IL19 마커 유전자 발현량이 -10.500 이상,
    상기 IL20 마커 유전자 발현량이 -10.000 이상, 또는
    상기 IL24 마커 유전자 발현량이 -10.500 이상으로 측정되는 경우 루미날 서브타입의 유방암인 것으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 검출 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준의 측정은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하여, 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행하고, 상기 단백질 발현 수준의 측정은 해당 단백질에 특이적인 항체를 포함하여, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행하는, 검출방법.
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