KR20180038092A - 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법 - Google Patents

글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소원으로 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 탄소원으로 글루코오스를 이용할 경우보다 당대 수율이 월등히 높고 , 탄소원으로 일반 글리세롤(상품으로 판매되는 순수 글리세롤)을 이용할 경우보다도 당대 수율이 높은 효과를 가진다.

Description

글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법{Biosynthesis Method of Mevalonates Using a Biodiesel By-Product}
본 발명은 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법에 관한 것이다.
에너지 자원 고갈의 문제가 없고, 폐식용유 등 폐자원의 활용이 가능하다는 측면과, 분진, 매연, 일산화탄소 등 각종 공해물질 발생이 저감된다는 환경적인 측면, 그리고 화석 연료의 고갈과 그에 따라 2020년까지 바이오디젤 보급률을 5%까지 증가시키겠다는 정책적인 측면 등이 어우러져 우지, 대두유, 폐식용유 등의 동·식물성 유지를 원료로 하여 제조되는 바이오디젤 산업이 급격하게 성장하고 있다(한국경제 2014. 08. 06자 기사).
바이오디젤은 지방산과 글리세롤이 결합된 형태인 동·식물성 지방의 트리글리세리드(triglyceride)로부터 에스테르교환반응(transesterification)을 통해 글리세롤을 분리시켜 얻어지는 메틸 에스테르(fatty acid methyl esters) 또는 에틸 에스테르(fatty acid ethyl esters)를 말한다. 바이오디젤은 트리글리세리드를 산 또는 염기 촉매하에 메탄올, 에탄올 등의 저급 알콜과 반응시켜 제조하는 화학적 방법과 에스테르교환 반응을 촉매하는 리파아제 등 효소를 이용하는 생물학적 방법, 초임계 메탄올, 에탄올을 이용하는 방법 등이 있는데, 현재 염기 촉매에 의한 화학적 방법이 가장 일반화되어 있다(Bioresource Technology, 70: 1~15, 1999; Fuel, 80(2): 225~231, 2001; Fuel, 80(5):693~698, 2001; Renewable Energy, 3:13~16, 2003).
바이오디젤이 트리글리세리드로부터 글리세롤를 분리시켜 제조되기 때문에 바이오디젤 생성 과정에서 부산물로서 글리세롤이 필수적으로 발생하게 되는데, 이 때 생성되는 글리세롤은 바이오디젤의 10%에 상당하는 것으로 보고되어 있다(Green Chem., 9:868, 2007). 바이오디젤 생성 부산물에는 글리세롤 이외에도 미반응 물질인 트리클리세리드, 메탄올 등의 반응물질, 분리되지 않은 바이오디젤, 산 또는 염기 촉매 등이 포함되어 있어 바이오디젤 생성 부산물의 글리세롤 순도는 50~80% 수준이다.
바이오디젤 생성 부산물에서 글리세롤을 분리·정제하는 증류법, 흡착법, 추출법 등이 제안되어 있으나(Green Chem., 9:868, 2007), 순수 글리세롤의 가격이 높지 않고 분리·정제 공정이 복잡하여 비용이 높기 때문에 바이오디젤에서 분리·정제한 글리세롤은 가격 경쟁력이 떨어진다. 따라서 바이오디젤 생산량의 증가에 따라 점차 증가하는 폐 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물은 대부분이 폐기되고 있는 실정이다.
한편 메발론산은 생물에서 코엔자임 큐텐(coenzyme Q10), 스쿠알렌(squalene), 콜레스테롤(cholesterol), 이소프레노이드(isoprenoid) 등의 생합성에 이용되는 중간대사체로 알코올 작용기와 카르복실 작용기를 양쪽 끝에 가지고 있는 구조이며, 물에 잘 녹고 극성 용매에도 잘 녹는다. 또한 산처리에 의한 탈수소화 반응을 통하여 쉽게 메발로노락톤으로 전환될 수 있다. 메발론산은 3위 탄소가 비대칭탄소원자이며 (R+)체만이 생물학적으로 생산되고 이용된다.
메발론산의 생합성 과정을 보면, 도 1에서 확인되듯이 2 분자의 아세틸 코엔자임 A(acetyl-CoA)를 전구체로 하여 아세토아세틸 코엔자임 A(acetoacetyl-CoA)와 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A(HMGCoA; hydroxymethylglutaryl CoA)의 생성을 거쳐 이루어진다.
2 분자의 아세틸 코엔자임 A로부터 아세토아세틸 코엔자임 A의 생성에는 아세토아세틸 코엔자임 A 합성효소(acetoacetyl-CoA synthase, acetyl-CoA acetyltransferase or acetoacetyl-CoA thiolase, 이하 "AtoB"), 아세토아세틸 코엔자임 A로부터 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A의 생성에는 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 합성효소(HMG-CoA synthase, 이하 "HMGS"), 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A로부터 메발로네이트의 생성에는 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소(HMG-CoA reductase, 이하 "HMGR")가 각각 관여한다(Journal of Biotechnology 140:218.226, 2009; NATURE BIOTECHNOLOGY 21:796-802, 2003], 문헌 [Metabolic Engineering 11:13-19, 2009; Clinical Biochemistry 40:575-584, 2007; Arch Biochem Biophys. 505(2):131-143, 2011)
메발론산과 메발로노락톤은 현재 산업적 응용범위가 넓어지고 있는 추세이며, 화장품 첨가물이나, 생분해성 폴리머 생산, 키랄 화합물생산에 사용되고 있다.특히 화장품 원료로 사용 시 피부 세포에 흡수되어 항노화, 항산화, 보습, 피부 장벽 재생, 주름 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 실제 메발론산은 피부에 처리하면 손상에 대한 피부 내성을 증대시키고 세균이나 외부 자극으로부터 피부를 보호해 주고 피부의 수분 유지를 도와주는 막인 피부 장벽이 손상으로부터 복원되는 것을 촉진하는 것으로 보고되었다.
본 발명은 메발로네이트의 생합성에 있어 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물의 탄소원으로서의 이용 가능성을 확인함으로써 완성된 것이다.
본 발명은 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트의 생합성 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 메발로네이트 생합성과 관련된 세 가지 유전자, 즉 AtoB를 암호화하는 atoB 유전자, HMGS를 암호화하는 mvaS 유전자, HMGR를 암호화하는 mvaE 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 500ml의 플라스크 및 2L의 발효기를 통해 메발로네이트를 생합성할 때, 탄소원으로서 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 공급할 경우, 각 당대 수율(탄소원 공급량 대비 메발로네이트 생성 수율)이 44.95%(500ml의 플라스크 배양), 26.43%(2L의 발효기 배양)로, 탄소원으로 글루코오스를 공급할 경우의 당대 수율 9.92%에 비하여 현저히 높았고, 또한 탄소원으로 일반 글리세롤(상품으로 판매되는 순수 글리세롤)을 공급할 경우의 각 당대 수율 41.1%(500mL의 플라스크 배양), 26.1%(2L의 발효기 배양)보다도 높은 결과를 보였다. 이러한 결과는 전술한 바와 같이 재활용이 경제성이 없어 폐기되는 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용하여 얻어진 것으로 메발로네이트의 생산 비용을 절감할 수 있다는 점에서 매우 유의미한 결과라 할 수 있다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 (a) AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 제조하는 단계, (b) 이 형질전환된 숙주 미생물 배양을 위한 배지를 조제하는 단계, (c) 그 배지에 상기 형질전환된 숙주 미생물을 접종하여 배양하는 단계, 및 (d) 배양물로부터 메발로네이트를 수득하는 단계를 포함하되, 상기 배지에는 탄소원으로서 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물이 상기 (b) 단계의 배지 조제 단계 및/또는 상기 (c) 단계의 숙주 미생물의 배양 단계 중에 공급되는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 메발로네이트는 메발론산(mevalonic acid)과 상호 등가적으로 사용된다.
또 본 명세서에서, "글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물"은 이미 전술한 바와 같이, 지방산과 글리세롤이 결합된 형태인 동·식물성 지방의 트리글리세리드(triglyceride)로부터 에스테르교환반응(transesterification)을 통해 글리세롤을 분리시켜 얻어지는 바이오디젤인 메틸 에스테르(fatty acid methyl esters) 또는 에틸 에스테르(fatty acid ethyl esters)를 생성할 때 생성되는 부산물로서, 글리세롤을 50~80% 수준으로 포함하는 것을 의미한다. 더 구체적으로 50~80%의 글리세롤 이외에 기타 미반응 물질인 트리클리세리드, 메탄올 등의 반응물질, 분리되지 않은 바이오디젤, 산 또는 염기 촉매 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에서, AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터의 제조는 AtoB, HMGS 및 HMGR를 암호화하는 유전자를 포함하여 구성되는데, 해당 유전자들은 당업계에 많은 양의 문헌을 통하여 널리 주지되어 있다. AtoB를 암호화하는 유전자는 당업계에서 phaA, mvaE, atoB 등으로 알려져 있고, HMGS를 암호화하는 유전자는 당업게에서 HMGS, mvaS 등으로 알려져 있으며, HMGR를 암호화하는 유전자는 HMGR, mvaA, mvaE 등으로 알려져 있는데, 해당 유전자들의 염기서열 등에 대한 정보는 예컨대 발명의 명칭이 "메발로네이트 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발로네이트 또는 메발로노락톤의 제조방법"인 한국 공개특허 제10-2015-0134512호, 발명의 명칭이 "메발론산의 생산에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 메발론산의 생산 방법"인 한국 공개특허 제10-2015-0006097호, 문헌 [Journal of Biotechnology 140:218.226, 2009], 문헌 [NATURE BIOTECHNOLOGY 21:796-802, 2003], 문헌 [Metabolic Engineering 11:13-19, 2009], 문헌 [Clinical Biochemistry 40:575-584, 2007], 문헌 [Arch Biochem Biophys. 505(2):131-143, 2011] 등으로부터, 또는 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등재된 해당 유전자들로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서 AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터는 AtoB, HMGS 및 HMGR를 모두 발현시킬 수 있는 하나의 발현벡터로 구성되거나 AtoB, HMGS 및 HMGR 중 둘을 발현시키고 나머지 하나를 발현시킬 수 있는 두 개의 발현벡터로 구성되거나 AtoB, HMGS 및 HMGR 각각을 발현시킬 수 있는 세 개의 발현벡터로 구성될 수 있다. 특히 mvaE 유전자의 산물은 AtoB와 HMGR의 기능을 동시에 가지므로 mvaE 유전자를 사용할 경우 HMGS를 암호화하는 HMGS, mvaS 등의 유전자와 함께 발현벡터를 하나 또는 두 개로 구성할 수도 있다.
발현벡터는 숙주 미생물 내에서 목적유전자(AtoB, HMGS 및/또는 HMGR를 암호하는 유전자)를 발현시킬 수 있는 DNA 구성물(DNA CONSTRUCT)로서, 숙주 미생물에 도일될 경우 숙주 미생물의 게놈과 독립적으로 복제되고 기능(목적 유전자의 발현)하거나 숙주 미생물의 게놈에 통합되어 복제·기능하게 된다.
본 발명에서 발현벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지 등 형태의 핵산일 수 있으며, 숙주 미생물에 따라 적합한 벡터를 상용화된 벡터 중에서 구입하여 사용하거나 구입·개조하여 사용할 수 있다. 예컨대 숙주 미생물로서 대장균을 사용할 경우 pUC19, pSTV28, pBBR1MCS, pBluscriptII, pBAD, pTrc99A, pET, pACYC184, pBR322, pJE101, pJE102,, pJE103 등을 사용할 수 있다.
재조합 DNA 기술을 포함한 발현벡터 구성에 대해서는 당업계에 상당한 양의 문헌이 축적되어 있으며, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)], 문헌[F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Inc. (1994)], 문헌 [Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques] 등을 참조할 수 있다.
발현벡터는 목적 유전자인 시스-트랜스퍼라제 유전자나 UDP 피로인산 신타아제 유전자 이외에, 그 목적 유전자와 작동 가능하게 연결됨으로써 상기 목적 유전자의 전사와 번역에 영향을 미치는 조절서열을 포함한다.
이러한 조절서열에는 통상적으로 프로모터 서열, 전사종결 신호 서열(polyadenylation signal) 등이 포함된다. 여기서 "작동가능하게 연결된다"는 의미는 어떤 유전자의 전사 및/또는 번역이 영향을 받도록 연결된다는 의미이다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그것에 연결된 어떤 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 프로모터와 그 유전자는 작동가능하게 연결된 것이다.
본 명세서에서 "프로모터"는 당업계에 알려진 통상의 의미를 따르는데, 구체적으로는 어떤 유전자의 전사 개시점을 기준으로 상위(5'쪽)에 위치하고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시점, 전사 인자 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는 그것이 원핵생물 유래일 경우 전사 개시점 상위에 있는 Prib-now box(통상 전사 개시점(+1) -10 부근 위치), Hogness box(통상 전사 개시점(+1) -35 부근 위치)를 포함하며, 그것이 진핵생물 유래일 경우 전사 개시점 상위에 있는 TATA 박스(통상 전사 개시점(+1) -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시 부위와 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 인핸서, 전사 억제 인자 등을 포함한다.
프로모터는 그것에 연결된 목적유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터라면 구성적 프로모터(특정 유기체에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터), 유도성 프로모터(특정 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터) 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 특정 숙주 미생물에 적합한 프로모터를 사용하는 경우이다. 예컨대 대장균을 숙주 미생물로 사용할 경우 T7A1, T7A2, T7A3, λpL, λpR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA, rrnB, 1PL 등의 프로모터, 숙주 미생물로서 효모를 사용할 경우 GAL1, GAL10, ADH1, TDH3, PGK 등의 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 발현벡터는 프로모터 이외에 전사 종결 서열인 터미네이터 서열을 포함하여 구성되는데, 터미네이터 서열은 poly(A) 첨가 신호(polyadenylation signal)로 작용하는 서열로서 전사의 완결성 및 효율성을 높이기 위한 것이다. 숙주 미생물에 따라 적합한 터미네이터 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 숙주 미생물이 대장균일 경우 tac 터미네이터 서열, rrnB 터미네이터 서열 등을 사용할 수 있고, 숙주 미생물이 효모일 경우 ADH1 터미네이터 서열 등을 사용할 수 있다.
상기 발현벡터는 선별 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자는 그러한 마커 유전자를 포함하는 숙주 미생물의 선별을 가능하게 하는 형질을 암호화하는 유전자로서 일반적으로는 항생물질 내성 유전자이다. 사용 가능한 항생물질 내성 유전자의 예로는 퓨로마이신 내성 유전자(예컨대 Streptomyces alboniger로부터 유래된 퓨로마이신 N-아세틸 트랜스퍼라제 유전자), 네오마이신 내성 유전자(예컨대 Streptomyces fradiae로부터 유래된 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자), 하이그로마이신 내성 유전자(Streptomyces hygroscopicus 로부터 유래된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자), 블레오마이신 내성 유전자(Streptomyces verticillus로부터 유래된 블레오마이신 결합 단백질), 블라스티시딘 내성 유전자(예컨대 Streptomyces verticillum로부터 유래된 블라스티시딘 S-아세틸트랜스퍼라제 유전자), 하이그로마이신 내성 유전자(예컨대 Escherichia coli로부터 유래된 아미노사이클리톨 포스포트랜스퍼라제 유전자), 암피실린 내성 유전자(β-락타마제 유전자) 등을 들 수 있다.
선별마커는 티미딜레이트 신타제 유전자, 티미딘 키나아제 유전자 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 등일 수 있다. 이들 유전자는 특정 성분이 존재·결여된 배지에서 해당 유전자를 가진 숙주 미생물의 선별을 가능하게 한다(Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537-56 (1990)).
본 발명의 방법에 있어서, 발현벡터는 또한 목적유전자의 용이한 클로닝을 위해서 제한효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 발현벡터를 제작한 후에는 이를 숙주 미생물에 형질전환시키는 (b) 단계가 수행되게 된다.
형질전환은 왜래 유전자가 도입됨에 의한 숙주 미생물의 유전자형의 변형을 의미하는데, 그 도입된 왜래 유전자는 숙주 미생물의 게놈과 독립적으로 존재하거나 숙주 미생물의 게놈에 통합되어 존재할 수 있다. 여기서 왜래 유전자에는 동종성 유전자와 이종성 유전자가 포함되는데, "동종성 유전자"란 숙주 미생물 또는 그와 동일한 생물종의 내인성 유전자를 의미하며, "이종성 유전자"란 그것이 형질전환되는 유기체에서는 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예컨대 HMGS를 암호화하는 한국 공개특허 제 호의 서열번호 1에 개시된 엔테로코커스 킹세종엔시스 Gf1(Enterococcus Kingsejongensis Gf1) 유래의 mvaS 유전자를 대장균에 도입할 경우 이 유전자는 이종성 유전자가 되며, 해당 유전자를 엔테로코커스 킹세종엔시스 Gf1에 도입할 경우는 동종성 유전자가 된다.
외래 유전자로 숙주 미생물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 방법 중 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 숙주 미생물이 대장균 등 원핵세포인 경우, 형질전환은 CaCl2 방법, 하나한 방법, 전기 천공 방법, 칼슘 포스페이트 침전법 등을 사용할 수 있고, 숙주 미생물이 효모 등 진핵세포인 경우에, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있다. 형질전환 방법과 관련하여 구체적인 사항은 문헌(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 문헌(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)), 문헌(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 문헌(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 문헌(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 문헌(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), 문헌(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 문헌(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 문헌(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory (1982)) 문헌(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080 (1980)), 문헌(Luchansky et al Mol. Microbiol. 2, 637-646 (1988)) 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 원핵세포로서는 그람-양성 세균과 그람-음성 세균 모두 사용할 수 있다. 구체적으로 에세리키아(Escherichia) 속 세균을 포함하여 살모넬라(Salmonella) 속 세균, 쉬겔라(Shigella) 속 세균, 엔테로박터(Enterobacter) 속 세균, 세라티아(Serratia) 속 세균, 에르위니아(Erwinia) 속 세균, 세라티아(Serratia) 속 세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균, 카울로박터(Caulobacter) 속 세균, 시네코시스티스(Synechocystis) 속 세균(예컨대 시네코시스티스 종 PCC 6803 또는 시네코콕코스 종 PCC 6301), 시네코콕코스(Synechococcus) 속의 세균, 바실러스 속의 세균(예컨대 Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringienesis 등), 락토콕코스(Lactococcus) 속의 세균(예컨대 Lactococcus lactis), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 세균(예컨대 Streptomyces lividans , Streptomyces ambofaciens , Streptomyces fradiae , Streptomyces griseofuscus), 로도콕코스(Rhodococcus) 속 세균(예컨대 Rhodococcus erythropolis), 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균(예컨대 Corynebacterium gluamicum), 미코박테리움(Mycobacterium) 속 세균(예컨대 Mycobacterium smegmatis) 등을 사용할 수 있다.
진핵세포로서는 효모세포, 예컨대 피키아 속 효모(예컨대 Pichia pastoris), 사카로마이세스 속 효모(예컨대 Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 속 효모(예컨대 Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 속 효모(예컨대 Kluyveromyces lactis), 스키조사카로마이세스 속 효모(예컨대 Schizosaccharomyces pombe) 등을 사용할 수 있다.
바람직하게는 대장균(Escherichia coli)을 사용하는 경우이다. 대장균에서의 발현은 다른 발현 숙주 미생물에 비해 비용, 수율 측면에서 여러 가지 장점을 제공할 수 있다. 목적유전자의 고수율의 발현을 위해 적합한 대장균으로서 대장균 W3110, 대장균 BL21, BL21(DE3), DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DHIOB/p3, DH1 IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, NovaBlue, DH5α, K12 RV308, K12 C600, K-12, MG1655, HB101 균주 등을 들 수 있다. 보다 자세한 것은 문헌(Brown, Molecular Biology Labfax, Academic Press (1991))을 참조할 수 있으며, 이 문헌도 마찬가지로 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
대장균에서 목적 단백질 기능 발휘·유지를 위해서는 단백분해효소 활성이 손상된 대장균을 숙주 미생물로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적인 사항은 문헌(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 119-128 (1990))을 참조할 수 있다.
또 대장균에서 목적유전자의 고수율의 발현을 위해서는 목적유전자의 서열을 대장균에서 선호되는 코돈으로 최적화시켜 이용할 수도 있다. 이와 관련해서는 문헌(Wada et al., Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992))을 참조할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 미량원소를 포함하여 조제된다.
일반적으로 숙주 미생물은 탄소원, 질소원, 미량원소를 포함하는 배지에서 배양된다.
본 발명의 배지는 탄소원으로, 배지 조제 단계에서 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 포함할 수 있고, 배지 조제 단계에 이를 포함하고 추가로 배양 중에 더 공급할 수 있으며, 배지 조제 단계에서는 포함시키지 않고 배양 중에 이를 공급할 수도 있다.
또 본 발명의 배지는 탄소원으로, 그 조제 단계 및/또는 배양 단계 중에 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 포함하거나 공급하는 이외에 당업계에 공지된 임의의 탄소원을 추가로 그 조제 단계 및/또는 배양 단계 중에 포함할 수 있다.
그러한 탄소원으로서는 바람직하게는 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 예컨대 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 전분, 셀룰로오스 등이 사용할 수 있다. 당밀이나 당 정제 과정의 부산물 등 복합 화합물이 또한 사용될 수 있다. 경우에 따라서 다양한 당 성분을 복합하여 사용하는 것이 유리할 수 있다. 숙주 미생물에 따라서는 대두유, 해바라기유, 땅콩유, 코코넛유, 팔미트산, 스테아르산, 리놀렌산 등의 지방, 메탄올, 에탄올, 폴리알콜 등의 알콜, 아세트산, 젖산 등의 유기산이 탄소원으로서 유리할 수 있다.
이러한 탄소원은 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물이 단독으로 사용되든, 다른 탄소원과 함께 사용되든 그 함량이 1%(w/v) 내지 15%(w/v)로 배지 조제 단계에서 포함되거나 배양 단계 중의 배지가 위 범위의 탄소원 농도를 유지하도록 배양 단계의 중에 공급될 수 있다.
질소원으로서는 통상적으로 무기 질소 화합물, 유기 질소 화합물 또는 이들 화합물들을 포함하는 복합 화합물일 수 있다. 예컨대 무기 질소 화합물로서는 암모니아, 암모늄염(예컨대, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트, 암모늄 니트레이트 등), 니트레이트 등을 들 수 있고, 유기 질소 화합물로서는 우레아, 아미노산 등을 들 수 있으며, 복합 화합물로서는 대두박, 대두 단백질, 효모 추출물, 육즙 등을 들 수 있다. 이러한 질소원은 그 배지에의 함량이 0.01%(w/v) 내지 5%(w/v)의 범위일 수 있다.
미량원소로서는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철, 인, 황 등을 포함하며 이들 미량원소는 염 화합물 형태로 배지에 첨가될 수 있으며, 이들 미량 원소의 배지에서 용해도를 높이고 용액 상태를 유지하기 위해 킬레이트제 예컨대 카테콜, 시트르산 등이 함께 첨가될 수 있다. 미량원소의 경우 0.001%(w/v) 내지 3%(w/v)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.
숙주 미생물의 배양을 위한 배지는 선택적으로 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트, 피리독신 등의 미량의 성장 촉진제를 포함할 수 있다.
배지 조성의 최적화에 대해서는 문헌(Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)을 참조할 수 있으며, 이 문헌 또한 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
배지는 숙주 미생물의 접종 전에 불필요한 미생물의 증식을 방지하기 위하여 멸균하여 사용하는 것이 바람직한데, 배지의 멸균 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 멸균 방법 중 적합한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 고압 증기 멸균, 자외선을 이용한 멸균 방법 등이 적합할 수 있다.
배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 25 내지 37℃이다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 약 6.0~7.0이다. 배지 pH는 배양이 진행되는 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수성 암모니아 등의 염기성 화합물이나, 인산, 황산 등의 산성 화합물을 첨가하여 조절될 수 있다. 배양 중 형성되는 거품의 제거를 위해서 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 첨가될 수 있다. 형질전환된 숙주 미생물만을 안정적으로 증식시키기 위해서 선별 효과를 갖는 적합한 물질, 예컨대 앞서 언급한 바 있는 항생제가 배지에 첨가될 수도 있다.
배양 중 숙주 미생물의 증식 특성에 따라 호기 조건 또는 혐기 조건을 만들어 주는 것이 유리할 수 있다.
배양은 회분식(batchwise), 반-회분식(semi-batchwise), 연속식(continuous culture), 유가식(fed-batch culture)으로 이루어질 수 있다.
배양은 목적하는 바의 생성물의 형성이 최대에 도달할 때까지 지속되는 것이 바람직하다. 이러한 배양 시간은 숙주 미생물에 따라 다르며, 숙주 미생물에 따른 최적의 배양 시간은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 이론적·실험적으로 결정될 수 있다.
숙주 미생물에 따른 적합한 배양법은 전술한 바 이외에도 예컨대 문헌(Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 문헌(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994), 미국세균학회(the American Society for Bacteriology)가 발행한 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C., USA, 1981) 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 방법은 숙주 미생물을 배양한 후에는 그 배양물로부터 메발로네이트를 수득하는 단계를 진행하게 된다.
메발로네이트를 수득하는 단계는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있는데, 예를 들면 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 등의 방법을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 균체를 원심분리를 통해 균체와 상등액을 분리한 후에, 메발로네이트가 존재하는 상등액에 아세톤 등의 용매를 이용하여 추출하고 고순도의 제품을 얻기 위해서는 HPLC 또는 결정화 작업등을 통한 분리정제가 진행될 수 있다. 다른 분리 방법과 관련하여서는 앞서 인용된 바의, 발명의 명칭이 "메발로네이트 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발로네이트 또는 메발로노락톤의 제조방법"인 한국 공개특허 제10-2015-0134512호, 발명의 명칭이 "메발론산의 생산에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 메발론산의 생산 방법"인 한국 공개특허 제10-2015-0006097호, 문헌 [Journal of Biotechnology 140:218.226, 2009], 문헌 [NATURE BIOTECHNOLOGY 21:796-802, 2003], 문헌 [Metabolic Engineering 11:13-19, 2009], 문헌 [Clinical Biochemistry 40:575-584, 2007}, 문헌 [Arch Biochem Biophys. 505(2):131-143, 2011] 등을 참조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 탄소원으로 이용한 메발로네이트의 생합성 방법을 제공할 수 있다. 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 탄소원으로 이용하는 본 발명의 방법은 탄소원으로 글루코오스를 이용할 경우보다 당대 수율이 월등히 높고 , 탄소원으로 일반 글리세롤(상품으로 판매되는 순수 글리세롤)을 이용할 경우보다도 당대 수율이 높은 효과를 가진다.
도 1은 메발로네이트의 생합성 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 메발로네이트 생합성에 사용한 pSTVM_mvaS_atoB의 모식도이다.
도 3 내지 5는 각각 메발로네이트 표준용액, 글리세롤 표준용액 및 발효액의 HPLC 분석 결과이다.
도 6 및 7은 플라스크 수준에서 각각 탄소원으로 순수 글루세롤과 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용하였을 때의 균체량과 메발로네이트의 생성량을 보여주는 결과이다. (결과 도면 확인 바랍니다)
도 8 내지 10은 발효기 수준에서 각각 탄소원으로 글루코오스, 순수 글루세롤 그리고 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용하였을 때의 균체량과 메발로네이트의 생성량을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 탄소원으로 글리세롤을 이용한 메발로네이트 생산
1. 재료 및 실험 방법
1.1 메발로네이트 생성능을 가진 형질전환 숙주 미생물
메발로네이트 생합성과 관련된 mvaE, mvaS, atoB의 유전자가 포함되고 각각 암피실린과 글로람페니콜에 내성 유전자가 포함된 2개의 플라스미드(pUCM_mvaE 및 pSTVM_mvaS_atoB)로 형질전환된 대장균 MG1655 균주를 실험에 사용하였다. mvaE, mvaS 유전자는 발명의 명칭이 "메발로네이트 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발로네이트 또는 메발로노락톤의 제조방법"인 한국 등록특허 제10-1625898호에서 각각 서열번호 7 및 8의 프라이머 서열로 증폭된 유전자(mvaE) 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 서열로 증폭된 유전자(mvaS)이고, atoB 유전자는 KEGG EC:2.3.1.9의 유전자(대장균 MG1655 균주가 가지고 있는 유전자임, http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?eco:b2224+eco:b2844)이며, pUCM_mvaE의 모식도는 위 한국 등록특허 제10-1625898호의 도 3에서 확인할 수 있고, pSTVM_mvaS_atoB의 모식도는 도 2에 개시되어 있다.
1.2 배양 배지 조성 및 배양 조건
본 실험에서 사용된 배지는 SB(Super broth) 배지로 트립톤(Tryprone) 35g/L, 효모추출물(Yeast extract) 20g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 5g/L를 포함하는 이외에 탄소원으로서 글루코오스, 순수 글리세롤 또는 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물(이하 "폐 글리세롤")을 일정 농도로 포함하고 있다. 배지는 각 배지 성분을 혼합한 후 멸균하여 조제하였으며, 폐 글리세롤은 따로 멸균하여 배지 성분으로 사용하였다.
1.3 플라스크 수준에서의 배양
상기 형질전환된 대장균의 단일 클로니를 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 LB 배지(트립톤(Tryprone) 10g/L, 효모추출물(Yeast extract) 5g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 5g/L) 4ml를 함유한 cap tube에 접종하여 30℃에서 12h 동안 배양하였다. cap tube에 배양한 후 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 SB 배지(트립톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L, 순수 글리세롤 또는 폐 글리세롤 20g/L) 70ml를 함유한 500ml 용량의 플라스크에 접종한 후 30℃에서 60h 동안 진탕 배양하였다.
1.3 발효기 수준에서의 배양
상기 형질전환된 각 대장균의 단일 클로니를 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 LB 배지(트립톤(Tryprone) 10g/L, 효모추출물(Yeast extract) 5g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 5g/L) 4ml를 함유한 cap tube에 접종하여 30℃에서 12h 배양하였다. cap tube에 배양한 후 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 SB 배지(트립톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L) 100ml를 함유한 500ml 용량의 플라스크에 접종한 후 30℃에서 4h 동안 진탕배양하였다. 이 후 수득된 배앵액 100ml을 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 SB 배지(트립톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L, 글루코오스나 순수 글리세롤 또는 폐 글리세롤 20g/L) 900ml에 접종한 후 2L 발효기를 이용하여 30℃에서, 900rpm, 50% DO값을 유지시켜 일정 시간 동안 배양하였으며, 30% 암모니아수를 이용해 pH 6.8로 유지하였다. 탄소원인 글루코오스는 배지에서의 농도가 25g/L의 농도, 순수 글리세롤과 폐 글리세롤은 배지에서의 농도가 20g/L의 농도가 되도록 pH Stat 방법(BS Kim et al 2004 bioprocess and biosystems engineering vol26 issue 3 pp147-150)으로 공급하여 유가배양하였다. 폐 글리세롤은 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물의 글리세롤 함량을 정량하여 글리세롤 농도가 20g/L이 되도록 공급하였다.
1.4 균체량 측정
플라스크 및 발효기를 통하여 얻어진 배양액 1ml을 취하고 희석하여 분광광동계를 이용하여 600nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱하여 균체량을 확인하였다.
또한 폐 글리세롤을 이용하였을 때에는 1ml을 취하여 PBS 버퍼(Phosphate bufferd saline)로 3회 Washing 후 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱하여 균체량을 확인하였다.
1.5 HPLC 를 통한 메발로네이트 정량분석
메발로네이트 정량분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석을 시료 준비는 Xiong M. et al의 방법(Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America) vol 111, no.23 pp8357~8362)에 따라 조사하였으며, 분석에 사용한 메발로네이트는 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였다. 메발로네이트 표준용액은 물에 녹여 20g/L 되도록 제조한 후 0.312에서 10g/L의 농도로 6종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량 곡선을 작성하였다. 순수 글리세롤은 대정화금사(한국, 경기도) 제품을 구입하여 사용하였고 폐 글리세롤은 JC 케미칼(한국 울산광역시)로부터 구입하였다. 글리세롤 표준용액은 물에 녹여 30g/L 되도록 제조한 후 0.468에서 30g/L의 농도로 7종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량 곡선을 작성하였다. 형질전환 숙주 미생물의 발효를 통해 글리세롤의 소모량 및 메발로네이트 생합성 여부를 확인하기 위해 발효액을 분석에 활용하였다. 발효액 1ml을 취한 후 원심분리기를 이용하여 균체와 상등액을 분리하고 상등액을 취하여 0.45uL 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다.
HPLC 분석 조건은 아래 표와 같다.
Figure pat00001
2. 실험 결과
2.1 메발로네이트와 글리세롤 표준 곡선
표준용액의 HPLC 분석 결과, 메발로네이트는 16.8분에, 글리세롤은 11.6분에 검출됨을 확인하였으며, 발효액을 분석하였을 때도 같은 결과를 얻었다.
메발로네이트 표준용액, 글리세롤 표준용액 및 발효액의 HPLC 분석 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
2.2 플라스크 배양
500ml 배양 플라스크에서 순수 글리세롤 또는 폐 글리세롤 20g/L를 포함하는 SB 배지 70ml를 이용하여 60h 동안 배양한 결과를 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6 및 도 7에서 왼쪽 그림은 세포의 생장곡선(Cell growth)을 나타낸 것이고, 오른쪽 그림은 배양 시간별 메발론네이트의 농도를 나타낸 것이다.
순수 글리세롤을 사용하였을 때 OD 값이 최대 14.05까지 균체가 성장하였으며, 폐 글리세롤을 사용하였을 때는 최대 16까지 균체가 성장하였다.
메발로네이트 생성량은 순수 글리세롤을 사용하였을 때 배양 시간에 따라 증가하여 최대 8.22g/L의 생성량을 보였고 탄소원 투입량 대비 당대 수율은 41.1%였다. 폐 글리세롤을 사용하였을 때는 최대 8.99g/L의 생성량을 보였고 당대 수율은 44.95%였다. 폐 글리세롤을 사용하였을 때 36시간 배양과 48시간 배양 시 높은 수율을 보였다.
2.3 발효기 배양
2L의 발효기에서 글루코오스 25g/L, 순수 글리세롤 20g/L 또는 폐 글리세롤 20g/L를 포함하여 SB 배지를 이용하여 배양한 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다(도 8: 글루코오스 사용, 도 9: 순수 글리세롤 사용, 도 10: 폐 글리세롤 사용).
글루코오스를 사용하여 80시간 배양하였을 때, 균체 성장은 OD 값이 최대 56.1까지 이루어졌고, 순수 글리세롤을 사용하여 79시간 배양하였을 때 균체 성장은 OD 값이 최대 76까지 이루어졌으며, 폐 글리세롤을 사용하여 67시간 배양하였을 때 균체 성장은 최대 49.7까지 이루어졌다.
메발로네이트 생성은 글루코오스를 사용하였을 때, 생성량 30.48g/L, 당대 수율(탄소원 공급량 대비 메발로네이트 생성 수율)이 9.92%이고, 순수 글리세롤을 사용하였을 때 생성량 62.17.19g/L, 당대 수율 26.1%이며, 폐 글리세롤을 사용하였을 대 생성량 36.62g/L, 당대 수율 26.43%로 나타났다.

Claims (17)

  1. (a) 아세토아세틸 코엔자임 A 합성효소인 AtoB, 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 합성효소인 HMGS 및 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소인 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 제조하는 단계,
    (b) 이 숙주 미생물 배양을 위한 배지를 조제하는 단계,
    (c) 그 배지에 상기 숙주 미생물을 접종하여 배양하는 단계, 및
    (d) 배양물로부터 메발로네이트를 수득하는 단계를 포함하되,
    상기 배지에는 탄소원으로서 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물이, 상기 (b) 단계의 배지 조제 단계 및 상기 (c) 단계의 숙주 미생물의 배양 단계 중 어느 하나 이상의 단계에 공급되는 것을 특징으로 하는, 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터는 AtoB, HMGS 및 HMGR를 모두 발현시킬 수 있는 하나의 발현벡터로 구성되거나, AtoB, HMGS 및 HMGR 중 둘을 발현시키고 나머지 하나를 발현시킬 수 있는 두 개의 발현벡터로 구성되거나, AtoB, HMGS 및 HMGR 각각을 발현시킬 수 있는 세 개의 발현벡터로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터는 mvaE 유전자를 포함하고 상기 HMGS를 암호화하는 유전자를 포함하여 하나의 벡터로 구성되거나, mvaE 유전자를 포함하는 발현벡터와 상기 HMGS를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터 각각으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지 및 바이러스 중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 조절서열이 상기 AtoB, HMGS 및 HMGR를 암호화는 유전자에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 상기 AtoB, HMGS 및 HMGR를 암호화는 유전자가, T7A1, T7A2, T7A3, λpL, λpR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA, rrnB 및 1PL 중에서 선택된 프로모터에 의해서 조절되는 것을 특징을 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 선별마커 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속 세균을 포함하여 살모넬라(Salmonella) 속 세균, 쉬겔라(Shigella) 속 세균, 엔테로박터(Enterobacter) 속 세균, 세라티아(Serratia) 속 세균, 에르위니아(Erwinia) 속 세균, 세라티아(Serratia) 속 세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균, 카울로박터(Caulobacter) 속 세균, 시네코시스티스(Synechocystis) 속 세균(예컨대 시네코시스티스 종 PCC 6803 또는 시네코콕코스 종 PCC 6301), 시네코콕코스(Synechococcus) 속의 세균, 바실러스 속의 세균(예컨대 Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringienesis 등), 락토콕코스(Lactococcus) 속의 세균(예컨대 Lactococcus lactis), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 세균(예컨대 Streptomyces lividans , Streptomyces ambofaciens , Streptomyces fradiae , Streptomyces griseofuscus), 로도콕코스(Rhodococcus) 속 세균(예컨대 Rhodococcus erythropolis), 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균(예컨대 Corynebacterium gluamicum), 및 미코박테리움(Mycobacterium) 속 세균(예컨대 Mycobacterium smegmatis) 중에서 선택된 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 미생물은 피키아 속 효모, 사카로마이세스 속 효모, 한세눌라 속 효모, 클루이베로마이세스 속 효모, 및 스키조사카로마이세스 속 효모 중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 미생물은 대장균이고,
    상기 대장균은 W3110, BL21, BL21(DE3), DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DHIOB/p3, DH1 IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, NovaBlue, DH5α, K12 RV308, K12 C600, K-12, MG1655 및 HB101 중에서 선택된 대장균인 것을 특징을 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 미생물은 대장균이고,
    상기 대장균은 MG1655 균주인 것을 특징을 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 탄소원으로서 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 포함하는 이외에, 다른 탄소원을 추가로 포함하고, 또 질소원과 미량원소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 탄소원을 1%(w/v) 내지 15%(w/v)의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 회분식, 반-회분식, 연속식 또는 유가식으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 메발로네이트의 생성량이 최대에 도달할 때까지 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.



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