KR20180036653A

KR20180036653A - 최적의 암 치료를 위한 Her2 단백질 정량

Info

Publication number: KR20180036653A
Application number: KR1020177037307A
Authority: KR
Inventors: 토드 헴브로우; 방영주; 안은경
Original assignee: 익스프레션 패톨로지, 인크.
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2018-04-09
Also published as: KR102067327B1; AU2016270686B2; EP3304072A4; US20160349259A1; US10208130B2; AU2016270686A1; EP3304072A1; JP6524266B2; IL256000A; WO2016196523A1; JP2018517906A; CN108027360A

Abstract

암을 앓고 있는 환자를 위한 개선된 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 종양이 항-Her 치료제를 포함하는 치료 요법으로의 치료에 반응하는지 여부를 확인한다. 특정 Her2 단편 펩타이드는 암 환자로부터 수득된 암 조직으로부터 수집된 종양 세포에서 직접 SRM-질량 분석법에 의해 정확히 정량화되고, 암 환자가 Her2 단백질을 특이적으로 표적하는 치료제로의 치료에 긍정적으로 반응하는지를 결정하기 위해 참조 기준과 비교된다.

Description

최적의 암 치료를 위한 Her2 단백질 정량

본 출원은, 각각 "최적의 암 치료를 위한 Her2 단백질의 정량"이란 표제의, 2015년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/168,709호 및 2016년 3월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/310,639호의 이익을 주장한다. 이 출원은 또한 종이 복사본과 컴퓨터 판독 가능 형식 (CRF)으로 제공되고, 2016년 5월 31일에 작성된 444 바이트 크기의 "001152_8047_US02_SEQ_LISTING"란 표제의 파일로 구성되며, 이의 전문이 참조로서 포함되는, EFS-web을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다.

환자로부터 종양 조직을 분석하고 항-Her2 치료제에 대한 반응이 유력한 환자를 확인함으로써, 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 종양 조직 중의 Her2 발현 수준은, 전장 Her2 단백질 (Neu 원발암유전자, c-ErbB-2, 티로신 키나제-유형 세포 표면 수용체 (tyrosine kinase-type cell surface receptor) HER2, pl85erbB2 및 CD340라고도 함)의 서브서열로부터 유도된 특정 펩타이드를 정량하고, 이 수준을 참조(reference) 수준과 비교함으로써 결정된다. Her2 발현 수준이 참조 수준보다 높으면, 환자는 적어도 하나의 항-Her2 치료제를 포함하는 요법으로 치료되는 반면, 수준이 참조 수준보다 낮으면, 환자는 항-Her2 치료제를 포함되지 않은 요법으로 치료된다.

특정된 펩타이드는 다중 반응 모니터링 (MRM)이라고도 하고, 본원에서 SRM/MRM 분석이라고 지칭되는, 질량 분석법(mass spectrometry)-기반 선택 반응 모니터링 (SRM)을 사용하여 검출된다. SRM/MRM 분석은 예를 들어, 포르말린 고정 암 조직과 같이 암 환자 조직으로부터 조제된 세포에서 직접적으로 특정된 Her2 단편 펩타이드의 존재를 검출하고 양을 정량적으로 측정하는데 사용된다. 상기 펩타이드의 양은 종양 샘플 중의 손상되지 않은 Her2 단백질의 양을 정량할 수 있게 한다. 특이적이고 최적화된 치료제 및 치료 전략은 Her2 단백질이 암세포에 얼마나 많이 존재하는지에 따라 개별 암 환자의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 환자로부터 수득한 종양 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 특정된 Her2 단편 펩타이드의 수준을 정량하고 질량 분석법을 사용하여 선택 반응 모니터링에 의해 상기 샘플 중의 Her2 펩타이드의 수준을 계산하는 단계;

(b) 상기 Her2 단편 펩타이드의 수준을 참조 수준과 비교하는 단계, 및

(c) Her2 단편 펩타이드의 수준이 상기 참조 수준보다 높을 때, 유효량의 항-Her2 치료제를 포함하는 치료 요법으로 환자를 치료하는 단계, 또는

(d) Her2 단편 펩타이드의 수준이 상기 참조 수준 미만일 때, 유효량의 항-Her2 치료제를 포함하지 않는 치료 요법으로 환자를 치료하는 단계.

상기 참조 수준은 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 약 1825 amol/μg ±250 amol/μg, ±150 amol/μg, ±100 amol/μg, ±50 amol/μg 또는 ±25 amol/μg일 수 있고, 상기 암은 예를 들어, 부인과암, 식도암, 담낭암, 췌장암, 유방암 및 폐암일 수 있다. 유리하게는 상기 암은 위암이다.

상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물은 액체 조직 프로토콜에 의해 제조될 수 있다. 상기 단백질 분해물은, 예를 들어 트립신 분해물과 같은 프로테아제 분해물을 포함할 수 있다.

질량 분석법의 방법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 선택 반응 모니터링 (Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (multiple Selected Reaction Monitoring, mSRM)일 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 상기 특정된 Her2 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유리하게 상기 내부 표준 펩타이드는 동위원소 표지 펩타이드, 예를 들어 ¹⁸O, ¹⁷O, ¹⁵N, ¹³C, ²H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소 (heavy stable isotope)로 표지된다.

특정된 Her2 단편 펩타이드의 측정은 치료에 사용되는 제제에 대한 처치 결정이 생물학적 샘플 중의 다른 펩타이드/단백질과 조합하여 특정된 Her2 단편 펩타이드의 특정 수준에 근거하도록 멀티플렉스 포맷으로 다른 단백질로부터의 다른 펩타이드를 검출 및 정량하는 것과 조합될 수 있다.

상기 기재된 방법에 있어서, 특정된 펩타이드의 수준이 참조 수준보다 높을 경우, 항-Her2 치료제는 트라스트주맙을 포함할 수 있고, 반대로 특정된 펩타이드의 수준이 참조 수준보다 낮을 경우, 치료학적 처치는 항-Her2 치료제인 트라스트주맙을 포함하지 않는다.

도 1은 트라스트주맙과 화학요법제로 치료한 환자의 무진행 생존률과 화학요법제만을 사용한 치료의 비교를 나타낸다. 데이터는 > 1825 amol/μg의 Her2 환자와 < 1825 amol/μg의 Her2 환자를 비교한다.
도 2는 트라스트주맙과 화학요법제로 치료한 환자의 전체 생존률과 화학요법제만을 사용한 치료의 비교를 나타낸다. 데이터는 > 1825 amol/μg의 Her2 환자와 < 1825 amol/μg의 Her2 환자를 비교한다.

암 환자가 Her2 단백질을 특이적으로 표적하는 암 치료제에 대해 유리한 방식으로 임상적으로 반응하는지를 결정하기 위한 정량 방법이 제공된다. 구체적으로, 종양 샘플 또는 환자의 샘플 중의 Her2 단백질을 측정하는 진단 방법이 제공되고, 그 결과 정량 데이터는 그 환자에 대한 후속 치료 결정을 유도하는데 사용된다. 상기 샘플은 유리하게 포르말린 고정되었다. 특정 Her2 펩타이드 단편을 측정하는 SRM/MRM 분석 및 이 펩타이드에 대한 특정 특성을 사용하여, 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직으로부터 유도된 세포 중의 Her2의 양을 결정한다. 이 펩타이드 단편은 전장 Her2 단백질(ICD)의 세포 내 도메인으로부터 유도되고, 서열 ELVSEFSR을 갖는다. 놀랍게도, 이 펩타이드는 종양 조직의 FFPE 샘플로부터 제조 된 분해물에서 신뢰성있게 검출되고 정량될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 미국 특허 제13/993,045에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참고로 인용되었다.

보다 구체적으로, 이 SRM/MRM 분석은, 예를 들어 포르말린 고정 암 환자 조직과 같은 환자 조직 샘플로부터 조제된 세포로 제조된 복합 단백질 용해물 샘플에서 이 펩타이드를 직접 측정할 수 있다. 포르말린-고정 조직으로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기재되어 있고, 이의 전문은 참고로서 본원에 통합된다. 미국 특허 제7,473,532호에 기재된 방법은 Expression Pathology Inc. (Rockville, MD)로부터 입수 가능한 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 용이하게 실시할 수 있다.

암 환자 조직으로부터 가장 넓고 유리하게 이용 가능한 조직 형태는 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직이다. 외과적으로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 지금까지 세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 일반적인 방법이고, 표준 병리학 실시를 위한 관행이다. 포름알데하이드 수용액은 포르말린이라고 지칭된다. "100%" 포르말린은 물 중 포름알데하이드 포화 용액 (부피 기준으로 약 40% 또는 질량 기준 37%)과 소량의 안정제, 보통 산화 및 중합도를 제한하는 메탄올로 구성된다. 조직을 보존하는 가장 흔한 방법은, 일반적으로 10% 중성 완충 포르말린이라고 불리는 수성 포름알데하이드에 전체 조직을 장시간 (8시간에서 48시간) 담근 다음, 고정된 전체 조직을 실온에서 장기간 저장하기 위해 파라핀 왁스에 포매한다. 따라서, 포르말린 고정 암 조직을 분석하기 위한 분자 분석 방법은 암환자 조직 분석을 위한 가장 많이 수용되고 많이 활용되는 방법이 될 것이다.

SRM/MRM 분석 결과는, 조직이 수집되고 보존된 환자의 특정 암 내의 Her2 단백질의 정확하고 정밀한 정량 수준을 연관시키는 데 사용될 수 있다. 이는 암에 대한 진단 정보를 제공할 뿐만 아니라, 의사 또는 다른 의료 전문가가 환자를 위한 적절한 치료법을 안내하는 객관적인 기준을 제공한다. 이러한 경우, 이 분석법을 이용함으로써, 암 조직 중의 Her2 단백질 발현의 특정 수준에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 암 조직을 가지는 환자가 특이적으로 설계된 항암 치료제에 의해 치료에 호의적인 반응을 하는지 여부를 나타내는 기능을 저해 및/또는 Her2 단백질의 존재를 감소시킨다.

항-Her2 치료제로 암 환자를 치료하는 것은 부인과암, 식도암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 폐암 및 위암을 앓고 있는 암 환자를 포함하여, 암 환자의 삶의 성장 및 연장으로부터 암을 예방하기 위한 가장 보편적이고 효과적인 전략 중 하나이다. 부인과암은, 예를 들어 자궁 경부암, 난소암, 자궁암, 질암 및 외음부암을 포함할 수 있다.

Her2 단백질은 상피 세포에서 발현되는 신호 수용체 단백질이며, 일반적으로 Her2 수용체는 건강한 세포의 성장, 분열 및 이의 복구 방법을 제어하는데 도움을 준다. 그러나, 일부 암에서는 암세포가 너무 많은 Her2 수용체 (Her2 단백질 과발현)를 만든다. 이는 세포가 제어되지 않는 방식으로 성장하고 분열하게 한다. 많은 경우, 이 단백질 과발현은 증폭된 Her2 유전자를 동반하여 많은 유전자 복제를 한다 (Her2 유전자 증폭으로 알려짐). 많은 경우, Her2 유전자의 이러한 여분의 복제는 Her2 수용체 (Her2 단백질 과발현)의 증가된 발현을 야기한다. 따라서, Her2 양성으로 간주되는 암을 치료하는데 유용한 몇몇 항-Her2 치료제 때문에, 환자의 암세포에 너무 많은 Her2 단백질이 존재하는지 여부를 임상의가 아는 것은 유용하다.

현재 암 환자가 항-Her2 치료 전략의 후보자인지 여부를 결정하기 위한 2가지 기본 테스트가 있다. 두 가지 테스트 모두 환자의 종양 샘플을 얇은 절편을 사용한다. 첫 번째 테스트인 IHC (면역 조직 화학) 테스트는, 암세포 내 Her2 단백질을 검출하기 위해 항체를 이용하고, 암세포 내 Her2 단백질이 과도하게 존재하는지 여부를 결정한다. IHC 테스트의 결과는 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성-Her2 단백질 과발현)일 수 있다. 두 번째 테스트인 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 테스트는, 암세포 중의 Her2 유전자가 너무 많이 복제되었는지 여부를 측정한다. FISH 테스트의 결과는 양성 (Her2 유전자 증폭) 또는 음성 (Her2 유전자 증폭 없음) 일 수 있다. 이 테스트는 Her2 유전자 증폭이 Her2 단백질의 과발현을 야기하지만, Her2 단백질의 측정을 직접적으로 제공하지 않는 것을 추측한다.

일반적으로, IHC 3+ 테스트 또는 FISH 양성인 암만이 Her2-양성암을 표적으로하는 치료제에 반응할 수 있다. IHC 2+ 테스트 결과는 경계선으로 간주되고, 종양이 IHC 2+이면, 상기 조직은 보다 정확한 Her2 FISH 테스트로 재테스트하게 된다. IHC 및 FISH 테스트 모두 HER2 양성 집단 내의 트라스트주맙 (trastuzumab)에 대한 민감성과 같은, 항-HER2 치료제에 대한 감수성를 예측하는 정량적인 데이터를 제공하지 않는다.

일부 Her2 상태 테스트 결과가 잘못되었을 수 있다는 연구 결과가 있다. 이는 다른 연구소가 양성 및 음성 Her2 상태를 분류하는 데 다른 규칙을 사용하기 때문일 수 있다. 또한, 테스트를 수행하는 각 병리학자는 결과가 긍정적인지 또는 부정적인지를 결정하기 위해 다른 기준을 사용할 수 있다. 대부분의 경우, 이는 결과가 경계선에 있을 때 발생하고, 이는 결과가 강력하게 Her2-양성이거나 Her2-음성이 아님을 의미한다. 다른 경우에 있어서, 종양의 한 영역의 조직은 Her2-양성을 테스트할 수 있고, 종양의 다른 영역의 조직은 Her2-음성을 테스트할 수 있다. 부정확한 Her2 테스트 결과는 암으로 진단받은 환자가 최선의 치료를 받지 못한다는 것을 의미한다. 암의 전부 또는 일부가 Her2-양성이지만 시험 결과가 HER2-음성으로 분류되면, 의사는 환자가 잠재적으로 그러한 약제의 혜택을 누릴 수 있음에도 불구하고, 항-Her2 치료법을 권장하지는 않는다. 암이 Her2-음성이지만 테스트 결과가 Her2-양성으로 분류되면, 의사는 환자가 치료의 혜택을 얻을 가능성이 낮고 약제의 2차적 위험에 노출 되어도 항-Her2 치료법을 권장 할 수 있다.

Her2 유전자 증폭 및/또는 Her2 단백질 과발현의 암을 병리학 보고서에서 Her2-양성이라고 한다. Her2-양성 암은 Her2-음성 암에 비해 빠르게 성장하고 확산 및 재발하는 경향이 있다. 그러나, 치료제는 Her2 단백질 기능에 특이적으로 결합하여, 이를 저해하며, 환자의 종양 테스트가 Her2에 대하여 양성인 경우에 처방된다. 예를 들어, 가장 일반적으로 사용되는 항-Her2 약제는 허셉틴(Herceptin) (화학명: 트라스트주맙)으로, 암세포의 Her2 수용체에 결합하여, 성장 신호를 받는 것을 차단하는 모노클로날 항체이다. 이러한 신호를 차단함으로써, 허셉틴은 암의 성장을 늦추거나 심지어 멈추게 할 수 있다. 허셉틴은 Her2 수용체 차단 이외에, 이것이 결합하는 암세포를 파괴하도록 면역 체계에 경고함으로써 암과 싸우는 것을 도울 수 있다.

진행된 Her2-양성 암을 가진 일부 환자들을 위한 또 다른 항-Her2 치료 옵션은 타이커브(Tykerb) (화학명: 라파티닙)이다. 타이커브는 세포를 성장시키고 비정상적으로 분열시키는 특정 단백질을 방해함으로써 작동한다. 타이커브는 다음과 같은 다른 비-Her2 표적 약제와 같이 사용할 수 있다; 1) Her2-양성 암이 안트라사이클린(anthracycline) 및 탁산(taxane)과 같은 다른 화학요법제, 및 허셉틴에 반응하지 않게 된 진행형 Her2-양성 암을 치료하기 위해 사용되는 화학요법제의 한 종류인 젤노다(Xeloda)(화학명: 카페시타빈), 2) 호르몬- 수용체-양성의 Her2-양성 진행된-단계의 암으로 진단된 폐경 후의 여성을 치료하기 위한 호르몬 요법의 한 종류인 페마라(Femara) (화학명: 레트로졸). 다른 항-Her2 치료제로는, 퍼투주맙 (다른 Her 단백질과의 Her2의 이량체화를 억제하는 항체) 및 네라티닙 (Her2 및 EGFR의 키나아제 활성을 억제하는 키나아제 억제제)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

따라서, 종양, 특히 종양에 있어서의 Her2 단백질의 정량 수준을 정확하게 평가하여 환자가 최적의 치료를 받을 수 있는 가장 큰 기회를 가질 수 있는 능력에 큰 임상적 가치가 있다.

펩타이드의 검출 및 특정된 Her2 단편 펩타이드의 정량 수준의 결정은 SRM/MRM 방법에 의해 질량 분광계에서 결정되며, 이에 의해 각 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크 면적은 액체 조직 용해물 내에 존재하는 복합 펩타이드 혼합물 내에서 결정된다 (전술한 바와 같은 미국 특허 제7,473,532호 참조). Her2 단백질의 정량 수준은 SRM/MRM 방법에 의해 결정되며, 이에 따라 하나의 생물학적 샘플 중의 Her2 단백질로부터 개별 특정된 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크 면적을 개별 특정된 Her2 단편 펩타이드에 대해 공지된 "스파이크된" 내부 표준의 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크 면적과 비교한다.

일 실시 양태에서, 상기 내부 표준은 하나 이상의 중동위 원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 정확히 동일한 Her2 단편 펩타이드의 합성 버전이다. 이러한 동위 원소 표지 내부 표준은 합성되어, 질량 분석법으로 천연 Her2 단편 펩타이드 크로마토그래피 시그너쳐 피크와는 다르며 구별이 가능하고, 비교 피크로 사용될 수 있는 예측 가능하고 일관된 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크를 생성한다. 따라서, 내부 표준이 생물학적 시료로부터의 단백질 또는 펩타이드 제조물에 공지된 양으로 첨가하고, 질량 분석법으로 분석될 때, 천연 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크 면적은 SRM/MRM 시그니처 크로마토그래피 피크 면적에 비교되고, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플로부터의 원래 단백질 제제물에 존재하는 천연 펩타이드의 절대 몰 농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드으에 대한 정량 데이터는 샘플당 분석되는 단백질의 양에 따라 표시된다.

Her2 단편 펩타이드에 대한 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위해, 단순 펩타이드 서열 이상의 부가적인 정보가 질량 분석기에 의해 활용된다. 이러한 부가적인 정보는 질량 분광계 (예: 삼중사극 질량 분광계)가 특정된 Her2 단편 펩타이드의 정확하고 집중된 분석을 수행하게 한다. SRM/MRM 분석을 수행할 때 중요한 고려 사항은 그러한 분석이 삼중사극 질량 분광계에서 효과적으로 수행될 수 있다는 것이다. 이러한 유형의 질량 분광계는 현재 세포 내에 포함된 모든 단백질의 수십만에서 수백만 개의 개별 펩타이드로 구성될 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 중의 단일 단리된 표적 펩타이드를 분석하는데 가장 적합한 장비로 간주될 수 있다. 이러한 부가적인 정보는 삼중사극 질량분광계에 정확한 지시를 제공하여 세포 내에 포함된 모든 단백질의 수십만에서 수백만개의 개별 펩타이드로 이루어지는 굉장히 복잡한 단백질 용해물 내 단일 단리된 표적 펩타이드를 분석할 수 있게 한다.

SRM/MRM 분석은 MALDI, 이온 트랩 또는 삼중사극을 포함하는 모든 유형의 질량 분광계 상에서 개발 및 수행할 수 있지만, 현재 SRM/MRM 분석을 위한 가장 유리한 장치 플랫폼은 종종 삼중사극 장비 플랫폼으로 간주된다. 일반적으로 표적 펩타이드, 특히 특정된 Her2 단편 펩타이드에 대한 부가적인 정보는 각 펩타이드의 하나 이상의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이이온 및 각 전이이온의 이온 유형을 포함할 수 있다. 이 특정된 Her2 단편 펩타이드의 펩타이드 서열 및 이 특정된 Her2 단편 펩타이드에 대한 필요한 부가적인 정보는 표 1에 나타내었다.

서열번호	펩타이드 서열	모노동위원소 질량	전구체 전하 상태	전구체 m/z	전이 m/z	이온형태
서열번호 1	ELVSEFS	967.066	2	483.748	538.261	y4
			2	483.748	625.294	y5
			2	483.748	724.362	y6

Her2 정량에 대한 적절한 참조 수준을 결정하기 위해, 종양 샘플을 암 (예를 들어, 위암)으로 고통받는 환자의 코호트로부터 수득하였다. 종양 샘플은 표준 방법을 사용하여 포르말린 고정시키고, 샘플 중의 Her2 수준을 상기에서 기재한 방법을 사용하여 측정하였다. 또한, 조직 샘플은 당 업계에 잘 공지된 IHC 및 FISH 방법을 사용하여 검사하였다. 코호트 중의 환자는 파클리탁셀(paclitaxel)과 같은 표준 화학요법제과 병용하여 트라스투주맙과 같은 항-Her2 치료제로 치료하였고, 환자의 반응은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 치료 후의 시간 간격으로 환자의 전체 생존율을 기록하는 방법으로 측정하였다. 적합한 참조 수준은, 예를 들어 로그 랭크 테스트의 최저 p 값을 결정하는, 당업계에 잘 알려진 통계 방법을 사용하여 결정할 수 있다.

일단 참조 수준이 결정되면, Her2 발현 수준이 충분히 높기 때문에 치료 요법에 항-Her2 치료제를 포함시켜 효과를 나타낼 가능성이 있는 환자와 Her2 발현 수준이 충분히 낮아 치료 효과가 없을 항-Her2 약제를 사용하지 않는 환자를 확인하는 데 사용할 수 있다. 당업자는 항-Her2 약제가 추가의 약물 또는 약물의 조합을 이용하는 요법의 일부로서 사용되는 것을 인식할 것이다. 비-표적화된 표준 화학요법제로 암을 치료하기 위한 치료 요법은 당업계에 공지되어 있으며, 사용되는 약물에는 플루오로우라실, 사이람자 (라무시루맙), 도세탁셀, 염산 독소루비신, 허셉틴(트라스트주맙) 및 미토마이신 C가 포함될 수 있다. 위암에 사용되는 약물 조합은 FU-LV (플루오로우라실 + 류코보린), TPF (도세탁셀, 시스플라틴 및 플루오로우라실) 및 XELIRI (카페시타빈 + 이노테리칸 염산염)가 포함된다. 이러한 약물 중 하나 이상은 개별적으로 사용될 수 있으며, 역사적으로 어떠한 단일 약물도 다른 약물에 비해 우수한 반응을 나타내지 않는 매우 유사한 결과와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 이 전체 약물 군은 특정 종양 단백질(들)을 표적하지 않으므로 표준 화학요법제로 간주되며, 치료 및 결과와 관련하여 상당히 상호성이 있다. 그러나, 역사적으로 위암 환자와 일반 암 환자를 한 가지 이상의 이들 표준 화학요법제로 치료하는 것은, 환자를 표준 화학요법제로 치료하지 않는 것과 비교할 때, 무진행(Progression Free) 생존률 (PFS) 및 전체 생존률 (OS)에 있어서 현저한 개선 효과를 나타내었다.

환자 샘플 중의 SRM에 의해 결정된 Her2의 수준은 다른 단위를 사용할 수 있지만 일반적으로 amol/μg 단위로 표시된다. 당업자는 참조 수준이 중심값 주변의 값, 예를 들어 ± 250, 150, 100, 50 또는 25 amol/μg로 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하기 상세히 기재된 구체예에서, 적절한 참조 수준은 1825 amol/μg 인 것으로 밝혀졌지만, 당업자는 임상 결과 및 경험에 기초하여 이보다 높거나 낮은 수준을 선택할 수 있음을 인식할 것이다. 부인과암, 식도암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 폐암 및 위암과 같은 많은 암에서 약 2000 amol/μg 이상 (선택적으로 2000 ± 250, 150, 100, 50 또는 25 amol/μg)은 트라스트주맙-포함 치료 요법에 대한 반응을 예측한다.

HER2 양성 위암 집단에서의 트라스트주맙 감수성에 대한 HER2 단백질 발현 수준의 예측치의 개발을 입증하는 실험 데이터.

환자

서울 대학교 병원의 총 249명의 환자가 조직학적으로 재발 또는 전이성 위암으로 확진되었다. 포르말린-고정, 파라핀-포매된 (FFPE) 생검을 치료 전에 수집하고, Her2를 면역조직화학 (IHC) 및/또는 FISH로 분석하였다. IHC 및/또는 FISH에 의해 Her2 +로 판명된 총 153명의 환자가 이 연구에 사용되었다. 트라스트주맙과 표준 화학요법제 (코호트 1)을 병용 투여한 총 95명의 환자를 분석하여 생존률 분석에 사용하였고, 표준 화학요법제 (코호트 2)만을 사용한 58명의 환자의 대조군을 분석하여 생존률 분석에 사용하였다.

방법

본 연구에서 모든 153명의 환자의 FFPE 종양 조직을 미세 절개하여 종양 세포를 수집하고, 전술한 바와 같은 액체 조직 시약을 사용하여 하류 질량 분석을 위해 가용화시켰다. Her2 단백질 수준은 모든 환자에서 선택 반응 모니터링 방법 (SRM)에 의해 질량 분광법을 사용하여 정량되었다. Kaplan-Meier 방법으로 Her2 단백질 수준의 함수로서 환자 집단의 무진행 생존룰 (PFS)과 전체 생존률 (OS)을 예측하였. Her2 단백질 수준과 치료 그룹 (화학요법제과 트라스트주맙 또는 화학요법제 단독) 간의 상호 작용 항을 포함하는 Cox 회귀 모델을 피팅하여 Her2가 비교에 미치는 영향을 평가했다. 트라스트주맙 감수성을 예측하기 위한 Her2 SRM의 최적 컷오프는 로그 랭크 테스트의 가장 낮은 p 값에 의해 결정되었다.

결과

트라스트주맙과 표준 화학요법제을 병용 투여 한 코호트 1의 환자 95명에 대한 조직학적 특성을 표 2에 나타내었다.

달리 명시되지 않는 한 데이터는 N (%)로 표시된다.

약어: Tmab, 트라스트주맙; ECOG, 동부 협동 종양군; GEJ, 위식도 접합부; PCC, 불량 응집성 암종; OS, 전체 생존률; HR, 위험 비율

† 인장 반지 특성 포함: 순수 인장 반지 세포 암 (즉, 응집력이 약한 암종) 또는 인장 반지 특성이 포함된 선암종.

각각의 환자 종양에 대한 Her2 수준을 결정하였으며, 얻어진 Kaplan-Meier 곡선은, 로그 랭크 테스트의 최저 P 값으로 결정시, Her2 수준이 1825 amol/μg의 컷오프보다 높았던 (> 1825 amol/μg) 환자에서 트라스트주맙 + 화학요법제로의 치료에 대한 현저한 효과를 입증한다. 도 1에 나타난 바와 같이, > 1825 amol/μg의 코호트 1 환자와 < 1825 amol/μg의 코호트 1 환자 간의 비교는, > 1825 amol/μg의 코호트 1은 PFS = 10.6개월이고, < 1825 amol/μg의 코호트 1은 PFS = 7개월로서 PFS에 있어서 유의한 차이를 나타낸다. 통계 분석은 p 값 = 0.0200으로 통계적으로 유의한 결과를 나타낸다.

도 1은 또한 > 1825 amol/μg의 코호트 1이, 표준 화학요법제만 투여된 코호트 2와 비교할 때, 트라스트주맙 + 화학요법제로의 치료로부터 훨씬 더 유의한 효과를 실현하는 것을 나타낸다. > 1825 amol/μg의 코호트 1 환자는 PFS = 10.6개월인 반면, 코호트 2의 환자는 PFS = 6개월이었다. 통계 분석 결과는 p 값 = 0.0020으로 통계적으로 유의미한 결과를 나타낸다.

도 1은 또한 코호트 1 환자 < 1825 amol/μg (트라스트주맙 + 화학요법제)와 코호트 2 환자 (화학요법제 단독) 간의 비교를 나타낸다. 상기 비교는 코호트 2 환자 < 1825 amol/μg는 PFS = 7개월을 나타냈고, 코호트 1 환자는 PFS = 6개월을 나타내 매우 유사한 PFS를 나타냈다. 로그 랭크 테스트에 의한 통계 분석은 이러한 비교에 대해 P 값 = 0.500을 나타내며, 환자의 Her2 값이 < 1825 amol/μg인 경우 Her2+ 환자를 항-Her2 트라스트주맙으로 치료하는 것이 표준 화학요법제 단독에 비해 유의한 효과가 없다는 것을 나타낸다.

> 1825 amol/μg의 코호트 1 환자에서 트라스트주맙 치료 효과를 나타내는 유사한 결과가 동일 통계 분석 하에서 전체 생존률(OS)로 실현되었다. Kaplan-Meier 곡선은, 로그 랭크 테스트의 최저 P 값으로 결정시, Her2 수준이 1825 amol/μg의 컷오프보다 높았던 (> 1825 amol/μg) 환자에서 트라스트주맙 + 화학요법제로의 OS의 치료에 대한 현저한 효과를 입증한다. 도 2에 나타난 바와 같이, > 1825 amol/μg의 코호트 1 환자와 < 1825 amol/μg의 코호트 1 환자 간의 비교는, > 1825 amol/μg의 코호트 1은 OS = 35개월이고, < 1825 amol/μg의 코호트 1은 PFS = 17.5개월로서 PFS에 유의한 차이를 나타낸다. 통계 분석은 p 값 = 0.0110으로 통계적으로 유의한 결과를 나타낸다.

도 2는 또한 코호트 1 > 1825 amol/μg이 표준 화학요법제 단독을 받는 코호트 2와 비교할 때, 트라스트주맙 + 화학요법제로 치료로부터 훨씬 더 유의한 효과를 실현하는 것을 나타낸다. 코호트 1 > 1825 amol/μg의 환자는 OS = 35개월인 반면, 코호트 2의 환자는 OS = 11.9개월을 나타냈다. 통계 분석은 p 값 = 0.0006으로 통계적으로 유의한 결과를 나타낸다.

도 2는 또한 < 1825 amol/μg (트라스트주맙 + 화학요법제)의 코호트 1 환자와 코호트 2 환자 (화학요법제 단독) 간의 비교를 나타낸다. 상기 비교는 < 1825 amol/μg의 코호트 2 환자는 OS = 17.5개월을 나타냈고, 코호트 1 환자는 PFS = 11.9개월을 나타내 유사한 PFS를 나타냈다. 로그 랭크 테스트에 의한 통계 분석은 이러한 비교에 대해 P 값 = 0.331을 나타내며, < 1825 amol/μg의 Her2 값을 나타내는 Her2+ 환자를 항-Her2 트라스트주맙 + 화학요법제로 치료하는 것이 표준 화학요법제 단독에 비해 유의한 효과가 없다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> EXPRESSION PATHOLOGY, INC. <120> QUANTIFYING HER2 PROTEIN FOR OPTIMAL CANCER THERAPY <130> IPA171339-US <150> US 62/168,709 <151> 2015-05-29 <150> US 62/310,639 <151> 2016-03-18 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg 1 5

Claims

암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
(a) 환자로부터 수득한 종양 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 특정된 Her2 단편 펩타이드의 수준을 정량하고 질량 분석법을 사용하여 선택 반응 모니터링에 의해 상기 샘플 중의 Her2 펩타이드의 수준을 계산하는 단계;
(b) 상기 Her2 단편 펩타이드의 수준을 참조 수준과 비교하는 단계, 및
(c) Her2 단편 펩타이드의 수준이 상기 참조 수준보다 높을 때, 유효량의 항-Her2 치료제를 포함하는 치료 요법으로 상기 환자를 치료하는 단계, 또는
(d) Her2 단편 펩타이드의 수준이 상기 참조 수준 미만일 때, 유효량의 항-Her2 치료제를 포함하지 않는 치료 요법으로 환자를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 약 1825 amol/μg ±250 amol/μg, ±150 amol/μg, ±100 amol/μg, ±50 amol/μg 또는 ±25 amol/μg이고, 상기 암이 부인과암, 식도암, 담낭암, 췌장암, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 1825 amol/μg ±250 amol/μg이고, 상기 암이 위암인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 1825 amol/μg ±150 amol/μg이고, 상기 암이 위암인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 1825 amol/μg ±100 amol/μg이고, 상기 암이 위암인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 1825 amol/μg ±50 amol/μg이고, 상기 암이 위암인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 수준이 분석되는 생물학적 샘플 단백질의 1825 amol/μg ±25 amol/μg이고, 상기 암이 위암인 것인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물이 액체 조직 프로토콜 (Liquid Tissue protocol)에 의해 제조되는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물을 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 트립신 분해물을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 사용되는 질량 분석법 모드가 선택 반응 모니터링 (Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (multiple Selected Reaction Monitoring, mSRM)인 것인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정된 Her2 펩타이드가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
제1항 내지 제13항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 샘플이 세포, 세포 집합체 또는 고형 조직인 것인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 종양 샘플이 포르말린 고정 고형 조직인 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 조직이 파라핀 포매된 조직인 것인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정된 Her2 단편 펩타이드를 정량하는 단계가, 상기 샘플 중의 Her2 펩타이드의 양을 공지된 양의 스파이크 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 결정하는 단계를 포함하고, 생물학적 샘플 중의 천연 펩타이드 및 내부 표준 펩타이드가 모두 서열번호 1에 나타난 바와 같은 Her2 단편 펩타이드의 동일한 아미노산 서열에 대응하는 것인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소 표지 펩타이드인 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드가 ¹⁸O, ¹⁷O, ¹⁵N, ¹³C, ²H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소 (heavy stable isotope)를 포함하는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 치료에 사용되는 제제에 대한 처치 결정이 생물학적 샘플 중의 다른 펩타이드/단백질과 조합하여 특정된 Her2 단편 펩타이드의 특정 수준에 근거하도록 특정된 Her2 단편 펩타이드를 검출 및 정량하는 단계가 멀티플렉스로 다른 단백질로부터의 다른 펩타이드를 검출 및 정량하는 단계와 조합될 수 있는 것인, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정된 펩타이드의 상기 수준이 상기 참조 수준보다 높은 경우, 상기 항-Her2 치료제가 트라스트주맙 (trastuzumab)을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정된 펩타이드의 상기 수준이 상기 참조 수준보다 낮은 경우, 치료학적 처치는 상기 항-Her2 치료제인 트라스트주맙을 포함하지 않는 것인, 방법.