KR20180030549A - 전립선 질병을 위한 바이오마커 조합 - Google Patents

전립선 질병을 위한 바이오마커 조합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전립선 질병의 진단, 및 전립선 질병의 검출에 사용될 수 있는 생물학적 샘플에서의 바이오마커의 동정에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 전립선 암과 전립선 질병의 비-암성 형태, 예컨대, 양성 전립선 비대증을 구별하는 진단 방법에서 다른 바이오마커와 조합한 바이오마커 글리시판-1(GPC-1)의 용도에 관한 것이다.

Description

전립선 질병을 위한 바이오마커 조합
본 발명은 일반적으로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 전립선 질병의 진단, 및 전립선 질병의 검출에 사용될 수 있는 생물학적 샘플에서의 바이오마커의 동정에 관한 것이다.
전립선 암은 가장 자주 진단되는 내장 암이며, 남성의 암 사망 원인 중 두번째이다. 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 SEER 프로그램과 질병 통제 센터(CDC)의 전국 건강 통계 센터에 따르면, 2014년에 전립선 암 23만 3천건이 발병하여(모든 새로운 암 발생 건수의 14%), 29,480명이 사망했다(모든 암 사망률의 5%). (SEER Cancer Statistics Factsheets: Prostate Cancer. National Cancer Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/statfacts/html/prost.html 참조).
전립선 암에 대한 일반적으로 사용되는 선별 검사에는 디지털 직장 검사(DRE) 및 혈액내 전립선 특이 항원(PSA) 검출이 포함된다. DRE는 침습적이고 부정확하며, PSA 분석 결과의 위음성(즉, 암은 검출되지 않음) 및 위양성(즉, 암이 존재하지 않는 암의 표시)의 유병률이 잘 문서화되어있다. 예를 들어, 권장된 4.0ng/ml 컷오프에서 진행된 표준 PSA 검사는 암 환자에게 86% 민감하지만 33%만이 특이적이며, 비-암 환자의 약 67%에서 위양성을 유발한다(Hoffman et al. BMC Fam Pract. 2002, 3:19). 전립선 암에 대한 PSA의 진단적 가치는 양성 및 암성 질환 사이의 특이성이 결여되어 제한적이다. 양성 전립선 비대증(BPH)과 전립선 염(25-86%) 환자의 대부분(Gao et al., 1997, Prostate 31: 264-281)뿐만 아니라 다른 비 악성 질환에서 PSA의 높은 수준이 검출될 수 있으며, 이는 이 마커의 진단적 특이성을 상당히 제한한다. 예를 들어, BPH에서는 혈청 PSA가 4에서 10 ng/ml로 증가하며, 전립선 염, 특히 급성 전립선 염에서는 더 높은 수치가 관찰된다.
DRE 또는 PSA 스크리닝으로 양성 진단을 받은 경우, 확진 진단 검사에는 경직장 초음파, 생검 및 경직장 자기 공명 화상법(MRI) 생검이 포함된다. 이러한 기술은 침습적이며, 검사중인 대상에게 큰 불편을 야기한다.
전립선 질병을 진단하기 위한 편리하고 신뢰할 수 있으며, 정확한 검사가 필요하다. 바람직하게는, 상기 검사는 전립선 암과 전립선 질병의 비-암성 형태(예를 들어, 양성 전립선 비대증(BPH))를 구별할 수 있는 능력을 가질 수 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 전립선 질병의 검출에 효과적인 바이오마커의 조합을 확인하였다. 특히, 바이오마커 조합은 암성 및 비-암성 전립선 질병 형태를 구별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 전립선 질병의 검출을 위해 이들을 사용하는 바이오마커 조합 및 분석에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 적어도 이하의 일련의 번호 부여된 구현예에 관한 것으로서, 구현예 1에 대한 참조는 아래에 번호 부여된 구현예 1a, 1b 및 1c 각각을 포함한다:
구현예 1a: 대상이 전립선 암(CaP)으로부터 양성 전립선 비대증(BPH)이 있는지 여부를 측정하는 방법으로서,
(a) BPH를 갖는 대상 집단 및 CaP를 갖는 대상 집단으로부터 얻은 일련의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하여, 시리즈의 각각의 상기 생물학적 샘플에서 상기 피분석물 각각에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계;
BPH 샘플과 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 단계; 및
상기 조합된 피분석물 수준들로부터 문턱값(threshold value)을 선택하고, 상기 샘플 내의 BPH와 CaP를 구별하기 위한 기준으로 상기 문턱값을 사용하는 단계
에 의해, BPH와 전립선 암(CaP)을 구별하기 위한 문턱값을 생성하는 단계; 및
(b) 대상의 생물학적 샘플에서 상기 적어도 2개의 피분석물을 검출함으로써 대상의 생물학적 샘플에서 각각의 상기 피분석물에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계; 및
(c) 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 얻어진 개별 또는 조합된 피분석물 수준에 적절한 알고리즘 및/또는 변형을 적용하여, 문턱값과의 비교를 위한 환자 피분석물 값을 생성하는 단계; 및
(d) 환자 피분석물 값과 문턱값의 비교에 의해 대상이 BPH 또는 CaP를 갖는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하며,
상기 적어도 2개의 피분석물은 글리피칸-1(GPC-1)을 포함하고, 이하의 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택된다:
GPC-1 및 간세포 성장 인자(HGF);
GPC-1 및 표피 성장 인자(EGF);
GPC-1 및 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1);
GPC-1 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF);
GPC-1 및 인간 인터루킨 18(HuIL-18);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 AB.BB(PDGFAB.BB);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 BB(PDGFBB);
GPC-1 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
GPC-1 및 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(HuGM-CSF);
GPC-1 및 인터페론 감마(IFNγ); 및
GPC-1 및 폴리스타틴(follistatin).
구현예 1b: 대상이 양성 전립선 비대증(BPH) 또는 전립선 암(CaP)인지 여부를 결정하는 방법으로서,
(a) BPH를 갖는 대상 집단 및 CaP를 갖는 대상 집단으로부터 얻은 일련의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하여, 시리즈의 각각의 상기 생물학적 샘플에서 상기 피분석물 각각에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계;
BPH 샘플과 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 단계; 및
상기 조합된 피분석물 수준들로부터 문턱값을 선택하고, 상기 샘플 내의 BPH와 CaP를 구별하기 위한 기준으로 상기 문턱값을 사용하는 단계
에 의해, BPH와 전립선 암(CaP)을 구별하기 위한 문턱값을 생성하는 단계; 및
(b) 대상의 생물학적 샘플에서 상기 적어도 2개의 피분석물을 검출함으로써 대상의 생물학적 샘플에서 각각의 상기 피분석물에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계; 및
(c) 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 얻어진 개별 또는 조합된 피분석물 수준에 적절한 알고리즘 및/또는 변형을 적용하여, 문턱값과의 비교를 위한 환자 피분석물 값을 생성하는 단계; 및
(d) 환자 피분석물 값과 문턱값의 비교에 의해 대상이 BPH 또는 CaP를 갖는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하며,
상기 적어도 2개의 피분석물은 글리피칸-1(GPC-1)을 포함하고 다음의 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1 및 간세포 성장 인자(HGF);
GPC-1 및 표피 성장 인자(EGF);
GPC-1 및 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1);
GPC-1 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF);
GPC-1 및 인간 인터루킨 18(HuIL-18);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 AB.BB(PDGFAB.BB);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 BB(PDGFBB);
GPC-1 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
GPC-1 및 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(HuGM-CSF);
GPC-1 및 인터페론 감마(IFNγ); 및
GPC-1 및 폴리스타틴.
구현예 1c: 양성 전립선 비대증(BPH)과 전립선 암(CaP)을 구별하는데 사용하기 위한 문턱값을 생성하는 방법으로서,
(a) BPH를 갖는 것으로 알려진 대상 집단 및 CaP를 갖는 것으로 알려진 대상 집단으로부터 얻은 일련의 생물학적 샘플 중 적어도 2개의 피분석물을 검출함으로써, 상기 각각의 생물학적 샘플에서의 상기 피분석물 각각에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계;
(b) BPH 및 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 단계; 및
(c) BPH와 CaP를 구별하기 위한 근거의 역할을 하는 상기 피분석물 수준들로부터 문턱값을 선택하는 단계를 포함하며;
상기 적어도 2개의 피분석물은 글리피칸-1(GPC-1)을 포함하고, 이하의 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1 및 간세포 성장 인자(HGF);
GPC-1 및 표피 성장 인자(EGF);
GPC-1 및 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1);
GPC-1 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF);
GPC-1 및 인간 인터루킨 18(HuIL-18);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 AB.BB(PDGFAB.BB);
GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 BB(PDGFBB);
GPC-1 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
GPC-1 및 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(HuGM-CSF);
GPC-1 및 인터페론 감마(IFNγ); 및
GPC-1 및 폴리스타틴.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 적어도 2개의 피분석물이 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1, HGF 및 PAI-1;
GPC-1, HGF 및 인간 섬유아세포 성장 인자 베타(HuFGFb);
GPC-1, HGF 및 EGF;
GPC-1, HGF 및 PDGFBB;
GPC-1, HGF 및 폴리스타틴;
GPC-1, HGF 및 G-CSF;
GPC-1, HGF 및 인간 인터루킨 8(HuIL-8);
GPC-1, HGF 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
GPC-1, HGF 및 인간 피부 T-세포 유인 사이토카인(CTACK - C-C 모티프 리간드 27 또는 CCL27로도 알려져 있음);
GPC-1, HGF 및 PDGFAB.BB;
GPC-1, HGF 및 IFNγ;
GPC-1, HGF 및 인간 단핵구 주화성 및 활성화 인자(HuMCP1/MCAF);
GPC-1, HGF 및 HuIL-18;
GPC-1, HGF, HuGM-CSF; GPC-1, HGF 및 유로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA);
GPC-1, HGF 및 인간 흑색종 성장 촉진 활성 알파(HuGROa, CXC 모티프 리간드 1, CXCL1로도 알려져 있음);
GPC-1, HGF 및 가용성 혈관 내피 성장 인자 수용체(sVEGFR);
GPC-1, EGF 및 폴리스타틴;
GPC-1, EGF 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα); 및
GPC-1, G-CSF 및 면역글로불린 유사 및 EGF-유사 도메인 2를 갖는 가용성 티로신 키나아제(sTIE2).
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 단계는 조합된 피분석물 수준의 하위집합을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, BPH 샘플과 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 상기 단계는 이하의 식에 따라 BPH 및 CaP 샘플 구별을 최대화하는 방식으로 이들 피분석물 수준의 가중 선형 합을 조합하는 단계를 포함하는 방법:
S = w1A1 + w2A2 ... wnAn
(상기 식에서, S는 가중 합이며,
w는 최종 피분석물 가중치이며,
A는 n개의 다른 피분석물에서 주어진 피분석물의 수준이거나, 주어진 피분석물 수준을 피분석물 값의 비율 또는 숫자로 변환한 것이다.)
구현예 5. 구현예 4에 있어서, 주어진 피분석물의 수준의 상기 변환이 지수 함수, 힘 함수 및/또는 근 함수의 사용을 수치적으로 포함하는, 방법.
구현예 6. 구현예 4 또는 5에 있어서, 최종 피분석물 가중치(w)를 얻는 단계는 1로 설정되거나 이하 식에 따라 생성된 초기 피분석물 가중치(W)를 생성하는 단계를 포함하며:
W = 최대 (M)/M,
(상기 식에서, W={w1, ... wn} 및 M = {중앙값(A1), ... 중앙값(An)}임);
상기 최대(M)는 얻어진 피분석물 수준의 최대 중앙값이고, M은 각각의 상기 피분석물에 대해 얻어진 중앙 피분석물 수준을 포함하는 벡터인, 방법.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, 각각의 상기 최종 중량은 일련의 생물학적 샘플에서 BPH와 CaP를 구별하는 최적화를 위한 판별 함수를 사용하여 결정되는, 방법.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, 상기 판별 함수는 :
(i) ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적;
(ii) 진양성률(True Positive Rates, TPR)과 진음성률(True Negative Rates, TNR)의 조합;
(iii) 제한된 특이도 범위 내에서 ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적;
(iv) 제한된 민감도 범위 내에서 ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적
중 임의의 하나 이상인, 방법.
구현예 9. 구현예 7 또는 8에 있어서, 최적화를 위한 판별 함수는 넬더-미드(Nelder-Mead)(단체법), 확률적 방법, 구배 하강법, 확률적 구배 하강법, 유전 알고리즘, 입자 군집(particle-swarm) 방법, 및/또는 억지접근(brute force) 방법 중 임의의 하나 이상인, 방법.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 대상의 생물학적 샘플로부터 수득된 개별 또는 조합된 피분석물 수준에 적용되는 적합한 알고리즘 및/또는 변환이 하기 식에 따른, 방법:
S = w1A1 + w2A2 ... wnAn
(상기 식에서, S는 가중 합이며,
w는 최종 피분석물 가중치이며,
A는 n개의 다른 피분석물에서 주어진 피분석물의 수준이거나, 주어진 피분석물 수준을 피분석물 값의 비율 또는 숫자로 변환한 것이다.)
구현예 11: 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 피분석물 수준들을 조합하는 상기 단계가 BPH와 CaP 샘플들 사이의 구별을 최대화하는, 방법.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 하기의 방식으로 선택하는 단계를 포함하는, 방법:
(i) BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식; 및/또는
(ii) BPH와 CaP를 구별할 때 민감도를 증가시키는 방식; 및/또는
(iii) BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 적합한 진양성률 및/또는 진음성률을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 14. 구현예 12 또는 13에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수치로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 오 분류 비율을 최소화하는, 방법.
구현예 15. 구현예 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 단계는 진양성률이 진음성률과 교차하는 지점을 확인함으로써, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 최소화하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 16. 구현예 12에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 민감도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는, 가중합 넬더-미드(Nelder-Mead) 최적화 절차를 사용하여, ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 부분면적(pAUC)을 최적화하는 단계를 포함하며, 상기 pAUC는 0과 특정 값(e)(예를 들어, 0.5) 사이의 제한된(1-감도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내는, 방법.
구현예 17. 구현예 12 또는 16에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는 민감도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 상기 민감도를 최대화하는, 방법.
구현예 18. 구현예 12 또는 16에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 상기 특이도를 최대화하는, 방법.
구현예 19. 구현예 12 또는 18에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 단계는 가중합 넬더-미드(Nelder-Mead) 최적화 절차를 사용하여, ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 부분면적(pAUC)을 최적화하는 단계를 포함하며, 상기 pAUC는 0과 특정 값(e)(예를 들어, 0.5) 사이의 제한된(1-감도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내는, 방법.
구현예 20. 구현예 12, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나에 있어서, 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1/EGF/폴리스타틴; 및
GPC-1/EGF/TNFα.
구현예 21. 구현예 12, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 하나에 있어서, 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1/HGF;
GPC-1/HGF/PAI-1;
GPC-1/HGF/HuFGFb;
GPC-1/HGF/EGF;
GPC-1/HGF/HuPDFGBB;
GPC-1/EGF;
GPC-1/PAI-1;
GPC-1/G-CSF; 및
GPC-1/PDGFAB.BB.
구현예 22. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
GPC-1/HGF;
GPC-1/PAI-1;
GPC-1/G-CSF;
GPC-1/EGF;
GPC-1/PDGFAB.BB;
GPC-1/HGF/FGFb;
GPC-1/HGF/PAI-1;
GPC-1/HGF/EGF;
GPC-1/HGF/폴리스타틴; 및
GPC-1/HGF/G-CSF.
구현예 23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 대상이 전립선 질병의 양성 지표를 이전에 얻은, 방법.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 대상이 디지털 직장 검사(DRE) 및/또는 PSA 검사에 의해 전립선 질병의 양성 지표를 이전에 얻은, 방법.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 단계는:
(i) 각각의 상기 피분석물 수준을 나타내는 하나 이상의 형광 신호를 측정하는 단계;
(ii) 샘플내 상기 피분석물의 중량/부피의 측정치를 얻는 단계;
(iii) 각각의 상기 피분석물 수준을 나타내는 흡광도 신호를 측정하는 단계; 또는
(iv) 질량 분광법, 단백질 어레이 기술, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동, 방사선표지 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및 대상의 생물학적 샘플에서 피분석물 수준을 얻는 상기 단계는 각각의 상기 샘플을 제1 및 제2 항체 집단과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 각각의 항체 집단은 상기 피분석물 중 하나에 대한 결합 특이도를 가지며, 제1 및 제2 항체 집단은 상이한 결합 특이도를 갖는, 방법.
구현예 27. 구현예 26에 있어서, 제1 항체 및/또는 제2 항체 집단이 표지되는, 방법.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 상기 표지가 방사선표지, 형광 표지, 비오틴-아비딘 증폭 시스템, 화학발광 시스템, 마이크로스피어 및 콜로이드성 금으로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
구현예 29. 구현예 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 각 항체 집단과 피분석물의 결합이 면역형광법, 방사선표지, 면역블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 유세포 분석법, 면역침강법, 면역조직화학, 바이오필름 검사, 친화도 링 검사, 항체 배열 광학 밀도 검사, 화학발광법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 검출되는, 방법.
구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및 대상의 생물학적 샘플이 각각 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 눈물, 소변, 또는 조직인, 방법.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 환자, BPH를 갖는 상기 대상 집단 및 CaP를 갖는 상기 대상 집단이 인간인, 방법.
구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및/또는 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 상기 단계는 피분석물을 직접 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및/또는 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 상기 단계는 피분석물을 코딩하는 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 상기 단계는 시험관내 또는 생체외에서 수행되는, 방법.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 참고문헌을 포함한다. 예를 들어, "항체"라는 문구는 또한 다중 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 "포함"을 의미한다. "포함하는"이라는 단어의 변형은 "포함하다" 및 "포함한다"와 같이 대응하는 의미가 다양하다. 따라서, 예를 들어, 피분석물 A 및 피분석물 B를 "포함하는" 바이오마커 조합은 피분석물 A 및 피분석물 B로만 구성될 수 있거나, 하나 이상의 추가 성분(예를 들어, 피분석물 C)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전립선 질병"은 양성 전립선 비대증(BPH), 전립선 상피내 종양, 전립선 염, 전립선 암, 전립선 선암종, 전립선 평활근육종 및 전립선 횡문근육종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 전립선 질병을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플" 및 "샘플"은 타액 샘플, 눈물 샘플, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플 또는 그의 하위 분류를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 대상으로부터 채취한 임의의 체액 또는 조직을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "진단하는" 및 "진단"은 당업자가 대상이 주어진 질병 또는 질환에 걸려 있는지 여부를 평가하고, 심지어 결정할 수 있는 방법을 지칭한다. 진단은 예를 들어, 본원에 기술된 바이오마커 또는 바이오마커의 조합의 검출과 같은 하나 이상의 진단 지표에 기초하여 이루어질 수 있으며, 이의 수준은 질환의 존재, 중증도, 또는 부재의 지표가 된다. 따라서, 상기 "진단하는" 및 "진단"이라는 용어에는 전립선 암 발병 위험도를 확인하는 것도 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상" 및 "환자"는 다르게 명시되지 않는 한, 상호교환적으로 사용되며, 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하는 경제적, 사회적 또는 연구의 중요성이 있는 임의의 동물을 포함한다. 따라서, "대상"은 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물과 같은 포유동물일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 분자(예를 들어, 항체)와 관련하여 용어 "분리된(isolated)"은 그것이 자연적으로 발생하는 성분의 적어도 일부가 없는 생물학적 분자이다.
본원에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgM 및 IgY, 단일-쇄 전 항체를 포함하는 전 항체들, 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 항체 단편은 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 항체, 디설파이드-결합된 Fvs(sdFv), 및 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체는 임의의 동물 기원 또는 적당한 생산 숙주로부터 유래될 수 있다. 단일-쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로, 또는 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분과 조합하여 포함할 수 있다. 또한 가변 영역(들) 및 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 포함된다. 항체는 생물학적 분자에 특이적으로 결합하는 단클론성, 다클론성, 키메라, 다중특이성, 인간화 또는 인간 단클론 항체 및 다클론 항체일 수 있다. 항체는 이중-특이적 항체, 아비바디(avibody), 디아바디(diabody), 트리바디, 테트라바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, VHH 도메인, 인간 항체, 완전 인간화 항체, 부분 인간화 항체, 안티칼린(anticalin), 아드넥틴(adnectin) 또는 어피바디(affibody)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체, 항체 변이체, 항체 유도체, 항원 결합 단편 등과 관련하여 용어 "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합"은 다른 비-표적 분자보다 우선적으로 주어진 표적 분자에 결합하는 그의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 항체, 항체 변이체, 항체 유도체 또는 항원 결합 단편("분자 A")이 주어진 표적 분자("분자 B")에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적 결합"할 수 있는 경우, 분자 A는 분자 B와 임의의 다른 개수의 잠재적인 대안적 결합 파트너를 구별할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 잠재적인 결합 파트너로서 상이한, 그러나 동일하게 접근가능한 복수의 분자에 노출될 때, 분자 A는 분자 B에 선택적으로 결합할 것이고, 다른 대안적인 잠재적인 결합 파트너는 분자 A에 실질적으로 결합되지 않을 것이다. 일반적으로, 분자 A는 분자 B에 다른 잠재적인 결합 파트너보다 적어도 10배, 바람직하게는 50배, 보다 바람직하게는 100배, 가장 바람직하게는 100배 이상 더 우선적으로 결합할 것이다. 분자 A는 약하지만, 검출가능한 수준에서 분자 B가 아닌 분자에 결합할 수 있다. 이것은 일반적으로 배경 결합으로 알려져 있으며, 예를 들어, 적절한 대조군의 사용에 의해, 분자 B-특이적 결합으로 쉽게 식별할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 이러한 전달 시스템은 반응 시약(예를 들어, 적절한 용기내 라벨, 참조 샘플, 지지 물질 등) 및/또는 지지 물질(예를 들어, 완충제, 분석 등을 수행하기 위한 사용설명서)의 한 위치에서 다른 위치로의, 저장, 수송, 또는 전달을 위한 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 박스와 같은 하나 이상의 인클로저를 포함할 수 있다.
수치의 범위를 언급할 때 본원에서 "사이"라는 용어의 사용은 범위의 각 종점에서의 수치를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 10 잔기와 20 잔기 사이의 길이의 폴리펩티드는 10 잔기 길이의 폴리펩티드 및 20 잔기 길이의 폴리펩티드를 포함한다.
본원의 선행 기술 문헌의 임의의 진술 또는 본원에서 유래된 진술 또는 상기 문헌들에 기초한 진술은 해당 문헌 또는 유래된 진술이 관련 기술의 일반적인 일반 지식의 일부임을 인정하지 않는다. 설명의 목적상, 본원에서 언급된 모든 문헌은 다르게 언급하지 않는 한, 그 전체가 참고 문헌으로 포함된다.
전립선 질병 진단을 위한 신뢰할 수 있고, 편리하고 정확한 검사의 개발은 특히 치료적 개입이 성공할 가능성이 가장 높은 초기 단계에서 중요한 목표로 남아 있다. 그러나 DRE 및 PSA 분석과 같은 초기 선별 과정들은 종종 불확실하고/결말없는 진단 결과를 제공하고 암성 및 비-암성 전립선 질병을 효과적으로 구별할 수 없다.
본 발명은 전립선 질병을 나타내는 바이오마커 조합을 제공한다. 특히, 바이오마커 조합은 주어진 대상에서 비-암 전립선 질병(예를 들어, BPH)과 전립선 암을 구별할 수 있다. 대상은 하나 이상의 진단 검사(예를 들어, DRE, PSA 검사)에 근거하여, 전립선 질병이 있거나 전립선 질병이 의심되는 것으로 판명되었을 수 있다. 따라서, 바이오마커 조합은 대상의 전립선 암 또는 BPH의 존재 여부를 진단하고, 및/또는 전립선 암 환자로부터 BPH 환자를 구별하기 위해 다양한 방법 및 분석 포맷에서 사용될 수 있다.
전립선 질병
본 발명은 전립선 질병의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 바이오마커 조합의 검출을 포함한다.
상기 방법에 따라 진단되는 전립선 질병은 양성 전립선 비대증(BPH), 전립선 상피내 종양, 전립선 염, 전립선 암, 전립선 선암종, 전립선 평활근육종 및 전립선 횡문근육종을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 암 전립선 질병이 완전히 또는 현저히 없는 "정상" 환자와 전립선 암을 갖는 대상을 구별할 수 있는 능력을 제공한다. 정상적인 환자는 예를 들어, BPH, 전립선 상피내 종양(PIN) 또는 전립선 염과 같은 비-암성 전립선 질병을 가질 수 있다.
당업자는 상이한 전립선 질병을 분류하는데 사용되는 표준 임상 시험 및 매개변수를 잘 알고 있다(예를 들어, "2015 Annual Report on Prostate Diseases", Harvard Health Publications (Harvard Medical School), 2015 참조; 이의 내용은 상호-참조에 의해 여기에 통합됨).
본원에서 고려되는 다양한 전립선 질병은 이 분야에서 일반적으로 받아들여지는 특징 및 분류 기준을 갖는다.
예를 들어, 본원에서 고려되는 바와 같이, 양성 전립선 비대증(BPH)은 어떤 경우에는 증가된 잔뇨량을 갖는 빈번한 배뇨, 소변 보유 및 자극적인 또는 방해된 소변 배뇨 패턴을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하부 요로 증상에서 절정에 달하는 전립선의 임상적 확대를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
전립선 염은 만성 비-세균성 전립선 염 및 급성 또는 만성 세균성 전립선 염을 포함하여 전립선의 염증과 관련된 장애를 지칭하는 것으로 이해될 수 있으며, 일반적으로 요중 긴급 및/또는 빈뇨 증상과 관련된다.
전립선 상피내 종양(PIN)은 고급 전립선 상피내 종양 및 저급 전립선 상피내 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 형태 및/또는 정도의 PIN을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. PIN은 일부 전립선 세포가 비정상적으로 보이고/보이거나 행동하기 시작한 전암성 질환으로 간주될 수 있다. 비정상 세포는 예를 들어, 선포(acini)와 덕트를 감싸는 상피 세포에 위치할 수 있는 반면, 라이닝(lining) 자체는 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있다.
전립선 암을 갖는 대상에서는 전립선 세포가 무한정으로 분열되어 비정상적인 성장(예를 들어, 종양)을 일으킨다. 비정상적인 성장은 통증이 없고, 무증상일 수 있다. 대안적으로, 비정상적인 성장은 신체적 불편감 및/또는 수액 장애 또는 출혈을 포함한 기타 국소 증상을 유발할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 비정상적인 성장은 정상적인 신체 기능의 파괴로 인해 발생하는 증상을 포함하여 전신 증상으로 최고조에 달할 수 있다. 일부 구현예에서, 전립선 암의 증상은 대변 습관 또는 방광 기능의 변화를 포함할 수 있다. 전립선 암 세포는 양성이거나 전이성일 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 전립선 암은 질병의 진행에 따라 단계로 분류될 수 있다. 비-제한적 예로서, 전립선 암 진행은 AJCC TNM 병기 시스템, Whitmore-Jewett 시스템 및/또는 D' Amico 위험 카테고리를 사용하여 단계로 분류될 수 있다.
당 분야의 통상적인 숙련자는 이러한 분류 시스템, 그의 특징 및 용도에 익숙하다.
전립선 암을 등급화하기에 적합한 시스템은 당업자에게 "글리슨 등급계(Gleason Grading System)"으로 알려져있다. 이 시스템은 전립선 암을 갖는 대상에게서 얻은 조직 샘플에서 가장 큰 두 가지 암 영역 각각에 등급을 지정한다. 상기 등급의 범위는 1-5이며, 1은 최소한의 공격적인 형태이고, 5는 가장 공격적인 형태이다. 전이는 등급 4 또는 등급 5에서 흔하게 발생하지만, 예를 들어, 등급 3 종양에서는 드물게 발생한다. 그런 다음 두 등급을 합하여 글리슨(Gleason) 점수를 산출한다. 2-4점은 저등급으로 간주되며; 5-7은 중급; 및 8-10은 고급으로 간주된다. 글리슨 점수가 낮은 종양은 평생동안 환자에게 심각한 위협을 주지 않을만큼 느린 속도로 성장할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 전립선 암은 상이한 등급을 갖는 영역을 가질 수 있으며, 이 경우 개별적인 등급이 전립선 암의 대부분을 차지하는 두 영역에 지정될 수 있다. 이 두 등급은 글리슨 점수/합계를 산출하기 위해 추가되며, 일반적으로 지정된 첫번째 번호는 종양에서 가장 흔한 등급이다. 예를 들어, 글리슨 점수/합계가 '3 + 4'로 쓰여진 경우, 글리슨 점수/합계 7에 대한, 종양의 대부분이 등급 3이고, 등급 4가 적음을 의미한다.
비-제한적 예로서, 3 + 4 이상의 글리슨 점수/합계는 본 발명의 방법에 따라 전립선 암을 나타낼 수 있다.
전립선 질병을 위한 바이오마커
본 발명의 방법에 따라, 전립선 질병은 본원에서 확인된 하나 이상의 바이오마커를 검출함으로써 진단될 수 있다.
본원에서 고려된 바와 같은 바이오마커는 피분석물일 수 있다. 본원에서 고려되는 피분석물은 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미를 부여해야하며, 감지하고 정량화할 수 있는, 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 대뇌 척수액, 소변, 눈물, 림프액, 타액, 간질액, 땀 등)의 물질 또는 화학적 성분을 제한없이 지칭한다. 비-제한적 예는 사이토카인 및 케모카인뿐만 아니라 세포-표면 수용체 및 이의 가용성 형태를 포함한다.
본 발명에 따라 검출된 바이오마커의 조합은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 이상의 개별 바이오마커를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오마커의 조합은 GPC-1 및 적어도 1개의 추가의 바이오마커, GPC-1 및 적어도 2개의 추가의 바이오마커, 또는 GPC-1 및 적어도 3개의 추가의 바이오마커를 포함할 수 있다. 1개 이상의 추가의 바이오마커는 피분석물일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상의 생물학적 샘플 중 2개 이상의 바이오마커의 조합을 측정하여 전립선 질병에 대한 양성 또는 음성 진단을 유도하는 기준으로 사용할 수 있다. 적어도 2개의 바이오마커의 조합은 GPC-1을 포함할 수 있다. 전립선 질병은 전립선 암 또는 BPH일 수 있다. 비-제한적인 예로써, 적어도 2개의 바이오마커의 조합은 하기 표 1에 제시된 것 중에서 선택될 수 있다.
Figure pct00001
일부 구현예에 있어서, 대상의 생물학적 샘플 중 적어도 3개의 바이오마커의 조합을 측정하여 전립선 질병에 대한 양성 또는 음성 진단을 유도하는 기준으로 사용할 수 있다. 적어도 3개의 바이오마커의 조합은 GPC-1을 포함할 수 있다. 전립선 질병은 전립선 암 또는 BPH일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 적어도 3개의 바이오마커의 조합은 하기 표 2에 제시된 것 중에서 선택될 수 있다.
Figure pct00002
바이오마커의 검출 및 정량화
본 발명에 따른 바이오마커 또는 바이오마커들의 조합은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오마커 또는 바이오마커들의 조합은 샘플에서 바이오마커 또는 바이오마커들의 조합의 특정 수준을 유도하도록 정량화된다. 바이오마커(들)의 수준(들)은 진단을 제공하기 위해 본원에서 제공된 방법에 따라 분석될 수 있다.
주어진 생물학적 샘플에서 바이오마커(들)을 검출하는 것은 측정이 가능한 출력을 제공할 수 있으며, 따라서 존재하는 바이오마커(들)의 수준을 정량화하는 수단을 제공한다. 출력 신호의 측정은 생물학적 샘플의 부피 당 바이오마커의 순중량(예를 들어, pg/mL; ㎍/mL; ng/mL 등)을 나타내는 수치를 생성하는데 사용될 수 있다.
비-제한적인 예로서, 바이오마커(들)의 검출은 샘플 중의 바이오마커(들)의 수준을 나타내는 하나 이상의 형광 신호에서 최고조에 달할 수 있다. 상기 형광 신호는 본 발명의 방법에 따라 진단 결정을 내리기 위해 직접 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 동일한 목적을 위해 다른 출력으로 변환될 수 있다(예를 들어, 상기 단락에서 설명된 부피당 중량).
본 발명에 따른 바이오마커는 예를 들어, 프로테오믹 기술 및 바이오마커를 코딩하는 핵산을 이용하는 기술을 포함하는 당 업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있다.
적당한 프로테오믹 기술의 비-제한적인 예는 질량 분석법, 단백질 어레이 기술(예를 들어, 단백질 칩), 겔 전기영동 및, 면역 형광법, 방사선표지, 면역조직화학법, 면역침강법, 웨스턴 블롯 분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 형광 세포 분류(FACS), 면역블롯팅, 화학 발광 및/또는 항체를 갖는 단백질을 검출하기 위해 사용되는 다른 공지된 기술을 포함하는, 바이오마커(들)에 대한 특이도를 갖는 항체에 따른 다른 방법들을 포함한다.
핵산 검출에 의존하는 적당한 기술의 비-제한적인 예로는 DNA, RNA(예를 들어, mRNA), cDNA 등을 검출하는 기술, 예컨대 PCR-기반 기술(예를 들어, 정량적 실시간 PCR; SYBR-녹색 염료 염색), UV 분광법, 하이브리드화 분석(예를 들어, 슬롯 블롯 하이브리드화) 및 마이크로어레이가 있다.
단클론 항체 및 다클론 항체를 비롯한 본 발명에 따른 바이오마커에 대한 결합 특이도를 갖는 항체는 쉽게 입수할 수 있으며, 다양한 상업적 공급사(예를 들어, Sigma-Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, Abcam, Abnova 등)로부터 구입할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 바이오마커에 대한 결합 특이도를 갖는 항체는 당 업계의 표준 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 단클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포의 생산 기술은 이 분야에서 잘 알려져있다. 비-제한적 예는 하이브리도마 방법(Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256:495-497; Coligan et al. section 2.5.1-2.6.7 in Methods In Molecular Biology (Humana Press 1992); and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, 페이지 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988) 참조), 인간 단클론 항체 생산을 위한 EBV-하이브리도마 방법(Cole, et al. 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조), 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4:72 참조) 및 트리오마 기술을 포함한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플(예를 들어, 체액 또는 조직 샘플)내 바이오마커(들)의 검출/정량화는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 달성된다. ELISA는 예를 들어, 색도측정법, 화학발광법 및/또는 형광측정법에 기초할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 ELISA는 임의의 적합한 포획 시약 및 항체 및 그의 유도체, 단백질 리간드 등을 포함하는 검출 가능한 시약을 사용할 수 있다.
비-제한적인 예로서, 직접적인 ELISA에서, 관심 바이오마커는 분석 플레이트 상에 직접 흡착시키거나 또는 플레이트 표면에 부착된 포획 항체를 사용하여 고정될 수 있다. 항원의 검출은 효소-접합 1차 항체(직접 검출) 또는 표지되지않은 1차 및 접합된 2차 항체의 맞춤 세트(간접 검출)를 사용하여 수행할 수 있다. 간접 검출법은 1차 항체에 대한 결합 특이도를 갖는 검출용으로 표지된 2차 항체를 이용할 수 있다. 포획(사용된다면) 및/또는 일차 항체는 상이한 숙주 종으로부터 유도될 수 있다.
일부 구현예에서, ELISA는 경쟁 ELISA, 샌드위치 ELISA, 세포내 ELISA 또는 ELISPOT(효소-결합 면역스폿 검정)이다.
ELISA를 제조하고 수행하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. ELISA 플레이트의 선택 및 코팅, 적절한 항체 또는 프로브의 사용, 블로킹 완충제 및 세척 완충제의 사용, 검출 단계의 세부 사항(예를 들어, 방사성 또는 형광성 태그, 효소 기질 등)과 같은 절차 고려사항은 당 분야에서 잘 정립되어 있고, 정례적이다(예를 들어, "The Immunoassay Handbook. Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques", Wild, D. (Ed), 4th edition, 2013, Elsevier 참조).
다른 구현예에서, 생물학적 샘플(예를 들어, 체액 또는 조직 샘플)내 바이오마커(들)의 검출/정량화는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 달성된다. 웨스턴 블롯팅은 당업자에게 잘 알려져있다(예를 들어, Harlow and Lane. Using antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Bold and Mahoney, Analytical Biochemistry 257, 185-192, 1997 참조). 간략하게, 주어진 바이오마커에 결합 친화성을 갖는 항체는 겔 전기영동에 의해 크기에 기초하여 분리된 단백질의 혼합물에서 바이오마커를 정량화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)로 제조된 멤브레인은 생물학적 샘플로부터의 단백질 혼합물을 포함하는 겔과 그 겔로부터 멤브레인으로 단백질이 이동하도록 유도하기 위해 인가된 전류 옆에 놓일 수 있다. 이어서, 상기 멤브레인은 관심 바이오마커에 대한 특이도를 갖는 항체와 접촉될 수 있고, 2차 항체 및/또는 검출 시약을 사용하여 가시화될 수 있다.
다른 구현예에서, 생물학적 샘플(예를 들어, 체액 또는 조직 샘플)에서 다중 바이오마커의 검출/정량화는 멀티플렉스 단백질 분석(예를 들어, 평면 분석 또는 비드-기반 분석)을 사용하여 달성된다. 상업적으로 이용가능한 다수의 멀티플렉스 단백질 분석 포맷(예를 들어, Bio-rad, Luminex, EMD Millipore)이 있으며, 적당한 멀티플렉스 단백질 분석의 비-제한적인 예는 본 명세서의 실시예 부분에 기술되어있다.
다른 구현예에서, 생물학적 샘플(예를 들어, 체액 또는 조직 샘플)내 바이오마커(들)의 검출/정량화는 유체의 스트림에 현탁된 표적 개체(예를 들어, 세포 및 단백질)를 계수, 검사 및 분류하기 위한 기술인 유동 세포계측법에 의해 달성된다. 광학/전자 검출 장치(예를 들어, 표적 바이오마커(들) 정량화)를 통해 흐르는 개체의 물리적 및/또는 화학적 특성을 동시에 다중 매개변수 분석할 수 있다.
다른 구현예에서, 생물학적 샘플(예를 들어, 체액 또는 조직 샘플)내 바이오마커(들)의 검출/정량화는 조직 또는 세포에서 항원에 대한 결합 특이도를 갖는 항체 또는 단백질 결합제를 사용함으로써 조직 절편 또는 세포에 단백질을 국한시키는 과정인, 면역조직화학 또는 면역세포화학법에 의해 달성된다. 가시화는 색상(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제) 또는 형광(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE))을 생성하는 표지로 항체/제제를 태깅(tagging)함으로써 가능할 수 있다.
당업자는 본 발명에 따른 바이오마커(들) 또는 이들을 코딩하는 핵산을 검출하는데 사용되는 특정 방법이 독창적인 입력을 요구하지 않는 일상적인 선택 사항이라는 것을 인식할 것이다.
바이오마커 분석 및 진단
본 발명의 방법에 따르면, 주어진 바이오마커 또는 바이오마커들의 주어진 조합의 검출 및 정량화는 전립선 질병을 진단하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 상기 방법은 주어진 생물학적 샘플 또는 일련의 생물학적 샘플에서 표적 바이오마커(들)을 분석하여 샘플내 바이오마커(들)의 정량적 측정치를 도출하는 단계를 포함한다. 적당한 바이오마커는 표 1 및 표 2에 언급된 바이오마커들 및 바이오마커 조합들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 비-제한적인 예로서, 정량적 측정은 바이오마커(들)을 검출 및 정량하기 위해 고안된 분석법에 의해 생성되는, 형광 신호 또는 흡광도 신호의 형태일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 정량적 측정은 샘플(들)에서의 바이오마커(들)의 중량/부피 측정의 형태로 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 전립선 질병을 앓고있는 것으로 알려진 환자 집단에서의 바이오마커(들)의 수준의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커(들)의 수준은 첫번째 전립선 질병이 있는 환자에게서 얻은 일련의 생물학적 샘플과 두번째 전립선 질병이 있는 환자에게서 얻은 일련의 생물학적 샘플에서 확인할 수 있다. 첫번째 전립선 질병은 예를 들어, BPH, PIN 또는 전립선 염과 같은 비-암성 전립선 질병일 수 있다. 두번째 전립선 질병은 전립선 선암종, 전립선 평활근육종 및 전립선 횡문근육종 중 하나 이상과 같은 형태를 포함하는 전립선 암일 수 있다. 전립선 암은 최소 글리슨 등급 또는 점수/합계(예를 들어, 6 이상(예를 들어, 3 + 3, 4 + 2 또는 2 + 4); 7 이상(예를 들어, 3 + 4 또는 4 + 3, 5 + 2), 또는 8 이상(예를 들어, 4 + 4, 5 + 3; 또는 3 + 5)으로 특징분석될 수 있다.
각 개체군의 샘플에서 관찰된 바이오마커(들)의 수준을 종합적으로 분석하여 암 또는 비-암성 전립선 질병의 진단을 제공하는 기준으로 사용할 수 있는 문턱값을 결정할 수 있다. 예를 들어, 전립선 질병을 앓고있는 것으로 확인되거나 의심되는 환자의 생물학적 샘플을 분석하고, 본 발명에 따른 표적 바이오마커(들)의 수준을 결정할 수 있다. 환자의 샘플내 바이오마커 수준과 환자 집단에서 생성된 문턱값(들)의 비교는 암 또는 비-암성 전립선 질병을 진단하는 기초가 될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 주어진 환자가 비-암성 전립선 질병 또는 암성 전립선 질병을 앓고 있는지 여부를 진단하는 것을 포함한다. 환자는 예를 들어, DRE 및/또는 PSA 검사의 결과로 전립선 암을 갖는 것으로 미리 확인되거나, 의심될 수 있다. 이러한 상황에서, 본원에 기술된 방법에 따른 비-암성 전립선 질병의 진단이 전립선 생검의 필요성을 회피하기 때문에 환자가 전립선 질병이 암인지 여부를 결정하는 것이 유리하다.
특별한 제한없이, 본 발명에 따른 진단 방법은 대상이 특정 형태의 전립선 질병을 가지고 있는지 여부를 구별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 전립선 질병 A를 앓고 있다고 미리-결정된 제1 그룹의 환자로부터 제1 시리즈의 생물학적 샘플, 및 전립선 질병 A를 앓고 있지 않은 것으로 미리-결정된 제2 그룹의 환자로부터 제2 시리즈의 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 제2 그룹의 환자는 다른 전립선 질병(예를 들어, 전립선 질병 B)을 앓거나 임의의 전립선 질병(전립선 질병-)을 앓고 있지 않을 수 있다. 제1 및 제2 환자 그룹 간의 식별을 위한 문턱값은 제1 및 제2 시리즈의 생물학적 샘플에서 1, 2, 3, 4, 5개 또는 5개 이상의 바이오마커를 검출함으로써 생성되어, 각 시리즈의 각 생물학적 샘플내 각각의 바이오마커에 대한 바이오마커 수준을 얻을 수 있다. 피분석물 수준은 제1 및 제2 그룹의 환자로부터의 샘플을 구별할 수 있는 방식으로 조합될 수 있다. 문턱값은 제1 및 제2 환자 그룹 간의 오 분류 비율을 감소시키고; 제1 및 제2 환자 그룹 간의 구별에 있어서 민감도를 증가시키거나 최대화하고; 및/또는 제1 및 제2 환자 그룹을 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키거나 최대화하는 임의의 하나 이상의 방법과 같은 적당한 방식으로, 조합된 피분석물 수준으로부터 선택될 수 있다. 문턱값은 주어진 후보 샘플에서 전립선 질병 A의 유무를 구별하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 따라서, 전립선 질병 A와 관련한 상태가 결정되지않은 대상으로부터의 생물학적 샘플이 얻어질 수 있고, 제1 및 제2 환자 그룹과 동일한 방식으로 측정된 문턱값을 생성하기 위한 기준으로 제공된 동일한 바이오마커(들)이 얻어져서, 환자 바이오마커 값을 얻는다. 정량화된 바이오마커 수준으로부터 유도된 환자 바이오마커 값은 이후 전립선 질병 A의 결정을 위한 문턱값과 비교될 수 있다. 대상의 생물학적 샘플로부터 얻어진 개별 또는 조합된 바이오마커 수준의 적절한 알고리즘 및/또는 변형이 문턱값과의 비교를 위한 환자 바이오마커 값을 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 문턱값 및/또는 환자 바이오마커 값을 유도하는데 사용되는 하나 이상의 파라미터들이 가중치를 받는다.
일부 구현예에서, 환자 바이오마커 값이 문턱값보다 작으면 환자는 전립선 질병 A에 대한 음성 진단을 받는다. 일부 구현예에서, 환자 바이오마커 값이 문턱값보다 큰 경우 환자는 전립선 질병 A에 대한 음성 진단을 받는다. 일부 구현예에서, 환자 바이오마커 값이 문턱값보다 작으면 환자는 전립선 질병 A에 대해 양성 진단을 받는다. 일부 구현예에서, 환자 바이오마커 값이 문턱값보다 큰 경우 환자는 전립선 질병 A에 대한 양성 진단을 받는다. 일부 구현예에서, 전립선 질병 A는 비-암성 전립선 질병(예를 들어, BPH, PIN 또는 전립선 염)이다. 일부 구현예에서, 전립선 질병 A는 전립선 암, 전립선 선암종, 전립선 평활근육종 및/또는 전립선 횡문근육종이다.
상기 분석을 수행하기 위한 적합한 및 비-제한적인 방법은 본원의 실시예에 기술되어 있다.
상기 방법의 비-제한적인 일례는 수신자 반응 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선 분석이다. 일반적으로, ROC 분석은 시험된 각 환자의 분류를 적당한 참조 표준에 근거한 '진' 분류와 비교하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 여러 환자를 분류하면 민감도 및 특이도 측정을 유도할 수 있다. 민감도는 일반적으로 진 양성인 환자들 모두에서 올바르게 분류된 환자의 비율이 될 것이고, 특이도는 진 음성인 사람들 모두에서 올바르게 분류된 환자의 비율일 것이다. 일반적으로 양성 분류를 결정하기 위해 선택한 문턱값에 따라 민감도와 특이도 사이에 절충점이 존재할 수 있다. 낮은 문턱값은 일반적으로 높은 민감도를 가질 수 있지만 비교적 낮은 특이도를 가질 수 있다. 대조적으로, 높은 문턱값은 일반적으로 낮은 민감도를 가질 수 있지만 비교적 높은 특이도를 가질 수 있다. ROC 곡선은 민감도 대 특이도의 플롯을 수평으로 반전시킴으로써 생성될 수 있다. 그 결과 반전된 수평축은 위 양성 분율이며, 1에서 특이도를 뺀 것과 같다. ROC 곡선 아래 면적(AUC)은 가능한 특이도의 전체 범위에 대한 평균 민감도, 또는 가능한 모든 민감도 범위에 대한 평균 특이도로 해석될 수 있다. AUC는 전체 정확도 측정값을 나타내며, 모든 가능한 해석 문턱값을 포함하는 정확도 측정값을 나타낸다.
전체 ROC 곡선의 분석을 사용하는 방법이 포함되지만, 상기 방법을 부분 영역의 통계 분석(부분적인 AUC 분석)으로 확장시킬 수도 있다. 부분 AUC 분석에서 수평 또는 수직축을 따른 적절한 범위의 선택은 임상 목적에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다. 주어진 전립선 질병의 존재를 높은 정확도로 검출하는 것이 중요한 임상적 환경에서, 높은 민감도에 상응하는 비교적 높은 위 양성 분율의 범위가 사용될 수 있다. 대안적으로, 주어진 전립선 질병을 배제하는 것이 중요한 임상적 환경에서, 높은 특이도와 균등한 비교적 낮은 위 양성 분율의 범위가 사용될 수 있다.
대상, 샘플 및 대조군
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플은 하나 또는 일련의 대상으로부터 유도된다. 본 명세서에서 언급된 대상 또는 환자는 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하여 경제적, 사회적 또는 연구 중요성을 갖는 임의의 동물을 포함한다. 대상 또는 환자는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유류와 같은 포유동물일 수 있다. 본원에 기술된 대상 및 환자는 전립선 질병을 앓거나 또는 앓지 않을 수도 있고, 암성 전립선 질병을 앓거나 또는 앓지 않을 수도 있고, 또는 비-암성 전립선 질병을 앓거나 또는 앓지 않을 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용된 샘플은 당업자에 의한 분석을 허용하기에 적합한 형태일 수 있다. 적합한 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 소변, 눈물, 뇌척수액, 림프액, 타액, 간질액, 땀 등과 같은 다양한 체액을 포함한다. 소변은 전립선 마사지 후에 얻어질 수 있다.
샘플은 조직 샘플, 예컨대, 조직의 생검, 또는 조직으로부터 긁힌 표면 샘플일 수 있다. 조직은 전립선에서 유래한 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 조직으로부터 제조된 세포의 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 방법은 일부 구현예에서 대조군 샘플의 사용을 포함할 수 있다.
대조군 샘플은 전립선 질병없는 개인으로부터 채취한 임의의 해당 샘플(조직 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 눈물 또는 소변)이다. 특정 구현예에서, 대조군 샘플은 본 발명에 따른 바이오마커를 코딩하는 핵산 물질을 포함하거나, 이로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 대조군 샘플은 표준 샘플을 포함할 수 있다. 표준 샘플은 대조군 수준으로 간주되는 수준에서 바이오마커의 기준량을 제공할 수 있다. 예를 들어, 표준 샘플은 전립선 질병을 앓거나 앓지 않을 수 있는, 하나 이상의 대상으로부터 하나 이상의 샘플(예를 들어, 다수의 샘플로부터의 양 또는 수준의 평균)에서 본원에 기술된 바이오마커의 양 또는 수준을 모방하도록 제조될 수 있다.
일부 구현예에서는 대조군 데이터가 이용될 수 있다. 대조군 데이터는 기준으로서 사용되는 경우, 대조군 수준으로 간주되는 바이오마커의 양 또는 수준을 제공하는 표, 차트, 그래프(예를 들어, 데이터베이스 또는 표준 곡선)에 포함될 수 있는 데이터의 편집을 포함할 수 있다. 상기 데이터는 예를 들어, 전립선 질병을 앓거나, 앓지 않을 수 있는, 하나 이상의 대상으로부터 하나 이상의 샘플(예를 들어, 다수의 샘플로부터의 양 또는 수준의 평균)에서 바이오마커의 양 또는 수준을 얻음으로써 편집될 수 있다.
키트
또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트가 본 명세서에 포함된다.
키트는 표 1 및 표 2에 언급된 바이오마커 및 바이오마커 조합들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에 기술된 하나 이상의 바이오마커(들)을 검출하기에 적합한 시약을 포함할 수 있다.
비-제한적인 예로서, 키트는 본원에 기술된 하나 또는 일련의 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 또는 일련의 항체를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 바이오마커(들)을 정량할 수 있는 분석물을 준비 및/또는 수행하기 위한 시약 및/또는 성분(예를 들어, ELISA, 유세포분석, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 겔 전기영동(단백질 및/또는 핵산 분리에 적합함) 및/또는 정량적 PCR을 수행하기 위한 시약)을 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 환자로부터 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 샘플을 수득 및/또는 가공하기 위한 장비를 포함할 수 있다.
광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 특정 구현예에 개시된 바와 같이 본 발명에 많은 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 본 구현예들은 모든면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예
본 발명은 특정한 실시예를 참조하여 설명될 것이지만, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 양성 전립선 비대증[BPH] 및 전립선 암[CaP] 환자에서의 피분석물 표현.
Biorad Bioplex 다중-피분석물 어레이 시스템을 사용하여 정상 환자(아암(Arm) 1), 양성 전립선 비대증 환자(BPH, 아암 2) 및 전립선 암 환자(CaP, 아암 3)의 혈장 샘플에서 82개의 피분석물의 표현을 조사했다. 염소 다클론 항-GPC-1 포획 항체 및 MIL-38 항-GPC-1 단클론 검출기 항체로 구성된 샌드위치 ELISA를 사용하여 가용성 GPC-1의 수준을 측정하였다.
1. 재료 및 방법
1.1 환자
298명의 환자의 혈장 샘플을 다중 피분석물 분석을 위해 수집했다. 정상군(98명의 환자), 양성 전립선 비대증[BPH, 100명의 환자], 및 전립선 암[CaP, 100명의 환자]의 세 그룹들 각각으로부터 샘플들을 분석하였다.
환자 범주는 다음과 같이 정의된다:
아암 1 - 정상
- 포함
이전 3개월 동안 DRE를 제외하고, 다음과 같이 정의된 PSA에 의해, 하부 요로를 임의 조작하지 않은 상태에서(예컨대, 내시경 검사), 정상 DRE와 정상 PSA에 의해 최소 1주에서 최대 1년간 진단된 50세 이상 남성(알파-차단제 포함):
- 50세 내지 60세의 PSA < 2 ng/mL
- 60세 이상의 PSA < 3 ng/mL.
전형적으로 상기 환자들은 정관절제술, 스텐트 시술 또는 스톤 시술 또는 발기 부전을 상담한다.
- 제외
지난 3개월동안 DRE 이외의 하부 요로 조작을 받은 임의의 아암 1 환자는 제외되었으며, DRE 결과가 없거나 승인된 기간 내에 DRE가 없는 임의의 아암 1 환자는 제외되었다.
PSA 결과가 없거나 승인된 기간 내에 PSA가 없는 임의의 아암 1 환자는 제외되었다.
무증상 BPH를 가진 임의의 아암 1 환자는 아암 1에서 제외되었지만, 아암 2(BPH)에 포함될 수 있었다.
아암 2 - 양성 전립선 비대증(BPH)
- 포함
최소 4주, 최대 1년 이내에 알파-차단제를 포함하여 병리학적으로 확인된 양성 전립선 비대증이 있는 50세 이상 남성. 또한, PSA가 연령 조절된 정상 범위내에 있고, PSA 검사가 적어도 1주일 및 최대 12개월 이내에 수행되는 경우, 하부 요로 증상(LUTS)을 비롯한 임상적 BPH를 가진 50세 이상의 남성이 포함되었다. 정상 PSA는 50세에서 60세 사이의 PSA < 2 ng/mL와 60세 이상의 PSA < 3 ng/mL로 정의된다.
- 제외
PIN이나 이형성이 있는 임의의 아암 2 환자는 제외되었다.
아암 3 - 전립선 암(CaP)
- 포함
알파 차단제를 포함한 50세 이상 남성의 경우 적어도 1주일의 생검으로 전립선 암 환자를 확인하고 글리슨 점수는 글리슨 3 + 4 또는 글리슨 4 + 3으로 7점 이상이다.
- 제외
부분 또는 근치적 전립선 절제술이나 HIFU 또는 근접 치료와 같은 다른 치료 시술을 받은 임의의 아암 3(전립선 암 또는 CaP) 환자는 제외되었다.
5 알파 환원효소 억제제(5ARI)를 투여한 임의의 아암 3 환자는 피나스테라이드(finasteride)의 마지막 투여 이후 최소 2일 실패 및 듀라스테라이드(durasteride)의 마지막 투여 후 최소 30주 실패가 없으면 제외되었다.
Saw Palmetto하에 있는 임의의 아암 3 환자는 마지막 투여 후 최소 1개월의 실패가 없으면 제외되었다.
안드로겐 차단요법(Androgen Deprivation Therapy, ADT) 또는 임의의 실험 약물 하에 있는 임의의 아암 3 환자는 제외되었다.
모든 아암에 대한 제외 기준은 다음과 같다:
- 포함 기준에 미달하는 임의의 환자는 제외되었다.
- 기저부 또는 편평 상피암을 제외한 전립선 암 이외의 병력이 있는 임의의 환자는 제외되었다.
1.2 샘플 수집
환자로부터 채취한 전혈 샘플을 원심분리하여, 혈장 성분을 분리하고, 이를 -20℃에서 보관하였다. 그후, 샘플을 수집 부위로부터 선적 후 해동하고, 분주하고 -80℃에서 보관했다.
1.3 다중-피분석물 어레이
환자 혈장 샘플을 얼음 위에서 해동시킨 다음 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 샘플을 40℃에서 10분 동안 20,000g에서 회전시켰다. 중간 분획은 0.22μm 원심 여과 장치로 임의의 펠렛 또는 지질 층을 피하면서 옮겨졌으며, 완료될 때까지 4℃에서 11,000g으로 회전시켰다. 그런 다음 샘플을 미세적정 플레이트(Microtitre plate)에 분액하여, Bio-plex 판독값으로 처리할 수 있었다. 이 플레이트는 Bio-plex 키트 지침에 따라 호주 프로테옴 분석시설(Australian Proteome Analysis Facility)에서 처리하고 실행할 수 있을 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조사의 지침에 따라, 그리고 Breen et al.(Breen et al. 2015, Cytokine 71, 188-198 참조)에 기술된 바와 같이, Bioplex 200 분석기를 사용하여 샘플을 분석하였다. Bio-plex 200 시스템(Bio-Rad)은 유동 세포계측법의 원리에 기반한 플렉서블 분석기이다. 이 시스템은 작은 샘플 용량을 사용하여 단일 마이크로플레이트 웰에 최대 100개의 피분석물을 다중화(동시에 측정)할 수 있다. Bio-Plex 분석법은 각각의 분석법을 식별할 수 있도록 다른 색상 코드(스펙트럼 주소)가 있는 미세 비드를 사용하여 설계되었다. 서로 다른 비율의 두 형광체로 비드를 염색하여, 100개의 고유한 비드 영역(xMAP 기술)으로 분류하였다.
이 분석을 위해 Biorad에서 4개의 키트를 입수하였다:
Bio-Plex Pro™ 인간 사이토카인 21-플렉스 분석, Cat# MF0-005KMII
Bio-Plex Pro™ 인간 사이토카인 27-플렉스 분석, Cat# M50-0KCAF0Y
Bio-Plex Pro™ 인간 암 바이오마커 패널 1, 16-플렉스, Cat# 171-AC500M
Bio-Plex Pro™ 인간 암 바이오마커 패널 2, 18-플렉스, Cat# 171-AC600M.
각 키트에 포함된 사이토카인 및 성장 인자는 다음과 같다:
27-플렉스: IL-1베타, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, 베이직 FGF, 에오탁신(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IFN-감마, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1알파, MIP-1베타, PDGF-BB, RANTES, TNF-알파 및 VEGF;
21-플렉스: IL-1알파, IL-2R알파, IL-3, IL-12 (p70), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-알파, HGF, IFN-알파2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, 베타-NGF. SCF, SCGF-베타, SDF-1알파, TNF-베타 및 TRAIL;
16-플렉스(암 패널 1): sEGFR, FGF-베이직, 폴리스타틴, G-CSF, HGF, sHER-2/neu, IL-6Rα, 렙틴(Leptin), 오스테오폰틴(Osteopontin), PECAM-1, PDGF-AB/BB, 프롤락틴(Prolactin), SCF, sTIE-2, sVEGFR-1, sVEGFR-2;
18-플렉스(암 패널 2): 안지오포이에틴(Angiopoietin)-2, sCD40L, EGF, 엔도글린(Endoglin), sFASL, HB-EGF, IGFBP-1, L-6, IL-8, IL-18, PAI-1, PLGF, TGF-α, TNF-α, uPA, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D.
1.4 MiCheck™ GPC-1 ELISA
MiCheck™ ELISA는 96 웰 플레이트에서 표준 샌드위치 ELISA 포맷이다. 그것은 검출을 위해 다클론 항-GPC-1 포획 항체(LSBio, Cat# LS-C313545) 및 MIL-38 단클론 항체를 사용한다. 이 분석은 2시간 내에 실행되며, 모든 일반적인 자동화된 ELISA 시스템과 호환된다.
혈청과 혈장을 사용한 프로토타입 MiCheck™ 분석의 성공적인 내부 검증이 완료되었다. 결과는 다음과 같다:
- 선형도: 분석 선형도는 10 pg/mL 내지 1.5 ng/mL의 작용 농도 범위에서 입증되었다.
- 민감도: 재조합 GPC-1의 계산된 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)는 각각 약 3.4 pg/mL 및 7.2 pg/mL이었다.
- 인간 혈청 및 혈장 샘플 검출: 희석 범위 2배 내지 128배에서 평가되었다. 4배 희석된 혈청/혈장과 128배 희석된 혈청/혈장 사이에서 관찰된 좋은 선형도가 존재하였으며, 평균 희석은 10배 내지 20배였다. GPC-1의 보간값의 평균은 다양한 희석에 걸쳐 3.8% CV에 의해 5.4 ng/mL이었다.
- 정밀도: 분석의 작용 범위내에서 분석된 GPC-1의 3개의 농도(1.0/0.5/0.25 ng/mL)로부터 평균 CV를 계산했다.
Figure pct00003
1.5 데이터 분석
Bioplex 분석을 위해, 샘플을 96 웰 미세적정 플레이트의 각 컬럼에서 하향 방향으로 순차적인 내부 넘버링 시스템에 따라 분액하였다. 형광 값을 결정하고 분석에 사용하였다.
ROC 분석(AUC)
R 통계 패키지를 사용하여 ROC 분석을 결정하였다(Robin et al. 2011, BMC Bioinformatics, 12, p77).
가중 모델
양성 및 전립선 암 샘플을 구별하는 피분석물 발현의 최상의 조합을 찾기 위해 알고리즘을 개발하였다. 이 모델은 다음과 같이 n개의 다른 피분석물(A)의 표현의 가중 합(S)을 사용한다.
S = w1A1 + w2A2 … wnAn
가중치 w1 ~ wn은 일반적인 최적화 절차인, R 분석 프로그램의 넬더-미드(Nelder-Mead) 알고리즘을 사용하여 결정되었다.
이 절차는 S의 값에 대해 ROC 분석의 최대 AUC를 최적화하여 양성 또는 PC 상태를 지정한다.
각 가중치의 초기 값은 각 피분석물의 중앙 표현값과 해당 피분석물의 최대 중간값 사이의 비율을 취하여 결정된다.
W = 최대(M)/M
여기서 W = {w1, ... wn} 및 M = {중앙값(A1), ... 중앙값(An)}.
이 모델은 2개 및 3개의 피분석물 조합 모두에 대해 S를 최적화하는데 사용되었다(Pepe et al. 2003, Biometrics, 59:133 참조).
부분 AUC 최적화
부분 AUC를 최적화하기 위해 가중합 넬더-미드 최적화 절차가 적용되는 대체 접근법이 이용되었다. pAUC는 제한된(1-특이도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내며, 일반적으로 이 범위는 값 0과 e 사이에 있으며, 여기서 e를 지정해야한다. 여기서 e는 0.5로 설정되었다. AUC가 모두 같을 때 나중에 상승하는 다른 ROC보다 빨리 상승하는 ROC는 더 높은 특이도를 가질 것이다. 전체 AUC보다는 pAUC에 대하여 최적화하면 더 높은 특이도를 가진 테스트를 위해 최적화된다.
이 접근법은 ROC AUC 분석을 위해 설명된 바와 같이 R 분석 프로그램을 사용하여 N개의 피분석물에 대한 가중합을 생성하는데 사용되었다.
2. 결과
2.1 분석
GPC-1 분석
MiCheck™ ELISA 분석을 사용하여 정상, BPH 및 CaP 환자에서 가용성 GPC-1 수준을 결정하였다(표 4). GPC-1 수준은 정상 또는 BPH 샘플보다 CaP 환자 샘플에서 더 낮았다.
Figure pct00004
GPC-1 수준은 정상적인 데이터 분포를 얻기 위해 로그 변환되었다. BPH와 CaP 그룹을 구별하기 위한 MiCheck™ ELISA의 민감도와 특이도를 다른 컷포인트(cutpoints)에서 측정했다(표 5).
로그 GPC-1 수준은 1.95의 컷포인트에서 0.585의 최대 AUC와 0.51(51%) 및 0.66(61%)의 민감도 및 특이도를 각각 제공하였다.
데이터의 두번째 독립적인 분석은 0.61의 AUC와 0.57/0.57의 민감도/특이도를 산출했다. 상이한 고정 특이도에서의 민감도는 90% 특이도에서 20%, 85% 특이도에서 29%, 80% 특이도에서 33% 및 75% 특이도에서 35%였다.
Figure pct00005
다중 피분석물 분석
PSA 검사의 높은 민감도(~ 80%)를 보완하기 위해 높은 특이도를 가진 전립선 암 검사에 대한 충족되지 않은 요구가 있다. 따라서, 특이도를 최대화하는 컷포인트가 결정되었다. 높은 특이도를 위한 최적의 컷포인트는 1.85로 결정되어, 0.3(30%)의 민감도와 0.81(81%)의 특이도를 제공한다.
진단 테스트의 특이도와 민감도는 단일 피분석물이 아닌 여러 피분석물을 측정함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 차별화되는(differentiating) BPH 및 CaP 환자에서 GPC-1 수준을 갖는 추가 피분석물을 포함하는 효과가 결정되었다.
BPH와 CaP 환자 간의 차별화를 극대화하기 위해, 서로 다른 가중치를 갖는 피분석물의 조합을 사용하는 가중합 최적화 절차를 평가했다. 총 82개의 다른 피분석물을 GPC-1과 함께 시험하여 조합의 성능을 최적화했다. 최적화된 가중합의 결정이 수행되었다. 가중합을 사용하여 컷오프 문턱값을 설정하였으며, 그럼으로써 수신자 반응 곡선(ROC)에 대한 곡선 아래 영역(AUC)을 최대화하여 오 분류 비율을 최소화했다. 민감도와 특이도가 최대 AUC 값에서 결정되었다. 이 분석은 독립적으로 3회 수행하였다.
- GPC-1 및 1개의 다른 피분석물
GPC-1 및 1개의 다른 피분석물에 대한 AUC 최적화 분석의 결과를 하기 표 6에 요약하였다. 3가지 분석에서 특정 조합의 출현 빈도가 도시되어있다. 다음과 같은 피분석물 조합이 확인되었다:
Figure pct00006
결과는 적절한 가중치 및 피분석물 조합을 통해 개선된 AUC, 민감도 및 특이도 결과를 얻을 수 있음을 보여준다. 상위 11개 조합에 대한 AUC 값은 모두 GPC-1 단독의 경우 AUC 0.585에서 개선되었다. 조합들의 AUC는 0.629(GPC-1/HuGM-CSF, 분석 2)의 범위에서 최대 0.71(GPC-1/HGF, 분석 3)까지 개선되었다. 민감도 및/또는 특이도도 GPC-1 단독보다 개선되었음을 나타냈다. 예를 들어, GPC-1/HGF 조합은 GPC-1 단독에 대해 0.51 및 0.66과 비교하여 0.64 및 0.72의 민감도 및 특이도를 나타냈다(분석 2, 표 7).
- GPC-1 및 2개의 피분석물 분석
GPC-1과 2개의 추가 피분석물을 사용하여 최적화 분석을 반복하였다. 최적화 분석의 결과는 표 7에 개시되어 있다.
Figure pct00007
GPC-1에 2개의 피분석물을 첨가하면 GPC-1 또는 GPC-1 + 1개의 피분석물보다 AUC, 민감도 및/또는 특이도가 더 향상되었다(표 8).
Figure pct00008
하기 GPC-1 + 2개의 피분석물의 조합은 분석에서 가장 우수한 조합으로 확인되었다(표 9).
Figure pct00009
- pAUC 최적화
AUC 최적화 분석의 결과는 GPC-1 + 1 또는 2개의 피분석물의 사용이 피분석물 중 하나인 GPC-1에 비해 아암 2 BPH와 아암 3 CaP 사이의 식별을 향상시킬 수 있었음을 나타냈다.
GPC-1과 1 또는 2개의 피분석물의 최적 조합을 확인하는 목적은 BPH와 CaP 환자 그룹을 구별하는 특이도를 최대화하는 것이었다.
부분 AUC를 최적화하기 위해 가중합 넬더-미드 최적화 절차가 적용되는 수정된 최적화 접근법이 개발되었다. pAUC는 제한된(1-특이도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내며, 일반적으로 이 범위는 값 0과 e 사이에 있으며, 여기서 e를 지정해야한다. 여기서 e는 0.5로 설정되었다. AUC가 동일할 때 나중에 상승하는 다른 ROC보다 빨리 상승하는 ROC는 더 높은 특이도를 가질 것이다. 전체 AUC보다는 pAUC를 위해 최적화하면 더 높은 특이도를 갖는 시험을 위해 최적화된다.
부분 AUC 최적화 절차는 GPC-1 + 1개(표 10) 및 GPC-1 + 2개의 피분석물 접근법(표 11)에 적용되었다. 고정 민감도 90%, 85%, 80% 및 75%에서의 민감도를 결정했다. 결과는 "분석 4", 표 7에 개시되어 있다.
GPC-1 + 1개의 추가적인 피분석물에 대한 부분 AUC 최적화 절차가 수행되었다. AUC 최적화에 대해 관찰된 바와 같이, GPC-1 뿐만 아니라 1개의 피분석물의 혼입은 BPH와 CaP 사이의 구별성을 개선시켰다(하기 표 7 및 표 12). GPC-1 + 1개의 피분석물 조합에서 현재 확인된 상위 5개의 피분석물은 다음과 같다:
Figure pct00010
HuIL-9를 제외하고, 이들 모든 피분석물은 본 명세서에서 기술한 AUC 가중합 최적화 절차를 사용하여 확인된 것과 공통되었다.
pAUC 최적화는 GPC-1 + 2개의 추가 피분석물을 사용하여 수행하였다. 최고 성능의 GPC-1 + 2개의 피분석물의 조합은 다음과 같다:
Figure pct00011
제3 피분석물의 첨가는 주어진 고정된 특이도에서의 민감도를 향상시켰다(표 12).
Figure pct00012
- BPH와 CaP를 구별하기 위한 최상의 수행 조합
4개의 개별 분석 결과(3개의 AUC 최적화 및 1개의 pAUC 최적화)는 다음 조합이 가장 빈번하게 발생하고 최상의 구별을 제공함을 나타냈다(표 13).
상호-참조에 의한 통합
본 발명은 2015년 7월 22일자로 Minomic International Ltd의 이름으로 출원된 "전립선 질병을 위한 바이오마커 조합"이라는 제목의 호주 가특허출원번호 제2015902919호의 우선권을 청구하며, 그 전체 내용이 상호-참조에 의해 여기에 통합된다.

Claims (33)

  1. 대상이 전립선 암(CaP)으로부터 양성 전립선 비대증(BPH)이 있는지 여부를 측정하는 방법으로서,
    (a) BPH를 갖는 대상 집단 및 CaP를 갖는 대상 집단으로부터 얻은 일련의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하여, 시리즈의 각각의 상기 생물학적 샘플에서 상기 피분석물 각각에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계;
    BPH 샘플과 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 단계; 및
    상기 조합된 피분석물 수준들로부터 문턱값(threshold value)을 선택하고, 상기 샘플 내의 BPH와 CaP를 구별하기 위한 기준으로 상기 문턱값을 사용하는 단계
    에 의해, BPH와 전립선 암을 구별하기 위한 문턱값을 생성하는 단계; 및
    (b) 대상의 생물학적 샘플에서 상기 적어도 2개의 피분석물을 검출함으로써 대상의 생물학적 샘플에서 각각의 상기 피분석물에 대한 피분석물 수준을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 얻어진 개별 또는 조합된 피분석물 수준에 적절한 알고리즘 및/또는 변형을 적용하여, 문턱값과의 비교를 위한 환자 피분석물 값을 생성하는 단계; 및
    (d) 환자 피분석물 값과 문턱값의 비교에 의해 대상이 BPH 또는 CaP를 갖는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하며,
    상기 적어도 2개의 피분석물은 글리피칸-1(GPC-1)을 포함하고, 이하의 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
    GPC-1 및 간세포 성장 인자(HGF);
    GPC-1 및 표피 성장 인자(EGF);
    GPC-1 및 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1);
    GPC-1 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF);
    GPC-1 및 인간 인터루킨 18(HuIL-18);
    GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 AB.BB(PDGFAB.BB);
    GPC-1 및 혈소판 유도 성장 인자 BB(PDGFBB);
    GPC-1 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
    GPC-1 및 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(HuGM-CSF);
    GPC-1 및 인터페론 감마(IFNγ); 및
    GPC-1 및 폴리스타틴(follistatin).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 2개의 피분석물이 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
    GPC-1, HGF 및 PAI-1;
    GPC-1, HGF 및 인간 섬유아세포 성장 인자 베타(HuFGFb);
    GPC-1, HGF 및 EGF;
    GPC-1, HGF 및 PDGFBB;
    GPC-1, HGF 및 폴리스타틴;
    GPC-1, HGF 및 G-CSF;
    GPC-1, HGF 및 인간 인터루킨 8(HuIL-8);
    GPC-1, HGF 및 가용성 CD40 리간드(sCD40L);
    GPC-1, HGF 및 인간 피부 T-세포 유인 사이토카인(CTACK - C-C 모티프 리간드 27 또는 CCL27로도 알려져 있음);
    GPC-1, HGF 및 PDGFAB.BB;
    GPC-1, HGF 및 IFNγ;
    GPC-1, HGF 및 인간 단핵구 주화성 및 활성화 인자(HuMCP1/MCAF);
    GPC-1, HGF 및 HuIL-18;
    GPC-1, HGF, HuGM-CSF; GPC-1, HGF 및 유로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA);
    GPC-1, HGF 및 인간 흑색종 성장 촉진 활성 알파(HuGROa, CXC 모티프 리간드 1, CXCL1로도 알려져 있음);
    GPC-1, HGF 및 가용성 혈관 내피 성장 인자 수용체(sVEGFR);
    GPC-1, EGF 및 폴리스타틴;
    GPC-1, EGF 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα); 및
    GPC-1, G-CSF 및 면역글로불린 유사 및 EGF-유사 도메인 2를 갖는 가용성 티로신 키나아제(sTIE2).
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 조합된 피분석물 수준의 하위집합을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, BPH 샘플과 CaP 샘플을 구별하는 방식으로 피분석물 수준을 조합하는 상기 단계는 이하의 식에 따라 BPH 및 CaP 샘플 구별을 최대화하는 방식으로 이들 피분석물 수준의 가중 선형 합을 조합하는 단계를 포함하는 방법:
    S = w1A1 + w2A2 ... wnAn
    (상기 식에서, S는 가중 합이며,
    w는 최종 피분석물 가중치이며,
    A는 n개의 다른 피분석물에서 주어진 피분석물의 수준이거나, 주어진 피분석물 수준을 피분석물 값의 비율 또는 숫자로 변환한 것이다.)
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 주어진 피분석물의 수준의 상기 변환이 지수 함수, 힘 함수 및/또는 근 함수의 사용을 수치적으로 포함하는, 방법.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 최종 피분석물 가중치(w)를 얻는 단계는 1로 설정되거나 이하 식에 따라 생성된 초기 피분석물 가중치(W)를 생성하는 단계를 포함하며:
    W = 최대 (M)/M,
    (상기 식에서, W={w1, ... wn} 및 M = {중앙값(A1), ... 중앙값(An)}임);
    상기 최대(M)는 얻어진 피분석물 수준의 최대 중앙값이고, M은 각각의 상기 피분석물에 대해 얻어진 중앙 피분석물 수준을 포함하는 벡터인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 각각의 상기 최종 중량은 일련의 생물학적 샘플에서 BPH와 CaP를 구별하는 최적화를 위한 판별 함수를 사용하여 결정되는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 판별 함수는 :
    (i) ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적;
    (ii) 진양성률(True Positive Rates, TPR)과 진음성률(True Negative Rates, TNR)의 조합;
    (iii) 제한된 특이도 범위 내에서 ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적;
    (iv) 제한된 민감도 범위 내에서 ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 면적
    중 임의의 하나 이상인, 방법.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 최적화를 위한 판별 함수는 넬더-미드(Nelder-Mead)(단체법), 확률적 방법, 구배 하강법, 확률적 구배 하강법, 유전 알고리즘, 입자 군집(particle-swarm) 방법, 및/또는 억지접근(brute force) 방법 중 임의의 하나 이상인, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 수득된 개별 또는 조합된 피분석물 수준에 적용되는 적합한 알고리즘 및/또는 변환이 하기 식에 따른, 방법:
    S = w1A1 + w2A2 ... wnAn
    (상기 식에서, S는 가중 합이며,
    w는 최종 피분석물 가중치이며,
    A는 n개의 다른 피분석물에서 주어진 피분석물의 수준이거나, 주어진 피분석물 수준을 피분석물 값의 비율 또는 숫자로 변환한 것이다.)
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물 수준들을 조합하는 상기 단계가 BPH와 CaP 샘플들 사이의 구별을 최대화하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 하기의 방식으로 선택하는 단계를 포함하는, 방법:
    (i) BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식; 및/또는
    (ii) BPH와 CaP를 구별할 때 민감도를 증가시키는 방식; 및/또는
    (iii) BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식.
  13. 청구항 12에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 적합한 진양성률 및/또는 진음성률을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수치로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 오 분류 비율을 최소화하는, 방법.
  15. 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 감소시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 단계는 진양성률이 진음성률과 교차하는 지점을 확인함으로써, BPH와 CaP 사이의 오 분류 비율을 최소화하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 민감도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는, 가중합 넬더-미드(Nelder-Mead) 최적화 절차를 사용하여, ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 부분면적(pAUC)을 최적화하는 단계를 포함하며, 상기 pAUC는 값 0과 특정 값(e)(예를 들어, 0.5) 사이의 제한된(1-감도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내는, 방법.
  17. 청구항 12 또는 16에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는 민감도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 상기 민감도를 최대화하는, 방법.
  18. 청구항 12 또는 16에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식으로 상기 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 상기 단계는 상기 특이도를 최대화하는, 방법.
  19. 청구항 12 또는 18에 있어서, BPH와 CaP를 구별하는데 있어서 특이도를 증가시키는 방식으로 조합된 피분석물 수준으로부터 문턱값을 선택하는 단계는 가중합 넬더-미드(Nelder-Mead) 최적화 절차를 사용하여, ROC 분석에 의해 생성된 곡선 아래 부분면적(pAUC)을 최적화하는 단계를 포함하며, 상기 pAUC는 값 0과 특정 값(e)(예를 들어, 0.5) 사이의 제한된(1-민감도) 범위 내에서 ROC 아래 면적을 나타내는, 방법.
  20. 청구항 12, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
    GPC-1/EGF/폴리스타틴; 및
    GPC-1/EGF/TNFα.
  21. 청구항 12, 16, 17, 18 또는 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
    GPC-1/HGF;
    GPC-1/HGF/PAI-1;
    GPC-1/HGF/HuFGFb;
    GPC-1/HGF/EGF;
    GPC-1/HGF/HuPDFGBB;
    GPC-1/EGF;
    GPC-1/PAI-1;
    GPC-1/G-CSF; 및
    GPC-1/PDGFAB.BB.
  22. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2종 이상의 피분석물은 하기 피분석물 조합 중 임의의 하나로부터 선택되는, 방법:
    GPC-1/HGF;
    GPC-1/PAI-1;
    GPC-1/G-CSF;
    GPC-1/EGF;
    GPC-1/PDGFAB.BB;
    GPC-1/HGF/FGFb;
    GPC-1/HGF/PAI-1;
    GPC-1/HGF/EGF;
    GPC-1/HGF/폴리스타틴; 및
    GPC-1/HGF/G-CSF.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 전립선 질병의 양성 지표를 이전에 얻은, 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 디지털 직장 검사(DRE) 및/또는 PSA 검사에 의해 전립선 질병의 양성 지표를 이전에 얻은, 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 단계는:
    (i) 각각의 상기 피분석물 수준을 나타내는 하나 이상의 형광 신호를 측정하는 단계;
    (ii) 샘플내 상기 피분석물의 중량/부피의 측정치를 얻는 단계;
    (iii) 각각의 상기 피분석물 수준을 나타내는 흡광도 신호를 측정하는 단계; 또는
    (iv) 질량 분광법, 단백질 어레이 기술, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동, 방사선표지 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및 대상의 생물학적 샘플에서 피분석물 수준을 얻는 상기 단계는 각각의 상기 샘플을 제1 및 제2 항체 집단과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 각각의 항체 집단은 상기 피분석물 중 하나에 대한 결합 특이도를 가지며, 제1 및 제2 항체 집단은 상이한 결합 특이도를 갖는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 제2 항체 집단이 표지되는, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 표지가 방사선표지, 형광 표지, 비오틴-아비딘 증폭 시스템, 화학발광 시스템, 마이크로스피어 및 콜로이드성 금으로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  29. 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 각 항체 집단과 피분석물의 결합이 면역형광법, 방사선표지, 면역블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 유세포 분석법, 면역침강법, 면역조직화학, 바이오필름 검사, 친화도 링 검사, 항체 배열 광학 밀도 검사, 화학발광법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 검출되는, 방법.
  30. 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및 대상의 생물학적 샘플이 각각 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 눈물, 소변, 또는 조직인, 방법.
  31. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자, BPH를 갖는 상기 대상 집단 및 CaP를 갖는 상기 대상 집단이 인간인, 방법.
  32. 청구항 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및/또는 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 상기 단계는 피분석물을 직접 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 생물학적 샘플 및/또는 대상의 생물학적 샘플에서 2종 이상의 피분석물을 검출하는 상기 단계는 피분석물을 코딩하는 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
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