KR20180026546A - 산 처리 수성 유청 단백질 추출물을 사용하는 알레르기 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유청 단백질 추출물의 제조, 영아용 조제분유 및 음식물 알레르기를 감소 또는 방지하는 것에 관한 것이다. 유청 단백질 추출물은, 유청 단백질 함유 조성물을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계; 이 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계; 및 상기 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 제조하는 단계에 의해서, 유청 단백질 함유 조성물로부터 제조된다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 추출물은 영아용 조제분유, 식이 보충제 또는 식품에 사용될 수 있다.

Description

산 처리 수성 유청 단백질 추출물을 사용하는 알레르기 치료 방법{ALLERGY TREATMENT USING ACID TREATED AQUEOUS WHEY PROTEIN EXTRACT}

본 발명은 유청 단백질 추출물의 제조, 영아용 조제분유 및 음식물 알레르기를 감소 또는 방지하는 것에 관한 것이다.

모유 수유를 받지 않는 영아는 정상적인 성장과 발달을 보장받기 위하여 영양 공급원으로서 영아용 조제분유에 의존해야 한다.

영아용 조제분유는 일반적으로 우유를 주성분으로 한다. 그러나, 영아들 중 약 2% 내지 3%는 우유의 단백질에 대해 알레르기를 일으킨다. 알레르기원에 대한 면역 반응을 조절하는 인자들이 다수 존재하는데, 영아에서 Th1/Th2 균형은 면역 발달에서 중요하며, 조제분유에는 면역 조절 기작을 촉진하고, Th1과 Th2를 분화시키는 시토킨이 결핍되어 있다. 그렇기 때문에, 면역 반응과 면역 발달을 적당히 촉진하는 식이 보충제, 식품 또는 영아용 조제분유에 대한 필요성이 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는, 유청 단백질 함유 조성물로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법을 제공한다:

- 유청 단백질 함유 조성물을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;

- 이 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계; 및

- 상기 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계.

다른 구체예에서, 본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는, 유청 단백질 함유 용액으로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법을 제공한다:

- 유청 단백질 함유 용액 중 불용성 유청 단백질로부터 가용성 유청 단백질을 분리하는 단계; 및

- 상기 가용성 유청 단백질을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계.

다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리된 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 제공한다. 임의의 구체예에서, 상기 추출물은 상기 기재한 방법에 따라서 제조된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 영아용 조제분유, 식이 보충제 또는 식품을 제조함에 있어서, 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물의 용도를 제공한다.

관련 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 포함하는 영아용 조제분유, 식이 보충제 또는 식품을 제공한다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 음식물 알레르기를 방지 또는 최소화하기 위한 의약품을 제조함에 있어서, 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물의 용도를 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기를 방지 또는 최소화하는 방법을 제공한다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 TNF 또는 IL-2의 분비를 감소시키는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 IL-18의 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 장 상피 세포 장벽 기능(intestinal epithelial cell barrier function)을 향상시키는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 Th1 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 Th2 면역 반응을 최소화하는 방법을 제공한다.

본 명세서에 개시되고 정의되어 있는 본 발명은 본문 또는 도면에 언급되어 있거나 이로부터 명백한 각각의 특징 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장됨이 이해될 것이다. 이러한 상이한 조합은 모두 다양한 본 발명의 대안적인 양태를 구성한다.

지금부터 본 발명의 임의의 구체예를 상세히 언급할 것이다. 본 발명은 구체예들과 함께 기술될 것이지만, 이들 구체예로 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다. 대조적으로, 본 발명은 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형물 및 균등물을 포함하는 것으로 의도된다.

당업자는 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 균등한 다수의 방법과 재료를, 본 발명을 수행하는데 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 방법과 재료에 결코 한정되지 않는다.

발명의 상세한 설명에 개시 및 정의된 본 발명은, 본 명세서 또는 도면에 언급되어 있거나 이로부터 명백히 파악할 수 있는 각각의 특징들 중 2개 이상을 대안적으로 조합한 것 전부로 확대될 수 있음이 이해될 것이다. 이와 같은 상이한 조합은 모두 본 발명의 다양한 대안적 양태를 구성한다.

문맥에서 달리 요구하는 경우를 제외하고, 본원에 사용된 용어 "~를 포함하다(comprise)"와 이 용어의 변형어, 예를 들어 "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함한다(comprises)" 및 "~이 포함된(comprised)" 은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명자는 놀랍게도, 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분의 형태인 유청 단백질 추출물은 면역 조절 특성을 가진다는 것을 알아냈다. 특히, 본원에 기술된 시험관 내 연구는, 상기 추출물(다르게는 'I23'으로도 알려짐)이 Th1 반응의 특징인 생물 마커를 증가시키는 반면에, Th2 반응의 마커는 최소화시킴을 보인다. 구체적으로, 이러한 시험관 내 연구는, 상기 추출물이 CD4⁺ T 세포에 의한 IL-2 분비를 감소시키고, IL-18과 TNF의 분비는 증가시킴을 보인다. 중요하게, 본 연구는 상기 추출물이 장 장벽 기능을 향상시킴을 보인다.

뿐만 아니라, 상기 기술한 바와 같이, 본원의 생체 내 연구는, 상기 추출물이 조제분유를 공급받은 알레르기 발생 성향 개체 내 총 혈청 IgE, 항 BLG IgG1 및 비만 세포의 수를 최소화함을 보인다. 또한, 본원의 생체 내 연구는, 상기 추출물이 알레르기 발생 성향 개체의 이유기 중 총 혈청 IgE를 최소화함을 보인다. 이와 같은 관찰 결과는 조제분유 수급 기간 및 이유기 동안 알레르기 발생 성향 개체 내 면역성을 조절함에 있어서 상기 추출물의 유용성을 입증한다.

산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물은 유청 단백질 함유 조성물을 가용화하는 단계 및 이 조성물의 수용성 성분을 산성화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

그러므로 임의의 구체예에서, 본 발명은 유청 단백질 함유 조성물로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:

- 유청 단백질 함유 조성물을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;

- 이 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계; 및

- 상기 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계.

다른 구체예에서, 유청 단백질 추출물은 수용성 유청(예를 들어, 액체 유청)을 산성화시키는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러므로 다른 구체예에서, 본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는, 유청 단백질 함유 용액으로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법을 제공한다:

- 유청 단백질 함유 용액 중 불용성 유청 단백질로부터 가용성 유청 단백질을 분리하는 단계; 및

- 상기 가용성 유청 단백질을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계.

상기 기술한 방법은 산성화된 가용성 유청 단백질을 중화시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다.

'유청'은 일반적으로 우유가 응고될 때 응유(curd) 형성과 함께 형성되는 우유의 묽은 분획 또는 세럼이다. 유청은, 통상적으로 치즈 제조시 응유가 형성될 때 형성된다. 유청은 락토스, 무기질 및 비타민이 풍부하며, 락트알부민과 미량의 지방을 함유한다.

유청은 임의의 포유 동물의 모유, 바람직하게는 소, 염소 또는 양의 모유, 더욱 바람직하게는 우유로부터 생성될 수 있다.

'유청 단백질'은 일반적으로 유청에서 발견되는 단백질이다. 이는 고체, 액체 또는 농축물의 형태로 제공될 수 있다.

'유청 단백질 함유 조성물'은 일반적으로 유청 단백질을 포함하는 조성물이다. 몇몇 구체예에서, 상기 유청 단백질 함유 조성물은 유청 단백질을 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 상기 조성물은 기타 비 단백질 성분, 예를 들어 탄수화물과 지방을 포함할 수 있지만, 이 조성물은 실질적으로 유청에서 발견되지 않는 단백질은 포함하지 않는다. 그 예로서는 유청 단백질 농축물(WPC) 및 유청 단백질 분리물(WPI)을 포함한다. WPC와 WPI, 그리고 이러한 조성물을 제조하는 방법은 본원에 추가로 기술되어 있다.

다른 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 유청에서는 일반적으로 발견되지 않는 단백질들을 포함한다. 그 예로서는 카세인 단백질을 포함한다. 이러한 기타 단백질은 유청 단백질과 함께 첨가되어 유청 단백질 함유 조성물을 형성할 수 있다. 대안적으로, 이와 같은 단백질은 유청 단백질 함유 조성물을 형성할 때 이 조성물 중에 포함될 수 있다. 이와 같이 대안적인 방법으로 형성된 조성물의 예로서는 우유 및 유제품을 포함한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 유청 단백질이 강화될 수 있다. 예를 들어, 유청 단백질은 유청 단백질 함유 조성물에 첨가되어 이 조성물 중 유청 단백질의 상대 함량을 증가시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 비 유청 단백질 또는 기타 비 단백질 성분을 유청 단백질 함유 조성물로부터 제거함으로써, 이 조성물 중 유청 단백질의 상대 함량을 증가시킬 수 있다. 여과법을 비롯한 유청 단백질을 강화시키는 방법에 관한 예는 본원에 추가로 기술되어 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 특정 단백직 종류가 강화될 수 있다. 관심의 특정 단백질 종류는 면역성 조절에 적용되는 것으로서, 특히 알레르기를 최소화하거나 방지하는데 유용한 단백질이다. 그 예로서는 Th2 반응보다는 Th1 면역 반응을 매개하는 경향이 있는 단백질을 포함한다. 일례로서는 TGF 베타가 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 이유기때 포유 동물 개체에 처음 도입된 식이 단백질에 대하여 내성(tolerance)을 유도하는데 유용한 펩티드를 포함할 수 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물의 단백질 성분은 부분적으로 또는 광범위하게 가수 분해될 수 있다. '부분적으로 가수 분해된 유청 단백질 함유 조성물'은 일반적으로 분자량이 일반적으로 5000d 미만인 올리고펩티드를 포함한다. '광범위하게 가수 분해된 유청 단백질 함유 조성물'은 일반적으로 분자량이 3000d 미만인 펩티드를 포함한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 염, pH 완충제, 보존제 또는 항 미생물제를 포함할 수 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 가당 유청, 산성 유청, 락토스 감소 유청(reduced lactose whey), 탈염 유청, WPC 또는 WPI 중 하나 이상을 포함한다.

'가당 유청'은 저온 살균되었으며, 보존제가 첨가되지 않은 체다, 모짜렐라 및 스위스 치즈와 같은 치즈의 제조로부터 얻을 수 있다. 가당 유청 분말은 일반적으로 물을 제외하고, 갓 생성 유청의 모든 성분을 동일한 상대 비율로 포함한다. 통상적으로, 가당 유청 분말은 약 11% 내지 14.5% 단백질, 약 63% 내지 75% 락토스, 약 1% 내지 1.5% 지방, 약 8.2% 내지 8.8% 회분 및 약 3.5% 내지 5% 수분을 포함한다.

'산성 유청'은 저온 살균되었으며, 보존제가 첨가되지 않은 코티지, 크림 치즈 및 리코타와 같은 치즈의 제조로부터 얻을 수 있다. 산성 유청 분말은 물을 제외하고, 원래 산성인 유청의 모든 성분을 동일한 상대 비율로 포함한다. 통상적으로, 산성 유청 분말은 약 11% 내지 13.5% 단백질, 약 61% 내지 70% 락토스, 약 0.5% 내지 1.5% 지방, 약 9.8% 내지 12.3% 회분 및 약 3.5% 내지 5% 수분을 포함한다. 산성 유청은 본원에 기술된 발명에 사용하기 전에 중화될 수 있다.

'락토스 감소 유청'은 유청으로부터 락토스를 선택적으로 제거하거나 가수 분해하여 얻을 수 있다. 건조 제품중 락토스 함량은 60%를 초과할 수 없다. 락토스의 감소는 침전법 또는 여과법과 같은 물리적인 분리 기술, 또는 락토스를 글루코스와 갈락토스로 가수분해하는 효소 가수 분해법에 의해 이루어질 수 있다. 락토스 감소 유청의 산도는 안전하고 적당한 성분들의 첨가에 의하여 조정될 수 있다. 통상적으로, 락토스 감소 유청 분말은 약 18% 내지 24.0% 단백질, 약 52% 내지 58% 락토스, 약 1% 내지 4% 지방, 약 11% 내지 22% 회분 및 약 3% 내지 4% 수분을 포함한다.

'탈염 유청' ('무기물 감소 유청(reduced minerals whey)' 이라고도 칭함)은 저온 살균된 유청으로부터 일정 비율의 무기물을 제거함으로써 얻어진다. 탈염의 통상적인 수준은 25%, 50% 및 90%이다. 건조 제품에서 회분은 7%를 초과할 수 없다. 탈염 유청은 이온 교환법, 정용 여과법 또는 전기 투석법과 같은 분리 기술을 통하여 제조될 수 있다. 탈염 유청의 산도는 안전하고 적당한 성분들의 첨가에 의하여 조정될 수 있다.

WPC는 단백질을 특정 함량으로 포함하는 유청 농축물이다. 일반적으로, WPC34는 단백질이 34% 이상인 농축물을 특정하고, WPC50은 단백질이 50% 이상인 농축물을 특정하며, WPC60은 단백질이 60% 이상인 농축물을 특정하고, WPC75는 단백질이 75% 이상인 농축물을 특정하며, WPC80은 단백질이 80% 이상인 농축물을 특정한다. 이와 같은 농축물은 저온 살균된 유청을 한외 여과하고 나서, 이 잔류물을 회수한 다음, 상기 잔류물을 농축 및 분무 건조하여 WPC34 및 WPC50 분말을 형성하거나; 아니면, 상기 잔류물을 정용 여과하고 나서, 농축 및 분무 건조하여 WPC50, WPC60, WPC75 또는 WPC80을 형성함으로써 제조될 수 있다.

WPI는 유청으로부터 충분한 양의 비 단백질 구성 성분을 제거하여 최종 완성된 건조 제품이 단백질을 90% 이상으로 함유하도록 함으로써 얻어진다. WPI는 막 분리 방법 또는 이온 교환법에 의하여 제조된다. 하나의 예에서, 저온 살균된 유체 유청을 정밀 여과하여 지질을 제거하고, 이후 정용 여과를 사용하여 투과물과 유청 단백질 분리물을 형성하며, 그 다음에 상기 유청 단백질 분리물을 농축하고 분무 건조함으로써 WPI 분말을 형성한다. 다른 예에서, 저온 살균된 유체 유청에 이온 교환 단백질 분리법을 수행하여 유청으로부터 단백질을 분리한 다음,흡착 유청 단백질을 탈착시키고, 이를 한외 여과하거나 또는 추가로 이온 교환법을 수행하여 무기물을 제거한다. 그 다음, 이렇게 형성된 유청 단백질 분리물을 농축 및 분무 건조시켜 WPI 분말을 형성한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물 중 단백질 함량은 건조 중량을 기준으로 하여 적어도 약 10%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 10%w/w 내지 약 90%w/w 미만이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 11%w/w 내지 약 25%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 11%w/w 내지 약 18%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 18%w/w 내지 약 25%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 34%w/w 내지 약 80%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 50%w/w 내지 약 75%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 50%w/w 내지 약 60%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 60%w/w 내지 약 75%w/w이다.

하나의 구체예에서, 단백질 함량은 약 90%w/w 내지 약 95%w/w이다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 탄수화물(예를 들어, 락토스) 및 지방 중 적어도 하나를 포함한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물 중 락토스 함량은 건조 중량을 기준으로 하여 적어도 약 1%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 1%w/w 내지 약 80%w/w 미만이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 63%w/w 내지 약 75%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 61%w/w 내지 약 70%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 52%w/w 내지 약 58%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 70%w/w 내지 약 80%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 48%w/w 내지 약 52%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 33%w/w 내지 약 37%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 25%w/w 내지 약 30%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 10%w/w 내지 약 15%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 4%w/w 내지 약 8%w/w이다.

하나의 구체예에서, 락토스 함량은 약 0.5%w/w 내지 약 1.0%w/w이다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물 중 지방의 함량은 건조 중량을 기준으로 하여 적어도 약 0.5%w/w이다.

하나의 구체예에서, 지방의 함량은 약 0.5%w/w 내지 약 10%w/w 미만이다.

하나의 구체예에서, 지방의 함량은 약 1%w/w 내지 약 5%w/w이다.

하나의 구체예에서, 지방의 함량은 약 5%w/w 내지 약 7%w/w이다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 단백질을 약 80%w/w 내지 82%w/w, 락토스를 약 4%w/w 내지 8%w/w, 그리고 지방을 약 4%w/w 내지 8%w/w 포함한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 WPC이다.

하나의 구체예에서, 상기 WPC는 WPC80이다. 기타 WPC는 WPC34, WPC50, WPC60 및 WPC75를 포함한다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 수용액과 접촉하기 위한 분말의 형태로 제공된다.

'수성 용매'라고도 불리는 '수용액'은 유청 단백질을 완전히 또는 부분적으로 용해하는데 사용될 수 있는, 물을 주성분으로 하는 성분이다. 수용액은 정제수, 증류수 또는 멸균수를 포함한 물일 수 있다. 수용액은 생리적으로 허용 가능한 염을 함유할 수 있다. 이와 같은 염 함유 용액의 예로서는 염수를 포함한다. 수용액은 pH 완충제 또는 보존제 또는 항 미생물제를 함유할 수 있다.

'수용성 단백질 함유 성분' 또는 '분획'은 일반적으로 수성 용매 중에 완전히 또는 부분적으로 용해된 단백질을 함유하는 샘플의 성분 또는 분획이다. 이를 '수성 가용화 단백질 함유 성분' 또는 '수성 가용화 단백질 함유 분획'이라고도 칭할 수 있다. 수성 용매 중에 완전히 용해되는 단백질은 용액 중 일정한 형태를 취하여, 용액과의 접촉을 피하여 소수성 또는 비극성 측쇄 및 측기가 단백질 내부로 매립되고, 극성 또는 친수성 측쇄는 용매와 접촉하기 위해서 단백질 표면에 노출되는 경향이 있다. 수성 용매 중에 부분적으로 용해되는 단백질은 용액 중 일정한 형태를 취하여, 단백질 표면에 존재하는 소수성 측쇄 또는 측기 중 일부가 용매에 노출될 수 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 가용화 단백질 함유 성분의 생성을 향상시키는 조건 하에서 수용액과 접촉한다. 예를 들어, 이 용액과 상기 조성물의 혼합물은 공지의 방법을 사용하여 휘젓거나 교반될 수 있다. 온도는 완전 또는 부분적 가용화를 향상시키도록 조정될 수 있다. 이 가용화를 보조하는 하나 이상의 제제가 상기 혼합물에 첨가될 수 있다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 수용액과 접촉하기 위해서 유청 단백질 함유 조성물이 적어도 약 0.5%w/w의 양으로 제공된다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 약 0.5%w/w 내지 10%w/w의 양으로 제공된다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 약 0.5%w/w 내지 7%w/w의 양으로 제공된다.

하나의 구체예에서, 유청 단백질 함유 조성물은 약 5%w/w 내지 6%w/w의 양으로 제공된다.

본 방법에서의 출발 물질 또는 공급 물질을 형성하는 유청 단백질 함유 조성물에 따라서, 성분 중에 기타 우유 유래 단백질이 또한 있을 수 있지만, 통상적으로 성분 중에 완전히 또는 부분적으로 가용화되어 있는 단백질은 유청 단백질이다.

본 방법에서 형성된 성분인 '불용성 성분'은 일반적으로 단백질, 지방 또는 회분을 포함한다. 일반적으로, 수용액을 휘젓거나, 교반하거나 또는 온도를 조정할 때 불용성 성분은 용해되지 않는다.

일반적으로 유청 단백질 함유 조성물이 용액의 양에 대하여 다량의 조성물로 제공되는 경우, 다량의 불용성 성분이 형성된다.

일반적으로 상기 불용성 성분은 페이스트와 같은 조직을 가지며, 색상은 백색이거나 희끄무레한 색이다.

일반적으로 불용성 성분은 유청 단백질 함유 성분이 수성 용매와 접촉하는 용기의 바닥에 침강된다. 침강은 원심 분리를 행하여 또는 행하지 않고 일어날 수 있다.

가용화된 단백질 함유 성분은 불용성 고체로부터 가용화된 단백질 함유 성분을 분리함으로써 회수될 수 있다. 일반적으로 실질적으로 모든 가용화 단백질 함유 성분이 회수된다. 몇몇 구체예에서, 실질적으로 모든 가용화 단백질 함유 성분이 불용성 고체로부터 분리된다. 가설에 의해서 한정되는 것을 원하는 것은 아니지만, 불용성 성분이 Th1 면역 반응을 저해하거나 장벽 기능을 손상시키는 분자를 함유할 수 있으므로, 수용성 성분으로부터 이 불용성 성분을 분리하는 것은 중요한 것으로 여겨진다.

분리 과정은 다단계 방법 중 하나의 단계일 수 있다.

고체로부터의 상청액과 같은 완전히 또는 부분적으로 가용성인 분획을 분리하는 것에 대한 유가공 업계에 공지된 임의의 수의 기술이 불용성 고체로부터 가용화 단백질 함유 성분을 분리하는데 사용될 수 있다. 이의 예로서는 디캔팅(decanting), 원심 분리법, 크로마토그래피(이온 교환, 겔 여과, HPLC, RP-HPLC, 친화성 크로마토그래피), 전기 투석법, 여과법 또는 흡착법을 포함한다.

통상적으로 가용화 단백질 함유 성분은 가용화 단백질 함유 성분의 pH를 적어도 약 2.5, 바람직하게는 pH 약 3 내지 6.0, 더욱 바람직하게는 약 3.0 내지 5.5, 3.5 내지 5.0으로 제공함으로써 산성화된다.

가설에 의해서 한정되는 것을 원하는 것은 아니지만, 산성화 단계는 LAP 펩티드를 제거함으로써 수용성 성분 중 TGF 베타를 활성화시키는 것으로 여겨진다.

산성화 단계는, 통상적으로 산이 가용화 단백질 함유 성분에 제공되는 경우 샘플로부터 가용화 단백질 함유 성분을 회수한 후에 수행될 수 있지만, 상기 회수 단계 전에도 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

따라서, 본 발명은 다음과 같은 단계들을 다음과 같은 순서로 포함하는, 유청 단백질 함유 조성물로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법을 제공한다:

- 유청 단백질 함유 조성물을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;

- 이 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계; 및

- 상기 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하여 유청 단백질 추출물을 제조하는 단계.

통상적으로 가용화 단백질 함유 성분은 이 가용화 단백질 함유 성분의 pH를 약 6.5~7.5, 바람직하게는 약 7로 제공함으로써 중화된다.

중화 단계는 일반적으로 샘플로부터 가용화 단백질 함유 성분을 회수하고 산성화한 후에 수행되지만, 샘플로부터 가용화 단백질 함유 성분을 회수하기 전에도 수행될 수 있다.

상기 기술한 유청 단백질 추출물은 액체 형태 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 통상적으로 상기 추출물은 고체 형태, 예를 들어 분말로 제공된다. 그러므로 임의의 구체예에서, 상기 기술한 방법은 가용화 단백질 함유 성분을 건조시켜 분말을 얻는 추가의 단계를 포함한다. 적당한 건조 방법에 관하여는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 증발법, 예를 들어 진공 농축법, 분무 건조법, 롤러 및 드럼 건조법이 그 예이다.

산 처리된 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물, 예를 들어 상기 기술한 방법에 의해 형성된 추출물은 사용전 추가로 가공 또는 변형될 수 있다. 다음과 같은 방법 또는 이의 변형 중 어느 하나가 적용될 수 있다:

- 예를 들어, 본원에 추가로 논의된 막 여과 기술을 사용하는, 유청 단백질의 강화, 농축 또는 분획화;

- 추출물 중에 함유된 단백질을 부분적으로 또는 광범위하게 가수 분해하는 효소 가수 분해;

- 예를 들어, 본원에 추가로 논의된 전기 투석 기술을 사용하는, 무기물 또는 회분의 제거;

- 본원에 추가로 기술된 크로마토그래피 또는 결정화 기술을 사용하는, 비 단백질 성분의 제거;

- 면역 조절 분자, 예를 들어 TGF 베타의 첨가;

- 이유기 중 새로이 섭취한 식이 단백질에 대하여 내성을 유도하는데 유용한 펩티드 항원의 첨가;

- 추가 건조;

- 과립의 분립.

막을 이용하는 기술, 예를 들어 역 삼투압법, 나노 여과법, 한외 여과법 그리고 정밀 여과법은 반투과성 막을 사용하고, 펌프와 밸브의 조합이 사용하여 유청 중 크기가 작은 분자가 이 막을 통과하도록 만드는 압력 구배를 막을 경계로 형성함으로써, 상기 막을 통과할 수 없는, 크기가 큰 분자와 입자를 농축하는, 압력에 의해 진행되는 분리 단계를 포함할 수 있다. 선택적 분리 또는 농축 단계는 공극의 크기가 상이하거나 분자량 컷오프가 상이한 막을 사용하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 막의 예로서는 역 삼투압법(RO), 나노 여과법(NF), 한외 여과법(UF) 및 정밀 여과법(MF)에 사용되는 막을 포함한다. FR 막은 공극의 크기가 가장 작아서 물만이 이 막을 통과할 수 있으며, 이 때, 유청의 다른 성분들은 모두 남게 된다. RO 막의 일반적인 용도는 물의 담수화이다. 이와 같은 막은 일반적으로 염을 거부하는 막의 능력에 따라서 등급이 매겨진다. 진공 농축법과 유사하게, RO 시스템은 유청의 고체 성분 비율을 바꾸지 않고, 오히려 물만을 제거함으로써 고체 성분을 농축시킨다. RO에 의한 유청 농축의 정도는, 물이 제거되었을 때 유청의 점도와 삼투압의 증가에 의해 제한된다.

나노 여과막은 때때로 "성긴(loose)" RO 막이라고 칭하기도 한다. NF 막은 일부 1가 이온이 물과 함께 이 막을 통과하게 만들어, 유청의 부분 "탈염"이 이루어지게 한다. NF 막은 전하가 1가인 무기물만을 제거하기 때문에, NF 막은 유청의 무기물 함량을 약간만 감소시킨다. NF 막은 몇몇 유형의 유청 중 염화나트륨 함량을 감소시키는데 사용될 수 있다.

한외 여과막은 RO 막이나 NF 막보다 공극이 크다. UF 막은 유청 중 락토스와 회분은 투과시키는 반면에 유청 중 단백질은 체류시켜, UF 막이 WPC 제조를 위한 표준적인 도구가 되게 한다. 제거되는 락토스와 회분의 양이 많을수록, WPC 중 단백질 함량은 높아지게 된다. 단백질 농축물이 증가함에 따라 유청의 점도는 증가하므로, 정용 여과라고 알려진 방법에 있어서 단백질이 50% 초과인 WPC를 제조할 때 과량의 락토스 및 무기물을 씻어내기 위해 잔류물에 물을 첨가할 필요가 있다.

정밀 여과 막은 막 분리 방법에 사용되는 막 중 공극의 크기가 가장 크다. 이 공극보다 작은 가용성 단백질, 펩티드, 락토스, 무기물, 비 단백질 질소 성분, 그리고 물은 MF 막을 용이하게 투과한다. 지방 입자는 MF 막에 의해 체류되므로, 이 막은 원심 분리에 의해 회수되지 않는 소량의 지방을 제거하는데 사용될 수 있다. WPI를 제조하기 위해서는 미량의 지방을 제거하여야 한다.

전기 투석법도 또한 반투과성 막을 사용하지만, 유청 성분을 분리하는 구동력으로서 압력 대신 전류를 사용한다. 전기 투석 막은 무기물만을 투과시키고, 락토스와 단백질은 체류시키게 된다. 전류는 전하를 띠는 무기물 이온이 막을 통과하도록 만들고, 이 이온을 브라인 스트림으로 보낸다. 락토스는 전류에 의해 이동하지 않으며 단백질은 이 막을 통과하지 못한다. 전기 투석법은 유청 단백질을 변성시키지 않지만, 유청 중 무기물을 75%까지 제거한다.

이온 교환법은 크로마토그래피의 일종이다. 예를 들어, 탈염 유청을 제조할 때, 유청은 유청 중 이온(하전된 무기물)과 결합하는 흡착제 비드를 함유하는 컬럼을 통과한다. 나머지 유청 성분, 예를 들어 단백질과 락토스는 방해받지 않는(unhindered) 컬럼을 통과한다. 그러므로, 생성된 유청은 미처리 유청에 비하여 무기물 함량이 감소할 것이다. 이온 교환법은 단백질을 변성시키지 않으며, 유청 중 무기물을 98%까지 제거할 수 있다.

크로마토그래피법에서는 유청 중 단백질을 다른 성분들과 분리하기 위해 하전된 수지를 사용한다. 단백질은 반대의 전하로 하전된 수지와 결합하는 반면, 락토스와 같은 성분들은 이 수지와 결합하지 않고 이 시스템을 바로 통과한다. 유청이 수지를 함유하는 컬럼 또는 탱크를 통과한 후에, 이 시스템으로 완충액을 통과시켜 결합된 단백질을 분비시킨다. 단백질은 UF에 의해 추가 정제된 후 분무 건조될 수 있다.

크로마토그래피는 또한 유청 중의 다른 단백질과 특정 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 락토페린과 락토퍼옥시다제는 가당 유청에 통상적인 pH에서 양으로 하전된다. 유청을 이루는 주요 단백질인, 알파-락탈부민, 베타-락토글로불린 및 소 혈청 알부민은 동일한 pH에서 음으로 하전된다. 유청이 음으로 하전된 수지를 함유하는 탱크를 통과할 때, 양으로 하전된 락토페린과 락토퍼옥시다제는 이 수지와 결합하는 반면, 기타 단백질 및 유청 성분은 이 컬럼을 통과한다. 이후 알칼리 용액을 이 컬럼에 통과시켜 결합된 단백질을 수지로부터 분비시킨다. 그 다음, 회수된 단백질은 세정 및 분무 건조될 수 있다.

결정화는 락토스 또는 비 흡습성 유청/투과물 분말 중 어느 하나를 제조하는데 사용된다. 락토스가 과포화되어, 농축 유청/투과물이 냉각될 때 락토스가 용이하게 결정화될 경우, 유청 또는 투과물은 증발법에 의해 총 고체 함량이 적어도 50%가 되도록 농축된다. 유청/투과물을 충분히 냉각한 후, 고품질 락토스로의 추가 가공을 위하여 락토스 결정은 분리될 수 있거나, 또는 결정화된 락토스를 포함하는 유청/투과 용액을 건조하여 비 흡습성 유청/투과물 분말을 제조할 수 있다.

베타-갈락토시다제 효소를 유청에 첨가하여, 이당류인 락토스를 이것의 구성 성분인 단당류, 글루코스 및 갈락토스로 가수 분해할 수 있다. 락토스 가수 분해 정도를 제어하기 위해 시간과 온도를 사용한다.

프로테아제는 단백질을 가수 분해하기 위해 유청에 첨가되는 효소이다. 단백질 가수 분해의 유형과 정도를 제어하기 위해 첨가된 프로테아제 유형, 시간 및 온도를 사용한다.

원칙적으로, 가수 분해에 의한 단백질 변형은 중합의 반대이다. 프로테아제는 단백질 분자의 펩티드 결합을 분해하여, 크기가 더 작은 펩티드와 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 효소의 가장 일반적인 그룹이다. 가수 분해 정도, 즉 유청 단백질이 가수 분해되는 정도는 음식물 성분인 가수 분해물의 기능성에 영향을 미칠 것이다.

유청 단백질은 열에 의해 변성되어 자체의 기능성이 변성될 수 있다. 유청 단백질의 변성양을 제어하기 위해 시간과 온도의 조합을 사용한다. 제어된 변성 과정은 종종 예열 처리 동안에 이루어진다. 변성된 유청 단백질의 양은 유청 단백질 질소 지수에 의해 측정될 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 영아용 조제분유, 성장기용 조제분유(follow on formula), 식이 보충제 또는 식품의 제조를 위한 상기 기술된 추출물의 용도를 제공한다.

영아용 조제분유는 일반적으로 모유 대신에 신생아 개체에 주어지는 영양 조성물이다. 영아용 조제분유는 약 4개월 내지 6개월인 개체에 주어질 수 있다.

성장기용 조제분유는 일반적으로 약 6개월 이상인 개체에 주어지는 영양 조성물이다.

상기 조제분유는 임의의 적당한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 조제분유는 본원에 기술된 유청 단백질 추출물과 기타 영양 성분들, 예를 들어 탄수화물 공급원 또는 지방 공급원을 적당한 비율로 배합하여 제조될 수 있다. 만일 유화제를 사용한다면, 이 유화제는 이 시점에서 포함시킬 수 있다. 기타 성분, 예를 들어 면역 조절 분자, 비타민 및 무기물은 이 시점에 첨가될 수 있지만, 보통 상기 성분들이 열 분해되는 것을 막기 위해서 후반부에 첨가된다. 임의의 친지성 비타민과 유화제 등은 배합하기 전에 지방 공급원에 용해할 수 있다. 그 다음, 물, 바람직하게는 역 삼투법을 거친 물을 혼합하여 액체 혼합물을 형성할 수 있다. 이때 상기 성분들의 분산을 돕기 위한 물의 온도는 편리하게는 약 50℃ 내지 약 80℃이다. 시판중인 액화제를 사용하여 액체 혼합물을 형성할 수 있다. 이후, 액체 혼합물을, 예를 들어 2 단계로 균질화한다.

이후, 액체 혼합물은, 이 액체 혼합물을 예를 들어 약 5초 내지 약 5분 동안, 약 80℃ 내지 약 150℃ 범위의 온도로 급속 가열함으로써 열 처리하여 박테리아 수가 감소시킬 수 있다. 이 과정은 증기 주입법, 고압 살균법 또는 열 교환법, 예를 들어 평판 열 교환기 사용에 의해 수행될 수 있다.

그 다음, 액체 혼합물은, 예를 들어 플래쉬 냉각법(flash cooling)에 의해 약 60℃ 내지 약 85℃로 냉각될 수 있다. 이 후, 액체 혼합물은 예를 들어 2 단계(1 단계: 약 10Mpa 내지 약 30MPa; 2 단계: 약 2Mpa 내지 약 10Mpa)로 다시 균질화될 수 있다. 그 다음, 상기 균질화된 혼합물을 추가로 냉각하여 임의의 열 감수성 성분, 예를 들어 비타민과 무기물을 첨가할 수 있다. 균질화된 혼합물의 pH와 고체 함량은 이 시점에서 조정하는 것이 편리하다.

균질화된 혼합물은 적당한 건조 기구, 예를 들어 분무 건조기 또는 동결 건조기로 옮긴 후 분말로 전환된다. 이 분말은 수분 함량이 약 5중량% 미만이어야 한다.

만일 액체 제품이 바람직하다면, 균질화된 혼합물은 멸균된 후 적당한 용기에 무균 상태로 충전될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제품은 예를 들어 열 처리를 통하여 유통 기한을 연장시키는 방식으로 처리될 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 상기 기술한 추출물을 포함하는 영아용 조제분유, 식이 보충제 또는 식품을 제공한다.

조제분유는 탄수화물 공급원을 함유할 수 있다. 바람직한 탄수화물 공급원은 락토스이지만, 통상적으로 영아용 조제분유 중에서 확인할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원, 예를 들어 락토스, 사카로스, 말토덱스트린, 전분 및 이의 혼합물이 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 탄수화물 공급원은 조제분유 총 에너지의 35% 내지 65%에 기여한다.

본 발명에 의한 성장기용 조제분유는 지질 공급원을 함유할 수 있다. 지질 공급원은 영아용 조제분유에 사용하기 적당한 임의의 지질 또는 지방일 수 있다. 바람직한 지방 공급원은 팜 올레인, 올레산 함량이 높은 해바라기유 및 올레산 함량이 높은 홍화유를 포함한다. 전성 아라키돈산과 도코사헥사에논산, 예를 들어 생선 오일 또는 미생물 오일을 다량으로 함유하는 오일을 소량으로 사용할 수 있기 때문에, 필수 지방산 리놀레산 및 α-리놀렌산도 첨가될 수 있다. 전체적으로, 지방 함유물은 조제분유 총 에너지의 30% 내지 55%에 기여하는 것이 바람직하다. 지방 공급원은 n-6 대 n-3 지방산 비율이 약 5:1 내지 약 15:1, 예를 들어 약 8:1 내지 약 10:1인 것이 바람직하다.

성장기용 조제분유는 또한 매일 섭취하는 식품에 필수적인 것으로 생각되는 모든 비타민과 무기물을 영양학적으로 상당량 함유할 수도 있다. 임의의 비타민과 무기물에 대한 최소 필요량은 확립되어 있다. 영아용 조제분유 중에 임의로 존재하는 무기물, 비타민 및 기타 영양소의 예로서는 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 C, 비타민 D, 엽산, 이노시톨, 니아신, 비오틴, 판토텐산, 콜린, 칼슘, 인, 요오드, 철, 마그네슘, 구리, 아연, 망간, 염화물, 칼륨, 나트륨, 셀레늄, 크롬, 몰리브덴, 타우린 및 L-카르니틴을 포함한다. 무기물은 보통 염의 형태로 첨가된다. 특정 무기물과 기타 비타민의 존재 및 함량은 대상 영아군에 따라서 달라질 것이다.

필요하다면 조제분유는 유화제 및 안정화제, 예를 들어 대두 레시틴, 모노-글리세라이드 및 디-글리세라이드의 시트르산 에스테르 등을 함유할 수 있다.

조제분유는 유리한 효과를 나타낼 수 있는 기타 물질, 예를 들어 락토페린, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 등을 임의로 함유할 수도 있다.

마지막으로, 조제분유는 소화가 잘 안되는 올리고당, 예를 들어 갈락토올리고당을, 예를 들어 0.3% 내지 7%의 함량으로 함유할 수 있다.

조제분유의 예에 관하여는 문헌[Koletzko B et al. 2005 J. Pediatric Gastroenterol Med. 41:584-599]에 논의되어 있다.

임의의 구체예에서, 추출물은 개체 체중 1㎏ 당 2.3g의 함량으로 개체에 제공된다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 영아용 조제분유, 성장기용 조제분유, 식이 보충제 또는 식품, 그리고 산성 유청을 함유하는 조제분유, 보충제 또는 식품을 제조함에 있어서 산성 유청의 용도를 제공한다. 이러한 구체예에서, 산성 유청은, 본원에 기술된 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 효과적으로 대체한다. 이와 같은 구체예에서, 산성 유청은 사용전에 중화할 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 음식물 알레르기를 방지하거나 최소화하기 위한 의약품을 제조함에 있어서 본원에 기술된 추출물의 용도를 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기를 방지하거나 최소화하는 방법을 제공한다. 통상적으로 개체는 사람이다. 통상적으로 사람은 알레르기 소인이 있다. 통상적으로 사람은 신생아이다. 통상적으로 신생아는 약 2세 미만이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 청구항 48의 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 TNF 또는 IL-2의 분비를 감소시키는 방법을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 청구항 48의 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 IL-18의 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 장 상피 세포 장벽 기능을 향상시키는 방법을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 Th1 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 추출물을 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 Th2 면역 반응을 최소화하는 방법을 제공한다.

상기 기술한 방법에 있어서, 산성 유청은 본원에 기술된 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물을 효과적으로 대체할 수 있다.

도 1은 추출물(I23)로 처리한 후 RAW 세포로부터 TNF 알파 분비의 억제를 나타낸다.
도 2는 추출물(I23)로 처리한 후 THP-1 세포로부터 IL-18 분비의 향상을 나타낸다.
도 3은 추출물(I23)로 처리한 후 1차 CD4+ T 세포로부터 IL-2 분비의 억제를 나타낸다.
도 4는 CD4 T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 추출물(I23)의 효과를 나타낸다.
도 5는 CD3 및 CD28 자극 후 CD4 T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 (산성화 또는 중성) 추출물(I23)의 효과를 나타낸다.
도 6은 중성 또는 산성화 추출물(I23) 또는 락토페린으로 처리한 후 T84 세포의 경 상피 내성(trans epithelial resistance)을 나타낸다.
도 7은 중성 추출물(중성 I23) 또는 산 활성화 추출물(산성화 I23) 중 어느 하나로 처리한 후 T84 세포의 경 상피 내성을 나타낸다.
도 8은 1/8 또는 1/12로 희석한 추출물(I23)을 조제분유의 형태로 투여하거나 매일 3회씩 볼루스 투여 방식으로 처리한 후 혈청 IgE 를 나타낸다.
도 9는 1/8 또는 1/12로 희석한 추출물(I23)을 매일 3회씩 조제분유의 형태로 투여하거나 볼루스 투여 방식으로 처리한 후 BLG 특이적 IgG1 농도를 나타낸다(이상치 포함; x로 표시).
도 10은 1/8 또는 1/12로 희석한 추출물(I23)을 매일 3회씩 조제분유의 형태로 투여하거나 볼루스 투여 방식으로 처리한 후 혈청 RMCPII 농도를 나타낸다.
도 11은 1/8 또는 1/12로 희석한 추출물(I23)을 매일 3회씩 조제분유의 형태로 투여하거나 볼루스 투여 방식으로 처리한 후 점막 고유층 1㎟ 당 비만 세포의 수를 나타낸다.
도 12는 1/8 또는 1/12로 희석한 추출물(I23)을 매일 3회씩 조제분유의 형태로 투여하거나 볼루스 투여 방식으로 처리한 후 장 내 IL-10 (A), IFN 감마 (B) 및 IL-4 (C)를 나타낸다.
도 13은 이유 연구(weaning study) 결과를 나타낸다. 혈청 BLG 특이적 IgG1 (A), IgE (B) 및 RMCPII (C). 제4일에 추출물(I23) 위관 영양 실험을 개시하였으며, 제14일에는 BLG 경구 투여를 개시하였다.

이하 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지, 결코 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1: 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분을 포함하는 유청 단백질 추출물의 제조

200ml H₂O를 WPC 80 12g에 첨가하고, 이것이 용해될 때까지 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이 용액을 16000g에서 10분 동안 원심 분리하여 용해되지 않은 고체를 제거하였다. 상청액을 분리해낸 다음, 여기에 10N HCl 1.335ml를 첨가하여 산성화하였다(30분). 10M NaOH 1.555ml를 첨가하여 이와 같이 산성화된 용액을 중화하였다(측정된 pH 약 7.0). 최종 용액을 0.45um 필터에 통과시켜 여과한 후, 다시 0.2um 필터에 통과시켜 멸균하였다. 6% 용액을 실험용 스톡 용액으로 사용하였다[즉, 스톡 용액은 조제분유에서 1/8 또는 1/12로 희석됨].

실시예 2: 산 처리 수용성 유청 단백질 함유 성분의 시험관 내 면역 조절 활성

실시예 1에서 형성된 추출물(I23)을 다수의 세포계 검정법으로 시험관 내 면역 조절 활성에 대하여 테스트하였다. 추출물을 분취하여 96웰 평판에 나누어 넣은 후 신속 세포계 스크리닝 검정법으로 스크리닝하였다.

도 1의 데이터는 시험관 내에서 대식 세포 세포주인 RAW 세포에 의한 TNF 알파(Th1 시토킨)의 분비를 나타낸다. I23은 RAW 세포 내에서 TNF 알파의 생산을 촉진하였다(도 1의 3번 분획 참조).

IL-18은 시토킨의 주변 환경에 따라서 Th1(염증) 또는 Th2(알레르기) 중 어느 하나로 T 세포를 발달시키는 초기 주요 면역 조절 시토킨이다. 본 발명자들은 또한 리포다당류(LPS)에 의해 THP1 세포(단핵구 세포주)를 자극하거나 자극하지 않으면서, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 첨가한 후의 IL-18 분비에 관하여도 평가하였다. 대조군 세포는 인산염 완충 염수(PBS) 중에 넣어두었다. 분획 I23은 THP1 세포로부터 IL-18의 생산을 촉진하였다(도 2의 3번 분획 참조).

IL-2는 T 세포 활성화에 필수적이며 면역 반응 유도에 중요한 역할을 하는 시토킨이다. 본 발명자들은 TGR 바이오사이언시스(TGR Biosciences) 1차 T 세포 검정법으로 I23이 IL-2 분비에 영향을 미치는 능력에 대해 평가하였다. MACS 자성 비드 기술(밀테니 피티와이 사(社)(Miltenyi Pty. Ltd))을 사용하여 T 세포를 말초 혈액으로부터 정제하였다(아델라이드 소재, 적십자 혈액 은행으로부터 버피 코트 함유 백혈구를 입수함). CD4⁺ T 세포를 간접적으로 정제하였다. 처음에, 원치 않는 세포(즉, CD 8⁺ 림프구, 대식 세포 및 B 세포 등)를 관련 세포 표면 마커에 대한 항체와 접합한 자성 비드로 표지화하였다. 이후, 표지화한 세포를 MACS 자성 컬럼에 통과시켰는데, 이 때 원치 않는 세포는 컬럼 유출액과 함께 컬럼을 통과하는 CD4⁺ T 세포와 결합하였다. 이러한 CD4⁺ T 세포를 세정한 다음 PMA와 항온 처리하여 시토킨 생산용 세포와 라이브러리 중 우유 분획을 자극하였다. IL-2의 분비는 ELISA에 의해 평가하였다(도 3 참조).

사람 CD4⁺ T 세포의 유사 분열 촉진 활성화를 통해 입증된 바와 같이, I23(도 3의 3번 분획)은 시험관 내에서 IL-2 시토킨의 분비를 저해한다. PMA 자극 후 IL-2 분비는 투여량 의존성이었다. IL-2 생산의 I23에 의한 단기 및 장기 저해 현상은, 밤새(O/N) 항온 처리하거나, 1시간 동안 펄스 처리하여 평가하였다(도 4 참조).

본 발명자들은 시험관 내 면역 조절 활성을 나타내는 4개의 잠재 분획을 확인하였다. IL-2 분비에 의해 측정된 바와 같이, 도 4의 I23 분획은 T 세포 활성화의 투여량 의존성 억제를 유도하였다. 상기 분획과 함께 24시간 동안 항온 처리한 T 세포와, 짧게는 1시간 동안 펄스 처리한 T 세포에서는 IL-2의 억제가 일어난다.

I23의 존재 하에, 정제한 사람 CD4⁺ T 세포를 밤새 PHA 및 PMA로 자극하였다. I23 농도의 감소가 IL-2 분비를 증가시키는, 투여량 범위 한정 연구법(dose ranging study)에서 명백한 바와 같이, I23은 분명히 IL-2 분비를 억제한다. I23의 최대 저해 수준은 자극되지 않은 세포와 공지의 면역 저해제인 덱사메타손(DEX)의 최대 저해 수준과 거의 비숫하였다. 생체 내에서 활성화될 T 세포에 있어서, 항원이 T 세포 수용체에 제시되고, 공동 자극 분자가 활성화되어 T 세포를 활성화시키고, 시토킨을 분비한다. 면역 조절 활성을 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체(공동 자극 분자에 대한 항체)를 사용하여, T 세포 수용체 세포를 통해 CD4⁺ T 세포를 자극한 후, IL-2 분비의 억제를 평가하였다. 이와 같은 활성화 프로토콜은, CD4⁺ T 세포를 PHA/PMA로 비 특이적 유사 분열 촉진 자극하는 것과 비교하여, 생체 내에서는 자연적으로 일어나는 것을 모의하는 것으로 설정하였다. I23은 항 CD3 항체와 항 CD28 항체로 활성화한 CD4⁺ T 세포에 의한 IL-2 분비를 저해한다(도 5 참조).

본 발명자들은 T84 세포 상피 장벽 기능 검정법(TGR 바이오사이언시스)을 사용하여 우유 분획(I23)의 시험관 내 효과를 평가하였다. I23은 시험관 내 면역 억제 활성을 나타냈으며, 본 발명자들은 이 장벽 기능 검정법에 산 활성화 및 중성 I23 및 I29를 포함시켰다. 산 활성화 및 중성 I23의 존재 및 부재 하의 배양액 중에서 T84 장 상피 세포 내 경 상피 내성(TER)을 측정하였다(도 6 참조). I23과 이의 TER에 대한 영향력에 관하여 도 7에 자세히 그래프로 나타내었다. TER의 감소는 세포의 장벽 기능의 감소를 나타낸다.

도 6의 데이터는, 중성 형태 또는 산성화된 형태의 I23이 배양 후 1일 또는 2일 경과한 상피 세포 장벽에 유해한 효과를 나타내지 않음을 보여준다(도 6 및 도 7 참조). 그러나, TER 검정법에서 세포의 장벽 기능은 유의하게 증가하였다.

면역 반응이 Th2형에서 Th1형으로 변할 때 우유 알레르기가 있는 영아를 대상으로 알레르기를 분석하였다. I23은 또한 THP1 세포로부터 Th1 시토킨 IL-18의 생산을 촉진하였다(도 2, 3번 분획 참조). 그러므로, 본 발명자들은 브라운 노르웨이 래트(Brown Norway rat)의 새끼를 대상으로 I23을 사용하는 생체 내 실험을 수행하였다.

실시예 3: 산 처리된 수용성 유청 단백질 함유 성분의 생체 내 면역 조절 활성

알레르기 성향 브라운 노르웨이 래트 새끼를 사용하여 생체 내 실험을 수행하였다. 산으로 활성화된 I23을 조제분유와 혼합하여 연속 주입법으로 위에 주입하였거나, 또는 0.1ml 볼루스로 위에 주입하였다(1일 3회씩). 그룹 당 8 마리를 대상으로 실험을 수행 및 완료하였으며, 혈청 분석을 실시하였다.

I23은, 조제분유(출발 용액(6%)의 1/8) 제조시 보충제로서 사용될 때나, 조제분유를 공급한 래트 새끼에 매일 3회씩 볼루스 형태로 투여되었을 때 면역 조절 활성을 나타냈다. 조제분유만이 투여된 래트 새끼 내 IgE 수준과 비교하였을 때, IgE의 유의한 감소가 얻어졌다. 일원 배치 분산 분석법(터키 사후 테스트; Tukey'spost-hoc test)을 사용하여 * = P< 0.05인 처리군과 조제분유 공급 군 사이의 유의성을 비교 평가하였다.

조제분유의 보충제(1/8 희석) 또는 매일 3회씩 위관 영양액의 형태로의 I23은 조제분유 공급 래트 새끼 내와 비교하여 혈청 IgE 수준을 감소시켰다(도 8 참조). I23을 조제분유 보충제(1/8 희석)로서 또는 매일 3회씩 볼루스 형태로서 공급한 후에 BLG 특이적 IgG1은 조제분유 공급 군과 유의한 차이가 없었다. 그러나, 1/12로 희석한 것을 공급한 경우에는 IgG1 역가가 감소하였으나(8 마리 래트 새끼 중 6 마리), 1/12로 희석한 것을 공급한 경우에 있어서 래트 2마리에서는 혈청 역가가 비정상적으로 높았으며, 이 때, 가외치를 제외하면 역가는 상당히 감소하였다. 도 9에서 데이터는 포함시킨 가외치 혈청 데이터와 함께 제시되었으며, 이 때 가외치는 그래프에 (x)로 표시하였다. RMCPII 수준은 I23 처리에 의해 감소하지 않았다(도 10 참조).

I23을 조제분유의 보충제로서 공급한 후 점막 고유층 내 비만 세포 수를 세었다(도 11 참조). 1/12로 희석한 조제분유를 보충한 후 I23을 공급한 래트 새끼 내 점막 고유층의 비만 세포 수는 감소하였다.

먹이에 I23을 보충한 후 장 균질물 중 시토킨 IL-10, 인터페론 감마 및 IL-4를 분석하였다(각각 도 12의 (A), (B) 및 (C) 참조). 그룹 간 IL-10 및 IL-4 수준에는 유의한 차이가 검출되지 않았다. I23을 1/8 또는 1/12로 희석한 조제분유에 보충하였을 경우 장 내 IFN 감마 농도가 증가하였다. 우유 알레르기를 나타내는 새끼의 경우에는 지속적으로 알레르기를 나타내는 새끼와 비교하였을 때 IFN 감마 수준이 증가하였다. I23은, Th2 반응이 전환되는 것과, 면역 시스템의 균형을 맞추는데 필요한 Th1 반응이 증가하는 것을 촉진하였다.

본 발명자들은 면역 조절 활성과 함께 생물 활성을 나타내는 우유를 확인하였다. I23이 조제분유에 대한 보충제로서 사용될 때(출발 용액(6%)의 1/8 희석), 또는 볼루스 형태로 매일 3회씩 조제분유 공급 래트 새끼에 투여될 때, IgE(알레르기 발생과 연관된 항체) 수준은, 조제분유만을 투여한 래트 새끼의 IgE 수준에 비하여 유의하게 감소하였다.

본 발명자들은 또한 이유 실험을 수행하여, I23, 산 활성화 및 산 비 활성화 I23이 위관 영양 공급된 래트 새끼에 있어서의 혈청 항체 반응을 평가하였다. 본 실험은, I23이 이유시 음식물 항원에 대한 면역 반응을 조절할 수도 있는지 여부를 확인하기 위해 수행하였다. 본 발명자들은 실험 제14일에 I23 위관 영양 공급을 개시하였다. 개체 발생 연구로부터 얻어진 최근 데이터는, 개체가 어릴수록 영아용 식이을 보충할 필요가 있음을 시사하였다. I23으로 전처리하면 이유시 음식물 항원에 대한 면역 반응에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 두 번째 실험을 실시하였다(I23은 제4일에 공급하기 시작하였으며, BLG는 제14일에 공급하기 시작하였음)(도 13의 A, B 및 C 참조). BLG 투여(BLG challenge)의 부재시, I23은 혈청 중 전체 IgE의 전반적인 농도를 감소시켰다. 개체 발생 연구에 의해 측정된 바와 같이 식이 보충제에 의한 면역 조정은 만일 생후 얼마 지나지 않아서(즉, 젖 먹이 기간에) 특이적 항원 접종과 함께 개시되면 더 효과적인 것으로 나타난다.

Claims (31)

1. 유청 단백질 농축물(WPC)을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;
   상기 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계;
   상기 회수된 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하는 단계; 및
   산성화된 가용성 단백질 함유 성분을 중화시켜 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계를 포함하는,
   유청 단백질 농축물(WPC)로부터 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 WPC80인 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위해 분말 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 수용액은 물인 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위해 적어도 0.5%w/w 내지 10%w/w의 양으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 불용성 고체로부터 가용성 단백질 함유 성분을 분리함으로써 회수되는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 가용성 단백질 함유 성분의 pH를 적어도 2.5로 제공함으로써 산성화되는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 원심 분리법, 크로마토그래피, 이온 교환법, 전기 투석법, 여과법 또는 흡착법 중 하나 이상으로 샘플을 처리하여 불용성 고체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분을 건조하여 분말을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유청 단백질 추출물을 제조하는 방법.
10. 제 1항의 방법에 의해 제조되는 유청 단백질 추출물.
11. 유청 단백질 추출물을 포함하는, 음식물 알레르기의 최소화 또는 방지용 약학 조성물로서,
    상기 유청 단백질 추출물은, 유청 단백질 농축물(WPC)을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;
    상기 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계;
    상기 회수된 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하는 단계; 및
    산성화된 가용성 단백질 함유 성분을 중화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 유청 단백질 추출물은 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 IL-2의 분비를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 상기 유청 단백질 추출물은 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 TNF 또는 IL-18의 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
14. 제 11항에 있어서, 상기 유청 단백질 추출물은 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 장 상피 세포 장벽 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
15. 제 11항에 있어서, 상기 유청 단백질 추출물은 음식물 알레르기 소인이 있는 개체 내에서 Th1 면역 반응을 향상시키고, Th2 면역 반응을 최소화시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
16. 제 11항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 WPC80인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
17. 제 16항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위해 분말 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
18. 제 11항에 있어서, 수용액은 물인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
19. 제 11항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위해 적어도 0.5%w/w 내지 10%w/w의 양으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
20. 제 11항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 불용성 고체로부터 가용성 단백질 함유 성분을 분리함으로써 회수되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
21. 제 11항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 가용성 단백질 함유 성분의 pH를 적어도 2.5로 제공함으로써 산성화되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
22. 제 11항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 원심 분리법, 크로마토그래피, 이온 교환법, 전기 투석법, 여과법 또는 흡착법 중 하나 이상으로 샘플을 처리하여 불용성 고체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
23. 유청 단백질 추출물을 포함하는, 음식물 알레르기의 최소화 또는 방지용 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제로서,
    상기 유청 단백질 추출물은, 유청 단백질 농축물(WPC)을 수용액과 접촉시켜 가용성 단백질 함유 성분과 불용성 성분을 포함하는 샘플을 형성하는 단계;
    상기 샘플로부터 가용성 단백질 함유 성분을 회수하는 단계;
    상기 회수된 가용성 단백질 함유 성분을 산성화하는 단계; 및
    산성화된 가용성 단백질 함유 성분을 중화하여 유청 단백질 추출물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
24. 제 23항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 WPC80인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
25. 제 23항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위해 분말 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
26. 제 23항에 있어서, 수용액은 물인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
27. 제 23항에 있어서, 유청 단백질 농축물(WPC)은 수용액과 접촉하기 위하여 적어도 0.5%w/w 내지 10%w/w의 양으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
28. 제 23항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 불용성 고체로부터 가용성 단백질 함유 성분을 분리함으로써 회수되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
29. 제 23항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 가용성 단백질 함유 성분의 pH를 적어도 2.5로 제공함으로써 산성화되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
30. 제 23항에 있어서, 가용성 단백질 함유 성분은 원심 분리법, 크로마토그래피, 이온 교환법, 전기 투석법, 여과법 또는 흡착법 중 하나 이상으로 샘플을 처리하여 불용성 고체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.
31. 제 23항에 있어서, 유청 단백질 추출물은 분말 형태인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물, 영아용 조제분유 또는 식이 보충제.

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