KR20180024734A - Mastoparan Peptide for Manufacturing Inactivated Non Living Vaccine and Non Living Vaccine Using the Same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 사균 백신 제조를 위한 마스토파란 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신의 제조방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a peptide for producing dead bacteria vaccine and a dead bacteria vaccine using the same, and more particularly to a mastoparan peptide for producing dead bacteria vaccine and a method for producing a dead bacteria vaccine using the same.
최근 병원성 세균에 대한 동물의 자체방어능력을 향상시키기 위해 건강기능식품, 사료 및 사료첨가제의 개발, 면역증강제의 개발 등에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.Recently, studies on the development of health functional foods, feed and feed additives, and the development of immunity enhancers have been actively carried out to improve the ability of animals to self-defense against pathogenic bacteria.
그러나, 인간을 포함한 동물 질병 치료를 위하여 과량의 항생제 투여로 인한 항생제 내성균이 발생하였으며, 항생제에 대한 내성 문제는 점차 심각해지고 있다. 현재 반코마이신을 대체할 새로운 항생제는 아직까지 개발되어 있지 못한 상황이며, 항생제 사용을 규제하여 내성을 줄이기 위한 시도로 국제기구가 만들어져 활동을 하고 있는 상황이다.However, in order to treat animal diseases including humans, antibiotic resistant bacteria are caused by excessive administration of antibiotics, and the problem of resistance to antibiotics is becoming serious. Currently, new antibiotics to replace vancomycin have not yet been developed, and international organizations have been created to reduce resistance by regulating the use of antibiotics.
또한, 가축에 과량의 항생제를 투여하는 경우에는 식품으로서의 안정성을 위협할 수 있고, 이는 곧 상품저하를 가져오므로 축산 농가에 큰 경제적 손실을 초래하게 된다. 더욱이, 동물용 의약품 중 항생제와 항균제를 배합사료에 혼합하여 사용하는 것은 2012년부터 전면 금지되고 있다. 해외에서도 세계보건기구(WHO)가 가축사료용 항생제 사용의 위험을 경고하고 있고, 유럽연합(EU)도 치료목적 외에는 항생제를 투여하지 못하도록 규제하고 있다. In addition, when an excessive amount of antibiotics is administered to livestock, the stability as a food may be threatened, which leads to a decrease in the yield of the product, resulting in a large economic loss to the livestock farming house. Furthermore, antibiotics and antimicrobials among animal medicines are totally prohibited from being used in combination in combination feeds in 2012. Overseas, the World Health Organization (WHO) warns of the danger of using antibiotics for livestock feed, and the European Union (EU) also restricts the use of antibiotics except for therapeutic purposes.
이와 같이 항생제 오남용으로 인한 폐해로 세균성 질병의 폭발적인 증가에 대한 시급한 대책이 요구되고 있으며, 항생제의 사용 없이 동물의 질병을 예방하는 방법의 개발이 필요하며, 질병을 예방하기 위해서는 예방백신의 역할이 증대되고 있다.Thus, it is urgently required to cope with the explosive increase of bacterial diseases due to abuse of antibiotics, development of a method for preventing animal diseases without using antibiotics is required, and the role of preventive vaccine is increased .
기존의 병원성 세균에 대한 전통적인 백신들은 주로 사균 백신(killed vaccine) 또는 서브유닛 백신(subunit vaccine)들이다. 그러나 기존의 사균 백신은 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 이성분 에틸렌이민(BEI) 등의 화학 약품을 처리하거나 열처리를 통하여 제조되므로, 세포 외 부속기관들이 이탈되거나 자연적인 에피톱(epitope)을 유지하지 못하여 면역원성이 낮아지는 단점이 존재하며, 사균 백신을 처리하여 면역반응을 유발할 경우에 면역유도 능력의 저하가 종종 발생하는 문제점이 발생하고 있다. 그 예로, Shuai-Cheng Wu 등의 연구에 따르면, 포르말린 처리에 의해 제조된 사균 백신(formalin-inactivated Salmonella typhimurium, FIST)을 접종한 마우스는 치사량(1 × 1010 CFU/mouse, n = 10)의 살모넬라 타이피뮤리움을 복강 내 주입시, 생존율이 30% 정도에 불과한 것으로 나타났다(Shuai-Cheng Wu, International Immunopharmacology 25 (2015) 353.362). Traditional vaccines against existing pathogenic bacteria are mainly killed vaccines or subunit vaccines. However, existing vaccine vaccines are produced through the treatment or heat treatment of chemical agents such as formalin, beta prolylactone (BPL), and binary ethylene imine (BEI), so that the extra- ). Therefore, there is a disadvantage that the immunogenicity is lowered, and when the vaccine is treated to induce an immune response, the immunity induction ability is often deteriorated. For example, according to a study by Shuai-Cheng Wu et al., Mice inoculated with formalin-inactivated Salmonella typhimurium (FIST) produced by formalin treatment had a lethal dose (1 × 10 10 CFU / mouse, n = 10) The survival rate of salmonella typhimurium infusion was only 30% (Shuai-Cheng Wu, International Immunopharmacology 25 (2015) 353.362).
이와 같은 단점을 보완하기 위해 최근에는 강독성 균주를 약독화시켜 생약독화 백신을 제조하고 있다. 그러나 상기 생약독화 백신은 병원성 균주를 약독화하지만, 생균을 사용하기 때문에 혐오감을 유발할 가능성이 있고, 생약독화를 위해 소실시킨 유전자가 자연 상태에서 회복되면 원래의 강독성 균주로 전환될 수 있는 가능성이 있다(Lin and He, 2012, Avila-Calderon et al., 2013; Langemann et al., 2010). 따라서, 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하면서도, 사균 백신처럼 안정한 백신의 제조방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. In order to overcome these drawbacks, recently, a toxin-resistant vaccine has been prepared by attenuating a strong toxic strain. However, the herbal medicine poisoned vaccine attenuates a pathogenic strain, but there is a possibility that it may cause a dislike because it uses live bacteria, and the possibility that the gene lost for the herbal medicine poisoning can be converted into the original strong toxicant strain when recovered from the natural state (Lin and He, 2012, Avila-Calderon et al., 2013; Langemann et al., 2010). Therefore, there is a continuing need to develop a method for producing a stable vaccine such as a deadly vaccine, while retaining the immunity inducing ability such as a herbal medicine-based vaccine.
한편, 모든 생명체는 생존을 위하여 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 생물은 항균 펩타이드를 자체적으로 생산하는데(Bevins et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 대략 10 내지 40 개의 아미노산으로 이루어진 작은 펩티드를 형성하며, 구조에 따라 크게 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-시트(sheet) 펩타이드 분자이고, 두 번째는 α-헬릭스 구조의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드 분자이다. 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다. 이와 같이 생물체에서 분리된 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있다. On the other hand, all life forms are known to produce antimicrobial substances for survival. Antimicrobial peptides isolated from various organisms are known to act in a variety of ways from bacteria to fungi and viruses. They play an important role in host defense and innate immune system Is known to be responsible for. The organism itself produces an antimicrobial peptide (Bevins et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), which forms small peptides of approximately 10 to 40 amino acids, Groups. The first is a cysteine-rich β-sheet peptide molecule, the second is an α-helical amphipathic peptide molecule, and the third is a proline-rich peptide molecule. These antimicrobial peptides have a variety of structures depending on the amino acid sequence. The most common of these structures is a structure that forms an amphipathic alpha helical form with no cysteine residues such as an antimicrobial peptide cecropin found in insects . Much research has been conducted on the antimicrobial activity of peptides isolated from such organisms.
현재, 생물체에서 분리된 펩타이드를 이용해 항균제를 개발하는 연구는 많이 시도되고 있으나, 아직까지 병원성 유해 세균을 항균 펩타이드로 처리하여 사멸시킨 후, 이를 사균 백신의 개발에 이용하고자 하는 연구는 진행되지 않고 있다. Currently, many attempts have been made to develop antimicrobial agents using peptides isolated from living organisms. However, studies on the use of antimicrobial peptides in the pathogenicity of antimicrobial peptides for the development of dead bacterial vaccines have not yet been conducted .
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항균 펩타이드들 중 마스토파란 펩타이드를 병원성 세균에 처리하여 사멸시킨 후, 이를 회수하여 사균 백신으로 적용하는 경우, 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하면서도, 종래 포르말린 등의 화학약품을 처리하여 생성된 사균 백신처럼 안전한 백신을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention have made intensive studies to overcome the problems of the prior art as described above. As a result, when the mastoparan peptides among antimicrobial peptides are treated with pathogenic bacteria to kill them and then recovered, It is possible to produce a safe vaccine such as a dead mold vaccine produced by treating chemical agents such as formalin and the like while having an immunity inducing ability such as an antiviral vaccine.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신 제조용 펩타이드 마스토파란을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is a main object of the present invention to provide a peptide mastoparan for the production of a vaccine against dead bacteria that produces a safe and excellent immunity-inducing ability as compared with a chemical agent such as formalin.
본 발명의 다른 목적은 상기 사균 백신 제조용 펩타이드 마스토파란을 이용한 백신의 제조방법 및 이에 따른 백신을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for producing a vaccine using the peptide mastoparan for the production of the killed virus vaccine, and a vaccine therefor.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 사균 백신 제조용 마스토파란 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a mastoparan peptide for the preparation of a vaccine against dead bacteria.
본 발명자들은 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신 제조에 적합한 항균 펩타이드(antimicrobial peptides , AMPs)의 발굴을 위해 수년간 연구, 분석하였고, 그 결과 마스토파란 펩타이드의 사균 백신 제조와 관련한 기능성을 검증하였다. 그 결과, 마스토파란 펩타이드를 적용하면, 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신을 제조할 수 있음을 확인하였다. The present inventors have conducted research and analysis for several years to discover antimicrobial peptides (AMPs) suitable for the production of a vaccine against dead bacteria that produce a safe and excellent immunity-inducing ability against chemical agents such as formalin. As a result, a vaccine against mastoparan peptides And verified the functionality related to manufacturing. As a result, it was confirmed that a mucus vaccine which can produce a safe and excellent immunity inducing ability as compared with a chemical agent such as formalin can be produced by applying the mastoparan peptide.
본 발명에서 용어 “마스토파란”은 흑참새벌의 독에 함유되어 있는 테트라테카펩티드(Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2) 및 그 유사 펩타이드를 의미하며, 이외에도 벌과에 속한 벌의 독에 상기 펩티드 서열과 유사한 서열의 펩타이드를 모두 포함하는 개념이다. 통상적으로 상기 마스토파란 펩타이드는 마스토파란군으로 총칭하여 정의될 수 있다. 상기 마스토파란은 소수성 아미노산과 염기성 아미노산이 풍부하여, 친수성 환경에서는 무작위 입체구조를 취하지만 소수성 환경에서는 양친매성 α-헬릭스 구조 형태를 갖는다. The term " mastoparan " in the present invention refers to a tetra-tecapeptide (Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys- -NH 2 ) and its analogous peptides. In addition, the concept includes the peptides of a sequence similar to the above peptide sequence in the bee venom belonging to bees. Generally, the above-mentioned mastoparan peptides can be collectively defined as mastoparans. The mastoparans are rich in hydrophobic amino acids and basic amino acids, and have a random stereostructure in a hydrophilic environment, but an amphipathic a-helix structure in a hydrophobic environment.
상기 마스토파란 펩타이드들은 항균활성에 대한 공통적인 생체물리학적인 특징을 공유하는데, 전체적으로 네트 양전하(net positive charge)를 보유하며, 이러한 양전하는 미생물의 표면에 존재하는 음전하를 정전기적으로 잡아당기는 역할을 매개한다. 또한, 마스토파란은 양친성(amphipathic)의 α-헬릭스 구조를 형성하며, 그 결과 미생물 막 표면의 소수성 부위에 위치한 소수성 잔기에 접촉하게 된다. 막 과의 상호 작용 중에 마스토파란은 카펫 모델, 도넛(toroidal) 모델, 또는 통-막대(barrel-stave) 모델로 알려진 메커니즘을 통하여 막의 붕괴를 일으키게 된다. The mastoparan peptides share a common biophysical profile for their antimicrobial activity, which has a net positive charge as a whole, and this positive charge acts to electrostatically pull the negative charge present on the surface of the microorganism Mediated. In addition, the mastoparan forms an amphipathic a-helix structure, which results in contact with hydrophobic residues located at the hydrophobic site on the microbial membrane surface. During interaction with the membrane, mastofaran causes membrane collapse through a mechanism known as a carpet model, a toroidal model, or a barrel-stave model.
특히, 막과의 상호 작용 중에, 마스토파란은 양친성(amphipathicity)을 최적화하기 위해 α-헬릭스 구조를 형성하며, 에너지 상태가 더 선호되는 구조로 변화하기 위해 펩타이드의 중간 부위의 구조가 변화하게 되고, 이를 통해 병원성 미생물의 지질층 이중막 구조를 불안정하게 한다. In particular, during interaction with the membrane, mastofarin forms an a-helix structure to optimize amphipathicity and changes the structure of the middle portion of the peptide to change to a more favorable energy state Thereby destabilizing the biomembrane structure of the pathogenic microorganism.
따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 병원성 세균에 처리하는 경우, 병원성 세균의 세포막 붕괴가 유도되고, 붕괴된 세포막을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출되게 되며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성은 소실되게 된다. 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures)되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란을 처리하여 사멸된 병원성 세균의 사체는 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하게 된다. Therefore, when the mastoparan peptide of the present invention is treated with a pathogenic bacterium, cell membrane breakdown of the pathogenic bacteria is induced, and cytosolic components are eluted outside the bacterium through the collapsed cell membrane. In this process, the pathogenic bacteria are killed, Is lost. On the other hand, the cell surface structure of the killed pathogenic bacteria becomes intact cellular morphology including cell surface structures. Thus, the dead pathogenic bacteria killed by treating the mastoparan of the present invention can be used as herbal medicine poisoning vaccine Such as the ability to induce immune.
본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 병원성 균주의 세포막의 붕괴를 일으키는 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 펩타이드 구조는 α-헬릭스 구조를 갖는 것이 특징이다. In the present invention, the term " peptide " means a polymer composed of amino acids linked by an amide bond (or peptide bond). For the purpose of the present invention means a peptide which causes the collapse of the cell membrane of a pathogenic strain. The peptide structure of the present invention is characterized by having an a-helix structure.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드인 것이 바람직하다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란 펩타이드는 한국 자생 땅벌의 독선 발현 전체 발현 유전체와 단백체를 분석하여 분리된 마스토파란 펩타이드다. 상기 펩타이드는 아미노산 서열이 INWKKIKSIIKAAMN의 15개 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란(MP-V1) 펩타이드이다. In the present invention, the peptide is preferably an antimicrobial peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The mastoparan peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a mastoparan peptide isolated by analyzing the whole expression genome and the proteome of the wild-type bumblebee. The peptide is a mastofaran (MP-V1) peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 consisting of 15 amino acids of the amino acid sequence INWKKIKSIIKAAMN.
상기 서열번호 1의 마스토파란 펩타이드와 유사한 효과를 나타내는 마스토파란 펩타이드의 예로는 서열번호 2의 아미노산 서열(INLKALAALAKKIL)을 갖는 마스토파란-L, 서열번호 3의 아미노산 서열(INWKGIAAMAKKIL)을 갖는 마스토파란-X(V), 및 서열번호 4의 아미노산 서열(LKLKSIVSWAKKVL)을 갖는 마스토파란-B 등을 들 수 있다. Examples of the mastoparan peptide showing an effect similar to that of the mastoparan peptide of SEQ ID NO: 1 include mastoparan-L having the amino acid sequence of INNKALAALAKKIL of SEQ ID NO: 2, mast with the amino acid sequence of INHKGIAAMAKKIL of SEQ ID NO: 3 Topolan-X (V), and Mastofaran-B having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (LKLKSIVSWAKKVL).
기존에 알려진 다른 마스토파란과 비교해 보면, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드는 다른 마스토파란에 비해 현저히 개선된 우수한 항균 활동을 나타내며, 마스토파란의 항균 활성 기작이 세포막 붕괴와 세포질 용출에 의한 항균 활성이므로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란 펩타이드는 다른 마스토파란 펩타이드에 비해 더욱 효과적으로 병원성 세균을 사멸시키는 동시에 병원성 세균의 세포 표면 구조는 온전하게 형태학적으로 보존하는 장점이 있다(도 2 참조). Compared with other known mastofarans, the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 exhibits remarkably improved antibacterial activity as compared to other mastofarans, and the antimicrobial activity mechanism of mastoparan The mastoparan peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 above more effectively kills pathogenic bacteria than the other mastoparan peptides and the cell surface structure of the pathogenic bacteria is entirely morphological (See FIG. 2).
ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/) 프로그램을 통한 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드의 극성(hydropathicity)(GRAVY) 계산의 평균은 본 발명의 마스토파란 MP-V1이 종래 알려진 다른 마스토파란과 비교하여 좀 더 낮은 소수성(hydrophobicity)을 갖으며, 이러한 낮은 소수성으로 인하여 병원성 세균의 지질 막에 대한 친화력이 더욱 증가할 것으로 예상된다. The average of the hydropathicity (GRAVY) calculation of the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 through the ProtParam program ( http://web.expasy.org/protparam/ ) It is expected that MP-V1 has a lower hydrophobicity as compared to other conventionally known mastofarans, and that affinity of the pathogenic bacteria to the lipid membrane is further increased due to this low hydrophobicity.
또한, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드는 14개의 아미노산으로 구성된 전형적인 마스토파란들과 명백하게 구별되게, 부가적으로 15번째 아미노산으로 아스파라긴(asparagine)을 포함하고 있다. 상기 15번째 아미노산인 아스파라긴은 그 사이드 체인의 아미드 그룹이 펩타이드 골격과 상호작용하는 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 헬릭스 구조를 안정화하는 C-말단의 캡핑 역할을 수행하며, 이를 통해 유해 병원균의 억제 활성을 증가시킨다. 즉, 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드에 존재하는 C-말단의 아미드 캡핑은 α-헬릭스 구조의 안정화를 촉진시키며, 마스토파란이 동물 및 박테리아 세포막에 강력하게 매립(embodiment) 되는 현상을 이끌어내며, 세포 표면 구조의 손상 없이 효과적으로 병원성 세균의 사멸을 촉진시키게 된다. In addition, the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 contains an asparagine as an additional 15th amino acid, apparently distinct from the typical mastoparans composed of 14 amino acids. As the 15th amino acid asparagine, the amide group of the side chain can form a hydrogen bond that interacts with the peptide backbone, so that the asparagine functions as a C-terminal capping function to stabilize the helix structure, Thereby increasing the activity. That is, the C-terminal amide capping present in the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 promotes the stabilization of the a-helix structure and the mastoparan is a potent embedding agent in animal and bacterial membranes, And promotes the killing of pathogenic bacteria effectively without damaging the cell surface structure.
본 연구진들은 선행특허 제10-2015-0168226호에서 C-말단의 아미드 그룹 없이 산성의 C-말단을 포함하는 합성 마스토파란의 CD 스펙트럼과, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드를 비교한 결과, 본 발명의 마스토파란 MP-V1에서는 C-말단의 아미드 캡핑 구조로 인하여 α-헬릭스 구조의 안정화가 이루어지고, 미생물의 막 유사 환경에서 보다 안정적인 헬릭스 구조를 형성함으로써, 다른 통상의 마스토파란보다 높은 항균 활성을 갖는 것을 증명한 바 있다.The present inventors have found that in the prior art 10-2015-0168226, a CD spectrum of a synthetic mastoparan containing an acidic C-terminus without an amide group at the C-terminus and a CD spectrum of a mastoparan (MP-V1) As a result of comparing the peptides, it was found that in the mastoparan MP-V1 of the present invention, the α-helix structure was stabilized due to the amide capping structure at the C-terminus and a more stable helix structure was formed in the membrane- It has been proven that it has higher antimicrobial activity than normal mastoparan.
또한, 본 발명의 마스토파란 MP-V1 펩타이드의 높은 항균활성은 7번째 아미노산인 라이신에 일정부분 기인한다. 일반적으로, 전형적인 마스토파란은 펩타이드의 중간에 소수성 아미노산을 갖고, 미생물 막 표면의 소수성 부위에 매립(embodiment)되어 막의 붕괴를 일으킨다. 이러한 통상적인 마스토파란과는 달리 본 발명의 마스토파란 MP-V1은 전하를 갖는 라이신의 사이드 체인 잔기가 미생물 막의 소수성 부분에 삽입되고, 이를 통해 마스토파란 MP-V1 펩타이드의 중간 부분에서 구조적 변화가 빈번하게 발생되며, 이를 통해 병원성 유해 미생물 막의 붕괴가 촉진된다. In addition, the high antimicrobial activity of the mastoparan MP-V1 peptide of the present invention is due to the lysine which is the seventh amino acid. Typically, a typical mastofarin has a hydrophobic amino acid in the middle of the peptide and is imposed on the hydrophobic site on the surface of the microbial membrane to cause membrane collapse. Unlike this conventional mastoparan, the mastoparan MP-V1 of the present invention is characterized in that the side chain residues of the lysine with charge are inserted into the hydrophobic portion of the microbial membrane, Changes frequently occur, thereby promoting the collapse of pathogenic harmful microbial membranes.
본 발명에서, 상기 백신은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균에 대한 백신인 것을 특징으로 하며, 이는 상기 마스토파란 펩타이드가 상기 그람음성 및 그람양성 병원성 세균의 세포막을 천공하여 세포질 성분을 세포막 외부로 유동시키는 원리에 기인한다(도 2 및 도 3 참조). In the present invention, the vaccine is a vaccine against Gram-negative pathogenic bacteria and Gram-positive pathogenic bacteria, wherein the mastoparan peptide punctures the cell membrane of gram-negative and Gram-positive pathogenic bacteria, (See Figs. 2 and 3).
마스토파란 펩타이드의 작용에 의해 사균백신으로 작용할 수 있는 상기 그람음성 병원성 세균의 종류로는 살모넬라 속의 균주, 비브리오 속 균주, 마이코박테리움 속 균주, 시겔라 속 균주 및 대장균이 있고, 보다 구체적으로 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 마이코박테리움 보비스(mycobacterium bovis), 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 및 장내 유해 대장균 등을 들 수 있다. The gram-negative pathogenic bacteria that can act as a dead cell vaccine by the action of the mastoparan peptide include Salmonella spp., Vibrio spp., Mycobacterium spp., Shigella spp., And Escherichia coli. More specifically, S. typhimurium (Salmonella Typhimurium), Salmonella gel rinah Room (Salmonella gallinarum), Vibrio cholera (Vibrio cholera), M. bovis (mycobacterium bovis), Shigella disen Terry Ke (Shigella dysenteriae), Shigella flex Tenerife ( Shigella flexneri , and intestinal toxic E. coli.
또한, 상기 그람 양성 병원성 세균의 종류로는 스타필로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 리스테리아 속 균주 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 리스테리아 모노싸이토제네스(Listeria monocytogenesis) 균주 등이 있다. Examples of the gram-positive pathogenic bacteria include Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Listeria sp., And more specifically, Staphylococcus aureus , Streptococcus sp. ( Streptococcus suis ), Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenesis ).
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 마스토파란 펩타이드를 처리한 병원성 세균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)의 전자현미경 사진에서 명확하게 세포질 공동현상을 관찰할 수 있었으며, 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외하고는 세포막의 형태 변형이 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 2 및 도3). 따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드가 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출되게 되며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성은 소실되게 함을 알 수 있는 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures)되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 사멸된 상기 그람음성 및 그람양성 병원성 세균의 사체를 사균 백신으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다. In a preferred embodiment of the present invention, the pathogenic bacterium Salmonella Typhimurium , Staphylococcus aureus , Streptococcus suis , Salmonella gellinia, Electron micrographs of Salmonella gallinarum and Enterotoxigenic Escherichia coli revealed that the cytoplasmic cavitation was clearly observed and that there was no morphological deformation of the cell membrane except for a partial pore of the cell membrane (Fig. 2 and Fig. 3). Therefore, it can be seen that the mastoparan peptide of the present invention causes the cytoplasmic components to be eluted out of the bacteria through the cell membrane perforation of the pathogenic bacterium. In this process, the pathogenic bacterium is killed and the pathogenicity is lost, The cell surface structure of the germ-negative and gram-positive pathogenic bacterium becomes intact cellular morphology including cell surface structures except for some perforations, and thus the mastoparan peptide of the present invention is treated, It was confirmed that the dead body can be used as a vaccine against dead bacteria.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 사균 백신의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a killed bacterial vaccine comprising the steps of:
(a) 병원성 세균을 준비하는 단계;(a) preparing pathogenic bacteria;
(b) 상기 준비된 병원성 세균에 마스토파란 펩타이드를 처리하여 상기 병원성 세균을 사멸시키는 단계; 및(b) treating the prepared pathogenic bacteria with a mastoparan peptide to kill the pathogenic bacteria; And
(c) 상기 사멸된 병원성 세균을 분리하는 단계.(c) isolating the killed pathogenic bacteria.
본 발명의 방법에서, 상기 마스토파란 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.In the method of the present invention, said mastoparan peptide is characterized by having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명의 방법에서, 상기 병원성 세균은 그람음성 병원성 세균, 및 그람양성 병원성 세균인 것을 특징으로 한다.Further, in the method of the present invention, the pathogenic bacterium is characterized by being a gram negative pathogenic bacterium, and a gram positive pathogenic bacterium.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사균 백신의 제조방법에 따른 사균 백신 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a dead mold vaccine composition according to the above method for producing a dead mold vaccine.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 BALB/c 수컷 마우스 동물 모델에 본 발명의 사균 백신을 처리하는 경우, 체액성 면역의 활성화 지표인 IgG 및 IgA 단백질의 발현과, 세포성 면역의 활성화 지표인 IL-10 및 TNF-α 단백질의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 본 발명의 사균 백신을 접종한 동물 모델에서 병원성 미생물에 대한 예방 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 사균 백신 조성물의 투여로 병원성 세균 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 상기 질환은 병원성 세균 감염에 의 해 인간 또는 동물에 발생하는 모든 세균성 질환을 의미한다.In the preferred embodiment of the present invention, when the BALB / c male mouse animal model is treated with the inoculum vaccine of the present invention, the expression of IgG and IgA proteins, which are the humoral immune activation markers, and IL- And TNF- [alpha] protein were significantly increased, and it was confirmed that the animal model inoculated with the inoculum vaccine of the present invention had a protective effect against pathogenic microorganisms. The term "prevention" of the present invention means all actions that inhibit or delay the onset of disease caused by a pathogenic bacterial infection by the administration of the dead mold vaccine composition of the present invention, and the disease is caused by pathogenic bacteria infection ≪ / RTI >
본 발명의 상기 사균 백신은 백신으로 투여되어 병원성 세균에 의해 감염되어 발생하는 질환에 대한 면역성을 유도할 수 있는데, 상기 사균 백신은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적절하게 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 주사제는 생리식염액 및 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등) 및 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 분사제의 경우에는 적합한 분사제, 예컨대 , 압축공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소 기반 낮은 끓는점 용매 등을 사용하여 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시체의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.The inoculum vaccine of the present invention may be administered as a vaccine to induce immunity against a disease caused by infection with a pathogenic bacterium. The inoculum vaccine may be appropriately formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a pigment and a flavoring agent in the case of oral administration. In the case of an injection, A non-aqueous solvent such as an aqueous solvent such as water and a ring gel liquid, a vegetable oil, a higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), and an alcohol (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.) A buffering agent, a preservative, an anhydrous agent, a solubilizing agent, an isotonic agent and a stabilizer may be mixed and used. In the case of a propellant, it can be conveniently delivered in the form of an aerosol sprayer body from a pressurized pack or sprayer using a suitable propellant, such as compressed air, nitrogen, carbon dioxide, or a hydrocarbon-based low boiling point solvent.
본 발명의 백신 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. The formulation of the vaccine composition of the present invention may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like in the case of oral administration, and in the case of injections, unit dosage ampoules or a plurality of dosage forms.
상기 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.The route of administration of the vaccine composition can be administered via any conventional route so long as it can reach the target tissue.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 상기 백신 조성물은 비경구 경로, 예컨대 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있으나, 구체적으로는 설하, 근육 내 또는 비강 경로로 투여될 수 있으며, 보다 구체적으로는 비강 경로이나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "administration" of the present invention means introduction of a predetermined substance into a human or animal by any suitable method, and is formulated into human or veterinary and administered by various routes. The vaccine composition of the present invention may be administered by parenteral routes such as intravenous, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous routes and administered by the inhalation route via oral, nasal, rectal, transdermal or aerosol And may be administered as bolus or slowly, but specifically administered sublingually, intramuscularly, or nasally, and more specifically, but not exclusively, the nasal passages.
본 발명의 사균 백신을 포함하는 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 마스토파란이 처리된 사균백신과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 나이, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료 상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman etal., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다. 본 발명의 사균 백신을 투여하는 경우, 1회 투여시 투여되는 수는 통상적으로 약 1×107 내지 1×1011, 보다 구체적으로는 1×108 내지 5×1010, 더욱 구체적으로는 5×108 내지 2×1010 개의 사균 범위이다.The vaccine composition comprising the inoculum vaccine of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount " of the present invention means an amount sufficient to exhibit a vaccine effect and an amount not causing side effects or serious or excessive immune response, The age, weight, sex, dietary habit, general health status, and medicament used in combination with, or concurrently with, the killed bacillus vaccine treated with the mastoparan, the severity, the activity of the specific compound, the route of administration, Including factors known in the art and in the medical arts. Various general considerations that are considered in the determination of "therapeutically effective amount" are known to those of skill in the art and are described, for example, in Gilman et al., Eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, And Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990. In the case of administration of the microorganism vaccine of the present invention, the number of doses administered per administration is usually about 1 × 10 7 to 1 × 10 11 , more specifically 1 × 10 8 to 5 × 10 10 , more specifically 5 × 10 8 to 2 × 10 10 dead cells.
본 발명의 사균 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The dead mold vaccine composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(i) 본 발명의 마스토파란 펩타이드는 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출시켜 병원성 세균을 완전하게 사멸시킬 수 있으며, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존시킬 수 있다. (i) The mastoparan peptide of the present invention can completely dissolve pathogenic bacteria by eluting the cytosolic components out of the bacteria through perforation of pathogenic bacteria, and the cell surface structure of the killed pathogenic bacteria is completely And can be preserved morphologically.
(ⅱ) 따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 제조된 사균 백신은 포르말린 등의 화학물질 처리에 의해 제조된 백신과 비교하여 우수한 면역유도 능력을 보유하며, 체액성 및 세포성 면역체계를 통해 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타낸다.(Ii) Therefore, the dead mold vaccine prepared by treating the mastoparan peptide of the present invention has excellent immunity-inducing ability as compared with the vaccine prepared by treating with chemical substances such as formalin, and the humoral and cellular immune system And exhibit excellent vaccine effects against pathogenic bacteria.
도 1은 마스토파란들의 일차구조 및 이차구조를 비교한 그림으로, 일차구조를 비교한 그림(도 1A), 펩타이드 계통도(도 1B), 및 원평광 이색 스펙트럼 분석(도 1C) 결과이다.
도 2는 병원성 세균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 마스토파란 VI을 처리하고, 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 3은 병원성 세균인 S. 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621), S. 수이스(Streptococcus suis)(도 3A), 및 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum)(도 3B)에 마스토파란 VI을 처리하고, 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진과, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 포르말린을 처리(도 3C)하고 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 4는 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 경구 접종하고, IgG 및 IgA 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 근육 내 접종하고, IgG 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 접종하고, IL-10 및 TNF-α 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신의 경구 접종을 통해 병원성 미생물인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456에 대한 예방 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신의 근육 내 접종을 통해 병원성 미생물인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456에 대한 예방 효과를 나타내는 그래프이다. FIG. 1 shows a comparison of the primary structure and the secondary structure of mastoparans. FIG. 1A shows a comparison of the primary structures (FIG. 1A), the peptide diagram (FIG. 1B), and the circularly unusual spectrum analysis (FIG.
FIG. 2 is an electron micrograph of a pathogenic bacterium, Salmonella Typhimurium HJL 491 bacterium treated with mastoparan VI and observing cell membrane state and cytoplasmic deformation.
Figure 3 is a graph showing the effect of the mastoparalin VI (Figure 3B) on the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus (KCTC 1621), Streptococcus suis (Figure 3A), and Salmonella gallinarum (Figure 3B) (FIG. 3C), and cell membrane state and cytoplasmic deformation were observed by treating Salmonella Typhimurium HJL 491 bacteria with formalin (FIG. 3C).
FIG. 4 is a graph showing the results of ELISA immunization of IgG and IgA proteins by inoculating a Bacillus subtilis vaccine prepared by treatment with a mastofaran peptide in BALB / c male mice.
FIG. 5 is a graph showing the results of ELISA immunization with IgG protein inoculated with Bacillus subtilis vaccine prepared by treatment with mastoparan peptide in BALB / c male mice.
FIG. 6 is a graph showing the results of ELISA immunization with IL-10 and TNF-.alpha. Inoculated with Bacillus subtilis vaccine prepared by treatment with mastofaran peptide in BALB / c male mice.
FIG. 7 is a graph showing the preventive effect against Salmonella Typhimurium HJL 456, which is a pathogenic microorganism, through oral inoculation of a killed bovine vaccine prepared by treatment with a mastofaran peptide.
FIG. 8 is a graph showing the preventive effect against the pathogenic microorganism Salmonella Typhimurium HJL 456 through intramuscular inoculation of a deadly vaccine prepared by treatment with a mastofaran peptide.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예 1. 실험재료 준비Example 1. Preparation of experimental material
1-1. 병원성 세균 및 생장조건1-1. Pathogenic bacteria and growth conditions
한국산 닭에서 분리된 악성 스트레인인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491을 병원성 세균으로 선정하였다. 병원성 세균 살모넬라 타이피뮤리움을 37℃에서 LB 브로스와 LB 아가 배지(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)에서 배양하여 준비하였다. Salmonella typhimurium HJL 491, a malignant strain isolated from Korean chickens, was selected as a pathogenic bacterium. Pathogenic bacterium Salmonella typhimurium was prepared at 37 ° C in LB broth and LB agar medium (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA).
그리고, 본 발명에서 사용된 S. 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621) 및 S. 수이스(Streptococcus suis)의 그람 양성세균 2종과, 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)의 그람 음성세균 3종을 각각 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea) 및 ATCC(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 또는 구입하여 분양 기관의 프로토콜에 따라 사용하였다.In addition, two gram-positive bacteria of Staphylococcus aureus (KCTC 1621) and Streptococcus suis used in the present invention, Salmonella gallinarum , Enterotoxigenic Escherichia coli, Escherichia coli were purchased or purchased from KCTC (Korea Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea) and ATCC (ATCC, Manassas, VA, USA), respectively.
1-2. 마스토파란 펩타이드 합성 및 정제1-2. Synthesis and Purification of Master Peptide
모든 마스토파란 펩타이드는 달리 언급 하지 않는 한 0.61mmol/g의 초기 로딩된 링크 아미드 수지(100mg)로 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc, 9-fluorenylmethoxy carbonyl)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 합성하였다. All mastoparan peptides were prepared by using 9-fluorenylmethoxy carbonyl (Fmoc, 9-fluorenylmethoxy carbonyl) as an amino acid protecting group with an initial loaded linkamide resin (100 mg) of 0.61 mmol / (Solid phase peptide synthesis: SPPS).
수지는 적절한 팽창을 위해 합성 전에 45분 동안 DMF(N,N-디메틸포름아미드) 용액으로 세척 하였다. 서열 연장을 위해, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기로 보호된 아미노산(5 당량)은 DMF 용액(2 mL, 0.15 mM) 내의 HBTU[2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트, 5.0 eq.], HOBt(1-히드록시벤조트리아졸, 5.0 eq.) 및 DIEA(디이소프로필에틸아민, 10 eq.)로 2분 동안 처리하여 활성화시켰다.The resin was washed with DMF (N, N-dimethylformamide) solution for 45 minutes prior to synthesis for proper expansion. For sequence extension, the amino acid protected with 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (5 eq.) Was dissolved in a solution of HBTU [2- (lH-benzotriazol-l-yl) -1,1 , 5.0 eq.], HOBt (1-hydroxybenzotriazole, 5.0 eq.) And DIEA (diisopropylethylamine, 10 eq.) For 2 minutes Lt; / RTI >
이 용액을 레진 상의 유리된 아민에 첨가하고, 커플링 반응은 볼텍스 교반과 동시에 1시간 동안 진행시켰다. DMF 용액으로 세정 후, DMF 용액 중 20% 피페리딘(2회: 1×10분, 2×3분)에 의해 9-플루오레닐메톡시카르보닐기를 제거하였다. 수지를 DMF(3×3 분) 용액으로 세척하고, 다음의 아미노산에 대해 같은 반응을 반복하여 수행하였다. 선형 펩타이드는 TFA(trifluoroacetic acid, 레진 100mg 당 TFA 2mL)에 존재하는 5% TIS(triisopropylsilane) 및 5% H2O로 2 시간 동안 반응시켜 수지에서 절단하였다.This solution was added to the free amine on the resin, and the coupling reaction was allowed to proceed for 1 hour at the same time as the vortex stirring. After washing with a DMF solution, the 9-fluorenylmethoxycarbonyl group was removed by 20% piperidine (twice: 1 x 10 minutes, 2 x 3 minutes) in DMF solution. The resin was washed with DMF (3 x 3 min) solution and the same reaction was repeated for the following amino acids. Linear peptides were digested with 5% TIS (triisopropylsilane) and 5% H 2 O in TFA (trifluoroacetic acid, 2 mL of TFA per 100 mg of resin) for 2 hours.
펩타이드가 침전되도록 절단된 칵테일을 차가운 에테르(ether)와 혼합하였고, 이후 원심분리 하였다. The cut cocktail to precipitate the peptide was mixed with cold ether and then centrifuged.
예비 RP- HPLC(reverse-phase HPLC) 분석은 0.05% TPA 존재 하에서 0% 내지 90%의 물/아세토니트릴 농도구배를 사용하여 비닥(Vydac) C18 컬럼 상에서 수행되었다. 펩타이드의 마지막 순도(>95%)는 분석용 비닥 C18 컬럼(4.6mm×250mm, 300A5mm 입자 사이즈) 상에서의 RP- HPLC 분석에 의해 평가하였다Preliminary RP-HPLC (reverse-phase HPLC) analysis was performed on a Vydac C 18 column using a gradient of water / acetonitrile concentration from 0% to 90% in the presence of 0.05% TPA. The final purity of the peptide (> 95%) was assessed by RP-HPLC analysis on an analytical Vydak C 18 column (4.6 mm x 250 mm, 300 A5 mm particle size)
서열 정렬(도 1A) 및 계통 분석(phylogenetic analyse, 도 1B 참조)을 마스토파란 MP-L, MP-X(V), MP-B, 및 MP-V1은 전형적인 마스토파란류로 분류되며, 공통적인 모티프를 공유한다. Mastoparan MP-L, MP-X (V), MP-B, and MP-V1 are classified as typical mastoparans by sequencing (Figure 1A) and phylogenetic analyte (Figure 1B) They share a common motif.
한편, 땅벌(Vespula vulgaris)의 독에서 분리한 서열번호 1의 서열을 갖는 마스토파란(MP-V1) 펩타이드는 부가적인 15번째 서열에 극성 아미노산인 아스파라긴을 포함하는 비정형적인 마스토파란으로, 이는 14개의 잔기로 이루어진 전형적인 마스토파란과는 확연하게 구별된다(도 1 참조).On the other hand, bumblebee (Vespula Mas Sat blue (MP-V1) a peptide having the sequence of SEQ ID NO: 1, isolated from the venom of vulgaris) is the atypical mas Sat blue comprising a polar amino acid, asparagine for additional 15th sequence, which is composed of 14 residues And is clearly distinguished from a typical mastoparan (see Fig. 1).
또한, 전형적인 마스토파란이 소수성 아미노산을 포함하는 것과 달리, MP -V1은 펩타이드의 중간에 극성을 갖는 사이드 체인인 7번째 라이신을 갖는 것이 밝혀졌다(도 1 참조). In addition, MP-V1 has a seventh lysine, which is a side chain with polarity in the middle of the peptide, as opposed to a typical mastoparan containing a hydrophobic amino acid (see Fig. 1).
또한, JASCO J-715 스펙트로폴라리미터(JASCO 인터내셔널, 도쿄, 일본)를 이용하여 합성된 폴리펩타이드들의 2차 구조를 조사하기 위해, 원편광 이색성 스펙트럼을 분석하였다. In order to investigate the secondary structure of the synthesized polypeptides using JASCO J-715 Spectropholar Limiter (JASCO International, Tokyo, Japan), circularly polarized dichroism spectra were analyzed.
상기 합성된 모든 마스토파란의 CD 스펙트럼은 수용액 상태에서 랜덤 코일(random-coil) 형태의 특성을 보였다(도 1C). 그러나, 8mM의 SDS 및 40%의 TFE 존재 하에서, 모든 마스토파란의 CD 스펙트럼은 α-헬릭스(α-helical) 특성을 보였다(도 1C).The CD spectra of all synthesized mastoparans showed a random-coil type characteristic in aqueous solution (Fig. 1C). However, in the presence of 8 mM SDS and 40% TFE, the CD spectra of all mastofarans showed a-helical character (Fig. 1C).
다른 환경에서 마스토파란에 대해 측정된 퍼센트 α-헬릭스(Percent α-helix)는 마스토파란이 8mM의 SDS 또는 40%의 TFE 존재 하에서, α-헬릭스 구조를 형성하는 경향이 있는 반면, 수용액 상태에서는 랜덤 코일 형태를 형성하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다(표 1).Percent α-helix, measured for mastoparans in other environments, tends to form α-helix structures in the presence of 8 mM SDS or 40% TFE, (See Table 1).
[표 1]. 다른 환경에서의 마스토파란의 퍼센트 α-헬릭스 특성 분석[Table 1]. Percent α-Helix Characterization of Master Blue in Different Environments
특히, 모든 마스토파란 중, MP-X(V)는 8mM SDS 또는 40% TFE 조건에서 가장 높은 α-헬릭스 퍼센트를 보인 반면 MP-V1은 MP-L과 MP-B에 비해 다소 높은 α 헬릭스 퍼센트를 나타내는 것으로 나타났다.In particular, MP-X (V) showed the highest a-helix percent in 8 mM SDS or 40% TFE conditions, while MP-V1 showed a slightly higher alpha helix percentage than MP-L and MP-B Respectively.
실시예 2. 마스토파란을 이용한 백신 제조Example 2. Preparation of vaccine using mastoparan
실시예 1-1에서 준비한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 단일 콜로니를 LB 브로스 200mL에 독립적으로 주입하고, 37℃에서 천천히 교반 배양하여 600nm에서 광학 밀도가 0.3에 도달할 때까지 배양하였다. A single colony of Salmonella Typhimurium HJL 491 prepared in Example 1-1 was independently injected into 200 mL of LB broth and incubated at 37 ° C with gentle agitation until the optical density reached 0.3 at 600 nm.
상기 실시예 1-2에서 제조한 서열번호 1의 마스토파란 VI 80μg/ml를 상기 병원균 배양 배지에 접종하고 반응시켰다. 16시간 경과 후, 상기 마스토파란 처리된 병원성 세균들을 LB 아가 배지로 옮겨 72시간 동안 배양하고, 병원성 세균의 사멸 상태를 확인하였다. 그 결과, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)의 콜로니가 형성되지 않음을 확인할 수 있었고, 본 발명의 마스토파란 펩타이드가 병원성 세균을 완전하게 사멸시킬 수 있음을 알 수 있었다. Ml of the mastoparan VI of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1-2 was inoculated into the pathogen culture medium and reacted. After 16 hours, the pathogenic bacterium treated with the mastoparan was transferred to LB agar medium and cultured for 72 hours to confirm the death of pathogenic bacteria. As a result, Salmonella typhimurium , Staphylococcus aureus , Streptococcus suis , Salmonella gallinarum , and Enterotoxigenic Escherichia coli were found to be effective as a result, , And it was found that the mastoparan peptide of the present invention can completely kill pathogenic bacteria.
상기 LB 아가 배지를 4000g 원심분리기에 넣고 30분 동안 원심분리하여 용해되어(lysated) 사멸된 세포들을 수거하였고, PBS 용액에 5 × 1010 세포/mL 농도로 재현탁하였다. 이렇게 준비된 각각의 병원성 세균에 대한 백신(ghost vaccine)으로 이용하였다. The LB agar medium was placed in a 4000 g centrifuge and lysated by centrifugation for 30 min. The killed cells were collected and resuspended in PBS at a concentration of 5 × 10 10 cells / mL. Each of these prepared pathogenic bacteria was used as a ghost vaccine.
실시예 3 전자현미경을 이용한 사멸된 병원성 세균의 형태학적 특성 관찰Example 3 Observation of Morphological Characteristics of Dead Pathogenic Bacteria Using Electron Microscope
상기 실시예 2의 방법으로 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 사균 백신의 세포질 특성 변화를 관찰하기 위해 전자현미경을 이용하였다. 상기 병원성 세균의 사균 백신을 전자현미경(Hitachi H-7600, Japan)으로 관찰하였다.An electron microscope was used to observe the changes in cytosolic characteristics of the killed bacterial vaccine prepared by treating mastoparan VI with the method of Example 2 above. The vaccine of the pathogenic bacteria was observed with an electron microscope (Hitachi H-7600, Japan).
먼저, 도 2에 도시된 바와 같이 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균의 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰하면, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하지 않은 살모넬라균에서는 완전한 세포질 함유 및 세포막 상태를 관찰할 수 있었다(도 2A 참조). 이에 반해, 마스토파란 펩타이드를 처리한 박테리아는 명확하게 세포질의 공동현상이 관찰되는 한편, 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외하고는 세포막의 형태 변형이 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 2B 참조). As shown in FIG. 2, when the cell membrane status and cytoplasmic deformation of Salmonella Typhimurium HJL 491 bacteria were observed, Salmonella without treatment with the mastoparan peptide of the present invention showed complete cytoplasmic and cell membrane states (See Fig. 2A). On the other hand, the bacterium treated with the mastoparan peptide was clearly observed to have cytoplasmic cavitation, while it was observed that there was no morphological change of the cell membrane except for a partial pore of the cell membrane (see FIG. 2B) ).
또한, 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)의 경우에도 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외하고는 세포막의 형태 변형이 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 3A 및 3B 참조).In addition, in the case of Salmonella gallinarum and Streptococcus suis , it was observed that there was no morphological change of the cell membrane except for a partial pore of the cell membrane (FIGS. 3A and 3B) 3B).
이에 반해, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 포르말린을 처리한 군에서는 세포질의 외부 유출은 없는 것으로 관찰되었고, 세포막 외부의 손상만이 관찰되었다.In contrast, in the group treated with Salmonella typhimurium HJL 491 bacteria in formalin, no external leakage of cytoplasm was observed, and only damage outside the cell membrane was observed.
상기와 같은 전자현미경을 통한 병원성 세균의 형태학적 특성 분석 결과를 통하여, 본 발명의 마스토파란 펩타이드가 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출되게 되며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성은 소실되게 함을 알 수 있었다. 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures)되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 사멸된 병원성 세균의 사체는 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하게 된다. As a result of the morphological characterization of pathogenic bacterium through the electron microscope, the mastoparan peptide of the present invention has a cell membrane perforation of a pathogenic bacterium, whereby the cytoplasmic components are eluted outside the bacterium. In this process, pathogenic bacteria are killed It was found that the pathogenicity was lost. On the other hand, the cell surface structure of the killed pathogenic bacteria becomes intact cellular morphology including cell surface structures except for some punctures, and therefore, the mastoparan peptide of the present invention is treated, The body of the vaccine has the same immunity as the herbal medicine.
실시예 4 동물모델을 통한 면역원성 검증Example 4 Immunogenicity Assay via Animal Model
4-1. 동물모델4-1. Animal model
BALB/c 수컷 마우스(Orient Bio, Inc., Sungnam, Korea)를 4개의 군으로 나누었고, 각각의 군에는 20마리의 마우스를 배치하였다. 각각의 군에 속한 마우스는 절반으로 나누어 6주령에 프라임 항원을 경구 또는 근육 접종(0 WPPI)하였고, 2주 후인 8주령에 부스트 항원을 경구 접종(2 WPPI)하였다. BALB / c male mice (Orient Bio, Inc., Sungnam, Korea) were divided into four groups, and 20 mice were placed in each group. Mice belonging to each group were divided into halves, and oral or muscle inoculation (0 WPPI) was performed at 6 weeks of age and 2 weeks of WPPI at 2 weeks of age.
A 군의 20마리 마우스는 각각 10 마리씩 나누어 살균된 PBS 용액을 경구 또는 근육 주사하여 대조군으로 사용하였고, B 내지 D 군은 상기 실시예 2의 방법으로 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 각각 1.0 × 107, 1.0 × 108, 및 1.0 × 109 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 각각 10마리씩 경구 또는 근육 주사하였다.In group A, 20 mice were divided into 10 mice and divided into sterilized PBS solutions orally or intramuscularly injected to control mice. Groups B to D contained Salmonella typhimurium prepared by treating mastoparan VI with the method of Example 2 The lysozyme vaccine was diluted with 20 μL of PBS solution at a concentration of 1.0 × 10 7 , 1.0 × 10 8 , and 1.0 × 10 9 CFU, respectively, and 10 mice were orally or intramuscularly injected.
혈청 및 분변 샘플은 각각, 0, 2주, 및 4 WPPI(week post prime inoculation) 경과 후에 면역 반응을 평가하기 위해 채취하였다.Serum and fecal samples were collected to assess the immune response after 0, 2 weeks, and 4 week post prime inoculation (WPPI), respectively.
모든 동물실험은 한국 동물 보호 위원회의 가이드라인에 따른 전북대학교 동물 윤리 위원회의 윤리 규정(CBU 2012-0017) 승인 하에 수행되었다.All animal experiments were conducted under the approval of the Ethical Code of the Animal Ethics Committee of Chonbuk National University (CBU 2012-0017) in accordance with the guidelines of the Korea Animal Protection Committee.
4-2. ELISA 면역 반응4-2. ELISA Immune Response
살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질(OMPs, outer membrane proteins)에 특이적인 IgG 및 IgA(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 상기 실시예 4-1의 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 경구 투여한 마우스에서 채취한 혈청 및 분변 샘플에 각각 적정하고, 허 및 이(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)의 ELISA 방법을 이용하여 분석하고, 도 4에 나타내었다.IgG and IgA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Specific for Salmonella typhimurium outer membrane proteins (OMPs) were treated with the salmonella typhimurium strain vaccine prepared by treating the mastoparan VI of Example 4-1 (Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunol. 18, 203-209), and the results are shown in FIG. 4 .
그 결과, B-D 군에서는 살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질에 특이적인 혈장 IgG의 농도가 2 WPPI 경과 후부터 점진적으로 증가하였고, 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 3배, 3.4배, 및 4.6배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05). 그리고, B-D 군에서는 살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질에 특이적인 분변 IgA의 농도가 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 각각 6.6배, 7.9배, 및 11.5배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.01). As a result, the concentration of plasma IgG specific to Salmonella typhimurium outer membrane protein gradually increased after 2 WPPI in the BD group and 3 times, 3.4 times, and 4.6 times (P <0.05), respectively. The concentration of fecal IgA specific to the membrane protein of Salmonella typhimurium in the BD group was 6.6, 7.9, and 11.5 times higher than that of the control group, at 4 WPPI, respectively (P <0.01) .
또한, 도 5를 참조하면, 상기 실시예 4-1의 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 근육 내 투여한 마우스에서 채취한 혈청을 분석한 결과, 경구투여 결과와 마찬가지로 IgG의 농도가 2 WPPI 경과 후부터 점진적으로 증가하였고, 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 2 내지 3배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05). 5, the sera collected from mice administered intramuscularly with the salmonella typhimurium vaccine prepared by treating the mastoparan VI of Example 4-1 were analyzed and compared with the results of oral administration The concentration of IgG was gradually increased after 2 WPPI and increased 2 to 3 times (P <0.05) at 4 WPPI.
상기와 같은 결과를 통해서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신이 체액성 면역체계를 통해 면역반응에 관여하는 항체를 분비하여 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타냄을 알 수 있었다.From the above results, it can be seen that the killed bacterial vaccine obtained by treating the mastoparan peptide of the present invention secretes an antibody involved in the immune response through the humoral immune system, thereby showing an excellent vaccine effect against pathogenic bacteria.
4-3. 사이토카인 정량4-3. Cytokine quantitation
상기 실시예 4-2의 실험이 끝나고, 4 WPPI 경과 시점에서, A 내지 D 군에서 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 경구 투여한 5마리의 마우스를 희생시키고, 무균상태에서 비장을 제거하였다. 비장세포를 허 등의 방법(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)에 따라 준비하였다. After completion of the experiment of Example 4-2, 5 mice immunized with salmonella typhimurium vaccine prepared by treating mastoparan VI in groups A to D at the time of 4 WPPI were sacrificed, The spleen was removed. Splenocytes were prepared according to the method of Hur and Lee (2011, Vaccine Immunol. 18, 203-209).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, B-D 군에서는 사이토카인 IL-10의 평균 농도가 대조군인 A 군에 비해 각각 2.6배, 2.9배, 및 3.7배 증가하는 것으로 나타났고, TNF-α의 농도가 대조군인 A 군에 비해 각각 3.8배, 4.3배, 및 4.9배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05). As a result, as shown in Fig. 6, the average concentration of cytokine IL-10 in the BD group was increased 2.6 times, 2.9 times, and 3.7 times, respectively, as compared with that of the control group, and the concentration of TNF- (P <0.05), respectively, compared with the control group, A group (3.8, 4.3, and 4.9, respectively).
상기와 같은 결과를 통해서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신이 세포성 면역체계를 통해 사이토카인을 분비하여 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타냄을 알 수 있었다.From the above results, it can be seen that the killed bacterial vaccine obtained by treating the mastoparan peptide of the present invention secretes cytokine through the cellular immune system and shows excellent vaccine effect against pathogenic bacteria.
4-4. 병원성 세균 접종 후 생존 실험4-4. Survival experiment after inoculation with pathogenic bacteria
4-4-1. 경구 투여4-4-1. Oral administration
사멸하지 않는 고위험성 병원성 균주인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456 균주를 허 등의 방법(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)에 따라 준비하였다. Salmonella Typhimurium strain HJL 456, a high-risk virulent strain, was prepared according to the method of Hur and Lee (2011, Vaccine Immunol. 18, 203-209).
상기 실시예 4-1에서 준비된 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 경구 투여한 모든 마우스에 4 WPPI 경과 후, 병원성 살모넬라 타이피뮤리움 HJL 456 균주를 2 × 108 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 복강 내 주사하였고, 14일 경과 후 까지 사망 여부를 순차적으로 관찰하였다.After the passage of 4 WPPI, the pathogenic Salmonella typhimurium HJL 456 strain was added to all mice orally administered with the Salmonella typhimurium strain vaccine prepared by treating the mastoparan VI prepared in Example 4-1 at a concentration of 2 × 10 8 CFU Were injected intraperitoneally in 20 μL of PBS solution, and the mortality was observed sequentially until 14 days after the injection.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, D 군의 5 마리 마우스 중에서 4마리의 마우스는 실험 종료 시까지 생존하는 것이 관찰되었다. 또한, B군에서는 실험 8일 및 10일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽는 것이 관찰되었고, C군에서는 실험 9일 및 11일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽어 3마리의 마우스가 실험 종료 시까지 생존하는 것으로 관찰되었다. 이에 반해 대조군인 A 군에서는 모든 마우스가 병원성 세균 접종 7일부터 11일 사이에 죽는 것이 관찰 되었다. As a result, as shown in Fig. 7, out of 5 mice of Group D, 4 mice were observed to survive until the end of the experiment. In Group B, one mouse died at each of the 8th and 10th days of experiment. In Group C, one mouse died at the 9th and 11th days of the experiment, and 3 mice survived until the end of the experiment Respectively. In contrast, in the control group A, all mice were observed to die from 7 to 11 days after inoculation with the pathogenic bacteria.
4-4-2. 근육 투여4-4-2. Muscle administration
상기 실시예 4-1에서 준비된 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 근육 내 투여한 모든 마우스에 4 WPPI 경과 후, 병원성 살모넬라 타이피뮤리움 HJL 456 균주를 2 × 108 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 복강 내 주사하였고, 14일 경과 후 까지 사망 여부를 순차적으로 관찰하였다.After 4 WPPI was passed to all the mice administered intramuscularly with the salmonella typhimurium vaccine prepared by treating the mastoparan VI prepared in Example 4-1, the pathogenic Salmonella typhimurium HJL 456 strain was added to 2 x 10 8 CFU And 20 μL of PBS was diluted in PBS, and the mice were sequentially injected intraperitoneally.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, C 및 D 군의 5 마리 마우스 모두 실험 종료 시까지 생존하는 것이 관찰되었다. 또한, B군에서는 실험 8일 및 9일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽는 것이 관찰되었고, 최종적으로 3마리의 마우스가 실험 종료 시까지 생존하는 것으로 관찰되었다. 이에 반해 대조군인 A 군에서는 모든 마우스가 병원성 세균 접종 7일부터 11일 사이에 죽는 것이 관찰 되었다. As a result, as shown in Fig. 8, it was observed that all five mice of group C and D survived until the end of the experiment. In Group B, one mouse was observed to die at each of the 8th and 9th days of experiment, and finally, three mice were observed to survive until the end of the experiment. In contrast, in the control group A, all mice were observed to die from 7 to 11 days after inoculation with the pathogenic bacteria.
본 실험에서는 고위험성 병원성 균주인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456 균주에 대한 본 발명의 백신 예방의 효과를 검증하기 위하여 극단적으로 높은 농도로 병원균을 접종하였고, 상기 균주가 100% 치사율을 갖는 것을 감안하면, 실제 현장에서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신의 경구 및 근육 내 투여를 통하여, 병원성 균주로 인해 발생하는 동물의 질병을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 사료된다.In this experiment, in order to verify the effect of the vaccine prevention of the present invention on the high-risk pathogenic strain Salmonella Typhimurium HJL 456, the pathogen was inoculated at an extremely high concentration, and the strain had a 100% mortality rate It is considered that an oral disease and an intramuscular administration of a deadly vaccine obtained by treating the mastoparan peptide of the present invention in an actual field can effectively prevent an animal disease caused by a pathogenic strain.
4-5. 통계분석4-5. Statistical analysis
SPSS version 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 PHT 검정(post hoc turkey)에 의해 쌍별 비교(pair-wise comparison)를 수행하였다. 모든 수치는 적어도 3회 이상의 독립적인 실험값에 대한 평균±SE로 표시하였다. 통계학적 유의성은 P < 0.01 수준에서 결정되었다.Pair-wise comparisons were performed by post hoc turkey using SPSS version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). All values were expressed as mean ± SE for at least 3 independent experiments. Statistical significance was determined at the P <0.01 level.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> National Institute of Biological Resources
The Industrial-Academic Cooperation Group, Jeonbuk, Korea University
Komipharm International Co., Ltd
<120> Mastoparan Peptide for Manufacturing Inactivated Non Living
Vaccine and Non Living Vaccine Using the Same
<130> PN160055AN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 1
Ile Asn Trp Lys Lys Ile Lys Ser Ile Ile Lys Ala Ala Met Asn
1 5 10 15
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASTOPARAN PEPTIDE-L
<400> 2
Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASTOPARAN PEPTIDE-X(V)
<400> 3
Ile Asn Trp Lys Gly Ile Ala Ala Met Ala Lys Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MASTOPARAN PEPTIDE-B
<400> 4
Leu Lys Leu Lys Ser Ile Val Ser Trp Ala Lys Lys Val Leu
1 5 10
<110> National Institute of Biological Resources
The Industrial-Academic Cooperation Group, Jeonbuk, Korea University
Komipharm International Co., Ltd
<120> Mastoparan Peptide for Manufacturing Inactivated Non Living
Vaccine and Non Living Vaccine Using the Same
<130> PN160055AN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 1
Ile Asn Trp Lys Lys Ile Lys Ser Ile Ile Lys Ala
Claims (9)
상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.The method according to claim 1,
Wherein the peptide is an antimicrobial peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 항균 활성은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 펩타이드.3. The method of claim 2,
Wherein said antimicrobial activity is antimicrobial activity against Gram negative pathogenic bacteria and Gram positive pathogenic bacteria.
상기 그람음성 병원성 세균은 살모넬라 속의 균주, 비브리오 속 균주, 마이코박테리움 속 균주, 시겔라 속 균주 및 대장균인 것을 특징으로 하는 펩타이드.The method of claim 3,
Wherein the Gram-negative pathogenic bacterium is a strain of the genus Salmonella, a strain of the genus Vibrio, a strain of the genus Mycobacterium, a strain of the genus Shigella or Escherichia coli.
상기 그람양성 병원성 세균은 스타필로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 및 리스테리아 속 균주인 것을 특징으로 하는 펩타이드.The method of claim 3,
Wherein the gram-positive pathogenic bacterium is Staphylococcus sp. Strain, Streptococcus sp. Strain, and Listeria sp. Strain.
(a) 병원성 세균을 준비하는 단계;
(b) 상기 준비된 병원성 세균에 마스토파란 펩타이드를 처리하여 상기 병원성 세균을 사멸시키는 단계; 및
(c) 상기 사멸된 병원성 세균을 분리하는 단계.A method for producing an inactivated vaccine comprising the steps of:
(a) preparing pathogenic bacteria;
(b) treating the prepared pathogenic bacteria with a mastoparan peptide to kill the pathogenic bacteria; And
(c) isolating the killed pathogenic bacteria.
상기 마스토파란 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Wherein said mastoparan peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: < RTI ID = 0.0 > 1. < / RTI >
상기 병원성 세균은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Wherein said pathogenic bacterium is gram-negative pathogenic bacterium and gram-positive pathogenic bacterium.
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| KR102077701B1 (en) * | 2018-12-18 | 2020-02-14 | 전북대학교산학협력단 | Vaccin composition containing novel inactivated Salmonella Gallinarum whole cells for preventing or treating Fowl Typhoid |
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| WO2018044018A1 (en) | 2018-03-08 |
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Legal Events
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |