KR20180016231A - 그래핀 양자점 복합체 - Google Patents

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KR20180016231A
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Abstract

본 발명은 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점 및 암 표적화 항체를 포함하는 복합체에 대한 것으로, 상기 사이클로덱스트린은 상기 그래핀 양자점의 아민기와 카보닐(-(C=O)-) 링커로 연결되어 있고, 상기 암 표적화 항체는 상기 그래핀 양자점과 펩티드 결합으로 연결되어 있다. 본 발명의 복합체는 항암 약물을 담지할 수 있으며, 암세포에 선택적으로 약물을 전달할 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 발광을 나타내어 약물의 모니터링 및 암의 진단에도 사용될 수 있다. 더불어, 본 발명의 복합체는 광열 또는 광역학 치료에 사용될 수 있다.

Description

그래핀 양자점 복합체 {Graphene quantum dot complex}
본 발명은 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점 및 암 표적화 항체를 포함하는 복합체에 대한 것이다.
탄소 원자들로 구성된 저차원 나노물질로는 풀러렌(fullerene), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 그래핀(graphene), 및 흑연(graphite) 등이 존재한다. 탄소 원자들이 6 각형 모양의 배열을 이루면서 공 모양이 되면 0 차원 구조인 풀러렌, 1 차원적으로 말리면 탄소나노튜브, 2 차원 상으로 원자 한 층으로 이루어지면 그래핀, 3 차원으로 쌓이면 흑연으로 구분을 할 수 있다.
이 중, 그래핀은 구조적·화학적으로 매우 안정할 뿐만 아니라, 원자 한 층의 두께를 가지면서 상대적으로 표면 결함이 적은 구조적 특성으로 인하여 탁월한 전도성을 보인다. 그래핀은 실리콘보다 100 배 빠르게 전자를 이동시키고, 이론적으로는 구리보다 약 100 배 정도 많은 전류를 흐르게 할 수 있다.
한편, 양자점(Quntum Dot)은 화학 공정을 통해 만드는 나노미터 크기의 반도체 결정체로, 주로 초미세 반도체, 질병진단 시약, 디스플레이 등에 활용된다. 현재 양자점에 대한 연구는 주로 카드뮴이나 납과 같은 독성이 있는 중금속으로 만들어진 양자점이 주를 이룬다. 그러나, 중금속 양자점은 독성이 있어 체내에 직접 투여되는 물질에 적용하는데 한계가 존재한다.
최근 나노-바이오 기술에서의 급격한 발전과 함께, 나노물질의 약물 전달체 및 영상화 물질로서의 응용이 주목을 받고 있으며, 양자점도 주목받는 나노물질 중의 하나이다. 그러나 중금속 양자점의 경우 앞서 기술한 바와 같이 독성 때문에 다양한 문제가 발생한다. 반면, 그래핀 양자점은 독성이 적을 뿐만 아니라, 탄소를 원료로 하므로 비용도 저렴하다는 장점이 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 그래핀 양자점에 암 표적화 항체를 결합시켜 약물의 전달 및 암 조직의 영상화 등 다양한 용도로 사용될 수 있는 복합체를 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1407903호 대한민국 공개특허 제10-2014-0033794호
본 발명의 목적은 하나 이상의 사이클로덱스트린;
하나 이상의 암 표적화 항체; 및
표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점을 포함하고,
상기 사이클로덱스트린은 상기 그래핀 양자점의 아민기와 카보닐(-(C=O)-) 링커로 연결되어 있고, 상기 암 표적화 항체는 상기 그래핀 양자점의 아민기와 펩티드 결합(-(C=O)-NH-)하고 있는 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 복합체에 소수성 항암 약물이 담지된 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 약물 모니터링용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은
하나 이상의 사이클로덱스트린;
하나 이상의 암 표적화 항체; 및
표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점을 포함하고,
상기 사이클로덱스트린은 상기 그래핀 양자점의 아민기와 카보닐(-(C=O)-) 링커로 연결되어 있고, 상기 암 표적화 항체는 상기 그래핀 양자점의 아민기와 펩티드 결합(-(C=O)-NH-)하고 있는 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 제공한다.
본 발명에서 "사이클로덱스트린(cyclodextrin)"은 6 ~ 12개의 포도당 분자가 알파-1,4-글리코시드결합을 한 환형의 올리고당을 의미한다.
상기 사이클로덱스트린은 외부는 친수성, 내부는 소수성을 나타내는 특유의 구조를 가지고 있다. 따라서 내부에 소수성 약물을 효과적으로 담지할 수 있으며, 생체적합성이 높다.
상기 사이클로덱스트린은 이를 이루는 글루코오스 개수에 따라 소수성 동공의 크기가 달라지며 6개의 포도당 분자가 연결된 알파(α)-사이클로덱스트린, 7개의 포도당 분자가 연결된 베타(β)-사이클로덱스트린, 8개의 포도당 분자가 연결된 감마(γ)-사이클로덱스트린 등으로 분류된다.
본 발명에서 사이클로덱스트린은 상기 3종류 외에 사이클로덱스트린 유도체도 모두 포함하며, 바람직하게는 7개의 글루코오스 단위체가 환형을 이루고 있는 베타 사이클로덱스트린류 또는 이의 유도체가 적절하다. 상기 베타 사이클로덱스트린 유도체는 예를 들어, 글루코오스 단위체에 치환된 알킬기에 따라 메틸 및 히드록시에틸, 히드록시프로필 베타 사이클로덱스트린, 설포부틸에테르 베타 사이클로덱스트린을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체의 함량은 본 발명의 복합체에 존재하는 그래핀 양자점의 함량에 대하여 5 내지 95 %일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 80%일 수 있다.
본 발명에서 "그래핀(graphene)"은 탄소 원자들이 모여 2차원적 벌집격자구조를 가지고 있는 탄소의 동소체 중 하나이며, 원자 1개 두께의 얇은 막 형태를 이루고 있다.
상기 그래핀의 공급원은 통상적으로 탄소를 공급할 수 있는 성분이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 탄소 섬유(carbon fiber, CF), 나노흑연, 고결정성 탄소나노파이버, 흑연 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "그래핀 양자점(graphene quantum dot)"은 그래핀을 구성요소로 하는 반도체 결정체를 의미한다. 기존의 양자점은 카드뮴 등의 중금속으로 이루어져 있어, 체내 투입시 독성을 야기할 수 있다는 문제점이 존재하였으나, 그래핀 양자점은 탄소를 구성성분으로 하여 체내 독성 문제를 해결 할 수 있다.
본 발명에서 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점은 그래핀 양자점의 표면에 아민 작용기가 존재하는 그래핀 양자점을 의미하며, 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서 표면에 아민기(-NH2)를 가지는그래핀 양자점은 L-글루탐산을 열분해하여 제조된다. 상기 L-글루탐산의 열분해 온도는 80 내지 250 ℃, 바람직하게는 100 내지 230 ℃일 수 있다.
본 발명에서 "암 표적화 항체"는 암 세포 또는 조직에 존재하는 표적 또는 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "표적" 또는 "마커"란 표적화 항체와 결합할 수 있는 임의의 독립체로, 정상 세포보다 암 세포에서 과발현되는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 핵산 등을 의미한다.
상기 암 세포에서 과발현되는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 핵산은 예를 들어, CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38 CD40, CD42, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79, CD137, EGFR(ErbB1), HER2(ErbB2), ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, CTLA4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CEA(Carcinoembryonic) 항원, gplOO, gpA33, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, 안지오포이에틴(Angiopoietin) 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 크립토(Cripto), ED-B, FAP, 피브로넥틴, 엽산 수용체, 강글리오시드(Ganglioside) GM3, GD2, GITR, GPNMB, ICOS, IGFIR, 인테그린 αυ, 인테그린 αυβ , KIR, LAG-3, 메소텔린(Mesothelin), c-MET, MN 탄산무수화효소 IX, MUC1, MUC16, 넥틴(Nectin)-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, 신데칸(Syndecan)-1, TACI, TAG-72, 테나신(Tenascin) 또는 이의 변이체를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "특이적으로 결합"은 암 표적화 항체와 표적 또는 마커 사이의 결합이 선택적이며, 원하지 않거나 비-특이적인 상호작용들과 구분될 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 항체는 자연 발생 또는 유전자 재조합 과정들로 형성된 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 면역글로불린 분자의 면역학적 활성부위를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 항체 융합 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는 항체 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인들을 함유하는 재조합 단백질을 의미한다.
본 발명에서 상기 "인간화된 항체"는 하나 이상의 이종의 항체를 인간의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들로 변형시킨 재조합 단백질을 의미한다. 인간화된 항체 분자의 불변 도메인들은 인간 항체로부터 유래된다.
본 발명에서 상기 "항체 융합 단백질"은 2개 이상의 상동한 또는 상이한 자연 항체, 단일사슬 항체, 또는 상동한 또는 상이한 특이성들을 갖는 항체 단편 부분들이 연결된 항원-결합 분자를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서, 암 표적화 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 이필리무맙(ipilimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세툭시맙(cetuximab), 패니투무맙(panitumumab), 카투막소맙(catumaxomab), 니모투주맙(nimotuzumab), 비바툭신(vivatuxin), 트레멜리무맙(tremelimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 니볼루맙(nivolumab), 다세투주맙(dacetuzumab), 우렐루맙(urelumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab), 블리나투모맙(blinatumomab) 또는 마투주맙(matuzumab)일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 암 표적화 항체는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 퍼투주맙(pertuzumab)이다.
상기 트라스투주맙 또는 퍼투주맙은 유방암 또는 위암 세포에서 과발현되는 HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2)에 결합하여 암세포를 사멸하는 효과를 나타내며, HER2와 결합한 후 엔도사이토시스를 통해 세포 내로 이동하는 것으로 알려져 있다. HER2는 유방암 및 위암세포 이외에, 난소암, 폐암 및 자궁암에서도 과발현되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체" 복합체는, 그래핀 양자점에 하나이상의 사이클로덱스트린과 하나 이상의 암 표적화 항체가 결합되어 있는 형태를 의미한다.
본 발명의 복합체에 있어서, 사이클로덱스트린은 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점과 카보닐(-(C=O)-) 링커로 연결되어 있으며, 바람직하게는 사이클로덱스트린의 하나 이상의 히드록시기(-OH)가 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점의 아민기와 카보닐 링커로 연결되어 있다.
본 발명에서 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점 사이의 카보닐기는 카바메이트 결합의 형성에 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 도입될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점 사이의 카보닐기는 1,1`-카보닐디이미다졸(1,1`-carbonyldiimidazole)을 사용하여 도입되었다.
본 발명의 복합체에 있어서, 암 표적화 항체는 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점과 펩티드 결합(-((C=O)-NH)-)으로 연결되어 있다.
본 발명에서 상기 펩티드 결합은 통상의 기술자 통상적으로 사용하는 방법에 의해 형성될 수 있으며, 바람직하게는 암 표적화 항체의 카복시기(-COOH)가 그래핀 양자점의 아민기와 반응하여 형성될 수 있다.
상기 펩티드 결합은 산성 조건에서 분해될 수 있다. 일반적으로 체내 pH는 대략 7.4 내외이나, 암 조직의 경우 정상 조직보다 낮은 산성의 pH를 가지며, 보통 대략 6.5 이하의 pH를 나타낸다. 또한, 암세포의 세포질의 경우 대략 6 이하의 pH를 나타내며, 암세포의 리소좀은 약 5.5의 pH를 나타낸다. 따라서 본 발명의 복합체는 암세포에서 선택적으로 분해될 수 있다.
본 발명의 복합체의 직경은 10 내지 1000 nm일 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 280 nm이고, 보다 바람직하게는 50 내지 250 nm이다. 복합체의 직경이 10 nm 보다 작으면 복합체가 신장을 통해 쉽게 체외로 빠져나가게 되며, 1000 nm 보다 클 경우 면역 반응에 의해 제거되어 암세포까지 도달하기 어렵다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서, 본 발명의 복합체의 사이클로덱스트린은 소수성 항암 약물을 담지한다.
상기 사이클로덱스트린은 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)으로 항암 약물을 담지한다. 사이클로덱스트린은 호스트-게스트 상호작용으로 소수성 물질과 포접 복합체(inclusion complex)를 형성하므로, 소수성 항암 약물의 물분산성을 향상시킬수 있다. 또한 호스트-게스트 상호작용으로 담지된 소수상 항암 약물의 화학 구조를 변형시키지 않아, 약물의 효력 저하를 발생시키지 않는다. 따라서 본 발명의 복합체는 담지된 항암 약물의 효력을 유지하면서 암세포까지 항암 약물을 전달할 수 있다.
본 발명의 복합체에 담지될 수 있는 소수성 항암 약물은 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 캄토테신 및 메토트렉세이트 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 복합체는 중금속이 함유되지 않은 생체 적합성 그래핀 양자점을 구성요소로 하므로 독성이 매우 낮다.
또한, 본 발명의 복합체의 사이클로덱스트린은 다른 담지체와 달리 항암 약물을 화학적 및 구조적 변화 없이 효과적으로 담지하므로, 약물의 화학적 물리적 성질을 변화시키지 않고, 따라서 약물의 효력을 감소시키지 않는다.
또한, 본 발명의 복합체는 그래핀 양자점과 암 표적화 항체가 펩티드 결합으로 연결되어 있고, 약물을 담지하는 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점이 카바메이트 결합으로 연결되어 있어, 정상 부위에서는 잘 분해되지 않고, 산성 환경인 암세포에서 쉽게 분해된다. 따라서 본 발명의 복합체는 항암 약물을 암 부위에 효과적으로 전달할 수 있다.
또한, 본 발명의 복합체는 발광 성질을 가지고 있는 그래핀 양자점을 포함하고 있으므로, 복합체에 담지된 항암 약물의 모니터링에도 사용될 수 있으며, 또한 암조직의 영상화를 통해 암을 진단하는데도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체, 또는 소수성 항암 약물을 담지한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점, 암 표적화 항체, 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 및 소수성 항암 약물은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 암은 유방암, 위암, 전립선암, 자궁경부암, 난소암, 피부암, 구강암, 식도암, 위암, 췌장암, 대장암, 방광암, 요관암, 간암, 폐암, 골육종, 신경교종, 뇌종양, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 또는 형질세포성종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 유방암 또는 위암이다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체, 또는 소수성 항암 약물을 담지한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하고, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있고, 수일에 한번 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 복합체는 중금속이 함유되지 않은 생체 적합성 그래핀 양자점을 구성요소로 하므로 독성이 매우 낮다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 복합체의 구성요소인 사이클로덱스트린은 다른 약물 담지체와 달리 항암 약물을 구조적 변화 없이 효과적으로 담지하므로, 약물의 화학적, 물리적 성질을 변화시키지 않고, 따라서 약물의 효력을 감소시키지 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 복합체는 그래핀 양자점과 암 표적화 항체가 펩티드 결합으로 연결되어 있고, 약물을 담지하는 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점이 카바메이트 결합으로 연결되어 있어, 정상 부위에서는 잘 분해되지 않고, 산성 환경인 암세포에서 쉽게 분해되어, 항암 약물을 암 부위에 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명은 상기 소수성 항암 약물을 담지한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 약물 모니터링용 조성물을 제공한다.
상기 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점, 암 표적화 항체, 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 및 소수성 항암 약물은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명의 복합체의 그래핀 양자점은 반도체 물질로, 발광 성질을 가지고 있다. 따라서 투여된 약물의 체내 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체, 또는 소수성 항암 약물을 담지한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점, 암 표적화 항체, 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 및 소수성 항암 약물은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(예를 들어, 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 질환의 치료 후 재발 여부 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 피검체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명의 진단용 조성물에 포함된 복합체는 암 표적화 항체를 함유하고 있어, 암 세포에 선택적으로 결합할 수 있으며, 또한 그래핀 양자점을 함유하고 있어 발광을 나타낸다. 따라서 본 발명의 복합체를 포함하는 조성물은 체내 조직을 영상화하여 암을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 주사, 주입 또는 임의의 다른 공지된 방법에 의해서 피검체에게 투여하는 조성물을 투여하는 단계, 및 해당 사건이 위치하는 피검체 내 구역을 영상화하는 단계를 포함하는 방법으로 사용될 수 있다.
투여되는 유용한 투여량 및 특정 투여 방식은 나이, 체중, 연령, 성별, 및 영상화되는 특정 영역, 뿐만 아니라 진단학적 용도 및 제제의 형태(예를 들어, 현탁액, 에멀젼, 미소 구체, 리포솜 등)와 같은 인자들에 따라서 달라질 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에 포함된 복합체는 발광 성질을 가지고 있는 그래핀 양자점을 가지고 있으므로, 암조직의 영상화를 통해 암을 진단하는데도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 또는 소수성 항암 약물을 담지한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물을 제공한다.
상기 사이클로덱스트린, 그래핀 양자점, 암 표적화 항체, 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체 및 소수성 항암 약물은 앞서 기술한 바와 같다.
상기 광열 치료(phtothermal therapy, PTT)는 광자로부터 에너지를 흡수하여 부분적으로 열의 형태로 이용하여 암을 치료하는 것으로, 작용제가 종양 근처에 가까이 다가갔을 때, 온도가 증가하여 암세포 사멸을 유도하는 방법이다.
상기 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 체내의 풍부한 산소와, 외부에서 공급되는 광자와, 빛에 민감한 반응을 보이는 광감작제(photosensitizer)와의 화학반응에 의하여 파생되는 단일상태 산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 병변 부위 및 암세포를 파괴하여 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양내 주입 또는 병변내(intralesional) 주입 등으로 투여될 수 있다.
본 발명의 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 조절될 수 있으며, 통상의 기술자가 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물을 사용할 경우, 정상 세포는 보존하면서 암 세포만 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명은 또한, S1) 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점, 사이클로덱스트린 및 1,1`-카보닐디이미다졸(1,1`-carbonyldiimidazole)을 혼합하여 복합체를 제조하는 단계, 및
S2) S1에서 제조된 복합체와 암 표적화 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 제1항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 S1)은 그래핀 양자점과 사이클로덱스트린을 카보닐 링커로 결합시키는 단계이다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서, S1)의 상기 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점은 L-글루탐산을 열분해하여 제조된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 S1)의 복합체는 사이클로덱스트린과 1,1`-카보닐디이미다졸(1,1`-carbonyldiimidazole)을 반응시킨 후, 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점을 첨가하여 제조되었다.
본 발명에서 상기 S2)는 그래핀 양자점 복합체에 암 표적화 항체를 결합시키는 단계이다. 구체적으로, 그래핀 양자점의 표면의 아민기(-NH2)와 암 표적화 항체의 카복시기(-COOH)가 결합하여 펩티드 결합을 형성한다. 상기 펩티드 결합은 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 형성될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드를 커플링 시약으로 사용하여 그래핀 양자점과 암 표적화 항체인 트라스트주맙을 결합하였다.
본 발명의 제조방법에 의하면 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 효과적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체는 항암 약물을 담지할 수 있으며, 암세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 그래핀 양자점과 암 표적화 항체 사이의 펩티드 결합 및 그래핀 양자점과 사이클로덱스트린 사이의 카바메이트 결합은 암세포의 산성 환경에서 분해되므로, 담지된 항암 약물이 암세포에 도달한 후에 유리된다. 따라서 정상 세포에서 항암 약물이 세포사멸 효과를 나타내지 않고, 암 세포에서 선택적으로 세포사멸 효과를 나타낼 수 있다.
또한 본 발명의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체는 발광을 나타내는 성질이 있어, 약물의 모니터링 및 암의 진단에도 사용될 수 있다.
더불어, 본 발명의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체는 그래핀 양자점이 광자로부터 에너지를 흡수하여 열을 낼 수 있어 광열치료에 사용될 수 있으며, 또한 광감작에 의해 단일상태 산소 또는 자유 라이칼을 유리하여 광역학 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1-1에서 제조된 그래핀 양자점을 에너지 분산 엑스레이 분광(EDX) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 베타 사이클로덱스트린(β-CD)과 표면에 아민기가 존재하는 그래핀 양자점(GQD)을 카보닐 링커로 연결하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)와 암 표적화 항체인 트라스트주맙(HER)을 연결하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 그래핀 양자점(GQD) 및 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)의 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 그래핀 양자점(GQD), 트라스투주맙(HER) 및 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)의 자외-가시 흡광도 분석을 나타낸 그래프이다.
도 6은 그래핀 양자점(GQD), 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER), 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD) 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)가 자외선 하에서 청색광을 나타내는 것을 관찰한 것이다.
도 7은 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER), 베타 사이클로덱스트린(β-CD), 그래핀 양자점(GQD) 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)의 자외-가시 흡광도 분석을 나타낸 그래프이다.
도 8은 베타 사이클로덱스트린(β-CD), 그래핀 양자점(GQD) 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(βCD-GQD)의 퓨리에 변환 적외선 분광 분석(FT-IR) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 베타 사이클로덱스트린(βCD), 그래핀 양자점(GQD) 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)의 열중량 분석(TGA) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 복합체, 그래핀 양자점(GQD), 그래핀 양자점-트라스트주맙 복합체(GQD-HER), 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD) 및 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 직경을 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 그래핀 양자점(GQD)과 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 표면을 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것으로, (a)와 (b)는 전계 방출형 주사 전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM) 관찰 결과이고, (c)와 (d)는 전계 방출형 투과전자현미경(Field-Emission Transmission Electron Microscopy, FE-TEM)관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 (a)는 1:3(v/v) 비율의 증류수:디메틸포름아미드(DMF) 혼합용액에 0, 5, 15, 20, 30, 50, 70 μM 농도로 독소루비신(DOX)을 용해시킨 후 측정된 자외-가시 흡광(UV-VIS)도 그래프 및 이를 계산한 독소루비신의 검정선(calibration curve)을 나타낸 그래프이고, (b)는 pH 5, pH 6 및 pH 7에서 각각 독소루비신의 자외가시 흡광도를 나타낸 그래프 및 이를 계산한 독소루비신의 검정선(calibration curve)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)의 자외-가시 흡광도(UV-VIS) 그래프이다.
도 14는 독소루비신(doxorubicin, DOX)이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)의 37℃에서, pH 5.5, 및 pH 7.4 일 때 시간에 따른 약물 방출능을 측정한 결과 및 25 ℃에서 pH 5.5일 때 시간에 따른 약물 방출능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 그래핀 양자점(GQD) 및 그래핀 양자점-트라스트주맙 복합체(GQD-HER)의 BT-474의 세포사멸 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 농도에 따른 BT-474 세포와 MCF-7 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)의 농도별, BT-474 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 그래핀 양자점이 암세포에 흡수되어 발광을 나타내는 것을 공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM) 및 암시야 현미경(dark-field microscopy)으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 19는 HER2의 양성 유방암세포인 BT-474에 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER), 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD) 및 프리-독소루비신(Free-DOX)의 배양된 복합체를 공초점 레이져 현미경을 이용하여 세포 섭취 및 세포 내 발광 정도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 제조예 및 실험예를 제시한다. 그러나, 이들 실시예, 제조예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예, 제조예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 사이클로덱스트린 - 그래핀 양자점 - 암 표적화 항체 복합체의 제조
1-1. 표면에 아민기(-NH 2 )를 가지는 그래핀 양자점의 제조
L-글루탐산 2 g을 플라스크에 넣고 가열 맨틀(heating matnel)에서 110 ℃로 가열하였다. 고체상의 L-글루탐산이 투명한 액체로 변하고, 나아가 갈색 액체로 변하면, 물 10 mL를 첨가하고 30분간 교반하였다. 반응 용액을 실온으로 냉각시키고, 10000 g에서 30분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해, 그래핀 양자점을 수득하였다.
에너지 분산 엑스레이 분광(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, EDX) 분석을 수행한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 탄소 함량은 51 %, 산소 함량은 41 %이고, 질소 함량이 8%인 것으로 나타났다. 따라서 그래핀 양자점에 아민기가 존재함을 알 수 있다.
1-2. 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체의 제조
도 2에 나타낸 방법으로 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체를 제조하였다.
구체적으로, 5 mL 바이알에 인산완충식염수(PBS) 2 mL를 넣고, 25 ℃에서 1,1`-카보닐디이미다졸(CDI)(516.6 mg, 3.2 mmol)을 용해시켰다. 또한, 70 mL 바이알에 PBS 30 mL을 넣고, 50 ℃에서 베타 사이클로덱스트린(βCD) 3616.1 mg (3.2 mmol)을 용해시켰다. 1,1`-카보닐디이미다졸이 용해된 용액을 베타 사이클로덱스트린이 용해된 용액에 섞고, 반응 혼합물을 50 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 10 mL 바이알에서 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD) 500 mg (2.9 mmol)을 PBS 8 mL에 용해시키고, 반응 혼합물과 섞어주었다. 50 ℃에서 4일 동안 교반한 후, 분획 분자량 1 kDa의 투석막을 사용하여 증류수에서 투석하였다. 그 후, 3일 간 동결건조하여 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)를 제조하였다.
1-3. 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체와 암 표적화 항체의 결합
도 3에 나타낸 방법으로, 실시예 1-2에서 합성한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)와 유방암 표적화 항체인 트라스투주맙(HER)을 결합하여 본 발명의 복합체를 제조하였다.
먼저, 20 mL 바이알에 디메틸 설폭시드(DMSO) 10 mL를 넣고, 트라스투주맙 60 mg (0.00041228 mmol)을 용해시키고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보이미드(EDC) 10 mg (2.317 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 20 mL 바이알에 DMSO 10 mL를 넣고, 실시예 1-2에서 합성한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체 40 mg (0.2317 mmol)을 용해시키고, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)를 첨가하였다. 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체가 용해된 용액을 앞서 트라스투주맙이 용해된 용액에 혼합하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 분획 분자량 1 kDa의 투석막을 사용하여 증류수로 2일 내지 3일 간 투석한 후, 0.45 μm 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 그리고 3일 동안 동결건조하여 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)를 제조하였다.
< 실시예 2> 본 발명의 복합체로의 항암 약물 담지
2-1. 독소루비신의 담지
실시예 1-3에서 제조한 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER) 50 mg, 독소루비신(doxorubicin, DOX) 5 mg 및 트리에틸아민 3.6 μL를 3 mL 디메틸 설폭시드(DMSO)에 용해시키고, 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 57 mL PBS 버퍼를 추가로 첨가하고 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 그리고 1 kDA 투석 백(dialysis bag)을 이용하여 증류수에 20시간 동안 투석하였다. 그 후, 동결건조하여 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)를 수득하였다.
2-2. 파클리탁셀의 담지
실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체 8 mg을 디메틸포름아미드(DMF) 3 mL에 녹인 혼합물에, 파클리탁셀 4.2 mg을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 증류수로 48시간 동안 투석한 후 동결건조하여, 파클리탁셀이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체를 제조하였다.
< 제조예 1> 그래핀 양자점 - 암 표적화 항체 복합체의 제조
20 mL 바이알에 포스페이트 버퍼(PBS) 10 mL를 넣고, 트라스투주맙(HER) 183.0 mg (0.00126 mmol)을 용해시키고 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보이미드(EDC) 1004.5 mg (6.47 mmol)을 첨가한 후, 상온에서 30분간 교반하였다. 10 mL 바이알에 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD) 223.4 mg (1.29 mmol)을 용해시키고 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 79.1 mg (0.65 mmol)을 첨가하여 상온에서 30분간 교반 후 앞서 준비한 트라스트주맙 용액과 혼합하여 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 분획 분자량 1 kDa의 투석막을 사용하여 증류수로 2일 내지 3일 간 투석한 후, 0.45 μm 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 그리고 3일 동안 동결건조하여 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)를 제조하였다.
젤 전기영동으로 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)의 합성을 확인한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙(HER) 위치에 밴드가 형성되었으며, 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)가 합성되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 자외-가시 흡광도를 측정한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER)의 최대 흡수 파장은 278 nm로, 그래핀 양자점(GQD)의 최대 흡수 파장(323 nm)에서 트라스투주맙(HER)의 최대 흡수 파장(280 nm) 영역으로 이동하였다. 따라서 그래핀 양자점-트라트투주맙 복합체(GQD-HER)가 합성되었음을 알 수 있다.
< 실험예 1> 실시예 및 제조예에서 제조한 복합체에 존재하는 그래핀 양자점 확인
실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD), 제조예 1에서 제조한 그래핀 양자점-트라스트주맙 복합체(GQD-HER), 실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD) 및 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스트주맙 복합체(βCD-GQD-HER)에 365 nm 파장의 자외선을 조사하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 복합체에서 그래핀 양자점(GQD)의 청색광이 나타남이 확인되었다. 따라서 합성된 복합체에 그래핀 양자점이 존재함을 알 수 있다.
< 실험예 2> 실시예 1에서 제조한 복합체의 합성 확인
자외-가시 흡광도(UV-VIS) 분석, 적외선 분광 분석(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 및 열중량 분석(thermogravimetric analysis, TGA)으로 실시예 1에서 제조한 복합체의 합성을 확인하였다.
2-1. 자외-가시 흡광도 분석
실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD) 및 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 자외-가시 흡광도(UV-VIS)를 측정하고, 그래핀 양자점(GQD), 베타 사이클로덱스트린(β-CD) 및 트라스투주맙(HER)의 자외-가시 흡광도(UV-VIS)와 비교하여 복합체의 합성을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점(GQD)은 323 nm에서 최대 흡수를 나타내었고, 베타 사이클로덱스트린(β-CD)은 264 nm에서 최대 흡수를 나타내었으며, 트라스투주맙(HER)은 280 nm에서 강한 흡수를 나타내었다.
베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)는 250-255 nm 파장에서 강한 흡수를 나타내었으며, 복합체의 최대흡수파장이 베타 사이클로덱스트린의 파장에 따라 단파장영역으로 이동함에 따라 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체의 합성을 확인할 수 있었다.
본 발명의 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)는 284 nm에서 최대 흡수를 나타내었으며, 합성단계에 따라 최대흡수파장이 각 반응물질의 최대흡수파장에 따라 장/단파장 영역으로 이동하는 것이 관찰되었다. 따라서, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체가 합성되었음을 알 수 있다.
2-2. 퓨리에 변환 적외선 분광 분석
Nicolet 380 spectrometer (high tech Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 퓨리에 변환 적외선 분광 분석(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)을 수행하여, 실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)의 합성을 확인하였다.
KBr 펠렛 기술을 이용하여 400 내지 4000 cm-1 파장에서 스펙트럼을 측정하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 베타 사이클로덱스트린(β-CD)은 3387 cm-1 (ν, O-H), 2928 cm-1 (ν, C-H), 1637 cm-1 (δ, O-H), 1030 cm-1 (ν, C-O-C)에서 투과 밴드를 나타내었다. 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD)은 3305 cm-1 (ν, N-H), 1720 cm-1 (δ, N-H)에서 흡수 밴드를 나타내었다. 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(βCD-GQD)의 경우에, 베타 사이클로덱스트린 및 그래핀 양자점 복합체에 속하는 모든 피크 및 N-H 피크가 관찰되었다. 이러한 결과는 베타 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점이 성공적으로 결합되었음을 나타낸다.
2-3. 열중량 분석
2960 SDT V3.0F (TA Instruments, 미국)로 열중량 분석(thermogravimetric analysis, TGA)을 수행하여 실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)의 합성을 확인하였다.
구체적으로, 베타 사이클로덱스트린, 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점, 및 실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점(GQD-βCD) 샘플 각각을 프로그램된 용광로 안의 플래티늄 팬에 놓았다. 질소 기체 하에서 10 ℃/min의 가열 속도로 샘플들을 10 ℃에서 800 ℃까지 가열시켰다. 그 후, 감소된 질량의 %를 계산하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 베타 사이클로덱스트린(βCD)은 270 ℃와 450 ℃ 사이에서 69 % 중량 손실이 나타났고, 그래핀 양자점(GQD)은 185 ℃와 450 ℃ 사이에서 64 % 중량 손실이 나타났으며, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)는 220 ℃와 450 ℃ 사이에서 55 % 중량 손실이 나타났다. 이를 통해 베타 사이클로덱스트린과 그래핀 양자점의 결합 효율이 약 55 %임을 알 수 있다.
< 실험예 3> 실시예 1에서 제조한 복합체의 입자크기 측정
동적 광 산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석 및 전계 방출형 주사 전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 사용하여, 본 발명의 복합체의 입자크기를 관찰하였다.
3-1. 동적 광산란 분석
633 nm He-Ne 가스 레이저가 장착된 Zetasizer Nano S 90 (ZEN1690)(Malvern Instruments, 영국)으로 동적 광산란 분석(Dynamic light scattering, DLS)을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD), 제조예 1에서 제조한 그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-HER), 실시예 1-2에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD), 및 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)를 증류수에 분산시켜 각각 0.1 mg/mL의 농도의 샘플을 제작하였다. 25℃에서 고정 산란각 90°로 하여 각각의 직경을 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점(GQD)의 직경은 26 nm 였고, 트라스투주맙-그래핀 양자점 복합체(GQD-HER)의 직경은 59.7 nm, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점 복합체(GQD-βCD)의 직경은 91.8 nm 였으며, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 직경은 225 nm 였다.
또한, 측정된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER) 직경의 다분산지수(Polydispersity Index, PDI) 값은 0.3으로, 단분산의 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)가 확보된 것을 알 수 있다.
3-2. 방출형 주사 전자현미경 관찰
전계 방출형 주사 전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 입자 크기를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD) 및 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)를 0.25 mg/mL의 농도로 증류수에 분산시켜 샘플 용액을 제조하였다. 각각의 샘플 용액을 실리콘 웨이퍼 위에 위치시키고 입자크기를 측정하였다.
그 결과, 도 11의 (a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점(GQD)과 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 크기는 각각 20 nm와 200 nm로, 실험예 3-1에서 동적 광산란 분석으로 측정한 결과와 유사하였다.
따라서, 본 발명 실시예 1의 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)는 입자 크기가 너무 작아서 신장으로 빠르게 배설되거나, 너무 커서 체내 면역반응에 의하여 제거되지 않고, 암세포까지 전달 될 수 있는 적절한 크기를 가짐을 알 수 있다.
< 실험예 4> 실시예 1에서 제조한 복합체의 표면 관찰
전계 방출형 투과전자현미경(Field-Emission Transmission Electron Microscopy, FE-TEM)을 이용하여, 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점(GQD) 및 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 두께 및 격자 간격을 측정하였다.
그래핀 양자점(GQD) 및 실시예1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)를 0.1 mg/mL 농도로 증류수에 용해시켜 샘플 용액을 제조하였다. 각각의 샘플 용액을 카본-코팅된 구리 격자(copper grid)위에 떨어뜨려 건조시킨 후, 200 kV에서 전계 방출형 투과전자현미경 촬영을 수행하였다.
그 결과, 도 11의 (c) 에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점(GQD)의 격자 간격은 약 2.4 Å (0.24 nm)으로 측정되었다. 또한, 도 11의 (d)에 나타낸 바와 같이, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 격자간격은 2.5 Å (0.25 nm)으로 측정되어 그래핀 양자점의 표면에 사이클로덱스트린 및 암 표적화 항체를 결합시킨 후에도 그래핀 양자점이 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 11의 (d)에 나타낸 바와 같이, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 표면층의 두께는 6 ~ 7 nm으로 측정되었다.
< 실험예 5> 실시예 1에서 제조한 복합체의 항암 약물 탑재능 평가
5-1. 독소루비신 검정선 도출
약물 탑재능을 평가하기 위해, 먼저 독소루비신 농도에 따른 검정곡선(calibration curve)을 도출하였다.
1:3 (v/v) 비율의 증류수:디메틸포름아미드(DMF) 혼합용액에 0, 5, 15, 20, 30, 50, 70 μM 농도로 각각 독소루비신을 용해시킨 후 496 nm 파장에서 자외-가시 흡광도(UV-VIS)를 측정하여 독소루비신 농도에 따른 검정선(calibration curve)을 도출하였다.
그 결과는 도 12의 (a)에 나타낸 바와 같으며, 독소루비신의 흡광 계수(extinction coefficient)는 12,800 M-1cm-1이었다.
또한, 1:3 (v/v) 비율의 pH 5, 6 또는 7의 버퍼:DMF 혼합용액에 대해서도 자외-가시 흡광도를 측정한 결과를 도 12의 (b)에 나타내었으며, 증류수와 동일한 결과를 나타내었다.
5-2. 탑재 용량 및 봉입 효율 측정
실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체(GL-GQD)를 증류수:DMF 1:3 (v/v) 혼합 용액에 용해시킨 후, 자외-가시 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 13에 나타낸 바와 같다.
측정된 흡광도로 부터 아래와 같은 Beer-Lambert 식을 이용하여 담지되어 있는 약물의 농도를 산출하였다.
A = ε x c x l
A = 흡광도; ε = Molar extinction coefficient (12,850 M-1cm-1); c= 농도; l = 셀두께
또한, 독소루비신의 탑재 용량(loading capacity LC) 및 봉입률(encapsulation efficiency, EE)을 아래의 식을 통해 계산하였다.
Figure pat00001
계산 결과, 독소루비신의 탑재 용량은 약 5.3 ± 0.2% 였으며, 봉입율은 53.2 ± 3.2%로 계산되었다.
베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER) 내 베타 사이클로덱스트린(β-CD)의 양이 약 36 wt% 이므로 100 wt%일 때의 탑재 용량은 14.6 ± 0.7%로 환산 되며, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER) 표면의 베타 사이클로덱스트린(β-CD) 양을 증가시켜 탑재 용량을 높일 수 있다.
< 실험예 6> 실시예 1에서 제조한 복합체의 in vitro 약물 방출능 평가
일반적으로 암 세포는 정상 세포에 비해 산성의 성질을 띄는 것으로 알려져 있으며, 특히 암세포의 리소좀은 약 pH 5.5를 나타낸다. 반면 일반적인 생리학적 조건은 pH 7.4를 나타낸다.
따라서 암 세포 환경에서의 약물 방출 효과를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체를 사용하여 pH 5.5 및 pH 7.4의 환경에서 약물 방출능을 측정하였다.
실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GL-GQD) (20 mg)를 인산완충식염수(PBS, pH 7) 5 mL에 용해시켰다. 이 용액을 분자량 1 kDa의 투석막을 사용하여 37 ℃의 pH 5.5의 완충액 50 mL에 담근 후 교반하였다. 시간에 따라 복합체가 분해되고, 약물이 방출이 되어 투석막 밖으로 빠져나오면 그 용액을 2 mL씩 취해 28시간 동안 자외-가시 흡광도(UV-VIS) 분석을 수행하였다.
또한, 위와 동일한 조건에서 완충액의 pH만을 pH 7.4로 달리하여 자외-가시 흡광도를 분석하였으며, 동일한 조건에서 온도만을 25 ℃로 달리하여 자외-가시 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 28시간 동안 pH 5.5 조건에서는 약 70%의 약물이 방출되는 반면 pH 7.4 조건에서는 약 20%의 약물이 방출되는 것이 확인되었다. 또한 약물 방출 온도가 25℃에서 37℃로 상승함에 따라 약 60%의 약물 방출능이 증가하는 것이 관찰되었다.
이러한 결과를 통해 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)가 pH 뿐만 아니라 온도에서도 민감하게 반응하여 약물 방출능이 가변적인 것이 확인 되었으며, 본 발명의 복합체가 암 표적을 위한 약물전달체로서 체온에서 우수한 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.
< 실험예 7> 본 발명의 복합체의 암세포 사멸효과 평가
7-1. 제조예 1에서 제조한 그래핀 양자점-트라스트주맙 복합체의 암세포 사멸효과 평가
HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2)의 양성 유방암 세포주인 BT-474를 이용하여 그래핀 양자점, 제조예 1에서 제조한 트라스투주맙이 결합된 그래핀 양자점 복합체(GQD-HER)의 암세포 독성을 확인하였다. 트라스투주맙은 암세포에서 다량 발현되는 HER2를 표적으로 하는 항체이다.
그래핀 양자점과 트라스투주맙이 결합된 복합체(GQD-HER)의 농도가 0, 100, 200, 300, 및 500 μg/mL가 되도록 각각의 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플을 BT-474세포에 48시간 동안 처리한 후, 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점 자체는 HER2 양성 암세포에 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 HER2 표적 항체인 트라스투주맙이 결합된 복합체의 경우 HER2 과발현 암세포인 BT-474에 세포독성을 나타내었다.
7-2. 실시예 1-3에서 제조한 복합체의 암세포 사멸효과 및 표적 효율성 평가
HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) 양성 유방암 세포주인 BT-474와 HER2의 음성 유방암 세포주인 MCF-7을 이용하여, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 암세포 사멸효과 및 표적 효율성을 확인하였다. 정상 유방세포에는 세포당 약 20,000개의 HER2 수용체가 있는 반면, HER2 과발현형 유방암세포에서는 약 100배 이상의 HER2가 발현되는 것으로 알려져 있다. 트라스투주맙은 HER2에 결합하여 암세포를 사멸하는 효과를 나타내며, HER2와 결합한 후 엔도사이토시스를 통해 세포 내로 이동하는 것으로 알려져 있다.
실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)의 농도가 0, 20, 100, 200, 300, 및 500 μg/mL 가 되도록 각각의 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플을 BT-474 세포와 MCF-7 세포에 동일하게 48시간 동안 처리한 후, CCK assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)는 500 μg/mL의 고농도에서 HER2 음성 암세포에서 세포독성을 나타내지 않는 반면, HER2 과발현 암세포인 BT-474에서는 높은 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 복합체가 특정 암세포에 선택적으로 항암활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
7-3. 실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체의 암세포 사멸효과 평가
본 발명의 실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체(DL-GQD)의 암세포 사멸 효과를 평가하기 위해 유방암 세포주인 BT-474 를 이용하여 세포사멸 효과를 확인하였다.
실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체(DL-GQD)의 농도가 0, 20, 50, 100 μg/mL가 되도록 각각의 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플을 BT-474 세포에 48시간 동안 처리한 후, CCK assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
대조군으로는 상기 0, 20, 50, 및 100 μg/mL 농도의 실시예 2의 복합체 샘플에 함유된 독소루비신의 양과 동량이 되도록 프리-독소루비신(Free-DOX)을 각각 0, 1.8, 4.4, 및 8.8 μg/mL으로 처리하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 복합체(DL-GQD)의 경우 BT-474에 투입한 양이 증가함에 따라 세포 독성이 증가하는 것이 관찰되었으며, 100 μg/mL의 농도로 처리한 경우 25 %의 현저히 높은 세포 독성을 나타내었고, 프리-독소루비신보다 더 우수한 세포 독성을 나타내었다.
< 실험예 8> 그래핀 양자점의 세포 섭취 및 발광 효과 확인
8-1. MCF-7 세포의 세포 섭취 및 발광 효과 확인
공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM) 및 암시야 현미경(dark-field microscopy)으로 그래핀 양자점의 세포 섭취(cellular uptake) 및 세포 내 발광을 관찰하였다.
MCF-7 세포를 5 X 104 cells/mL의 양만큼 cover glass bottom dish에 식립한 후 24 시간 배양하였다. 공초점 레이저 현미경 관찰을 위해 2 mg/mL 농도의 실시예 1-1에서 제조한 그래핀 양자점과 세포질 염색약인 라이조트래커(Lysotracker)를 2 mM 농도로 첨가한 후 14 시간을 추가 배양하고 공초점 레이져 현미경으로 세포 섭취를 관찰하였다.
또한, 암시야 현미경 관찰을 위해 MCF-7 세포를 5 X 104 cells/mL의 양만큼 cover glass bottom dish에 식립 후 24 시간 배양한 뒤 2 mg/mL 농도의 그래핀 양자점을 첨가하여 14 시간 추가 배양 후 세포섭취를 관찰하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 그래핀 양자점이 세포 내로 섭취되어 청색광을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체가 체내에 투여된 약물을 모니터링하는데 사용될 수 있고, 또한 암세포의 영상화에도 사용될 수 있음을 알 수 있다.
8-2. BT-474 세포의 세포 섭취 및 발광 효과 확인
HER2 양성 유방암 세포주인 BT-474에 실시예 1-3에서 제조한 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(GQD-comp), 실시예 2에서 제조한 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD) 또는 프리-독소루비신(Free-DOX)을 각각 처리하여 배양하였다. 배양된 세포에 세포질에서만 선택적으로 녹색광을 띄는 라이조트래커(Lysotracker) 2 μM을 처리하였다.
형광성 그래핀 양자점들은 청색광을 띄고 독소루비신은 적색광을 나타내기 때문에, 세포질에만 선택적으로 녹색광을 띄는 라이조트래커 2 μM을 처리하여 독소루비신이 담지된 그래핀 양자점 복합체의 생체외 내포작용(in vitro endocytosis) 및 핵으로의 국지화 현상을 확인할 수 있다.
공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 이용하여 배양된 복합체들의 세포 섭취(cellular uptake) 및 세포 내 발광 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 19의 (a)에 나타낸 바와 같이, 약물이 담지되지 않은 실시예 1-3의 복합체(βCD-GQD-HER)의 경우, 녹색으로 염색된 세포질 내 청색 신호가 관찰되었다. 따라서, 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(βCD-GQD-HER)가 세포내에 내포작용으로 성공적으로 내입되며, 약물전달체로서의 우수한 역할할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 19의 (b)에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 복합체(DL-GQD)의 경우, 독소루비신을 담지하고 있어, 유방암 세포 내 적색 신호가 관찰되었으며, 프리-독소루비신(Free-DOX)만 처리한 경우를 관찰한 도 19의 (c)와 유사한 결과를 나타내었다.
이상의 결과는 앞서 실험예 7의 in vitro 암세포 사멸효과 평가 결과와 일치하는 것으로, 독소루비신이 담지된 베타 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-트라스투주맙 복합체(DL-GQD)가 BT-474 표면에 과발현된 HER2 수용체에 선택적으로 표적화되어 보다 효과적으로 세포 내부에 독소루비신이 전달될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. 하나 이상의 사이클로덱스트린;
    하나 이상의 암 표적화 항체; 및
    표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점을 포함하고,
    상기 사이클로덱스트린은 상기 그래핀 양자점의 아민기와 카보닐(-(C=O)-) 링커로 연결되어 있고, 상기 암 표적화 항체는 상기 그래핀 양자점의 아민기와 펩티드 결합(-(C=O)-NH-)하고 있는 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 베타 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암 표적화 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 이필리무맙(ipilimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세툭시맙(cetuximab), 패니투무맙(panitumumab), 카투막소맙(catumaxomab), 니모투주맙(nimotuzumab), 비바툭신(vivatuxin), 트레멜리무맙(tremelimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 니볼루맙(nivolumab), 다세투주맙(dacetuzumab), 우렐루맙(urelumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab), 블리나투모맙(blinatumomab) 또는 마투주맙(matuzumab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암 표적화 항체는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 퍼투주맙(pertuzumab) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표면에 아민기를 가지는 그래핀 양자점은 L-글루탐산을 열분해하여 제조된 것인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체의 직경이 10 내지 1000 nm인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린에 소수성 항암 약물이 담지되어 있는 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암 약물은 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 캄토테신 및 메토트렉세이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 유방암, 위암, 전립선암, 자궁경부암, 난소암, 피부암, 구강암, 식도암, 위암, 췌장암, 대장암, 방광암, 요관암, 간암, 폐암, 골육종, 신경교종, 뇌종양, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 또는 형질세포성종양으로 이루어진 군에서 선택된 어느하나 이상인 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 위암인 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 약물 모니터링용 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 암의 진단용 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체를 포함하는 광열 치료 또는 광역학 치료용 조성물.
  15. S1) 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점, 사이클로덱스트린 및 1,1`-카보닐디이미다졸을 혼합하여 복합체를 제조하는 단계, 및
    S2) S1에서 제조된 복합체와 암 표적화 항체를 혼합하는 단계
    를 포함하는 제1항의 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, S1)의 상기 표면에 아민기(-NH2)를 가지는 그래핀 양자점은 L-글루탐산을 열분해하여 제조된 것인 사이클로덱스트린-그래핀 양자점-암 표적화 항체 복합체의 제조방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109467074A (zh) * 2018-12-13 2019-03-15 南京师范大学 一种提高阿霉素抗癌效率的碳量子点及其制备方法与应用
KR20190140582A (ko) * 2018-06-12 2019-12-20 가천대학교 산학협력단 아스코빅산 검출을 위한 산화그래핀-양자점 복합체 센서 및 이를 이용한 아스코빅산 검출 방법
CN112592717A (zh) * 2020-12-18 2021-04-02 湖南工业大学 一种纳米荧光碳点及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140033794A (ko) 2012-09-10 2014-03-19 한국전기연구원 양자점 및 탄소나노튜브를 하이브리드로 이용한 실시간 암진단 및 치료용 접합체
KR101407903B1 (ko) 2012-11-23 2014-06-13 한국교통대학교산학협력단 근적외선 그래핀 양자점의 합성방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140033794A (ko) 2012-09-10 2014-03-19 한국전기연구원 양자점 및 탄소나노튜브를 하이브리드로 이용한 실시간 암진단 및 치료용 접합체
KR101407903B1 (ko) 2012-11-23 2014-06-13 한국교통대학교산학협력단 근적외선 그래핀 양자점의 합성방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem. Eur. J. 2011, 17, 5171 - 5179 *
J Mater Chem C Mater Opt Electron Devices. 2013 August 21; 1(31): 4676-4684 *
Macromolecular Research, Vol. 18, No. 7, pp 641-647 (2010) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190140582A (ko) * 2018-06-12 2019-12-20 가천대학교 산학협력단 아스코빅산 검출을 위한 산화그래핀-양자점 복합체 센서 및 이를 이용한 아스코빅산 검출 방법
CN109467074A (zh) * 2018-12-13 2019-03-15 南京师范大学 一种提高阿霉素抗癌效率的碳量子点及其制备方法与应用
CN112592717A (zh) * 2020-12-18 2021-04-02 湖南工业大学 一种纳米荧光碳点及其制备方法

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