KR20180009938A - 에피카테킨을 유효성분으로 포함하는 오십견 및 근육암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
에피카테킨을 유효성분으로 포함하는 오십견 및 근육암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종(Soft-tissue sarcoma) 예방 및 치료용 약학적 조성물으로서, 상기 조성물은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포를 근원세포로 분화유도하거나, 횡문근육종 세포를 근원세포로 재분화시키는 것이다.
Description
본 발명은 근육암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로는 p38MAPK 및 Akt 신호전달 경로의 활성화를 통하여, MyoD-매개 근원세포(myoblast)의 분화를 촉진하고 근육 재생 능력을 강화하며, 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma: RD) 세포를 근원세포로 재분화하여 근육암을 예방 또는 치료하는 에피카테킨을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 오십견의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로는 섬유아세포에서 근원세포로의 전환분화하는 것을 유도하여 골격근의 섬유화를 막고 근육생성을 활성화하는 에피카테킨을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 대한 것이다.
근육 이상과 관련된 질환은 근육 손실 및 관련 질환, 예를 들면, 근육감소증, 악액질, 근육손상, 근이영양증 및 근육피로이다.
근육 손실은 근육량의 점진적 손실, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 근육 손실은 다양한 원인에 기인하며, 다양한 병증, 질병 및 질환과 관련된다. 특히 암, 자가면역 질환, 감염 질환, HIV 감염, AIDS, 만성 염증, 관절염, 영양실조, 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 구루병, 만성 하부 척추 통증, 말초신경 손상, 척수 손상, 화학적 손상, 중추신경계(CNS) 손상과 같은 다른 질환도 근육 손실과 연관되거나 근육 손실을 야기할 수 있다.
근육 손실을 유발하는 암으로서는 근육에 발생하는 연부조직 육종(Soft-tissue sarcoma)이 있으며, 구체적으로는 평활근육종(Leiomyosarcoma) 및 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)이 있다.
평활근육종(Leiomyosarcoma) 및 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)은 악성 종양으로서 덩어리짐, 통증, 두통, 메스꺼움, 출혈등의 증상을 수반하는 질환이다. 이러한 질환의 치료를 위해서 외과적 수술, 화학요법, 방사선 치료 등이 동원된다. 약물치료를 위해서 할라벤(Halaven, 에리불린 메실레이트)등의 약물이 개발되고 있으나, 피로감, 호중구 감소증, 구역, 탈모, 변비, 복통, 발열 등 다양한 부작용이 보고되고 있다.
오십견은 유착성 관절낭염(adhesive capsulitis)이라고도 하며, 어깨 관절의 통증과 운동의 장애가 수반되는 질환이다. 오십견에 대한 정확한 발병원인은 아직 알 수 없으나, 근육조직사이에 섬유화가 발생하고 이로 인하여 근육의 기능이 정상적으로 발휘되지 못하며, 통증을 수반하면서 석회화를 수반하는 경우가 있다.
이에 본 발명자는 평활근육종(Leiomyosarcoma) 및 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)을 포함하는 근육암 및 오십견의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로는 에피카테킨이 p38MAPK 및 Akt 신호전달 경로의 활성화를 통해 MyoD-매개 근원세포의 분화를 촉진하고, 섬유아세포가 근원세포로 전환분화하는 것을 촉진함으로써 근육 재생 능력을 강화하고, 골격근의 섬유화를 막고, 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma: RD) 세포를 근원세포로 재분화하는 현상을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종(Soft-tissue sarcoma) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에피카테킨을 함유하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종(Soft-tissue sarcoma) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 연부조직육종은 근육에서 발생하는 것일 수 있다.
상기 연부조직육종은 평활근육종(Leiomyosarcoma) 또는 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)일 수 있다.
상기 조성물은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포를 근원세포로 분화유도하거나, 횡문근육종 세포를 근원세포로 재분화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에피카테킨을 함유하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 연부조직육종은 근육에서 발생하는 것일 수 있다.
상기 연부조직육종은 평활근육종(Leiomyosarcoma) 또는 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)일 수 있다.
상기 식품은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포를 근원세포로 분화유도하거나, 횡문근육종 세포를 근원세포로 재분화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 오십견 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 전환분화를 유도하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 오십견 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 식품은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 분화분화를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명은 에피카테킨을 유효성분으로 포함하는 근육암 예방 또는 개선용 약학적 조성물 또는 기능성 식품으로서, 에피카테킨은 근육전사인자인 MyoD, 미오게닌 및 미오신 중쇄(myosin heavy chain, MHC)를 포함하는 근원성 특이적 단백질의 발현을 촉진시키고, 근육분화 활성을 조절하여 근원세포의 근육세포로의 분화를 촉진하고, 배아 섬유아세포를 근원세포로 트랜스(전환)-분화를 촉진하고, 근육세포의 재생 능력을 강화시키며 또한 세포사멸없이 다핵성 근섬유 형성을 촉진하며, 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma: RD) 세포를 근원세포로 재분화하여 근육암 및 오십견을 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.
도 1A와 1B은 근원세포 분화능에 에피카테킨이 미치는 효과를 테스트하기 위한 면역블롯(immunoblotting) 결과이다.
도 1C는 근관세포 형성여부를 확인하기 위한 면역염색(immunostaining)이며, 도 1D는 도 1C 결과의 정량분석 결과이다.
도 2는 에피카테킨이 p38MAPK 및 Akt의 인산화를 유도하는지를 알아보기 위한 면역블롯(immunobltting) 결과이다.
도 3은 에피카테킨이 MyoD 활성과 MyoD 및 단백질 E의 이형이합체화를 촉진하는 지를 살펴보기 위한 루시퍼라아제 분석 결과(도 3A) 및 E2A 항체로 면역침전한 후 MyoD 항체로 웨스턴 블롯한 결과이다
도 4는 에피카테킨의 전환-분화능을 확인하기 위한 면역블롯 (MHC, MyoD, 미오게닌)결과 및 이에 대한 정량분석결과이다.
도 5는 에피카테킨이 MyoD-형질전환 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma: RD) 세포를 근원세포로 재분화하는지 알아보기 위한 면역블롯(MHC, MyoD, 미오게닌) 결과 (도 5A) 및 이에 대한 정량분석결과(도 5B)이며, 도 5C는 항-MHC 항체와 DAPI로 근관세포 형성정도를 보기 위한 면역염색(immunostaining) 결과이고, 도 5D는 도 5C의 면역염색(immunostaining) 결과의 정량분석 결과이다.
도 1C는 근관세포 형성여부를 확인하기 위한 면역염색(immunostaining)이며, 도 1D는 도 1C 결과의 정량분석 결과이다.
도 2는 에피카테킨이 p38MAPK 및 Akt의 인산화를 유도하는지를 알아보기 위한 면역블롯(immunobltting) 결과이다.
도 3은 에피카테킨이 MyoD 활성과 MyoD 및 단백질 E의 이형이합체화를 촉진하는 지를 살펴보기 위한 루시퍼라아제 분석 결과(도 3A) 및 E2A 항체로 면역침전한 후 MyoD 항체로 웨스턴 블롯한 결과이다
도 4는 에피카테킨의 전환-분화능을 확인하기 위한 면역블롯 (MHC, MyoD, 미오게닌)결과 및 이에 대한 정량분석결과이다.
도 5는 에피카테킨이 MyoD-형질전환 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma: RD) 세포를 근원세포로 재분화하는지 알아보기 위한 면역블롯(MHC, MyoD, 미오게닌) 결과 (도 5A) 및 이에 대한 정량분석결과(도 5B)이며, 도 5C는 항-MHC 항체와 DAPI로 근관세포 형성정도를 보기 위한 면역염색(immunostaining) 결과이고, 도 5D는 도 5C의 면역염색(immunostaining) 결과의 정량분석 결과이다.
에피카테킨은 카카오콩에서 발견되며 식품중에서 카테킨의 대부분을 차지하며, 녹차의 총 건조중량의 약 2~5%을 구성한다. 에피카테킨 및 카테킨을 포함하는 항산화 영양소는 골근육세포의 에스트로겐 발현을 억제하고, ERK 신호전달을 억제하며, unloading-mediated 근육 위축증 예방을 초래한다. 다크초콜릿에 존재하는 주요 성분인 에피카테킨은 심혈관질환 및 심근손상의 발병위험을 줄인다(Buijsse, Weikert, Drogan, Bergmann, & Boeing, 2010; Ramirez-Sanchez, Maya, Ceballos, & Villarreal, 2010). 에피카테킨은 현저하게 골형성증식, 분화 및 미네랄화를 촉진한다(Zeng et al.,2014). 게다가 인간에 있어서, 에피카테킨의 처방은 근육성장 및 강화에 이로운 효과((Gutierrez-Salmean et al., 2014)를 갖는다. 그러나 근육성장에 대한 에피카테킨의 양성적 효과에 대한 자세한 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다.
본 발명에서 본 발명자는 근원세포(myoblast) 분화에 대한 에피카테킨의 효과를 연구하였다. 에피카테킨이 주요 근육분화(promyogenic) 신호전달경로인 p38MAPK 및 Akt를 활성화하여 MyoD 활성 및 근원세포의 분화를 촉진한다. 게다가 에피카테킨의 처리는 MyoD에 의해 유발되는 마우스 배아 섬유아세포의 근원성 전환을 촉진하고, 근육재생을 촉진하며, 인간 횡문근육종(rhabdomyosarcoma) RD 세포주의 분화능을 촉진한다. 또한 섬유아세포를 근원세포로 전환분화하여 근육섬유화를 저지할 수 있다.
종합하면, 본 발명의 에피카테킨 처리는 주요 근육분화 신호전달(promyogenic signalings)의 활성화 및 MyoD-매개 유전자 발현을 통한 근원성 분화를 촉진한다. 이리하여, 에피카테킨은 근육퇴화, 근육위축, 오십견 및 횡문근육종을 포함하는 근육암 등을 개선, 예방 및 치료하기 위한 치료제 및 건강기능성 식품으로서 가능성을 보유하고 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 근육암의 치료 또는 예방용 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 치료 및 예방에 사용하기 위해 본 발명의 에피카테킨 자체를 투여하는 것이 가능하나, 약학적 조성물의 활성 성분으로서 상기 에피카테킨이 포함되는 것이 바람직하다.
또한 상기 약학적 조성물은 상기 에피카테킨을 유효성분으로 함유하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.01∼1000 ㎎/일, 바람직하게는 1∼500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 근육암의 예방 또는 개선용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 에피카테킨을 함유할 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 에피카테킨 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
1. 실시예
(1) reagents
에피카테킨(PubChem CID: 72276)을 시그마-알드리치사로부터 구입하였다.
(2) 세포 배양
근원세포 C2C12, 배아 섬유아세포 10T1/2 세포주 및 배아 신장 293T 세포를 배양하였다(Bae et al., 2009; Bae et al., 2010). C2C12 근원세포 (myoblast)의 분화를 유도하기 위해, 융합점 근처의 세포주를 37, CO2 인큐베이터에서 15% FBS (growth medium, GM)를 포함하는 DMEM에서 2% HS (differentiation medium, DM)를 함유하는 DMEM으로 이주하였고, 약 48 내지 72시간 동안 근관세포(myotube) 형성을 관찰하였다. 근관세포(myotube) 형성의 효율성은 임시 분화 분석(transient differentiation assay)를 이용하여 정량화되었다(Bae et al.,2010).
p38MAPK 억제제 및 Akt 억제제가 사용된 본원발명의 실험결과에서, 새로운 배양배지에서 30분간 C2C12 세포는 2.5 μM의 SB203580(CalBiochem, La Jolla, CA)또는 1 μM의 LY294002으로 선배양된 후 20 μM 에피카테킨으로 처리되었다.
Cdo+/+ 마우스에서 분리된 마우스 배아 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)가 배양되었고(Cole & Krauss, 2003), MEFs는 20% FBS 및 염기 섬유아세포 성장인자(bFGF; 100 ng/mL)를 포함하는 F10 배지에서 배양되었다. 트랜스(전환)-분화 연구를 위해, 100 mm 배양 접시에 10T1/2 세포주와 MEFs 세포들을 10% FBS가 함유된 DMEM에서 배양하여, 5 ㎍ MyoD 또는 대조군 벡터(pBp)로 형질전환하였다. 24시간 내지 48시간 동안 배양한 후, 10T1/2 세포주 및 MEFs 세포는 2일 동안 2% HS에서 20 μM 에피카테킨으로 처리되었다.
(3) 웨스턴블럿 및 면역침전(Western blotting analysis and immunoprecipitation analysis)
세포주를 온전한 proteinase inhibitor cocktail (Roche)를 포함하는 추출 버퍼(10 mM Tris-Hcl, [pH7.2], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100)에서 분쇄(lysis)시키고 SDS PAGE를 수행하였다. 일차 항체로는 항-Cdo, 항-pan-Cadherin, 항-p38, 항-p-p38 (p38MAPK의 인산화된 활성형), 항-Akt, 항-p-Akt (Akt의 인산화된 활성형), 항-MHC, 항-미오게닌 및 항-MyoD를 사용하였다.
면역침전분석을 위해서, C2C12 또는 293T 세포가 36시간 동안 MyoD로 형질전환되었다. 24시간 동안 에피카테킨으로 처리한 후, 세포 추출액 전체는 항-E2A 및 단백질 G 아가로스 비드(Roche Diagnostics)로 4℃ 오버나이트 배양하였다. 비드는 추출 버퍼로 3회 세척하였고, 추출 버퍼안에서 재현탁하였다. 그리고 샘플을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
(4) 면역 세포 화학 및 현미경 검사(Immunocytochemistry and microscopy)
C2C12 세포주를 4 % 파라 포름알데하이드(paraformaldehyde)로 20분간 고정시키고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline)의 0.2 % Triton X-100로 투과시킨 후 밀봉하여 항-MHC로 염색하였다. 이어서 Alexa Fluor 568-접합 2차 항체(Molecular Probes)로 처리하였다. 이미지는 Nikon ECLIPSE TE-2000U microscope, NIS-Elements F software (Nikon), Photoshop CS5 (Adobe)로 촬영 및 처리하였다.
(5) 루시퍼라제 분석(Luciferase assay)
C2C12 세포주가 웰(well)당 4 x 104 세포주의 밀도로 12-웰 플레이트에 파종되었다. 파종 후 24시간이 지난 후, C2C12 세포주는 MyoD-Luc 리포터 플라즈미드 100 ng 및 Lipofectamine 2000을 사용하여 형질전환되었다. 24시간 경과 후, 형질전환된 세포주는 GM으로 운반되어, 수확되었다. 그리고 firefly luciferase activity는 Luciferase Reporter Assay System (Promega)의 Luminometer 를 사용하여 측정되었다.
2. 실험예
(1) 근원세포 분화를 촉진하는 에피카테킨
근원세포 분화에 있어서 에피카테킨의 효과를 실험하기 위해, vehicle DMSO 또는 다양한 에피카테킨의 농도 조건에서, C2C12 근원세포를 2일 동안 분화유도하였고, 근육-특이적 단백질을 사용하는 면역블롯(immunoblotting)을 이용하여 근원세포의 분화에 미치는 영향을 평가하였다.
에피카테킨으로 처리된 C2C12 근원세포는 MHC 및 미오게닌의 발현이 에피카테킨의 양에 비례하여 증가하였고, MyoD 수준은 변동이 없었다(도 1A). 게다가 2일 동안 에피카테킨으로 처리된 C2C12 근원세포는 더 많은 핵을 갖고, 보다 길어진 MHC-양성 근관세포를 형성하였고, 이는 MHC immunostaining에 의해 분석되었다.
근관세포 형성을 정량분석하기 위해, MHC-양성 세포주들은 근관세포당 2개에서 5개의 핵을 가진 세포, 6개 또는 그 이상의 핵을 가진 세포 또는 단핵세포로 집계되었고, 이를 도식화하였다(도 1C).
에피카테킨 처리는 투여량에 따라, 6개 이상의 핵을 가진 근관세포의 비중을 증가시키고, 단핵세포의 비중을 급격히 감소시켰다. 이러한 결과들은 생화학적 측면에서나 형태학적 측면에서 에피카테킨이 C2C12 근원세포의 분화를 촉진시키고 있음을 의미한다.
(2) 근원세포 분화에서 p38MAPK 및 Akt를 활성화하는 에피카테킨
p38MAPK 및 Akt 신호전달 경로는 골근육분화에 중요한 역활을 수행한다. 에피카테킨-매개 근원세포 분화의 분자조절경로를 분석하기 위해, C2C12 근원세포는 다양한 농도의 에피카테킨으로 처리되었으며, 면역블롯(immunoblotting)에서 p38MAPK (pp38)또는 Akt(pAkt)의 활성화된 인산화 형태에 대한 항체를 사용하여 p38MAPK 및 Akt의 활성화 상태를 분석하였다.
에피카테킨의 처리는 투여량에 비례하여, pp38 및 pAkt의 수준을 상당히 향상시킨 반면, 전체 단백질의 발현수준은 상대적으로 일정하였다(도 2A). 에피카테킨이 처리된 근원세포와 마찬가지로, 에피카테킨으로 처리된 MEFs는 pp38 및 pAkt의 수준이 향상됨을 보였고(도 2B), 특히 MEFs에서 p38MAPK의 인산화된 수준은 에피카테킨이 1~5μM 범위일 때 최고수준이었다.
본 발명자는 p38MAPK 및 Akt의 활성이 에피카테킨-매개 근원세포 분화에 필수인 지를 실험하였다. 이를 위해, C2C12 근원세포는 분화배지에서 48 시간 동안 에피카테킨으로 처리하기 전에, p38MAPK에 대한 약물학적 억제제인 SB203580 또는 Akt에 대한 약물학적 억제제인 LY294002로 30분간 선처리하였다. 이후, pp38, pAkt, MHC, MyoD 및 미오게닌의 발현정도가 분석되었다. SB203580에 의한 p38MAPK 의 억제는 대조군(vehicle-treated 세포주)에 비해 MHC 및 미오게닌의 발현수준을 급격히 감소시켰고, MyoD의 발현수준을 완만히 감소시켰다(도 2C). 에피카테킨 처리는 SB203580로 선처리된 C2C12 근원세포에서 미오게닌의 발현을 부분적으로 회복시켰으나, MHC 및 MyoD의 발현수준을 회복시키지 못했다. 이와 유사하게, LY294002-선처리에 의한 Akt 억제는 대조군에 비하여 근원세포성 단백질 (예를 들면, MHC, MyoD 및 미오게닌)의 발현을 감소시켰다(도 2D).
추가적으로, 에피카테킨 처리는 Akt가 억제된 세포주에서 MHC, MyoD 및 미오게닌의 발현을 회복시키지는 못했다. 이러한 근원세포성 신호전달경로는 근원세포성 표현형을 유지하고 증폭시키는 양성 피드백 네트워크와 관련이 있다. 그리고 근육분화효과(promyogenic effects)는 대부분 MyoD-매개 근육-특이적 유전자(예를 들면, MHC 및 Myogenin) 발현을 통한 활성화를 통해서 조절된다. 이러한 결과는 에피카테킨의 근육분화(promyogenic) 활성이 MyoD의 활성 및 근원세포의 분화를 향상시키기 위한 p38MAPK 및 Akt 작용경로의 활성화에 의존적임을 의미한다.
(3) MyoD의 활성 및 MyoD와 E 단백질의 이형이합체화를 촉진하는 에피카테킨
에피카테킨이 MyoD 활성화에 미치는 효과를 실험하기 위해, C2C12 근원세포는 MyoD-반응성 루시퍼라제 리포터(4RTK-luc)로 형질전환하였다. 24시간 후, 근원세포는 36 시간 동안 DMSO 또는 다양한 농도의 에피카테킨이 들어있는 분화배지로 이주되었고, 이어서 루시퍼라제 분석을 실시하였다. 도 3A에서 보다시피, 에피카테킨은 용량에 비례하여, MyoD-의존적 루시퍼라제 활성을 증가시켰다. 이는 에피카테킨이 MyoD의 전환분화능(transactivation)을 향상시켰음을 의미한다.
p38MAPK 및 Akt는 MyoD 및 파트너 E단백질의 이형이합체화를 향상시켜 MyoD의 활성화를 유도한다. 그러므로 본 발명자는 MyoD 및 E 단백질의 이형이합체화가 에피카테킨 처리에 의해 향상되는지를 연구하였다. 이를 위해, C2C12 근원세포는 2일 동안 분화배지에서 vehicle 또는 에피카테킨으로 처리되었고, E2A에 대한 항체로 면역침전(immunoprecipitation)을 실시하였고, MyoD 항체로 면역블롯(immunoblotting)을 실시하였다. 분쇄물(lysate)내에서 E2A 단백질의 수준은 일정하게 유지된 반면, 에피카테킨으로 처리된 C2C12 근원세포에서 MyoD의 수준은 대조군(vehicle-treated cells)에 비하여 점차적으로 증가하였다(도 3B). 마찬가지로 대조군에 비해, 에피카테킨으로 처리된 C2C12 근원세포의 E2A 항체와의 침전물에서 더 많은 MyoD 단백질이 발견되었다. MyoD와 E2A의 복합체 형성에 미치는 에피카테킨의 효과를 확인하기 위해, 293T 세포주를 MyoD 발현벡터로 형질전환시키고, vehicle(대조군) 또는 에피카테킨으로 처리하였다. 내인성 상호작용과 마찬가지로, 에피카테킨 처리는 대조군에 비해, MyoD로 형질전환된 C2C12 근원세포의 E2A 침전물내에서의 MyoD의 양을 증가시켰다(도 3C). 이러한 데이터는 p38MAPK 및 Akt와 마찬가지로, 에피카테킨이 E 단백질과의 이형이합체화를 통해 MyoD의 활성을 향상시킨다는 것을 의미한다.
(4) MyoD에 의해 매개되는 섬유아세포의 근원성 전환(myogenic conversion)을 촉진시키는 에피카테킨
MyoD는 섬유아세포에서 근원세포로의 전환능을 갖는다. 이에 본 발명자는 에피카테킨이 MyoD에 의해 매개되는, 섬유아세포로부터 근원세포로의 전환분화 활성을 향상시키는지를 실험하였다. 대조군 pBp(pBabe-puro) 또는 pBp/MyoD를 발현하는 10T1/2 마우스 배아 섬유아세포를 DMSO 또는 에피카테킨으로 처리한 후 2일 동안 분화유도되었다. 그리고 면역블롯(immunoblot)분석을 실시하였다. vehicle로 처리된 10T1/2 세포주의 MyoD의 이소성(ectopic) 발현은 MyoD, 미오게닌 및 MHC의 발현을 유발하고, 이는 에피카테킨 처리로 인하여 더욱 향상된다(도 4A, 4B). 이와 마찬가지로, 에피카테킨 처리는 또한 대조군에 비해, MyoD로 형질전환된 MEFs에서 MHC 및 미오게닌의 발현을 증가시킨다(도 4C 및 4D). 본 발명자들은 10T1/2 세포주에서 p38MAPK 및 Akt의 활성화 상태를 조사하였다. MyoD에 의한 10T1/2 세포주의 전환분화는 pp38 및 pAkt 의 수준을 향상시키고 이는 에피카테킨의 처리에 의해 더욱 더 향상된다(도 4E, 4F). 이러한 결과는 에피카테킨 처리가 p38MAPK 및 Akt의 활성화를 통해서 섬유아세포의 MyoD-의존성 전환분화의 가능성을 향상시킨다는 것을 의미한다. 진행성 근육섬유화는 근육위축증 및 노화성 근육 위축증과 관계있는 이소성 근육 재생과 상호관련성이 있다. 근육 줄기세포의 근원성(myogenic capacity) 향상은 근육재생을 개선하는 효과적인 예방책이다. 근원성 분화 및 섬유아세포의 전환분화에 대한 에피카테킨의 효과는 노화 또는 근위축 조건에서 근육재생을 개선하는데 효과적일 수 있다.
(5) 인간 RD 세포(rhabdomyosarcoma cells)의 근원성 분화를 향상시키는 에피카테킨
횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)은 비정상적인 분화성을 갖는 골근육세포로부터 발생하는 cancer의 악성형태이다. 본 발명자는 에피카테킨이 인간 횡문근육종 세포주의 분화능을 개선할 수 있는지를 실험하였다. 인간 횡문근육종 RD 세포주는 72시간 동안 에피카테킨으로 처리되었고, MHC, MyoD 및 미오게닌의 발현을 위한 immunoblotting을 실시하였다. 도 5A 및 5B에서, 에피카테킨 처리는 대조군과 비교시, MHC 및 MyoD의 발현을 향상시켰다. 게다가, 대조군에 비해, 에피카테킨 처리는 근관세포 형성도 개선하였고, 6개 이상의 핵을 가진 대형 근관세포의 비중을 향상시켰다(도 5C 및 5D). 이러한 결과는 에피카테킨이 인간 횡문근육종 세포주의 분화능을 개선시킬 수 있음을 의미한다.
Claims (12)
- 에피카테킨(Epicatechin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종(Soft-tissue sarcoma) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 연부조직육종은 근육에서 발생하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 연부조직육종은 평활근육종(Leiomyosarcoma) 또는 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma) 인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 전환분화를 유도하거나, 횡문근육종 세포를 근원세포로 재분화시키는 것인 조성물.
- 에피카테킨을 함유하는 것을 특징으로 하는 연부조직육종 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
- 제 5항에 있어서, 상기 연부조직육종은 근육에서 발생하는 것을 특징으로 하는 식품.
- 제 5항에 있어서, 상기 연부조직육종은 평활근육종(Leiomyosarcoma) 또는 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma) 인 것을 특징으로 하는 식품.
- 제 5항에 있어서, 상기 식품은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 전환분화를 유도하거나, 횡문근육종 세포를 근원세포로 재분화시키는 것인 식품.
- 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 오십견 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 전환분화를유도하는 것인 조성물.
- 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 오십견 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
- 제 11항에 있어서, 상기 식품은 근육전사인자인 MyoD의 활성을 조절하여 근원세포의 근관세포로의 분화를 유도하거나, 섬유아세포에서 근원세포로 전환분화를 유도하는 것인 식품.
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