KR20180002687A

KR20180002687A - 인터루킨 36 수용체(il-36r)에 대한 항체

Info

Publication number: KR20180002687A
Application number: KR1020177032985A
Authority: KR
Inventors: 피터 바우어스; 앤드류 존 맥나잇; 데이비드 제이. 킹; 마르코 론디
Original assignee: 아납티스바이오, 아이엔씨.
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2018-01-08
Also published as: ES2914243T3; AU2016248208A1; RU2017139481A3; AU2016248208B2; EP3283110A4; US20200087408A1; CN107847590B; US20180094065A1; EP4176900A1; JP7212098B2; US10526410B2; WO2016168542A1; KR102666920B1; CA2982555A1; RU2017139481A; PL3283110T3; CN107847590A; EP3283110B1; MX2017013080A; DK3283110T3

Abstract

본 발명은 인터루킨 36 수용체(interleukin 36 receptor: IL-36R)에 의해 인코딩되는 단백질에 결합하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 전술한 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 IL-36R-결합제를 제공한다. 본 발명은 또한 관련된 벡터, 조성물, 및 IL-36R 억제에 대한 반응성 질병 또는 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환, 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 IL-36R-결합제를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

인터루킨 36 수용체(IL-36R)에 대한 항체

본원과 동시에 제출되고 다음과 같이 확인된 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 전체로 본원에 참고문헌으로 포함된다: 2016년 4월 13일에 생성된 "723558_ST25.TXT," 라는 이름의 70,258 Byte ASCII(Text) 파일.

인터루킨 36 (IL-36) 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ(이전에는 IL-1F6, IL-1F8 및 IL-1F9)는 IL-36 수용체(IL-36R)(이전에는 IL-1Rrp2 또는 IL-1Rrp2)에 결합하고 IL-1 수용체 액세서리 단백질(IL-1 receptor accessory protein: IL-1RAcP)을 공수용체로 사용하여 IL-1에 의해 유도된 것과 유사한 세포 내 신호전달을 자극하는 인터루킨-1(IL-1) 패밀리 구성원이다(Towne et al., J. Biol. Chem ., 279(14): 13677-13688 (2004)). IL-1F5는 IL-36R의 길항제로서 작용하는 것으로 밝혀진 IL-1 패밀리 구성원이며, 현재 IL-36Ra로 지칭된다(Dinarello et al., Nat. Immunol ., 11(11): 973 (2010)).

IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ는 병원체에 노출된 및 피부 내부 상피 조직, 및 피부 내를 포함하는 여러 조직에서 고도로 발현된다. IL-1β/TNF-α-자극된 인간 각질형성세포에서 IL-36Ra 및 IL-36α의 발현이 유의하게 증가되며, 건선 피부 병변에서 IL-36Rα 및 IL-36γ mRNA가 과발현된다. 만성 신장 질환에서도 향상된 IL-36α mRNA 및 단백질 발현이 관찰되었다(Ichii et al., Lab Invest., 90 (3) : 459-475 (2010)). 쥣과 골수 유래 수지상 세포 (BMDCs)와 CD4+ T 림프구는 모두 전염증성 사이토카인(예를 들어, IL-12, IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 IL-23)을 생산함으로써 IL-36R을 구성적으로 발현하고 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 직접적으로 반응하여 다른 IL-1 사이토카인보다 더욱 강한 자극 효과를 유도한다(Vigne et al., Blood, 118(22): 5813-5823 (2011)).

각질형성세포에서 IL-36α를 과발현하는 형질전환 마우스는 출생시에 일시적인 염증성 피부 장애를 나타내어, 인간 건선과 유사한 12-O- 테트라데카노일포르 볼13-아세테이트-유발된 피부 병리학에 대해 마우스가 고도로 감수성이 있게 한다(Blumberg et al., J. Exp . Med., 204(11): 2603-2614 (2007); 및 Blumberg et al., J. Immunol., 185(7):4354-4362 (2010)). 또한, IL-36R-결핍 마우스는 이미퀴모드(imiquimod)-유도된 건선성 피부염으로부터 보호된다(Tortola et al., J. Clin. Invest., 122(11): 3965-3976 (2012)). 이러한 결과는 피부의 특정 염증성 질환에서 IL-36의 역할을 강하게 시사한다.

IL-36 사이토카인은 또한 농포성건선, 전신성 농포성건선(GPP), 및 손-발바닥 농포성건선(palmo-plantar pustulosis: PPP)을 포함하는 건선의 특정 중증 형태에 연관되어 있다(예를 들어, Town, J.E. and Sims, J.E., Curr . Opin . Pharmacol., 12(4): 486-90 (2012); 및 Naik, H.B. and Cowen, E.W., Dermatol Clin., 31(3): 405-425 (2013) 참조). 농포성건선은 붉은 피부로 둘러싸인 하얀 농포로 특징지어지는 드문 형태의 건선이다. 전신성 농포성건선은 중증의 전신성 형태의 건선으로 치명적인 위험이 있는 반면, 손-발바닥 농포성건선은 손바닥과 발바닥에 영향을 주는 농포성건선의 만성적 형태이다. 현재 농포성건선, GPP, 및 PPP에 대한 치료는 경구용 레티노이드 및 국소 스테로이드를 포함하지만, 이러한 치료는 나쁜 효능 및 심각한 부작용을 나타낸다.

IL-36R에 높은 친화력으로 결합하고 IL-36R 활성을 효과적으로 중화시키는 IL-36R의 길항제(예를 들어, 항체)가 필요하다. 본 발명은 이러한 IL-36R-결합제를 제공한다.

본 발명은 아미노산 서열 Gln Val Gln Xaa1 Xaa2 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa3 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa4 Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Ala Xaa7 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Xaa8 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(서열번호 56)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe), (b) Xaa2는 발린(Val), 메티오닌(Met), 또는 류신(Leu), (c) Xaa3은 아르기닌(Arg) 또는 글리신(Gly), (d) Xaa4는 글리신(Gly), 세린(Ser), 또는 알라닌(Ala), (e) Xaa5는 아르기닌(Arg) 또는 알라닌(Ala), (f) Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 리신(Lys), (g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 아스파라긴(Asn), (h) Xaa8은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala), 및 (i) Xaa9는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.

본 발명은 아미노산 서열 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Xaa1 Met Xaa2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Xaa3 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Phe Xaa4 Pro Xaa5 Xaa6 Xaa7 Val Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Thr Ser Met Ile Ile Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(서열번호 15)을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 트립토판(Trp) 또는 티로신(Tyr), (b) Xaa2는 히스티딘(His), 아스파라긴(Asn), 또는 티로신(Tyr), (c) Xaa3은 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg), (d) Xaa4는 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 또는 히스티딘(His), (e) Xaa5는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr), (f) Xaa6은 아스파라긴(Asn) 또는 글리신(Gly), 및 (g) Xaa7은 세린(Ser), 알라닌(Ala), 또는 아스파르트산(Asp)이다.

본 발명은 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Gln Xaa3 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa4 Xaa5 Tyr Ser Ile Thr Xaa6 Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa7 Pro Gly Xaa8 Xaa9 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa10 Xaa11 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Xaa12 Tyr Xaa13 Cys Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa14(서열번호 57)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 Xaa1은 글루타민(Gln) 또는 아스파르트산(Asp); Xaa2는 발린 (Val) 또는 류신(Leu); Xaa3은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe); Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser); Xaa5는 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg); Xaa6은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala); Xaa7은 프롤린(Pro) 또는 페닐알라닌(Phe); Xaa8은 리신(Lys) 또는 아스파라긴(Asn); Xaa9는 글리신(Gly) 또는 리신(Lys); Xaa10은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr); Xaa11은 발린(Val) 또는 아르기닌(Arg); Xaa12는 트레오닌(Thr) 또는 발린 (Val); Xaa13은 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe); 및 Xaa14는 알라닌(Ala) 또는 부존재이다.

본 발명은 서열번호 33, 서열번호 34, 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Xaa1 Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa2 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Xaa3 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys(서열번호 36)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala), (b) Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr), 및 (c) Xaa3은 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이다.

본 발명은 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Xaa1 Asn Xaa2 Ile Thr Tyr Phe Tyr Trp Tyr Leu Xaa3 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(서열번호 40)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 세린(Ser) 또는 아르기닌(Arg), (b) Xaa2는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala), 및 (c) Xaa3은 글루타민(Gln) 또는 히스티딘(His)이다.

본 발명은 아미노산 서열 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa1 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Xaa2 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa3 Ser Gly Ser Gly Xaa4 Asp Xaa5 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Xaa6 Xaa7(서열번호 58)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 아스파르트산(Asp) 또는 트립토판(Trp), (b) Xaa2는 아르기닌(Arg) 또는 메티오닌 (Met), (c) Xaa3은 글리신(Gly), 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro), (d) Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 아스파라긴(Asn), (e) Xaa5는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr), (f) Xaa6은 아르기닌(Arg) 또는 부존재, 및 (g) Xaa7은 트레오닌(Thr) 또는 부존재이다.

본 발명은 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기된 면역글로불린 폴리펩티드를 인코딩하는 단리 또는 정제된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 상기된 면역글로불린 폴리펩티드를 포함하는 IL-36R-결합제, 이러한 IL-36R-결합제를 인코딩하는 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 단리된 세포, 이러한 IL-36R-결합제 또는 이러한 벡터와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계에 의한 IL-36R 억제에 반응하는 질환의 치료 방법을 제공한다.

도 1a는 hIL-36γ를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 hIL-36β를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 hIL-36α를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 50 ng/mL hIL-36α를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1e는 20 ng/mL hIL-36β를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1f는 600 ng/mL hIL-36γ를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 인간 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 2 ug/mL cynoIL-36α를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 시노몰구스 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 10 ug/mL cynoIL-36β를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 시노몰구스 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 300 ng/mL cynoIL-36γ를 갖는 세포의 자극시 실시예 1에 기재된 HEK 시노몰구스 IL-36R/IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 실시예 2에 기재된 KINEXA™ 분석에 의해 결정된, 인간 IL-36R에 대한 APE5281 결합으로 지칭되는 항체에 대한 곡선을 도시하는 실험 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 실시예 2에 기재된 BIACORE™ 분석에 의해 결정된, 인간 IL-36R에 대한 APE6194 결합으로 지칭되는 항체에 대한 곡선을 도시하는 실험 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 실시예 2에 기재된 KINEXA™ 분석에 의해 결정된, 인간 IL-36R에 대한 APE7247 결합으로 지칭되는 항체에 대한 곡선을 도시하는 실험 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 10 ng/mL hIL-36α를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 1 ng/mL hIL-36β를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 100 ng/mL hIL-36γ를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 10 ng/mL hIL-36α를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4e는 1 ng/mL hIL-36β를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4f는 100 ng/mL hIL-36γ를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4g는 10 ng/mL hIL-36α를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4h는 1 ng/mL hIL-36β를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4i는 100 ng/mL hIL-36γ를 사용한 실시예 3에 기재된 일차 인간 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 50 ng/mL cynoIL-36α를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 10 ng/mL cynoIL-36β를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 250 ng/mL cynoIL-36γ를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 50 ng/mL cynoIL-36α를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5e는 10 ng/mL cynoIL-36β를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5f는 250 ng/mL cynoIL-36γ를 사용한 실시예 4에 기재된 일차 시노몰구스 각질형성세포에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 5 ng/mL의 IL-36β를 사용한 실시예 5에 기재된 일차 인간 단핵구에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 500 ng/mL의 IL-36β를 사용한 실시예 5에 기재된 일차 인간 단핵구에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 10 ng/mL의 IL-36α를 사용한 실시예 6에 기재된 일차 인간 말초혈액단핵세포(PBMCs)에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 1 ng/mL의 IL-36β를 사용한 실시예 6에 기재된 일차 인간 말초혈액단핵세포(PBMCs)에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 100 ng/mL의 IL-36γ를 사용한 실시예 6에 기재된 일차 인간 말초혈액단핵세포(PBMCs)에서 IL-8 분비 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 1차 항체로 APE5100을 사용한 BIACORE™ 분석에 의해 결정된, 실시예 8에 기재된 항체/항원 교차 경쟁 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 1차 항체로 APE6155를 사용한 BIACORE™ 분석에 의해 결정된, 실시예 8에 기재된 항체/항원 교차 경쟁 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 인간 IL-36R 및 인간 IL-1RAcP를 안정적으로 동시에 발현시키는 CHO-K 세포를 사용한 실시예 9에 기재된 경쟁적 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 시노몰구스 원숭이 IL-36R 변이체 1 및 시노몰구스 원숭이 IL-1RAcP를 안정적으로 동시에 발현시키는 CHO-K 세포를 사용한 실시예 9에 기재된 경쟁적 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 20 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 2 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 300 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 1 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 100 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 3 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10d는 300 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 2 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10e는 300 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 3 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10f는 300 ng/mL cynoIL-36γ로 자극된 HEK 시노몰구스 IL-36R 변이체 4 /IL-8 세포를 사용한 실시예 1에 기재된 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 및/또는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 또는 이들의 단편(예컨대 항원결합 단편)을 제공한다. 본원에서 사용된, 용어 "면역글로불린" 또는 "항체"는 박테리아나 바이러스와 같은 이질적인 이물질을 식별하고 중화하기 위해 면역 체계에서 사용되는 단백질 또는 다른 신체 체액에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드는 이의 자연 환경으로부터 제거된다는 점에서 "단리"되어있다. 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 또는 항체는 하나 이상의 상보성 결정 부위(complementarity determining region: CDR)를 포함하는 단백질이다. CDR은 항체의 "초가변부위(hypervariable region)"를 형성하고, 이는 항원 결합에 책임이 있다(하기에 추가적으로 논의함). 전체 면역글로불린은 전형적으로 네 개의 폴리펩티드로 구성된다: 중쇄(H) 폴리펩티드의 두 개의 동일한 피 및 경쇄(L) 폴리펩티드의 두 개의 동일한 카피. 각각의 중쇄는 하나의 N-말단 가변(VH) 부위 및 세 개의 C-말단 불변(CH1, CH2, 및 CH3) 부위를 함유하고, 각각의 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 부위 및 하나의 C-말단 불변(CL) 부위를 함유한다. 항체의 경쇄는 그들의 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로, 카파(κ) 또는 람다(γ)의 두 가지 구별되는 유형 중 하나에 해당할 수 있다. 전형적 면역글로불린에서, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 두 개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 경쇄 가변 부위는 중쇄의 사변 부위에 정렬되고, 경쇄 불변 부위는 중쇄의 첫번째 불변 부위에 정렬된다. 중쇄의 나머지 불변 부위는 서로 정렬된다.

경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍의 가변 부위는 항체의 항원 결합 위치를 형성한다. V_H 및 V_L 부위는 네 개의 프레임워크(FW 또는 FR) 부위를 포함하는 각각의 부위를 갖는 동일한 일반 구조를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "프레임워크 부위(framework region)"는, 초가변 또는 상보성 결정 부위(CDRs) 사이에 위치한 가변 부위 내에 상대적으로 보존된 아미노산 서열을 지칭한다. 각각의 가변 영역에는 네 개의 프레임워크 부위가 존재하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된다. 프레임워크 부위는 가변 부위의 구조적 프레임워크를 제공하는 β 시트를 형성한다(예를 들어, C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology , 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001) 참조).

프레임워크 부위는 세 개의 상보성 결정 부위(CDRs)에 의해 연결된다. 상기 기술된 바와 같이, CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 공지된 세 개의 CDR은 항체의 "초가변부위"를 형성하고, 항원 결합에 책임이 있다. CDR은, 프레임워크 부위에 의해 형성되는 베타-시트 구조를 연결하는, 그리고 일부의 경우에는 일부를 구성하는, 루프를 형성한다. 경쇄 및 중쇄의 불변 부위가 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 연관되지 않은 반면, 불변 부위는 가변 부위의 방향에 영향을 줄 수 있다. 불변 부위는 또한 작동자 분자 및 세포와의 상호작용을 통해서 항체-의존성 보체-매개된 용혈 또는 항체-의존성 세포성 독성과 같은 다양한 작동자 기능을 나타낸다.

본 발명의 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 바람직하게 이전에는 IL-1Rrp2로 공지된, 인터루킨 36 수용체(interleukin 36 receptor: IL-36R)에 결합한다. IL-36R은 IL-1R 패밀리의 수용체이고, 리간드 IL-36α(이전에는 IL-1F6), IL-36β(이전에는 IL-1Fβ), 및 IL-36γ(이전에는 IL-1F9)에 결합한다(예를 들어, Vigne et al., Blood, 118(22): 5813-5823 (2011) 참조). IL-36α IL-36β 및 IL-36γ는 사이토카인의 IL-1 패밀리의 구성원이고 IL-36R에 결합하고 IL-1 수용체 악세서리 단백질(IL-1 receptor accessory protein: IL-1RAcP)을 공수용체로 이용하여 IL-1에 의해 유도되는 것과 유사한 세포내 신호를 자극한다(Towne et al., J. Biol . Chem., 279(14): 13677-13688 (2004)). IL-36 사이토카인 및 IL-36R은 각질형성세포 및 다른 상피 세포 유형뿐만 아니라 수지상세포 및 나이브 CD4+ T-세포에 의해서 강하게 발현된다(Towne et al., supra; Vigne et al., Blood, 118(22): 5813-5823 (2011); 및 Vigne et al., Blood, 120(17): 3478-3487 (2012)).

본 발명의 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 본 발명의 단리된 면역 글로불린 경쇄 폴리펩티드는 IL-36R 및 다른 항원에 결합하여 "이중 반응성(dual reactive)" 결합제 (예를 들어 이중 반응성 항체)를 생성시키는 물질을 형성할 수있다.

IL-36R에 결합하는 특정 다른 항체, 이들의 성분은 업계에 공지되어 있다(예를 들어, U.S. 특허출원공보 2013/0236471 참조). 항-IL-36R 항체는 또한 예를 들어, Abcam (Cambridge, MA), 및 R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)와 같은 기원으로부터 상업적으로 이용가능하다.

본 발명은 아미노산 서열 Gln Val Gln Xaa1 Xaa2 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa3 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa4 Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Ala Xaa7 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Xaa8 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(서열번호 56)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe), (b) Xaa2는 발린(Val), 메티오닌(Met), 또는 류신(Leu), (c) Xaa3은 아르기닌(Arg) 또는 글리신(Gly), (d) Xaa4는 글리신(Gly), 세린(Ser), 또는 알라닌(Ala), (e) Xaa5는 아르기닌(Arg) 또는 알라닌(Ala), (f) Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 리신(Lys), (g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 아스파라긴(Asn), (h) Xaa8은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala), 및 (i) Xaa9는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다. 일부 구현예에서, 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gln Val Gln Xaa1 Xaa2 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa3 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa4 Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Xaa7 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa8 Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(서열번호 1)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되고, 여기서 (a) Xaa1은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe), (b) Xaa2는 발린 (Val), 메티오닌 (Met), 또는 류신(Leu), (c) Xaa3은 아르기닌(Arg) 또는 글리신(Gly), (d) Xaa4는 글리신(Gly), 세린(Ser), 또는 알라닌(Ala), (e) Xaa5는 아르기닌(Arg) 또는 알라닌(Ala), (f) Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 리신(Lys), (g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala), 및 (h) Xaa8은 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.

본 발명의 중쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 어느 하나를 갖는 서열번호 56 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 및 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

본 발명은 또한 아미노산 서열 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Xaa1 Met Xaa2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Xaa3 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Phe Xaa4 Pro Xaa5 Xaa6 Xaa7 Val Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Thr Ser Met Ile Ile Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(서열번호 15)를 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 트립토판(Trp) 또는 티로신(Tyr), (b) Xaa2는 히스티딘(His), 아스파라긴(Asn), 또는 티로신(Tyr), (c) Xaa3은 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg), (d) Xaa4는 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 또는 히스티딘(His), (e) Xaa5는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr), (f) Xaa6은 아스파라긴(Asn) 또는 글리신(Gly), 및 (g) Xaa7은 세린(Ser), 알라닌(Ala), 또는 아스파르트산(Asp)이다.

본 발명의 중쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 어느 하나를 갖는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

본 발명은 또한 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Gln Xaa3 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa4 Xaa5 Tyr Ser Ile Thr Xaa6 Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa7 Pro Gly Xaa8 Xaa9 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa10 Xaa11 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Xaa12 Tyr Xaa13 Cys Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa14(서열번호 57)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 Xaa1은 글루타민(Gln) 또는 아스파르트산(Asp); Xaa2는 발린 (Val) 또는 류신(Leu); Xaa3은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe); Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser); Xaa5는 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg); Xaa6은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala); Xaa7은 프롤린(Pro) 또는 페닐알라닌(Phe); Xaa8은 리신(Lys) 또는 아스파라긴(Asn); Xaa9는 글리신(Gly) 또는 리신(Lys); Xaa10은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr); Xaa11은 발린(Val) 또는 아르기닌(Arg); Xaa12는 트레오닌(Thr) 또는 발린 (Val); Xaa13은 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe); 및 Xaa14는 알라닌(Ala) 또는 부존재이다. 일부 구현예에서, 단리된 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Val Gln Xaa2 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa3 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa4 Pro Gly Xaa5 Xaa6 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa7 Xaa8 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(서열번호 25)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되고, 여기서 (a) Xaa1은 글루타민(Gln) 또는 아스파르트산(Asp), (b) Xaa2는 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe), (c) Xaa3은 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser), (d) Xaa4는 프롤린(Pro) 또는 페닐알라닌(Phe), (e) Xaa5는 리신(Lys) 또는 아스파라긴(Asn), (f) Xaa6은 글리신(Gly) 또는 리신(Lys), (g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr), (h) Xaa8은 발린(Val) 또는 아르기닌(Arg), 및 (i) Xaa9는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.

본 발명의 중쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 하나 또는 그 이상을 갖는 서열번호 57 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 또는 서열번호 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 33, 서열번호 34, 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 1-서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 경우, 예를 들어, 본 발명의 중쇄 폴리펩티드의 IL-36R에 대한 결합의 영향을 줌으로써, 물질적으로 상기 폴리펩티드에 영향을 주지 않는 추가적인 성분이 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 이러한 성분의 예는, 예를 들어, 정제 또는 분리를 가능하게 하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티, 패신저(passenger) 돌연변이, 유리 시스테인, 추가적 글리코실화 부위, 및 높은 가능성의 탈아미드화 또는 이성화 부위를 포함하는 문제가될 수 있는 부위가 없는 서열을 포함한다.

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 1-서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 경우, 상기 폴리펩티드는 임의의 추가적인 성분(즉, 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 내인성이지 않은 성분)을 포함하지 않는다.

본 발명은 서열번호 1-서열번호 35 중 어느 하나에 대하여 90% 이상 동일성(예를 들어, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한)인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성"은 관심의 핵산 또는 아미노산 서열을 참고 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 관심 서열과 참고 서열을 가장 긴 서열의 길이(즉, 관심 서열 또는 참고 서열 중 길이가 긴 것)로 나눈 값과 같은(즉, 동일한) 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수이다. 최적의 정렬을 얻고 2 이상의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 공지되어 있고 다수의 이용 가능한 소프트웨어 프로그램이 포함된다. 이러한 프로그램의 예는 LUSTAL-W, T-Coffee, 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열의 정렬용), BLAST 프로그램(예를 들어, BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 이들의 이후 버전들) 및 FASTA 프로그램(예를 들어, FASTA3x, FASTM, 및 SSEARCH)을 포함한다(서열 정렬 및 서열 유사성 검색용). 서열 정렬 알고리즘은 또한 예를 들어, Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)에 개시되어 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Xaa1 Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa2 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Xaa3 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys(서열번호 36)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala), (b) Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr), 및 (c) Xaa3은 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이다.

본 발명의 경쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 하나 또는 그 이상을 갖는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 37, 서열번호 38, 또는 서열번호 39 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

본 발명은 또한 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Xaa1 Asn Xaa2 Ile Thr Tyr Phe Tyr Trp Tyr Leu Xaa3 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(서열번호 40)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, (a) Xaa1은 세린(Ser) 또는 아르기닌(Arg), (b) Xaa2는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala), 및 (c) Xaa3은 글루타민(Gln) 또는 히스티딘(His)이다.

본 발명의 경쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 하나 또는 그 이상을 갖는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 또는 서열번호 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

본 발명은 아미노산 서열 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa1 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Xaa2 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa3 Ser Gly Ser Gly Xaa4 Asp Xaa5 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Xaa6 Xaa7(서열번호 58)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 (a) Xaa1은 아스파르트산(Asp) 또는 트립토판(Trp), (b) Xaa2는 아르기닌(Arg) 또는 메티오닌 (Met), (c) Xaa3은 글리신(Gly), 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro), (d) Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 아스파라긴(Asn), (e) Xaa5는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr), (f) Xaa6은 아르기닌(Arg) 또는 부존재, 및 (g) Xaa7은 트레오닌(Thr) 또는 부존재이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 아미노산 서열 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa1 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa2 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(서열번호 45)을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되고, 여기서 (a) Xaa1은 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro), 및 (b) Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr)이다.

본 발명의 경쇄 폴리펩티드는 임의의 적절한 조합으로 상기 언급된 아미노산 치환 중 하나 또는 그 이상을 갖는 서열번호 58 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 46, 서열번호 47, 또는 서열번호 55 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성된다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함, 이로 구성, 또는 이로 필수적으로 구성되는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 36-서열번호 50 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 경우, 본원에 기재된 바와 같은, 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 주지 않는 추가적 성분이 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 36-서열번호 50 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 경우, 상기 폴리펩티드는 임의의 추가적인 성분(즉, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 내인성이지 않은 성분)을 포함하지 않는다.

본 발명은 서열번호 36-서열번호 50 중 어느 하나에 대하여 90% 이상 동일성(예를 들어, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한)인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성"은 관심의 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

상기 기술된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산은 상이한 아미노산으로 대체되거나 치환될 수 있다. 아미노산 "대체(replacement)" 또는 "치환(substitution)"은 폴리펩티드 서열 내에서 주어진 위치 또는 잔기에서 하나의 아미노산이 동일한 위치 또는 잔기에서 다른 아미노산으로 대체되는 것을 지칭한다.

아미노산은 "방향족" 또는 "지방족"으로 넓게 분류된다. 방향족 아미노산은 방향족 고리를 포함한다. "방향족" 아미노산의 예는 히스티딘(H 또는 His), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 및 트립토판(W 또는 Trp)을 포함한다. 비-방향족 아미노산은 넓게 "지방족"으로 분류된다. "방향족" 아미노산의 예는 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 이소류신(I 또는 Ile), 메티오닌 (M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 시스테인(C 또는 Cys), 프롤린(P 또는 Pro), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파르트산(A 또는 Asp), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 리신(K 또는 Lys), 및 아르기닌(R 또는 Arg)을 포함한다.

지방족 아미노산은 4개의 서브그룹으로 서브분류될 수 있다. "큰 지방족 비-극성 서브-그룹(large aliphatic non-polar sub-group)"은 발린, 류신, 및 이소류신을 포함한다. "지방족 약한-극성 서브-그룹(aliphatic slightly-polar sub-group)"은 메티오닌, 세린, 트레오닌, 및 시스테인을 포함한다. "지방족 극성/하전된 서브-그룹(aliphatic polar/charged sub-group)"은 글루탐산, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 및 아르기닌을 포함한다. "작은-잔기 서브-그룹(small-residue sub-group)"은 글리신 및 알라닌을 포함한다. 하전된/극성 아미노산의 그룹은 3개의 서브-그룹으로 서브분류될 수 있다: 리신 및 아르기닌을 포함하는 "양으로-하전된 서브-그룹(positively-charged sub-group)", 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하는 "음으로-하전된 서브-그룹(negatively-charged sub-group)", 및 아스파라긴 및 글루타민을 포함하는 "극성 서브-그룹(polar sub-group)".

방향족 아미노산은 두 개의 서브-그룹으로 서브분류될 수 있다: 히스티딘 및 트립토판을 포함하는 "질소 고리 서브-그룹(nitrogen ring sub-group)" 및 페닐알라닌 및 티로신을 포함하는 "페닐 서브-그룹(phenyl sub-group)".

아미노산 대체 또는 치환은 보존적, 반-보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 공통의 특징을 갖는 또다른 아미노산에 의한 하나의 아미노산의 대체를 지칭한다. 각각의 아미노산 사이의 공통의 특징을 정의하기 위한 기능적 방법은 상동성 유기체의 대응하는 단백질 사이의 아미노산 변화의 표준화된 서열을 분석하는 것이다(Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산의 그룹은 그룹 내의 아미노산이 서로 바람직하게 교환되고 따라서 전체 단백질 구조에 대한 영향에 있어서 가장 유사한 것으로 정의될 수 있다(Schulz and Schirmer, supra).

보존적 아미노산 치환의 예는 상기 기재된 서브-그룹 내에서 아미노산의 치환, 예를 들어, 양전하를 유지할 수 있도록 리신을 아르기닌으로 그리고 반대로, 음전하를 유지할 수 있도록 글루탐산을 아스파르트산으로 그리고 반대로, 자유 -OH가 유지될 수 있도록 세린을 트레오닌으로, 및 자유 -NH₂가 유지될 수 있도록 글루타민을 아스파라긴으로 치환하는 것을 포함한다.

"반-보존적 돌연변이"는 상기 나열된 동일한 그룹 내에서의 아미노산 치환을 포함하지만, 동일한 서브-그룹 내에서의 치환을 포함하지 않는다. 예를 들어, 아스파르트산을 아스파라긴으로, 또는 아스파라긴을 리신으로의 치환은 상이한 서브-그룹이 아닌, 동일한 그룹 내의 아미노산을 포함한다. "비-보존적 돌연변이"는 예를 들어, 리신을 트립토판으로, 또는 페닐알라닌을 세린으로 등 상이한 그룹 사이의 아미노산 치환을 포함한다.

또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산은 상기 언급된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드로 삽입될 수 있다. 어떠한 수의 임의의 적절한 아미노산이 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 이러한 관점에서, 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 2 이상, 5 이상, 또는 10 이상의 아미노산), 그러나 20 아미노산 이상은 아닌(예를 들어, 18 이하, 15 이하, 또는 12 이하의 아미노산) 아미노산이 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 바람직하게, 1-10 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산)이 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 이러한 관점에서, 아미노산(들)은 임의의 적절한 위치 내 상기 언급된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드 중 임의의 하나로 삽입될 수 있다. 바람직하게, 아미노산(들)은 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3)로 삽입된다.

본 발명의 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 본원에 기술된 특정 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 제한되지 않는다. 사실, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드는 본 발명의 IL-36R에 결합하기 위해 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드와 경쟁하는 임의의 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드는 본원에 기술된 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드에 의해 인식되는 IL-36R의 동일한 에피토드에 결합하는 임의의 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드일 수 있다. 항체 경쟁은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 면역조직화학적방법을 사용하는 통상의 펩티드 경쟁 분석법을 사용하여 분석될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 4,828,981 및 8,568,992; 및 Braitbard et al., Proteome Sci., 4: 12 (2006) 참조).

본 발명은 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 본 발명의 단리된 아미노산 서열을 포함, 이로 필수적으로 구성, 또는 이로 구성되는 단리된 IL-36R-결합제를 제공한다. "IL-36R-결합제(IL-36R-binding agent)"는 바람직하게 IL-36R 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질성 분자를 의미한다. 바람직하게, IL-36R-결합제는 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)이다. 본 발명의 IL-36R-결합제는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함, 이로 필수적으로 구성, 또는 이로 구성된다. 일 구현예에서, IL-36R-결합제는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함, 이로 필수적으로 구성, 또는 이로 구성된다. 또다른 구현예에서, IL-36R-결합제는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함, 이로 필수적으로 구성, 또는 이로 구성된다.

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기는, 아미노산 대체, 삽입, 및/또는 결실의 결과로 IL-36R-결합제의 생물학적 활성이 물질적으로 감소되지 않는(예를 들어, 향상 또는 개선되는) 한은 상이한 아미노산 잔기와 임의의 조합으로 대체될 수 있고, 또는 결실되거나 삽입될 수 있다.

IL-36R-결합제의 "생물학적 활성"은, 예를 들어, 특정 IL-36R 에피토프에 대한 결합 친화력, 이것의 수용체(들)에 대한 IL-36R 결합의 중화 또는 억제, 인 비보에서 IL-36R 활성(예를 들어, IC₅₀)의 중화 또는 억제, 약동학, 및 상호-반응성(예를 들어, IL-36R 단백질의 비-인간 호몰로그(homologs) 또는 오솔로그(orthologs)에서, 또는 다른 단백질 또는 조직에서)을 지칭한다. 당업계에서 항원-결합제의 다른 생물학적 특성 또는 특징은, 예를 들어, 결합활성(avidity), 선택성, 용해성, 폴딩(folding), 면역독성, 발현, 및 형성을 포함한다. 상기 언급된 특성 또는 특징은 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면플라스몬공명분석(BIACORE™), 또는 KINEXA™, 인 비트로 또는 인 비보 중화 분석법, 수용체-리간드 결합 분석법, 사이토카인 또는 성장인자생성 및/또는 분비 분석법, 및 신호전달 및 면역조직화학분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는 표준 기술을 사용하여 관찰, 측정, 및/또는 분석될 수 있다. 특정 구현예에서 본 발명의 인터루킨 36 수용체 (IL-36R)-결합제는 바람직하게 하나 또는 그 이상의 다음의 생물학적 활성을 나타낸다: (a) IL-36R 및 IL-36Rα, IL-36Rβ, 및/또는 IL-36Rγ 사이의 상호작용 억제, (b) IL-36R에 의해 매개되는 세포내 신호전달 억제, 및/또는 (c) 인간 및 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스) IL-36R의 활성과 상호-반응 및 억제. 당업계에서 인식되는 항원-결합제의 다른 생물학적 특징 또는 특성은, 예를 들어, 결합활성(avidity), 선택성, 용해성, 폴딩(folding), 면역독성, 발현, 및 형성을 포함한다. 상기 언급된 특성 또는 특징은 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면플라스몬공명분석(BIACORE™), 또는 KINEXA™, 인 비트로 또는 인 비보 중화 분석법, 수용체-리간드 결합 분석법, 사이토카인 또는 성장인자생성 및/또는 분비 분석법, 및 신호전달 및 면역조직화학분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는 표준 기술을 사용하여 관찰, 측정, 및/또는 분석될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "억제하다(inhibit)" 또는 "중화하다(neutralize)"는 IL-36R-결합제의 활성에 대한 관점에서, 예를 들어, IL-36R의 생물학적 활성, 또는 IL-36R과 연관된 질병 또는 병태의 진행 또는 정도를 실질적으로 길항, 금지, 예방, 저지, 늦춤, 방해, 변화, 제거, 멈춤, 또는 반전시키는 능력을 지칭한다. 본 발명의 IL-36R-결합제는 바람직하게 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위로 IL-36R의 활성을 억제 또는 중화시킨다.

본 발명의 IL-36R-결합제는 본원에 기재된 바와 같이 전체 항체, 또는 항체 단편일 수 있다. 본원에 상호교환적으로 사용되는 용어 "항체의 단편", "항체 단편", 및 "항체의 기능적 단편"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖는 항체의 하나 또는 그 이상의 단편을 의미한다(일반적으로, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005) 참조). IL-36R-결합제는 임의의 IL-36R-결합 항체 단편을 함유할 수 있다. 항체 단편은 바람직하게, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 CDR, 가변부위(또는 이들의 일부), 불변부위(또는 이들의 일부), 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 예는, i) V_L, V_H, C_L, 및 CH₁ 영역을 포함하는 1가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지 영역에 이황화결합(disulfide bridge)에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편, (iii) 항체의 싱글암(single arm)의 V_L 및 V_H 영역을 포함하는 Fv 단편, (iv) 약한 환원 조건을 사용한 F(ab')₂ 단편의 이황화결합의 절단으로 인한 Fab' 단편, (v) 이황화-안정화 Fv 단편(disulfide-stabilized Fv: dsFv), 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변부위 영역(VH 또는 VL) 폴리펩티드인, 항체 영역(domain antibody: dAb)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

IL-36R-결합제가 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 단편을 포함하는 구현예에서, 단편은 단편이 IL-36R에 결합하고, 바람직하게는 IL-36R의 활성을 억제할 수 있는 한 임의의 크기일 수 있다. 이러한 관점에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 단편은 바람직하게 약 5 내지 18 사이(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 아미노산을 포함한다. 유사하게, 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 단편은 바람직하게 약 5 내지 18(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 아미노산을 포함한다.

IL-36R-결합제가 항체 또는 항체 단편인 경우, 항체 또는 항체 단편은 바람직하게 임의의 적절한 분류의 중쇄불변부위(F_c)를 포함한다. 바람직하게, 항체 또는 항체 단편은 야생형 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 항체에 기초한 중쇄불변부위, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 각각의 항체 분류 또는 아이소타입은 한번 인식된 항원을 처분하거나 중화시키기 위한 구분된 세트의 작동자(effector) 메커니즘과 결합한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, IL-36R-결합제가 항체 또는 항체 단편인 경우, 하나 또는 그 이상의 작동자 기능, 예컨대 작동자 분자 및 세포와의 상호작용(예를 들어, 보체 시스템의 활성화)을 통한 항체- 의존성 보체-매개된 용해 또는 항체-의존성 세포독성에서의 관여를 나타낼 수 있다.

IL-36R-결합제는 또한 단일 사슬 항체 단편일 수 있다. 단일 사슬 항체 단편의 예는, (i) 두 영역이 단일 폴리펩티드 사슬로 합성될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 결합된 Fv 단편의 두 개의 영역(즉, V_L 및 V_H)을 포함하는 1가 분자인 단일 사슬 Fv(single chain Fv: scFv)(예를 들어, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn et al., Nat. Biotechnol ., 16: 778 (1998) 참조) 및 (ii) 폴리펩티드 사슬의 이합체인 디아바디(diabody), 여기서 각각의 폴리펩티드 사슬은 동일한 폴리펩티드 서열 상에서 V_H 및 V_L 사이의 쌍을 허용하기에 너무 짧은 펩티드 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함하고, 이로써 상이한 V_H -V_L 폴리펩티드 사슬 상의 상보성 영역 사이의 쌍을 유도하여 두 개의 기능적 항원결합위치를 갖는 이합체 분자를 생성한다. 항체 단편은 당업계에 공지되어 있고 더욱 자세한 사항은 예를 들어, 미국특허출원공보 2009/0093024 A1에 기재되어 있다.

IL-36R-결합제는 또한 인트라바디(intrabody) 또는 이의 단편일 수 있다. 인트라바디는 세포내적으로 기능하고 발현되는 항체이다. 인트라바디는 전형적으로 이황화결합이 결핍되어 있고 그들의 특이적 결합 활성을 통해 타겟 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 인트라바디는 단리된 V_H 및 V_L 영역 및 scFv와 같은 단일 영역 단편을 포함한다. 인트라바디는 인트라바디의 N 또는 C 말단에 부착된 세포 내(sub-cellular)의 수송 신호를 포함할 수 있어 타겟 단백질이 위치하는 세포 내의 부분에서 높은 농도로 발현을 허용한다. 타겟 유전자와 상호작용시, 인트라바디는 타겟 유전자 기능을 조절하고 및/또는 타겟 단백질 분해를 촉진 및 비-생리학적 세포 내의 구획에서 타겟 단백질을 격리하는 것과 같은 메커니즘에 의해서 표현형적/기능적 녹아웃을 달성한다. 인트라바디-매게된 유전자 비활성화의 다른 메커니즘은, 타겟 단백질 상의 촉매 부위에 대한 결합과 같은 인트라바디가 지향하는 에피토프 또는 단백질-단백질, 단백질-DNA, 또는 단백질-RNA 상호작용과 연관된 에피토프에 의존할 수 있다.

IL-36R-결합제는 또한 항체 콘주게이트(conjugate)일 수 있다. 이러한 관점에서, IL-36R-결합제는 (1) 항체, 대체 골격(alternative scaffold), 또는 이들의 단편, 및 (2) IL-36R-결합제를 포함하는 단백질 또는 비-단백질 모이어티의 콘주게이트일 수 있다. 예를 들어, IL-36R-결합제는 펩티드, 형광 분자, 또는 화학치료제에 콘주게이션된 항체의 전부 또는 일부일 수 있다.

IL-36R-결합제는 인간 항체, 비-인간 항체, 또는 키메라 항체일 수 있거나, 이들로부터 얻어질 수 있다. "키메라"는 인간 및 비-인간 부위를 모두 포함하는 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 바람직하게, IL-36R-결합제는 인간화 항체이다. "인간화" 항체는 인간 항체 골격 및 하나 이상의 비-인간 항체로부터 얻어지거나 유래된 CDR을 포함하는 모노클로날 항체이다. 비-인간 항체는 예컨대, 설치류(예를 들어 마우스 또는 랫트)와 같은 임의의 비-인간 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 인간화 항체는 비-인간 항체에서 얻어지거나 이로부터 유래된 하나, 둘, 또는 세개의 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 IL-36R-결합제의 CDRH3은 마우스 모노클로날 항체로부터 얻어지거나 유래될 수 있는 반면, 본 발명의 IL-36R-결합제의 나머지 가변부위 및 불변부위는 인간 단일클론성 항체로부터 얻어지거나 유래된다.

인간 항체, 비-인간 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체는 인 비트로 기원(예를 들어, 재조합적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 세포주) 및 인 비보 기원(예를 들어, 설치류)을 포함하는 임의의 방법에 의해서 얻을 수 있다. 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); 및 Janeway et al. (eds.), Immunobiology , 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 인간 항체 또는 키메라 항체는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 사용하여 생성될 수 있고 여기서 하나 또는 그 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린 유전자로 대체된다. 내인성 항체 유전자가 인간 항체 유전자로 효과적으로 대체되는 형질전환 마우스의 예는, Medarex HUMAB-MOUSE™, Kirin TC MOUSE™, 및 Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (예를 들어, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), 및 Lonberg, Handb . Exp . Pharmacol ., 181: 69-97 (2008) 참조)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간화 항체는 비-인간 CDR을 인간 항체 골격에 이식(예를 들어, Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); 및 Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008) 참조)하는 것을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법(예를 들어, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009) 참조)을 사용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 예를 들어, 미국특허출원공보 2011/0287485 A1에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

일 구현예에서, CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 또는 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 가변부위는, 단백질 화학 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 또다른 분자, 예컨대 항체 또는 비-항체 폴리펩티드로 이식(transplanted)(즉, 이식(grafted))될 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR을 포함하는 IL-36R-결합제를 제공한다. IL-36R-결합제는 본원에 기술된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역의 1, 2, 또는 3 CDR을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, IL-36R의 임의의 리간드(예를 들어, IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ)에 대한 IL-36R의 결합을 차단하고 IL-36R-매개된 신호전달을 억제하는 IL-36R-결합제는 IL-36R의 에피토프에 결합한다. 본 발명은 또한 간접적 또는 다른자리적(allosteric) 방법으로 IL-36R이 그것의 임의의 리간드에 결합하는 것을 차단하는 IL-36R의 단리된 또는 정제된 에피토프를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및 본 발명의 IL-36R-결합제를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 또는 정제된 핵산 서열을 제공한다.

용어 "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의도하고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 비-자연적 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 중합체 형태, 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 지칭한다. 이러한 용어는 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 및 단일 가닥 DNA, 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 상기 용어는, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA의 유사체 및 이에 제한되는 것은 아니나, 메틸화 및/또는 캡핑된 폴리뉴클레오티드와 같은 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업계에 많은 다른 결합이 공지되어있지만(예를 들어 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트, 등) 핵산은 전형적으로 인산결합을 통해 결합되어 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드를 형성한다.

본 발명은 추가적으로 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 본 발명의 IL-36R-결합제를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 에피솜, 코스미드, 바이러스벡터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스), 또는 파지일 수 있다. 적절한 벡터 및 벡터 제조 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994) 참조).

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 본 발명의 IL-36R-결합제를 인코딩하는 핵산 서열에 더하여, 바람직하게 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화신호, 전사종결자, 신호펩티드(예를 들어, 오스테오넥틴 신호 펩티드), IRES(internal ribosome entry sites) 등과 같은 발현 조절 서열을 포함하고, 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 위해 제공된다. 예시적 발현 조절 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술되어 있다.

상이한 기원에서 다양하게 유래한 많은 수의 구조성, 유도성, 및 억제성 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있다. 프로모터의 대표적인 기원은 예를 들어, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모, 및 박테리아를 포함하고, 이들 기원으로부터 유래한 적합한 프로모터는 이미 이용 가능하거나, ATCC 및 다른 상업적 또는 개인적 기원과 같은 기탁기관과 같이 공중이 이용 가능한 서열에 기초하여 합성적으로 만들어질 수 있다. 프로모터는 일방향성일 수 있고(즉, 한 방향으로 번역을 시작) 또는 이방향성일 수 있다(즉, 3' 또는 5' 방향으로 번역을 시작). 프로모터의 비-제한적인 예는 예를 들어, T7 박테리아 발현 시스템, pBAD(araA) 박테리아 발현 시스템, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 예를 들어, Tet 시스템(미국특허 5,464,758 및 5,814,618), Ecdysone 유도성 시스템(No et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 93: 3346-3351 (1996)), T-REX™ 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA), LACSWITCH™ 시스템 (Stratagene, San Diego, CA), 및 Cre-ERT 타목시펜 유도성 재조합효소 시스템 (Indra et al., Nuc . Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc . Acid. Res., 28: e99 (2000); 미국특허 7,112,715; 및 Kramer & Fussenegger, Methods Mol . Biol ., 308: 123-144 (2005)을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "인핸서"는 예를 들어, 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 핵산 서열의 코딩 부위로부터 수 kb 떨어진 곳에 위치할 수 있고 조절 인자의 결합, DNA 메틸화 패턴, 또는 DNA 구조상의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 기원을 갖는 많은 인핸서가 당업계에 잘 공지되어 있고 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에(예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 상업적 또는 개인적 기원으로부터) 사용가능하다. (통상적으로 사용되는 CMV 프로모터와 같은) 프로모터를 포함하는 많은 폴리뉴클레오티드는 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 코딩 서열 내, 또는 하류에 위치할 수 있다.

벡터는 또한 "선택 마커 유전자(selectable marker gene)"를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "선택 마커 유전자"는 해당하는 선별제의 존재 하에서 특이적으로 선택되거나 또는 선택에 대항하기 위한 핵산 서열을 발현하는 세포를 허용하는 핵산 서열을 지칭한다. 적절한 선택 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 국제특허출원 WO 1992/008796 및 WO 1994/028143; Wigler et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol . Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817-823 (1980); 및 미국특허 5,122,464 및 5,770,359에 기술되어 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 "에피솜 발현 벡터(episomal expression vector)" 또는 "에피솜(episome)"으로, 숙주 세포 내에서 복제 가능하고, 적합한 선택압의 존재 하에서 숙주 세포 내에서 DNA의 염색체외 부분으로 존재한다(예를 들어, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004) 참조). 상업적으로 이용가능한 대표적인 에피솜 발현 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 엡스타인 바 핵 항원 1(Epstein Barr Nuclear Antigen 1: EBNA1) 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus: EBV) 복제 원점(oriP)을 포함하는 에피솜 플라스미드를 포함한다. Invitrogen (Carlsbad, CA)의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1 및 Stratagene (La Jolla, CA)의 pBK-CMV는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제 기원을 사용하는 에피솜 벡터의 비-제한적인 예를 대표한다.

다른 적절한 벡터는 통합 발현 벡터(integrating expression vector)를 포함하고, 무작위로 숙주 세포의 DNA에 통합되거나, 발현 벡터 및 숙주 세포의 염색체 사이에 특정 재조합을 가능하게 하는 재조합 위치를 포함할 수 있다. 이러한 통합 발현 벡터는 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 조절 서열을 사용하여 필요한 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있다. 위치 특이적 방법으로 통합하는 벡터의 예는, 예를 들어, Invitrogen (Carlsbad, CA)의 flp-in 시스템(예를 들어, pcDNA™5/FRT), 또는 Stratagene (La Jolla, CA)의 pExchange-6 Core Vector에서 찾을 수 있는 것과 같은 cre-lox 시스템의 성분이다. 숙주 세포 염색체로 무작위적으로 통합되는 벡터의 예는, 예를 들어, Life Technologies (Carlsbad, CA)의 pcDNA3.1(T-항원의 존재 하에서 도입되는 경우), Millipore (Billerica, MA)의 UCOE, 및 Promega (Madison, WI)의 pCI 또는 pFN10A (ACT) FLEXI™을 포함한다.

바이러스 벡터 또한 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 대표적인 바이러스 발현 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니나, Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands)로부터 이용 가능한 아데노바이러스-기반 Per.C6 시스템 Invitrogen (Carlsbad, CA)의 렌티바이러스-기반 pLP1, 및 Stratagene (La Jolla, CA)의 레트로바이러스 벡터 pFB-ERV plus pCFB-EGSH을 포함한다.

본 발명의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열이 동일한 벡터 상의 세포에 제공될 수 있다(즉, cis). 일방향성 프로모터는 각각의 핵산 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 이방향성 및 일방향성 프로모터의 조합은 다수의 핵산 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 대안적으로 독립한 벡터 상의 세포 집단에 제공될 수 있다(즉, trans). 각각의 핵산 서열은 독립한 벡터 각각에서 동일하거나 상이한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 독립한 벡터는 세포에 동시에 또는 순차적으로 제공될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 벡터(들)는 인코딩되는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포로 도입될 수 있고, 도입됨으로써 임의의 적절한 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 바람직한 숙주 세포는 용이하고 신뢰성 있게 성장할 수 있고, 합리적으로 빠른 성장률을 가지고, 잘 특징화된 발현 시스템을 가지며, 용이하고 효과적으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 것이다.

적절한 원핵 세포의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, Bacillus 속 유래의 세포(예컨대 Bacillus subtilis 및 Bacillus brevis), Escherichia 속 유래의 세포(예컨대 E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella, 및 Erwinia 속 유래의 세포를 포함한다. 특히 유용한 원핵 세포는 Escherichia coli의 다양한 계통(예를 들어, K12, HB101 (ATCC No. 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC No. 53338), 및 CC102)을 포함한다.

바람직하게, 벡터는 진핵 세포로 도입된다. 적절한 진핵 세포는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포의 예는 Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces, 및 Schizosaccharomyces 속 유래의 세포를 포함한다. 바람직한 효모 세포는 예를 들어, Saccharomyces cerivisae 및 Pichia pastoris를 포함한다.

적절한 곤충 세포는, 예를 들어, Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr . Opin . Biotechnol ., 4: 564-572 (1993); 및 Lucklow et al., J. Virol ., 67: 4566-4579 (1993)에 기술되어 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함한다.

바람직하게, 포유동물 세포가 본 발명에서 사용된다. 많은 적절한 포유동물 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있고, 다수가 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 이용가능하다. 적절한 포유동물 세포의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells: CHO) (ATCC No. CCL61), CHO DHFR-세포 (Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97: 4216-4220 (1980), 인간 배아 신장(human embryonic kidney: HEK) 293 또는 293T 세포(ATCC No. CRL1573), 및 3T3 세포(ATCC No. CCL92)를 포함한다. 다른 적절한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1 (ATCC No. CRL1650) 및 COS-7 세포주 (ATCC No. CRL1651), 및 CV-1 세포주 (ATCC No. CCL70)이다. 추가적 예시적인 포유동물 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 포함하는 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 일반 이배체 세포, 영장류 조직의 인 비트로 배양에서 유래한 세포 계통 뿐만 아니라 일차 배양조직(primary explants) 또한 적절하다. 다른 적절한 포유동물 세포주는, 이에 제한되는 것은 아니나, 마우스 신경아세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 및 BHK 또는 HaK 햄스터 세포주, ATCC로부터 얻을 수 있는 전부를 포함한다. 적절한 포유동물 숙주 세포를 선택하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양 증식, 스크리닝, 및 정제 방법이 당업계에 공지되어 있다.

일 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 예를 들어, 포유동물 세포는 인간 림프구 또는 전-B 백혈구 기원의 세포주와 같은 림프구에서 유도된 세포주이다. 인간 림프구 세포주의 예는, 제한되지 않고, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), Raji 세포 (CCL-86), PER.C6 세포 (Crucell Holland B.V., Leiden, The Netherlands), 및 이들의 유도체를 포함한다.

본 발명의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 "형질감염(transfection)", "형질전환(transformation)", 또는 "형질도입(transduction)"에 의해서 세포로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 "형질감염", "형질전환", 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 하나 또는 그 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 많은 형질감염 기술이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 DNA 공-침전(예를 들어, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol . 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-덱스트란; 전기천공법; 양이온성 리포솜-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진 미세입자 충격(tungsten particle-facilitated microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공-침전(Brash et al., Mol . Cell Biol ., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 적절한 패키징 세포 내에서 감염성 입자의 성장 후에, 파지 또는 바이러스 벡터는 숙주 세포로 도입될 수 있고, 이들 중 다수는 상업적으로 이용가능하다.

본 발명은 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 본 발명의 IL-36R-결합제, 상기한 것들 중 임의의 것을 인코딩하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 조성물은 약학적으로 허용가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용가능한) 조성물로, 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용가능한) 담체, 및 본 발명의 핵산 서열, IL-36R-결합제, 또는 벡터를 포함한다. 임의의 적절한 담체가 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 담체의 선택은, 부분적으로, 조성물이 투여될 수 있는 특정 위치 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 수 있다. 조성물은 선택적으로 멸균될 수 있다. 조성물은 보관 및 동결되거나 동결건조될 수 있고 사용 전 적절한 멸균 담체에 재구성될 수 있다. 조성물은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)에 기술된 통상적인 기술에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 추가적으로 포유동물에서 IL-36R 억제 또는 중화에 반응하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 언급한 조성물을 IL-36R 억제 또는 중화에 반응하는 질병을 갖고 있는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하고, 그 결과 포유동물에서 질병이 치료된다. "IL-36R 억제에 반응하는" 또는 "IL-36R 중화에 반응하는" 질병은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 IL-36R 수준 또는 활성을 감소시키는 것이 치료적 이익을 갖는, 또는 부적절한 발현(예를 들어, 과발현) 또는 IL-36R의 증가된 활성이 질환 또는 질병의 병리적 효과를 야기하거나 이에 기여하는, 임의의 질환 또는 질병을 지칭한다. IL-36R 억제에 반응하는 질병은 예를 들어, 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 및 암을 포함한다.

염증성 질환은, 예를 들어, 피부, 폐, 및 위장관의 알러지성 염증, 아토피성 피부염(아토피 습진으로도 알려짐), 천식(알러니성 및 비-알러지성), 상피-매개된 염증, 섬유증(예를 들어, 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 피부경화증, 신장 섬유증, 및 흉터), 알러지성 비염, 음식 알러지(예를 들어, 땅콩, 계란, 유제품, 갑각류, 나무 견과류(tree nuts) 등), 계절성 알러지, 및 다른 알러지를 포함한다. 본 발명의 방법은 임의의 유형의 자가면역 질환(즉, 신체가 자신의 조직을 공격 및 손상시키는 면역계 과잉 활성에 의해 유발되는 질병 또는 질환)을 치료하는데 사용될 수 있고, 예를 들어, MacKay I.R. and Rose N.R., eds., The Autoimmune Diseases, Fifth Edition, Academic Press, Waltham, MA (2014)에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예는 다발성 경화증, 천식, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 피부경화증, 크론병, 심상성건선(일반적으로 건선으로 지칭됨), 농포성건선, 전신성 농포성건선(generalized pustular psoriasis: GPP), 손-발바닥 농포성건선(palmo-plantar pustulosis: PPP), 염증성장질환, 건선성관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus: SLE), 궤양성 대장염, 및 강직성 척추염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 농포성건선, 전신성 농포성전선, 손-발바닥 농포선건선(PPP), 또는 심상성건선을 치료하기 위해 사용된다.

농포선건선은 붉은 피부로 둘러싸인 백색 농포로 특징지어지는 드문 형태의 건선이다. GPP는 인터루킨-36-수용체 길항제(인터루킨-36Ra)의 결핍에 의해 유발될 수 있는, 백혈구 증가 및 C-반응성 단백질의 향상된 혈청 수준과 함께, 갑작스럽고, 반복된 고열, 전신성 발진 및 파종성 농포에 의해 특징지어지는 생명을 위협하는 질병이다(Marrakchi et al., N. Engl . J. Med., 365(7):620-628 (2011)). GPP는 종종 기존 또는 이전의 심상성건선(psoriasis vulgaris: PV)를 갖는 환자에서 나타난다; 그러나, GPP는 PV의 병력이 없는 환자에서 발생할 수 있다(Sugiura et al., J. Invest. Derm., 133: 2514-2521 (2013)). 손-발바닥 농포성건선은 영향받은 개인의 삶의 질을 상당히 손상시키는 손바닥과 발바닥 상의 메마른 농포 및 붉고, 비늘 모양의 피부에 의해 특징지어지는 만성 염증성 피부 질환이다(de Waal, A.C. and van de Kerkhof, P.C.M., J. Dermatological Treatment, 22(2): 102-105 (2011)).

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 호흡기 질환의 예는 천식, 낭포성섬유증, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및 급성 호흡곤란 증후군을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 대사성 질환의 예는 비만, 2형 당뇨병, 죽상동맥경화증, 및 심혈관계 질환을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 흑색종, 신장암, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 침샘암, 전립선암, 췌장암, 백혈병, 림프종, 및 메르켈 세포 암종을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 임의의 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Bhatia et al., Curr. Oncol . Rep., 13(6): 488-497 (2011) 참조).

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩ㅂ티드, 본 발명의 IL-36R-결합제, 상기 기재한 임의의 것을 인코딩하는 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 투여는 포유동물에서 면역 반응을 유발한다. "면역 반응"은 예를 들어 항체 생산 및/또는 면역 작동자 세포(예를 들어, T-세포)의 활성을 수반할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 등은 필요한 약학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 바람직하게, 효과는 치료적인 것, 즉 효과는 부분적으로 또는 전체적으로 질환을 치유하고 및/또는 질환에 기여하는 증상에 대항하는 것이다. 이 때문에, 본 발명의 방법은 IL-36R-결합제의 "치료적 유효량"을 투여하는 단계를 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 치료기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 나이, 성별, 및 몸무게와 같은 요인, 및 개인에서 필요한 반응을 이끌기 위한 IL-36R-결합제의 능력에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-36R-결합제의 치료적 유효량은 인간에서 IL-36R 생체활성을 감소시키는 양이다.

대안적으로, 약학적 및/또는 생리학적 효과는 예방적인 것, 즉 질환 또는 그들의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 효과일 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 방법은 IL-36R-결합제의 "예방적 유효량"을 투여하는 단계를 포함한다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과(예를 들어, 질환 시작의 방지)를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다.

전형적 용량은, 예를 들어, 동물 또는 인간 체중 당 1 pg/kg 내지 20 mg/kg의 범위일 수 있다; 그러나 이러한 예시적 범위 이하 또는 이상의 용량이 본 발명의 범위 내일 수 있다. 일일 비경구 용량은 총 체중 당 약 0.00001 μg/kg 내지 총 체중 당 약 20 mg/kg (예를 들어, 약 0.001 μg /kg, 약 0.1 μg /kg, 약 1 μg /kg, 약 5 μg /kg, 약 10 μg/kg, 약 100 μg /kg, 약 500 μg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg), 바람직하게는 총 체중 당 약 0.1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 0.5 μg/kg, 약 1 μg/kg, 약 50 μg/kg, 약 150 μg/kg, 약 300 μg/kg, 약 750 μg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 상기 기재된 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의됨), 더욱 바람직하게는 총 체중 당 약 1 μg/kg 내지 5 mg/kg (예를 들어, 약 3 μg/kg, 약 15 μg/kg, 약 75 μg/kg, 약 300 μg/kg, 약 900 μg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 또는 상기 기재된 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의됨), 및 더더욱 바람직하게는 총 체중 당 약 0.5 내지 15 mg/kg (예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 13 mg/kg, 또는 상기 기재된 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의됨)일 수 있다. 치료적 또는 예방적 유효성은 치료된 환자의 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 병태에 따라, 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 치료는 원하는 질환의 억제가 발생할 때까지 반복될 수 있고 또는 대안적으로 치료는 환자의 평생 동안 계속될 수 있다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있고 본 발명의 범위 내이다. 원하는 용량은 조성물의 단일 볼러스(bolus) 투여에 의해, 조성물의 다중 볼러스 투여에 의해, 또는 조성물의 지속적 인퓨전 투여에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 본 발명의 IL-36R-결합제, 상기 기재된 것 중 어느 하나를 인코딩하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터의 유효량을 포함하는 조성물이 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피내, 근육내, 비강내, 구강내, 설하, 또는 좌제 투여를 포함하는 표준 투여 기술을 사용해 포유동물에 투여될 수 있다. 바람직하게 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 경피내, 직장내, 질내, 및 피하 투여를 포함한다. 더욱 바람직하게, 조성물은 정맥내, 피하, 또는 경피 주입에 의한 말초신경계 전달을 사용하여 포유동물에 투여된다.

포유동물(예를 들어, 인간)에 투여된 후, 본 발명의 IL-36R-결합제의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성은 특정 IL-36R-결합제의 안정성 결정에 의해서 측정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, IL-36R-결합제(예를 들어, 항체)는 약 30분 내지 45일(예를 들어, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 1일, 약 5일, 약 10일, 약 15일, 약 25일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 상기 기재된 범위 중 임의의 두 개에 의해서 정의된 범위) 사이의 인 비보 반감기를 갖는다. 또다른 구현예에서, IL-36R-결합제는 약 2시간 내지 약 20일(예를 들어, 약 5시간, 약 10시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 2일, 약 3일, 약 7일, 약 12일, 약 14일, 약 17일, 약 19일, 또는 상기 기재된 범위 중 임의의 두 개에 의해서 정의된 범위) 사이의 인 비보 반감기를 갖는다. 또다른 구현예에서, IL-36R-결합제는 약 10일 내지 약 40일(예를 들어, 약 10일, 약 13일, 약 16일, 약 18일, 약 20일, 약 23일, 약 26일, 약 29일, 약 30일, 약 33일, 약 37일, 약 38일, 약 39일, 약 40일, 또는 상기 기재된 범위 중 임의의 두 개에 의해서 정의된 범위) 사이의 인 비보 반감기를 갖는다.

본 발명의 IL-36R-결합제의 안정성은 아미노산 서열의 50%가 본래의 형태에 있고, 나머지 50%가 변성되는 것인, 전이 중간 값(Tm)의 관점에서 측정될 수 있다. 일반적으로, Tm이 높을수록, 단백질이 더 안정하다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 IL-36R 결합제는 약 60-100℃의 인 비트로 Tm을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 IL-36R 결합제는 약 65-80℃(예를 들어, 66℃ , 68℃, 70℃, 71℃, 75℃, 또는 79℃), 약 80-90℃ (예를 들어, 약 81℃, 85℃, 또는 89℃), 또는 약 90-100℃ (예를 들어, 약 91℃, 약 95℃, 또는 약 99℃)를 포함할 수 있다.

본 발명의 IL-36R 결합제의 안정성은 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 분석법, 예를 들어 혈청 반감기 측정, DSC(differential scanning calorimetry), 열 시프트 분석법, 및 펄스-추적 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 인 비보 및 인 비트로에서 단백질 안정성을 측정하는 다른 방법은 예를 들어 Protein Stability and Folding, B.A. Shirley (ed.), Human Press, Totowa, New Jersey (1995); Protein Structure, Stability, and Interactions (Methods in Molecular Biology), Shiver J.W. (ed.), Humana Press, New York, NY (2010); 및 Ignatova, Microb . Cell Fact., 4: 23 (2005)에 기술되어 있다.

특정 IL-36R-결합제의 생물학적 활성은 또한 IL-36R 또는 그들의 에피토프의 친화력을 결정함으로써 측정될 수 있다. 용어 "친화력"은 두 물질의 가역적 결합에 대한 평형상수를 지칭하고 해리 상수(K_D)로 표현된다. 에피토프에 대한 항체의 친화력과 같은 리간드에 대한 결합제의 친화력은, 예를 들어, 약 1 피코몰 (pM) 내지 약 100 마이크로몰 (μM) (예를 들어, 약 1 피코몰 (pM) 내지 약 1 나노몰 (nM), 약 1 nM 내지 약 1 마이크로몰 (μM), 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM)일 수 있다. 일 구현예에서, IL-36R-결합제는 IL-36R 단백질에 1 나노몰보다 작거나 같은 K_D(예를 들어, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.025 nM, 0.01 nM, 0.001 nM, 또는 상기 기재한 값들 중 임의의 두 개에 의해서 정의된 범위)로 결합할 수 있다. 또다른 구현예에서, IL-36R-결합제는 IL-36R에 200 pM보다 작거나 같은 K_D(예를 들어, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 상기 기재한 값들 중 임의의 두 개에 의해서 정의된 범위)로 결합할 수 있다. 관심 있는 항원 또는 에피토프에 대한 면역글로불린 친화력은 업계에 인식된 임의의 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어. 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS), 분리 비드(예를 들어, 자성 비드), 표면플라스몬공명(surface plasmon resonance: SPR), 용액 상 경쟁(solution phase competition, KINEXA™), 항원 패닝, 및/또는 ELISA(예를 들어, Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001 참조)을 포함한다.

본 발명의 IL-36R-결합제는 단독으로 또는 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-36R-결합제는 본원에 개시된 질환의 치료 또는 예방을 위해 다른 물질, 예컨대, 예를 들어 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손 및 플루디카손),비-스테로이드성 항-염증제(NSAIDs) (예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 및 나프록센), 생물제제(예를 들어, 인플릭시맙(REMICADE™), 아달리무맙(HUMIRA™), 또는 에타너셉트(ENBREL™)), 메토트렉세이트(MTX), 경구 레티노이드(예를 들어, 아시트레틴(SORIATANE™)), 및 국소 스테로이드를 포함하는 항-염증제와 조합하여 투여될 수 있다.

치료적 사용에 더하여, 본원에 기술된 IL-36R-결합제는 진단 또는 연구 적용에 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, IL-36R-결합제는 부적절한 발현(예를 들어, 과발현) 또는 질환 또는 질병의 병리적 효과를 야기하거나 기여하는 IL-36R의 증가된 활성이 있는 질병 또는 질환을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 유사한 방법으로, IL-36R-결합제는 IL-36R 억제에 반응하는 질환 또는 질병을 시험하기 위한 개체에서 IL-36R 단백질 수준을 모니터링하기 위한 분석법에 사용될 수 있다. 연구 적용은, 예를 들어, IL-36R-결합제 및 시료, 예를 들어 인간 체액 내 또는 세포 또는 조직 추출물 내에서 IL-36R 단백질을 검출하기 위한 라벨 사용하는 방법을 포함한다. IL-36R-결합제는 검출가능한 모이어티로 하는 공유적 또는 비공유적 표지와 같은 변형을 하거나 변형하지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I), 형광 또는 화학발광 화합물(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린), 효소(예를 들어, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 겨자무과산화효소), 또는 보결기(prosthetic group)일 수 있다. 검출가능한 모이어티에 항원-결합제(예를 들어, 항체)를 각각 접합하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법은 본 발명의 문맥 내에 포함된다(예를 들어, Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol . Meth ., 40: 219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem . and Cytochem ., 30: 407-412 (1982) 참조).

IL-36R 단백질 수준은 본 발명의 IL-36R-결합제를 사용하여 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 방사선면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 및 FACS를 포함한다. IL-36R의 일반 또는 표준 발현 값은 임의의 적절한 기술, 예를 들어, 항원-항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에서 IL-36R을 포함하거나 포함하는 것으로 예측되는 시료를 IL-36R-특이적 항체와 결합을 사용하여 결정될 수 있다. 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 물질로 표지되어 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 가능하게 한다. 적절한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 및 방사성 물질(예를 들어, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) 참조)을 포함한다. 이후 시료 내 발현된 IL-36R 폴리펩티드의 양은 표준 값과 비교된다.

IL-36R-결합제는 키트 내에 제공될 수 있다, 즉 진단 분석을 수행하기 위한 지침을 갖는 미리 결정된 양의 시약과 결합하여 포장된다. IL-36R-결합제가 효소로 표지된다면, 키드는 바람직하게 효소에 의해 필요한 기질 및 코펙터(cofactor)(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함한다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액), 등과 같은 다른 첨가물이 키트에 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 분석법의 감응성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 내 농도로 제공되기 위해 다양할 수 있다. 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 수 있는 부형제를 포함하는 건조 파우더(전형적으로 동결건조된 것)로 포함될 수 있다.

하기 예는 본 발명을 추가적으로 예시하는 것이다, 그러나 물론 이의 범위를 제한하고자하는 것이 아니다.

실시예 1

본 실시예는 본 발명의 면역글로불린 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 폴리펩티드가 인 비트로에서 인간 IL-36R에 결합하고 신호전달을 차단하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

IL-8 프로모터(Promega Corp., Madison, WI)와 함께 인간 IL-36R(hIL-36R) 또는 시노몰구스 IL-36R(cynoIL-36R)을 인코딩하는 플라스미드 구조물로 HEK293T/17 세포(ATCC CRL-11268)를 안정하게 형질감염시키고, 모든 후속 분석법을 위해 단일 세포 클론을 선택하였다.

HEK293 세포를 DMEM+10% FBS 10 mL 중의 T75 배양플라스크 상에 3×10⁶세포/플라스크로 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 이튿날 아침, 24 μl FUGENE ™ HD (Promega Corporation, Madison, WI)를 500 μl OPTI-MEM ™ 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 첨가하고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션 하였다. IL-36R을 인코딩하는 DNA(2 μl)와 IL8 프로모터를 인코딩하는 DNA (2 μl)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 추가로 25 분 동안 배양하였다. 시노몰구스 IL-36R 대립 유전자 변이를 Sanger sequencing으로 조사하였고, 4 개의 별개의 대립 유전자 변이체가 시노몰구스 원숭이 집단 내에서 확인되었다. 각각의 시노몰구스 IL-36R 대립 유전자 변이를 발현하는 HEK 세포주를 각각 생성하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-8 리포터 세포주 모두에 대해, 내인성으로 발현된 HEK 인간 IL1RAcP를 이용하였다. 이 DNA/FUGENE™ 혼합물을 형질감염을 위해 세포에 부드럽게 첨가하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질감염 24 시간 후, 세포를 분할하고 하이그로마이신 및 퓨로마이신을 함유하는 DMEM+10% FBS에 넣고 4주 동안 선별하였다. 4주 후, 안정화된 세포를 96 웰 투명 바닥 플레이트에 1 세포/웰로 도말하였다(5 플레이트/세포주). 단일 세포 클론을 IL-36R의 표면 발현을 위해 스크리닝하고, 아래에 기재된 분석에 사용된 낮은 계대 수(즉, 1 내지 3) 세포로 확대시켰다.

HEK293-인간 IL36R/IL8 또는 HEK293-cynoIL36R/IL8 변이체 안정 세포주를 아 쿠타아제로 수확하고 96-웰 투명-바닥 플레이트 상에서 100 μl DMEM+10% FBS 중에 0.06×10⁶세포/웰로 밤새 파종하고 37℃, 5% CO₂에서 배양 하였다. 다음날 아침, 플레이트를 싱크대에 거꾸로 뒤집어서 배지를 제거하고 페이퍼 타올을 부드럽게 두들겨 건조시켰다. 본 발명의 HC 및 LC 폴리펩티드 (표 1 참조), IL-36Ra(R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 음성 아이소타입 대조군 항체의 다양한 조합을 포함하는 희석된 항체를 DMEM+10% FBS(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 2배 희석 시리즈에 의해 원하는 농도로 희석하고, 즉시 웰에 첨가하고(50μl/웰), 37℃, 5 % CO₂에서 20 분간 배양하였다.

[표 1]

이어서, 세포를 50μl의 IL36α, IL36β 또는 IL36γ 리간드(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 자극하고 추가로 24 시간 동안 37℃, 5 % CO₂에서 배양하였다. 개별적 사이토카인 각각의 EC₅₀을 분석 전에 실험에 의해 결정하였다. 루시퍼라제 활성은 STEADY-GLO™ Luciferase Assay System (Promega, Cat # E2520, Madison, WI)을 사용하여 결정하였다. 루시퍼라제 분석 기질:버퍼의 1:1 혼합액 100 μl를 각 웰에 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양한 후 96-웰 검은색 벽으로 된 투명한 바닥 플레이트에 옮겼다(150μl). 플레이트를 ENVISION™ 플레이트 판독기 (PerkinElmer, Waltham, WA)에서 판독하여 루미네센스(luminescence)(60초 지연)를 결정하였다. GraphPad PRISM™ 소프트웨어 5 (GraphPad, San Diego, CA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

인간 및 cynoIL-36R에 대한 IL-8 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 도 1a-1f (인간 IL-36R), 도 2a-2c(cyno IL-36R), 도 10a-10c(cyno IL-36R) 및 도 10d-10f(인간 IL-36R)에 나타내었다. 시험된 각 항체의 측정된 효능(IC₅₀)은 표 2 및 표 3.1 및 표 3.2에 제시되어있다.

[표 2] HEK 인간 IL-36R IL-8 루시퍼라제 리포터 분석

[표 3.1] HEK cynoIL-36R IL-8 루시퍼라제 리포터 분석

[표 3.2]

본 실시예의 결과는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리 펩타이드가 인 비트로에서 인간 IL-36R에 결합하고 신호전달을 억제하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

실시예 2

본 실시예는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 인 비트로에서 인간 IL-36R에 결합하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

본원에 기술된 바와 같이 다양한 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리 펩티드를 인코딩하는 DNA 시료를 다음을 조합하여 제조하였다: 최대-준비된(maxi-prepped) DNA (6μg HC 플라스미드 및 6μg LC 플라스미드 포함), 1 ml OPTIMEM™(Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 72 μl의 FUGENE™ HD Transfection Reagent (Promega, Fitchburg, WI). 모든 시약은 예열되었다. 이후 완전히 혼합하고 실온에서 25분 동안 배양한 후, 각 T225 배양 플라스크 내 8×10⁶ HEK293-c18 세포 (ATCC CRL-10852)에 시약/DNA 믹스 1 ml를 첨가하였다. 형질 감염 18시간 전에, 플라스크 당 10% FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) 20 ml를 함유하는 T225 배양 플라스크에 세포를 플레이팅하고 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양하였다. 형질 감염 후, 세포를 5% CO₂에서 37℃로 복귀시켰다. 다음날, 각 플라스크의 배지를 293 Freestyle 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 25ml와 교환하고, 세포를 8% CO₂ 배양기로 옮겼다. 항체 생산은 7-12 일 동안 수행하였다. 상등액을 각각의 플라스크로부터 수집하고, 3000 rpm에서 10 분 동안 회전시키고, 새로운 튜브로 멸균 여과 하였다.

항체 정제를 위해, 관심 항체를 함유하는 세포 배양 상등액 약 20-30 ml를 PBS 완충액 (11.9 mM 인산염, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4) (Fisher Bioreagents, Waltham, MA)으로 미리 평형화된 1-2 ml MAB SELECT SURE™ LX 수지 (GE Healthcare, Waukesha, WI)로 충전된 중력 칼럼을 통과시켰다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 PBS 버퍼로 세척하였다. 결합된 항체를 0.1M 글리신 pH 3.0의 5-10 칼럼 부피로 수지에서 용리시켰다. 항체를 함유하는 용출액을 Amicon Ultra 10K 농축기 (Millipore, Billerica, MA)에서 약 0.1-2mg / mL의 항체 농도로 농축시키고, 버퍼를 PBS 버퍼로 3 회 교환하였다. 항체 농도는 Nanodrop 2000c 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 측정하였고, 순도는 SDS-PAGE 분석으로 평가하였다.

본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드를 포함하는 다양한 정제된 항체의 결합 친화력을 BIACORE™ T200 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) 분석을 사용하여 평가하였다. BIACORE™ T200 평가 소프트웨어 (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)를 사용하여 항체-항원 결합 동역학 및 친화력을 결정하였다. 아민 커플링 화학을 사용하여 인간 IL-36R의 세포 외 도메인을CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Waukesha, WI) 상에 약 100 RU로 고정화하였다. 다양한 농도에서 각 항체를 재구성하기 위해 HBS-EP + 버퍼 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % 폴리소르베이트, pH 7.6) (Teknova, Hollister, CA)을 사용하였다. 이어서, 각 항체 농도를 고정된 항원에 대해 30 μl/분의 유속으로 2 내지 3 분 동안 주입하고, 15 분 동안 해리시켰다. 표면은 매 사이클 후 3M MgCl₂ 60μL로 재생되었다. 결합 및 해리 동역학 상수 (kon 및 koff)는 BIACORE™ T200 평가 소프트웨어로 질량 이동을 사용하는 1:1 결합 모델을 사용하여 온-오프 속도 (각각 ka 및 kd) 및 친화력(KD)을 보고하기 위해 피팅(fit)하였다.

본원에 기재된 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드를 포함하는 다양한 정제된 항체의 결합 친화력을 KINEXA® 3000 분석 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) 분석을 사용하여 평가하였다. KINEXA® 기술은 다양한 농도의 항원과 함께 배양한 후 용액 상에서 결합 되지 않은/유리 항체 분자의 양을 측정한다. 최대 표면적을 위한 마이크로 비드를 사용하여 용액 상에서 결합 사건을 측정하는 것은 고체상에 대한 결합을 측정하는 방법에 내재 된 질량 이동 제한 및 변동 효과(mobility effect)를 피할 수 있다. 각각의 실험에서 50 μg의 수용성 인간 또는 cyno IL-36R 세포외 도메인을 50 mg의 UltraLink Biosupport beads (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 아민 결합시켰다. 항체의 일정한 농도 (신호의 0.8V-1.2V를 생성하기에 충분한)를 평형을 달성 또는 도달하기에 충분한 시간동안 (배양 시간은 각각 항체에 대하여 다양하고 결합력에 의존함) 시료 버퍼(1xPBS, pH 7.4, 0.02 % NaN₃, 0.1 % BSA) 내의 적정된 항원과 함께 배양하였다. 이어서, 항체 - 항원 용액을 0.25 mL/분의 속도로 항원-결합 비드에 흘렸다. ALEXA FLUOR™ 647- 접합 된 AffiniPure Donkey 항-인간 IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) (500ng/ml)를 사용하여 비드에 포획된 유리 항체를 검출하였다. 항체의 KD 및/또는 ABC (활성 결합 농도)는 KINEXA™ Pro Software에서 1-부위 균일 결합 모델(one-site homogeneous binding model)을 사용하여 비선형 회귀 분석으로 얻었다.

BIACORE™ T200 및 KINEXA® 3000 분석 검정 결과 KD 값을 표 4 및 도 3a(인간화 1D9에 대한 KinExA 데이터), 도 3b (5D3 APE6194에 대한 Biacore) 및 도 3c (인간화 18D4에 대한 KinExA 데이터)에 나타내었다.

[표 4]

이들 데이터는 본원에 기술된 본 발명의 면역글로불린 HC 및 LC 폴리펩티드의 상이한 조합을 포함하는 항체가 높은 친화력으로 인간 IL-36R에 결합할 수 있음을 증명한다.

실시예 3

본 실시예는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 인 비트로에서 인간 IL-36R에 결합하고 IL-36R을 내인성으로 발현하는 인간 일차 각질형성세포에 의한 사이토카인(예를 들어, IL-8) 방출 및 세포 신호전달을 억제하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

본 분석에 사용된 항체를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 정제하였다. 정상 인간 상피 각질 세포 (Normal human epidermal keratinocytes: NHEK)를 Lonza Clonetics (cat # 00192627)로부터 구입하였다. 세포를 배양하고 5% CO₂37℃ 배양기에서 권장된 배양 배지 (Lonza KGM Gold SingleQuot 보충물, cat# 0092152을 갖는 Lonza KBM Gold 배지, cat # 0019215)를 사용하여 확장시켰다. 세포를 2 계대에서 여러 번의 단일 사용 표본으로 액체 질소에 동결시켰다.

계대 2 세포를 해동하고 전술한 권장된 배양 배지에서 ml 당 100,000 세포의 밀도로 희석하고 웰 당 100 μl의 세포를 표준 평평한 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 배양하여 최종 세포 밀도를 1 웰 당 10,000 세포로 하였다. 바깥쪽 웰은 가장자리 효과를 피하기 위해 웰 당 200μl 인산 완충 생리 식염수로 채웠다. 세포를 5% CO₂ 37℃ 배양기에서 밤새 배양하여 부착되도록 하였다.

다음날 항체를 배양 배지에서 반 로그 희석에 의해 10 μg/ml 또는 1 μg/ml에서 0까지의 농도로 첨가하였다. 30분 후, 재조합 인간 IL-36 리간드를 배양 배지 중 약 EC₅₀ 농도 (이전에 각 리간드에 대해 실험적으로 결정됨)에서 첨가하였다. 항체와 리간드 농도는 원하는 최종 농도의 4x로 만들고 웰 당 50μl를 각 웰 200 μl의 최종 총 부피에 첨가하였다. 상등액은 플레이트를 3분 동안 원심 분리한 후 약 48시간 후에 제거하고, 깨끗한 플레이트로 옮기고, 즉시 시험하거나 추가 분석까지 -80℃에서 보관하였다.

세포 상등액 내의 인간 IL-8 수준은 R&D Systems DUO-SET™ ELISA 키트 (cat # DY208)를 사용하여 제조업자에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 ELISA로 평가 하였다. 데이터를 그래프로 나타내고, GraphPad PRISM™ 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀값을 계산하였다.

본 분석의 결과를 표 5 및 도 4a-4i에 나타내었다.

[표 5]

본 실시예의 결과는 본원에 기재된 HC 및 LC의 조합을 포함하는 항체가 IL-36R을 발현하고 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 자극된 인간 일차 각질형성세포로부터 염증성 사이토카인 방출(IL-8)을 농도 의존적 방식으로 억제하는 것을 증명한다.

실시예 4

본 실시예는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 인 비트로에서 시노몰구스 IL-36R (cyno IL-36R)에 결합하고 IL-36 의존성 세포 신호 전달 및 내인적으로 IL-36R을 방출하는 일차 각질형성세포에 의한 사이토카인(예를 들어, IL-8) 방출을 억제하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

본 분석에 사용된 항체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 정제하였다. 정상 시노몰구스 원숭이 상피 각질형성세포를 CellBiologics (Chicago, IL, cat # MK-6066K)로부터 구입하였다. 권장된 배양 배지 (CellBiologics 상피 세포 배지 보충물, Cat# M6621-kit을 포함하는 CellBiologics 상피 배지, Cat# M6621)를 사용하여 5% CO₂ 37℃ 배양기에서 세포를 배양하고 확장시켰다. 세포를 2 계대에서 여러 번의 단일 사용 표본으로 액체 질소에 동결시켰다.

다음날 항체를 배양 배지에서 반 로그 희석에 의해 10 μg/ml 또는 1 μg/ml에서 0까지의 농도로 첨가하였다. 30분 후, 재조합 시노몰구스 IL-36 리간드를 배양 배지 중 약 EC₅₀ 농도 (이전에 각 리간드에 대해 실험적으로 결정됨)에서 첨가하였다. 항체와 리간드 농도는 원하는 최종 농도의 4x로 만들고 웰 당 50μl를 각 웰 200 μl의 최종 총 부피에 첨가하였다. 상등액은 플레이트를 3분 동안 원심 분리한 후 약 48시간 후에 제거하고, 깨끗한 플레이트로 옮기고, 즉시 시험하거나 추가 분석까지 -80℃에서 보관하였다.

세포 상등액 내의 시노몰구스 IL-8 수준은 eBioscience (San Diego, CA) 원숭이 IL-8 platinum ELISA kit (cat# BMS640/3)를 사용하여 제조업자에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 ELISA로 평가하였다. 데이터를 그래프로 나타내고, GraphPad PRISM™ 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀값을 계산하였다.

본 분석의 결과를 표 6 및 도 5a-5f에 나타내었다.

[표 6]

본 실시예의 결과는 본원에 기재된 HC 및 LC의 조합을 포함하는 항체가 IL-36R을 발현하고 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 자극된 시노몰구스 일차 각질형성세포로부터 염증성 사이토카인 방출(IL-8)을 농도 의존적 방식으로 억제하는 것을 증명한다.

실시예 5

본 실시예는 본원에 기재된 HC 및 LC로 구성된 항체의 IL-36R을 발현하는 인간 단핵구로부터 IL-8의 인간 IL-36-매개된 방출을 용량-의존적 방식으로 차단하는 능력을 증명한다.

공여체 전혈 단위로부터 제조된 Leukocyte Reduction System 단위를 샌디에고 블러드 뱅크 (San Diego Blood Bank)로부터 수득하였다. 말초혈액단핵세포 (PBMCs)를 Ficoll 밀도 원심 분리 (Sigma HISTOPAQUE™ cat# 10771)를 사용하여 표준 방법으로 준비하였다. 인간 단핵구 단리 키트 Ⅱ (Miltenyi Biotec, San Diego, CA, cat# 130-091-153)를 사용하여 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다.

10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 단핵 세포를 500,000 세포/ml의 밀도로 희석하고, 웰 당 100μl의 세포를 표준 평평한-바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 최종 세포 밀도는 50,000로 플레이팅 하였다. 모서리 효과를 피하기 위해 바깥쪽 웰을 웰 당 200μl PBS로 채웠다. 플레이팅된 세포를 5% CO₂37℃ 배양기에서 2-3 시간 동안 배양하여 회복되도록 하였다.

약 2-3 시간의 배양 후, 항체를 배양 배지 중 반-로그 희석에 의해 10 μg/ml 또는 1μg/ml의 농도에서 0까지 첨가하였다. 30분 후, 재조합 인간 IL-36 리간드를 배양 배지에 약 EC₅₀농도 (이전에 각 리간드에 대해 실험적으로 결정됨)로 첨가하였다. 항체와 리간드 농도는 원하는 최종 농도의 4x로 만들고 웰 당 50μl를 각 웰 200 μl의 최종 총 부피에 첨가하였다. 상등액은 플레이트를 3분 동안 원심 분리한 후 약 48시간 후에 제거하고, 깨끗한 플레이트로 옮기고, 즉시 시험하거나 추가 분석까지 -80℃에서 보관하였다.

세포 상등액 내 인간 IL-8 수준을 제조업자에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 R&D Systems DUO-SET™ ELISA 키트(cat# DY208)를 사용하여 ELISA로 평가하였다. 데이터를 그래프로 나타내고, GraphPad PRISMTM 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

이들 실험의 결과를 표 7 및 도 6a 및 6b에 나타내었다.

[표 7]

본 실시예의 결과는 본원에 기재된 HC 및 LC의 조합을 포함하는 항체가 IL-36R을 발현하고 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 자극된 인간 일차 단핵구로부터 염증성 사이토카인 방출(IL-8)을 농도 의존적 방식으로 억제하는 것을 증명한다.

실시예 6

본 실시예는 본원에 기술된 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 인간 일차 말초혈액단핵세포로부터 IL-36-의존성 사이토카인 방출을 억제하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

공여체 전혈 단위로부터 제조된 Leukocyte Reduction System 단위를 샌디에고 블러드 뱅크 (San Diego Blood Bank)로부터 수득하였다. 말초혈액단핵세포 (PBMCs)를 Ficoll 밀도 원심 분리 (Sigma HISTOPAQUE™ cat# 10771)를 사용하여 표준 방법으로 준비하였다.

10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 PBMCs를 1×10⁶세포/ml의 밀도로 희석하고, 웰 당 100μl의 세포를 표준 평평한-바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 최종 세포 밀도는 100,000로 플레이팅 하였다. 모서리 효과를 피하기 위해 바깥쪽 웰을 웰 당 200μl PBS로 채웠다. 플레이팅된 세포를 5% CO₂37℃ 배양기에서 2-3 시간 동안 배양하여 회복되도록 하였다.

약 2-3 시간의 배양 후, 항체를 배양 배지 내에 반-로그 희석에 의해 10 μg/ml 또는 1μg/ml의 농도에서 0까지 첨가하였다. 30분 후, 재조합 인간 IL-36 리간드를 배양 배지에 약 EC₅₀농도 (이전에 각 리간드에 대해 실험적으로 결정됨)로 첨가하였다. 항체와 리간드 농도는 원하는 최종 농도의 4x로 만들고 웰 당 50μl를 각 웰 200 μl의 최종 총 부피에 첨가하였다. 상등액은 플레이트를 3분 동안 원심 분리한 후 약 48시간 후에 제거하고, 깨끗한 플레이트로 옮기고, 즉시 시험하거나 추가 분석까지 -80℃에서 보관하였다.

이들 실험의 결과를 도 7a-7c에 나타내었고, 본원에 기재된 HC 및 LC의 조합을 포함하는 항체가 IL-36R을 발현하고 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 자극된 인간 일차 말초혈액단핵세포로부터 염증성 사이토카인 방출(IL-8)을 농도 의존적 방식으로 억제하는 것을 증명한다.

실시예 7

본 실시예는 본원에 기술된 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 시노몰구스 일차 말초혈액단핵세포로부터 IL-36-의존성 사이토카인 방출을 억제하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

말초혈액단핵세포(PBMC)를 Biotox Sciences (San Diego, CA)에서 얻은 정상 시노몰구스 원숭이 전혈로부터 Ficoll 밀도 원심 분리 (Sigma HISTOPAQUE™; cat# 10771)를 사용하여 표준 방법으로 준비하였다.

세포 상등액 내의 시노몰구스 IL-8 수준은 eBioscience (San Diego, CA) 원숭이 IL-8 platinum ELISA kit (cat# BMS640/3)를 사용하여 제조업자에 의해 제공된 표준 프로토콜에 따라 ELISA로 평가하였다. 데이터를 그래프로 나타내고, GraphPad PRISM™ 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀값을 계산하였다. 본 분석의 결과를 표 8에 나타내었다.

[표 8]

본 실시예의 결과는 본원에 기재된 HC 및 LC의 조합을 포함하는 항체가 IL-36R을 발현하고 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 자극된 시노몰구스 일차 말초 혈액 안핵 세포로부터 염증성 사이토카인 방출(IL-8)을 농도 의존적 방식으로 억제하는 것을 증명한다.

실시예 8

본 실시예는 본원에 기술된 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 인간 IL-36R에 대한 결합에 대해 교차-경쟁(cross-compete)하는 항체를 형성할 수 있음을 증명한다.

본원에 기재된 다양한 HC 및 LC 폴리펩티드를 포함하는 항체에 의한 타겟 IL-36R의 교차-경쟁 결합은 BIACORE™ T200 system (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 결정하였다. 각각의 분석에서, 1차 항체는 칩의 표면 상에 포획되었고, 사용되지 않은 포획 부위는 인간 IL-36R에 결합하지 않는 포화량의 음성 대조군 항체의 첨가에 의해 연속적으로 차단되었다. 이 단계 다음에 IL-36R의 결합 및 항체가 단량체 항원 상의 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위한 2차 항체의 추가를 수행하였다. 항체가 동일한 에피토프에 결합한다면, 2차 결합은 관찰되지 않을 것이다; IL-36R 상의 상이한 결합 부위가 이용된다면, 2차 항체는 1차 항체/항원 복합체에 결합할 것이다.

항-인간 IgG(Fc-특이적; GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)를 EDC-활성화 커플링 화학을 사용하여 ~8,000RU에서 BIACORE™ CM5 칩의 표면상에 고정화 시켰다. 본원에 기재된 본 발명의 HC 및 LC 폴리펩티드의 다양한 조합을 포함하는 항-IL-36R 항체 (10μg/mL; 10μL/분의 유속에서 60초의 접촉 시간)를 25℃에서 칩의 표면 상에 포획하고 ~500RU 포획 항체를 수득하였다. 표면은 타겟에 대한 비-특이적, 아이소타입-매치된 음성 대조군 항체를 사용하여 차단하였다(100μg/mL에서 APE4909; 10μL/분의 유속에서 60초의 접촉 시간). 그 후, 러닝 버퍼(HBS-EP+, pH7.6; ;GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)에서 희석된 IL-36R(1μM에서)을 칩의 표면에 흘려 주었고(30μL/분의 유속에서 100초), 즉시 2차 항체를 뒤이어 하였다. 간접적으로 칩 표면의 질량 변화를 모니터링하는 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해 생성된 결과적인 센소그램(sensogram)를 검사하여 항체 사이의 교차 경쟁을 결정하였다.

본 발명의 항-IL-36R 항체에 대한 경쟁적 결합 분석의 결과를 표 9 및 도 8a 및 8b에 나타내었다.

[표 9]

본 실시예의 결과는 항체 APE6155 (5D3) 및 APE3847 (18D4)가 인간 IL-36R 상의 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하지만, IL-36R에 대한 결합에 대해 항체 APE5100과 경쟁하지 않음을 증명하며, APE6155, APE3847은 APE5100과 에피토프를 공유하지 않음을 제시한다. 경쟁 결과는 항원에 결합하는 일차 및 2차 항체의 순서와 부합하고 독립적이었다.

실시예 9

본 실시예는 본원에 기재된 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 IL-1RAcP와 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-36R을 발현하는 세포에 결합할 수 있음을 증명한다.

인간 IL-36R 및 인간 IL-1RAcP를 안정적으로 동시에 발현하는 CHO-K 세포에 대한 항체의 결합을 조사하였다. 시노몰구스 IL-36R 대립 유전자 변이를 Sanger sequencing으로 조사하였고, 4개의 별개의 대립 유전자 변이체가 시노몰구스 원숭이 집단 내에서 확인되었다. APE6155 및 APE7247에 대해 시노몰구스 원숭이 IL-36R 변이체 1 및 시노몰구스 원숭이 IL-1RAcP를 안정적으로 동시에 발현하는 CHO-K 세포에 대한 항체의 결합 또한 시험하였다. 각 항체를 아쿠타아제(accutase)를 사용하여 수확한 CHO 세포와 함께 배양하고, 세척하고, 웰 당 500,000 세포로 파종 하였다. 세포를 33nM-16pM 범위 농도에서 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하고, FACS 염색 버퍼로 3회 세척하였다. 세포를 회전시키고 흡인시킨 다음 상온에서 10분 동안 100μl 파라포름알데히드와 배양하였다. 세포를 다시 세척하고 흡인하고 4℃에서 20분 동안 항-인간 IgG Alexa 647 100μL로 염색하였다. 세포를 FACS Array (BD Biosciences)에서 분석하기 전에 100μL FACS 분석 버퍼에 재현탁하였다.

본 발명의 항-IL-36R 항체에 대한 경쟁적 결합 분석의 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다. 도 9a는 인간 IL-36R 및 인간 IL-36R을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 대한 APE06155 및 APE07247 항체의 결합을 나타내고, 도 9b는 시노몰구스 원숭이 변이체 1 IL-36R 및 IL-1RAcP를 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 동일한 항체를 나타낸다. 데이터는 APE6155에 대하여 인간 및 시노몰구스 IL-36R 발현 CHO 세포에 대해 각각 1.5 nM 및 2.4 nM으로 결정된, 및 인간 및 시노몰구스 IL-36R 발현 CHO 세포에 대해 결합하는 백업 Ab APE7247에 대해 각각 2.8 nM 및 3.3 nM으로 결정된 EC₅₀ 값으로 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 피팅하였다. 음성 아이소타입 매치된 대조군 항체 APE00422는 어느 세포주에도 결합을 나타내지 않았다.

실시예 10

본 실시예는 본원에 기술된 본 발명의 면역글로불린 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 폴리펩티드가 우수한 약동학 특성 및 피하 생체이용률을 갖는 시노몰구스 원숭이에서 인 비보로 사용될 수 있음을 증명한다. 시노몰구스 원숭이는 단일 용량 정맥 (IV) 또는 피하 (SC) 주사로 ANB019를 투여받았다. 혈액 시료를 투약 후 0.5 내지 672 시간 (4주)의 단일 투여량 연구에서 원숭이로부터 수집하였다. 유래된 혈청 시료를 자체 ELISA-기반 방법을 사용하여 AnaptysBio, Inc. (San Diego, CA)에서 분석하였다. ANA020의 혈청 농도 대 시간 데이터에 대하여 약동학 분석을 AnapysBio, Inc.에 의해서 수행하였다.

ANB019의 혈청 농도 vs. 시간 프로파일은 IV 및 SC의 두 가지 투여 경로 모두에서, IV 투여의 경우 24시간 시점을 통해 Tmax로부터 금격히 감소하는 수준을 보인 이후 비인간 영장류에서 단일클론 항체의 예측되는 행동을 갖는 선형 감소를 보이며 정상적으로 행동하였다. ANB019 혈청 농도 값으로부터 추정된 약동학 변수가 비-구획 분석으로부터 유도되었고 표 10에 열거하였다. 매개 추정은 원숭이에서 IgG4 스캐폴드 단일클론 항체에 대한 예상된 약동학과 일치하였다. ANB019의 반감기는 IV 주입 후 ~270 시간 및 SC 주입 후 ~330 시간으로 추정되었다. SC 주사 후 생체 이용률은 60%였다.

[표 10]

본원에 인용된 간행물, 특허 출원서, 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고문헌으로 포함되도록 지시된 것과 동일한 범위로 본원에 참고문헌으로 포함되며, 본원에 그 전체가 기재된다.

본 발명을 설명하는 문맥에서(특히 하기 청구항의 문맥에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 "하나 이상" 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에 다르게 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 커버하는 것으로 해석된다. 하나 또는 그 이상의 항목의 목록(예를 들어, "A 및 B 중 하나 이상") 다음 용어 "하나 이상"의 사용은, 본원에 다르게 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 나열된 항목으로부터 선택되는 하나의 항목(A 또는 B) 또는 나열된 항목(A 및 B) 중 두개 또는 그 이상의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"은 다르게 지시되지 않는 한 개방형 말단 용어로 이해된다(즉, "포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌"). 본원에서 값의 범위를 인용한 것은, 본원에 다르게 지시되지 않는 한, 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값을 지칭하는 약식 방법으로서의 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 개별적인 값은 본원에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 다르게 지시되지 않거나 문맥에 의해서 명백히 부인되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 그리고 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들면, "~와 같은")의 사용은 다른 방식으로 청구되지 않는 한 단지 본 발명을 더 잘 예시하고자 의도하는 것이며 본 발명의 범위에 대한 제한을 제시하는 것이 아니다. 명세서 내 어떠한 언어도 본원의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지시하는 것으로 이해되지 않는다.

본원에 기술된 본 발명의 바람직한 구현예는, 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최선의 방식을 포함하며 본원에 기술된다. 이러한 바람직한 구현예의 변형은 상기에 기술된 설명을 읽음으로써 당업자에게 분명해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 수 있음을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에 다르게 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한, 가능한 이들의 모든 변형에서 상기 기술된 구성요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> AnaptysBio, Inc. <120> ANTIBODIES DIRECTED AGAINST INTERLEUKIN 36 RECEPTOR (IL-36R) <130> 723558 <150> US 62/147,824 <151> 2015-04-15 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa1 is leucine (Leu) or phenylalanine (Phe) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa2 is valine (Val), methionine (Met), or leucine (Leu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa3 is arginine (Arg) or glycine (Gly) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa4 is glycine (Gly), serine (Ser), or alanine (Ala) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa5 is arginine (Arg) or alanine (Ala) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa6 is threonine (Thr) or lysine (Lys) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa7 is serine (Ser) or alanine (Ala) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa8 is tyrosine (Tyr) or phenylalanine (Phe) <400> 1 Gln Val Gln Xaa Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa Asp Xaa Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Xaa Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala 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phenylalanine (Phe) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa8 is lysine (Lys) or asparagine (Asn) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa9 is glycine (Gly) or lysine (Lys) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa10 is serine (Ser) or threonine (Thr) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa11 is valine (Val) or arginine (Arg) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa12 is threonine (Thr) or valine (Val) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa13 is tyrosine (Tyr) or phenylalanine (Phe) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (118)..(118) <223> Xaa14 is is alanine (Ala) or absent <400> 57 Xaa Xaa Gln Xaa Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa Xaa Tyr Ser Ile Thr Xaa Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Xaa Tyr Xaa Cys 85 90 95 Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 58 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa1 is aspartic acid (Asp) or tryptophan (Trp) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa2 is arginine (Arg) or methionine (Met) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa3 is glycine (Gly), serine (Ser) or proline (Pro) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa4 is threonine (Thr) or asparagine (Asn) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa5 is phenylalanine (Phe) or tyrosine (Tyr) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa6 is arginine (Arg) or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa7 is threonine (Thr) or absent <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Xaa Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Xaa Asp Xaa Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Xaa Xaa 100 105

Claims

아미노산 서열 Gln Val Gln Xaa1 Xaa2 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa3 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa4 Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Ala Xaa7 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Xaa8 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(서열번호 56)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe),
(b) Xaa2는 발린(Val), 메티오닌(Met), 또는 류신(Leu),
(c) Xaa3은 아르기닌(Arg) 또는 글리신(Gly),
(d) Xaa4는 글리신(Gly), 세린(Ser), 또는 알라닌(Ala),
(e) Xaa5는 아르기닌(Arg) 또는 알라닌(Ala),
(f) Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 리신(Lys),
(g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 아스파라긴(Asn),
(h) Xaa8은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala), 및
(i) Xaa9는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.
청구항 1에 있어서, 아미노산 서열 Gln Val Gln Xaa1 Xaa2 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa3 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Xaa4 Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Xaa7 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa8 Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(서열번호 1)을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe),
(b) Xaa2는 발린 (Val), 메티오닌 (Met), 또는 류신(Leu),
(c) Xaa3은 아르기닌(Arg) 또는 글리신(Gly),
(d) Xaa4는 글리신(Gly), 세린(Ser), 또는 알라닌(Ala),
(e) Xaa5는 아르기닌(Arg) 또는 알라닌(Ala),
(f) Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 리신(Lys),
(g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala), 및
(h) Xaa8은 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.
청구항 1에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드.
아미노산 서열 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Xaa1 Met Xaa2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Xaa3 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Phe Xaa4 Pro Xaa5 Xaa6 Xaa7 Val Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Thr Ser Met Ile Ile Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(서열번호 15)을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 트립토판(Trp) 또는 티로신(Tyr),
(b) Xaa2는 히스티딘(His), 아스파라긴(Asn), 또는 티로신(Tyr),
(c) Xaa3은 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg),
(d) Xaa4는 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 또는 히스티딘(His),
(e) Xaa5는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr),
(f) Xaa6은 아스파라긴(Asn) 또는 글리신(Gly), 및
(g) Xaa7은 세린(Ser), 알라닌(Ala), 또는 아스파르트산(Asp)이다.
청구항 4에 있어서, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드.
아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Gln Xaa3 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa4 Xaa5 Tyr Ser Ile Thr Xaa6 Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa7 Pro Gly Xaa8 Xaa9 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa10 Xaa11 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Xaa12 Tyr Xaa13 Cys Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa14(서열번호 57)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 글루타민(Gln) 또는 아스파르트산(Asp),
(b) Xaa2는 발린 (Val) 또는 류신(Leu),
(c) Xaa3은 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe),
(d) Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser),
(e) Xaa5는 글리신(Gly) 또는 아르기닌(Arg),
(f) Xaa6은 세린(Ser) 또는 알라닌(Ala),
(g) Xaa7은 프롤린(Pro) 또는 페닐알라닌(Phe),
(h) Xaa8은 리신(Lys) 또는 아스파라긴(Asn),
(i) Xaa9는 글리신(Gly) 또는 리신(Lys),
(j) Xaa10은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr),
(k) Xaa11은 발린(Val) 또는 아르기닌(Arg),
(l) Xaa12는 트레오닌(Thr) 또는 발린 (Val),
(m) Xaa13은 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe), 및
(n) Xaa14는 알라닌(Ala) 또는 부존재이다.
청구항 1에 있어서, 아미노산 서열 Xaa1 Val Gln Xaa2 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa3 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa4 Pro Gly Xaa5 Xaa6 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Xaa7 Xaa8 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Ala Ile Arg Gly Pro Tyr Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser(서열번호 25)을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 글루타민(Gln) 또는 아스파르트산(Asp),
(b) Xaa2는 류신(Leu) 또는 페닐알라닌(Phe),
(c) Xaa3은 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser),
(d) Xaa4는 프롤린(Pro) 또는 페닐알라닌(Phe),
(e) Xaa5는 리신(Lys) 또는 아스파라긴(Asn),
(f) Xaa6은 글리신(Gly) 또는 리신(Lys),
(g) Xaa7은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr),
(h) Xaa8은 발린(Val) 또는 아르기닌(Arg), 및
(i) Xaa9는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이다.
청구항 6에 있어서, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 또는 서열번호 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드.
서열번호 33, 서열번호 34, 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드.
아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Xaa1 Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa2 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Xaa3 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys(서열번호 36)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala),
(b) Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr), 및
(c) Xaa3은 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이다.
청구항 10에 있어서, 서열번호 37, 서열번호 38, 또는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드.
아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Xaa1 Asn Xaa2 Ile Thr Tyr Phe Tyr Trp Tyr Leu Xaa3 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(서열번호 40)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 세린(Ser) 또는 아르기닌(Arg),
(b) Xaa2는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala), 및
(c) Xaa3은 글루타민(Gln) 또는 히스티딘(His)이다.
청구항 12에 있어서, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드.
아미노산 서열 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa1 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Xaa2 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa3 Ser Gly Ser Gly Xaa4 Asp Xaa5 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Xaa6 Xaa7(서열번호 58)을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 아스파르트산(Asp) 또는 트립토판(Trp),
(b) Xaa2는 아르기닌(Arg) 또는 메티오닌 (Met),
(c) Xaa3은 글리신(Gly), 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro),
(d) Xaa4는 트레오닌(Thr) 또는 아스파라긴(Asn),
(e) Xaa5는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr),
(f) Xaa6은 아르기닌(Arg) 또는 부존재, 및
(g) Xaa7은 트레오닌(Thr) 또는 부존재이다.
청구항 14에 있어서, 아미노산 서열 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Xaa1 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa2 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(서열번호 45)을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 여기서
(a) Xaa1은 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro), 및
(b) Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr)이다.
청구항 15에 있어서, 서열번호 46, 서열번호 47, 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드.
서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드.
청구항 1-9 중 어느 한 항의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산 서열.
청구항 10-17 중 어느 한 항의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산 서열.
청구항 18 또는 청구항 19의 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
하나 이상의 하기 생물학적 활성을 나타내는 인터루킨 36 수용체(interleukin 36 receptor: IL-36R)-결합제(binding agent):
(a) IL-36R 및 IL-36α, IL-36β, 및/또는 IL-36γ 사이의 상호작용을 억제,
(b) IL-36R에 의해 매개되는 세포내 신호전달을 억제,
(c) 인간 IL-36R, 시노몰구스 IL-36R, 및 비-인간 영장류 IL-36R과 상호작용하고 활성을 억제.
청구항 1-9 중 어느 한 항의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 청구항 10-17 중 어느 한 항의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 인터루킨 36 수용체(IL-36R)-결합제.
청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 청구항 1-9 중 어느 한 항의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 청구항 10-17 중 어느 한 항의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 IL-36R-결합제.
청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 청구항 1-9 중 어느 한 항의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 청구항 10-17 중 어느 한 항의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 IL-36R-결합제.
청구항 21-24 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 항체 콘주게이트, 또는 이들의 항원-결합 단편인 것인 IL-36R-결합제.
청구항 22에 있어서, F(ab')₂단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fv 단편, scFv 단편, dsFv 단편, dAb 단편, 또는 단일 사슬 결합 폴리펩티드인 것인 IL-36R-결합제.
IL-36R에 결합하기 위해 청구항 18-26 중 어느 한 항의 IL-36R 결합제와 경쟁하는 것인 IL-36R-결합제.
청구항 21-27 중 어느 한 항의 IL-36R-결합제를 인코딩하는 단리된 핵산 서열.
청구항 28의 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
청구항 29의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
(a) 청구항 21-27 중 어느 한 항의 IL-36R-결합제 또는 청구항 29의 벡터 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
IL-36R 억제에 반응하는 포유동물에서 질병을 치료하는 방법으로서, 유효량의 청구항 31의 조성물을 IL-36R 억제에 반응하는 질병을 갖는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하고, 그 결과 포유동물에서 상기 질병이 치료되는 것인 방법.
청구항 32에 있어서, 상기 질병이 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 질환(epithelial mediated inflammatory disorder), 섬유증, 또는 암인 것인 방법.
청구항 33에 있어서, 상기 질병이 심상성건선, 농포성건선, 전신성 농포성건선(generalized pustular psoriasis: GPP), 손-발바닥 농포성건선(palmo-plantar pustulosis: PPP), 염증성장질환, 건선성관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 피부경화증, 천식, 및 강직성 척추염인 것인 방법.
청구항 32-34 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 상기 IL-36R-결합제의 반감기가 30분 내지 45일인 것인 방법.
청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 피코몰(pM) 및 약 100 마이크로몰(μM) 사이의 KD로 상기 IL-36R-결합제가 IL-36R에 결합하는 것인 방법.
청구항 31의 조성물의 IL-36R 억제에 반응하는 포유동물에서 질병을 치료하기 위한 약을 제조하기 위한 용도.
청구항 37에 있어서, 상기 질병이 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 상피 매개된 염증성 질환(epithelial mediated inflammatory disorder), 섬유증, 또는 암인 것인 용도.
청구항 37에 있어서, 상기 질병이 심상성건선, 농포성건선, 전신성 농포성건선(generalized pustular psoriasis: GPP), 손-발바닥 농포성건선(palmo-plantar pustulosis: PPP), 염증성장질환, 건선성관절염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, COPD, 피부경화증, 천식, 및 강직성 척추염인 것인 용도.