KR20180000282A

KR20180000282A - 토마토 유래 sra1 유전자를 이용한 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR20180000282A
Application number: KR1020170042818A
Authority: KR
Inventors: 강진호
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2017-04-03
Publication date: 2018-01-02
Also published as: KR101852532B1

Abstract

본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질 코딩 유전자를 이용한 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명의 SlSRA1 유전자를 이용하여 모용 발달, 이차대사물질 합성 및 식물체 해충 저항성을 증대시키는 형질전환체 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

토마토 유래 SRA1 유전자를 이용한 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법 및 그에 따른 식물체{Method for increasing pest resistance in plant using SRA1 gene from Solanum lycopersicum and the plant thereof}

본 발명은 토마토 유래 SRA1 유전자를 이용한 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

모용(trichome)은 표피에서 자라나온 것인데, 이것은 식물들 종 사이에서 주목할만한 형태학적인 변화를 보여준다. 모용은 단세포 또는 다세포로 분류되며, 민샘 모용(nonglandular trichome)(단순한 털)과 샘 모용(glandular trichome)으로 구별되기도 한다. 샘 모용의 경우 다양한 이차대사물질을 분비하고 생산한다. 또한, 모용은 생물적 및 비생물적 스트레스 방어와 관련된 여러 생리적인 기능과 관련이 있다. 예를 들어, 모용은 병원체와 다양한 해충에 대항하여 식물을 보호하고, 선인장에서 사용되는 수분 포집과 수분손실을 막거나, UV-B 복사(radiation)로부터 보호한다.

애기장대에서 수행한 분자 유전학 연구는 단순한 단세포의 모용 발달을 조절하는 경로에 대해서 자세한 이해를 제공한다. 예를 들어 MYB와 bHLH 전사인자와 D40 반복단백질로 이루어진 다중단백질 복합체가 상피세포에서 나오는 모용의 분화를 조절하는 것을 보여준다. 뒤틀린 모용 돌연변이체 연구는 모용의 분기, 세포 확장, 그리고 다른 세포의 형태학적인 면에서 액틴 세포골격 망이 중요한 역할을 한다는 것을 보여주고 있다. 하지만 애기장대 외에는 모용의 발달에 관한 분자 유전학적인 연구가 부족하기 때문에, 다중세포 모용 및 샘 모용 발달 기작은 거의 알려지지 않았다. 그럼에도 불구하고, 특정한 대사물질을 생산하는 '세포 공장'으로서 샘 모용에 대한 관심이 증가함으로써 샘 모용 발달과 대사적인 과정에 대한 통합적인 이해를 이루기 위해 연구가 많이 되고 있다.

토마토(Solanum lycopersicum)는 민샘과 샘 구조 모두를 포함하여 형태학적으로 구별되는 모용을 생산한다. 가장 잘 연구된 모용들 중에는 타입Ⅰ과 타입 VI 모용이 있다. 타입 I 모용은 다중세포 바닥, 긴 다중세포 줄기(~2 mm), 그리고 acyl sugar가 분비되는 작은 glandular tip이 있는 것이 특징이다. 타입 VI 모용은 짧은(~0.1 mm) 다중세포 줄기와 플라보노이드와 테르페노이드를 생산하는 네 개의 세포로 이루어진 glandular head를 가진다. 오믹스(omics)라는 최신 기술은 이러한 모용에서 특정한 대사물질을 생산하는 기초가 되는 생화학적인 경로를 설명하는데 도움을 주었다. 상호보완적인 유전학 연구는 샘 모용에서 합성되는 화학성분과 해충에 대한 재배종 토마토의 저항성과의 관계를 연결시켜주는 증거를 제공해준다. 그러나, 몇 개 안 되는 연구에서만 샘 모용의 발달과 기능에 관여하는 유전자들에 대해서 밝혀졌다. 예를 들어, jai-1 돌연변이는 타입 VI 샘 모용의 밀도를 조절하는 자스모네이트(jasmonate) 수용기의 구성성분(CORONATINE-INSENSITIVE1)이다. 또한 플라보노이드 생합성 효소인 CHI1(chalcone isomerase)의 기능이 결여될 경우 타입 VI 모용의 밀도를 감소시킨다고 보고되어있다. 반면에, MEP(methyl-D-erythritol 4-phosphate) 경로의 효소인 DXH2(1-deoxy- D -xylulose 5-phosphate synthase 2)의 하향조절은 타입 VI 모용의 밀도를 증가시킨다. 타입 VI 모용 발달에 관한 이러한 효과와 반대로, 토마토 Woolly 유전자는 타입 I 모용의 발달을 조절하는 전사인자를 포함하는 호메오 도메인을 암호화시킨다. 이러한 발견은 토마토에서 다양한 모용의 발달은 특정한 구조에 특이하게 맞는 조절과정이 관여함을 보여준다. 토마토 모용의 발달과 기능에 관한 더 나은 이해는 다양한 모용의 종류에 영향을 주는 유전자 연구를 통해 가능하다. 그러나, 이러한 유전자들은 분자적인 레벨에서는 아직 밝혀져 있지 않다.

토마토 hairless(hl) 식물은 줄기와 배축 모용 생성에 문제가 있는 자발적 돌연변이로 반세기전에 알려졌다(Rick and Butler, 1956, Advances in Genetics 8:267-382). 'hairless' 돌연변이의 표현형이 모용의 결핍으로부터 유래된 것이 아니라 상피조직에서 오돌토돌한 표현을 보여주고, 구부러지고 짧은 모용의 발달로부터 유래된 것이라 보고되기도 했다. 차후의 연구에서 hl 식물은 타입 VI 샘모용에서 세스퀴테르펜과 폴리페놀 화합물의 축적이 결여됨을 보여주고 있으며, 이는 해충저항성 감소와 연관이 있음을 보여주었다(Kang et al., 2010, J. Exp. Botany 61:1053-1064). 그러나 아직까지 토마토 hairless(hl) 표현형을 결정하는 유전자에 대해서는 알려져 있지 않다. 이에 본 발명자는 유전자지도 클로닝 방법을 이용하여 hl 표현형을 야기시킨 유전자를 규명하고 생물학적 기능을 밝히고자 하였다.

한국공개특허 제2014-0119703호에는 '돌연변이 tghV1 대립유전자를 포함하는 토마토 식물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0951062호에는 '배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 비알디 1 유전자, 이를 이용한 형질전환체 및 상기 유전자를 발현시켜 해충 저항성을 증진시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 토마토 유래 SRA1 유전자를 이용한 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 토마토 hairless(hl) 식물의 변이 표현형을 결정하는 유전자가 SRA1 유전자임을 규명하였으며, hl 돌연변이는 SlSRA1 gDNA의 약 3Kb의 C-말단 부위가 결실 및 재배열되어 야기되었음을 밝혔으며, hl 돌연변이체에 야생형 SlSRA1 cDNA를 형질전환시켜서 정상적인 모용 형태와 수, 대사물질 축적 및 해충 저항성이 회복됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SlSRA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 해충 저항성 증대용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 유전자는 식물체 해충 저항성을 증대시키는 형질전환 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 형질전환 식물체는 모용 발달, 이차대사물질 합성 및 식물체 해충 저항성을 증대시켜 작물 개발 및 생산성 증대를 가져올 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 야생형(WT) 및 hl 식물체의 줄기(stem) 및 하배축(hypocotyl)의 모용을 관찰한 사진이다. I는 타입 I 모용을 나타낸다. 스케일 바는 1mm을 표시한다.
도 2는 hl 유전자가 애기장대 유래 SRA1의 상동체를 암호화함을 나타낸다. (A) hl은 토마토 11번 염색체의 유전지도에서 U601668 및 T0675 분자표지 사이에 위치한다. 괄호 내 숫자는 재조합 이벤트(event) 숫자를 나타낸다. (B) SlSRA1의 게놈 DNA 구조이다. 블랙 상자는 엑손을 나타내며, 블랙 상자 사이의 선은 인트론 또는 유전자간 부위(intergenic region)을 나타낸다. (C) SlSRA1 유전자의 전장 cDNA의 개략도이다. 상자는 코딩 서열 부위이며, 흰색 상자는 1번째 부터 29번째까지의 엑손 부위이며, 블랙 상자는 마지막 30번째 엑손을 나타낸다. 솔리드 화살표는 전장 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머쌍이며, 점선 화살표는 3' RACE의 프라이머쌍을 나타낸다. (D) 야생형(WT) 및 hl 식물체 잎에서의 SRA1 전장 cDNA의 RT-PCR 결과이다. elF4A는 로딩 대조군을 나타낸다. (E) 야생형(WT) 및 hl 식물체의 SlSRA1의 게놈 DNA 구조를 비교한 결과이다. hl는 WT 내의 SlSRA1 유전자의 30번째 엑손(exon 30)을 포함하여 3.2kb가 결손되고, 화살표로 나타내는 3개의 부위는 보유한다.
도 3은 야생형(WT), hl 식물체 및 SRA1 유전자로 보완된 형질전환체 라인(SRA1-2, SRA1-10)의 모용 형태를 비교한 결과이다. I는 타입 I 모용을 나타낸다.
도 4는 야생형(WT), hl 식물체 및 SRA1 유전자로 보완된 형질전환체 라인(SRA1 -2, SRA1 -10)의 단위면적 당 타입 VI 모용 수(Type VI number/cm²)를 비교한 결과이다. *는 P<0.05, ***는 p<0.001로 통계상 유의적 차이를 나타낸다.
도 5는 야생형(WT), hl 식물체 및 SRA1 유전자로 보완된 형질전환체 라인(SRA1-2, SRA1-10)의 타입 VI 샘(gland)에서 생성되는 모노테르펜(A) 및 세스퀴테르펜(B) 함량을 비교한 결과이다. *는 P<0.05, **는 p<0.01로 통계상 유의적 차이를 나타낸다.
도 6은 야생형(WT), hl 식물체 및 SRA1 유전자로 보완된 형질전환체 라인(SRA1-2, SRA1-10)의 타입 VI 샘(gland)에서 생성되는 플라보노이드 관련 대사물질(루틴 및 퀘르세틴-트리사카라이드) 함량을 비교한 결과이다. *는 P<0.05, ***는 p<0.001로 통계상 유의적 차이를 나타낸다.
도 7은 야생형(WT), hl 식물체 및 SRA1 유전자로 보완된 형질전환체 라인(SRA1-2, SRA1-10)의 담배박각시나방의 유충에 대한 저항성을 확인하기 위하여 유충이 처음으로 먹는데 걸리는 시간(A, first feeding time) 및 각 식물체에서 8일간 키운 유충의 중량(B, Larval mass)을 측정하여 비교한 결과이다. *는 P<0.05, **는 p<0.01, ***는 p<0.001로 통계상 유의적 차이를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum specifically Rac1-associated protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SlSRA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 SlSRA1 단백질의 범위는 토마토(Solanum lycopersicum)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 해충 저항성의 증대를 의미한다. 본 발명은 또한 SlSRA1 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.

또한, 상기 SlSRA1 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 SlSRA1 유전자의 cDNA 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

SlSRA1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

본 발명에서의 해충은 식물에 해를 끼치는 곤충이며, 바람직하게는 담배박각시나방(Manduca sexta)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

또한, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 SlSRA1 단백질을 코딩하는 유전자는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 SlSRA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 제조합 벡터를 hairless 돌연변이체(hl, accession number LA3556)에 형질전환시켜 제조된 형질전환 식물체는 비형질전환 식물체인 hairless 돌연변이체보다 담배박각시나방에 저항성을 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물의 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 가지과이며, 더 더욱 바람직하게는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 해충 저항성 증대용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 SlSRA1 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시켜 SlSRA1 유전자를 과발현시킴으로써 식물의 해충 저항성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 식물 재료 및 재배 조건

모든 실험에서 토마토 재배종인 Ailas Craig(LA2838A)를 야생형(WT)으로 사용하였다. WT 및 hairless(hl, accession number LA3556)의 종자는 토마토유전자원센터(University of California, Davis, 미국)에서 제공받았다. 종자는 지피 포트(jiffy pot)(Hummert International, Earth City, MO, 미국)에 파종하여 생장상 안에서 재배하였다. 재배 조건은 27℃에서 17시간 명배양과 18℃에서 7시간 암배양의 주기로 설정하였고 습도는 60%로 유지하였다. 3~4주간 재배한 식물체를 형태 및 2차대사물질 분석을 위한 시료로 활용하였다.

2. Hl 의 유전자지도 작성

Hl 돌연변이(LA3556)와 S. pennellii(LA0716)를 교잡하여 얻어진 F2 집단을 이용하여 세부적인 유전자 지도 작성을 수행하였으며, 토마토의 유전체 서열을 이용함으로써 작성이 가능하였다. 376개체의 F2집단을 이용하여 모용 표현형과 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)기반의 COS(conserved ortholog set) 표지를 이용하여 유전자형 분석을 하였다(Tomato-EXPEN 200 map; http://solgenomics.net). 몇몇의 경우, 솔라눔 모용 프로젝트(Solanum Trichome Project)에서 확보한 S. pennellii와 S. lycopersicum의 상동성을 가진 EST서열을 비교함으로써 새로운 PCR기반의 표지를 개발하였다.

3. PCR 분석

잎에서 추출된 RNA(Plant RNeasy Kit, Qiagen, 미국)는 cDNA(Complementary DNA) 합성(Thermoscript RT-PCR system, Invitrogen, 미국)을 위해 사용하였다. 합성방법은 키드 제조사의 설명에 따라 진행하였다. SlSRA1에 상응하는 cDNA 가닥은 SlSRA1 cDNA 프라이머(PIR-cDNA, 표 1 참조)를 이용하여 PCR 증폭하였다(DNA Engine Dyad Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). eIF4A(elongation factor 4A)를 암호화 한 cDNA는 elf4A 프라이머(elf4A, 표 1 참조)를 이용하여 PCR 증폭하여 대조군으로 사용하였다. RT-PCR 반응(25㎕)에는 2㎕의 cDNA, 각각 0.75㎕의 10μM 프라이머, 0.75㎕의 10mM dNTP 혼합액, 5㎕의 5X KAPA 버퍼, 그리고 0.5㎕의 KAPA DNA 중합효소(KAPAHIFI HotStart, Kapa Biosystem)가 첨가되었다. 증폭조건은 95℃에서 5분간 초기 변성단계를 포함하며, 98℃에 20초, 65℃에 15초, 그리고 72℃에서 3분의 주기를 30회 반복한 다음, 최종 단계에서 72℃에 5분간 반응하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. 3' RACE(rapid amplification of cDNA ends)는 WT과 hl 식물체로부터 전사되는 SlSRA1의 폴리아데닐화 영역(polyadenylation sites) 규명에 사용되었다. 반응을 위한 프라이머 서열(3' RACERT, 3' RACE1 및 3' RACENESTED)은 표 1에 나열하였다.

WT과 hl 식물체 SlSRA1에 상응하는 게놈 DNA 가닥은 표 1에 나열된 gPIR1-gPIR15의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. PCR 반응(20㎕)에는 2㎕ gDNA 주형, 각각 1㎕의 10 μM 프라이머, 그리고 10㎕의 Taq polymerase 2X MeanGreen Mastermix(Syzygy Biotech)가 첨가되었다. 증폭 산물은 94℃에 5분간 초기변성을 거친 후, 94℃ 45초, 52℃ 30초, 그리고 72℃ 1분의 주기를 30번 반복한 다음, 최종 단계에서 72℃에서 10분간 반응하여 생성되었다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. PCR로 증폭된 가닥은 pGEM-T-Easy 플라스미드 벡터(Promega, 미국)를 이용하여 클론화하였다. 자동화 염기분석은 미시간 주립 대학교 유전 공학 지원시설(Michigan State University Genomics Technology Support Facility; http://rtsf.msu.edu/)에서 수행하였다.

4. 형질전환 식물

전장의 SlSRA1 cDNA를 포함하는 pGEM-T 플라스미드는 PIR-SX 프라이머(표 1)를 이용하여 다시 증폭하였다. 증폭된 가닥은 제한효소 SpeI과 XhoI로 절단하여 3.9Kb의 가닥을 정제하였다. 그리고 SpeI과 XhoI의 인식서열을 가진 pBI-TS 바이너리 벡터에 삽입하였다. 이 벡터는 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터와 NOS 종결자(nopaline synthase terminator)를 포함하며, pBI-35S::SRA1이 되었다. 완성된 벡터는 뿌리혹 박테리아(Agrobacterium tumefaciens strain EHA105)에 도입하였고 hl 식물체의 자엽 절편에 형질전환을 시도하기 위하여 사용되었다. 초기 형질전환체(T0) 내의 T-DNA 삽입 여부 확인은 35S-PIR 프라이머(표 1)를 이용하여 CaMV 프로모터와 SRA1 cDNA 구간 사이의 서열을 PCR 증폭함으로써 확인하였다. SlSRA1 도입유전자를 포함하는 재분화된 T0 형질전환 식물체는 화분에 이식하여 모용발달의 분석을 준비하기 위하여 생장상으로 옮겨 재배하였다. 이 식물체들은 이후, 각 개체군으로부터 종자(T1 세대)를 수확하기 위하여 온실로 옮겨 재배하였다. T1 식물체들은 일반적인 형태의 모용과 뒤틀린 형태의 모용을 나타내는 개체가 3:1의 비율로 분리되었고 그 중에서 일반적인 형태의 모용을 나타내는 개체들을 선발하였다. 일반적인 모용을 나타내는 식물체는 T2 세대 종자를 확보하기 위하여 온실에서 재배하였다. 모든 T2 자손에서는 일반적인 형태의 모용이 나타났으며, 이들은 도입유전자에 대해 동형접합자로 선발되었다.

5. 모용의 밀도와 형태

KL 2500 LCD 광원(Schott, 독일)과 Leica DFC 290 카메라(Leica, 독일)를 갖춘 해부현미경(Leica MZ16, 독일)를 사용하여 모용의 형태와 밀도를 측정하였다. 모든 측정은 각각의 유전자형에 대해 같은 생장상에서 함께 재배한 식물체를 이용하여 수행하였다.

6. 대사물질 분석

타입 VI 모용 추출물을 준비하기 위해 4주된 식물체의 잎을 사용하였다. 그리고 선행연구에서 설명된 것과 동일한 방법으로 플라보노이드와 테르페노이드 화합물의 함량을 측정하였다(Kang et al., 2010, J. Exp. Botany 61:1053-1064). 간단하게, 타입 VI 모용의 분비샘을 파스퇴르 피펫을 이용하여 정해진 개수만큼 포집하여 100㎕의 메탄올:아세트산:증류수(9:1:10) 혼합액에 용해하였다. 이 혼합액에는 프로필-4-히드록시벤조산(propyl-4-hydroxybenzoate) 혹은 테트라데칸(tetradecane)이 플라보노이드 파생물질이나 테르페노이드에 대한 각각의 내부 표준 물질(internal standards)로 함유되어 있다. 비휘발성인 대사물질의 함량은 HPLC(high performance liquid chromatography)/time-of-flight MS를 이용하여 측정하였으며, 휘발성 테르펜에 대해서는 GC-MS를 이용하여 측정하였다.

7. 곤충 섭식 실험

Carolina Biological Supply Company(Burlington, 미국)로부터 담배 박각시벌레(Manduca sexta) 유충의 알을 제공받아 26℃에 배양하여 부화시켰다. 부화된 애벌레는 5주된 토마토 식물체 잎 위로 옮겨주었다. 식물체는 섭식 실험을 진행하는 동안 생장상 내에서 계속 재배하였다.

실시예 1. hl 돌연변이는 토마토 유래 SRA1 상동체를 암호함을 확인

Hl의 줄기와 하배축에 뚜렷하게 보이는 타입 I 모용의 결핍은 hl의 자세한 유전지도 작성을 위한 확실한 형태적 표현형을 제공한다(도 1). Hl는 선행된 지도 작성에서 11번 염색체의 단완부에 있는 것으로 확인되었다(도 2A). 본 발명자는 hl 돌연변이(LA3556)와 S. pennellii(LA0716)간의 교잡을 통해 얻은 F₂집단, 그리고 분자표지인 U601668과 T0675를 이용하여 hl의 위치에 대한 범위를 300kb 구역까지 축소하였다. 이 간격 사이에 후보 유전자가 존재하며, 두 개의 인접한 유전자좌(Solyc11g013280, Solyc11g013290)에 의해 암호화되는 단백질은 세포질 FMR1(Fragile X mental Retardational) 상호작용하는 단백질(Cytoplasmic FMR1 interacting protein, CYFIP) 계열의 하나로써 확인되었다(도 2B). 또한 PIR121(P53-inducible protein 121) 혹은 SRA1(Specifically Rac1-associated protein 1)으로도 알려져 있다. CYFIP/PIR121/SRA1(이하 SRA1라고 함) 단백질은 후생동물 및 식물체 사이에 높은 보존성을 가진다; 이들은 이형오각구조적(heteropentameric) WRC(WAVE Regulatory Complex)의 한 부분이며, 유비쿼터스(ubiquitous) Arp2/3 구조의 활성을 자극함으로써 액틴 세포골격 변화를 조절한다. WRC의 다양한 자극신호에 대한 반응은 세포의 분극화와 소포낭 이동을 포함하는 다양한 작용안에서 공간 및 시간적으로 액틴 섬유의 조합을 조절한다. 애기장대에서 AtSRA1(At5g18410, KLUNKER, PIRP 또는 PIROGI) 혹은 WRC의 다른 구성인자의 돌연변이로 인해 관찰된 모용의 뒤틀린 표현형은 토마토 hl 돌연변이에서 관찰한 것과 매우 유사한 결과를 보인다. 따라서 Solyc11g013280과 Solyc11g013290이 hl 에 대한 강력한 후보가 될 것이라 사료된다.

염기서열 분석은 Solyc11g013280과 Solyc11g013290이 AtSRA1 단백질의 C-와 N-말단부에 상응하는 단백질을 암호하는 것으로 보여주고, 다른 식물체나 후생동물에서의 SRA1 유전자 그룹 내 유전자와 상응함을 보여주고 있다. 이러한 결과는 아마도 Solyc11g013280과 Solyc11g0132900이 단일 유전자좌일 것으로 생각되어진다. 실제로, 이들 두 개의 유전자좌를 포함하는 42kb의 게놈 부위는 30개의 엑손을 가지고 있으며, 이들 엑손은 AtSRA1의 인트론-엑손간 배열과 매우 유사하다(도 2B). 이 가설에서 좀더 나아가, 우리는 야생형 토마토 잎의 RNA와 Solyc11g013290에서 개시코돈 ATG로, 그리고 Solyc11g013280에서 종결코돈 TGA로 추정되는 서열에 대한 프라이머(PIR-cDNA, 표 1 참조)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 2C). 단일 3.86kb의 전사체가 증폭되었다. 상기 cDNA는 1,287개의 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 것으로 추정되며, AtSRA1과 81%의 유사성을 가지는 것으로 확인되었다. 우리는 Solyc11g013280과 Solyc11g013290이 단일 유전자로 구성되었으며, 토마토에서 AtSRA1에 상동적인 토마토 유래 SRA1인 SlSRA1를 암호화함을 확인하였다.

hl 잎으로부터 분리한 RNA로부터 PIR-cDNA 프라이머쌍을 이용한 RT-PCR 반응은 SISRA1 cDNA 증폭산물을 얻는데 실패하였다(도 2D). WT에서 SRA1의 유전체 영역은 총 42kb로 확인되었고, hl 식물체에서는 i) 마지막 엑손(30번째 엑손); ii) 상기 엑손의 인트론 단편; iii) 유전자의 3'-비번역부위;을 둘러싼 ~3kb정도의 서열이 결실된 돌연변이임이 확인되었다(도 2E). hl의 gDNA는 야생형 DNA의 3' UTR로부터 파생된 일부 서열을 보유하고 있으며, 결실로 인해 나타난 부분의 DNA 구조와 긴밀하게 연관되어 있다(도 2E). 염기서열 분석 결과를 확인하고 hl에서 SRA1 전사체가 발현되는지 확인하기 위해, 3' RACE를 이용하여 전사에 작용하는 부분을 증폭하였다. 야생형과 hl로부터 얻어진 PCR 산물의 염기분석을 하였고 돌연변이는 SRA1전사체의 3' 말단이 짧아진 상태임이 확인되었다. 돌연변이는 30번 엑손이 결여된 상태였고 SRA1의 C-말단에 63개의 아미노산이 결실된 단백질을 암호화하였다. 이에 hl 돌연변이는 SISRA1 유전자가 손상된 것임을 확인하였다.

실시예 2. hl 돌연변이의 유전적 보완(genetic complementation)은 정상적인 모용 발달으로의 회복을 확인

hl 돌연변이가 뒤틀린 모용의 표현형을 만드는 원인임을 확인하고자, 우리는 아그로박테리움 매개 형질전환 방법을 사용하여 CaMV 35S 프로모터와 결합된 WT SlSRA1 cDNA를 hl 돌연변이 식물체에 발현시켰다. 7 개체의 초기 형질전환체(T₀)로부터 줄기와 하배축에서 정상적인 모용의 발달이 관찰되었다. 이 중 두 개의 형질전환체 라인(SRA1-2 및 SRA1-10)는 T₁세대에서 정상과 돌연변이 표현형에 대해 3:1로 분리되었다. 도입유전자에 대해 동협접합체인 T₂ 라인을 선발하여 이 후 분석을 위해 사용하였다.

WT, hl, 그리고 선발된 두 개의 형질전환체(SRA1-2 및 SRA1-10)의 잎, 줄기, 하배축의 모용 형태를 비교하기 위해 광학 현미경을 사용하였다(도 3). WT의 타입 I 모용과의 비교에서, hl 돌연변이는 타입 I 모용을 만들어내지 못했다(도 3). 형질전환체인 SRA1 -2와 SRA1 -10 라인의 잎, 줄기, 하배축의 모용 형태는 WT 것과 차이가 나지 않았다(도 3). 모용 밀도와 SlSRA1의 상관관계를 조사한 결과, hl 잎에서 타입 VI 모용의 밀도가 WT에 비해 현저히 감소한 것을 확인하였으며, 형질전환체의 경우 WT 수준으로 밀도가 회복됨을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는 hl 돌연변이의 모용 표현형은 SlSRA1의 결실로부터 야기된 것으로 보여진다.

실시예 3. SISRA1 의 모용에서의 대사물질 축적 확인

이전의 연구에서는 hl 돌연변이의 타입 VI 모용은 특정 테르페노이드와 플라보노이드의 축적에 문제가 있음을 보여주었다(Kang et al., 2010, J. Exp. Botany 61:1053-1064). 상기 화합물의 생산에 있어서 SRA1의 역할을 알아보기 위해 WT, hl, SRA1-형질전환 식물체의 타입 VI gland에서 생성되는 테르페노이드와 플라보노이드의 함량을 비교하였다. hl 식물로부터 분리한 타입 VI gland는 WT에 비해 세스퀴테르펜(sesquiterpenes)의 양이 현저하게 낮은 반면, 모노테르펜(monoterpenes)에서는 차이가 없었다(도 5). SRA1-형질전환 식물의 경우, 모노테르펜의 양은 변화가 없으나, 세스퀴테르펜 양은 WT만큼 회복이 되었다(도 5). 또한 hl에서 생성이 줄어든 루틴(rutin)과 퀘르세틴 트리사카라이드(quercetin trisaccharide)의 양이 SRA1 -2와 SRA1 -10의 형질전환 식물에서는 WT 레벨로 회복되는 것을 볼 수 있다(도 6). 이러한 결과는 토마토 타입 VI 샘 모용에서 세스퀴테르펜과 플라보노이드 유도체의 생성에 SRA1이 중요한 역할을 함을 보여주었다.

실시예 4. SISRA1 의 곤충 저항성 증가 확인

hl 돌연변이가 식물과 해충 사이의 상호작용에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, WT, hl, SRA1-형질전환 식물에 담배박각시나방(M. sexta) 유충을 키워 곤충의 행동과 처음으로 식물을 먹는데 걸리는 시간을 관찰했다. WT 식물을 대상으로 한 곤충에 비해, hl 식물에 있는 곤충은 잎의 표면을 처음으로 먹는 시간이 현저하게 줄었다(도 7A). 상기 유충 행동의 관찰을 통해서 타입 I 모용의 존재가 잎의 표면에 접근하려는 유충을 처음에 막는 것이라 예상한다. SRA1-2과 SRA1-10 형질전환체의 잎에서의 담배박각시나방 유충의 섭식 시간이 hl 잎을 섭식하는 시간보다 현저하게 길었으며, WT 식물에 대한 곤충의 행동과 차이가 없었다. 또한, 각 식물체에서 8일간 곤충을 키운 후 무게를 재본 결과, hl 식물에서 자란 유충은 WT 혹은 형질전환 식물체보다 현저하게 무거웠다(도 7B). 이러한 결과는 SRA1이 해충에 대한 식물의 방어를 향상시키는 역할을 한다는 것을 의미한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method for increasing pest resistance in plant using SRA1 gene from Solanum lycopersicum and the plant thereof <130> PN17129 <160> 45 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3864 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 atggcggttc cgattgaaga agccatagct gcactatcca cattttctct agaggatgat 60 caacctgaag tacaaggccc agggttttgg gtttcagctg aaggaggtgc aactattagt 120 ccaatcgagt acagtgatgt ggctgcatat aggttgtcct tatcagaaga tactaaagct 180 attaaccagc tgaacacact tatacaagag gggaaggaaa tgggttccgt gctctacaca 240 tatagaagtt gtgttaaagc acttcctcag cttccagatt ctatgaagca aagtcaggcc 300 gacctgtatc ttgaaactta ccaagttttg gatttggaaa tgagccgtct acgtgaaatt 360 cagagatggc aagcatccgc agcatctaag ctggcagctg acatgcaacg tttttccaga 420 cctgagcgtc gtattaatgg tcccacagta actcatcttt ggtccatgct gaaattactt 480 gatgttctga tccagcttga tcatcttaaa aatgcaaaag ctagtatacc taatgacttc 540 tcttggtaca aaaggacatt cacacaagtt agtgtgcagt ggcaagatac agattcaatg 600 agagaggagt tggatgattt acagatcttc ttgagcacga ggtgggctat tttgttgaac 660 ttgcatgttg agatgttccg tgtcaacaat gttgaagaca ttcttcaagt tctaattgtt 720 ttcatagtcg agtctttgga gttgaatttt gcacttttat ttccggagag gcacacactt 780 cttcgtgttt tgcctgtcct tgttgtccta gcggcatcat cagagaaaga tagtgaatca 840 ttgtacaaaa gggtgaaaat caacagactt atgaacatat ttaagaatga tcctgtggta 900 cctgctttcc cagatcttca cctgtctcct gctgcgattt taaaagagtt atcgacatac 960 ttccctaaat tttctgcaca aactcggctt ctcactcttc cagcacctca tgagctgcca 1020 ctgcgtgagg cacaagatta tcagaggcaa tatctgattg tcaaccatat tggggcgatc 1080 cgtgctgagc atgatgactt cactgttcgt tttgcttcag ccatgagtca gcttgtcttg 1140 ctaaaatcaa ttgacggtgt ggatgtagag tgggttaagg aagtcaaagg aaatacttat 1200 gacatggttg ttgaaggttt tcaactctta agcagatgga ctgcacgagt ttgggaacag 1260 tgtgcttgga agttttctcg cccgtgcaag gatcctgttc caatggagtc acatgacatg 1320 cctgcatcat tttccgacta tgaaaaggtg gtacggtaca attataatgc tgaagaaagg 1380 aaggctctgg ttgaacttgt aagctatatc aagagtattg ggtcaatgat gcaaaaggtg 1440 gacacttcag tgaccgatgc cttgtgggag acaatccatg cagaggtgca agattttgtt 1500 cagaatacgc ttgcgacaat gttgcggact accttccgga aaaagaaaga cctttctagg 1560 attctttctg atatgagaac actttcagca gattggatgg caaatgctag taagccagag 1620 actgaaatgc agtcatatcc gcatagtggt gaagaaagca gagggaccct attttatcca 1680 aggccagtag caccaacatc tgctcaggtc cattgcttgc agttcctcat atatgaagtg 1740 gtttccggtg gcaacatgcg gaagcctggt ggtatttttg gaaatagtgg ttctgaaata 1800 cctatcaatg acttgaaaca gctggagaca ttcttctaca agcttggttt tttcttacat 1860 gtattagact acacagctac cctaggaact ttgaccgatc ttggtttctt atggtttaga 1920 gaattctatc tggagtcttc tcgtgttata cagttcccca ttgaatgctc ccttccatgg 1980 atgctggtgg atcatgtgat cgaatctcca attattggcc ttctggagag tgccttgatg 2040 tcatttgaca tctataatga tgctgctcag caagcattag tgatcctcaa gcaacgtttt 2100 ttatacgatg aaatcgaagc tgaggtagac aattgttttg atatatttgt cttgaagttg 2160 tgtgagacta tttttactta ctacaaaagt tgggcagcca gtgagctact tgatccatca 2220 tttctctttg ccatagacat tggggaaaag tttgcagtcc agccaatgag attcgtagct 2280 cttttaaaaa cgactagagt gaagcttcta ggtcggacca tcaacttgag aagtttgatt 2340 gctgatagga tgaacaaaat gttcagggat aatcttgaat ttctgtttga tcgctttgaa 2400 tcacaggatt tatgtgctat tgtggagctg gaaatgttgc tggacatctt gcaacttact 2460 catgaattac tctcgaaaga ccttacaata gattctttca atcttatgtt gaacgagatg 2520 caggagaatg tatcccttgt ttcttattct agtcgtcttg cttcgcagat ttggacagaa 2580 atgcaaaatg acttcttgcc aaatttcatc ctctgcaata ctactcagcg ttttgtccga 2640 tcagcacgag tgccccctgt tcctgtccag aagccttcgg ttccttatgc gaagccaaat 2700 ttctactgtg gaactcctga tctgaattct gcttaccaga gctttgctcg attgtattgt 2760 gggttttttg gtgtgcctca catgttttct ctagtcaagc tcttgggatc taggtcactt 2820 ccttggctta tccgagccct tttggataat atatcgaaca agattactac cgttgaaccg 2880 atgattactg gactgcaaga agctttgccg aagtctatag ggttacttcc atttgatggt 2940 ggtatatcag ggtgcatgag gcttgccaag gagcatctta gctgctggca ttcaaagtct 3000 gaactcaaag ctgaagtcct ttgtggaatc aaggagattg gtagcatatt gtactggatg 3060 ggacttcttg atattgtatt gagagaagtc gatacccgcc agtttatgca aactgctcct 3120 tggttgggat tgattcctgg tgctgatggg caaatattgc actctcaaga aggaggagat 3180 agccctatgg tcactctgtt taaatctgca actactgcaa ccatgtccaa ccctaactgc 3240 acaaatccaa catcatttca cacaatatcg agacaagcag aagctgccga tttgttgtac 3300 aaagccaata ttaatactgg aagtgtgttg gaatatgccc ttgcttttac aagtgctgca 3360 ttagataaat actgcagtaa atggagtgca gccccaaaga cgggttttat tgatattact 3420 acttcaaagg acttctaccg gattttcagt ggacttcaaa tcgaatacct ggaggaatct 3480 attcagctac aatcaaacac ttacgaaatg ttgggcgatt cagttgcctg gggtggatgt 3540 acaataatct acctgcttgg gcaacaattg cattttgaat tgtttgattt ttcccatcaa 3600 gtcctcaatg ttgctgaggt ggagtctgta gcaatatcgc caacacagaa gaatcctaat 3660 ttcctccagg gtattgaagg tttgctagaa gctatgaaga aagcaaggag gctaaataat 3720 catgtgtttt caatgttaaa agcacgctgt ccattggaag ataaacaggc ttgtgccatc 3780 aaacaaagcg gtgcaccttt gcatcggata aaatttgaga atactgtgtc cgcttttgaa 3840 acgttgccac agaaaggtgc ctga 3864 <210> 2 <211> 1287 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 2 Met Ala Val Pro Ile Glu Glu Ala Ile Ala Ala Leu Ser Thr Phe Ser 1 5 10 15 Leu Glu Asp Asp Gln Pro Glu Val Gln Gly Pro Gly Phe Trp Val Ser 20 25 30 Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ile Ser Pro Ile Glu Tyr Ser Asp Val Ala 35 40 45 Ala Tyr Arg Leu Ser Leu Ser Glu Asp Thr Lys Ala Ile Asn Gln Leu 50 55 60 Asn Thr Leu Ile Gln Glu Gly Lys Glu Met Gly Ser Val Leu Tyr Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Ser Cys Val Lys Ala Leu Pro Gln Leu Pro Asp Ser Met Lys 85 90 95 Gln Ser Gln Ala Asp Leu Tyr Leu Glu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Leu 100 105 110 Glu Met Ser Arg Leu Arg Glu Ile Gln Arg Trp Gln Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Ser Lys Leu Ala Ala Asp Met Gln Arg Phe Ser Arg Pro Glu Arg Arg 130 135 140 Ile Asn Gly Pro Thr Val Thr His Leu Trp Ser Met Leu Lys Leu Leu 145 150 155 160 Asp Val Leu Ile Gln Leu Asp His Leu Lys Asn Ala Lys Ala Ser Ile 165 170 175 Pro Asn Asp Phe Ser Trp Tyr Lys Arg Thr Phe Thr Gln Val Ser Val 180 185 190 Gln Trp Gln Asp Thr Asp Ser Met Arg Glu Glu Leu Asp Asp Leu Gln 195 200 205 Ile Phe Leu Ser Thr Arg Trp Ala Ile Leu Leu Asn Leu His Val Glu 210 215 220 Met Phe Arg Val Asn Asn Val Glu Asp Ile Leu Gln Val Leu Ile Val 225 230 235 240 Phe Ile Val Glu Ser Leu Glu Leu Asn Phe Ala Leu Leu Phe Pro Glu 245 250 255 Arg His Thr Leu Leu Arg Val Leu Pro Val Leu Val Val Leu Ala Ala 260 265 270 Ser Ser Glu Lys Asp Ser Glu Ser Leu Tyr Lys Arg Val Lys Ile Asn 275 280 285 Arg Leu Met Asn Ile Phe Lys Asn Asp Pro Val Val Pro Ala Phe Pro 290 295 300 Asp Leu His Leu Ser Pro Ala Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Phe Pro Lys Phe Ser Ala Gln Thr Arg Leu Leu Thr Leu Pro Ala Pro 325 330 335 His Glu Leu Pro Leu Arg Glu Ala Gln Asp Tyr Gln Arg Gln Tyr Leu 340 345 350 Ile Val Asn His Ile Gly Ala Ile Arg Ala Glu His Asp Asp Phe Thr 355 360 365 Val Arg Phe Ala Ser Ala Met Ser Gln Leu Val Leu Leu Lys Ser Ile 370 375 380 Asp Gly Val Asp Val Glu Trp Val Lys Glu Val Lys Gly Asn Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Met Val Val Glu Gly Phe Gln Leu Leu Ser Arg Trp Thr Ala Arg 405 410 415 Val Trp Glu Gln Cys Ala Trp Lys Phe Ser Arg Pro Cys Lys Asp Pro 420 425 430 Val Pro Met Glu Ser His Asp Met Pro Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Glu 435 440 445 Lys Val Val Arg Tyr Asn Tyr Asn Ala Glu Glu Arg Lys Ala Leu Val 450 455 460 Glu Leu Val Ser Tyr Ile Lys Ser Ile Gly Ser Met Met Gln Lys Val 465 470 475 480 Asp Thr Ser Val Thr Asp Ala Leu Trp Glu Thr Ile His Ala Glu Val 485 490 495 Gln Asp Phe Val Gln Asn Thr Leu Ala Thr Met Leu Arg Thr Thr Phe 500 505 510 Arg Lys Lys Lys Asp Leu Ser Arg Ile Leu Ser Asp Met Arg Thr Leu 515 520 525 Ser Ala Asp Trp Met Ala Asn Ala Ser Lys Pro Glu Thr Glu Met Gln 530 535 540 Ser Tyr Pro His Ser Gly Glu Glu Ser Arg Gly Thr Leu Phe Tyr Pro 545 550 555 560 Arg Pro Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Val His Cys Leu Gln Phe Leu 565 570 575 Ile Tyr Glu Val Val Ser Gly Gly Asn Met Arg Lys Pro Gly Gly Ile 580 585 590 Phe Gly Asn Ser Gly Ser Glu Ile Pro Ile Asn Asp Leu Lys Gln Leu 595 600 605 Glu Thr Phe Phe Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Leu His Val Leu Asp Tyr 610 615 620 Thr Ala Thr Leu Gly Thr Leu Thr Asp Leu Gly Phe Leu Trp Phe Arg 625 630 635 640 Glu Phe Tyr Leu Glu Ser Ser Arg Val Ile Gln Phe Pro Ile Glu Cys 645 650 655 Ser Leu Pro Trp Met Leu Val Asp His Val Ile Glu Ser Pro Ile Ile 660 665 670 Gly Leu Leu Glu Ser Ala Leu Met Ser Phe Asp Ile Tyr Asn Asp Ala 675 680 685 Ala Gln Gln Ala Leu Val Ile Leu Lys Gln Arg Phe Leu Tyr Asp Glu 690 695 700 Ile Glu Ala Glu Val Asp Asn Cys Phe Asp Ile Phe Val Leu Lys Leu 705 710 715 720 Cys Glu Thr Ile Phe Thr Tyr Tyr Lys Ser Trp Ala Ala Ser Glu Leu 725 730 735 Leu Asp Pro Ser Phe Leu Phe Ala Ile Asp Ile Gly Glu Lys Phe Ala 740 745 750 Val Gln Pro Met Arg Phe Val Ala Leu Leu Lys Thr Thr Arg Val Lys 755 760 765 Leu Leu Gly Arg Thr Ile Asn Leu Arg Ser Leu Ile Ala Asp Arg Met 770 775 780 Asn Lys Met Phe Arg Asp Asn Leu Glu Phe Leu Phe Asp Arg Phe Glu 785 790 795 800 Ser Gln Asp Leu Cys Ala Ile Val Glu Leu Glu Met Leu Leu Asp Ile 805 810 815 Leu Gln Leu Thr His Glu Leu Leu Ser Lys Asp Leu Thr Ile Asp Ser 820 825 830 Phe Asn Leu Met Leu Asn Glu Met Gln Glu Asn Val Ser Leu Val Ser 835 840 845 Tyr Ser Ser Arg Leu Ala Ser Gln Ile Trp Thr Glu Met Gln Asn Asp 850 855 860 Phe Leu Pro Asn Phe Ile Leu Cys Asn Thr Thr Gln Arg Phe Val Arg 865 870 875 880 Ser Ala Arg Val Pro Pro Val Pro Val Gln Lys Pro Ser Val Pro Tyr 885 890 895 Ala Lys Pro Asn Phe Tyr Cys Gly Thr Pro Asp Leu Asn Ser Ala Tyr 900 905 910 Gln Ser Phe Ala Arg Leu Tyr Cys Gly Phe Phe Gly Val Pro His Met 915 920 925 Phe Ser Leu Val Lys Leu Leu Gly Ser Arg Ser Leu Pro Trp Leu Ile 930 935 940 Arg Ala Leu Leu Asp Asn Ile Ser Asn Lys Ile Thr Thr Val Glu Pro 945 950 955 960 Met Ile Thr Gly Leu Gln Glu Ala Leu Pro Lys Ser Ile Gly Leu Leu 965 970 975 Pro Phe Asp Gly Gly Ile Ser Gly Cys Met Arg Leu Ala Lys Glu His 980 985 990 Leu Ser Cys Trp His Ser Lys Ser Glu Leu Lys Ala Glu Val Leu Cys 995 1000 1005 Gly Ile Lys Glu Ile Gly Ser Ile Leu Tyr Trp Met Gly Leu Leu Asp 1010 1015 1020 Ile Val Leu Arg Glu Val Asp Thr Arg Gln Phe Met Gln Thr Ala Pro 1025 1030 1035 1040 Trp Leu Gly Leu Ile Pro Gly Ala Asp Gly Gln Ile Leu His Ser Gln 1045 1050 1055 Glu Gly Gly Asp Ser Pro Met Val Thr Leu Phe Lys Ser Ala Thr Thr 1060 1065 1070 Ala Thr Met Ser Asn Pro Asn Cys Thr Asn Pro Thr Ser Phe His Thr 1075 1080 1085 Ile Ser Arg Gln Ala Glu Ala Ala Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Asn Ile 1090 1095 1100 Asn Thr Gly Ser Val Leu Glu Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Ala Ala 1105 1110 1115 1120 Leu Asp Lys Tyr Cys Ser Lys Trp Ser Ala Ala Pro Lys Thr Gly Phe 1125 1130 1135 Ile Asp Ile Thr Thr Ser Lys Asp Phe Tyr Arg Ile Phe Ser Gly Leu 1140 1145 1150 Gln Ile Glu Tyr Leu Glu Glu Ser Ile Gln Leu Gln Ser Asn Thr Tyr 1155 1160 1165 Glu Met Leu Gly Asp Ser Val Ala Trp Gly Gly Cys Thr Ile Ile Tyr 1170 1175 1180 Leu Leu Gly Gln Gln Leu His Phe Glu Leu Phe Asp Phe Ser His Gln 1185 1190 1195 1200 Val Leu Asn Val Ala Glu Val Glu Ser Val Ala Ile Ser Pro Thr Gln 1205 1210 1215 Lys Asn Pro Asn Phe Leu Gln Gly Ile Glu Gly Leu Leu Glu Ala Met 1220 1225 1230 Lys Lys Ala Arg Arg Leu Asn Asn His Val Phe Ser Met Leu Lys Ala 1235 1240 1245 Arg Cys Pro Leu Glu Asp Lys Gln Ala Cys Ala Ile Lys Gln Ser Gly 1250 1255 1260 Ala Pro Leu His Arg Ile Lys Phe Glu Asn Thr Val Ser Ala Phe Glu 1265 1270 1275 1280 Thr Leu Pro Gln Lys Gly Ala 1285 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcaaatggcg gttccgattg aagaag 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agcaggcctc aggcaccttt ctgtggc 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaaagacggc aactttctgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagcctctgg tggcatagtc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctagtaaaag tgaaagcacg 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccaccacata ttgtaatcat tttc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccatgttttt gccactgtcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caaggatgga aaagttgagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtccactaga ctagttaggg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatagcaggt caggtctagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gagtatagca caaatgatgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agataataag gacattttcc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 actgtacttt tgagacactg g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tatgtgtgtg acttgtgaga g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 taagcggaga agggtagagg 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtatgaatat tgtacatatg ag 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgattatgat tcttctagtc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gatcaagaat gtttgtctgc c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caattccatg tactccctgc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 attaatatgc aaatgtaacg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tagtcgtctc aatagaaagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctggtaaaac agataagttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgtgagaatc ttggtttacc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 catataggaa atcagtgaag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gataagaaag ttgtcaatgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttgcattagt aagatttagc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cccttgttta ttgttcttgc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tttagagtga gaagctcagg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 attgaagtaa attaacttgg 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 catgtctgaa ataatattga cg 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tcagctttct tcttgtatcg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gattcttaca gatgcagttc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atgtgttcca ctctatttgc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 acgacaaaag tgagtcgagg 20 <210> 37 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gctcgcgagc gcgtttaaac gcgcacgcgt tttttttttt ttttttt 47 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 agattactac cgttgaaccg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gctcgcgagc gcgtttaaac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cgttgaaccg atgattactg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gcgtttaaac gcgcacgcgt 20 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cgactagtat ggcggttccg attgaa 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ttctcgagtc aggcaccttt ctgtgg 26 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tgccatcatt gcgataaagg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cacggaacat ctcaacatgc 20

Claims

토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 SlSRA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 SlSRA1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 비형질전환체에 비해 식물의 해충 저항성을 증대시키는 방법.
토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체의 제조방법.
제3항의 방법에 의해 제조된 해충 저항성이 증대된 형질전환 식물체.
제4항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 SlSRA1(Solanum lycopersicum SRA1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물의 해충 저항성 증대용 조성물.