KR20170136535A

KR20170136535A - 조혈성 및 림프성 악성종양에서 cd99를 표적화하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170136535A
Application number: KR1020177029405A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 와이. 팍; 스테픈 시우-사 청; 몬트레 타바콜리
Original assignee: 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2017-12-11
Also published as: CA2980038A1; JP2018511311A; EP3271399A4; WO2016149682A2; BR112017019856A2; MX2017011882A; AU2016232719A1; WO2016149682A3; CN107614531A; EP3271399A2

Abstract

본 발명은 (a) CD99의 세포외 도메인에 결합하고, (b) 골수성 또는 림프성 악성 세포-표면 발현 CD99에 결찰되며, (c) 골수성 또는 림프성 악성 세포-표면 발현 CD99의 캡핑/클러스터링/응집을 촉진시키고, (d) 항체-결찰 CD99+ 골수성 또는 림프성 악성 세포에서의 세포사멸 및 이의 결과적 세포독성을 유도하는 1종 이상의 항체를 포함하는 혈액학적 병태, 상세하게는 CD99+ 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS) 및 T-세포 종양을 포함한 조혈성 및 골수성 악성 종양의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법은 환자로부터의 조직 샘플 또는 골수성 림프성 악성 세포에서 CD99의 증가된 발현을 검출함으로써 항-CD99 항체를 이용한 치료에 민감한 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자를 확인하는 방법 및 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 단독으로, 또는 1종 이상의 추가 성분, 예컨데 이동제(mobilizing agent), 통과이동 차단제, 및 화학요법제, 예컨데 다우노루비신, 아이다루비신(idarubicin), 시타라빈, 5-아자시티딘(azacytidine), 및 데시타빈과 조합하여 투여함으로써 증가된 CD99 유전자 및/또는 세포-표면 단백질 발현을 나타내는 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.

Description

조혈성 및 림프성 악성종양에서 CD99를 표적화하는 조성물 및 방법

본 발명은 일반적으로 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)(MDS) 및 악성 T-세포 종양(neoplasm)과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양의 치료에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 (i) 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 T-세포 종양과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양의 치료를 위한 항-CD99 항체, 및 1종 이상의 항-CD99 항체(들)를 포함하는 조성물; (ii) 조혈성 및 림프성 악성종양의 치료에 적합한 항-CD99 항체를 생성 및 확인하는 방법; (iii) 항-CD99 항체 및/또는 1종 이상의 항-CD99 항체(들)를 포함하는 조성물을 이용한 치료에 대해 민감한 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및/또는 T-세포 림프종과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양을 가진 환자를 확인하는 방법; (iv) 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군 및/또는 T-세포 림프종과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양과 연관된 CD99⁺ 세포, 예컨데 CD99⁺ 백혈병 줄기 세포(leukemic stem cell) 및/또는 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)에서 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 방법; 및 (v) CD99⁺ 급성 골수성 백혈병, CD99⁺ 골수이형성 증후군 및/또는 CD99⁺ T-세포 림프종의 치료 방법에 관한 것이다.

CD99는 T 세포 성숙 및 백혈구의 내피통과 이동(transendothelial migration)을 조절하는 32 kDa 막관통 단백질이다. CD99는 또한 T-세포 급성 림프모구 림프종/백혈병(T-cell acute lymphoblastic lymphoma/leukemia)(T-ALL), 유잉육종(Ewing sarcoma), 및 신경내분비 종양의 진단을 돕는 바이오마커로서 사용된다. 그러나, 다양한 조혈성 및 림프성 악성종양에서 CD99가 생존가능한 치료 표적인지 여부는 불명확한채로 남아있다.

T 세포 종양, 예컨데 T-급성 림프모구(T-acute lymphoblastic)(T-LL)/림프성 백혈병(lymphocytic leukemia)(T-ALL) 및 역형성 큰 세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)(ALCL)은 혈구의 T 세포계(lineage) 암이다. T-LL 및 T-ALL은 골수에서 축적되고 정상 혈구의 생성을 저해하는 비정상 미성숙 T-세포 전구체(모구(blast))의 급속한 성장이 특징이며, 골수에서 20-25%의 모구의 컷-오프(cut-off)로 임의로 분리된다. T-ALL은 소아과 및 성인 코호트(cohort)에서 ALL의 ~15% 및 25%로 집계되는 한편, T-LL은 성인에서 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(NHL) 사례의 ~2%를 나타낸다. 이와 반대로, ALCL은 NHL의 희귀한 유형이지만(사례 중 ~3%), 보다 일반적인 유형의 T-세포 림프종 중 1종을 나타낸다.

T-LL/T-ALL의 임상 증상 및 징후는 정상 골수가 적혈구, 혈소판, 및 정상 백혈구에서의 하락(혈구감소증)을 야기하는 백혈병 세포로 대체됨으로써 야기된다. 이러한 증상 및 징후는 피로, 숨가쁨, 잦은 멍 및 출혈, 및 감염 위험 증가, 비장종대 또는 간비대를 포함하고 조직의 백혈병 침투에 의해 야기되는 다른 징후가 또한 존재할 수 있다. 몇몇의 위험 인자, 염색체 이상, 및 다른 체세포 돌연변이가 확인되었으나, 구체적 원인은 명확하지 않다. 급성 백혈병과 같이, T-ALL은 급속도로 진행되며, 치료되지 않는 경우 전형적으로 수주 또는 수개월 이내에 치명적일 수 있다.

급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) 또는 급성 비림프구성 백혈병(acute nonlymphocytic leukemia)(ANLL)으로도 알려진 급성 골수성 백혈병(AML)은 골수에서 축적되고 정상 혈구의 생성을 저해하는 비정상 백혈구성 급속한 성장이 특징인 혈구의 골수주(myeloid line)의 암이다. AML은 성인에게 영향을 미치는 가장 일반적인 급성 백혈병이며, 이의 발병률은 연령대에 따라 증가한다. AML은 미국에서 암 사망의 약 1.2%로 집계되는 비교적 희귀한 질환이지만, 그 발병률은 인구 연령대를 따라 증가한다.

AML의 임상 증상 및 징후는 정상 골수가 적혈구, 혈소판, 및 정상 백혈구에서의 하락(혈구감소증)을 야기하는 백혈병 세포로 대체됨으로써 야기된다. 이러한 증상 및 징후는 피로, 숨가쁨, 잦은 멍 및 출혈, 및 감염 위험 증가, 비장종대 또는 간비대를 포함하고 조직의 백혈병 침투에 의해 야기되는 다른 징후가 또한 존재할 수 있다. 몇몇의 위험 인자, 염색체 이상, 및 다른 체세포 돌연변이가 확인되었으나, 구체적 원인은 명확하지 않다. 급성 백혈병과 같이, AML은 급속도로 진행되며, 치료되지 않는 경우 전형적으로 수주 또는 수개월 이내에 치명적일 수 있다.

AML은 몇몇의 아형(subtype)을 갖는다; 아형 사이에서 치료 및 예후는 상이하다. 아형에 따라 5년 생존은 15-70%로 다양하며, 재발률은 33-78%로 다양하다. AML은 처음에는 차도를 유도할 목적의 화학요법으로 치료된다; 환자는 추가 화학요법 또는 동종 조혈 줄기 세포 이식을 받는 것으로 넘어갈 수 있다.

급성 골수성 백혈병을 가진 환자 치료는 20년에 걸쳐 변하지 않았으며, AML 생존율은 성인에 대해 50% 미만 및 아동에 대해 약 60-70%로 상당히 낮게 머물러 있다. 환자들은 그들의 질환이 치료된 경우라도 종래의 화학요법 처방 및 골수 이식으로 인한 질병률도 상당히 존재한다. 더욱 효과적이고, 독성이 덜한 치료가 명확히 필요하다.

골수이형성 증후군(MDS, 이전엔 전백혈병으로 알려짐)은 혈구의 골수 세포계의 비효과적 생성을 포함하는 혈액학적(혈액 관련) 의학적 상태의 다양한 집합이다. MDS에 걸린 환자는 심각한 빈혈이 발생할 수 있어, 수혈이 필요할 수 있다. 일부 경우에, 질환이 악화되는 경우 환자는 진행성 골수 장애에 의해 야기된 혈구감소증(낮은 혈구 수치)을 발병한다.

MDS의 예후는 유형 및 심각성에 따라 달라질 수 있다. 많은 사람이 MDS를 갖고 정상 수명을 산다. 종종, 사람들은 증상이 없어, 정기적 혈액 검사에서 나타날때까지 조차 자신이 MDS에 걸린 것을 알지 못한다.

골수 이형성 증후군은 골수의 조혈 줄기 세포에서 발생하는 모든 장애이다. MDS인 경우에는, 조혈작용(혈액 생성)에 장애가 있고 효과적이지 않다. 혈액-형성 세포의 수 및 질이 비가역적으로 감소하며, 또한 혈액 형성을 손상시킨다.

골수이형성 증후군(MDS)은 비효과적 조혈작용으로 인한 말초 혈구감소증이 특징인 클론성 혈액 장애의 관련 그룹을 나타낸다. 상기 증후군은 신규(de novo) 발생하거나, 다른 질환에 대한 화학요법 및/또는 방사선 요법을 이용한 치료 이후에 이차적으로 발생할 수 있다. 이차성 골수이형성증은 일반적으로 신규 골수이형성증에 비해 좋지 않은 예후를 갖는다. MDS는 진단으로부터 다양한 간격 이후에 환자의 약 30%에서 급성 골수성 백혈병으로 변형된다.

MDS는 2살의 어린 환자가 보고되기는 하였으나, 대부분 고령 환자에서 발생한다. 빈혈, 출혈, 잦은 멍, 및 피로가 일반적인 초기 소견이다. 중복되는 골수증식성 질환과 관련하여 비장종대 및 간비종대(hepatosplenomegaly)가 가끔 나타날 수 있다. 약 50%의 환자가 검출 가능한 세포유전적 이상을 갖고, 가장 일반적으로는 염색체 5 또는 7, 또는 삼중 염색체 8의 전부 또는 일부의 결실을 갖는다. 골수는 대개 진단시 세포과다이지만, 15% 내지 20%의 환자가 발육부전 골수로 나타난다. 발육부전 골수형성이상 환자는 극심한 혈구감소증을 갖는 경향이 있으며, 면역억제 요법에 대해 보다 자주 반응할 수 있다.

AML 및 MDS는 둘 다 자가-재생 줄기 세포에 의해 개시 및 지속된다. Lapidot et al., Nature 367:645-648 (1994); Bonnet and Dick, Nat. Med. 3:730-737 (1997); Nilsson et al., Blood 100:259-267 (2002); Nilsson et al., Blood 110:3005-3014 (2007); Tehranchi et al., New Engl . J. Med . 363:1025-1037 (2010); Nilsson et al., Blood 96:2012-2021 (2000); 및 Pang et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 110:3011-3016 (2013). 이러한 질환을 개시하는 세포는 정상적인 조혈 줄기 및 전구체(hematopoietic stem and progenitor)(HSPC)의 면역 표현형 특징을 공유하지만, 세포 표면 단백질의 비정상적 발현이 질환 줄기 세포를 예비 단리시킬 수 있으며, 매력적인 치료 표적을 나타낼 수 있다. AML 백혈병 줄기 세포(leukemic stem cell)(LSC) 및 MDS 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)(HSC)에서 높게 발현되는 세포 표면 단백질로서 CD99의 확인이 기재되어 있다. 높은 CD99 발현은 AML 이종이식에서 질환 공격성과 연관이 있다. 이와 반대로, 높은 CD99 전사 발현을 가진 환자는 개선된 예후를 가지며, 이는 백혈병 세포 내피통과 이동 및 말초혈액(peripheral blood)(PB)으로의 이동 향상으로 부여된 증가된 화학민감성에 기인한 것일 수 있다. 최종적으로, CD99의 단일클론 항체(monoclonal antibody)(mAb)를 기본으로 한 표적화는 정상적인 HSC 및 내피 세포의 상대적 보전(sparing)과 함께, 면역 이팩터 세포(effector cell) 또는 보체의 부재시 직접 세포독성을 유도한다. 이와 함께, 이러한 데이터는 AML 및 MDS 줄기 세포에서 우선적으로 발현되는 세포 표면 단백질로서, 백혈병 모구의 내피통과 이동 및 이동의 매개체로서, 및 mAb에 의한 직접 표적화에 대한 유망한 치료 표적으로서 CD99를 정립시킨다.

본 발명은 혈액학적 병태, 상세하게는 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 및 T-세포 림프종과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양 치료용 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, AML, MDS, 및 T-세포 악성종양과 같은 조혈성 및 림프성 악성종양은 세포 CD99의 응집을 촉진하는 1종 이상의 화합물(들)을 이용해 효과적으로 치료될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 각각의 항-CD99 항체는 (i) CD99의 세포외 도메인(extracellular domain)에 결합하고; (ii)CD99의 응집, 클러스터링(clustering), 및/또는 캡핑(capping)을 촉진하며; (iii) AML 및/또는 MDS 및/또는 항-CD99 항체가 결합하는 악성 T-세포 종양 세포에서의 세포사(cell death)를 유도한다. 또한, 본원에서 입증되는 바와 같이, 세포사의 유도는 결합 및 응집, 클러스터링 또는 캡핑 중 1종 이상의 조합과 매우 밀접하게 관련되어, 이후 세포사가 발생할 것으로 예측할 수 있다.

일부 실시양태에서, (i) T 세포 종양의 치료를 위한 항-CD99 항체, 및 1종 이상의 항-CD99 항체(들)를 포함하는 조성물; (ii) T 세포 종양의 치료에 적합한 항-CD99 항체를 생성 및 확인하는 방법; (iii) 항-CD99 항체 및/또는 1종 이상의 항-CD99 항체(들)를 포함하는 조성물을 이용한 치료에 대해 민감한 T 세포 종양을 가진 환자를 확인하는 방법; (iv) CD99⁺ 백혈병 줄기 세포 및/또는 조혈 줄기 세포와 같은 T 세포 종양과 연관된 CD99⁺ 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법; 및 (v) CD99⁺ T 세포 종양의 치료 방법의 제공을 포함하여 T 세포 종양의 치료 방법이 개시된다.

일 실시양태에서, 치료가 필요한 환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양을 치료하는 방법으로서, CD99의 세포외 도메인을 인식하거나 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 유효량의 항체를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일 실시양태에서, 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자는 CD99+ 골수성 또는 림프성 악성 세포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 악성 세포는 성숙한 T-세포 림프종 세포, T-급성 림프모구 백혈병(T-LL), T-급성 림프모구 백혈병(T-ALL) 세포, 또는 역형성 큰 세포 림프종(ALCL) 세포로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 악성 세포는 원발성 AML 모구 세포(blast cell), 백혈병 줄기 세포(LSC), 원발성 MDS 모구 세포, 및 MDS 조혈 줄기 세포(HSC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 악성 세포는 T 림프모구 림프종, 혈관면역모구 T-세포 림프종, 또는 역형성 큰 세포 림프종(ALCL)에 시달리는 환자로부터 유래된 세포이다.

일 실시양태에서, 치료가 필요한 환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 악성 종양은 T 림프모구 림프종, 혈관면역모구 T-세포 림프종, 또는 역형성 큰 세포 림프종(ALCL), NK/T 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, ALCL은 역형성 림프종 키나아제(anaplastic lymphoma kinase)(ALK) 양성 역형성 큰 세포 림프종(ALCL) 또는 ALK 음성 역형성 큰 세포 림프종이다. 일 실시양태에서, 악성 종양은 비-호지킨 림프종이다. 일 실시양태에서, 상기 악성종양은 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 본 발명은 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군의 치료를 위한 항-CD99 항체, 및 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군의 치료에 적합한 항-CD99 항체를 생성 및 확인하는 방법을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 항-CD99 항체 및/또는 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 이용한 치료에 대해 민감한, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 또는 T-세포 악성종양을 포함한 조혈성 또는 림프성 악성종양을 가진 환자를 확인하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 CD99⁺ 백혈병 줄기 세포 및/또는 조혈 줄기 세포와 같은 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군을 포함한 조혈성 또는 림프성 악성종양과 연관된 CD99⁺ 세포에서 세포사를 유도하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CD99의 증가된 수준을 나타내는 급성 골수성 백혈병 및/또는 CD99⁺ 골수이형성 증후군과 같은 CD99⁺ 조혈성 또는 골수성 악성종양의 치료 방법을 제공한다.

도 1a는 20 μg/ml의 아이소타입(isotype) 컨트롤 항체의 존재시 MDS92 세포 수와 비교하여 72시간에서 MDS92 세포 수(p<0.001)의 128배 감소로 입증된 바와 같이, MDS 세포주 MDS92(Tohyama et al., Br. J. Haematol. 91:795 (1995)) 상의 CD99와 12E7으로 표시한 20 μg/ml의 항-CD99 항체(Levy et al., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A . 76:6552 (1979))의 결찰(ligation)은 상기 MDS92에 대해 세포독성임을 나타내는 막대 그래프이다. 도 1b는 7-AAD 대 아넥신(Annexin) V 형광 값의 플롯(plot)이며, 이는 이팩터 세포-독립적 세포사멸을 나타낸다(20 μg/ml의 아이소타입 컨트롤 항체의 존재하에서 72시간 배양한 이후 MDS92 세포의 세포사멸의 부재와 비교하여 CD99를 10 μg/ml의 12E7과 72시간 결찰 이후 MDS92 세포의 아넥신 V 양성(p<0.001)의 77% 증가에 의해 입증된 바와 같음).
도 2a는 아이소타입 컨트롤 항체의 존재시 MDS92 세포 수와 비교하여 CD99와 항-CD99 항체 12E7의 결찰 이후 22시간에 MDS92 세포 수(p<0.001)의 시간-의존성 128배 감소에 의해 입증된 바와 같은 12E7-매개 세포독성을 나타내는 막대 그래프이다. 도 2b는 CD99와 항-CD99 항체 12E7의 결찰 이후 MDS92 세포 상의 CD99 세포-표면 발현의 시간-의존적 감소를 나타내는 로그 플롯이다. 도 2c는 골수 분화 마커 CD11b 대 CD14 형광 값의 플롯이며, 이는 CD99와 항-CD99 항체 12E7의 결찰 이후 양측 마커의 세포-표면 발현의 시간-의존적 감소를 나타낸다.
도 3은 원발성 CD34⁺ MDS 세포 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰이, 48시간 후 항체에 비해 세포 수의 10배 감소 및 아이소타입(IgG) 컨트롤 항체에 비해 세포 수의 8배 감소에 의해 입증된 바와 같이, 상기 원발성 MDS 세포에 대해 세포독성임을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4a는 고-발현 CD99⁺ AML 세포주 HL60 및 MOLM13 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰이, 72시간 후 아이소타입 컨트롤 항체에 비해 세포 수의 49배 감소(HL60; p<0.001) 및 70배 감소(MOLM13; p<0.001)에 의해 입증된 바와 같이, 세포독성임을 나타내는 막대 그래프이다. 도 4b는 아이소타입 컨트롤 항체와 비교하여 MOLM13 및 HL60 세포 상의 CD99 발현의 증가된 수준을 나타내는 로그 플롯이다.
도 5a는 CD99-발현 원발성 AML 1520 모구 세포 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰이, 48시간 후 세포 수의 57배 감소(p<0.001)에 의해 입증된 바와 같이, 세포독성임을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5b는 CD99-발현 원발성 AML 890 모구 세포 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰이, 48시간 후 세포수의 48배 감소(p<0.001)에 의해 입증된 바와 같이, 세포독성임을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5c는 80시간 후 HSC 세포 수의 1.4배 감소에 의해 입증된 바와 같이 12E7 항-CD99 항체가 정상 제대혈 HSC에 대해 보통의 세포독성 효과만을 갖는다는 것을 나타낸 막대 그래프이다.
도 6a-6f는 MDS 및 AML에서에서 CD99가 질환 형성 줄기 세포에 대해 과발현되었음을 나타낸다. 도 6a는 치료 관련 골수이형성 증후군(MDS) 환자(n=26)로부터의 조혈 줄기 세포(HSC, 세포계-음성(lineage-negative)(LN) CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-)의 유세포분석(flow-cytometric)(FC) 결과를 도시한 것이고, 정상 제대혈(cord blood)(CB) 대조군(n=27)은 CD99의 발현에 대한 유세포분석법(FC)에 의해 분석되었다. 도 6b는 분별되지 않은 AML 모구(CD19-CD3-CD45낮음SSC낮음)(n=63) 및 CD99 발현에 대해 FC에 의해 분석된 정상 CB 대조군의 플롯이다. 에러 바(error bar)는 ± SD를 나타낸다. *표는 p<0.0001(대응이 없는(unpaired) t-검사)을 나타낸다. 도 6c는 AML 시편 UPenn 1956으로부터의 CD3-CD19-CD34+CD38- 세포에서 유세포분석법에 의해 평가된 CD99 발현의 결과를 도시한 것이다. 면역표현형에 의해, "CD99가 적은" 세포는 대부분 HSC 및 다분화능 전구체(multipotent progenitor)(MPP, LN CD34+CD38-CD90-CD45RA-)와 유사한 반면, "CD99가 많은" 세포는 초회민감림프구 MPP(lymphoid-primed MPP)(LMPP, LN CD34+CD38-CD90-CD45RA+)와 유사하였다. 도 6d는 "CD99가 적은" 및 "CD99가 많은" 세포 집단이 FACS에 의해 >95% 순도까지 이중-분류되고, 메틸셀룰로스 에세이(assay)(1600개의 세포)에 놓였을 때, 14일차에 많은 수의 정상 골수 군집이 "CD99가 적은" 부분으로부터 형성되었으나, "CD99가 많은" 집단으로부터는 그렇지 않았음을 나타내는 막대 그래프이다. 도 6e는 "CD99가 적은" 세포로부터 유래된 콜로니가 UPenn 1956 AML 시편(B-벌크 AML 모구, 1-7-CD99가 적은 콜로니)에서 존재하는 FLT3-ITD 분자 이상이 부족함을 나타내는 아가로스 겔이다. 도 6f는 CD34+ 발현 AML(n=54)에서, CD99 발현은 LSC-농축된 CD34+CD38- 분획에서 높다는 것을 나타내는 그래프이다. 에러 바는 ± SD를 나타낸다. *는 p<0.0001(대응이 있는 t-검사)을 나타낸다.
도 7a-7e는 CD99가 생체내(in vivo) 질환 공격성을 촉진하지만 화학요법의 맥락에서 환자 결과를 개선함을 나타낸다. 도 7a는 2개의 shRNA를 가진 HL60 세포에서 CD99의 녹다운(knock down)(#61 및 #59에 대해 각각 2.3배 및 8.3배)이 시험관내(in vitro) 증식 키네틱을 유의미하게 변화시키지 않았음을 나타내는 그래프이다. 에러 바는 ± SD를 나타낸다. 도 7b는 벡터 대조군에 비해 shRNA#59로 형질도입된 MOLM13이 이식된 준 치사량으로 조사된 NSG 마우스의 전체 생존(overall survival)(OS)에 유의미한 개선이 있었음을 나타내는 생존 곡선이다(각각 58일 및 34일, p=0.0033, 그룹 당 n=5, 3개의 독립적인 이식 세트의 대표). 도 7c는 AML 환자의 말초혈액에서 모구 %로 측정된 바와 같은, CD99의 표면 발현이 유발 가능 질환(disease burden)과 관련 있음을 나타내는 그래프이다. 도 7d는 이스턴 코퍼레이티브 온콜로지 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group)(ECOG) 1900 임상 시험 상의 표준 또는 강화된 용량의 다우노루비신(Daunorubicin)(DNR)에 대해 무작위화된 358명의 AML 환자에서, 높은 CD99 전사 발현은 표준 용량의 DNR 그룹에서의 개선된 OS와 관련되어 있음을 나타내는 생존 곡선을 도시한 것이다(CD99가 많은 그룹 및 CD99가 적은 그룹 각각에 대해 25.0개월 및 10.4개월, p=0.000585, 좌측 상부 패널). DNR의 강화는 CD99 발현이 적은 그룹의 불리한 예후 도입을 완화시켰다(CD99가 많은 그룹에 대해 23.3개월과 비교하여 21.3개월까지, 좌착 하부 패널). 도 7e는 DNR 강화로부터의 구체적 이점으로 기재된 DNMT3a 또는 NPM1 돌연변이 또는 MLL-전위된 하위그룹에서, DNR 강화가 CD99가 적은 그룹에서 OS를 개선시켰으나(12.3개월 내지 20.2개월, p=0.007, 우측 상부 패널), CD99가 많은 그룹에서는 그렇지 않음(18.1개월 내지 17.5개월, p=0.701, 우측 하부 패널)을 나타내는 생존 곡선을 도시한 것이다. 모든 생존 비교에 대해 장기-순위 검사를 사용하였다.
도 8a-8d는 CD99가 백혈병 모구의 내피통과 이동 및 동원을 촉진하였음을 나타낸다. 도 8a는 테트라사이클린 유도성 렌티바이러스 벡터를 사용해 CD99를 과발현시키기 위해 형질도입되고 트랜스웰 삽입부(8 μM 공극 크기)에 합류하도록 성장한 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell)(HUVEC) 상에 파종된(seeded) HL60 세포의 막대 그래프이다. 이러한 데이터는 CD99 과발현이 4시간 및 28시간에 측정된 바와 같은 통과이동(transmigration) 효율의 유의미한 증가를 야기하였음을 나타낸다. 도 8b는 72시간 이후에, 잔류하고 있는 이동하지 않은 세포가 이동한 세포에 비해 유의미하게 낮은 수준의 CD99 발현을 가졌음을 나타내는 막대 그래프이다. 도 8c는 말초혈액(n=9)으로부터 수득된 원발성 AML 시편이 골수(n=31)에 비해 유의미하게 높은 수준의 CD99 발현을 나타냄을 나타내는 막대 그래프이다. 도 8d는 준 치사량으로 조사된 10마리의 NSG 마우스로의 인간 AML 샘플 UPenn 2741의 이종이식 이후 10주차에 생착된(engrafted) 세포 상에서 CD99 발현을 나타내는 유동세포계수법 데이터의 그래프이다. 이러한 데이터는 대응이 있는(paired) 분석에서, CD99 발현이 골수에서에 비해 말초혈액에서 순환하는 생착된 종양 세포 상에서 유의미하게 높았음을 나타낸다. 에러 바는 ± SD를 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 (패널 d에 대한 대응이 있는 t-검사, 나머지 모두에 대한 대응이 없는 t-검사).
도 9a-9h는 항-CD99 단일클론 항체(mAb)가 AML 및 MDS 세포에 대해 직접적으로 세포독성이며, 상기 항체-매개 세포독성이 이팩터 및 보체-독립적임을 나타낸다. 도 9a(좌측 패널)는 10 μg/ml 또는 20 μg/ml의 용량으로, 72시간 동안 항-CD99 mAb 클론 12E7을 이용한 AML 시편 AU 5.1로부터의 백혈병 모구를 배양한 이후 상대 세포 수의 막대 그래프를 도시한 것이다. 이러한 데이터는 IgG1 아이소타입 컨트롤 항체를 이용한 배양과 비교하여 12E7 항체를 이용하여 배양한 이후 세포 수의 유의미한 감소를 나타낸다. 도 9a(우측 패널)는 원발성 MDS 환자 샘플로부터의 세포계 음성 CD34+CD38- 세포를 항-CD99 mAb 클론 12E7과 72시간 동안 배양한 이후 상대 세포 수의 막대 그래프를 도시한 것이다. 이러한 데이터는 IgG1 아이소타입 컨트롤 항체를 이용한 배양과 비교하여 12E7 항체를 이용하여 배양한 이후 세포 수의 유의미한 감소를 나타낸다. 도 9b는 MOLM13 세포를 항-CD99 mAb H036-1.1(Abcam, Cambridge, MA)과 72시간 동안의 배양한 이후 상대 세포 수의 그래프이다. 이러한 데이터는 IC50=186 ng/ml를 갖는 세포 수의 용량 의존성 감소를 나타낸다. 도 9c는 MOLM13 세포를 5 μg/mL(mL 당 마이크로그램)의 H036-1.1과 배양한 이후 활성화된 카스파제 3(aCaspase3)의 막대 그래프이다. 이러한 데이터는 aCaspase3의 증가를 나타내며, 이는 세포사멸을 통한 세포사의 H036-1.1-매개 유도를 나타낸다. 도 9d는 항-CD99 MAb H036-1.1과 72시간 배양한 이후 MOLM13 세포, 제대혈(CB) HSC, 및 HUVEC의 상대 세포 수의 그래프이다. 이러한 데이터는 IC50이 MOLM13 세포에 대해 186 ng/ml였으며, CB HSC에 대해 5201 ng/ml였음을 나타내며, 이는 실질적 치료 범위(therapeutic window)를 입증한다. IC50은 최대 20,000 ng/ml 용량의 HUVEC로는 도달되지 않았다. 실험은 도 12에서 나타낸 바와 같이, 항-CD99 mAb H036-1.1에 노출시킨 이후의 비 AML 성인 골수 CD34+CD38- 세포 및 HUVEC 세포와 비교하여 MSK MDS-001 CD34+CD38- 세포를 사용하여 반복되었다. 유사하게는, 상대 세포 수가 MSK MDS-001 CD34+CD38-에 대해 현저히 감소됨에 따라 넓은 치료 범위를 나타내는 반면에, 성인 BM CD34+CD38- 및 HUVEC 세포는 훨씬 덜 영향을 받았다. 도 9e는 준 치사량으로 조사된 NSG 마우스로의 이식 이전에 H036-1.1을 이용한 AML 시편 UPenn 2741을 45분 동안 생체외(ex vivo) 치료한 이후 말초혈액(PB)에서의 인간 키메라 현상(chimerism)의 그래프이다. 이러한 데이터는 8주차에 인간 키메라 현상에 의해 측정된 바와 같은 종양 생착의 유의미한 감소를 나타낸다. 도 9f(좌측 패널)는 항-CD99 mAb(12E7)를 이용한 치료 이후 HL60 세포의 면역형광 분석 결과(CD99-녹색, DAPI-청색)를 도시한 것이며, 이는 105분에 CD99의 뚜렷한 세포 표면 캡핑을 드러낸다. 도 9f(우측 패널)는 가교 항-IgG 2차 mAb의 존재하에 72시간 동안 MOLM13 세포를 배양한 이후 상대 세포 수의 막대 그래프이며, 이는 항-CD99 mAb (IgG-아이소타입)의 세포독성의 유의미한 강화작용을 나타내고, 세포 표면 CD99의 항-CD99-매개 응집에서의 IgG-매개 강화와 일치하며, MOLM13 세포사의 촉진을 야기한다.
도 9g는 항-CD99 MAb H036-1.1을 이용하여 MOLM13 세포를 배양한 이후 Src-패밀리 키나아제(Src-family kinase)(SFK, pSrc[Y416])의 활성화를 나타내는 방사선 사진(autoradiograph)이다. 도 9h는 SFK 항-CD99 항체 PP2 (20 μM)를 이용하여 3시간 동안 MOLM13 세포를 예비배양한 이후 H036-1.1을 이용하여 48시간 동안 배양한 이후 상대적 수의 그래프이다. 이러한 데이터는 PP2의 부재시 세포독성의 유의미한 감소를 나타내며(48시간에서 IC50 476 ng/ml), IC50은 PP2의 존재시 도달되지 않았다; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (대응이 없는 스투덴트 t-검정), 이는 예비배양 단계 동안 세포 표면 CD99의 하향-조절과 일치하며, H036-1.1-매개 CD99 응집 감소와 세포사를 야기한다.
도 10a-10c. 도 10a는 항-CD99 항체 12E7을 이용하여 48시간 배양한 이후 15개의 AML 세포주에 대한 상대 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. 검사된 15개의 AML 세포주 중에서, AML 5Q, NB4, KCL22, MOLM13, HL60, MOLM14, NOMO1, U937, MonoMac1, KG1a, 및 AML 14는 12E7 항체와의 CD99 결찰에 이은 성장 억제에 민감한 것으로 발견되었다. 시험된 4개 세포주, KBM5, SET2, KU812, 및 K562는 12E7 항체를 사용한 CD99 결찰에 대해 감응하지 않음이 밝혀졌다. 도 10b는 AML 세포주 HL60, K562, KBM5, SET2, 및 KU812 세포에서 C-키트 및 CD99의 상대적 발현을 나타내는 유세포분석 플롯(상부 패널) 및 IgG1κ 또는 항-CD99 12E7 항체를 이용하여 48시간 동안 배양한 이후의 상대 세포 수를 나타내는 막대 그래프(하부 패널)이다. HL60은 CD99 발현이 많고 및 c-키트 발현이 낮은 대표적인 "민감성" 세포주이다. CD99를 발현하지 않거나(K562 및 KBM5), 높은 수준의 c-키트를 발현하지 않는(SEM2 및 KU812) "저항성" 세포주는 Bcr-abl 양성이거나(K562/KBM5/KU812), 또는 JAK2 양성이다(SEM2). 이러한 데이터는 낮은 CD99 발현 또는 높은 c-키트 발현이 항-CD99 항체 12E7에 의해 매개된 세포독성에 대해 저항할 것으로 예측된다는 것을 나타낸다. 도 10c는 항-CD99 항체 12E7, HEC2, DN16, 및 H036의 존재하에서 CD99+ AML 세포의 내피통과 이동 키네틱의 그래프이며, 이는 2차 항체의 부재시, 특정 항-CD99 항체가 CD99에 의해 매개되는 것으로 알려진 AML 세포의 내피통과 이동을 억제하지 않음을 나타낸다.
도 11의 상부 패널은 UPenn 2522 이종이식 AML 마우스의 항-CD99 MAb H036-1.1을 이용한 복합 생체외 예비치료 및 생체내 치료에 대한 도식을 도시한 것이다. 도 11의 하부 패널은 5개월 이후 AML 모구 UPenn 2522 이종이식 마우스의 골수에서의 인간 키메라 현상의 평가를 나타낸다. 이종이식 이전의 AML 모구의 예비-코팅 또는 항-CD99 MAb를 이용한 이종이식 마우스의 생체내 치료는 AML 이종이식편을 제거하는 한편, 5마리 중 4마리(4/5)의 대조 동물은 백혈병을 생착하였다.
도 12는 항-CD99 MAb H036-1.1을 이용하여 72시간 배양한 이후 MSK MDS-001 CD34+CD38- 세포, 성체 BM CD34+CD38- 세포, 및 HUVEC의 상대 세포 수의 그래프이다. 항-CD99 MAb는 MDS-001 CD34+CD38- 세포에 대해 독성이 유의미하게 높으며, 이는 벽혈병 세포에 대해 유익한 치료 범위를 나타낸다.
도 13은 면역조직화학에 의해 조직 미세배열(microarray)을 염색함으로써 CD99 발현에 대한 264개의 NHL 사례의 스크리닝 결과를 나타내는 표 4를 도시한 것이다. 5% 컷-오프를 사용하는 경우, 4개/13개(31%) ALCL, 11개/20개(55%) T 림프모구 림프종, 7개/16개 (44%) 혈관면역모구 T-세포 림프종, 10개/63개 (16%) 말초 T-세포 림프종(특정되지 않음), 0개/3개 (0%) NK/T 세포 림프종, 2개/17개 (11.7%) 여포성 림프종, 2개/24개 (8%) 외투 세포 림프종, 4개/22개 (18%) 만성 림프구성 백혈병, 3/16 (18.8%) 변연부 림프종, 및 1개/70개 (1.4%) 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma)(DLBCL)이 CD99 발현에 대해 양성이었다. 샘플은 또한 양성 세포 % 및 염색 강도로 점수화되었다. 약-중(weak-moderate) 염색을 이용한 사례는 대부분 세포질 패턴을 나타낸 한편, 강한(strong) 사례는 막(membrane) 염색을 나타내었다.
도 14a는 면역조직화학에 의한 CD99에 대한 대표적인 염색 패턴을 도시한 것이다. A) T 림프모구 림프종(막, 강함), B) 외투 세포 림프종(세포질, 중간), C) 변연부 림프종(세포질, 약함), D) 역형성 큰 세포 림프종(세포질, 중간).
도 14b는 정상 골수(n=7) 및 소아 T-ALL 사례의 골수(n=117)에서 CD99 (mRNA)의 발현을 도시한 것이다. 상기 결과는 CD99가 정상 BM(p<.0001)에 비해 T-ALL에서 상향 조절(up-regulated)됨을 드러낸다. 이러한 분석에 사용된 미가공 데이터는 BioGPS에서 공개적으로 이용 가능한 전사 프로파일로부터 얻었다. 이 연구에서의 환자는 아동 ALL에 대한 독일 공동-작업 연구 그룹(German Co-operative study group for childhood ALL) 및 네덜란드 아동 종양학 그룹(Dutch Childhood Oncology Group)(DCOG) 프로토콜에 등록되었다.
도 14c는 T-ALL과 부합되는 환자의 진단-재발 쌍들 사이에서 CD99의 발현(유동세포계수)을 도시한 것이다. 상기 결과는 CD99가 진단 및 재발시 유사한 수준으로 발현되었음을 드러낸다. 이들을 함께 고려하면, 이러한 데이터는 CD99가 진단 및 재발시 T-ALL에서 표적화시킬 수 있음을 제시한다. 이러한 분석에 사용되는 미가공 데이터는 BioGPS에서 공개적으로 이용 가능한 전사 프로파일로부터 얻었다. 이 연구에서의 환자는 네덜란드 아동 종양학 그룹 프로토콜에 등록되었다.
도 14d는 정상 말초혈액 B 및 T 세포에 비해 림프성 종양(세포주)에 대한 CD99 발현 수준을 도시한 것이다. AML 세포주 HL60을 양성 대조군으로 사용하였다. 293T 세포뿐 아니라 각각의 개별 세포주에 대한 아이소타입 대조군에 대한 발현 수준까지 CD99 발현을 정규화하였다. 이 실험은 정상 T 세포에 비해 Karpas-299(ALCL 세포주) 및 KoptK1(T-ALL 세포주)에 대해 양성 피드백되며, Granta-519(백혈병성 변형 [B-세포계] 세포주를 갖는 외투 세포 림프종)가 정상 B 세포에 비해 높은 수준으로 CD99를 발현함을 드러낸다. 이와 반대로, Mac2A(ALCL), Hut78(시자리 증후군(sezary syndrome)), Hut102(균상식육종), Ly8(미만성 거대 B 세포 림프종, DLBCL), WSU(DLBCL), Daudi(버키트 림프종), DOHH2(면역모세포 B 세포 림프종), SKO-007(다발성 골수종), SKMM1(다발성 골수종), SKMM2(다발성 골수종), LICR2(형질구성 백혈병(plasma cell leukemia)), 및 RPMI 8226(형질세포종/다발성 골수종)에 대한 CD99의 발현은 그들의 정상 B 및 T 세포 대응물에 비해 낮다. 이에 불구하고, 4개/4개 피부 T 세포 림프종, 3개/3개 DLBCL, 0개/1개 버키트 림프종, 및 1개/1개 백혈병성 외투 세포 림프종은 FC에 의해 CD99 양성이었으나, 데이터에 나타나지는 않았다.
도 15a는 40ug/ml IgG 및 50-100ug/ml 항-IgG 대조군(p≤.0002)에 비해 40ug/ml DN16 및 50-100ug/ml 항-IgG를 이용하여 72시간 배양한 이후 세포 수의 70-81% 감소로 입증된 바와 같은 KOPTK1 세포주에서의 DN16-매개 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 15b는 40ug/ml IgG 및 50-100ug/ml 항-IgG 대조군(p≤.0021)에 비해 40ug/ml DN16 및 50-100ug/ml 항-IgG를 이용하여 72시간 배양한 이후 세포 수의 38-43% 감소에 의해 입증된 바와 같은 Karpas-299 세포주에서의 DN16-매개 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 15c는 40ug/ml DN16 및 50-100ug/ml 항-IgG를 이용한 72시간 배양이 낮은 수준의 CD99를 발현하는 ALCL 세포주인 Mac2A에서의 세포독성 유도에 실패하므로, 적절한 음성 대조군으로서 제공된다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 15d는 40ug/ml IgG 및 50-100ug/ml 항-IgG 대조군(p≤.0003)에 비해 40ug/ml 12E7 및 50-100ug/ml 항-IgG를 이용하여 72시간 배양한 이후 세포 수의 42-78% 감소에 의해 입증된 바와 같은 KOPTK1 세포주에서의 12E7-매개 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 15e는 40ug/ml IgG 및 75ug/ml 항-IgG 대조군(p≤.0001)에 비해 40ug/ml O13 및 75ug/ml 항-IgG를 이용하여 72시간 배양한 이후 세포 수의 25% 감소에 의해 입증된 바와 같은 Karpas-299 세포주에서의 O13-매개 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 항-IgG의 존재하에 72시간 동안의 CD99 mAb(F8, O13, 12E7, DN16)를 이용한 치료시 Karpas-299, KOPTK1, 및 Mac2A 세포주에서 확인된 세포 수의 최대 변화를 요약한 표 5를 도시한 것이다. 이러한 결과들은 CD99 mAb-매개 세포독성이 에피토프(epitope) 특이적일 수 있음을 제시한다.

본 명세서는 부분적으로 저위험 골수이형성 증후군(MDS) 환자로부터의 조혈 줄기 세포(HSC) 및 정상 성인 도너(donor)로부터의 정상 골수(BM) 세포의 전사체(transcriptome) 분석 결과를 기본으로 한다. 상기 전사체 분석에서 확인된 3,258개의 차등적으로 발현된 전사물 중에서, 25개의 차등적으로 발현된 세포 표면 전사물을 검출하였다. 37개의 신규 MDS 사례의 유동세포계수 분석은 환자 샘플 중 73%에서 CD99의 조절저해된 세포 표면 단백질 발현을 입증하였다. 또한, 26개의 치료 관련 MDS 환자 샘플에서 동일한 25개의 세포 표면 단백질의 유세포분석을 수행하여, CD99가 환자 샘플 중 85%에서 과발현됨이 밝혀졌다.

특정 세포 표면 단백질, 상세하게는 세포 표면 마커 CD99의 발현이 저위험 골수이형성 증후군(MDS) 환자 유래의 조혈 줄기 세포(HSC)뿐 아니라 치료 관련 MDS 환자 샘플 둘 다에서 증가한 이러한 예비 관찰을 기본으로 하여, MDS 세포주 및 원발성 세포에서뿐 아니라 AML 세포주 및 원발성 AML 모구에서 CD99의 세포외 도메인에 대해 결합 특이성을 갖는 항체의 잠재적 치료 효능을 평가하였다. 발명자의 실험에서, CD99는 MDS 및 AML 둘 다에서 기본적으로 가장 자주 과발현된 마커였으며, 이는 상당히 과발현되었다(대조군에 비해 평균 약 7배).

본원에 기재된 바와 같이, MDS 세포 상의 CD99를 항-CD99 항체 12E7과 같은 특정 항-CD99 항체와 결찰하는 것은 (i) 세포 수의 시간-의존성 감소를 야기하였고; (ii) 항-CD99 항체에서 결찰된 MDS 세포에서의 세포사를 유도하였며(아넥신 V 양성의 증가에 의해 입증된 바와 같음); (iii) CD99의 세포 표면 발현 수준을 감소시켰고; (iv) CD14 및 CD11b와 같은 특정 골수 특이적 분화 마커의 수준을 감소시켰다. 유사하게는, 항-CD99 항체 12E7과 같은 특정 항-CD99 항체를 이용한 원발성 CD34⁺ MDS 세포 상의 CD99의 결찰은 항체의 부재하에 또는 아이소타입 컨트롤 항체의 존재하에 배양된 배양액에서의 세포 수에 비해 항-CD99 항체의 존재하에 배양된 배양액에서의 세포 수의 시간-의존성 감소에 의해 입증된 바와 같이 상기 원발성 MDS 세포에 대해 세포독성이었다.

높은 수준의 CD99를 발현하는 AML 세포 상의 CD99를 항-CD99 항체 12E7과 같은 특정 항-CD99 항체와 결찰하는 것은 항체의 부재하에 또는 아이소타입 컨트롤 항체의 존재하에 배양된 배양액 중의 세포 수에 비해, 항-CD99 항체의 존재하에 배양된 배양액 중의 세포 수의 시간-의존성 감소에 의해 입증된 바와 같이 상기 AML 세포에 대해 세포독성이었다는 것 또한 관찰되었다. 유사하게는, 원발성 CD99-발현 AML 모구 상의 CD99를 항-CD99 항체 12E7과 같은 특정 항-CD99 항체와 결찰하는 것은 세포 수의 시간-의존성 감소에 의해 입증된 바와 같이 상기 원발성 AML 모구에 대해 세포독성이었으나, 정상 제대혈 HSC 세포 수에 대해서는 보통의 시간-의존 효과만을 나타내었다.

또한, 본원에 기재된 바와 같이, CD99-발현 MDS 세포주, MDS 원발성 세포, AML 세포주, 및 원발성 AML 모구 상의 CD99의 항-CD99 항체 결찰로 인한 세포독성은 보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity)(CDC) 및/또는 항체 의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(ADCC)의 부재하를 포함하여, 항체 이팩터 기능의 부재하에 발생하였다는 것이 추가로 밝혀졌다.

이러한 연구를 통해, 검사된 항-CD99 항체의 부분집합이 CD99+ 세포 성장에 대한 세포독성 특성을 나타내었으며, 이는 예를 들어 세포사멸과 같은 세포사의 유도를 통한 항-CD99-매개 세포독성으로부터 야기되었음이 밝혀졌다. 이들 세포독성 항-CD99 항체는 세포 표면 CD99를 결찰시키는 특성을 공유하여, 항체-결합 CD99의 세포 표면 상에서의 응집을 촉진하였으며, 이는 세포 표면의 국소 영역에서의 클러스터링 또는 캡핑을 야기하였다. 또한, 특정 항-CD99 항체의 세포독성, 및 특정 항-CD99 항체에 의해 유도된 세포사멸은 CD99 응집, 클러스터링, 및 캡핑을 촉진하는 각각의 항체의 능력과 직접 연관되어 있었다. 이러한 결과는, 바람직하게는 CD99+ AML 및 CD99+ MDS를 억제하기에 유효한 항-CD99 항체가 CD99+ MDS 및 AML 세포의 표면 상에서 (i) CD99 응집을 유도하고; (ii) CD99 클러스터링을 유도하며; (iii) CD99 캡핑을 유도하는 특성 중 1종 이상을 포함해야 한다는 것을 나타내었다.

본원에 추가로 상세하게 기재된 이러저러한 발견들을 기본으로 하여, 본 명세서는 다음을 제공한다:

(1) 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군의 치료를 위한 항-CD99 항체, 및 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물, 여기서 적합한 항-CD99 항체는 표면-발현 CD99에 결찰(즉, 결합)되고; CD99+ AML 및/또는 MDS 세포의 성장을 억제하며; 결찰된 CD99의 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 가능하게 하고; 세포사의 직접 유도를 통해, 예컨데 세포사멸, 괴사/네크롭토시스(necroptosis), 자가소화 세포사, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 또는 다른 세포사 메커니즘, 예컨데 유사분열 카타스트로피(mitotic catastrophe), 파랍토시스(paraptosis), 파이롭토시스(pyroptosis), 파이로네크로시스(pyronecrosis), 및 엔토시프스(entosifs)를 통해 AML 및/또는 MDS 세포의 세포독성을 촉진한다;

(2) 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군의 치료에 적합한 항-CD99 항체를 생성 및 확인하는 방법;

(3) 항-CD99 항체 및/또는 1종 이상의 항-CD99 항체(들)를 포함하는 조성물을 이용한 치료에 대해 민감한 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군에 걸린 환자를 확인하는 방법;

(4) CD99⁺ 백혈병 줄기 세포 및/또는 조혈 줄기 세포와 같은 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군과 연관된 CD99⁺ 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법; 및

(5) CD99의 증가된 수준을 나타내는 CD99⁺ 급성 골수성 백혈병 및/또는 CD99⁺ 골수이형성 증후군의 치료 방법.

본원에 더 상세하게 기재된 바와 같이, 급성 골수성 백혈병 및/또는 골수이형성 증후군을 치료하기 위한 이러한 항체, 조성물, 및 방법은 다음의 새롭게 발견되고 여기에 개시된 관계로부터 유래한다: (1) 급성 골수성 백혈병과 연관(원발성 AML 세포, 모구, 및 백혈병 줄기 세포(LSC)를 포함)되고/되거나 신규 또는 치료 관련 골수이형성 증후군과 연관(원발성 MDS 세포, 모구, 및/또는 조혈성 줄기 세포(HSC)를 포함)된 조직 및/또는 세포에서 CD99의 증가된 발현; (2) 특정 항-CD99 항체에 의한 결찰에 대한 상기 CD99+ AML 및 MDS 조직 및 세포의 민감성 및 상기 항-CD99 항체에 결찰되었을 때의 세포 CD99의 결과적 응집, 클러스터링, 및 캡핑; 및 (3) 항-CD99 결찰로부터 야기된 세포독성, 및 결과적 응집, 클러스터링, 및 캡핑, 이는 세포 표면-발현 CD99에 대한 항-CD99 결합 및 상기 CD99 응집의 결과로서 유도된 세포사(예를 들어, 세포사멸)에 의해 매개된다.

CD99 ⁺ AML 및 MDS 세포 상의 CD99의 결찰 -매개 클러스터링(Ligation-mediated Clustering)을 위한 항-CD99 항체

본 발명은 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 증식을 억제하거나 세포 사멸을 유도하기 위해 본원에 개시된 방법에 적합하게 사용될 수 있는 세포 독성 항-CD99 항체를 제공하며, 이는 상승된 수준의 CD99를 발현하는 세포로 구성된 AML 및/또는 MDS에 걸린 환자의 치료에 적합하다.

본원에 개시된 세포 독성 항-CD99 항체는 하기 특성을 나타낸다:

1. CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 표면 상에 발현될 때 CD99의 세포외 도메인에 대한 결합 친화성;

2. CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 표면에서 항체 결합 CD99의 응집, 클러스터링 및 캡핑을 촉진; 및

3. CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포 표면의 CD99에 결합될 때 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에서의 세포사 유도.

세포 사멸, 괴사/네크로프토시스, 자가포식 세포사, 소포체-스트레스 관련 세포 독성, 또는 유사분열 카타스트로피(catastrophe), 파랍톱시스(paraptosis), 피롭토시스(pyroptosis), 피로네크로시스(pyronecrosis) 및 엔토시프스(entosifs)와 같은 다른 세포사의 메커니즘에 의한 것이든 아니든, CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 표면 상의 CD99에 결합된 항체에 의한 응집, 클러스터링 및/또는 캡핑의 촉진은 그 항체의 세포 독성 및 세포 사멸 유도 능력의 예측 요소임이 이해될 것이다[참고: Kroemer 등, Cell Death Differ. 16(1):3-11 (2009)]. 아무튼 세포사는 응집, 클러스터링 및/또는 캡핑에 대한 중간 평가를 하든 안하든 직접 관찰할 수 있다.

이들 방법에 적합하게 사용될 수 있는 예시적인 항체에는, 서열 2의 아미노산 61-64, 서열 4의 아미노산 45-48 및 서열 6의 아미노산 61-64 에 의해 정의되는 에피토프 "DGEN"(서열 7)의 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 뮤린 IgG1 항체 12E7[Levy 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., 76:6552 (1979)] 및 O13 [Dracopoli 등, Am. J. Hum. Genet. 37:199 (1985)]와, 에피토프 DDPRPPNPPK(서열 12)의 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 뮤린 IgM H036-1.1 항체가 포함된다.

이에 반해, 일부 실시양태에서, 서열 2 및 6의 아미노산 32-39에 의해 정의되지만 서열 4의 아미노산 서열에는 존재하지 않는 에피토프 "LPDNENKK"(서열 8)(여기서, 아미노산 32-39는 아미노산 서열 "LPGDDFDL"(서열 9)을 함유한다)에서 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 뮤린 IgG1 항체 DN16[Hahn 등, J. Immunol. 159:2250 (1997)]은 본 발명에 적합하지 않은데, 그 이유는 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 동안 항체 결합 CD99의 응집을 촉진시키는 제한된 능력과 그에 상응하는 낮은 수준의 세포독성을 나타내기 때문이며, 항체-매개 응집, 세포 독성 및 세포 사멸은 항-CD99 항체-결합 CD99를 2차 항-IgG 항체와 결합시킴으로써 증가될 수 있는데, 이는 그것의 이원성 때문에 2개의 항-CD99 항체 결합 CD99 분자를 근접시킨다.

CD99 세포외 도메인의 중첩 15-mer 펩티드의 펩티드 스캐닝 실험을 이용하여 항-CD99 mAb 세포 독성에 필요한 잠재적 항원 에피토프를 추가로 동정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. MAbs 12E7 및 F8은 둘다 에피토프 DAVVDGEND (서열 10)를 포함하는 중첩 펩티드를 인식하였다. MAb O13은 에피토프 AVVDGEN (서열 11)을 포함하는 중첩 펩티드를 인식하였다. MAb H036-1.1은 에피토프 DDPRPPNPPK (서열 12)를 포함하는 중첩 펩티드를 인식하였다. MAb 3B2는 에피토프 LPD (서열 13)를 포함하는 중첩 펩티드를 인식하였다. MAb는 에피토프 DALPDN (서열 14)을 포함하는 중첩 펩티드를 인식하였다. 15-mer 펩티드가 단편인 세포외 도메인의 서열은 서열 15이다.

유사하게, 일부 실시양태에서, 뮤린 IgG 항체 3B2 및 F8은, CD99의 세포외 도메인에 결합하지만 응집 매개 능력과 세포사 유도 능력이 없어서 항체 결합 CD99의 응집을 촉진시키지 않고 항체-결합 AML 및/또는 MDS 세포에 대해 세포 독성이 없기 때문에 본 발명에 개시된 방법에 부적당하다. 더욱이, 3B2- 및 F8- 항체 결합 CD99에 대한 2차 항-IgG 항체의 결합은 항-CD99 항체-매개 응집 또는 세포 독성을 촉진시키는 데 비효과적이다.

표 1에는 12E7, O13 및 H036-1.1 항-CD99 항체의 각각의 특성을 나타내는데,이들은 (1) AML 및/또는 MDS 세포의 표면에서 발현될 때 CD99의 세포외 도메인에 결합하고; (2) AML 및/또는 MDS 세포에서 표면 발현된 CD99의 응집, 클러스터링 및 캡핑 중 적어도 하나를 촉진하는 바람직한 특성을 발휘한다. 이들 항체는 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에 세포 독성이 있으며 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에서 세포사를 유도하는 것으로 입증되었다.

표 1에는 또한 DN16, 3B2 및 F8 항-CD99 항체의 특성을 나타내는데, AML 및/또는 MDS 세포의 표면 상에서 발현될 때 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 바람직한 특성을 나타내지만 AML 및/또는 MDS 세포에서 표면 발현 CD99의 응집, 클러스터링 및 캡핑을 촉진하지는 않는다. 이들 항체는 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에 세포 독성이 없고 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에서 세포사를 유도하는 능력이 없다.

따라서, 응집/클러스터링/캡핑을 촉진시키고, 결과적으로 CD99⁺ AML 및/또는 CD99⁺ MDS 세포에서 세포사를 유도하는 능력을 가진 12E7, O13 및 H036-1.1 항-CD99 항체를 공유하는 세포 독성 항체는 본 발명 개시의 범위 내에 있으며, CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에서 세포 독성을 유도하기 위한, 또는 상승된 수준의 CD99를 발현하는 AML 및/또는 MDS-관련 세포를 나타내는 AML 및/또는 MDS 환자를 치료하기 위한 본 발명 개시의 방법에 적절하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

이에 반해, 응집/클러스터링/캡핑을 촉진하거나 CD99⁺ AML 및 /또는 MDS 세포에서 세포사를 유도하는 능력이 없거나 제한적인, DN16, 3B2 및 F8 항-CD99 항체를 공유하는 비세포 독성 항체는 본 발명의 범위 및 본 발명 방법의 범위를 벗어나는 것임을 이해할 것이다.

표 1

항- CD99 항체의 특성

본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합할 수 있는 항-CD99 항체는 약 100 ng/ml 내지 약 10 μg/ml 또는 약 250 ng/ml 내지 약 5 ㎍/㎖ 또는 약 500 ng/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖의 IC50으로 인간 CD99의 세포외 도메인에 결합한다.

본 발명 개시의 방법들을 실시하기에 적합한 항-CD99 항체는 바람직하게는 단일클론 항체이고, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및/또는 본원에 개시된 12E7, O13 및 H036-1.1 항-CD99 항체 중 임의의 것의 결합 단편 또는 상기 항-CD99 항체가 12E7, O13 및 H036-1.1 항-CD99 항체를 공유하고 하기 (1) 내지 (3)의 특성을 갖는 한 이전에 개시되었거나 새로 개발된 다른 항체의 결합 단편을 포함하는 인간, 인간화 또는 키메라 단일 클론 항체일 수 있다: (1) CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 표면에서 발현될 때 CD99의 세포외 도메인에 대한 결합 친화성; (2) CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포의 표면에서 항체 결합 CD99의 응집, 클러스터링 및/또는 캡핑의 촉진; 및 (3) CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포 표면의 CD99에 결합될 때 CD99⁺ AML 및/또는 MDS 세포에서의 세포사 유도. 하나 이상의 응집, 클러스터링 및 캡핑과 세포 독성 간의 밀접한 상관 관계 때문에, 응집, 클러스터링 및 캡핑은 세포 독성 및 보다 구체적으로 세포사의 표지자로서 작용할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 응집, 클러스터링 및 캡핑을 일으키는 것으로 이전에 확인된 항체를 사용하여 세포사를 유도함으로써 세포 독성을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 항-CD99 항체는 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 단일클론 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지며, 즉 모집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서 수식어 "단일클론 (monoclonal)"은 항체의 특징이 개별 항체들의 혼합물이 아니라는 것을 의미하다.

본 발명의 항-CD99 단일클론 항체는 문헌[Kohler 등, Nature 256:495 (1975)]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호).

하이브리도마 방법에서, 햄스터와 같은 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화된다. CD99에 대한 항체는 CD99와 보조제의 복수회 피하 주사(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가될 수 있다. CD99는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 그 중 일부는 본원에서 추가로 기술된다. 예를 들어, 인간 및 마우스 CD99의 재조합 생산은 하기에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 동물을 면역 글로불린 중쇄의 Fc 부분에 융합된 CD99에 의해 면역화시킨다. 또 다른 실시양태에서는, 동물을 CD99-IgG1 융합 단백질에 의해 면역화시킨다. 동물을 일반적으로 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.)에 의해 CD99의 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시키고 용액을 여러 부위에 피내 주사한다. 2주 후에 동물을 부스팅시킨다. 7~14일 후에 동물로부터 출혈을 시키고 혈청을 항 CD99 역가에 대해 분석한다. 역가 안정기가 될 때까지 동물을 부스팅시킨다.

대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그런 다음 림프구를 폴리에틸렌글리콜과 같은 적절한 융합 제제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다[참고: Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 접종 및 성장시킨다. 예를 들어, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)를 결핍한 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.

골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포일 수 있다. 골수종 세포주는 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 솔크 인스티튜트 셀 배급 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 미국 메릴랜드주 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포에서 유래된 것과 같은 뮤린의 골수종 세포주일 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술된 바 있다[참고: Kozbor, J. Immunol. 133:3001(1984), Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51- 63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포를 성장시키는 배양 배지를 CD99에 대해 유도된 단일클론 항체의 제조에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역 침강법에 의해 또는 방사 면역 에세이 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 에세이 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 에세이에 의해 결정될 수 있다.

단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌[Munson 등, Anal. Biochem . 107:220 (1980)]에 기재되어 있는 스캐차드 분석법(Scatchard analysis)에 의해 측정될 수 있다. 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다[참고: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)]. 이 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장할 수 있다.

서브 클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 면역 글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다 .

본 발명의 항-CD99 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하도록 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 나타내는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어 라이브러리 내의 비결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론은 항원으로부터 용리되어, 항원 흡착/용출의 추가적인 사이클에 의해 더욱 농후화될 수 있다. 본 발명의 항-CD99 항체 중 임의의 항원은 목적하는 파지 클론을 선별하기 위한 적절한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 목적하는 파지 클론으로부터의 Fv 서열과 적합한 불변 영역(Fc) 서열을 사용하여 전체 길이 항-CD99 항체 클론을 작제함으로써 수득할 수 있다[참고: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3].

항체의 항원-결합 도메인은 약 110개의 아미노산의 2개의 가변(V) 영역으로부터 형성되고, 각각은 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)로부터 되고 둘다 3개의 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDRs)이 존재한다. 가변 도메인은, VH 및 VL이 짧고 유연한 펩티드를 통해 공유결합되어 있는 단쇄 Fv(scFv) 단편, 또는 그들이 서로 불변 영역에 융합되어 비공유결합적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서 파지 상에 기능적으로 표시될 수 있다[참고: Winter 등, Ann. Rev. Immunol . 12:433-455 (1994)]. 본원에 사용된 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 집합적으로 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.

VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝될 수 있고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있으며, 이어서 문헌[Winter 등, Ann. Rev. Immunol . 12:433-455 (1994)]에 기재되어 있는 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 조사할 수 있다. 면역원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요없이 면역원에 대해 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 문헌[Griffiths 등, EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 임의의 면역화없이 광범위한 비-자체 항원 및 자체 항원에 단일 항원의 인간 항체를 제공하도록 클로닝될 수 있다. 끝으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 재배치되지 않은 V-유전자 단편을 클로닝하고 고도로 가변적인 CDR3 영역을 코딩하고 PCR 프라이머를 사용하여 문헌[Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol . 227:381-388 (1992)]에 기재되어 있는 바와 같이 시험관내에서 재배열을 수행하여 합성적으로 제조할 수 있다.

필라멘트상 파지는 작은 피막 단백질 pIII에 융합시켜서 항체 단편을 나타내는 데 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌[Marks 등, J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 도메인이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 연결되는 단쇄 Fv 단편으로 표시되거나, 또는 예를 들어, 문헌[Hoogenboom 등, Nucl . Acids Res. 19:4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 사슬이 pIII에 융합되고 다른 하나가 박테리아 숙주 세포 페리플라즘 내로 분비되는 Fab 단편으로서 표시되며, 여기서 Fab-피막 단백질 구조의 어젬블리는 와일드 타입 피막 단백질 중 일부가 대체됨으로써 파지 표면 상에 나타나게 된다.

일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 얻어진다. 항-CD99 클론을 선호하는 라이브러리가 필요한 경우, 개체를 CD99로 면역화시켜 항체 반응을 일으키고 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구(PBLs)를 라이브러리 작제를 위해 회수한다. 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능성 인간 면역 글로불린 유전자 어레이를 보유하는(및 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 형질전환 마우스에서 항-CD99 항체 반응을 생성함으로써 얻어지는 항-CD99 클론을 선호하도록 편향되어, CD99 면역화가 CD99에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 일으킬 수 있다. 인간 항체 생산 형질전환 마우스의 생성은 이하에서 기술한다.

항-CD99 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농후화는 CD99-특이성 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 데 적합한 스크리닝 방법을 이용하여, 예를 들어 CD99 친화성 크로마토그래피에 의한 세포 분리 또는 형광 염료 표지된 CD99에 대한 세포 흡착 후 FACS(flow-activated cell sorting)에 의해 얻을 수 있다.

대안적으로, 비면역 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 표현을 제공하고, 또한 CD99가 항원성이 아닌 임의의 동물(인간 또는 비-인간) 종을 사용하여 항체 라이브러리를 작제할 수 있다. 시험관내 항체 유전자 작제를 포함하는 라이브러리의 경우, 재배열되지 않은 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 개체로부터 줄기 세포를 수확한다. 목적하는 면역 세포는 인간, 마우스, 쥐, 토끼, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종 등 다양한 동물 종으로부터 얻을 수 있다.

항체 가변 유전자 단편(VH 및 VL 단편 포함)을 코딩하는 핵산은 목적 세포로부터 회수하여 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 문헌[Orlandi 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 86:3833-3837 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 원하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단과 일치하는 프라이머로 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행함으로써 얻을 수 있고, 이로써 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있다. V 유전자는, 문헌[Orlandi 등 (1989) 및 Ward 등, Nature 341:544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이, 성숙한 V- 도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에 있는 역방향 프라이머 및 J-단편 내에 기초를 둔 정방향 프라이머에 의해 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머는 또한 문헌[Jones 등, Biotechnol 9:88-89(1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손 내에 기초를 둘 수 있으며, 정방향 프라이머는 문헌[Sastry 등, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 86:5728-5732 (1989)]에 기재되어 있는 바와 같이 불변 영역 내에 기초를 둘 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌[Orlandi 등 (1989) 또는 Sastry 등 (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머들에 변성을 포함시킬 수 있다. 라이브러리 다양성은, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해, 예를 들어 문헌[Marks 등, J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991) 또는 Orum 등, Nucleic Acids Res. 21:4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이, 각 V-유전자 패밀리를 표적으로 하는 PCR 프라이머를 사용하여 최대화시킬 수 있다. 증폭된 DNA를 발현 벡터로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 효소 부위를 문헌[Orlandi 등 (1989)]에 기재된 바와 같이 일단부에 태그로서 PCR 프라이머 내에 도입하거나, 문헌[Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991)]에 기재된 바와 같은 태그된 프라이머에 의해 추가로 PCR 증폭시킬 수 있다.

합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 단편으로부터 시험관내에서 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 단편은 클로닝 및 서열화되고[Tomlinson 등, J. Mol . Biol . 227:776-798 (1992)에 보고됨], 매핑되었으며 [Matsuda 등, Nature Genet. 3:88-94 (1993)에 보고됨], 이들 클로닝된 단편들(H1 및 H2 루프의 모든 주요 구조를 포함함)은 문헌[Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol. 227:381-388 (1992)]에 기재되어 있는 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는 데 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 문헌[Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:4457-4461 (1992)]에 개시되어 있는 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 가지도록 만들 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 단편은 클로닝 및 서열화되었으며(Williams and Winter, Eur . J. Immunol. 23:1456-1461 (1993)에 보고됨) 합성 경쇄 레퍼토리를 만드는 데 사용될 수 있다. VH 및 VL 폴드의 범위 및 L3 및 H3 길이의 범위에 기초한 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭 후, 생식선 V-유전자 단편을 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol . 227:381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관 내에서 재배열할 수 있다.

항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 여러 가지 방법으로 함께 조합함으로써 작제될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터로 생성될 수 있고, 그 벡터는 시험관 내에서 예를 들어 문헌[Hogrefe 등, Gene 128:119-126 (1993)]에 기재되어 있는 바와 같이 재조합되거나, 또는 생체 내에서 예를 들어 문헌[Waterhouse 등, Nucl . Acids Res. 21:2265-2266 (1993)]에 기재되어 있는 바와 같이 결합 감염에 의해 재조합될 수 있다. 생체 내 재조합 접근법은 대장균 형질 전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2본쇄 성질을 이용한다. 순수 VH 및 VL 레퍼토리는, 하나는 파지미드에, 다른 하나는 파지 벡터에 분리하여 클로닝된다. 두개의 라이브러리는 이어서 각 세포가 다른 조합을 포함하고 라이브러리 크기가 존재하는 세포(약 10¹² 클론)의 수에 의해서만 제한되도록 파지미드 함유 박테리아의 파지 감염에 의해 결합된다. 두 벡터는 생체 내 재조합 신호를 포함하여 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘 상에 재조합되고 파지 비리온에 함께 패키징된다. 이 거대한 라이브러리는 양호한 친화성(약 10^-8M의 Kd^-1)의 다양한 항체를 다수 제공한다.

대안적으로, 레퍼토리는 예를 들어 문헌[Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 88:7978-7982 (1991)]에 기술된 바와 같이 동일 벡터에 순차적으로 클로닝되거나, 또는 PCR에 의해 함께 어셈블리된 다음, 예를 들어 문헌[Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 클로닝된다. PCR 어셈블리는 또한 단쇄 Fv(scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 VH 및 VL DNA를 결합시키는 데 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 내 PCR 어셈블리"는 PCR에 의해 림프구 내의 VH 및 VL 유전자를 결합시킨 다음, 문헌[Embleton 등, Nucl . Acids Res. 20:3831-3837 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 연결된 유전자의 레파토리를 클로닝하는 데 사용된다.

순수 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 생성된 항체는 보통 친화성(약 10⁶ 내지 10⁷ M^-1의 Kd^- ¹)일 수 있지만, 친화성 성숙은 또한 문헌[Winter 등 (1994), supra.]에 기재되어 있는 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제 및 재선택함으로써 시험관 내에서 모방될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Hawkins 등, J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992)] 또는 문헌[Gram 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:3576-3580 (1992)]의 방법으로, 오류-유발 폴리머라제[Leung 등, Technique 1:11-15 (1989)에 보고됨]를 사용하여 시험관 내에서 무작위로 돌연변이를 도입할 수 있다. 추가로, 친화성 성숙은, 예를 들어, 선택된 개별적인 Fv 클론에서 목적하는 CDR에 걸친 랜덤 서열을 지니는 프라이머로 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 변이시키고, 보다 높은 친화성 클론을 스크리닝함으로써 수행할 수 있다. PCT 특허 공보 WO 1996/07754(1996년 3월 14일 공개)는 면역 글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이 유발을 유도하여 경쇄 유전자 라이브러리를 생성하는 방법을 기술하였다. 또 다른 효과적인 접근법은 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 면역화되지 않은 도너로부터 얻은 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 재조합시키고 문헌[Marks 등, Biotechnol . 10:779-783 (1992)]에 기재되어 있는 바와 같이 여러 차례 사슬 리셔플링하여 높은 친화성을 위해 스크리닝하는 것이다. 이 기술은 10^-9M 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. CD99 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 표 2A에 제시되어 있다. CD99를 코딩하는 핵산 서열은 CD99의 원하는 영역의 아미노산 서열을 사용하여 디자인할 수 있다.

CD99를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스포네이트 방법과 같이 문헌[Engels 등, Agnew. Chem . Int . Ed. Engl. 28:716-734 (1989)]에 기재되어 있는 방법 중 임의의 방법에 의한 화학적 합성을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시양태에서, 발현 숙주 세포에 의해 바람직한 코돈은 CD99 코딩 DNA의 설계에 사용된다. 대안적으로, CD99를 코딩하는 DNA는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다.

CD99를 코딩하는 DNA 분자의 작제에 이어, DNA 분자는 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 플라스미드와 같은 발현 벡터에서 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유래되는 복제 및 조절 서열을 함유한다. 벡터는 형질 전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열뿐만 아니라 통상적으로 복제 부위를 보유한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에서 추가로 기술된다. 효모와 같은 진핵 유기체 또는 포유 동물과 같은 다세포 유기체 유래 세포가 사용될 수 있다.

선택적으로, CD99를 코딩하는 DNA는 분비 리더 서열에 작동 가능하게 연결되어 숙주 세포에 의한 발현 산물을 배양 배지로 분비하게 한다. 분비 리더 서열의 예는 stII, 에코틴, lamB, 포진 GD, lpp, 알칼리성 포스파타아제, 인버타제 및 알파 인자를 포함한다. 또한, 본원에서 사용하기에 적합한 것은 단백질 A의 36 아미노산 리더 서열[Abrahmsen 등, EMBO J. 4:3901 (1985)]이다.

숙주 세포를 형질 감염시키고, 바람직하게는 본 발명의 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질 전환시키고, 프로모터 유도, 형질 전환체 선택, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.

형질 감염은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지 여부에 관계없이 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 흡수를 지칭한다. 다수의 형질 감염 방법, 예를 들어, CaPO₄ 침전 및 전기천공법이 당업자에게 공지되어 있다. 성공적인 형질 감염은 일반적으로 이 벡터의 작동에 대한 표시가 숙주 세포 내에서 발생할 때 인식된다. 형질 감염을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 일부는 본원에서 추가로 기술된다.

형질 전환은 DNA가 염색체 외 요소 또는 염색체 통합물로서 복제 가능하도록 DNA가 유기체에 도입되는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 변형은 그러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 형질 전환을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에서 추가로 기술된다.

CD99을 생산하는 데 사용되는 원핵 숙주 세포는 문헌[Sambrook 등, supra]에 일반적으로 기재된 바와 같이 배양될 수 있다. CD99를 생산하는 데 사용되는 포유류 숙주 세포는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 다양한 배지에서 배양될 수 있으며, 그 중 일부는 본원에서 기술된다. 본원에서 언급된 숙주 세포는 숙주 동물 내에 존재하는 세포뿐만 아니라 시험관 배양물 중의 세포를 포함한다.

CD99의 정제는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있으며, 그 중 일부는 본원에서 기술된다. 정제된 CD99는, 파지 디스플레이 클론의 친화성 크로마토그래피 분리에 사용하기 위해 아가로오스 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 비드, 셀룰로오스, 다양한 아크릴 공중합체, 히드록시메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 공중합체, 나일론, 중성 및 이온 담체 등과 같은 적합한 매트릭스에 부착될 수 있다. 매트릭스에 대한 CD99 단백질의 부착은 문헌[Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)]에 기재되어 있는 방법으로 수행할 수 있다. 단백질 리간드를 폴리사카라이드 매트릭스, 예를 들면 아가로오스, 덱스트란 또는 셀룰로오스에 부착시키는 데 일반적으로 사용되는 기술은, 시아노겐할라이드로 담체를 활성화시킨 후 펩티드 리간드의 1차 지방족 또는 방향족 아민을 활성화된 매트릭스에 커플링시키는 것을 포함한다.

대안적으로, CD99는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는 데 사용되거나, 흡착 플레이트에 부착되거나 세포 분류에 사용된 세포에서 발현되거나, 또는 스트렙타비 딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 바이오틴에 접합되거나, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 공지된 임의의 다른 방법에 사용될 수 있다.

파지 라이브러리 샘플은 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는 데 적합한 조건 하에서 고정화된 CD99와 접촉시킨다. 통상적으로, pH, 이온 세기, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체 상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌[Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 88:7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산으로, 또는 예를 들어 문헌[Marks 등, J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991))]에 기재된 바와 같이 알칼리로, 또는 예를 들어 문헌[Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 항원 경쟁과 유사한 방법으로 CD99 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 한 차례의 선택으로 20-1,000배 농후화될 수 있다. 더욱이, 농후화된 파지는 박테리아 배양물 중에서 성장시켜서 추가로 여러 차례의 선택을 거칠 수 있다.

선택 효율은 세척 중의 해리 동역학(kinetics) 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편이 동시에 항원과 결합할 수 있는지 여부를 포함하는 많은 요인에 의존한다. 단시간 세정, 다가 파지 디스플레이 및 고체상의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용하여 고속 해리 동역학(및 약한 결합 친화성)을 갖는 항체를 유지할 수 있다. 고밀도는 다가 상호 작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라 해리된 파지의 리바인딩을 선호하다. 저속 해리 동역학(및 우수한 결합 친화성)을 갖는 항체의 선택은 문헌[Bass 등, Proteins 8:309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 장시간 세척 및 1가 파지 디스플레이와 문헌[Marks 등, Biotechnol . 10:779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 낮은 항원 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.

CD99의 경우 약간 다른 친화성을 가지면서도 다양한 친화성을 가진 파지 항체를 선택할 수 있다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이(예를 들어, 상기 기술된 친화성 성숙 기술 중 일부에서 수행되는 것과 같은)는 다수의 돌연변이체, 항원에 대한 대부분의 결합, 및 소수의 보다 높은 친화성을 야기할 수 있다. CD99를 제한함으로써, 희귀의 고친화성 파지를 경쟁시킬 수 있다. 더 높은 친화성의 모든 돌연변이체를 유지하기 위해, 파지는 과량의 비오티닐화된 CD99와 함께 배양될 수 있지만, CD99의 표적 몰 친화성 계수보다 낮은 몰 농도의 농도로 바이오티닐화된 CD99와 함께 배양될 수 있다. 이어서 고친화성 결합 파지는 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드에 의해 캡쳐될 수 있다. 이러한 "평형 캡쳐"는 낮은 친화성을 가진 매우 많은 과량의 파지로부터 2배 정도의 적은 고친화성을 가진 돌연변이 클론의 분리를 허용하는 감도로 그들의 결합 친화도에 따라 항체가 선택되도록 한다. 고상에 결합된 파지를 세척하는 데 사용되는 조건은 또한 해리 동역학에 기초하여 판별하도록 조작될 수 있다.

CD99 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 전술한 바와 같이 파지 라이브러리로부터 CD99 클론을 단리하고, 선택적으로 적합한 박테리아 숙주에서 개체군을 성장시켜 파지 클론의 단리된 집단을 증폭시키는 단계; (2) 블로킹 및 비블로킹 활성이 각각 요구되는 CD99 및 제2 단백질을 선택하는 단계; (3) 고정된 CD99에 항-CD99 파지 클론을 흡착시키는 단계; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정기와 중첩되거나 공유되는 CD99 결합 결정기를 인식하는 바람직하지 않은 클론을 용출시키는 단계; 및 (5) 단계(4) 후에 흡착 유지된 클론을 용출시키는 단계. 선택적으로, 원하는 블로킹/비블로킹 특성을 갖는 클론은 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 더욱 농후화될 수 있다.

본 발명의 하이브리도마-유래 단일클론 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여(예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 목적하는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭하도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열화된다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 이 벡터는 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. coli 세포, 유사 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질 감염되어 재조합 숙주 세포에서 목적하는 단일클론 항체의 합성을 얻을 수 있다. 항체-코딩 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 관한 검토 논문에는 문헌[Skerra 등, Curr . Opinion in Immunol . 5:256 (1993)] 및 문헌[Pluckthun, Immunol . Revs. 130:151 (1992)]이 포함된다.

본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지된 DNA 서열(예를 들어, 적절한 DNA 서열은 Kabat 등의 상기 문헌으로부터 얻을 수 있다)과 조합되어 전체 또는 부분 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고 그러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 이해할 것이다. 하나의 동물(인간과 같은) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드", 전체 길이 중쇄 및/또는 경쇄(들)에 대한 코딩 서열을 형성하는 Fv 클론은 본원에서 사용되는 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론을 인간 불변 영역 DNA에 융합시켜 모든 인간, 전체 또는 부분 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.

본 발명의 하이브리도마 유래의 항-CD99 항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 하이브리도마 클론 유래의 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 치환함으로써 변형될 수 있다(예를 들어, Morrison 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)의 방법에서와 같음). 하이브리도마 또는 Fv 클론-유도된 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 면역 글로불린 코딩 서열에 비-면역 글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유도된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

본 발명은 또한 항체가 비인간 동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 함유하는 항-CD99 항체의 키메라 유도체를 고려한다. 키메라 항체 분자는 예를 들어 마우스, 래트, 카멜리드 또는 다른 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인과 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근법이 개시된 바 있으며, AML 및/또는 MDS 세포의 표면에서 CD99의 세포외 도메인을 인식하는 면역 글로불린 가변 영역을 함유하는 키메라 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 81:6851 (1985); Takeda 등, Nature 314:452 (1985); Cabilly 등, 미국 특허 제4,816,567 호; Boss 등, 미국 특허 제4,816,397 호; Tanaguchi 등, 유럽 특허 공보 EP171496, 유럽 특허 공보 10 0173494, 영국 특허 GB 2177096B 및 PCT 특허 공보 WO 2013/064700]을 참고할 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 인용된다.

특정 양태에서, 본 발명의 범위 내의 항-CD99 항체는 Fab, Fab' 및 F(ab')2', Fd, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 다이설파이드-결합된 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단편과 같은 인간 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 단쇄 항체를 포함하는 CD99-결합 항체 단편은 가변 영역을 단독으로 또는 힌지 영역, C_H1, C_H2, C_H3 및 C_L 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한 힌지 영역, C_H1, C_H2, C_H3 및 C_L 도메인을 갖는 가변 영역(들)의 임의의 조합을 함유하는 CD99-결합 단편이 포함된다. 항체는 인간, 마우스, 쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭일 수 있다. 본원에서 사용된 "인간" 항체는 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역 글로불린 라이브러리, 인간 B 세포 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린을 형질 전환 발현시키는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 카멜리드 항체의 생성은 예를 들어, PCT 특허 공보 WO 2013/064700에 기재되어 있다.

본원에 개시된 바와 같이, 본 방법에 적합하게 사용될 수 있는 항-CD99 항체는 AML 및/또는 MDS 세포 표면 상에 항체-결합 CD99의 응집, 클러스터링 및/또는 캡핑을 촉진시키는 특성 중 적어도 하나가 확인될 수 있는 것들이다. 따라서, 항체-결합 CD99의 응집, 클러스터링 및/또는 캡핑과 같은 특성은 이중 또는 다중 특이성 항-CD99 항체를 사용함으로써 향상될 수 있음을 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이성 항체" 및 "이작용성 항체" 각각은 제1 에피토프, 항원 또는 합텐에 대해 특이적인 적어도 하나의 제1 항원 결합 부위와, 제2 에피토프, 항원 또는 합텐에 특이적인 하나 이상의 제2 항원 결합 부위를 포함함으로써 CD99 세포외 도메인 상의 2개의 상이한 항원 에피토프를 인식하는 항체를 나타낸다.

이러한 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 생성된 항체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이중 특이성 항체는 2개의 상이한 CD99 에피토프를 인식할 수 있는 모든 항체 또는 항체의 접합체, 또는 항체의 중합체 형태를 포함한다. 이중 특이성 항체는 그들의 2가 특성을 유지하도록 환원되고 개질된 항체 및 CD99에 대해 다수의 항원 인식 부위를 가질 수 있도록 화학적으로 결합된 항체를 포함한다.

비제한적인 예로서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 이중 특이성 항체는 본원에 기술된 CD99 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있고 2개 이상의 그러한 CD99 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 한 특이성은 낮은 친화성, 예를 들어 약 10^-9 미만의 결합 상수, 통상적으로 약 10^-8 미만의 결합 상수를 갖고, 약 10^-7 이상의 결합 상수를 가질 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하기에 적합한 항체는 이중 특이성, 삼중 특이성 또는보다 큰 다중 특이성일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 방관자 세포로서의 과립구(호중구), NK 세포 및 CD4+ 세포에 대한 독성 위험이 낮을 수 있다.

이중 특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전체 길이의 이중 특이성 항체의 통상의 제조 방법은 2개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다[참고: Millstein 등, Nature 305:537-539 (1983)]. 상기 사슬들은 하기에 기재된 바와 같이 하나의 링커로 연결될 수 있다. 적절하고 일반적으로 사용되는 링커는 (GGGGS)₃이다.

면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마스)는 상이한 항체 분자의 혼합물을 생성한다. 항-CD99 에피토프 결합 특이성의 목적하는 조합을 갖는 항체의 정제는 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행될 수 있다. 관련된 단리 공정은 문헌[PCT 공개 번호 WO 1993/08829 및 Traunecker 등, EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

이중 특이성 항체는 AML 및/또는 MDS 세포 표면에서 발현되는 CD99의 응집이 증진되도록 2개의 가변 영역, 제1 CD99 에피토프에 특이적인 제1 가변 영역과 제2 CD99 에피토프에 특이적인 제2 가변 영역을 결합하여 생성시킬 수 있다. 이러한 이중 특이성 항체는 문헌[Bassan, Blood 120 (26):5094-5095 (2012)]에 기재된 단쇄 이중 특이성 T 세포 관여 항체(BiTE®)와 유사할 수 있으며, CD19x CD3 BiTE 항체인 블리나투모맙(blinatumomab)을 예로 들 수 있다[참고: Topp 등, Blood 120 (26):5185-5187 (2012) 및 Loffler 등, Blood 95 (6):2098-2103 (2000)].

BiTE® 항체는 단일 펩티드 사슬에 구조 V_L1-V_H1-V_H2-V_L2를 가지며 글리신-세린 링커에 의해 결합된 2개의 상이한 단쇄 Fv 단편으로 구성된다. BiTE 항체 작제물은 일반적으로 크기가 약 60-kDa이며, 포유 동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현될 수 있으며, 재생을 필요로 하지 않는 완전한 활성 형태로 고수율로 분비되고, C-말단 히스티린 태그에 의해 정제될 수 있다. BiTE® 항체는 10~100 pg/ml의 매우 낮은 농도와 2:1 정도로 낮은 주효 세포와 표적 세포 비율에서 높은 수준의 세포 독성 활성을 나타내도록 디자인될 수 있다.

항체 V 경쇄(VL) 및 V 중쇄(VH) 도메인은 표준 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 방법에 따라 클로닝될 수 있다. cDNA는 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소에 의해 합성될 수 있으며, V 도메인은 프라이머 5'L1 및 3'K 측면 VL 도메인과 문헌[Dubel 등, J. Immunol . Methods 175 : 89-95 (1994)]에 기재된 프라이머를 기반으로 한 중쇄의 5'H1 및 3'G에 의해 PCR을 통해 증폭된다.

VL 및 VH 영역은 올리고 뉴클레오티드 프라이머 쌍 5'VLB5RRV(AGGTGTACAC TCCGATATCC AGCTGACCCA GTCTCCA)/3'VLGS15 (GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC) 및 5'VHGS15 (GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCTCAGGT(GC)(AC)A(AG)C TGCAG(GC)AGTC (AT)GG)/3'VHBspE1 (AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCT TGGCCCCAG)를 사용하여 VL- 및 VH-특이성 PCR을 위한 주형으로서 별도의 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 중첩 상보 서열은 후속적인 융합 PCR 동안 결합하여 15-아미노산(G₄S₁)₃ 링커의 코딩 서열을 형성하는 PCR 산물에 도입될 수 있다. 이 증폭 단계는 프라이머 쌍 5'VLB5RRV/3'VHBspEa로 수행할 수 있으며, 생성된 융합 생성물(scFv 단편)은 제한 효소(예: EcoRV 및 BspE1)로 절단하여 플라스미드 벡터 (예: 블루스크립트 KS 벡터; Stratagene, La Jolla, CA)에 클로닝될 수 있다. 생성된 이중 특이성 단쇄 항체는 발현 벡터(예를 들어, pEF-DHFR)에 서브 클로닝되고, 예를 들어 전기천공법 및 선별에 의해 CHO 세포에 형질감염될 수 있다. 이중 특이성 항체는 문헌[Mack 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 92:7021-7025 (1995)]에 기술된 바와 같이 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 그의 C-말단 H 테일을 통해 정제될 수 있다.

PCT 공보 번호 제WO 1996/27011호에 개시된 또 다른 접근에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이에 계면은 재조합 세포 배양액으로부터 회수된 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 설계될 수 있다. 이러한 계면은 항체 불변 도메인 중 C_H3　도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 방법에 의해, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1종 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일 또는 유사 크기의 상보적 "캐비티"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 원하지 않는 다른 부-생성물보다 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다. 교호적 방법으로 2개의 상이한 단일 사슬 가변 영역을 열 안정성 항원 (HSA)에 연결한다. HSA를 링커로서 사용하여 혈청 반감기를 증가시키고 낮은 면역원성의 혜택을 받는다.

이중 특이성 항체는 가교결합된 또는 "이형접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이형접합에서 항체 중 하나는 아비딘에, 또 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체들은 면역 체계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하도록 제안되어 왔고(미국 특허 번호 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안되어 왔다 (PCT 공보 번호 제WO 1991/100360호 및 제WO 1992/200373호 및 유럽 특허 번호 제EP 03089호). 이형접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 적당한 가교결합제는 많은 가교결합 기술과 함께 당업계에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 번호 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중 특이성 항체를 생성하는 기술이 또한 상기 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어 이중 특이성 항체는 화학적 연결(chemical linkage)을 통해 제조될 수 있다. 문헌 [Breunanet et al, Science 229:81 (1985)]에서는, 온전한 항체가 단백질 가수분해로 절단되어 F(ab')2 단편을 발생시키는 절차를 개시한다. 이러한 단편들은 디티올 착화제 소듐 아르세나이트의 존재하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자 사이에 디술피드 형성을 방지한다. 이어서 발생된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 다시 전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중 특이성 항체를 형성한다.

재조합 세포 배양액으로부터 이중 특이성 항체 단편을 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 개시되어 있다. 예를 들어, 이중 특이성 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되어 왔다. 문헌[Kostelny et al, J. Immunol . 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체를 경첩 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하고 이어서 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성을 위해 사용될 수 있다.

문헌[Hollinger et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 90:6444-6448 (1993)]에 개시된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중 특이성 항체 단편을 만들기 위한 교호적 메카니즘을 제공한다. 상기 단편들은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 결찰된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 이때 상기 링커는 너무 짧아서 상기 두 개의 도메인을 동일한 쇄 상에서 쌍을 이루게 할 수 없다. 따라서, 하나의 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적 V_L 및 V_H 도메인과 억지로 쌍을 이루도록 되어서 2개의 항원-결합 부위를 형성한다.

단일 사슬 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의해 이중 특이성 항체 단편을 만들기 위한 또 다른 전략이 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al, J. Immunol . 152:5368 (1994)] 참고. 대안적으로, 항체는 문헌[Zapata et al, Protein Eng . 8(10): 1057-1062 (1995)]에 개시된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 간략하게, 이러한 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 F_d　세그먼트 (V_H"C_HI-V_H"C_HI)를 포함한다. 선형 항체는 이중 특이성 또는 단일 특이성일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 항-CD99 항체는 단일클론 항체 및 다클론 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab 및 F(ab')2), 키메라 항체, 이작용성 또는 이중 특이성 항체 및 사량체 항체 복합체를 포함하는 것으로 이해된다.

항체는 세포의 표면에서, 만약 항체가 적당한 친화력 (결합상수)으로, 예를 들어 10⁷M^-1 이상의 큰 친화력으로 결합한다면, CD99에 대해 반응성인 것으로 이해된다. 부가적으로, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 항체는 또한 그들의 결합 친화력 면에서 5x10^-2M, 10^-2M, 5x10^-3M, 10^-3M, 5x10^-4M, 10^-4M, 5x10^-5M, 10^-5M, 5x10^-6M, 10^-6M, 5x10^-7M, 10^-7M, 5x10^-8M, 10^-8M, 5x10^-9M, 10^-9M, 5x10^-10M, 10^-10M, 5x10^-11M, 10^-11M, 5x10^-12M, 10^-12M, 5x10^-13M, 10^-13M, 5x10^-14M, 10^-14M, 5x10^-15M, 및 10^-15M 미만의 해리상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함하는 것으로 개시되거나 구체화될 수 있다.

항체는 종래의 기술을 사용하여 단편화될 수 있고 그 단편들은 전체 항체에 대해 상기 개시한 바와 동일한 방식으로 결합 활성에 대해 선별될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생길 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편은 디술피드 가교를 환원하도록 처리되어 Fab' 단편을 생성할 수 있다.

화학적 접합은 E-아미노기 또는 경첩 영역 티올 기를 갖는 동종- 및 이종-이작용성 시약을 사용하는 것을 기본으로 한다. 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DNTB)과 같은 동종 이작용성 시약은 2개의 Fab 사이에 디술피드 결합이 생기게 하고, O-페닐렌디말레이미드 (O-PDM)는 2개의 Fab 사이에 티오에테르 결합이 생기게 한다. 문헌[Breuner et al., (1985) and Glennie et al., (1987)] 참조. N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종 이작용성 시약은 항체의 노출된 아미노 기와 Fab 단편을 계통이나 아이소타입과 무관하게 결합한다. 문헌[Van Dijk et al., (1989)] 참조.

펩티드 또는 폴리펩티드 링커가 또한 사용될 수 있으며, 특히 항체의 Fc 도메인의 경첩 영역을 닮은 것이 사용될 수 있으며, 다만 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 부류의 링커의 내용에 대해 그 전문이 참고로 포함된 미국 특허 번호 제7,928,072호를 참조한다. 본 발명의 항-CD99 항체, 즉 CD99를 발현하는, AML 및/또는 MDS뿐 아니라 AML 및/또는 MDS 줄기 세포, 예컨대 백혈병 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포를 치료하기에 유용한 항체는, 변형된, 즉 항체에 임의의 유형의 분자가 공유 접착됨으로써 변형된 유도체를 포함하여, 공유 접착은 항체가 CD99의 세포외 도메인 상에 그의 동족성 에피토프에 결합되는 것을 막지 못한다. 예를 들어, 항체 유도체는 변형된, 예를 들어 당화, 아세틸화, PEG화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차폐기에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결에 의해 변형된 항체를 포함할 수 있다. 수많은 화학적 변형 중 어떠한 것도 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하는 (이에 제한되는 것은 아님) 공지의 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 유도체는 하나 이상의 색다른(non-classical) 아미노산을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 항-CD99 항체는 하나 이상의 세포독성 화합물에 접합되어 항체 세포독성을 한층 더 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 약물 접합(Antibody Drug Conjugates; ADC)은 세포독성 페이로드(payload) 또는 약물에 불안정한 결합을 갖는 안정한 화학적 링커를 통해 결합된 항체(전체 mAb 또는 단일-사슬 가변 단편 [scFv]과 같은 항체 단편)로 구성된 바이오접합/면역접합의 형태이다. 항-CD99 항체의 CD99-결합과 세포독성 활성을 세포독성 약물의 암-사멸 능력과 결합함으로써, 항체-약물 접합체는 세포독성 약물의 전체적인 세포독성 활성과 표적 특이성을 향상시킨다. 이러한 표적화로 인해, 세포독소는 감소된 부작용을 나타내고 항체는 추가로 향상된 치료 범위를 나타낸다.

세포독소는 항체와 세포독소 사이에 안정한 연결을 통해 항-CD99-항체에 커플링될 수 있다. 링커는 디술피드, 히드라존, 또는 펩티드(절단가능한), 또는 티오에테르(절단가능하지 않은)를 포함한 화학적 단위를 기본으로 하여 세포독성제가 표적 세포로 분포하고 전달되는 것을 제어할 수 있다. 절단가능한 유형과 절단가능하지 않은 유형의 링커가 전임상 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴은 효능있고 매우 독성이 높은 항미세관 모노메틸 오리스타틴 E 또는 MMAE (Monomethyl auristatin E), 합성 항신생물제(antineoplastic agent)를 인간 특이성 CD30-포지티브 악성 세포로 전달하는 효소-민감성 절단가능한 링커를 포함한다. 그의 높은 독성 때문에, 투불린의 중합을 블록킹함으로써 세포 분할을 억제하는 MMAE는, 단일-제제 화학요법 약물로서 사용될 수 없다. 항-CD30 단일클론 항체에 연결된 MMAE의 조합은 세포외액 안에서 안정하고 생체내에서 카텝신에 의해 절단가능하며, 따라서 치료를 위해 안전하다. 다른 승인된 ADC인 트라투주맙 엠탄신은 안정하고 절단불가능한 링커에 의해 접착된, 미세관-형성 억제제 머탄신 (DM-1), 메이탄신(Maytansine)의 유도체 및 항체 트라스투주맙 (Herceptin®/Genentech/Roche)의 조합이다.

절단가능하거나 절단불가능한 링커의 유형은 세포독소에 대해 특이적 특성을 부여한다. 예를 들어, 절단불가능한 링커는 약물을 세포 안에서 유지한다. 결과적으로 전체 항체, 링커 및 세포독소는 표적화 세포로 들어갈 수 있고, 그 표적화 세포 안에서 항체가 그의 구성 아미노산으로 분해된다. 생성된 아미노산, 링커 및 세포독소는 이로써 활성화된다. 대조적으로 절단가능한 링커는 생체내에서 효소적으로 절단되어 세포독소를 방출한다. 세포독소는 표적화된 세포를 빠져 나와 이웃하는 세포를 사멸시킬 수 있다.

AML 및/또는 MDS 세포의 표면상에 발현된 CD99의 항-CD99- 매개된 응집, 집락 화, 및/또는 캡핑의 검출

특정 측면에서, 본 발명은 AML 및/또는 MDS 세포의 표면상에 발현된 CD99의 항-CD99-매개된 응집, 집락화, 및/또는 캡핑을 검출하기 위한 영상 방법을 제공한다.

예를 들어, 면역형광법을 활용하여 세포의 표면 상에 CD99를 검출하고 위치를 알아낼 수 있다. AML 또는 MDS 세포를 3 내지 6 시간 동안 항-CD99 단일클론 항체와 함께 배양한 후, 파라포름알데히드로 고정시키고, 그의 아이소타입에 따라 항-CD99 항체의 불변 도메인에 결합하는 플루오로크롬 표지된 2차 항체를 부가한다. 이어서 세포를 슬라이드 상에 고정시키고 동일초점 현미경 또는 시야가 넓은 현미경을 사용하여 영상화하게 된다. 이러한 기술을 사용하여, 세포의 표면 상의 CD99 분자를, 상이한 항-CD99 항체를 부가하여 응집, 집락화, 및/또는 캡핑에 대해 평가할 수 있다.

그 밖에 방법을 당업계에서 쉽게 가져와서 항체 결합된 CD99의 항-CD99-매개된 응집, 집락화, 및/또는 캡핑을 검출하는데 활용할 수 있고, 예컨대 유세포 측정 방법을 항체 결합된 CD99의 동일초점-형 영상화에 사용할 수 있다. 예를 들어, 암니스(Amnis)(미국 워싱턴주 시애틀 소재)는 고성능 시스템 (FlowSight®)을 제공하는데, 이는 명시야, 암시야를 동시에 생성하기 위한 12개의 표준 검출 채널 및 각각의 세포의 형광 이미지의 10개의 채널을 포함한다.

CD99의 높은 발현을 나타내는 AML 및/또는 MDS 세포의 항-CD99- 매개된 세포독성 및 세포사멸의 검출

다른 측면에서, 본 발명은 항-CD99-매개된 세포사멸 AML 및/또는 MDS 세포를 검출함으로써 AML 및/또는 MDS 세포에서 항-CD99 항체의 세포독성을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 시험관내 AML 또는 MDS 세포주 또는 1차 환자 샘플에 대해 항-CD99 항체의 세포독성을 시험하기 위해, 세포를 항-CD99 항체와 함께, 무혈청(1차 환자 샘플의 경우) 또는 상보성-비활성화된 혈청을 함유하는 배지 안에서 배양할 수 있다. 1차 환자 샘플의 경우, 배지는 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴, IL-3 및 IL-6을 포함한 시토카인으로 보충할 수 있다. 항체 투여량은 100 ng/ml 내지 20 ㎍/ml의 범위에 걸쳐 적정할 수 있다. 72시간 후, 생존 세포의 절대적 개수는 생존 배제 염료로서 트라이팬 블루를 사용하여 혈구계로 하는 수동 세포 계수, 또는 생존 배제 염료로서 프로피듐 요오다이드 또는 DAPI를 사용하여 단일 비드-증진된 사이토플루오로메트리 (Montes et al, J. Immunol . Methods 317:45 (2006))에 의해 셀 수 있다.

시험관 내 세포사멸에 대해 평가하기 위해, 상기 개시한 것과 동일한 실험적 셋-업을 다만 단시간에 걸쳐(8 내지 24 시간) 사용할 수 있다. 이러한 시간 동안, 항-CD99 항체에 의한 세포사멸의 유도를 유세포 측정법에 의해 평가될 때 아넥신(Annexin) V/7-AAD 염색에 의해 평가할 수 있고, 아넥신 V+ 7-AAD- 세포는 초기 사멸 세포를 나타내고 아넥신 V+ 7-AAD+ 세포는 후기 사멸 세포를 나타낸다. 사멸 세포는 또한, 세포의 고정 및 투과화 후 활성화 카스파제 3을 검출하는 플루오로크롬 접합된 항체로 세포내 염색에 의해 검출할 수 있다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물 및 제형

본 발명은 높은 수준의 CD99 유전자 발현과 관련된 AML 및/또는 MDS의 치료를 위한 하나 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 치료 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나 이상의 항-CD99 항체를 약제학적 조성물로서, 본원에 개시된 바와 같은 AML 및/또는 MDS를 치료 또는 개선시키기 위한 투여량으로, 환자에게 투여할 수 있으며, 여기서 각각의 항체가 적당한 담체 또는 부형제와 함께 혼합된다. 항-CD99 항체의 혼합물을 또한 약제학적 조성물로서 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명의 범위 안에서 조성물은, 치료제가 항-CD99 항체인 조성물을, (1) AML 및/또는 MDS와 관련된 세포의 표면 상에 나타난 CD99의 세포외 도메인을 결찰하고, (2) AML 및/또는 MDS 세포 상에 결찰된 CD99의 집락화 및 응집을 매개하고, (3) 예를 들어 항체 결찰된 세포 상에 세포사멸을 유도함으로써, AML 및/또는 MDS 세포 상에 항체 결찰된 CD99의 세포독성을 촉진시키는 데 유효한 양으로 포함한다.

각각의 성분의 유효량의 최적 범위를 결정하는 것은 당업계의 기술 범주 안에 있다. 유효량은 사용된 특이성 항-CD99 항체뿐만 아니라 환자의 연령 및 임상적 상태를 포함한 많은 인자의 함수이다. 투여된 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 있다면 동시치료의 종류, 치료 빈도, 및 원하는 효과의 속성에 달려 있을 것이다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "비경구 투여"란 용어는 보통 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 낭밑, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물은 예를 들어, 정맥내 푸시(intravenous push) 또는 대량 정맥내 주입(intravenous bolus)을 통해 정맥내로 투여할 수 있다. 대안적으로, 항-CD99 항체를 포함하는 조성물은 정맥 주입을 통해 투여할 수 있다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물의 정맥내 주입을 위한 적당한 투여량은 약 2 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 10 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 20 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 50 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 100 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 200 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day 또는 약 500 mg 이상의 항-CD99 항체/m2/day의 투여량을 포함한다.

하나 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가의 화합물, 예컨대, 예를 들어, AML 및/또는 MDS의 치료를 위한 화학요법 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, AML을 위한 유도 화학요법은 시타라빈 (ara-C) 및 안트라시클린, 예컨대 다우노루비신 또는 이다루비신을 포함할 수 있다. 시타라빈은 연속된 7일 동안 연속적인 IV 주입으로서 투여될 수 있는 한편, 안트라시클린은 일반적으로 IV 푸시로서 연속된 3일 동안 투여된다. AML 아형 급성 전골수세포 백혈병은 종종 안트라시클린 및/또는 아르세닉 트리옥시드와 조합된 all-trans-레티노산(ATRA)로 치료된다. 본 발명의 조성물은 또한 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg)과 유사한, 세포독성제에 가교결합된 항-CD99 항체 면역접합체를 포함할 수 있다.

MDS의 경우, 하나 이상의 항-CD99 항체를 조혈 성장 인자(예컨대, 적혈구 형성 인자) 또는 MDS의 치료를 위해 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration; FDA)에서 허가를 받은 5-아자시티딘, 데시타빈 (단독 또는 발프로산과 조합하여) 및 레날리도미드, 3개의 제제 중 하나와 조합하여 사용할 수 있고, 이렇게 하면 무엇보다도 MDS의 염색체 5q 결손 아형뿐만 아니라 다른 MDS의 저-위험 아형을 갖는 환자에게 있어서 적혈구 세포 수혈 필요성을 감소시키는데 효과적이다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물은 일반적으로 치료효과량의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "약제학적으로 허용가능한"이란 용어는 미국연방 정부 또는 주정부의 관리 기관에 의해 허가되거나 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에게 사용하기 위한 기타 일반적으로 인정되는 약전에 목록으로 된 것을 의미한다. "담체"란 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 말한다. 이러한 약제학적 담체는, 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 콩기름, 광유, 참기름 등과 같은 멸균액일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 물이 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액을 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적당한 약제학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.

이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 좌약으로서, 종래의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이드와 함께 제형될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예컨대 약제학 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하도록 치료효과량의 항-CD99 항체를, 바람직하게는 정제된 형태로, 적당량의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

조성물은 인간에게 정맥내 투여를 하도록 맞춰진 약제학적 조성물로서 통상의 절차에 따라 제형될 수 있다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 버퍼 또는 다른 생리학적으로 허용가능한 버퍼 상태의 용액이다. 필요하다면, 상기 조성물은 또한 용해보조제, 및 주사 부위에서 통증을 완화시켜 주는 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 별도로 공급되거나 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 밀폐 용기(hermetically sealed container), 예컨대 활성 시약의 양을 표시한 앰플 또는 작은 봉지 안에 함께 혼합되어 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 주사 또는 멸균을 위한 멸균수의 앰플이, 상기 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 제공될 수 있다.

본원에 개시된 항-CD99 항체는 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 음이온으로 형성된 것, 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 양이온으로 형성된 것을 포함한다.

본 발명의 많은 항-CD99 항체는 약제학적으로 양립가능한 반대이온과의 염 (즉, 약제학적으로 허용가능한 염)으로서 제공될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"이란 수용자에게 투여될 때 직접적으로나 간접적으로 본 발명의 항체 또는 조성물을 제공할 수 있는 임의의 무독성 염을 의미한다.

"약제학적으로 허용가능한 반대이온"은 객체에게 투여시 염으로부터 방출될 때 독성이 아닌 염의 이온성 부분이다. 약제학적으로 양립가능한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 및 숙신산을 포함하는 (단, 이에 제한되지는 않음) 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 그 상응하는 유리 염기 형태보다 물 또는 다른 양성자성 용매에서 더욱 용해도가 높은 경향이 있다. 본 발명의 조성물은 이러한 염을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 예를 들어 CD99+ 종양 세포 (및 CD99+ 종양 줄기 세포)의 자가 골수를 퍼징하지 위해 생체 외에서, 공지된 방법에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Robertson et al, 79:2229-2236 (1992)]을 참조한다.

AML 및 MDS 세포 상에 높은 CD99 발현을 검출하기 위한 방법

본 발명은 높은 CD99 세포 표면 발현을 나타내는 AML 및/또는 MDS 조직 또는 세포에 대한 활성을 촉진하는 세포독성 및/또는 이를 유도하는 세포사멸을 나타내는 항체, 및 그의 조성물뿐만 아니라 하나 이상의 항체 또는 항체 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 CD99 유전자 전사의 상대적 활성 및 CD99 전사의 수준과 아울러 AML 및/또는 MDS 조직 또는 세포의 표면 상에 노출된 CD99 단백질 분자의 상대적 개수를 포함한, 높은 CD99 유전자 발현 정도의 정량화에 의존하는 높은 CD99 발현을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 높은 CD99 발현을 평가하기 위한 예시적인 방법을 본 섹션에서 설명한다.

높은 CD99 유전자 발현은, 예를 들어, 마이크로어레이, 실시간-PCR (RT-PCR)을 포함한 정량적 PCR, 및 직접 RNA 시퀀싱을 포함한 당업계에 잘 공지된 하나 이상의 방법에 의해 결정될 수 있다. 높은 CD99 유전자 발현의 검출을 위한 본원에 개시된 방법은 각각 공통적으로 CD99 유전자에 의해 코딩된 mRNA의 증폭, 혼성화, 및/또는 시퀀싱을 통해 CD99 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "높은 유전자 발현," 특히 용어 "높은 CD99 유전자 발현,"은 내재성 또는 외재성 컨트롤 조직 또는 세포일 수 있는 컨트롤 조직 또는 세포와 비교했을 때 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포에서 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상인 유전자 발현의 수준을 말한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "내재성 컨트롤"이란 비-AML 및/또는 비-MDS 조직 또는 세포와 비교할 때 AML 및/또는 MDS 조직 또는 세포에서 높은 발현을 나타내지 않는, 뉴클레오티드 서열, 전형적으로 유전자 또는 유전자 서열을 말한다. 따라서, 예를 들어 "내재성 컨트롤"은, CD99 유전자가 비-백혈병 조직 샘플 또는 세포와 관계없이 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포에서 높은 발현 수준을 나타내는지 여부를 평가하기 위한 "네가티브 컨트롤"로서 사용될 수 있다.

"내재성 컨트롤"로서 작용할 수 있는 적당한 유전자는 예를 들어 비제한적으로 β-악틴, GAPDH, 및 시클로필린을 포함한다. CD99 유전자 발현 및 내재성 컨트롤 유전자 발현 (즉, 비-CD99 유전자 발현)의 수준을 결정할 수 있고 (예를 들어, CD99 전사물 개수를 정량화함으로써), CD99와 비-CD99 유전자 발현의 비를 유도할 수 있고, 소정의 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포 안에서 CD99 유전자 발현의 수준이 CD99와 비-CD99 유전자 발현의 비 차원으로 표현될 수 있고, 이때 소정의 문턱 비(threshold ratio)보다 큰 비가 높은 CD99 유전자 발현을 나타낸다.

대조적으로 본원에서 사용될 때, 용어 "외재성 컨트롤"은 비-AML 및/또는 비-MDS 조직 또는 세포로부터 CD99 유전자 또는 유전자 서열을 말하고, 이러한 CD99 유전자 또는 유전자 서열은 비-AML 및/또는 비-MDS 조직 또는 세포에서 높은 발현을 나타내지 않고 상응하는 AML 및/또는 MDS 조직 또는 세포에서 높은 발현에 대해 시험된다. 따라서, 예를 들어, "외재성 컨트롤"은 CD99 유전자가 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포에서 높은 발현 수준을 나타내는지 여부를, AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포에서 발현 수준(예를 들어, mRNA 전사의 개수)을 상응하는 비-AML 및/또는 비-MDS 조직 샘플, 예컨대 정상 공여자로부터 조직 샘플, 또는 비-AML 및/또는 비-MDS 세포, 예컨대 CD34⁺　비-AML 및/또는 비-MDS 세포와 비교함으로써 평가하기 위한 "네가티브 컨트롤"로서 사용될 수 있다.

높은 CD99 유전자 발현은 또한 AML 및/또는 MDS 환자로부터 소정의 조직 샘플에서, 세포의 총 개수에 상대적인 모세포 (즉, AML 및/또는 MDS 세포)의 백분율 또는 분율을 기준으로 하여 평가될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 예를 들어 AML 및/또는 MDS 조직 샘플에서 CD99-연관된 전사물의 개수는 AML 및/또는 MDS 조직 샘플에서 모세포의 역백분율 또는 역수로 정량화되고 이것을 곱할 수 있다. 이어서 CD99 유전자 발현을 위한 문턱 전사물 개수에 상대적인 생성된 CD99 전사물 개수를 평가하고, 이러한 평가를 기본으로, 항-CD99 항체, 또는 그의 유도체의 투여를 포함하는 치료법에 대한 AML 및/또는 MDS 환자의 반응성이 예상될 수 있다. 더욱 구체적으로, 이러한 방법에 의해, 문턱 전사물 개수보다 큰 CD99 유전자 발현에 대한 전사물 개수로 이러한 치료 요법의 치료 효능을 예측할 것이다.

높은 CD99 유전자 발현의 측정은 예를 들어 (1) AML 및/또는 MDS 환자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA를 정량화하고; (2) 비-AML 및/또는 비-MDS 컨트롤 공여자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 수준을 정량화하고; (3) AML 및/또는 MDS 환자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 수준을 컨트롤 공여자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 수준과 비교함으로써 달성할 수 있다. 컨트롤 공여자 조직 샘플에서 CD99 mRNA와 비교했을 때 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 높은 수준은, 본원에 개시된 구조적 및/또는 기능적 특성을 나타내는 항-CD99 항체로 치료하는 것에 대한 AML 및/또는 MDS 환자의 민감성을 나타낼 것으로 판단된다.

대안적으로, 높은 CD99 유전자 발현은 (1) AML 및/또는 MDS 환자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA 수준을 정량화하고; (2) AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플에서, 비-CD99 mRNA, 예컨대, 예를 들어, GAPDH 또는 악틴의 수준을 정량화하고; (3) AML 및/또는 MDS 환자의 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 수준을 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플에서 비-CD99 mRNA의 수준과 비교하여 시험될 수 있다. AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플에서 비-CD99 mRNA와 비교할 때 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플에서 CD99 mRNA의 높은 수준은, 본원에 개시된 바와 같은 항-CD99 항체로 치료하는 것에 대한 AML 및/또는 MDS 환자의 민감성을 나타낼 것으로 판단된다.

이들 방법의 특정 측면에서, CD99 mRNA는 조직 샘플에서 CD99 mRNA에 대해 특이성인 프라이머 쌍으로 mRNA를 증식시킴으로써, AML 및/또는 MDS 환자로부터 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포인지, 비-AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포인지, 또는 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 공여자로부터 조직 샘플 또는 세포인지를, 정량화할 수 있다(표 2A 참조). 마찬가지로, 비-CD99 mRNA는 조직 샘플에서 비-CD99 mRNA에 대해 특이성인 프라이머 쌍으로 RNA를 증식시켜 AML 및/또는 MDS 환자로부터 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포인지, 비-AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포인지, 또는 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 공여자로부터 조직 샘플 또는 세포인지를 정량화할 수 있다. 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하되, 여기서 mRNA가 CD99 RNA이든지 비-CD99 mRNA이든지 간에, 정방향 프라이머는 mRNA의 5' 말단을 향해 혼성화되고, 상기 후방향 프라이머는 mRNA의 3' 말단을 향해 혼성화된다.

CD99 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 대한 뉴클레오티드 서열의 예를 표 2A에 나타내고, 상응하는 수탁 번호 및 서열 확인번호도 같이 나타낸다.

표 2A

높은 CD99 유전자 발현이 일어난 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포를 확인하게 위해, mRNA는 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포로부터 및 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 조직 샘플 또는 세포로부터 단리될 수 있고, 소정의 mRNA의 발현의 수준이 결정될 수 있고, 높은 유전자 발현의 평가가 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포에 대해 그리고 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 조직 샘플 또는 세포에 대해 결정된 mRNA 수준을 비교하여 이루어질 수 있다.

대안적으로, 높은 CD99 유전자 발현이 일어난 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포는, mRNA를 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포로부터 단리시키고, CD99 mRNA 및 컨트롤 mRNA의 수준을 결정하고, 백혈병 조직 샘플 또는 세포 안에서 CD99 mRNA 및 컨트롤 mRNA 수준을 비교하여 mRNA 발현의 비를 결정함으로써, 높은 유전자 발현을 평가하여 식별될 수 있고, 이때 컨트롤 mRNA 수준에 상대적인 CD99 mRNA 수준의 높은 비는 높은 수준의 CD99 유전자 발현을 나타낸다. 이러한 맥락에서 사용될 때, 컨트롤 mRNA는 AML 및/또는 MDS 조직 또는 세포에서 높은 발현 수준을 나타내지 않는 유전자로부터의 mRNA를 말한다. 적당한 컨트롤 mRNA는 예를 들어 β-악틴, GAPDH, 및 시클로필린을 포함한다.

적당한 AML 및/또는 MDS 조직 샘플은 예를 들어, AML 및/또는 MDS 환자로부터 혈액, 림프절, 골수, 및/또는 종양 생검 샘플을 포함한다. 적당한 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 조직 샘플은 예를 들어 비-AML 및/또는 MDS 공여자로부터, 예컨대 건강하고 질병이 없는 공여자로부터 혈액, 림프절, 및/또는 골수 샘플을 포함한다. 비-AML 및/또는 MDS 공여자로부터 이러한 혈액, 림프절, 및/또는 골수 샘플은 전형적으로 CD34⁺ 세포를 함유한다. 공여자 조직 샘플 또는 세포의 정확한 속성 또는 공급원과 상관없이, 공여자 조직 또는 세포는 CD99 유전자의 높은 발현을 나타내지 않는 것으로 공지되어 있다는 것이 중요할 것으로 판단된다.

적당한 AML 및/또는 MDS 세포는 예를 들어, 골수모양 전구체를 포함한다. 적당한 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 세포는, 특히 비-AML 및/또는 MDS CD34⁺　컨트롤 세포는, 예를 들어 비-AML 및/또는 MDS 공여자, 예컨대 건강하고 질병이 없는 공여자로부터 골수모양 전구체, 또는 하나 이상의 세포주, 예컨대 Kasumi-1 세포주를 포함한 CD34⁺　세포주를 포함한다. 소스 또는 동질성과 상관없이, 적당한 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 조직 샘플 또는 세포는 높은 수준의 CD99 유전자를 나타내지 않음을 특징으로 할 것으로 파악된다.

AML 세포주

시험된 거의 모든 AML 세포주가 항-CD99 MAb에 반응성이었다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 AML 세포주가 본 발명의 방법에 사용되고, 이때 하나 이상의 세포주는 Kg1a, SET2, Meg1a, THP-1, NB4, AML14, KBM5, AML5Q, KCL22, MOLM14, HL60, K562, U937, KU812, MOLM13, Monomac, 및 NOMO1로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 10a는 항-CD99 항체 12E7와 함께 48 hr 동안 배양 후 세포 성장 억제에 대해 시험된 15개의 AML 세포주의 상대적 세포 개수를 나타내는 막대 그래프이다. 시험된 15개의 AML 세포주 중 11개, 즉 AML 5Q, NB4, KCL22, MOLM13, HL60, MOLM14, NOMO1, U937, MonoMac1, KG1a, 및 AML 14는 12E7 항체와 CD99 결찰 후 성장 억제에 민감한 것으로 밝혀졌다. 시험된 4개의 세포주, 즉 KBM5, SET2, KU812, 및 K562는 12E7 항체와의 CD99 결찰에 대해 비반응성인 것을 특징으로 하였다.

도 10b는 AML 세포주 HL60, K562, KBM5, SET2, 및 KU812 세포 (상단)에서 c-kit 및 CD99의 상대적 발현을 나타내는 유세포 측정 도식 및 IgG1κ 또는 항-CD99 12E7 항체 (하단)과 함께 48시간 배양 후 상대적 세포 개수를 나타내는 막대 그래프를 나타낸다. HL60은 높은 CD99 및 낮은 c-kit 발현을 나타내는, 대표적인 "민감한" 세포주이다. "저항성" 세포주는 CD99을 발현하지 않거나(K562 및 KBM5), 높은 수준의 c-kit를 발현하고(SEM2 및 KU812), Bcr-abl 포지티브 (K562/KBM5/KU812)이거나, JAK2 포지티브이다 (SEM2). 이들 데이터는, 낮은 CD99 발현 또는 높은 c-kit 발현이 항-CD99 항체 12E7에 의해 매개된 세포독성에 대한 저항성의 전조가 됨을 입증한다.

도 10c는 2차 항체의 부재 하에, 항-CD99 항체 12E7, HEC2, DN16, 및 H036의 존재 하에 CD99+ AML 세포의 내피를 통한 이동 역학의 그래프로서, 특정 항-CD99 항체가, CD99에 의해 매개되는 것으로 알려진, AML 세포의 내피를 통한 이동을 억제하지 않는다는 것을 나타내고 있다.

별도의 실험에서, 17개의 AML 세포주가 항-CD99 MAb H036-1.1에 노출되었다. 모든 17개의 AML 세포주는 항-CD99 단일클론 항체 H036-1.1에 대한 반응을 보여주었고, 대부분의 경우 (11/17) 이 반응은 시험된 투여량에서 완벽하였다. 항체 노출 후 세포 개수에서의 감소는 표 2B에 나타낸 바와 같이 2.74배 내지 370.5배 범위이었다.

표 2B

이러한 실험에서, 시험된 모든 17개의 AML 세포주, 즉 Kg1a, SET2, Meg1a, THP-1, NB4, AML14, KBM5, AML5Q, KCL22, MOLM14, HL60, K562, U937, KU812, MOLM13, Monomac, 및 NOMO1는 항-CD99 H036-1.1 항체와의 CD99 결찰 후 성장 억제에 민감한 것으로 밝혀졌다 (Abcam). 시험된 4개의 세포주, 즉 Kg1a, SET2, KCL22, 및 K562는 H036-1.1 항체와의 CD99 결찰에 의한 성장 억제에 대해 부분적으로 반응성인 것으로 밝혀졌다.

CD99 유전자의 높은 발현을 검출하는데 쉽게 맞춰질 수 있는 유전자 발현 수준의 정량화 방법을 이제 더욱 상세히 개시한다.

마이크로어레이 분석

높은 CD99 유전자 발현이 AML 및/또는 MDS 환자 및/또는 컨트롤 공여자 조직 샘플 또는 세포로부터 단리된 RNA의 마이크로어레이 분석에 의해 검출되고 정량화될 수 있다. 그러나, 그의 감도에 대한 한계 때문에, 마이크로어레이 방법은 양이 적은 유전자의 절대적 조직 분포를 정확하게 결정할 수 없거나 시그널 포화(signal saturation)에 기인하여 높은 CD99 유전자 발현의 정도를 너무 적게 잡을 수 있다. 마이크로어레이 발현 프로파일링에 의해 높은 CD99 발현을 나타내는 세포에 대해, 하나 이상의 정량적 PCR 방법, 예컨대, 예를 들어 Taqman™ 프로브 검출을 기본으로 한 RT-PCR (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen Life Sciences)을 사용하여 추가의 분석이 수행될 수 있고, 이는 더 큰 동적 범위의 감도를 제공한다.

간략히, 마이크로어레이 분석은 AML 및/또는 MDS 환자 또는 컨트롤 공여자 조직 샘플 또는 세포로부터 추출된 RNA를, CD99 유전자 안의 코딩 서열 및/또는 비-CD99 유전자 안의 코딩 서열(그 발현이 검출되어야 하고/하거나 정량되어야 함)로 혼성화되는 프라이머 쌍으로 PCR 증폭시키는 것을 포함한다. PCR 생성물을 슬라이드 상에 어레이 형태로 점을 찍고, 각각의 PCR 생성물은 어레이에서 독특한 위치를 차지한다. 이어서 RNA는 역전사하고 형광-표지된 cDNA 프로브가 발생한다. 마이크로어레이를 형광-표지된 cDNA 프로브로 탐색하고, 슬라이드를 스캔하고 형광 강도를 측정한다. 형광 강도의 수준은 혼성화 강도와 상관관계가 있으며, 이는 유전자 발현의 상대적 수준과 상관관계가 있다.

CD99 유전자 발현 분석은 시판중인 마이크로어레이 (예를 들어, U133A chip; 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 Affymetrix) 또는 종래의 마이크로어레이를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 제조사의 설명서에 따라 그리고 문헌[Schena et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 93: 10614-10619 (1996) 및 Heller et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94:2150-2155 (1997)]에 개시된 바와 같이 신테니(Synteni) 마이크로어레이 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 높은 CD99 유전자 발현을 검출할 수 있다. 마이크로어레이 혼성화는 문헌[Abraham et al., Blood 105:794-803 (2005)]에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.

프로브 수준 데이터는 공업용 알고리듬(예를 들어, Affymetrix Microarray Suite 5.0 알고리듬) 또는 종래의 알고리듬을 사용하여 정규화할 수 있다. CD99 유전자 발현 강도 값뿐만 아니라 비-CD99 유전자 발현 강도 값도 시판되는 프로그램 (예를 들어, GeneSpring 7.3.1 GX; 미국 캘리포니아 산타 클라라 소재의 아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies)) 또는 종래의 알고리듬을 사용하여 로그 변환, 중앙값 정규화, 및/또는 분석할 수 있다.

많은 인자들, 예를 들어 GAPDH 3':5' 비 및 악틴 3': 5' 비와 같은 인자를 사용하여 CD99 유전자 발현 분석의 품질을 평가할 수 있다. 열악한 품질 결과를 갖는 샘플이란 약 1.25 초과의 GAPDH 3':5' 비 및/또는 약 3.0 초과의 악틴 3':5' 비를 갖는 것으로 정의될 수 있다.

높은 CD99 유전자 발현은 GeneSpring 안에서 얻을 수 있는 1로부터의 편차를 기본으로 한 크로스-유전자 오류 모델을 적용함으로써 계산된 분산을 사용하여 Welch's ANOVA를 사용하여 결정할 수 있다. 이렇게 하여 각각의 샘플과 연관된 반복값(replicates)과 분산의 부족을 극복할 수 있고, 원칙적으로 분산 필터링과 유사한 것으로 간주될 수 있다. 계보적 군집화 알고리듬(hierarchical agglomerative algorithm)을 사용하여 자율 집락 형성(unsupervised clustering)을 수행할 수 있다. 피어슨(Pearson)의 상관계수 및 중심 연결이 각각 유사도 방법(similarity method) 및 연결 방법(linkage method)으로서 사용될 수 있다.

샘플 간의 가능한 차이를 검출하기 위해, 각각의 샘플 사이에 발현에서 1.5-배 차이가 났고/났거나 Benjamini-Hochberg 다중 검정 보정을 사용하여 스튜던츠 티 테스트(Student's t test)에 의해 0.05의 보정된 P 값에서 통계적으로 유의미하였던 데이터 세트로부터, 유전자를 추출할 수 있다. 차등적으로 발현된 유전자를 Gene Ontology (GO) 농축에 대해 평가할 수 있다(예를 들어, GeneSpring을 사용함).

정량적 PCR

AML 및/또는 MDS 조직 샘플에 존재하는 AML 및/또는 MDS 세포의 상대적 개수 및/또는 조직 샘플 안에서 각각의 AML 및/또는 MDS 세포 안의 CD99 유전자 발현의 수준과 같은 인자에 따라, CD99 유전자 발현의 수준을 검출하고/검출하거나 정량화하기 위해 정량적 PCR 분석을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

예를 들어, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR-기본 평가에 사용하여 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포 및/또는 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 공여자 조직 샘플 또는 세포로부터 유래된, CD99 유전자 mRNA 및/또는 비-HOX 집락/비-CD99 유전자 mRNA의 적어도 일부, 또는 상응하는 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나 이상은 CD99 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 대해 특이성이고 그것으로 혼성화된다. 증폭된 cDNA는 선택적으로 검출 전에 분획화 단계, 예를 들어, 겔 전기영동에 도입될 수 있다.

RT-PCR은 정량적 PCR 방법이고, 여기서 PCR 증폭은 역전사와 함께 수행된다. RNA는 조직 샘플 또는 세포, 예컨대 혈액, 림프절, 골수, 및/또는 종양 생검 샘플로부터 추출되고, 역전사되어 cDNA 분자를 생성한다. 하나 이상의 특이성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 cDNA 분자를 증폭시키고, 이는 예를 들어 겔 전기영동을 사용하여 분리되고 가시화될 수 있다. 증폭은 환자와 암을 앓고 있지 않은 컨트롤로부터 취해진 조직 샘플 또는 세포 상에서 수행될 수 있다. 증폭 반응은 두자리수 크기에 걸쳐 cDNA를 수차례 희석할 때 수행될 수 있다. 시험의 수차례 희석 시 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 공여자 샘플의 동일한 희석과 비교할 때, AML 및/또는 MDS 환자 샘플의 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상의 발현 증가가 전형적으로 포지티브인 것으로 판단된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "증폭"은 의도하는 특이성 표적 핵산 서열의 적어도 일부를 함유하는 표적 핵산의 다수의 복제 생성을 말한다. 다수의 복제는 앰플리콘 또는 증폭 생성물과 혼용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 증폭된 표적은 완전한 표적 mRNA 서열 (즉, 엑손과 미번역 인접 서열의 스플라이싱된 전사물) 및/또는 표적 게놈 서열 (인트론 및/또는 엑손을 포함)보다 덜 함유한다. 예를 들어, 특이성 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드의 내부 위치로 혼성화되고 그로부터 중합을 개시하는 증폭 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 일부를 증폭시킴으로써 생성될 수 있다. 증폭된 부분은, 다양한 잘 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 검출될 수 있는 검출가능한 표적 서열을 함유한다.

많이 잘 알려진 핵산 증폭 방법은 교호적으로 이중 가닥 핵산을 변성시키고 프라이머를 혼성화하기 위해 열순환처리해야 한다; 그러나, 다른 잘 알려진 핵산 증폭 방법은 등온선이다. 폴리머라제 사슬 반응 (PCR; 미국 특허 번호 제 4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호에 개시됨)은 다수의 변성 주기, 대응 가닥에 대한 프라이머 쌍의 어닐링, 및 표적 서열의 복제 수를 기하급수적으로 증가시키기 위한 프라이머 연장을 사용한다. RT-PCR로 불리는 변이에서, 역전사효소(RT)를 사용하여 mRNA로부터 상보적 DNA (cDNA)를 만들고, 이어서 cDNA를 PCR에 의해 증폭시켜 다수의 DNA 복제를 생성한다.

CD99 유전자 발현은 또한 정량적 실시간 PCR 방법을 사용함으로써 특징규명하거나, 대안적으로, 이것을 사용하여 처음부터 검출하고/검출하거나 정량화할 수 있다 [Gibson et al, Genome Research 6:995-1001 (1996) and Heid et al., Genome Research 6:986-994 (1996)]. 실시간 PCR은 증폭 과정에서 PCR 생성물 축적 수준을 평가하는 기술이다. 이러한 기술로 다수의 샘플에서 mRNA 수준의 정량적 평가가 가능하다. 이러한 방법에 의해, AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포는 상응하는 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 공여자 샘플 또는 세포 및/또는 무관한 정상 비-AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포의 패널과 나란히 시험할 수 있다.

실시간 PCR은 예를 들어, ABI7700 프리즘 또는 GeneAmp.RTM.5700 서열 검출 시스템 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems) 상에서 수행될 수 있다. 7700 시스템은 정방향 및 후방향 프라이머를, 한쪽 말단에 5' 형광 리포터 염료 및 다른 말단에 3'켄처(quencher) 염료를 갖는 특이 프로브(Taqman™)와 조합하여 사용한다. 실시간 PCR을 5'-3' 핵산분해효소 활성을 갖는 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 수행할 때, 프로브는 절단되고 형광을 내어 형광의 증가에 의해 반응이 모니터링될 수 있다 (실시간). 5700 시스템은 SYBR®그린, 즉 이중 가닥 DNA에만 결합하는 형광 염료, 및 7700 기기와 동일한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용한다. 프라이머와 형광 프로브를 맞추는 것은 프라이머 익스프레스 프로그램 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)에 따라 설계될 수 있다. 프라이머 및 프로브의 최적 농도는 초기에 당업자에 의해 결정된다. 컨트롤 (예를 들어, β-악틴-특이성) 프라이머 및 프로브는 예를 들어 Perkin Elmer/Applied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 시판된다.

샘플에서 CD99 유전자 발현의 양을 정량화하기 위해, 문제의 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 표준 곡선은 실시간 PCR로 측정된 Ct 값을 사용하여 생성하고, 이는 평가에 사용된 초기 cDNA 농도와 관련된다. 문제의 유전자의 10-10⁶ 복제 범위의 표준 희석이 일반적으로 충분하다. 또한, 표준 곡선을 컨트롤 샘플 서열에 대해 생성한다. 이로써 비교 목적으로 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포의 초기 RNA 함량을 컨트롤 조직 샘플 또는 세포의 양에 대해 표준화할 수 있다.

전체 RNA가 본원에 개시된 Trizol 시약을 사용하여 AML 및/또는 MDS 조직 샘플 또는 세포 및 비-AML 및/또는 MDS 컨트롤 조직 샘플 또는 세포로부터 추출될 수 있다. 첫 번째 가닥 합성은 1-2 ㎍의 전체 RNA를 SuperScript II 역전사 효소 (미국 캘리포니아주 카를스배드 소재의 Life Technologies)와 함께 1시간 동안 42℃에서 사용하여 수행될 수 있다. 이어서 cDNA는 CD99 mRNA 또는 표 2A에 나타낸 다른 서열을 기본으로 설계된 또는 다르게는 당업자에게 공지되고 쉽게 이용가능한 CD99 유전자-특이성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다.

RT-PCR의 정량적 성질을 확실히 하기 위하여, 검사되는 AML 및/또는 MDS 환자 및 비-AML 및/또는 MDS 대조군 도너 조직 샘플 및/또는 세포 각각에 대한 내재성 컨트롤(internal control)로서 β-액틴과 같은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)를 사용할 수 있다. 제1 가닥 cDNA의 연속 희석물을 제조하고, β-액틴 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 에세이를 실시하였다. β-액틴 주형의 선형 범위 증폭을 가능케 하고, 초기 복제수에서의 차를 반영하기에 충분히 민감한 희석물을 선택한다. 이들 조건을 이용하여, 각 조직으로부터의 각각의 역전사 반응에 대해 β-액틴 수준을 결정한다. DNase 처리함으로써 그리고 역전사효소 첨가없이 제조한 제1 가닥 cDNA를 사용하는 경우 음성 PCR 결과를 보장함으로써 DNA 오염을 최소화한다.

Dynabeads mRNA Direct Microkit (Invitrogen, Life Sciences Technologies, Carlsbad, CA)를 이용한 예시적 RT-PCR 반응에서, 10⁵ 이하의 세포를 함유하는 샘플을 14.25 ㎕ H₂O; 1.5 ㎕ BSA; 6 ㎕ 제1 가닥 완충액; 0.75 mL의 10 mM dNTP 믹스; 3 ㎕ Rnasin; 3 ㎕ 0.1 M dTT; 및 1.5 ㎕ Superscript II로 이루어진 총 반응 부피 30 ㎕에서 시험한다. 생성한 용액을 42℃에서 1시간 동안 배양하고, H₂O에서 1:5로 희석시키며, 80℃에서 2분간 가열하여 상기 비드로부터 cDNA를 분리시키고, 즉시 MPS 상에 위치시킨다. cDNA를 함유하는 상청액을 새로운 관으로 전달하고 -20℃에서 저장한다.

RNA 서열결정

CD99 유전자의 발현 증가는 AML 및/또는 MDS 환자 조직 샘플 또는 세포 및/또는 비-AML 및/또는 MDS 대조군 도너 조직 샘플 또는 세포에서 mRNA의 직접적인 서열결정에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, CD99 유전자의 발현 증가는 역전사에 의해 mRNA가 cDNA로 전환된 이후 결정될 수 있다.

CD99 유전자의 발현을 검출하여 정량하도록 쉽게 적응될 수 있는 tSMS(True Single Molecule Sequencing) (tSMS^TM) 및/또는 DRS(Direct RNA Sequencing) (DRS^TM)은 유전자 발현을 정량하기 위한 유용한 수법이다. 이들 SBS(sequencing-by-synthesis) 수법은 이전의 역전사 또는 PCR 증폭을 필요로 하지 않고도 조직 샘플 또는 세포 유래의 mRNA 상에서 실시될 수 있다.

DRS 수법(Helicos BioSciences Corporation, Cambridge, MA) 및 단일분자 DRS를 이용한 트랜스크립톰 프로파일링(transcriptome profiling)은 Ozsolak et al., Nature 461(7265):814-818 (2009) 및 Ozsolak and Milos, Methods Mol Biol 733:51-61 (2011)에 기재되어 있다. tSMS 및 DRS 수법은 또한 각각 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는, 미국 특허 번호 7,666,593호; 7,767,400호; 7,501,245호; 및 7,593,109호뿐만 아니라 미국 특허 공개 번호 2008/0081330호, 2009/0163366호, 2008/0213770호, 2010/0184045호, 2010/0173363호, 2010/0227321호, 2008/0213770호, 및 2008/0103058호에 기재되어 있다.

CD99 유전자에 의해 코딩된 mRNA는 CD99 mRNA 서열(예를 들어, 하기 표 2A에 제시된 바와 같거나 또는 다르게는 당업자에게 공지되어 있어 용이하게 입수 가능함)을 기본으로하여 설계된 특정 서열결정 프라이머를 이용함으로써 tSMS 및 DRS 수법에 의해 직접적으로 서열결정될 수 있다.

AML 및/또는 MDS와 관련된 CD99 ⁺ 세포의 성장 및/또는 생존을 억제하는 방법 및 CD99 ⁺ 발현 증가를 나타내는 AML 및/또는 MDS에 걸린 환자를 치료하는 방법

본 발명은 또한 CD99 발현 증가를 나타내는 AML 및/또는 MDS를 치료하기 위하여 하나 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 요법을 제공한다.

CD99 발현 증가를 특징으로 하는 AML 및/또는 MDS를 치료하는데 효과적인 항-CD99 항체의 양은 표준 임상 수법에 의해 결정될 수 있다. 최적 투여량 범위를 확인하는데 도움을 주기 위하여 시험관내 에세이(in vitro assay)를 임의로 이용할 수 있다. 제형에 적용될 정확한 용량은 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 심각성에 따라 달라질 것이다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래한 용량-반응 곡선으로부터 외삽(extrapolated)될 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 조성물은 인간에 사용하기 전에 소망하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험관내 시험, 이어서 생체내(in vivo) 시험될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 약제학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유용성을 입증하는 시험관내 에세이는 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 화합물의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 화합물 또는 조성물의 효과는, 비제한적으로, 증식 및 세포사멸(apoptosis) 에세이를 비롯한, 당업자에게 공지된 수법들을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 특정 화합물의 투여가 지시되는지 여부를 결정하기 위하여 이용될 수 있는 시험관내 에세이는 환자 조직 샘플을 배양 증식시킨 다음 화합물에 노출시키거나 또는 다르게는 화합물을 투여하여, 이러한 화합물의 상기 조직 샘플에 대한 효과를 관찰하는 시험관내 세포 배양 에세이를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 유효량의 항-CD99 항체 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료 및 억제하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 상기 화합물은 그 효과를 제한하거나 또는 원하지 않는 부작용을 생성하는 물질을 실질적으로 갖지 않지 않도록 실질적으로 정제된다.

하나 이상의 항-CD99 항체를 적용하는 상기 치료 및 억제 방법은 예를 들어, AML 및/또는 MDS 치료용 화학요법 화합물과 같은 하나 이상의 부가적 화합물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. AML에 대한 유도 화학요법은 또한 시타라빈 (ara-C), 및 다우노루비신과 같은 안트라시클린을 포함할 수 있다. 시타라빈은 7일 연속하여 연속적 IV 주입으로 제공될 수 있는 한편, 안트라시클린은 3일 연속하여 IV 푸시(push)로 제공될 수 있다. AML 아형 급성 전골수구성(promyelocytic) 백혈병은 흔히 안트라시클린 및/또는 삼산화 비소와 조합하여 전-트랜스형 레티노산(all-trans-retinoic acid: ATRA)으로 치료한다.

재발 고위험군 환자(예를 들어, 세포유전학, 선행 MDS, 또는 요법 연관 MDS/AML 위험이 높은 환자)의 경우, 환자가 이식을 견딜 수 있고 적합한 제공자가 있는 경우에는 동종(allogeneic) 줄기세포 이식이 보통 권장된다. 예후가 양호한 (즉, inv(16), t(8;21), 및 t(15;17)) 백혈병의 경우, 환자는 일반적으로 강화 화학요법(consolidation chemotherapy)으로 공지된 3 내지 4개의 집중적인 화학요법 코스를 더 거칠 것이다. AML이 재발한 환자의 경우, 이식전 세포절제 또는 이식후 예방으로서 조혈 줄기세포 이식물과 조합되어 항-CD99 항체가 투여될 수 있다.

당업자에게 잘 공지되어 이는 바와 같이 예를 들어, 리포좀 내의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 수용체-매개 세포내 취입작용(endocytosis)(참고, 예를 들어, Wu and Wu, J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987)) 등과 같은 각종 전달 시스템이 공지되어 있고, 또한 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 이용되고 있다.

투여 방법은 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 코 내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항-CD99 항체 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부내층(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 또한 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 또는 국소적일 수 있다. 또한, 심실내 및 척추강내 주사를 비롯한 적절한 경로에 의해 중추신경계에 항-CD99 항체 또는 조성물을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 심실내 주사는 예를 들어, 옴마야 저장기(Ommaya reservoir)와 같은 저장기에 부착된 심실내 카테터에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 이용하는 것에 의해, 또 에어로졸화제를 이용한 제형화에 의해 폐 투여가 적용될 수 있다.

치료를 필요로 하는 면적에 국소적으로 항-CD99 항체 또는 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이러한 것은 예를 들어, 수술중 국소 주입, 국소 도포에 의해, 카테터에 의한 주사에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 실라스틱(sialastic) 부재와 같은 막, 또는 섬유를 비롯하여, 다공성, 비다공성이거나, 또는 젤라틴성 물질이다. 항-CD99 항체는 리포좀(Langer, Science 249:1527-1533 (1990))과 같은 소포(vesicle) 또는 방출 제어 시스템(controlled release system)으로 전달될 수 있다. 방출 제어 시스템은 치료 표적 주변에 배치될 수 있으므로, 전신 용량의 소량(fraction) 만을 필요로 한다(참조, 예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

항-CD99 항체를 포함하는 조성물의 정맥내 주입은 적어도 약 1일, 또는 적어도 약 3일, 또는 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 14일, 또는 적어도 약 21일, 또는 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 42일, 또는 적어도 약 56일, 또는 적어도 약 84일, 또는 적어도 약 112일 동안 연속적일 수 있다.

항-CD99 항체를 포함하는 조성물의 연속적 정맥내 주입은 특정 기간 동안 지속된 다음, 다른 기간의 휴약 기간이 뒤따른다. 예를 들어, 연속 주입 기간은 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 21일, 약 1일 내지 약 28일, 약 1일 내지 약 42일, 약 1일 내지 약 56일, 약 1일 내지 약 84일, 또는 약 1일 내지 약 112일 일 수 있다. 상기 연속 주입에 이어, 약 1일 내지 약 2일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 14일, 또는 약 1일 내지 약 28일의 휴약 기간이 뒤따른다. 연속 주입은 상술한 바와 같이 반복할 수 있고, 이어서 다른 휴약 기간이 뒤따른다.

채용한 정확한 연속 주입 계획에 관계없이, 항-CD99 항체를 포함하는 조성물의 연속 주입은 소망하는 효능이 달성될 때까지 또는 허용될 수 없는 수준의 독성이 명백해질 때까지 지속되는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 일부 측면 내에서, AML 및/또는 MDS와 관련된 CD99+ 세포의 성장 및/또는 생존을 억제하는 방법 및 CD99+ 발현 증가를 나타내는 AML 및/또는 MDS에 걸린 환자의 치료 방법은 각각 조혈성 줄기세포 및/또는 백혈병 줄기세포와 관련될 뿐만 아니라 AML 및/또는 MDS 세포의 골수에서부터 말초 혈액까지의 이동을 증진시키는 화합물로 세포를 처리하거나 또는 상기 화합물을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 이동을 달성하기 위한 예시적 작용물질(agent)은 당해 기술에 기재되어 있고 또 G-CSF (Pabst et al., Blood 119(23):5367-5373 (2012)) 및 Plerixafor (Uy et al., Blood 119(17):3917-3924 (2012)를 포함한다.

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반대로 나타내지 않는 한, 용어들은 "개방적"인 것으로 의도하고 있음을 이해해야 할 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하되, 이에 한정되지 않는" 것으로 이해되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는" 것으로 이해되어야 하며, 용어 "포함한다"는 "포함하되, 이에 한정되지 않는다" 등으로 이해되어야 한다). "적어도 하나" 및 "하나 이상의"와 같은 표현 및 "하나" 및 "하나의"와 같은 용어는 단부 및 복수 모두를 포함한다.

본 발명의 특징들 또는 측면들이 마쿠시 그룹 용어로 기재되는 경우, 그 개시내용은 마쿠시 그룹의 구성원의 임의의 개별적 구성원 또는 서브그룹 면에서 기재하려는 것임을 이해해야 한다. 유사하게, 본원에 개시된 모든 범위는 모든 가능한 서브범위 및 서브범위의 조합을 포괄하는 것이고 또 "사이", "까지", "적어도", "보다 큰", "미만" 등과 같은 표현은 범위에 인용된 수 및 각각의 개별 구성원을 포함한다.

비제한적으로 특허, 특허 출원, 및 특허 공개를 비롯하여 미국, PCT 또는 미국이 아닌 외국이든, 및 모든 기술적 및/또는 과학 문헌이든 상기 또는 하기에서 인용되는 모든 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

각종 실시양태가 본원에 개시되어 있으나, 다른 실시양태도 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 각종 실시양태는 오로지 예시하기 위한 것이고 제한을 의미하지 않으며, 그의 진정한 범위 및 정신은 특허청구범위에 의해 표시된다.

본 발명은 이하의 비제한적인 실시예를 참조하여 자세하게 설명될 것이다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 모든 다른 문헌에서 시사하는 바는 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된다.

이하의 실험에 사용된 항체는 예를 들어 Abcam (Cambridge MA)으로부터 모두 상업적으로 입수 가능하다.

실시예

실시예 1

항- CD99 12E7 항체는 CD99+ MDS 세포주, MDS 원발성 세포(primary cell), AML 세포주, 및 원발성 AML 모구(blast)에서 세포독성이고 또 이들 세포에서 세포사멸 ( apoptosis)을 유도한다

이 실시예는, CD99-발현성 MDS 세포주, MDS 원발성 세포, AML 세포주, 및 원발성 AML 모구 상의 CD99의 항-CD99 항체 12E7-매개 결찰이 세포독성이고 또 이들 세포에서 세포사멸을 유도함을 나타낸다. 또한, CD99의 결찰에 기인한 세포독성은 항체 이팩터(effector) 작용의 부재하에서 생기므로, 12E7-매개 세포독성 및 세포사멸은 보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 및/또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)과는 독립적이다.

12E7로 표시된 항-CD99 항체(Levy et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 76:6552 (1979)) 20 ㎍/ml를 사용하여 MDS 세포주 MDS92 (Tohyama et al., Br. J. Haematol. 91:795 (1995)) 상의 CD99를 결찰시키는 것은 20 ㎍/ml의 아이소타입 콘트롤 항체(isotype control antibody) 존재하에서의 MDS92 세포 수와 비교하여, 72시간에서, MDS92 세포 수의 128배 감소 (p<0.001)에 의해 분명한 바와 같이 이들 MDS92 세포에 대해 세포독성이다. 도 1A. AAD 대 Annexin V 형광값의 분석은 이팩터-독립적 세포사멸(20 ㎍/ml의 아이소타입 콘트롤 항체 존재하에서의 72시간 이후 MDS92 세포의 세포사멸 부재와 비교하여 10 ㎍/ml의 12E7를 사용한 CD99의 72시간 결찰 후 MDS92 세포의 Annexin V 양성 (p<0.001)에서의 77% 증가에 의해 입증되는 바와 같음)을 나타내었다. 도 1B.

CD99+ MDS92 세포에 대한 12E7-매개 세포독성은 아이소타입 콘트롤 항체 존재하에서의 MDS92 세포 수와 비교하여 항-CD99 항체 12E7를 사용한 CD99의 결찰 이후 22시간에서 MDS92 세포 수의 시간-의존적인 128배 감소(p<0.001)에 의해 더욱 지지되었다. 도 2A. MDS92 세포 상에서의 CD99 세포-표면 발현은 항-CD99 항체 12E7를 사용한 CD99의 결찰 이후에 시간-의존적인 감소를 나타내었다. 도 2B. 골수성 분화 마커(myeloid differentiation marker) CD11b 및 CD14의 세포-표면 발현은 항-CD99 항체 12E7을 사용한 CD99의 결찰 이후 시간-의존적인 감소를 나타내었다. 도 2C.

원발성 CD34⁺ MDS 세포 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰은 48 시간 후 콘트롤 항체가 없는 경우에 대하여 세포 수에서 10배 감소 및 아이소타입 (IgG) 콘트롤 항체에 대하여 세포 수에서 8배 감소에 의해 입증되는 바와 같이 원발성 MDS 세포에 대해 세포독성이다. 도 3.

HL60 및 MOLM13과 같이 고수준의 CD99를 발현하는 AML 세포주 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰은 72 시간 후 아이소타입 콘트롤 항체에 대하여 49배 감소 (HL60; p<0.001) 및 70배 감소(MOLM13; p<0.001)에 의해 입증되는 바와 같이 AML 세포주에 대하여 세포독성이다. 도 4A. CD99는 아이소타입 대조군과 비교하여 MOLM13 및 HL60 세포 상에서 고수준으로 발현된다.

CD99-발현성 원발성 AML 1520 모구 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰은 48 시간 후 세포 수에서 57배 감소 (p<0.001)로 입증되는 바와 같이 원발성 AML 모구 세포에 대해 세포독성이다. 도 5A. CD99-발현성 원발성 AML 890 모구 세포 상의 CD99와 12E7 항-CD99 항체의 결찰은 48 시간 후 세포 수에서 48배 감소 (p<0.001)로 입증되는 바와 같이 원발성 AML 모구 세포에 대해 세포독성이다. 도 5B. 12E7 항-CD99 항체는 80 시간 후 HSC 세포 수에서 1.4배 감소로 입증되는 바와 같이 정상 제대혈 HSC에 대하여 보통 정도의 세포독성만을 갖는다. 도 5C. 이는 항-CD99가 실질적 치료적 범위(therapeutic window)를 가짐을 나타낸다.

실시예 2

고도로 정제된 세포계 음성 [ Lin -] CD38+CD34-CD90+ CD45RA -조혈 줄기세포( HSC )의

트랜스크립톰 ( Transcriptome ) 대조 분석

본 실시예는 CD99가 MDS 및 AML에서 질환형성(diseas-initiating) 줄기세포에 대해 발현됨을 나타낸다. AML에서, LSC는 질환 세포 덩어리를 포함하는 비-자가재생 후대로 분화하는 능력 및 자가재생성을 나타내는 것으로 밝혀졌고(Lapidot et al., Nature 367:645-648 (1994) and Bonnet and Dick, Nat. Med . 3:730-737 (1997)), 이는 암 줄기세포 가설에 의해 제시된 기준을 충족하는 최초의 종양을 나타낸다. 따라서 항-CD99 항체를 사용한 LSC 표적화는 AML에서 질환형성 줄기세포 공격을 가능하게 한다.

MDS가 HSC에서 개시됨이 밝혀졌으며, 이는 MDS HSC가 질환 관련 세포유전 이상을 함유하고 있어 면역결핍 동물에서 질환을 생착할 수 있음을 나타낸다. Nilsson et al., Blood 100:259-267 (2002); Nilsson et al., Blood 110:3005-3014 (2007); Tehranchi et al., New Engl . J. Med . 363:1025-1037 (2010); Nilsson et al., Blood 96:2012-2021 (2000); Pang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 110:3011-3016 (2013); 및 Will et al., Blood 120:2076-2086 (2012). 따라서, 항-CD99 항체를 사용하여 MDS HSC를 표적화하는 것은 MDS에서 질환형성 줄기세포 공격을 가능하게 한다.

다수의 연구자들은 정상 HSC에 비하여 AML LSC에 대하여 우선적으로 발현되는 세포 표면 단백질을 확인하였다 (Jin et al., Nat. Med . 12:1167-1174 (2006); Majeti et al., Cell 138:286-299 (2009); Jan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 108:5009-5014 (2011); Jin et al., Cell Stem Cell 5:31-42 (2009); van Rhenen et al., Blood 110:2659-2666 (2007); Saito et al., Sci . Transl . Med . 2:17ra19 (2010); 이들은 HSC를 남겨두고 AML LSC를 선택적으로 표적화할 수 있는 요법에 대한 유망한 표적을 대표한다. 지금까지, MDS HSC에서 세포 표면 단백질 발현은 세밀하게 특징화되지 않았으며, 이 질환에서는 줄기세포를 표적으로 한 어떠한 요법도 평가되지 않았다.

8명의 골수이형성 증후군(MDS) 환자, 7명의 위험성이 적은 사람 및 1명의 중간정도의 위험성이 있는 사람 (Greenberg et al., Blood 89:2079-2088 (1997))) 및 11명의 연령-매칭된 정상 대조군(McGowan et al., Blood 118:3622-3633 (2011))에 대해 고도로 정제된 HSC (세포계 음성 [Lin-] CD38+CD34-CD90+CD45RA-)의 대조적 트랜스크립톰 분석을 실시하여, 25개의 조절부전(dysregulated) 세포 표면 단백질 전사물(FDR<0.1)을 확인하였다. MDS HSC에 대해 특이적인 세포 표면 마커를 확인하기 위하여, 유세포 분석(flow cytometry: FC)을 이용하여 26개의 치료관련 MDS 시편 및 37개의 진정(de novo) MDS 시편의 검증 코호트(validation cohort)에서 제대혈(CB) HBS 대조군과 비교한 이들 마커의 세포 표면 발현을 확인하고, CD99가 가장 빈번하게 과발현됨을 확인하였다 (각 사례의 85% 및 73%, 도 6a). 이들 임의로 선택된 MDS 사례 전반에서의 높은 빈도의 CD99 발현은 항-CD99 항체가 광범위한 MDS 아형에 대하여 효과적일 수 있음을 제시한다.

다른 골수 악성종양의 마커로서 CD99의 관련성을 연구하기 위하여, 78쌍의 진단 및 재발 AML 샘플로부터의 백혈병 모구 상에서 CD99의 발현을 FC에 의해 평가하여 진단 샘플의 81% 및 재발 샘플의 83%에 대하여 CD99 발현의 증가된 수준을 관찰하며 (평균 9.2배 증가, p<0.0001, 도 6b), 이는 CD99가 MDS에서뿐만 아니라 AML에서 과발현됨을 나타낸다. CD99 발현은 진단 및 재발 사이에서 안정적이었고, 이는 항-CD99 항체가 다수의 질환 상태(초기 진단 및 재발시 모두)에서 효과적일 수 있음을 제시한다. 일 실험에서, CD99 표면 발현은 진단과 비교하여 재발시 현저하게 증가하였다(p=0.047).

CD99의 발현이 정상 조혈 줄기세포 및 조혈 전구세포(HSPC) 유래 백혈병 세포를 구별할 수 있는지 여부를 검사하기 위하여, AML의 줄기세포 농축된 CD34+CD38-분획에서 CD99 세포 표면 발현을 평가하였다. 상기 분획 내에서, "CD99가 많은(CD99 high)" 세포는 LMPP(lymphoid-primed multipotent progenitors: 림프-프라이밍된 다능성 전구세포, CD34+CD38-CD90-CD45RA+)와 유사하였고, 이는 대부분의 인간 AML(Goardon et al., Cancer Cell 19:138-152(2011))에 의해 적용된 면역표현형과 일치하는 반면에, "CD99가 적은(CD99 less)" 세포는 정상 조혈생성에서 우세한 HSC/다능성 전구세포(MPP)와 유사하였다(도 6c). Majeti et al., Cell Stem Cell 1:635-645 (2007). "CD99가 적은" 세포가 FACS-정제되어 메틸셀룰로스 배양액으로 들어가면, 이들은 정상 HSC의 강력한 골수 콜로니 형성 특징을 나타내었지만, LSC에 의해서는 관찰되지 않았다(도 6e). 이들 콜로니를 수집하고, 동종 특이적 PCR에 의해 이들 콜로니가 상응하는 AML과 관련된 분자 마커(예를 들어, FLT3-ITD)를 결여하고 있음을 밝혀내었고, 이는 잔존하는 정상 또는 전백혈병(pre-leuckemic) HSC에서 유래한 것과 일치하였다(도 6e). Jan et al., Sci . Transl . Med. 4:149ra118 (2012). 이것은 동일 환자 내에서 잔존하는 정상 조혈 줄기세포(HSC)와 비교하여 백혈병 줄기세포(LSC)에 대한 CD99 발현의 특이성을 나타내므로, 항-CD99 항체는 넓은 치료 범위를 가질 것이다.

AML의 CD34⁺CD38^- 분획은 LSC의 경우에 농축되는 것으로 밝혀졌고(Bonnet and Dick, Nat. Med . 3:730-737 (1997) 및 Goardon et al., Cancer Cell 19:138-152 (2011)), 또한 상기 분획에는 보다 분화된 AML 모구에 비교하여 AML에서 일관되게 높은 수준의 CD99 발현이 있음이 확인되었다(도 6f). CD99 발현이 기능적 LSC를 위하여 농축되는지 여부를 시험하기 위하여, CD99 발현 분획의 상위 10% 및 하위 10%를 원발성 AML의 LSC 농축된 D34⁺CD38^-CD90^-CD45RA^- 분획 내에 이식시키고, 제한 희석으로 NSG 마우스에 준치사량(sublethal) 조사(185 cGy)하여, 상위 10%의 경우 백혈병 형성능(LIC)이 CD99가 많은 세포(상위 10%의 경우 24,401 세포 중의 1, 하위 10%로부터는 생착 없음)(참조, 표 3A)에 한정되는 것을 발견하였다. CD99 발현하는 분획의 상위 10% 및 하위 10%는 AML 시편 UPenn 2741의 "LMPP-유사" LSC 농축 분획으로부터 정제하고, 준치사 조사된 NSG 마우스(185 cGy)에 제한 희석으로 이식하였다. 백혈병 생착 (컷 오프 >0.1% 인간 CD45+ 세포 이용)은 "상위 10%" 세포가 이식된 마우스에서만 관찰되었다. 이는 CD99 발현이 기능적으로 관련된 백혈병 형성 세포의 특정 마커임을 입증하며, 항-CD99 항체는 이러한 질환 형성(disease-initiating) 세포 집단을 우선적으로 치사시킬 것임을 제시한다.

표 3A

백혈병 형성능(LIC)은 CD99가 많은 세포에 한정된다

다른 독립적 AML 샘플 UPenn 2522를 사용하여 유사한 희석 분석 실험을 실시하였다. 표 3B는 CD99 발현이 높거나 또는 낮은 CD19-CD3- CD45(dim) SSC(low) 백혈병 모구의 UPenn 2522 이식의 제한 희석 분석을 나타낸다. 표 3B에서, AML 시편 UPenn 2522로부터 CD99 발현성 "LMPP-유사" LSC-농축 모구의 상위 및 하위 15%를 유사하게 정제하고 제한 희석하여 NSG 마우스에 이식하였다. "상위 15%" CD99 발현성 모구가 이식된 마우스에서만 백혈병 생착이 관찰되었다. 　

표 3B

CD99 발현이 높거나 또는 낮은 CD19-CD3- CD45(dim) SSC (low) 백혈병 모구의 UPenn 2522 이식의 제한 희석 분석

따라서, CD99는 AML에서 고도로 발현될 뿐만 아니라 기능적 LSC에서 농축되는 것으로 보인다. 이것은 이러한 특징을 갖는 것으로 보고된 최초의 LSC 마커를 나타낸다. 다른 LSC 마커는 LSC 및 더욱 분화된 AML 모구 (예를 들어, CD44, CD47, 및 TIM3 ; 데이터는 나타내지 않음) 상에서 거의 동일한 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. Jin et al. , Nat. Med . 12:1167-1174 (2006); Majeti et al., Cell 138:286-299 (2009); 및 Jan et al., Proc Natl . Acad . Sci . U.S.A . 108:5009-5014 (2011).

더 조사하기 위하여, 환자 AML 모구 중에서 CD99의 이질적 발현을 평가하였다. 환자 AML 모구를 분획처리하였다. 분획처리되지 않은 세포를 분획처리된 CD34+CD38- AML 세포와 비교하고 CD99, CD44, CD123, CD47, 및 TIM3을 비롯한 선택된 가능한 LSC 마커의 발현 수준에 대해 평가하였다. 시험된 몇 개의 AML 마커 중에서, CD99 만이 환자 AML 모구 중에서, 분획처리된 백혈병 줄기세포(CD34+, CD38-)에서 통계적으로 관련된 방식으로 현저하게 농축되는 것으로 밝혀졌다. CD44, CD123, CD47, 또는 TIM3에 대해서는 어떠한 통계적으로 관련된 발현 증가를 보이지 않았다.

CD99의 분포는 정상 HSPC에서의 그것과 비교하여 백혈병 세포 상에서 훨씬 많았다. 이러한 관찰을 토대로, 백혈병 세포로부터 잔존하는 정상 HSC의 예상되는 분리를 실시하였다. AML 환자 샘플(MSK AML 003)을 얻었다. AML 시편 MSK AML-003으로부터의 CD3-CD19-CD34+CD38- 세포에서 FC에 의해 CD99 발현을 평가하였다. 세포 집단을 >95% 순도로 "CD99가 적은" 그룹과 "CD99가 많은" 그룹으로 FACS-분류하였다. 양쪽 그룹을 사이토카인이 보충된 메틸셀룰로스에 플레이팅하였다(750 세포, 3중 시험). 정상 골수/적혈구 콜로니는 상이한 유형의 조혈 세포 (CFU-E, BFU-E, GEMM, CFU-M 및 CFU-G)의 예상 분포를 갖는 "CD99가 적은" 분획으로부터만 형성되었다. 또한, "CD99가 적은" 분획 유래 콜로니는 MSK AML-003에 존재하는 동형접합성 FLT3-ITD 비정상을 갖고 있지 않았다.

별도의 실험에서, AML 샘플 (MSK-003) 유래 분획을 "CD99가 많은" 분획(Lin-CD34+CD38-CD99+) 및 "CD99가 적은" 분획(Lin-CD34+CD38-CD99-)으로 분류하고, 이들을 NSG 마우스에 이종이식하였다. 12주 후에 생착을 평가하였다. "CD99가 적은" 세포는 정상적인 림프-골수 생착을 나타내었고, 이는 표 3C에 나타낸 바와 같은 잔존하는 정상 조혈 줄기세포(HSC)의 활성과 일치하였다. 대조적으로, "CD99가 많은" 세포는 표 3C에 나타낸 바와 같이, 높은 세포 용량에서 4마리 마우스 중 4마리에서 백혈병 생착을 형성하였다.

표 3C

CD99가 많은 세포 및 CD99가 적은 세포를 NSG 마우스에

이종이식한 지 12주 후 생착

AML에서 CD99 기능을 특징화하기 위하여, MOLM13 AML 세포에 shRNA 표적화 CD99를 안정하게 형질도입하였다(8.0배 녹다운(knowdown)). 2종의 shRNA(#61 및 #59에 의해 각각 2.3배 및 8.3배)를 갖는 HL60 세포에서 CD99의 녹다운은 시험관내 증식 역학을 현저하게 변경하지 않았다. 에러 바(Error bar)는 ± SD를 나타낸다. 이것은 시험관내 성장에서 유의미한 차이를 초래하지 않았지만(도 7a), 이들 세포가 이식된 준치사량 조사된 NSG 마우스는 벡터 대조군과 비교하여 생존이 현저하게 개선되었고(58d 대 34d, p=0.02, 도 7b), 이는 CD99가 미세환경과의 상호작용을 조절함으로써 더욱 공격적인 질환을 조장할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 인간 AML 샘플 중에서 CD99 표면 단백질 발현이 많은 것은 BM 질환 부담 증가와 상당하게 관련되었다(도 7c). CD99 발현이 많은 것은 마우스 및 인간 모두에서 AML의 더욱 공격적 생장과 관련된다.

LSC에서 농축된 유전자 발현 특징은 나쁜 임상 결과를 예측하여 왔고(Majeti, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 106:3396-3401 (2009) and Eppert, et al. Nature Medicine 17:1086-1093 (2011)), CD123 및 CD47과 같은 LSC 마커의 과발현은 백혈병 부담 증가와 더 나쁜 OS와 각각 관련된다. 따라서, AML에서 CD99 mRNA 발현은 "줄기세포성"을 강화할 것이고 더 나쁜 예후를 예상하게 하는 것으로 추정되었다. ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 임상 시험(E1900)에 등록한 358명의 AML 환자로부터 입수할 수 있는 트랜스크립톰 데이터를, 초기 질환 치료를 위한 2 용량의 다우노루비신 (DNR)과 비교함으로써 분석하였다. 놀랍게도, 낮은 CD99 발현은 나쁜 예후와 관련되며, 이는 더 많은 용량의 DNR을 투여받는 것에 의해 완화되는 것으로 보인다(도 7d).

또한, DNR 강화(NPM1 돌연변이, DNMT3a 돌연변이, 또는 MLL-재배열; Patel et al., New Engl . J. Med . 366:1079-1089 (2012))로부터 얻은 이익에 예상되는 AML 분자 아형 내에서, 상기 이익은 CD99 발현이 낮은 것에 한정되었다(도 7e). 염증에 반응한 단핵구 및 호중구의 내피통과 이동(endothelial migration)에서 CD99의 확립된 역할을 고려할 때(Schenkel et al., Nat. Immunol . 3:143-150 (2002) and Lou et al., J. Immunol . 178:1136-1143 (2007)), 높은 수준의 CD99 mRNA 발현이 내피를 통한 백혈병 모구(leuckemic blast)의 PB(peripheral blood)로의 이동을 촉진시키는 것에 의해 화학요법 면에서 개선된 임상 결과를 초래하는 것으로 상정되었고, 여기서 상기 모구는 화학요법에 더욱 민감한 것으로 밝혀졌다. Uy et al., Blood 119:3917-3924 (2012).

실시예 3

CD99는 내피통과 이동 및 백혈병 모구의 이동을 촉진시킨다

백혈병 모구의 내피통과 이동에 대한 CD99 발현의 영향을 시험하기 위하여, AML 세포주 HL60는 안정적으로 CD99를 과발현(6.7배)하도록 유도되었고, 이들을 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 상에 파종하여 트랜스웰 멤브레인 상에서 콘플루언스(confluence)되기까지 성장시켜, HL60이 HUVEC를 통하여 화학유도물질(chemoattractant) SDF-1로 이동하게 하였다(데이터 나타내지 않음). CD99의 과발현은 내피통과 이동 효능에서의 현저한 증가를 초래하였다(3.72배 증가, 4 시간 p<0.0009, 28 시간에서 2.93배, p=0.0065, 도 8a). 이 이동 효능은 상이한 항-CD99 mAb 부가에 의해 다양하게 향상될 수 있거나 또는 억제될 수 있었다(데이터 나타내지 않음). 내피통과 이동을 차단하는 항-CD99 항체는, 말초혈액에서 "트랩" 이동된 백혈병 세포에 대한 G-CSF 또는 Plerixafor와 같은 이동제와 조합되어 사용될 수 있고, 여기서 종양 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포독성 항-CD99 항체에 대한 민감성뿐만 아니라 향상된 화학민감성을 나타낼 수 있다.

72시간 후, 잔존하는 미이동 세포는 이동한 세포와 비교하여 현저히 낮은 수준의 CD99 발현을 나타냈다(3.65배 낮음, p=0.028, 도 8b). CD99 발현과 SDF-1 수용체 CXCR4의 발현 사이에는 아무런 연관관계가 없었다(데이터 나타내지 않음). CD99 표면 발현은 BM과 비교하여 말초혈액에서 취한 AML 시편 상에 대하여 현저한 것으로 밝혀졌고 (1.65배 더 높음, p=0.028, 도 8c), 또한 원발성 AML 이종이식편으로부터 동시에 취한 BM 및 PB의 페어 분석(paired analysis)에서, CD99 표면 발현은 BM과 비교하여 PB에서 순환하는 백혈병 모구 상에서 현저하게 높았다(2.32배 증가, p<0.0001, 도 8d). 마지막으로, AML 세포주에서의 CD99의 과발현은 피브로넥틴 및 콜라겐과 같은 기질 성분에 의해 코팅된 조직 배양판에 접착되어 증가되었다(도 8e).

이와 함께, 이들 발견은 CD99가 내피통과 이동을 향상시키고 또 BM에서 기질 성분과의 접착을 감소시키는 것에 의해 백혈병 모구의 이동을 촉진시킴을 제시한다.

실시예 4

항- CD99 단일클론 항체( mAb )는 AML 및 MDS 세포에 대하여 직접적으로 세포독성이다

AML 및 MDS에서 세포사를 유도하는 항-CD99 mAb의 능력을 시험하였다. 몇 개의 항-CD99 mAb 클론(12E7, O13, H036-1.1)은 시험관내 15개 AML 세포주 중 11개 (도 9b)뿐만 아니라 원발성 AML 모구 및 MDS CD34⁺ 세포 (도 9a)에 대해 세포독성이었다. 항-CD99 mAb와 함께 5 ㎍/ml로 배양된 MOLM13 세포에서의 세포사멸 유도(도 9c)는 시간 경과에 따라 활성화 카스파제(caspase) 증가를 나타내었고 또한 면역 이팩터 세포 또는 보체 부재하에 발생하였으며, 이는 그것이 직접적인 세포독성 효과임을 제시한다. 세포사멸은 세포 주기 상태(데이터 나타내지 않음)와 독립적으로 유도되었고 또한 판-카스파제(pan-caspase) 항-CD99 항체 QVD (데이터 나타내지 않음)에 의해 억제될 수 있었다.

CD99는 정상 HSC(도 6a) 및 내피 세포 (데이터 나타내지 않음) 상에 낮은 수순 및 중간 정도의 수준으로 각각 발현되지만, 항-CD99 mAb는 시험관내에서 이들 세포 유형에 대하여 아주 보통 효과를 가지며, 이는 잠재적으로 광범위한 치료 범위를 나타낸다(도 9d). 준치사량 조사된 NSG 마우스에 이종이식되기 전에 항-CD99 mAb (H036-1.1, 20 ㎍/ml)를 사용하여 원발성 AML 세포를 생체외(ex vivo) 치료하는 것은 8주에 PB에서 측정된 바와 같이 현저한 생착 감소를 초래하였다(20.5% 대 67.4%, p=0.006, 도 9e). 이들 실험은 AML 환자 유래의 동일개체 골수 이식편을 항-CD99 항체로 생체외 처리하는 것이 질환 형성 세포의 이식편을 고갈시켜서, 이식 이후의 재발 위험을 감소시키는 점에서 효과적일 수 있음을 제시한다.

세포독성 항-CD99 mAb는 CD99의 마킹된 세포 표면 캡핑을 유도하였고, 이차 교차결합성 항체를 IgG 아이소타입 항-CD99 mAbs (예를 들어, 클론 O13)에 부가하는 것은 상기 캡핑 효과를 반복하여서 세포독성을 향상시키며, 이는 세포 표면 상에서의 CD99의 다량체화가 세포사를 유도하는 핵심이라는 것을 제시한다(도 9f). 세포독성 항-CD99 항체(예를 들어, 12E7)는 또한 세포 표면 응집 및 CD99의 클러스터링을 유도하는 반면에, 비-세포독성 항-CD99 항체(예를 들어, 3B2)는 CD99 표면 발현의 어떠한 눈에 띄는 재조정(redistribution)도 유도하지 않았다.

CD99는 골육종 세포에서 Src-패밀리 키나제(SFK)의 활성과 물리적으로 관련되고 그를 억제하는 것으로 기재되어 있다. Scotlandi et al., Oncogene 26:6604-6618 (2007). CD99는 AML에서 SFK와 공동면역침강되며(데이터 나타내지 않음), 또한 세포독성 항-CD99 mAb는 강인한 SFK 활성화를 유도함이 확인되었다(도 9g). 소분자 항-CD99 항체 PP2를 사용한 SFK의 약리학적 억제는 항-CD99 mAb 유도된 세포독성을 현저하게 약화시켰다(도 9h). 따라서, 조절부전 SFK 활성화를 증진시킴으로써, 항-CD99 mAb는 암유전자 유도된 세포사멸을 통하여 세포사를 증진시킬 수 있다.

실시예 5

항- CD99 단일클론 항체( mAb )는 AML 이종이식편을 제거한다

AML 이종이식편을 제거하는 항-CD99 mAb의 능력을 시험하였다. NSG 마우스에서 이종이식된 AML 시편 UPenn 2522의 조합된 생체외 및 생체내 H036-1.1 치료를 실시하였다. 개략적 실험 수순은 도 11, 상부 패널에 나타낸다. 450,000 AML 모구 (UPenn 2522)를 H036-1.1 항-CD99 Mab (20 마이크로그램/mL) 또는 아이소타입(20 마이크로그램/mL)에 의해 45분간 예비코팅하였다. 상기 모구들을 준치사량 조사된 NSG 마우스에 이종이식하였다. 2주 후, 마우스에 H036-1.1 또는 아이소타입(15 마이크로그램) 처리를 하였다. 5개월 후, 마우스를 희생시키고, 골수(BM)를 평가하였다. 도 11, 하부 패널에 도시된 바와 같이, 5개월 후 인간 키메라 형성에 대한 마우스 골수(BM)의 평가는 H036-1.1에 의해 예비코팅처리된 모구를 투여받은 0/6 동물 및 생체내에서 H036-1.1에 의해 처리된 0/5 동물이 BM (회색 점선으로 경계를 표시한 임계치)에서 >0.1% 인간 생착을 초래하는 반면에, 4/5 대조 동물이 생착되었다. 에러 바는 ±SD를 나타낸다. 도 11에 도시된 바와 같이, 이종이식되기 전 AML 모구의 예비코팅 또는 이종이식된 마우스를 항-CD99 MAb로 생체내 처리하는 것이 AML 이종이식편을 제거하는 반면에, 4/5 대조군 동물은 백혈병을 생착시켰다. 이 데이터는 모구의 생체외 예비치료 또는 확립된 이식편을 H036-1.1 항-CD99 MAb를 이용하여 생체내 치료하는 것이 NSG 마우스에서 AML 이종이식편 제거를 초래함을 보여준다.

실시예 6

새로운(de novo) 항체 생성, 인간화, 및 검증(validation)

표준 수법에 의해 새로운 항-CD99 mAb 생성을 실시하였다. 상품 판매자(써모 피셔)를 통하여 입수한 정제된 형질전환체 CD99를 이용하여 통상의 수단에 의해 마우스를 면역화시켰다. 시험관내 능력 및 효능을 기준으로 하여 85명의 후보자에 대한 항-CD99 mAb 스크리닝을 실시하였다. Ab를 함유하는 하이브리도마(hybridoma) 상청액을 IgG 아이소타입 음성 대조군과 비교하여 평가하였다. 하이브리도마 상청액과 72 시간 배양한 후 상대적 MOLM13 세포 수를 확인하였다. 상대적 세포가 현저하게 감소된 3개의 상청액을 확인하였다. 1개 후보자, 상청액 13,는 상대적 세포 수 감소에 특히 효과적이었다. 상청액 13에 노출된 MOLM13 세포는 또한, IgG 아이소타입 처리된 MOLM13 세포(데이터 나타내지 않음)에 비교하여, PI 염색에 의한 생존성 감소 및 증가된 SSC를 나타내었다. 후보들의 추가적인 평가는 12E7/H036-1.1/O13 MAb와 비교하여 동등하거나 또는 더 큰 시험관내 효능을 나타내는 기준을 포함할 것이다. 세포사멸촉진(pro-apoptotic) 활성이 인간 내피 세포주 및 HSC에서 치사를 초래하지 않음을 확실히 하기 위하여 부가적 특징화를 실시할 것이다. 선도적 세포사멸촉진성 Ab도 또한 시험관내에서 인간 AML 세포주, 원발성 AML 세포, 및 LSC를 사용하여 ADCC/CDC 활성에 대해 평가하였다. 능력 및 효능을 증가시키기 위한 선도적 후보 Ab의 친화성 최적화, 및 선도적 인간화된 mAb 후보의 생체내 검증을 실시할 것이다.

실시예 7

악성 T-세포 종양에서 CD99 표적화

CD99는 T 세포 성숙 및 백혈구의 내피통과 이동을 조절하는 32 kDa 막관통 단백질이다. CD99는 T-세포 급성 림프아구성 림프종/백혈병(T-ALL), 유잉 육종, 및 신경내분비 종양의 진단에 도움을 주는 바이오마커로서 통상 사용된다. 본 발명자들은 CD99에 작용하는(directed) 단일클론 항체(mAbs)가 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수이형성 증후군(MDS)에서 세포독성을 효과적으로 유도함을 보여준다. CD99가 T-세포 종양에서 생존가능한 치료 표적인지 여부를 결정하기 위하여 추가의 실험을 실시하였다.

이 실험에서, 조직 마이크로어레이(microarrays)를 이용한 면역조직화학(IHC)에 의해 115개의 림프종 환자 샘플에 대해 CD99 단백질 발현을 평가하였다. CD99 발현은 성숙 T-세포 림프종 세포주, T-ALL 세포주, 및 말초혈액(PB) T-세포에 대한 유세포 분석에 의해서도 측정하였다. 최고 수준의 CD99 발현을 나타내는 세포주를 시험관내 세포독성 에세이에 사용하며, 증가하는 농도의 항-IgG 교차결합성 항체(Ab)(50-100 ㎍/ml) 존재하에서 40 ㎍/ml의 항-CD99 mAb(DN16, O13, 또는 12E7)와 함께 배양하였다. 세포 생존 및 형태는 항-CD99 mAb와 배양한지 72시간 후 유세포 분석 및 광 현미경에 의해 평가하였다. 결과를 도 13-16에 나타낸다.

각종 T-세포 종양은 5% 컷 오프 기준으로 IHC에 의한 CD99 발현을 나타내었다: 11/20 (55%) T 림프모구성(lymphoblastic) 림프종, 7/16 (44%) 혈관면역모구성(angioimmunoblastic) T-세포 림프종, 4/13 (31%) 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 10/63 (16%) 말초 T-세포 림프종, 및 0/3 (0%) NK/T 세포 림프종. 유세포 분석은 CD99가 PB T-세포 (정규화된 MFI: 56.1, 39.5, 20.5)에 대하여 Karpas-299(ALCL) 및 Kopt-K1 (T-ALL) 세포주 상에서 상향조절되는 반면, 낮은 수준의 CD99는 Mac2A (ALCL), Hut78 (시자리 증후군), 및 Hut102 (균상식육종) 세포주 (정규화된 MFI: 각각 0.19, 10.9, 0.5) 상에서 발현됨을 밝혔다.

Kopt-K1 세포와 DN16 또는 12E7의 배양은 IgG 아이소타입 컨트롤 (DN16: 70-81% 세포사, p≤.0002; 12E7: 42-78% 세포사, p≤.0003)에 관하여 증가하는 농도의 항-IgG Ab에서 현저한 세포사를 유도하였다. DN16 또는 O13과 Karpas-299의 배양은 또한 항-IgG Ab 존재하에서 세포 수의 현저한 감소를 초래하였다(O13: 75 ㎍/ml 항-IgG Ab을 사용한 25% 세포사, p<.0001; DN16: 50-100㎍/ml 항-IgG Ab을 사용한 38-43% 세포사, p≤.0021). B-ALL에서 이전의 발견과 일치되게, 세포사는 마킹된 세포 응집과 관련되어 있었다.

상기 실험은 T-세포 림프종, 특히 ALCL에서 T-ALL 모구 및 실질적 퍼센트의 세포에 대하여 CD99가 고도로 발현됨을 나타낸다. 이론에 얽매임 없이, 항-CD99 mAb는 항-IgG Ab의 존재하에서 T-ALL 및 ALCL 세포주에 대하여 세포독성이며, 이는 CD99의 교차결합성 또는 다량체화가 세포사를 유도하는데 필요함을 제시한다. 집합적으로, 이들 연구는 원칙적으로 치료적 mAb를 사용하여 CD99를 표적화하는 것이 복수의 T-세포 종양의 치료에서 새로운 전략을 가능하게 함을 나타낸다.

개별적으로 또는 합쳐서, 이들 연구는 CD99를 AML, MDS, 및 T-세포 종양 중의 질환 형성 세포 상에 농축되는 유망한 예후 마커 및 치료 표적으로 확립하였다. 또한, 항-CD99 mAb에 의한 SFK 활성의 조절부전은 상기 경로의 다른 조절제를 사용하여 이용될 수 있는 AML 및 MDS에서 신규한 치료의 약점을 나타낸다. 세포사멸을 직접 유도하거나 및/또는 화학민감성을 향상시킴으로써, CD99에 작용하는 요법은 AML 및 MDS에서 질환 줄기세포의 박멸을 허용할 수 있어, 장기간 차도를 초래한다.

SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING CD99 IN HAEMATOPOIETIC AND LYMPHOID MALIGNANCIES <130> 11000/005156-WO0 <140> PCT/US2016/023303 <141> 2016-03-18 <150> 62/135,119 <151> 2015-03-18 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaggccggg gcggggcggg cgcagccggc gctgagcttg cagggccgct cccctcaccc 60 gcccccttcg agtccccggg cttcgcccca cccggcccgt gggggagtat ctgtcctgcc 120 gccttcgccc acgccctgca ctccgggacc gtccctgcgc gctctgggcg caccatggcc 180 cgcggggctg cgctggcgct gctgctcttc ggcctgctgg gtgttctggt cgccgccccg 240 gatggtggtt tcgatttatc cgatgccctt cctgacaatg aaaacaagaa acccactgca 300 atccccaaga aacccagtgc tggggatgac tttgacttag gagatgctgt tgttgatgga 360 gaaaatgacg acccacgacc accgaaccca cccaaaccga tgccaaatcc aaaccccaac 420 caccctagtt cctccggtag cttttcagat gctgaccttg cggatggcgt ttcaggtgga 480 gaaggaaaag gaggcagtga tggtggaggc agccacagga aagaagggga agaggccgac 540 gccccaggcg tgatccccgg gattgtgggg gctgtcgtgg tcgccgtggc tggagccatc 600 tctagcttca ttgcttacca gaaaaagaag ctatgcttca aagaaaatgc agaacaaggg 660 gaggtggaca tggagagcca ccggaatgcc aacgcagagc cagctgttca gcgtactctt 720 ttagagaaat agaagattgt cggcagaaac agcccaggcg ttggcagcag ggttagaaca 780 gctgcctgag gctcctccct gaaggacacc tgcctgagag cagagatgga ggccttctgt 840 tcacggcgga ttctttgttt taatcttgcg atgtgctttg cttgttgctg ggcggatgat 900 gtttactaac gatgaatttt acatccaaag ggggataggc acttggaccc ccattctcca 960 aggcccgggg gggcggtttc ccatgggatg tgaaaggctg gccattatta agtccctgta 1020 actcaaatgt caaccccacc gaggcacccc cccgtccccc agaatcttgg ctgtttacaa 1080 atcacgtgtc catcgagcac gtctgaaacc cctggtagcc ccgacttctt tttaattaaa 1140 ataaggtaag cccttcaatt tgtttcttca atatttcttt catttgtagg gatatttgtt 1200 tttcatatca gactaataaa aagaaattag aaaccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1255 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser 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caccatggcc 180 cgcggggctg cgctggcgct gctgctcttc ggcctgctgg gtgttctggt cgccgccccg 240 gatggtggtt tcgatttatc cgatgccctt cctggggatg actttgactt aggagatgct 300 gttgttgatg gagaaaatga cgacccacga ccaccgaacc cacccaaacc gatgccaaat 360 ccaaacccca accaccctag ttcctccggt agcttttcag atgctgacct tgcggatggc 420 gtttcaggtg gagaaggaaa aggaggcagt gatggtggag gcagccacag gaaagaaggg 480 gaagaggccg acgccccagg cgtgatcccc gggattgtgg gggctgtcgt ggtcgccgtg 540 gctggagcca tctctagctt cattgcttac cagaaaaaga agctatgctt caaagaaaat 600 gcagaacaag gggaggtgga catggagagc caccggaatg ccaacgcaga gccagctgtt 660 cagcgtactc ttttagagaa atagaagatt gtcggcagaa acagcccagg cgttggcagc 720 agggttagaa cagctgcctg aggctcctcc ctgaaggaca cctgcctgag agcagagatg 780 gaggccttct gttcacggcg gattctttgt tttaatcttg cgatgtgctt tgcttgttgc 840 tgggcggatg atgtttacta acgatgaatt ttacatccaa agggggatag gcacttggac 900 ccccattctc caaggcccgg gggggcggtt tcccatggga tgtgaaaggc tggccattat 960 taagtccctg taactcaaat gtcaacccca ccgaggcacc cccccgtccc ccagaatctt 1020 ggctgtttac aaatcacgtg tccatcgagc acgtctgaaa cccctggtag ccccgacttc 1080 tttttaatta aaataaggta agcccttcaa tttgtttctt caatatttct ttcatttgta 1140 gggatatttg tttttcatat cagactaata aaaagaaatt agaaaccaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaa 1207 <210> 4 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu 20 25 30 Pro Gly Asp Asp Phe Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn 35 40 45 Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys Pro Met Pro Asn Pro Asn 50 55 60 Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala 65 70 75 80 Asp Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly 85 90 95 Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gly Val Ile Pro 100 105 110 Gly Ile Val Gly Ala Val Val Val Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser 115 120 125 Phe Ile Ala Tyr Gln Lys Lys Lys Leu Cys Phe Lys Glu Asn Ala Glu 130 135 140 Gln Gly Glu Val Asp Met Glu Ser His Arg Asn Ala Asn Ala Glu Pro 145 150 155 160 Ala Val Gln Arg Thr Leu Leu Glu Lys 165 <210> 5 <211> 1270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggaggccggg gcggggcggg cgcagccggc gctgagcttg cagggccgct cccctcaccc 60 gcccccttcg agtccccggg cttcgcccca cccggcccgt gggggagtat ctgtcctgcc 120 gccttcgccc acgccctgca ctccgggacc gtccctgcgc gctctgggcg caccatggcc 180 cgcggggctg cgctggcgct gctgctcttc ggcctgctgg gtgttctggt cgccgccccg 240 gatggtggtt tcgatttatc cgatgccctt cctgacaatg aaaacaagaa acccactgca 300 atccccaaga aacccagtgc tggggatgac tttgacttag gagatgctgt tgttgatgga 360 gaaaatgacg acccacgacc accgaaccca cccaaaccga tgccaaatcc aaaccccaac 420 caccctagtt cctccggtag cttttcagat gctgaccttg cggatggcgt ttcaggtgga 480 gaaggaaaag gaggcagtga tggtggaggc agccacagga aagaagggga agaggccgac 540 gccccaggcg tgatccccgg gattgtgggg gctgtcgtgg tcgccgtggc tggagccatc 600 tctagcttca ttgcttacca gaaaaagaag ctatgcttca aagaaaatga tggctgaaga 660 cctagggaac aaggggaggt ggacatggag agccaccgga atgccaacgc agagccagct 720 gttcagcgta ctcttttaga gaaatagaag attgtcggca gaaacagccc aggcgttggc 780 agcagggtta gaacagctgc ctgaggctcc tccctgaagg acacctgcct gagagcagag 840 atggaggcct tctgttcacg gcggattctt tgttttaatc ttgcgatgtg ctttgcttgt 900 tgctgggcgg atgatgttta ctaacgatga attttacatc caaaggggga taggcacttg 960 gacccccatt ctccaaggcc cgggggggcg gtttcccatg ggatgtgaaa ggctggccat 1020 tattaagtcc ctgtaactca aatgtcaacc ccaccgaggc acccccccgt cccccagaat 1080 cttggctgtt tacaaatcac gtgtccatcg agcacgtctg aaacccctgg tagccccgac 1140 ttctttttaa ttaaaataag gtaagccctt caatttgttt cttcaatatt tctttcattt 1200 gtagggatat ttgtttttca tatcagacta ataaaaagaa attagaaacc aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa 1270 <210> 6 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu 20 25 30 Pro Asp Asn Glu Asn Lys Lys Pro Thr Ala Ile Pro Lys Lys Pro Ser 35 40 45 Ala Gly Asp Asp Phe Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn 50 55 60 Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys Pro Met Pro Asn Pro Asn 65 70 75 80 Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala 85 90 95 Asp Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly 100 105 110 Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gly Val Ile Pro 115 120 125 Gly Ile Val Gly Ala Val Val Val Ala Val Ala Gly Ala Ile Ser Ser 130 135 140 Phe Ile Ala Tyr Gln Lys Lys Lys Leu Cys Phe Lys Glu Asn Asp Gly 145 150 155 160 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Asp Gly Glu Asn 1 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Leu Pro Asp Asn Glu Asn Lys Lys 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Leu Pro Gly Asp Asp Phe Asp Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn Asp 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Ala Val Val Asp Gly Glu Asn 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Leu Pro Asp 1 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Asp Ala Leu Pro Asp Asn 1 5 <210> 15 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Phe Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Ala Pro Asp Gly Gly Phe Asp Leu Ser Asp Ala Leu 20 25 30 Pro Asp Asn Glu Asn Lys Lys Pro Thr Ala Ile Pro Lys Lys Pro Ser 35 40 45 Ala Gly Asp Asp Phe Asp Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Glu Asn 50 55 60 Asp Asp Pro Arg Pro Pro Asn Pro Pro Lys Pro Met Pro Asn Pro Asn 65 70 75 80 Pro Asn His Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ala 85 90 95 Asp Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Lys Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly 100 105 110 Ser His Arg Lys Glu Gly Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gly 115 120 125 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 aggtgtacac tccgatatcc agctgaccca gtctcca 37 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg agcttggtcc c 51 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtsmarc tgcagsagtc wgg 53 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 aatccggagg agacggtgac cgtggtccct tggccccag 39 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims

조혈성 또는 림프성 악성종양(malignancy)을 가진 환자에서 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성(susceptibility)을 확인하는 방법으로서,
a. CD99 유전자 서열에 특이적인 프라이머 쌍(primer pair)을 이용하여 상기 환자로부터의 세포에서 RNA를 증폭시킴으로써 상기 세포에서 CD99 mRNA의 수준을 정량하는 단계,
b. CD99 유전자 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 건강한 인간 대상체로부터의 대조 세포에서 RNA를 증폭시킴으로써 상기 세포에서 CD99 mRNA의 수준을 정량하는 단계, 및
c. 상기 환자로부터의 상기 세포에서 상기 CD99 mRNA의 수준을 상기 건강한 인간 대상체로부터의 상기 세포에서 상기 CD99 mRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
상기 건강한 인간 대상체 세포에서의 상기 CD99 mRNA와 비교한 상기 환자 세포에서의 상기 CD99 mRNA의 수준이 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 나타내며;
상기 항-CD99 항체는,
(i) CD99⁺ 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99의 세포외 도메인(domain)에 결합하고;
(ii) 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합된 상기 항체의 응집, 클러스터링(clustering), 및 캡핑(capping) 중 1종 이상을 촉진하며;
상기 항체는 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서의 세포사(cell death)를 유도하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 상기 CD99 mRNA의 5' 말단을 향하여 혼성화(hybridize)되며, 상기 역방향 프라이머는 상기 CD99 mRNA의 3' 말단을 향하여 혼성화되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 CD99 mRNA는 서열(SEQ ID NO) 1, 서열 3, 및 서열 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 원발성 AML 모구 세포(blast cell), 백혈병 줄기 세포(leukemic stem cell)(LSC), 원발성 MDS 모구 세포, 및 MDS 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)(HSC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 항체는 DGEN(서열 7), DAVVDGEND(서열 10), AVVDGEN(서열 11), 및 DDPRPPNPPK(서열 12)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CD99 상의 에피토프(epitope)에 결합하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 항체는 IgG 단일클론 항체인 방법.
제6항에 있어서, 상기 IgG 단일클론 항체는 12E7 및 O13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뮤린(murine) 항체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 항체는 IgM인 방법.
제8항에 있어서, 상기 항체는 IgM 단일클론 항체 H036-1.1인 방법.
제1항에 있어서, 상기 항체는 제2 항체에 접합되는(conjugated) 방법.
제10항에 있어서, 상기 제2 항체는 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 항체는 DGEN(서열 7), DAVVDGEND(서열 10), AVVDGEN(서열 11), 및 DDPRPPNPPK(서열 12)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CD99의 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 항체는 DGEN(서열 7), DAVVDGEND(서열 10), AVVDGEN(서열 11), 및 DDPRPPNPPK(서열 12)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하지 않는 CD99의 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합하는 방법.
조혈성 또는 림프성 악성종양과 연관된 CD99⁺ 골수성 또는 림프성 악성세포에서 세포사를 유도하는 방법으로서, CD99+ 골수성 또는 림프성 악성세포를 항-CD99 항체와 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 항체는,
상기 CD99⁺ 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99의 세포외 도메인과 결합하며, 상기 항체는 상기 골수성 또는 림프성 종양세포의 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서의 세포사를 유도하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 항체는 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합된 상기 항체의 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 촉진하는 방법.
CD99의 증가된 수준을 나타내는 골수성 또는 림프성 약성세포와 연관된 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 치료 방법으로서, 상기 방법은 항-CD99 항체를 포함하는 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 항체는,
a. CD99⁺ 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99의 세포외 도메인에 결합하고;
b. 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합된 상기 항체의 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 촉진하며;
상기 항체는 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서의 세포사를 유도하는 방법.
CD99의 증가된 수준을 나타내는 세포와 연관된 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 치료용 조성물로서,
a. i. CD99⁺ 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99의 세포외 도메인에 결합하고;
ii. 상기 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99에 결합된 상기 항체의 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 촉진하며;
iii. 상기 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 골수성 또는 림프성 종양세포에서의 세포사를 유도하는 제1 항-CD99 항체, 및
b. 상기 CD99⁺ 골수성 또는 림프성 종양세포의 내피통과 이동(transendothelial migration)을 억제하는 제2 항-CD99 항체를 포함하는
조성물.
제16항에 있어서, 상기 제2 항체는 12E7, HEC2, DN16, 및 H036으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
CD99+ 골수성 또는 림프성 종양세포의 증식을 억제하는 방법으로서,
상기 CD99+ 골수성 또는 림프성 종양세포를 항-CD99 항체와 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 항체는,
a. 상기 CD99⁺ 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99의 세포외 도메인에 결합하고;
b. 상기 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99에 결합된 상기 항체의 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 촉진하며;
상기 항체는 상기 골수성 또는 림프성 종양세포 표면 상의 CD99에 결합될 때 상기 골수성 또는 림프성 종양세포에서의 세포사를 유도하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 항-CD99 항체는 약 100 nM 내지 약 10 μM 또는 약 250 nM 내지 약 5 μM 또는 약 500 nM 내지 약 1 μM의 Kd로 상기 CD99의 세포외 도메인에 결합하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 CD99+ 골수성 또는 림프성 종양세포를 다우노루비신, 아이다루비신(idarubicin), 시타라빈, 아자시티딘(azacytidine), 및 데시타빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 화합물은 상기 항-CD99 항체와 동시에 첨가되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 화합물 및 상기 항-CD99 항체는 순차적으로 첨가되는 방법.
환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양을 치료하는 방법으로서,
항-CD99 항체를 골수성 또는 림프성 악성세포의 세포독성을 유도하기에 유효한 양으로 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하고;
상기 환자는 대조 골수성 또는 림프성 비-악성세포에서의 CD99 발현 수준에 비해 증가된 CD99 발현 수준을 나타내는 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는, 방법.
제24항에 있어서, 다우노루비신, 아이다루비신, 시타라빈, 아자시티딘, 및 데시타빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 화학요법적 유효량으로 상기 환자에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 화합물은 상기 항-CD99 항체와 동시에 투여되는 방법.
제24항에 있어서, 상기 화합물은 상기 항-CD99 항체와 순차적으로 투여되는 방법.
제23항에 있어서, 이동제(mobilizing agent)를 상기 AML 및/또는 MDS 환자에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 이동제는 플레릭사포르(plerixafor) 또는 G-CSF 또는 이들의 조합물인 방법.
제27항에 있어서, 상기 이동제는 상기 항-CD99 항체가 투여되기 이전에 상기 AML 및/또는 MDS 환자에 투여되는 방법.
CD99 유전자의 증가된 발현 수준을 나타내는 골수성 또는 림프성 악성세포에 시달리는 것으로 사전에 확인된 환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양을 치료하는 방법으로서,
상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서 세포독성을 유도하기에 유효한 양으로 항-CD99 항체를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 다우노루비신, 아이다루비신, 시타라빈, 아자시티딘, 및 데시타빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 상기 AML 및/또는 MDS 환자에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 화합물은 상기 항-CD99 항체와 동시에 투여되는 방법.
제24항에 있어서, 상기 화합물은 상기 항-CD99 항체 이후에 투여되는 방법.
제30항에 있어서, 이동제를 상기 환자에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 이동제는 플레릭사포르(plerixafor) 또는 G-CSF 또는 이들의 조합물인 방법.
제34항에 있어서, 상기 이동제는 상기 항-CD99 항체가 투여되기 이전에 상기 환자에 투여되는 방법.
항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 민감성을 확인하는 방법으로서,
a. 상기 환자로부터의 골수성 또는 림프성 악성세포에서 CD99 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
b. 비-악성 도너 대조 골수성 또는 림프성 세포로부터의 세포에서 상기 CD99 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
c. 환자 세포에서 상기 CD99 유전자의 수준을 대조 세포에서 유전자 발현의 대응 수준과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 대조 세포에서 유전자 발현의 대응 수준에 비해 적어도 약 2배 이상 큰 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서 상기 CD99 유전자 발현 수준은 상기 항-CD99 항체의 치료 효능을 예측하며,
상기 항-CD99 항체는 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 CD99의 응집, 클러스터링 또는 캡핑 중 적어도 1종을 촉진할 수 있는 방법.
항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 민감성을 예측하는 방법으로서,
CD99의 발현 증가에 대한 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 시험하는 단계를 포함하고, 상기 CD99의 증가된 발현은 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 상기 CD99에 결합될 때, CD99의 응집, 클러스터링 또는 캡핑 중 적어도 1종을 촉진하는 항-CD99 항체의 치료 효능을 예측하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 c-키트(kit) 유전자 발현에 대해 시험하는 단계를 더 포함하고, 없거나 낮은 수준의 c-키트 유전자 발현은 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 환자의 민감성을 예측하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 BCR-ABL 전좌(translocation)의 존재에 대해 시험하는 단계를 더 포함하고, BCR-ABL의 존재는 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 예측하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 돌연변이화된 JAK2의 존재에 대해 시험하는 단계를 더 포함하고, 본질적으로 활성인 JAK2 돌연변이의 존재는 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 예측하는 방법.
항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 민감성을 예측하는 방법으로서,
CD99의 발현 증가에 대해 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 시험하는 단계를 포함하고, 상기 CD99의 증가된 발현은 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 상기 CD99에 결합될 때 세포독성인 항-CD99 항체의 치료 효능을 예측하는 방법.
항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자의 민감성을 예측하는 방법으로서,
CD99의 발현 증가에 대해 골수성 또는 림프성 악성 환자 세포를 시험하는 단계를 포함하고, 상기 CD99의 증가된 발현은 상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 상기 CD99에 결합될 때 세포사를 유도하는 항-CD99 항체의 치료 효능을 예측하는 방법.
환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양의 치료를 위한 후보 항-CD99 항체를 생성하는 방법으로서,
a. CD99의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 생성하는 단계,
b. i. 골수성 또는 림프성 악성세포-표면 발현 CD99의 항체-매개 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑에 대해, 및
ii. 상기 골수성 또는 림프성 악성세포-표면 발현 CD99의 항체-매개 세포사 유도에 대해 상기 항-CD99 항체를 시험하는 단계를 포함하고,
CD99의 상기 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 매개하고 상기 세포사를 유도하는 항-CD99 항체는 환자에서 상기 조혈성 또는 림프성 악성종양의 치료를 위한 후보 항-CD99 항체인 방법.
항-CD99 항체가, AML 또는 MDS 세포가 각각 증가된 수준의 CD99를 발현하는 환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양의 치료에서 사용하기 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법으로서,
a. 항-CD99 항체를 제공하는 단계;
b. 상기 항-CD99 항체를 1종 이상의 검사에 적용하여 그것이 골수성 또는 림프성 악성세포-표면 발현 CD99의 항체-매개 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑을 야기하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑이 발생하는 경우, 항체는 CD99+ 골수성 또는 림프성 악성세포에 대해 세포독성이며, 조혈성 또는 림프성 악성종양의 치료를 위한 후보인 것으로 귀결되고; 대안적으로 상기 응집, 클러스터링, 및/또는 캡핑이 발생하지 않는 경우, 항체는 상기 치료를 위한 후보가 아닌 것으로 귀결되는 방법.
골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99의 증가된 수준을 나타내는 환자에서 조혈성 또는 림프성 악성종양을 치료하는 방법으로서,
1종 이상의 항-CD99 항체, 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물 또는 제형, 및/또는 AML 및/또는 MDS의 치료에 유효한 1종 이상의 다른 약제와 조합된 1종 이상의 항-CD99 항체를 포함하는 조성물 또는 제형을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하고; 항-CD99 항체는 상기 세포의 표면에 결합될 때 세포사를 유도하는 방법.
조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자에서 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 확인하는 방법으로서,
a. 상기 환자로부터의 세포에서 CD99 mRNA의 수준을 정량하는 단계,
b. 상기 환자로부터의 세포에서 비-CD99 대조 RNA의 수준을 정량하는 단계, 및
c. 상기 세포에서 상기 CD99 mRNA의 수준을 상기 세포에서 상기 대조 RNA의 수준과 비교하여, CD99 유전자 및 대조 유전자에 대한 유전자 발현 비율을 얻는 단계를 포함하고,
상기 세포에서 CD99 유전자 및 대조 유전자에 대한 유전자 발현의 비율이 비-AML 및/또는 비-MDS 세포에서 CD99 유전자 및 대조 유전자에 대해 사전-측정된 임계 비율에 비해 큰 것은 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 세포사멸(apoptosis)을 유발하는 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 나타내는 방법.
제47항에 있어서, 상기 대조 mRNA는 β-액틴, GAPDH, 및 시클로필린(cyclophilin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
조혈성 또는 림프성 악성종양에 시달리는 환자에서, 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 확인하는 방법으로서,
a. CD99 유전자 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 상기 환자로부터의 골수성 또는 림프성 악성세포에서 RNA를 증폭시킴으로써 상기 세포에서 CD99 mRNA의 수준을 정량화하는 단계,
b. CD99 유전자 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 건강한 인간 대상체로부터의 대조 세포에서 상기 세포에서의 RNA를 증폭시킴으로써 상기 세포에서 CD99 mRNA의 수준을 정량하는 단계, 및
c. 상기 환자로부터의 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서 상기 CD99 mRNA의 수준을 상기 건강한 인간 대상체로부터의 상기 대조 세포에서 상기 CD99 mRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함하고;
상기 건강한 인간 대상체 대조 세포에서의 상기 CD99 mRNA와 비교한 상기 환자 골수성 또는 림프성 악성세포에서의 상기 CD99 mRNA의 수준이 항-CD99 항체를 이용한 치료에 대한 상기 환자의 민감성을 나타내며;
상기 항-CD99 항체는,
상기 골수성 또는 림프성 악성세포 표면 상의 CD99에 결합될 때, 상기 골수성 또는 림프성 악성세포에서의 세포사를 유도하는 방법.
제1항, 제14항, 제16항, 제19항, 제24항, 제31항, 제38항, 제39항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 또는 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 성숙한 T-세포 림프종 세포, T-급성 림프구성 백혈병(T-acute lymphoblastic leukemia)(T-LL), T- 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 세포, 및 역형성 큰 세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)(ALCL) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.