KR20170116811A - Injectable double network hydrogels and biomedical use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤에 관한 것으로서, 주입형 이중 가교 하이드로젤은 펜톤 가교반응 및 효소 가교반응을 포함하는 방법을 이용해 합성된 기존의 단일 가교 하이드로젤 대비 기계적 물성을 향상 시킬 수 있으며, 또한 기존에 제시된 원-팟 합성법 대비, 간단하고 신속한 방법으로 이중가교 하이드로젤을 제조할 수 있음과 동시에 제조 조건에 따라 이중가교 하이드로젤의 물리/화학적 특성을 쉽게 제어할 수 있는 제조법을 제시한다. The present invention relates to an injectable double crosslinked hydrogel, which can improve the mechanical properties of a conventional single crosslinked hydrogel prepared by a method including a Fenton crosslinking reaction and an enzyme crosslinking reaction, In addition, it is possible to prepare double crosslinked hydrogel by a simple and rapid method compared with the conventional one - pot synthetic method, and to propose a manufacturing method which can easily control the physical / chemical properties of the double crosslinked hydrogel according to the manufacturing conditions.
Description
본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 상기 주입형 이중 가교 하이드로젤은 기존 단일 가교 고분자 하이드로젤에 비해 기계적 강도를 개선시킬 수 있으며, 또한 기존의 이중 가교 하이드로젤 제조방법에 비해 간편한 방법으로 제조할 수 있을 뿐 아니라 제조 조건에 따라 이중가교 하이드로젤의 물리/화학적 특성을 쉽게 제어할 수 있다. The present invention relates to an injectable double-crosslinked hydrogel and its biomedical use. More particularly, the injectable double-crosslinked hydrogel can improve the mechanical strength as compared with a conventional single-crosslinked polymer hydrogel, The crosslinked hydrogel can be manufactured more easily than the double crosslinked hydrogel manufacturing method and the physical / chemical properties of the double crosslinked hydrogel can be easily controlled according to the manufacturing conditions.
친수성 고분자의 3차원(3D) 네트워크로 이루어진 고분자 하이드로젤은 생체 조직과의 구조적 유사성 뿐 아니라, 생체적합성과 다중 가변성(multi-tunable properties)으로 인해 다양한 생의학적 응용분야에 널리 사용되어 왔다.Polymer hydrogels composed of a three-dimensional (3D) network of hydrophilic polymers have been widely used in a variety of biomedical applications due to their biocompatibility and multi-tunable properties, as well as their structural similarity to living tissue.
특히, in situ 형성 하이드로젤은 최소침습성 기술(minimally invasive techniques)을 기반으로 약물/세포 전달체, 조직 충진제, 혹은 조직공학용 지지체로 사용되어 환자의 편의성을 크게 증대시켜주었다. 그러나, 상기 in situ 형성 하이드로젤은 낮은 파괴 인성(fracture toughness)과 낮은 탄성 계수와 같은 고유의 기계적 성능에 한계가 있기 때문에 인공 연골, 인공 인대, 인공 근육 등, 높은 부하하중을 견딜 수 있는 연조직 대체 물질로의 활용은 제한되고 있는 실정이다. In particular, in situ forming hydrogels have been used as drug / cell carriers, tissue fillers, or tissue engineering supports based on minimally invasive techniques, greatly enhancing patient comfort. However, since the in situ formed hydrogel has inherent mechanical performance limitations such as low fracture toughness and low elastic modulus, it is difficult to replace soft tissue such as artificial cartilage, artificial ligament, artificial muscle, The application to materials is limited.
따라서, 기계적 성능이 우수한 주입형 하이드로젤의 개발은 상기 의료용 임플란트 뿐 아니라 마이크로캡슐 및 패치 등의 약물전달체, 콘택트렌즈와 같은 생체 재료에 활용되고 더 나아가 액추에이터, 센서 보호용 코팅제, 스마트섬유, 밀봉제 혹은 개스킷 등 기존 하이드로젤의 사용이 제한되었던 다양한 응용분야로 적용 범위를 확장할 수 있다.Therefore, the development of an injection-type hydrogel having an excellent mechanical performance can be applied not only to the medical implants, but also to biomaterials such as microcapsules and patches, drug delivery materials and contact lenses, and furthermore to actuators, sensor protective coatings, smart fibers, Gaskets, and other applications where the use of existing hydrogels has been limited.
하이드로젤의 낮은 기계적 성능 문제를 해결하기 위해, 이중 가교(double-network; DN) 하이드로젤, 나노복합체 하이드로젤(nanocomposite hydrogels), 마크로/마이크로파티클 복합 하이드로젤(macromolecular microsphere composite hydrogels) 초분자 슬라이드-링 하이드로젤(supramolecular slide-ring hydrogels) 및 테트라-PEG 하이드로젤(tetra-PEG hydrogels)을 포함한 다양한 하이드로젤들이 개발되고 있다. To solve the low mechanical performance problems of hydrogels, double-network (DN) hydrogels, nanocomposite hydrogels, macromolecular microsphere composite hydrogels, supramolecular slide- Various hydrogels have been developed, including supramolecular slide-ring hydrogels and tetra-PEG hydrogels.
이 중에서도 이중 가교 하이드로젤은 강성(brittle) 및 연성(ductile)의 고분자 네트워크가 상호 침투(interpenetrating) 구조로 이루어진 하이드로젤로 강성 고분자 네트워크는 외부에서 가해지는 에너지를 효과적으로 분산시킴과 동시에 연성 고분자 네트워크는 구조를 안정화하여 우수한 기계적 성질을 가지는 바, 기존 하이드로젤의 낮은 기계적 물성을 극복할 대안으로서 제안되고 있다. Among them, the double-crosslinked hydrogel is a hydrogel in which the brittle and ductile polymer networks are interpenetrating, and the rigid polymer network efficiently disperses the energy externally applied, and at the same time, Has been proposed as an alternative to overcome the low mechanical properties of conventional hydrogels since it has excellent mechanical properties by stabilizing the structure.
그러나, 통상적인 이중가교 하이드로젤의 제조는 다단계의 광 중합방법을 이용하고 고분자의 팽윤 및 확산을 필요로 하는 바, 수 일 이상의 제조 시간, 낮은 재현성, 그리고 복잡한 하이드로젤의 형성이 불가능한 문제는 주입형 하이드로젤로의 응용에 있어 단점으로 작용하고 있다. However, the conventional preparation of double-crosslinked hydrogel requires multi-stage photopolymerization and requires swelling and diffusion of the polymer. Problems such as the production time of several days or more, low reproducibility, and the impossibility of forming a complicated hydrogel, Which is a disadvantage in application to hydrogels.
최근, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이중 가교 하이드로젤의 원-팟(one-pot) 합성 방법들이 소개되고 있지만, 여전히 간단하고 신속한 제조 방법으로 주입형 하이드로젤로써 응용 가능한 제조시간을 만족함과 동시에 하이드로젤의 물리/화학적 특성의 제어가 가능한 제조방법이 대두되지 못한 실정이다.Recently, one-pot synthesis methods of double-crosslinked hydrogels have been introduced in order to solve such problems. However, it is still a simple and rapid manufacturing method that satisfies a manufacturing time applicable as an injection type hydrogel and, at the same time, A manufacturing method capable of controlling the physical / chemical properties of the material has not been developed yet.
본 발명의 목적은, 기존의 제조방법 대비, 간단하고 신속한 방법으로 기존 단일 결합 고분자 하이드로젤에 비해 향상된 기계적 성능을 갖는 이중가교 하이드로젤을 제조할 수 있으며, 또한 이중가교 하이드로젤의 물리/화학적 특성을 쉽게 제어할 수 있는 주입형 이중 가교 하이드로젤 제조방법 및 이의 생의학적 용도를 제공하는 데에 있다.It is an object of the present invention to provide a double crosslinked hydrogel having improved mechanical performance as compared with the existing single-bound polymer hydrogel by a simple and quick method compared with the conventional manufacturing method, And a biomedical use thereof. The present invention also provides a method for producing the double-crosslinked hydrogel,
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아크릴 반응기를 갖는 단량체, 및 가교제를 사용한 펜톤 가교반응에 의한 일차 네트워크 하이드로젤, 및 링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어진 것을 특징으로 하는, 주입형 이중 가교 하이드로젤을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a polymer electrolyte membrane, which comprises a monomer having an acrylic reactor, a primary network hydrogel formed by a Fenton crosslinking reaction using a crosslinking agent, Characterized in that it is made of a secondary network hydrogel by an enzyme cross-linking reaction which is carried out by dehydrogen bonding between phenol derivatives or aniline derivatives adjacent two or more polymers containing two or more kinds of the same or different polymers. .
또한 본 발명은 단량체로 아크릴산을, 가교제로써 매크로 가교제(macro cross-linker)를 펜톤 가교반응에 의해 매크로코어를 갖는 일차 네트워크 하이드로젤, 및 링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 마크로코어를 갖는 주입형 이중 가교 하이드로젤을 제공한다.The present invention also relates to a process for the preparation of a macromolecule-containing primary network hydrogel comprising acrylic acid as a monomer, macrocross-linker as a cross-linking agent by Fenton's cross-linking reaction and a phenol derivative or aniline Characterized in that it consists of a secondary network hydrogel formed by an enzyme cross-linking reaction comprising two or more kinds of homologous or heterogeneous polymers to which derivatives are bonded and which are connected by dehydrogen bonding between phenol derivatives or aniline derivatives adjacent to each other between two or more polymers. Lt; RTI ID = 0.0 > hydrogel < / RTI >
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재를 제공한다.The present invention also provides an implant material for tissue regeneration and filling comprising an injectable double crosslinked hydrogel.
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 카테터와 같은 심혈관계 의료기기뿐만 아니라 체내 삽입용 의료기기의 표면코팅 소재를 제공한다.The present invention also provides surface coating materials for cardiovascular medical devices, such as catheters, as well as medical devices for insertion into the body, including injection double crosslinked hydrogels.
또한 본 발명은 상기 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착 및 지혈용 소재를 제공한다.The present invention also provides a material for tissue adhesion and hemostasis comprising the injectable double crosslinked hydrogel.
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체를 제공한다.The present invention also provides a carrier for a physiologically active substance or a drug delivery carrier, which comprises an injectable double crosslinked hydrogel.
본 발명에 따른 주입형 이중 가교 하이드로젤은 펜톤반응과 효소 가교반응을 이용하여 기존 단일가교 하이드로젤에 비하여 기계적 물성을 향상시킬 수 있으며, 또한 원-팟 합성법에 의해 제조가 가능한 바, 종래 제조방법에 비해 보다 간편하고 신속한 방법으로 제조할 수 있으며 동시에 물리/화학적 특성을 쉽게 제어할 수 있다.The injection type double-crosslinked hydrogel according to the present invention can improve the mechanical properties as compared with the existing single crosslinked hydrogel using the Fenton reaction and the enzyme cross-linking reaction, and can be manufactured by the one-pot synthesis method. Can be manufactured in a simpler and quicker manner than the conventional method, and at the same time, the physical / chemical properties can be easily controlled.
도 1은 펜톤가교반응을 이용한 아크릴산 하이드로젤 제조 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 펜톤/효소 가교반응을 이용한 이중 가교 하이드로젤 모식도를 나타낸 도면이다.
도 3은 펜톤 및 효소가교된 하이드로젤, 펜톤/효소 이중 가교 결합된 하이드로젤 각각의 최대 압축강도를 나타낸 도면이다.
도 4는 Fe2+ 비율 변화(a), H2O2 농도 변화(b) 및 HRP 농도 변화(c)에 따른 이중 가교 하이드로젤의 젤화시간을 나타낸 도면이다.
도 5는 가교도에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 도면이다.
도 6은 AAc 및 GH 농도에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 도면이다.
도 7은 Fe2+ 비율 변화(a), H2O2 농도 변화(b) 및 HRP 농도 변화(c)에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 도면이다.
도 8은 다양한 pH 조건 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 도면이다.
도 9는 Fe2+ 비율 변화 및 H2O2 농도 변화(a), 및 가교도(EGDA 함량변화) 변화 (b)에 따른 이중 가교 하이드로젤의 세포적합성 조절을 나타낸 도면이다.
도 10은 다양한 조성을 갖는 이중 가교 하이드로젤의 기계적 강도를 나타낸 도면이다.
도 11은 다양한 조성을 갖는 이중 가교 하이드로젤의 세포부착성 평가를 나타낸 도면이다.
도 12는 마크로코어를 갖는 이중 가교 하이드로젤의 제조 모식도를 나타낸 도면이다.
도 13은 마크로코어를 갖는 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 도면이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a production process of acrylic acid hydrogel using a Fenton crosslinking reaction. FIG.
2 is a schematic view of a double crosslinked hydrogel using a Fenton / enzyme crosslinking reaction.
FIG. 3 is a graph showing the maximum compressive strengths of each of the fenton and enzyme cross-linked hydrogels and the fenton / enzyme double cross-linked hydrogels.
4 is a graph showing the gelation time of the double-crosslinked hydrogel according to the Fe 2+ ratio change (a), the H 2 O 2 concentration change (b), and the HRP concentration change (c)
5 is a view showing the mechanical properties of the double-crosslinked hydrogel according to the degree of crosslinking.
6 is a graph showing the mechanical properties of the double-crosslinked hydrogel according to the concentrations of AAc and GH.
FIG. 7 is a graph showing the mechanical properties of the double-crosslinked hydrogel according to the Fe 2+ ratio change (a), the H 2 O 2 concentration change (b), and the HRP concentration change (c)
8 is a view showing mechanical properties of a double-crosslinked hydrogel according to various pH conditions.
9 is a diagram showing cell fitness control of a double-crosslinked hydrogel according to Fe 2+ ratio change, H 2 O 2 concentration change (a), and crosslinking degree (EGDA content change) change (b).
10 is a view showing the mechanical strength of a double-crosslinked hydrogel having various compositions.
11 is a diagram showing an evaluation of cell adhesion of a double-crosslinked hydrogel having various compositions.
12 is a schematic view showing a production process of a double-crosslinked hydrogel having a macromolecule.
13 is a view showing the mechanical properties of a double-crosslinked hydrogel having a macromolecule.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 발명자들은 주입형 이중 가교 하이드로젤이 펜톤 반응과 효소 가교반응을 동시에 이용하여 기존 합성된 단일 가교 하이드로젤보다 기계적 물성을 향상 시킬 수 있으며, 또한 원-팟 합성법에 의한 제조가 가능함과 동시에 물리/화학적 특성을 제어할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have found that the injection type double crosslinked hydrogel can improve the mechanical properties more than the existing synthesized single crosslinked hydrogel by simultaneously using the Fenton reaction and the enzyme crosslinking reaction and also can be produced by the one- Physical / chemical properties can be controlled, thus completing the present invention.
본 발명은 아크릴 반응기를 갖는 단량체 및 가교제를 사용한 펜톤 가교반응에 의한 일차 네트워크 하이드로젤, 및 수용성 링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어진 것을 특징으로 하는, 주입형 이중 가교 하이드로젤을 제공한다.The present invention relates to a primary network hydrogel obtained by a Fenton cross-linking reaction using a monomer having an acrylic reactor and a crosslinking agent, and a homogeneous or heterogeneous polymer having a phenol derivative or an aniline derivative bonded to the side chain of the polymer with or without a water- Or more, and is composed of a secondary network hydrogel formed by an enzyme cross-linking reaction, which is connected by dehydrogen bonding between two or more phenol derivatives or aniline derivatives adjacent to each other between two or more polymers.
도 1을 참조하면, 상기 일차 네트워크 하이드로젤은 2가 철이온, 아스코르브산 (ascorbic acid) 및 과산화수소를 포함한 용액 하에서 아크릴 반응기를 갖는 단량체 및 가교제의 펜톤 가교반응을 통해 in situ 가교시켜 제조하며 2가 철이온과 아스코르브산의 비율을 조절하여 반응 속도를 제어할 수 있고 이에 제한되는 것은 아니다.Referring to FIG. 1, the primary network hydrogel is prepared by in situ crosslinking of a monomer having an acrylic reactor and a crosslinking agent through a Fenton crosslinking reaction in a solution containing bivalent iron ion, ascorbic acid and hydrogen peroxide, The reaction rate can be controlled by controlling the ratio of iron ion to ascorbic acid, but not limited thereto.
또한 상기 단량체는 아크릴산, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 디메틸아크릴아미드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 아크릴레이트, 비닐알코올, N-이소프로필아크릴아미드, 비닐피롤리돈, 2-카복시에틸아크릴레이트 및 설포베테인으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.The monomer may also be selected from the group consisting of acrylic acid, acrylamide, methacrylamide, dimethylacrylamide, hydroxyethylmethacrylate, hydroxyethyl acrylate, vinyl alcohol, N-isopropylacrylamide, vinylpyrrolidone, 2- But are not limited to, one or more selected from the group consisting of sulfates,
또한 상기 가교제는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, N,N'-메틸렌비스아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. The crosslinking agent may be any one or more selected from the group consisting of ethylene glycol dimethacrylate, ethylene glycol diacrylate, and N, N'-methylene bisacrylamide, but is not limited thereto.
또한 상기 이차 네트워크 하이드로젤은 호스래디시 퍼록시데이즈 (horseradish peroxidase) 및 과산화수소의 존재 하에서 동종 또는 이종 고분자들이 in situ 가교될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. Also, the secondary network hydrogel may be in situ bridged by, but not limited to, homo or heteropolymers in the presence of horseradish peroxidase and hydrogen peroxide.
또한 본 발명에 따른 주입형 이중 가교 하이드로젤의 이차 네트워크 하이드로젤은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the secondary network hydrogel of the injection type double-crosslinked hydrogel according to the present invention may be represented by the following Formula 1, but is not limited thereto.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 화학식 1에서, R은 하이드록시 또는 아민기이고, L은 링커로서, 수용성 고분자이다.In
상기 페놀 유도체는 티라민, 하이드록시페닐아세트산 및 하이드록시페닐프로피온산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상일 수 있다.The phenol derivative may be one or two or more selected from the group consisting of tyramine, hydroxyphenylacetic acid, and hydroxyphenylpropionic acid.
상기 아닐린 유도체는 하이드록시에틸아닐린, 아미노에틸아닐린 및 아미노벤질알콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상일 수 있다.The aniline derivative may be one or more selected from the group consisting of hydroxyethyl aniline, aminoethyl aniline, and aminobenzyl alcohol.
상기 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.The polymer is selected from the group consisting of gelatin, chitosan, heparin, cellulose, dextran, dextran sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, alginate, collagen, albumin, fibronectin, laminin, elastin, bitonectin, hyaluronic acid, fibrinogen, - < / RTI > polymers.
상기 다지-고분자는 3지(3-arm)-폴리에틸렌글리콜(3armPEG), 4지(4-arm)-폴리에틸렌글리콜(4armPEG), 6지(6-arm)-폴리에틸렌글리콜(6armPEG) 또는 8지(8-arm)-폴리에틸렌글리콜(8armPEG)에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 다지-폴리에틸렌글리콜, 및 테트로닉 시리즈(4arm-PPO-PEO)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 고분자일 수 있다.The Dodge-polymer may be selected from the group consisting of 3-arm-polyethylene glycol (3armPEG), 4-arm-polyethylene glycol (4armPEG), 6-arm-polyethylene glycol (6armPEG) Polyethylene glycol, 8-arm-polyethylene glycol (8arm PEG), and tetronic series (4arm-PPO-PEO).
상기 링커는 다관능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA), 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 수용성 고분자일 수 있다.Wherein the linker is one or more water-soluble polymers selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polyethyleneimine (PEI), polyvinyl alcohol (PVA) .
도 2를 참조하면, 상기 주입형 이중 가교 하이드로젤은 아크릴 반응기를 갖는 단량체 및 가교제와 수용성 링커를 포함하거나 포함하지 않고 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 고분자를 2가 철이온, 아스코르브산 및 과산화수소를 포함한 용액 하에서 펜톤/효소반응을 이용하여 in situ 가교시켜 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 2, the injection type double-crosslinked hydrogel comprises a monomer having an acrylic reactive group and a polymer having a phenol derivative or an aniline derivative bonded to the side chain with or without a cross-linking agent and a water-soluble linker, with a bivalent iron ion, an ascorbic acid, By in situ crosslinking using a Fenton / enzyme reaction in a solution containing hydrogen peroxide, but is not limited thereto.
상기 주입형 이중 가교 하이드로젤은 2가 철이온과 아스코르브산의 비율, 호스래디시 퍼록시데이즈의 농도 또는 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간 또는 기계적 강도에서 선택된 물리화학적 성질을 조절할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.The injection type double crosslinked hydrogel can control the physicochemical properties selected from gelation time or mechanical strength by controlling the ratio of divalent iron ion to ascorbic acid, the concentration of horseradish peroxidase, or the concentration of hydrogen peroxide, no.
또한 본 발명은 단량체로 아크릴산을, 가교제로써 매크로 가교제(macro cross-linker)를 펜톤 가교반응에 의해 매크로코어를 갖는 일차 네트워크 하이드로젤 및 링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 마크로코어를 갖는 주입형 이중 가교 하이드로젤을 제공한다. The present invention also relates to a process for the preparation of a macromolecule, which comprises reacting acrylic acid as a monomer, macrocross-linker as a cross-linking agent with a primary network hydrogel having macrocore by a Fenton cross-linking reaction and a phenol derivative or aniline derivative Characterized in that the macromolecule is composed of a secondary network hydrogel comprising two or more kinds of the same or different kinds of polymers combined with each other and linked by dehydrogen bonding between phenol derivatives or aniline derivatives adjacent to each other between two or more polymers, The present invention provides an injectable double-crosslinked hydrogel.
상기 매크로 가교제에 의해 생성되는 매크로코어는 이중 가교 하이드로젤 내부에서 부가적인 플랫폼으로 작용하여 외부에서 가해지는 충격에너지를 효과적으로 분산시켜 하이드로젤의 기계적 강도 및 내피로성을 향상시킬 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The macrocore produced by the macrocrosslinking agent may serve as an additional platform within the double-crosslinked hydrogel to effectively disperse the impact energy externally to improve the mechanical strength and fatigue resistance of the hydrogel, but the present invention is not limited thereto .
상기 매크로 가교제(macro cross-linker)는 플루로닉 F127-디아크릴레이트(pluronic F127-diacrylate), 플루로닉 F68-디아크릴레이트(pluronic F68-diacrylate), 플루로닉 F108-디아크릴레이트(pluronic F108-diacrylate), 플루로닉 P85-디아크릴레이트(pluronic P85-diacrylate), 플루로닉 P123-디아크릴레이트(pluronic P123-diacrylate), 테트로닉 T1307-테트라아크릴레이트 (Tetronic T1307-tetraacrylate), 테트로닉 T1107-테트라아크릴레이트 (Tetronic T1107-tetraacrylate), 테트로닉 T908-테트라아크릴레이트 (Tetronic T908-tetraacrylate), 테트로닉 T90R4-테트라아크릴레이트 (Tetronic T90R4-tetraacrylate), 덱스트란 메타크릴레이트(dextran methacrylates), N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate), N-아이소프로필아크릴아마이드 (N-isopropylacrylamide) 및 스테아릴메타크릴레이트 (stearyl methacrylate)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The macro cross-linker may be selected from the group consisting of pluronic F127-diacrylate, pluronic F68-diacrylate, pluronic F108-diacrylate, Diacrylate, F108-diacrylate, pluronic P85-diacrylate, pluronic P123-diacrylate, Tetronic T1307-tetraacrylate, Tetronic T90R4-tetraacrylate, Tetronic T90R-tetraacrylate, Tetronic T908-tetraacrylate, Tetronic T90R4-tetraacrylate, dextran methacrylates, In the group consisting of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N-isopropylacrylamide and stearyl methacrylate in the group consisting of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, It may be but is not limited to this.
상기 마크로코어를 갖는 주입형 이중 가교 하이드로젤의 보다 상세한 설명은 앞선 주입형 이중 가교 하이드로젤과 동일한 바 생략한다.A more detailed description of the injection type double crosslinked hydrogel having the macromolecule is the same as the injection double crosslinked hydrogel described above.
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재를 제공한다.The present invention also provides an implant material for tissue regeneration and filling comprising an injectable double crosslinked hydrogel.
상기 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The implant material may be selected from the group consisting of cartilage regeneration, bone regeneration, periodontal bone regeneration, skin regeneration, cardiac tissue regeneration, artificial intraocular lens, spinal nerve regeneration cord regeneration, cranial regeneration, vocal regeneration and augmentation, adhesion barrier, urinary incontinence treatment, filler for wrinkle removal, wound treatment, dressing, tissue augmentation, and intervertebral disc treatment, but are not limited thereto.
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 카테터 등, 체내 삽입용 의료기기의 표면코팅 소재를 제공한다. The present invention also provides a surface coating material for a medical device for insertion into the body, such as a catheter, comprising an injectable double crosslinked hydrogel.
상기 체내삽입용 의료기기는 스텐트 (stent), 카테터 (catheter), 피하 이식편 (subcutaneous implant), 화학 센서, 도관 (lead), 심장 박동기 (pacemaker), 이식 혈관편 (vascular graft), 상처용 드레싱 (dressing), 남성기 삽입물 (penile implant), 삽입용 심박 발생 장치 (implantable pulse generator), 삽입용 심장 제세동기 (cardiac defibrillator), 또는 신경 흥분기 (nerve stimulator)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The medical device for insertion into a body includes a stent, a catheter, a subcutaneous implant, a chemical sensor, a lead, a pacemaker, a vascular graft, a wound dressing a cardiac defibrillator, or a nerve stimulator may be selected from the group consisting of a pancreas, a pancreas, a dressing, a penile implant, an implantable pulse generator, an insertion cardiac defibrillator, no.
또한 본 발명은 상기 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착 및 지혈용 소재를 제공한다.The present invention also provides a material for tissue adhesion and hemostasis comprising the injectable double crosslinked hydrogel.
상기 지혈용 소재는 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈, 대퇴동맥의 봉합, 백내장 절개 봉합, 연골 및 관절연골 치유, 피부 접합, 장기/분비선 절개면 지혈, 위장관 분합, 및 힘줄 및 인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The material for hemostasis includes at least one of neurosurgical surgery including a vascular surgery area, orthopedic surgery including adhesion of bone, hemostasis of a laceration patient, suture of a femoral artery, cataract incision suture, cartilage and articular cartilage healing, skin joining, But are not limited to, hemostasis, gastrointestinal tract differentiation, tendon and ligament healing, and the like.
또한 본 발명은 주입형 이중 가교 하이드로젤을 포함하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체를 제공한다.The present invention also provides a carrier for a physiologically active substance or a drug delivery carrier, which comprises an injectable double crosslinked hydrogel.
상기 생리활성물질 또는 약물은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.The physiologically active substance or drug may be any one or two or more selected from the group consisting of peptides or protein drugs, antibacterial agents, anticancer agents and anti-inflammatory agents.
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The peptide or protein drug may be a fibroblast growth factor (FGF), a vascular endothelial growth factor (VEGF), a transforming growth factor (TGF), a bone morphogenetic factor protein, BMP), human growth hormone (hGH), pGH, leucocyte growth factor (G-CSF), erythrocyte growth factor (EPO), macrophage growth factor (M-CSF), tumor necrosis factor ), Epithelial growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), interferon-α, β, γ, interleukin-2 (IL-2), calcitonin, nerve growth factor (LHRH agonist), insulin, thyroid stimulating hormone releasing hormone (TRH), angiostatin, endostatin, somatostatin, glucagon, endorphin, Bastitor Shin, Mergein, Colistin, Bacitracin, Single Antibody , Vaccines, and mixtures thereof, but is not limited thereto.
상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Wherein the antimicrobial agent is selected from the group consisting of minocycline, tetracycline, oproxacin, phosphomycin, mergein, proproxacin, ampicillin, penicillin, doxycycline, thienamycin, cephalosporin, noradocin, gentamicin, neomycin, , Pyromomycin, micronomycin, amikacin, tobramycin, dibacin, cytotoxin, sepracur, erythromycin, cyprofloxacin, levofloxacin, enoxasin, vancomycin, imipenem, fosidic acid and mixtures thereof But it is not limited thereto.
상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Wherein the anticancer agent is selected from the group consisting of paclitaxel, texothier, adriamycin, endostatin, angiostatin, mitomycin, bleomycin, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, daunorubicin, dirubicin, 5-fluorouracil, methotrexate, Thymomycin-D, and mixtures thereof. However, the present invention is not limited thereto.
상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Wherein the anti-inflammatory agent is selected from the group consisting of acetaminophen, aspirin, ibuprofen, diclofenac, indomethacin, piroxycam, fenoprofen, plubiprofen, ketoprofen, naproxen, Camphor, camphor, tenoxicam, and mixtures thereof, but is not limited thereto.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited by these examples.
<실시예 1> 재료 준비Example 1 Preparation of Material
아크릴산(Acrylic acid; 이하 'AAc'), 아크릴아마이드(acrylamide; 이하'AAm'), 에틸렌글리콜 디아크릴레이트(ethylene glycol diacrylate; 이하 'EGDA'), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; 이하 'PEG'), 플루로닉 F127-디아크릴레이트(pluronic F127-diacrylate; 이하 'F127DA'), 헤파린, 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase, 250~330 U/mg; 이하 'HRP'), 과산화수소(hydrogen peroxide, 이하 'H2O2'), 4-메틸아미노피리딘 (4-dimethylaminoprydine; 이하 'DMAP'), p-니트로페닐클로로포르메이트 (p-nitrophenylchloroformate; 이하 'PNC'), 티라민(tyramine; 이하 'TA'), 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 이하 'HPA'), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; 이하 'EDC'), N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide; 이하 'NHS'), 에틸렌 디아민(ethylene diamine; 이하 'EA'), 2-모르폴리노에탄술폰산(2-morpholinoethanesulfonic acid; 이하 'MES'), 염화철(ferrous chloride; 이하 'FeCl2'), l-아스코르브산(l-ascorbic acid; 이하 'AA')를 시그마 알드리치 사로부터 구입하였다(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). (Hereinafter referred to as 'AA'), acrylamide (hereinafter referred to as 'AAm'), ethylene glycol diacrylate (EGDA), polyethylene glycol (PEG) (F127DA), heparin, horseradish peroxidase (250-330 U / mg, hereinafter referred to as HRP), hydrogen peroxide (hereinafter referred to as "'H 2 O 2 '), 4-dimethylaminopyridine (DMAP), p-nitrophenylchloroformate (PNC), tyramine (TA) 3-hydroxypropionic acid (hereinafter HPA), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide EDC '), N-hydroxysuccinimide (NHS), ethylene diamine (EA), 2-morpholy Ethane sulfonic acid (2-morpholinoethanesulfonic acid; hereinafter 'MES'), iron chloride (ferrous chloride; hereinafter 'FeCl 2'), l- ascorbic acid (l-ascorbic acid; hereinafter 'AA') were (Sigma purchased from Sigma-Aldrich captive Aldrich, St. Louis, MO, USA).
4-지 폴리프로필렌 옥사이드(4-arm polypropylene oxide; PPO) 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide; 이하 'PEO') (분자량= 18,000 g/mol; Tetronic)를 바스프 코리아로부터 구입하였다(BASF Korea, Seoul, Korea). 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; 이하 'DMSO') 및 트리에틸아민(triethylamine; 이하 'TEA')를 준세이화학(Junsei Chemical, Tokyo, Japan), 및 간토화학(Kanto Chemical, Tokyo, Japan)에서 각각 구입하였다. 모든 화학물질은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 4-arm polypropylene oxide (PPO) polyethylene oxide (PEO) (molecular weight = 18,000 g / mol; Tetronic) was purchased from BASF Korea (BASF Korea, Seoul, Korea) . Dimethylsulfoxide (DMSO) and triethylamine (TEA) were purchased from Junsei Chemical, Tokyo, Japan and Kanto Chemical, Tokyo, Japan, respectively. Respectively. All chemicals were used without further purification.
생체 외 세포를 관찰하기 위해, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium; 이하 'DMEM'), 소태아혈청(fetal bovine serum; 이하 'FBS'), 페니실린-스트렙토마이신 (penicillinstreptomycin; 이하 'PS'), 및 둘베코 인산 완충액(Dulbecco's phosphate buffered saline; 이하 'DPBS')을 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구매하였으며, WST-1 시약은 두젠바이오사(Dogenbio, Seoul, Korea)로부터 구입하였다.(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (hereinafter, referred to as 'PS'), ) And Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) were purchased from Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). WST-1 reagent was purchased from Dogenbio, Seoul, Korea Respectively.
<실시예 2> 젤라틴-히드록시페닐프로피온산 (GH) 고분자 합성Example 2 Synthesis of Gelatin-Hydroxyphenylpropionic Acid (GH) Polymer
젤라틴-히드록시페닐프로피온산(gelatin-hydroxyphenyl propionic acid; 이하 'GH') 고분자는 종래 방법에 따라 EDC 및 NHS의 존재 하에 젤라틴과 HPA의 결합에 의해 합성되었다. Gelatin-hydroxyphenyl propionic acid (hereinafter referred to as 'GH') polymer was synthesized by binding of gelatin and HPA in the presence of EDC and NHS according to a conventional method.
DI water와 DMF 가 3:2의 비율로 구성된 조용매(co-solvent)를 사용, 15 mL의 조용매에 용해된 EDC 3.83 g을 HPA 3.32 g이 125 mL의 조용매에 용해된 용액에 투입하였다. 1시간 동안 활성화시킨 후에, 상기 용액에 3.45 g의 NHS가 조용매 15 mL에 용해된 용액을 투입하여 1시간 동안 교반 하였다. 3.83 g of EDC dissolved in 15 mL of a co-solvent was added to a solution of 3.32 g of HPA dissolved in 125 mL of the co-solvent using a co-solvent in which DI water and DMF were mixed at a ratio of 3: 2 . After activation for 1 hour, 3.45 g of NHS was added to the solution and the mixture was stirred for 1 hour.
상기 활성화된 HPA 용액을 젤라틴 용액(5 g in 150 mL DI water, 40℃)에 투입한 후 24시간 동안 40℃의 온도를 유지하며 반응시켰으며. 상기 반응시킨 혼합물을 40℃에서 여과막(분자량컷오프=15,000 Da)을 이용하여 여과하고, 동결건조하여 GH 고분자를 수득하였다.The activated HPA solution was added to a gelatin solution (5 g in 150 mL DI water, 40 ° C.), and reacted at a temperature of 40 ° C. for 24 hours. The reacted mixture was filtered at 40 ° C using a filtration membrane (molecular weight cutoff = 15,000 Da) and lyophilized to obtain a GH polymer.
<실시예 3> 테트로닉-티라민 (TTA) 고분자 합성Example 3 Synthesis of Tetronic-Tyramine (TTA) Polymer
테트로닉-티라민(TTA) 고분자는 종래 알려진 방법에 따라 합성하였다. Tetronic-tyramine (TTA) polymers were synthesized according to known methods.
테트로닉을 다이옥산에 용해시킨 후, 이 용액에 DMAP 및 TEA를 다이옥산에 용해시킨 용액과, PNC를 다이옥산에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합하여 아민-반응성 테트로닉-PNC를 얻었다.Tetronic was dissolved in dioxane. To this solution, a solution of DMAP and TEA dissolved in dioxane and a solution of PNC dissolved in dioxane were successively mixed to obtain an amine-reactive Tetronic-PNC.
TA가 용해된 DMSO 용액에 상기 아민-반응성 테트로닉-PNC를 천천히 투입한 후 중합시켰다. 이렇게 중합된 반응물은 메탄올을 이용한 멤브레인 투석을 수행하였고, 농축, 침전물 석출, 여과 및 건조과정을 거쳐 진공 상태에서 TTA 고분자를 얻었다. The amine-reactive Tetronic-PNC was slowly added to the DMSO solution in which TA was dissolved and then polymerized. The polymerized reactants were dialyzed with methanol, concentrated, precipitated, filtered and dried to obtain TTA polymer in a vacuum state.
상기 얻어진 TTA 고분자의 화학적 구조는 1H-NMR 분광법(AS400, OXFORD instrument, UK) 및 자외선/가시광선 분광 광도계(V-750, Jasco, Japan)을 이용하여 확인하였다.The chemical structure of the obtained TTA polymer was confirmed by 1 H-NMR spectroscopy (AS400, OXFORD instrument, UK) and ultraviolet / visible light spectrophotometer (V-750, Jasco, Japan).
<실시예 4> 헤파린-폴리에틸렌글리콜-티라민 (HPT) 중합체 합성Example 4 Synthesis of Heparin-Polyethylene Glycol-Tyramine (HPT) Polymer
헤파린-폴리에틸렌글리콜-티라민(heparin-PEG-tyramine; HPT) 중합체는 종래 알려진 방법에 따라 합성하였다. The heparin-PEG-tyramine (HPT) polymer was synthesized according to a conventionally known method.
4 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 다이옥산에 용해시킨 후, 질소분위기 하에서 상기 용액에 DMAP 0.61g과 TEA 0.51g을 다이옥산 100 ml에 용해시킨 용액과 PNC 1.01g을 다이옥산 20ml에 용해시킨 용액을 순차적으로 첨가하여 24시간 동안 교반하였다. 상기 교반한 반응물을 회전식 증발기를 이용하여 고농도로 농축한 후 차가운 디에틸에테르에 천천히 떨어뜨려 침전시키고 감압 여과하여 PNC-PEG-PNC 침전물을 수득하였다. After dissolving PEG having a molecular weight of 4 kDa in dioxane, a solution prepared by dissolving 0.61 g of DMAP and 0.51 g of TEA in 100 ml of dioxane and 1.01 g of PNC in 20 ml of dioxane was added successively to the solution under nitrogen atmosphere And stirred for 24 hours. The stirred reaction mixture was concentrated to a high concentration using a rotary evaporator, slowly dropped into cold diethyl ether, precipitated and filtered under reduced pressure to obtain a PNC-PEG-PNC precipitate.
앞서 얻어진 PNC-PEG-PNC(10 g)을 DMF 40 ml에 용해시키고, TA 0.3641 g을 DMF 40 ml에 용해시킨 후, 30 ℃의 질소분위기에서 PNC-PEG-PNC 용액에 티라민 용액을 천천히 적하한 후 6시간 동안 교반하였다. 그 후, EA 4.629 g을 DMF(20 ml)에 용해시킨 용액을 상기 혼합물에 천천히 적하한 후 24시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 차가운 디에틸에테르에 적하한 후 감압 여과하여 얻어진 침전물을 감압건조하여 흰색 분말 형태의 NH2-PEG-TA를 수득하였다. PNC-PEG-PNC (10 g) obtained above was dissolved in 40 ml of DMF, and 0.3641 g of TA was dissolved in 40 ml of DMF. Then, a solution of thiamine in PNC-PEG-PNC solution was slowly dropped in a nitrogen atmosphere at 30 ° C The mixture was stirred for 6 hours. Thereafter, a solution prepared by dissolving 4.629 g of EA in DMF (20 ml) was slowly added dropwise to the above mixture, followed by stirring for 24 hours. The mixture was added dropwise to cold diethyl ether, filtered under reduced pressure, and the resulting precipitate was dried under reduced pressure to obtain NH 2 -PEG-TA in the form of a white powder.
헤파린 1 g을 30 ml의 0.1 M MES에 용해시킨 후, 1 ml의 0.1 M MES에 용해시킨 EDC 65 mg를 넣어 주었다. 15분이 지난 후 1 ml의 0.1 M MES에 용해시킨 NHS 19 mg을 넣어주었다. 15분이 지난 후 10 ml의 0.1 M MES에 용해시킨 NH2-PEG-TA(1.42 g)을 넣어주고 24시간 동안 교반하였다. 그 후 감압여과 한 뒤, 상기 혼합물을 여과막(분자량컷오프=15,000 Da)을 이용하여 3일간 여과하였고 동결건조하여 HPT 고분자를 수득하였다.1 g of heparin was dissolved in 30 ml of 0.1 M MES and then 65 mg of EDC dissolved in 1 ml of 0.1 M MES was added. After 15 minutes, 19 mg of NHS dissolved in 1 ml of 0.1 M MES was added. After 15 minutes, 10 ml of NH 2 -PEG-TA (1.42 g) dissolved in 0.1 M MES was added and stirred for 24 hours. After filtration under reduced pressure, the mixture was filtered using a filtration membrane (molecular weight cutoff = 15,000 Da) for 3 days and lyophilized to obtain HPT polymer.
<실시예 5> 펜톤가교 반응을 이용한 아크릴산 하이드로젤 제조Example 5 Production of acrylic acid hydrogel using Fenton crosslinking reaction
개시제인 EGDA를 포함한 증류수에 AAc를 용해시켜 고분자 전구체 용액을 제조하였다. 그 후 상기 고분자 전구체 용액을 FeCl2 , AA 및 H2O2 와 혼합한 후 교반하여 아크릴산 하이드로젤을 제조하였다. 하이드로젤 내의 각 시료의 농도는 EGDA (0.25 중량%), AAc (30 중량%), FeCl2 (0.025 mM), AA (4.975 mM) 및 H2O2 (20 mM)이었다. The polymer precursor solution was prepared by dissolving AAc in distilled water containing EGDA as an initiator. Thereafter, the polymer precursor solution was mixed with FeCl 2 , AA, and H 2 O 2 , followed by stirring to produce acrylic acid hydrogel. The concentration of each sample in the hydrogel was EGDA (0.25 wt%), AAc (30 wt%), FeCl 2 (0.025 mM), AA (4.975 mM) and H 2 O 2 (20 mM).
<실시예 6> 효소가교반응을 이용한 젤라틴 하이드로젤 제조Example 6 Preparation of gelatin hydrogel using enzyme cross-linking reaction
5 중량%의 GH 고분자를 40℃의 20 mM H2O2 용액 (용액 A) 및 0.005 mg/mL HRP 용액 (용액 B)에 각각 완전히 용해시킨 후 상기 용액 A 및 용액 B를 혼합하고 흐름이 관찰되지 않을 때까지 완만히 교반하여 젤라틴 하이드로젤을 제조하였다.After 5 wt% of the GH polymer was completely dissolved in each of 20 mM H 2 O 2 solution (solution A) and 0.005 mg / mL HRP solution (solution B) at 40 ° C, the solutions A and B were mixed, The mixture was gently stirred until no gelatin hydrogel was prepared.
<실시예 7> 펜톤/효소 가교반응을 이용한 이중 가교 하이드로젤 제조Example 7 Preparation of Double-Crosslinked Hydrogel Using Fenton / Enzyme Crosslinking
이중 가교 하이드로젤을 제조하기 위해, AAc 단량체, EGDA 가교제, GH 고분자 및 펜톤/효소 시약을 바이알에 투입하였고, AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 합성을 개시하기 위해 H2O2 용액을 첨가하였다. 상기 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤은 복잡한 처리과정 없이 재료 및 시약의 간단한 혼합과 펜톤 및 효소 반응을 통해 형성할 수 있었다. To prepare the double crosslinked hydrogel, the AAc monomer, EGDA crosslinker, GH polymer, and Fenton / enzyme reagent were added to the vial and H 2 O 2 solution was added to initiate the synthesis of the AAc / GH double crosslinked hydrogel. The AAc / GH double bridged hydrogel could be formed through simple mixing of materials and reagents and Fenton and enzyme reactions without complex processing.
즉, 다양한 농도의 EGDA를 함유한 증류수에 AAc 단량체와 GH를 용해시켰다. 상기 용해시킨 전구체 용액을 FeCl2, AA, HRP 및 H2O2 와 혼합시켜 이중 가교 하이드로젤을 제조하였다. 이중 가교 하이드로젤 내 각 시료의 농도는 AAc (30 중량%), GH (5 중량%), FeCl2 (0.025 mM), AA (4.975 mM), HRP (0.05 mg/mL), H2O2 (20 mM) 이었으며 EGDA의 농도는 0.1, 0.25, 및 0.5 중량%가 되도록 제조하였다. That is, AAc monomer and GH were dissolved in distilled water containing various concentrations of EGDA. The dissolved precursor solution was mixed with FeCl 2 , AA, HRP and H 2 O 2 to prepare a double crosslinked hydrogel. The concentrations of AAc (30 wt%), GH (5 wt%), FeCl 2 (0.025 mM), AA (4.975 mM), HRP (0.05 mg / mL) and H 2 O 2 20 mM) and the concentration of EGDA was 0.1, 0.25, and 0.5% by weight.
<< 실험예Experimental Example 1> 기계적 강도 측정 1> Measurement of mechanical strength
실시예 7에서 제조한 이중 가교 하이드로젤의 기계적 성능은 실시예 5 및 실시예 6에 따른 하이드로젤의 기계적 성능과 비교하여 측정하였으며, 기계적 성능 측정을 위하여 만능 재료 시험기(universal testing machine; UTM)를 이용하였다.The mechanical performance of the double-crosslinked hydrogel prepared in Example 7 was compared with the mechanical performance of the hydrogel according to Example 5 and Example 6, and a universal testing machine (UTM) was used for mechanical performance measurement Respectively.
압축 강도 측정을 위하여, 테프론 몰드(10x10x10 mm3)에서 준비한 입방형 하이드로젤 시료를 UTM의 하부 플레이트 상에 배치하고 1000 N 로드셀을 장착하였으며 로드셀과 연결된 상부 플레이트로 꾹 눌렀고, 3 mm/min의 압축속도로 크랙이 생길 때까지 눌렀다.For the measurement of compressive strength, a cubic hydrogel sample prepared from a Teflon mold (10x10x10 mm 3 ) was placed on the bottom plate of UTM, and a 1000 N load cell was mounted. The sample was pressed with a top plate connected to the load cell, I pushed it until it cracked at speed.
인장 강도 측정을 위하여, 테프론 몰드(10x35x3 mm3)에서 준비한 하이드로젤 시료를 준비하였고, 100 N 로드셀을 장착하였으며, 크로스헤드 속도를 30 mm/min으로 하였다. 압축과 연신을 위한 변형은 최초 길이에 대한 변형된 길이로서 정의하였고, 응력은 힘을 시료의 최초 단면적으로 나누어 산출하였다.For measurement of tensile strength, a hydrogel specimen prepared in a Teflon mold (10 × 35 × 3 mm 3 ) was prepared, a 100 N load cell was mounted, and the crosshead speed was 30 mm / min. The strain for compression and stretching was defined as the strained length for the initial length and the stress was calculated by dividing the force by the initial cross-sectional area of the sample.
(1) 기계적 강도 평가(1) Evaluation of mechanical strength
도 3과 같이, 펜톤가교 반응을 통한 AAc 하이드로젤 및 효소가교 반응을 통한 젤라틴 하이드로젤의 최대 압축강도는 각각 0.8 MPa 및 0.26 MPa인 반면, 펜톤/효소가교 반응을 통한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 압축강도는 4.2 MPa을 나타내었으며 또한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 최대 압축 변형율은 AAc 하이드로젤 및 젤라틴 하이드로젤의 최대 압축 변형율보다 더 우수함을 알 수 있었다. 상기 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤은 98%의 압축 변형에서도 쉽게 붕괴되지 않으며, 외관상 손상 없이 원래의 형상으로 완전히 회복된 반면, AAc 하이드로젤은 95%의 압축 변형에서 파열되었으며, 또한 GH 하이드로젤은 오직 80%의 압축 변형만을 유지할 수 있었다. As shown in FIG. 3, the maximum compressive strengths of gelatin hydrogel through AAc hydrogel and enzyme crosslinking through Fenton's cross-linking reaction were 0.8 MPa and 0.26 MPa, respectively, while AAc / GH double cross-linked hydrogel The compressive strength of AAc / GH double crosslinked hydrogel was higher than that of AAc hydrogel and gelatin hydrogel. The AAc / GH double bridged hydrogel was not easily disintegrated at 98% compressive strain and completely recovered to its original shape without apparent damage, whereas AAc hydrogel ruptured at 95% compressive strain and GH hydrogel Only 80% compressive strain could be maintained.
또한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤은 AAc 하이드로젤 및 젤라틴 하이드로젤에 비해 우수한 인장 특성을 나타내었다. AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 파괴변형 및 인장강도는 각각 6.9 mm/mm 및 0.2 MPa을 나타내었으며, AAc 하이드로젤의 파괴변형 및 인장강도는 각각 5.9 mm/mm 및 0.07 MPa이며, 젤라틴 하이드로젤의 파괴변형 및 인장강도는 각각 0.75 mm/mm 및 0.02 MPa를 나타내었다. AAc / GH double crosslinked hydrogels showed better tensile properties than AAc hydrogel and gelatin hydrogel. The fracture strain and tensile strength of AAc / GH double bridged hydrogel were 6.9 mm / mm and 0.2 MPa, respectively. The fracture strain and tensile strength of AAc hydrogel were 5.9 mm / mm and 0.07 MPa, respectively, and the gelatin hydrogel The fracture strain and tensile strength were 0.75 mm / mm and 0.02 MPa, respectively.
상기 이러한 결과를 통해 펜톤/효소가교 반응을 통한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤은 기계적 강도가 탁월하게 개선되는 것을 확인할 수 있었다.From these results, it was confirmed that the AAc / GH double crosslinked hydrogel through the Fenton / enzyme cross-linking reaction exhibits excellent mechanical strength.
(2) 젤화시간 평가(2) Gelling time evaluation
펜톤시약인 Fe2+ 비율 및 H2O2 농도의 변화와, 효소반응 시약인 HRP의 농도 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 젤화시간을 vial tilting method를 이용하여 평가하였다. Changes in Fe 2+ ratio and H 2 O 2 concentration, which are Fenton 's reagents, and gelation time of double crosslinked hydrogel according to concentration of enzyme reaction reagent, HRP, were evaluated by vial tilting method.
도 4를 참조하면, Fe2+ 비율에 따라, 5초 내지 90초의 범위에서 이중 가교 하이드로젤의 젤화시간을 제어하였다. 그리고, H2O2의 농도가 10 mM에서 40 mM으로 증가하는 경우 젤화시간이 감소된 반면, HRP 농도는 젤화속도에 의미있는 영향을 미치지 못하였고, H2O2의 농도가 20 mM 이상인 경우, 젤화속도는 HRP 농도에 의해 영향을 받지 않았다. Referring to FIG. 4, the gelation time of the double crosslinked hydrogel was controlled in the range of 5 to 90 seconds according to the Fe 2+ ratio. When the concentration of H 2 O 2 increased from 10 mM to 40 mM, the gelation time decreased, but HRP concentration did not significantly affect the gelation rate. When the concentration of H 2 O 2 was more than 20 mM , And the rate of gelation was not affected by HRP concentration.
(3) 가교도에 따른 이중 가교 하이드로젤 기계적 물성 평가(3) Evaluation of mechanical properties of double-crosslinked hydrogel according to crosslinking degree
가교제인 EGDA의 농도 변화[0.10 중량%(DN (L)), 0.25 중량%(DN (M)) 및 0.50 중량%(DN (H))]에 따른 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 기계적 성능을 정량적으로 측정하였다. The mechanical performance of the AAc / GH double crosslinked hydrogel according to the concentration change of the crosslinking agent EGDA [0.10 wt% (DN (L)), 0.25 wt% (DN (M)) and 0.50 wt% (DN And quantitatively measured.
그 결과, 도 5와 같이 각각의 샘플에 대한 최대 압축강도는 DN (L), DN (M) 및 DN (H)이 각각 2.6 MPa, 4.2 MPa, 및 3.3 MPa를 나타내었다. 이를 통해 가교제인 EDGA의 함량이 0.25 중량%일 때 가교도가 우수함을 알 수 있었고, 96%에서도 쉽게 붕괴되지 않으며, 외관상 손상 없이 원래의 형상으로 완전히 회복되었다. 또한 이 실험은 가교제의 농도의 변화에 따라 이중 가교 하이드로젤의 물성을 다양하게 구현하는 것이 가능함을 나타내는 결과로 기존의 제조방법이 가지는 제어가 용이하지 않던 한계점을 해결하는 수단으로 본 제조법이 이용될 수 있음을 입증한다. As a result, as shown in FIG. 5, the maximum compressive strengths for the respective samples were 2.6 MPa, 4.2 MPa, and 3.3 MPa, respectively, for DN (L), DN (M), and DN As a result, it was found that when the content of the crosslinking agent EDGA was 0.25% by weight, the crosslinking degree was excellent, and even at 96%, it was not easily collapsed and completely recovered to its original shape without any apparent damage. Also, this experiment shows that it is possible to variously realize physical properties of the double-crosslinked hydrogel according to the change of the concentration of the crosslinking agent. As a result, the present manufacturing method is used as a means for solving the limitations of the conventional manufacturing method .
(4) AAc 및 GH 함량에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성 평가(4) Evaluation of mechanical properties of double-crosslinked hydrogel according to AAc and GH contents
이중 가교 하이드로젤의 AAc 단량체 및 GH 고분자의 다양한 농도 변화에 따른 기계적 물성을 평가하였다. The mechanical properties of AAc monomers and GH polymers of crosslinked hydrogels were evaluated.
즉, GH(5 중량%), EGDA(0.25 중량%), Fe2+ 비율(0.5%), HRP(0.05 mg/ml), 및 H202(20 mM)의 일정한 조성 하에 AAc의 함량을 10 중량%, 20 중량%, 30 중량% 및 40 중량%로 함량을 변화시켜 각각 투입하여 제조된 이중 가교 하이드로젤은 도 6과 같이 각각 2.1 MPa, 3.1 MPa, 4.2 MPa, 및 3.3 MPa의 최대 압축강도 값을 나타내었다. That is, the content of AAc was measured under a constant composition of GH (5% by weight), EGDA (0.25% by weight), Fe 2+ ratio (0.5%), HRP (0.05 mg / ml), and H 2 O 2 The double crosslinked hydrogel prepared by varying the contents of 10% by weight, 20% by weight, 30% by weight and 40% by weight was subjected to maximum compression of 2.1 MPa, 3.1 MPa, 4.2 MPa and 3.3 MPa, Intensity value.
또한, AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), Fe2+ 비율(0.5%), HRP(0.05 mg/ml) 및 H202(20 mM)의 일정한 조성 하에 GH 고분자를 3 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 및 20 중량%로 함량을 변화시켜 각각 투입하여 제조된 이중 가교 하이드로젤은 도 6과 같이 각각 1.8 MPa, 4.4 MPa, 3.8 MPa, 및 2.6 MPa의 최대 압축강도 값을 나타내었다.Under the constant composition of AAc (30 wt%), EGDA (0.25 wt%), Fe 2+ ratio (0.5%), HRP (0.05 mg / mL) and H 2 O 2 (20 mM) The double crosslinked hydrogels prepared by varying the contents of 5 wt%, 5 wt%, 10 wt%, and 20 wt%, respectively, had maximum compressive strengths of 1.8 MPa, 4.4 MPa, 3.8 MPa, and 2.6 MPa, Respectively.
(5) Fe(5) Fe 2+2+ 비율, H Ratio, H 22 OO 22 농도, 및 HRP 농도의 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성 평가 Evaluation of mechanical properties of double crosslinked hydrogel according to changes of concentration and HRP concentration
일정한 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), HRP(0.05 mg/ml), 및 H2O2(20mM)의 조성 하에 다양한 Fe2+ 비율(0.1%, 0.25%, 0.5%, 및 1%) 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 최대 압축강도를 측정하였다. 도 7(a)을 참조하면, Fe2+ 비율이 0.5%일 경우 우수한 최대 압축강도 값을 나타냈으며, 그 값은 4.2 MPa 임을 알 수 있었다.Various Fe 2+ ratios (0.1%, 0.5%) were prepared under the composition of constant GH (5 wt.%), AAc (30 wt.%), EGDA (0.25 wt.%), HRP (0.05 mg / ml), and H 2 O 2 0.25%, 0.5%, and 1%). The maximum compressive strength of the double crosslinked hydrogel was measured. Referring to FIG. 7 (a), when the Fe 2+ ratio was 0.5%, the maximum compressive strength value was found to be 4.2 MPa.
또한, 일정한 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), HRP(0.05 mg/ml) 및 Fe2+(0.5 중량%)의 조성 하에 다양한 H2O2 농도(5 mM 10 mM, 20 mM, 30 mM, 및 40 mM) 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 최대 압축강도를 측정하였다. 도 7(b)를 참조하면, H2O2 농도가 30 mM일 경우, 우수한 최대 압축강도 값을 나타냈으며, 그 값은 4.1 MPa 임을 알 수 있었다.Moreover, various H 2 O 2 concentration of the composition under certain GH (5 wt%), AAc (30% by weight), EGDA (0.25 wt%), HRP (0.05 mg / ml) and Fe 2+ (0.5 wt.%) ( 5
또한, 일정한 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), Fe2+(0.5%) 및 H2O2(20mM)의 조성 하에 다양한 HRP 농도(0 mg/ml, 0.025 mg/ml, 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml) 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 최대 압축강도를 측정하였다. 도 7(c)를 참조하면, HRP 농도가 0.05 mg/ml일 경우 우수한 최대 압축강도 값을 나타냈으며, 그 값은 4.2 MPa 임을 알 수 있었다.In addition, various HRP concentrations (0 mg / ml) were measured under the composition of constant GH (5 wt.%), AAc (30 wt.%), EGDA (0.25 wt.%), Fe 2+ (0.5 wt.%) And H 2 O 2 , 0.025 mg / ml, 0.05 mg / ml, and 0.1 mg / ml), the maximum compressive strength of the double crosslinked hydrogel was measured. Referring to FIG. 7 (c), when the HRP concentration was 0.05 mg / ml, the maximum compressive strength value was found to be 4.2 MPa.
(6) pH 조건 변화에 따른 이중 가교 하이드로젤의 기계적 물성 평가(6) Evaluation of mechanical properties of double crosslinked hydrogel according to pH condition
기본적인 조성은 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), Fe2+ 비율(0.5%), HRP(0.05 mg/ml) 및 H2O2(20mM)에서 수산화나트륨(NaOH) 및 염산(HCl)을 적정량 혼합함으로써 고분자 전구체 용액의 다양한 pH 조건(pH 2, pH 5, pH 7, 및 pH 10) 변화에 따른 이중 가교하이드로젤의 최대 압축강도를 측정하였다.The basic composition of the hydroxide in GH (5 wt%), AAc (30 wt%), EGDA (0.25 wt%), Fe 2+ ratio (0.5%), HRP (0.05 mg / ml) and H 2 O 2 (20mM) The maximum compressive strength of the double crosslinked hydrogel was measured by varying the pH (
도 8을 참조하면, pH에 따라 펜톤 및 효소반응의 활성도가 변화하여 압축강도의 변화를 보였으며, pH 5 조건에서 형성된 하이드로젤의 압축강도가 가장 높았음을 알 수 있다. Referring to FIG. 8, the activity of the Fenton and enzyme reaction was changed according to the pH, and the compressive strength was changed. The hydrogel formed at
이는 펜톤 및 효소반응의 pH에 따른 반응 활성(각 반응의 최대 활성 pH: 펜톤반응(pH 2), 효소반응(pH 6))이 이중 가교 하이드로젤의 물성에 영향을 미치기 때문이며 pH 5에서 이중 가교 하이드로젤의 최적 물성이 나타났음을 알 수 있다.This is because the reaction activity (the maximum active pH of each reaction: the Fenton reaction (pH 2), the enzyme reaction (pH 6)) depending on the pH of the Fenton and enzyme reaction affects the physical properties of the double crosslinked hydrogel, It can be seen that the optimum properties of the hydrogel are shown.
즉, 상기 다양한 조건에서의 수행된 기계적 물성 평가로부터 이중 가교 하이드로젤을 제조하는 최적의 함량은 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%), Fe2+ 비율(0.5%), HRP(0.05 mg/ml), H202(20 mM) 및 pH 5 조건임을 알 수 있었다.That is, from the evaluation of the mechanical properties performed under the various conditions described above, the optimal contents for producing the double crosslinked hydrogel were GH (5 wt%), AAc (30 wt%), EGDA (0.25 wt%), Fe 2+ ratio 0.5%), HRP (0.05 mg / ml), H 2 O 2 (20 mM) and
<실험예 2> 이중 가교 하이드로젤의 세포적합성 시험Experimental Example 2 Cell Suitability Test of Double-Crosslinked Hydrogel
이중 가교 하이드로젤 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 용출시험법(eluting test methods)을 이용하여 세포적합성 시험을 수행하였다. 즉, 분리된 배지에서 30분 동안 예비경화시킨 하이드로젤(1 g)을 24시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 배양시켜 추출물(10 ml)을 얻었다. 인간 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblasts; hDFBs)는 96-웰 플레이트(5ⅹ103 세포/웰)에 분주하였고, 37℃에서 24시간 동안 5% CO2의 가습 분위기 하에서 10% FBS 및 1% PS를 첨가한 DMEM에서 배양하였다. To evaluate the cytotoxicity of the double-crosslinked hydrogel extract, a cell compatibility test was conducted using eluting test methods. That is, a hydrogel (1 g) preliminarily cured in a separate medium for 30 minutes was cultured in an incubator at 37 ° C for 24 hours to obtain an extract (10 ml). Human dermal fibroblasts (hDFBs) were dispensed into 96-well plates (5 × 10 3 cells / well) and added with 10% FBS and 1% PS under humidified atmosphere of 5% CO 2 for 24 hours at 37 ° C. And cultured in one DMEM.
상기 추출물(200 ㎕)을 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 12시간 후에 WST-1 용액을 각 웰 플레이트에 첨가한 후 상기 웰 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포생존율은 450 nm의 파장에서 각 웰 플레이트의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기(BioRad, Model 550, Hercules, CA, USA)에 의해 측정하였다.The extract (200 μl) was added to the 96-well plate, and after 12 hours, the WST-1 solution was added to each well plate and the well plate was incubated at 37 ° C for 2 hours. The cell viability was measured by a microplate reader (BioRad, Model 550, Hercules, CA, USA) at a wavelength of 450 nm.
그 결과, 도 9와 같이 이중 가교 하이드로젤의 세포적합성은 H2O2 농도에 영향을 받지 않으며 Fe2+ 비율이 0.1%에서 1.0%로 증가할수록 세포적합성은 증가하였다. 이때, Fe2+ 비율이 낮음도 불구하고 상대적으로 높은 세포독성을 나타내는 것은 잔류하는 AAc 단량체에 의한 것으로 판단되었다. 보다 높은 농도의 펜톤 시약의 처리는 중합 공정을 더 가속화함으로써 중합도를 더 높일 수 있었다. 일반적으로 독성 시약으로 분류되는 H2O2에 의해 세포독성을 초래하지만, 본 발명에 따른 하이드로젤 중 H2O2의 잔류량은 중합 후 극히 소량이기 때문에 큰 문제를 야기하지 않는 것으로 판단되었다. As a result, the cell fitness of the double-crosslinked hydrogel was not influenced by the H 2 O 2 concentration as shown in FIG. 9, and the cell fitness was increased as the Fe 2+ ratio was increased from 0.1% to 1.0%. At this time, it was judged that residual AAc monomer showed relatively high cytotoxicity despite low Fe 2 + ratio. Treatment of higher concentrations of Fenton's reagent could further increase the degree of polymerization by further accelerating the polymerization process. Generally, H 2 O 2 classified as a toxic reagent causes cytotoxicity, but it is judged that the residual amount of H 2 O 2 in the hydrogel according to the present invention does not cause a large problem since it is extremely small after polymerization.
상기 방법에 따라 과산화수소 정량 분석 키트를 이용하여 잔류하는 H2O2의 양을 측정하였다. 하지만, 정량키트의 분석범위 내에서 H2O2는 검출되지 않았으며, 이는 H2O2 농도가 5μM 미만의 소량임을 의미한다. 상기 H2O2 농도는 세포독성 수준인 1 mM H2O2 농도보다 훨씬 적은 양이다. The amount of residual H 2 O 2 was measured using a hydrogen peroxide quantitative analysis kit according to the above method. However, H 2 O 2 was not detected within the assay range of the quantitation kit, which means that the H 2 O 2 concentration is a small amount less than 5 μM. The H 2 O 2 concentration is much less than the cytotoxic 1 mM H 2 O 2 concentration.
도 9를 참조하면, 다양한 EGDA 함량(0.1 내지 0.5 중량%) 변화에 따라 가교도의 영향을 추가적으로 평가하였으며 hDFB 세포의 80% 이상이 생존하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 세포독성 주요 원인은 잔류하는 AAc 단량체에 의한 것이며, 또한 Fe2+ 비율을 제어함으로써 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤의 세포적합성을 향상시킬 수 있었다.Referring to FIG. 9, the influence of the degree of crosslinking was further evaluated according to various EGDA contents (0.1 to 0.5% by weight), and it was confirmed that more than 80% of hDFB cells survived. From the above results, the main cause of cytotoxicity of AAc / GH double crosslinked hydrogels was attributed to residual AAc monomer, and by controlling Fe 2+ ratio, cell compatibility of AAc / GH double crosslinked hydrogel could be improved.
<실험예 3> 다양한 조성을 갖는 이중 가교 하이드로젤의 기계적 강도 평가Experimental Example 3 Evaluation of Mechanical Strength of Double-Crosslinked Hydrogel Having Various Compositions
하기 표 1과 같이 일차 네트워크 하이드로젤에 이용되는 단량체의 종류와, 이차 네트워크 하이드로젤에 이용되는 고분자의 종류를 변경시켜 앞선 실시예 7과 동일한 방법으로 제조한 이중 가교 하이드로젤의 기계적 강도를 측정한 결과, 도 10과 같이 아크릴 기능기 및 효소가교 기능기를 함유한 단량체와 다양한 고분자들에서 간단하게 이중 가교 하이드로젤을 제조할 수 있음을 확인하였다. 특히, 일차 네트워크 하이드로젤에 이용되는 단량체로서 아크릴산을 이용하고, 이차 네트워크 하이드로젤에 이용되는 고분자로서 GH를 이용한 경우 가장 우수한 최대 압축강도 값(4.2 MPa)을 나타내었다.The mechanical strength of the double-crosslinked hydrogel prepared in the same manner as in Example 7 was measured by changing the kind of monomer used in the primary network hydrogel and the kind of the polymer used in the secondary network hydrogel as shown in Table 1 below As a result, as shown in FIG. 10, it was confirmed that a double crosslinked hydrogel can be simply prepared from a monomer containing an acrylic functional group and an enzyme crosslinking functional group and various polymers. In particular, acrylic acid was used as the monomer used in the primary network hydrogel and the highest compressive strength (4.2 MPa) was obtained when GH was used as the polymer used in the secondary network hydrogel.
<실험예 4> 세포 부착성 평가<Experimental Example 4> Evaluation of cell adhesion
세포 부착성 평가를 위하여 실험예 3에 개시된 방법으로 하이드로젤을 제조한 후 제조된 하이드로젤 표면에 섬유아세포를 배양하였다. 실험에 사용된 세포의농도는 5×104 cells/well 이었으며 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 live/dead 분석키트로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 부착된 세포의 양은 AAc/HPT, AAc/TTA, AAc, AAc/GH 순서로 증가하였으며 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤에선 AAc대비 증가하였을 뿐 아니라 컨트롤로 이용된 TCPS 대비 더 우수한 세포부착 특성을 나타내었다. 이는 GH 고분자의 젤라틴 내에 발현되어있는 RGD 등의 세포부착단백질의 효과이다. AAc/HPT 혹은 AAc/TTA가 이용된 이중 가교 하이드로젤에선 AAc 대비 현저히 감소한 세포부착 특성을 보였는데. 이는 HPT와 TTA 고분자가 가진 방오특성에 기인하였다. For evaluation of cell adhesion, hydrogel was prepared by the method described in Experimental Example 3, and fibroblasts were cultured on the surface of the hydrogel prepared. The concentration of cells used was 5 × 10 4 cells / well and cultured for 24 hours. Cultured cells were stained with live / dead assay kit and observed with fluorescence microscope. The amount of adhered cells was increased in the order of AAc / HPT, AAc / TTA, AAc, and AAc / GH. AAc / GH double bridged hydrogel not only showed an increase in AAc but also showed better cell attachment characteristics compared to control TCPS . This is the effect of the cell adhesion protein such as RGD expressed in the gelatin of the GH polymer. AAc / HPT, or AAc / TTA, showed significantly reduced cell adhesion properties compared to AAc. This is due to the antifouling properties of HPT and TTA polymers.
결과를 도 11에 나타내었다. 도 11을 참조하면, 고분자의 조성변화를 통해 이중 가교 하이드로젤의 세포부착특성을 용이하게 변화시킬 수 있음이 확인되었다.The results are shown in Fig. Referring to FIG. 11, it was confirmed that the cell adhesion characteristics of the double-crosslinked hydrogel can be easily changed through the composition change of the polymer.
<실시예 8> 마크로코어를 갖는 이중 가교 하이드로젤 제조Example 8: Preparation of a double-crosslinked hydrogel having a macromolecule
AAc, GH 및 F127DA를 포함하는 고분자 전구체 용액을 37℃에서 30분 동안 가열한 후 FeCl2, AA, HRP 및 H2O2를 가하여 실시예 7과 동일한 방법으로 펜톤/효소 가교반응을 통해 이중 가교 하이드로젤을 제조하였다. 이중 가교 하이드로젤 내 각 시료의 농도는 AAc (25 중량%), GH (5 중량%), F127DA (5 중량%), FeCl2 (0.025 mM), AA (4.975 mM), HRP (0.05 mg/mL), H2O2 (20 mM)이 되도록 제조하였다. The polymer precursor solution containing AAc, GH and F127DA was heated at 37 占 폚 for 30 minutes and FeCl 2 , AA, HRP and H 2 O 2 were added thereto, followed by crosslinking through a Fenton / enzyme crosslinking reaction in the same manner as in Example 7 Hydrogels were prepared. The concentrations of AAc (25 wt%), GH (5 wt%), F127DA (5 wt%), FeCl 2 (0.025 mM), AA (4.975 mM), HRP ) And H 2 O 2 (20 mM).
<실험예 5> 마크로코어를 갖는 이중 가교 하이드로젤의 기계적 강도 평가Experimental Example 5 Evaluation of Mechanical Strength of Double Crosslinked Hydrogel Having Macrocore
실시예 8에 따른 마크로코어를 갖는 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤과, 가교제로서 EGDA을 이용한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤을 비교하여 기계적 강도를 측정하였으며, 상기 기계적 강도는 만능 재료 시험기(universal testing machine; UTM)을 이용하였다. 이때, 가교제로서 EGDA을 이용한 AAc/GH 이중 가교 하이드로젤은 GH(5 중량%), AAc(30 중량%), EGDA(0.25 중량%) Fe2+ 비율(0.5%), HRP(0.05 mg/ml), 및 H202(20 mM)의 조성으로 제조하였다.The mechanical strength was measured by comparing AAc / GH double crosslinked hydrogel having a macro core according to Example 8 with AAc / GH double crosslinked hydrogel using EGDA as a crosslinking agent. The mechanical strength was measured with a universal testing machine ; UTM) was used. At this time, the AAc / GH double crosslinked hydrogel using EGDA as a crosslinking agent had a ratio of GH (5 wt%), AAc (30 wt%), EGDA (0.25 wt%) Fe 2+ , ), And H 2 O 2 (20 mM).
그 결과, 도 13과 같이 F127DA를 가교제로 이용하여 제조한 하이드로젤은 기존 EGDA를 가교제로 이용한 하이드로젤에 비해 향상된 물성을 나타내었다. 상기 F127DA는 온도감응성 고분자로서 37℃에서 자가조립을 통해 이중 가교 하이드로젤 내부에 마이셀을 형성할 수 있으며, 상기 이중 가교 하이드로젤 내부에 형성된 마이셀 마크로코어는 외부에서 가해지는 충격을 효과적으로 분산시켜 결과적으로 보다 향상된 물성을 나타내었다.As a result, as shown in FIG. 13, the hydrogel prepared using F127DA as a crosslinking agent showed improved physical properties as compared with the hydrogel using the conventional EGDA as a crosslinking agent. The F127DA is a thermosensitive polymer and can form micelles inside the double crosslinked hydrogel through self-assembly at 37 DEG C. The micellar macromolecule formed inside the double crosslinked hydrogel effectively disperses the external impact, And exhibited improved physical properties.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It is to be understood that various modifications and changes may be made without departing from the scope of the appended claims.
Claims (26)
링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어진 것을 특징으로 하는, 주입형 이중 가교 하이드로젤. A primary network hydrogel by Fenton cross-linking using a monomer having an acrylic reactor and a cross-linking agent, and
Linking by dehydrogen bonding between two or more phenol derivatives or aniline derivatives adjacent to each other including two or more homo- or hetero- polymers in which a phenol derivative or an aniline derivative is bonded to a side chain of the polymer with or without a linker, ≪ / RTI > by weight of a second network hydrogel.
링커를 포함하거나 포함하지 않고 고분자의 곁사슬에 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체가 결합된 동종 또는 이종의 고분자를 둘 이상 포함하며, 둘 이상의 고분자 간 인접된 페놀 유도체 또는 아닐린 유도체 간의 탈수소 결합에 의해 연결된 효소 가교반응에 의한 이차 네트워크 하이드로젤로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 마크로코어를 갖는 주입형 이중 가교 하이드로젤. Acrylic acid as a monomer, a macrocross-linker as a cross-linking agent, a primary network hydrogel having a macrocore by a Fenton cross-linking reaction, and
Linking by dehydrogen bonding between two or more phenol derivatives or aniline derivatives adjacent to each other including two or more homo- or hetero- polymers in which a phenol derivative or an aniline derivative is bonded to a side chain of the polymer with or without a linker, Characterized in that the secondary network hydrogel comprises a macromolecule.
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