KR20170116010A - 화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 이의 제조 및 용도 - Google Patents

화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 이의 제조 및 용도 Download PDF

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KR20170116010A
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유디트 후아르테 시간다
라우라 인차우르라가 카사다몬
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네카네 마르틴 아르벨라
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Abstract

본 발명은 새로운 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 생물학적 활성 화합물을 캡슐화하기 위한 나노 입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 컨쥬게이트 및 나노 입자 모두를 제조하는 방법, 상기 컨쥬게이트 또는 나노 입자를 함유하는 조성물 및 그의 적용에 관한 것이다. 본 발명은 제약 분야 및 나노 기술 분야에 적용 가능하다.

Description

화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 이의 제조 및 용도{NANOPARTICLES FOR ENCAPSULATING COMPOUNDS, THE PREPARATION AND USES THEREOF}
본 발명의 분야
본 발명은 약제학적 분야 및 나노기술 분야에 포함된 것이고, 메틸 비닐 에테르 및 말레산 무수물의 공중합체로부터 유도된 신규한 중합체 컨쥬게이트의 나노입자를 사용한 활성 성분의 캡슐화에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 컨쥬게이트 및 나노입자 둘 다를 생산하기 위한 방법, 상기 컨쥬게이트 또는 나노입자를 함유하는 조성물, 및 이의 적용에 관한 것이다.
본 발명의 배경
많은 항암제를 포함하는, 다수의 활성 성분(약물)은, 다양한 문제를 일으키는, 비경구적으로 투여된다. 환자의 삶의 질 증가 뿐만 아니라 의료비의 감소는, 경구 경로에 의한 항암제의 투여에 수반되는 주요한 장점 중에서 강조될 것이다. 이러한 경로의 투여는 암 세포를 적절한 및 지속된 농도 수준으로 항암제에 지속적으로 노출시켜야 하는데, 이는 치료 지수를 개선할 수 있고, 부작용을 감소시킬 수 있다.
약물이 경구적으로 제공되는 경우 이의 생체이용률(bioavailability)은 위 내에서의 안정성, 용해도, 삼투성, 및 첫 번째-통과 신진대사(first-pass metabolism)와 같은 많은 인자로 인하여 일반적으로 낮다:
- 낮은 용해도 및 낮은 투과성을 가지는 화합물은, 경구 제형을 제형화하는데 있어서 과제(challenges)가 존재한다.
- 위장관은, 점액의 신속한 회전율 및 상대적으로 일정한 체류 시간(relatively constant transit time)으로 인하여, 어려운 투여 부위인 것으로 입증되고 있다.
- 약물은 장벽을 통해 통과해야 하고, 그 다음에 간으로 문맥 순환을 통해 통과해야한다; 둘 다의 부위는 첫 번째-통과 신진대사의 공통의 부위이다.
- 특히 화합물이 친유성 성질이라면, 약물의 흡수는 유출 매커니즘에 의해 또한 제한될 수 있다. 예를 들어, 상피 세포의 점막 표면 상에 위치된 분비성 운반체 P-당단백질은 다양한 약물[예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 캠토테신(camptothecin)]의 낮은 및 가변적인 생체이용률에 책임이 있다.
두 가지의 밀접한 관계의 범주 내로 그룹될 수 있는 이러한 인자, 흡수(용해성 및 삼투성) 및 신진대사는, 약물의 경구 생체이용률을 최적화할 경우에 고려되어야 한다(Hayden Thomas et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006;2(4):591-608).
상기 언급된 문제점을 극복하기 위한 하나의 가능한 전략은, 경구 약물 전달을 위한 담체로서 중합체 나노입자의 사용일 수 있다. 나노미립자 시스템에서 약물의 캡슐화는, 소화관의 거친 조건에 대항하여 이들을 보호하고, 흡수 세포의 표면까지 로딩된 약물을 처리하고, 이들의 방출을 조절한다. 생체접착(bioadhesion)은 약물 투여를 추가적으로 개선한다. 생체접착성 약물 전달 시스템(bioadhesive drug delivery systems)을 가지는 것에 대해서 몇가지 장점이 있다: (ⅰ) 접착의 결과로서, 제형이 전달 부위에서 보다 길게 머무른다; (ⅱ) 특이적 생체접착성 분자를 사용함으로써, 특정한 부위 또는 조직, 예를 들어, 위장관(GI tract)을 타겟하는 것을 가능하게 할 것이다; 및 (iii) 약물의 조절된 방출과 결합된 경우에, 증가된 체류 시간은, 더 낮은 투여 빈도로 이어질 수도 있다(Woodley, Clin Pharmacokinet 2001;40(2):77-84). 그러나, 적절한 생체접착성을 위해서는, 나노입자는 점막층을 가로지르고 이어서 상피의 표면에서 접착성 상호작용을 수립하기 위해, 점막-침투 특성(muco-permeating properties)을 나타내야 한다.
키토산, 폴리비닐 알코올(PVA), 락트산과 글리콜산의 호모- 및 공중합체(PLGA)(homo- and copolymers of lactic and glycolic acids), 또는 메틸 비닐 에테르 및 말레산 무수물 사이의 상이한 공중합체(USA, International Specialty Products ISP로부터의 Gantrez®로서 상품화됨)와 같은 많은 중합체가 경구 약물 전달을 위한 생체접착성 나노입자를 제조하기 위한 유용한 물질로서 기재되었다.
적절한 친수성 화합물로 나노입자를 코팅하거나 회합(association)시키는 것은 이들의 물리화학적 특성을 변경할 수 있고, 따라서, 생물학적 매질(biological medium)과의 이들의 상호작용 및 분포를 변경시켜 작용 또는 흡수에 대한 이상적인 부위로 상기 캡슐화된 약물의 도달을 촉진할 수 있다. 하나의 가능한 전략은, 페길화된 나노입자(pegylated nanoparticles)로 명명된, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 장식된-나노입자(polyethylene glycol (PEG) decorated-nanoparticles)의 사용이다.
경구 투여에서 이들의 용도에 대하여, 통상적인 나노입자에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 연합은, 루멘의 구성요소와 이러한 담체의 상호작용을 최소화한다. 이러한 사실은, 단백질의 상호작용을 예방하고(Gref et al., Science 1994;263:1600-1603), 위장 점막의 보호하는 점액층을 통해 통과(passage)하는 것을 촉진시키는, 나노입자 주위의 친수성 코로나(hydrophilic corona)를 생산하고 미끈거리는 표면을 제공하는 PEGs의 능력과 관련된 것이다.
이러한 전략의 주요한 결점은, 나노입자의 표면에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 회합의 안정성이다(Peracchia et al., Life Sci 1997;6:749-761). 단백질을 거부하는 폴리에틸렌 글리콜의 능력은, 중합체 사슬의 배열, 전하, 길이 및 유연성에 따라 달라지는 것으로 알려져 있다(Torchillin, J Microencapsul 1998;15:1-19). 나노입자의 표면을 변형하기 위한 공정은, 디블록(diblocks) 또는 트리블록(triblocks)의 형태에서 공유 결합(De Jaeghere et al., J Drug Target 2000;8:143-153)에 의해 또는 물리적인 흡착(Stolnik et al., Adv Drug Del Rev 1995;16:195-214)에 의해 주로 수행된다. 공유 결합이 선호되는 점을 고려하여, 대부분의 페길화된 나노입자(most pegylated nanoparticles)는, 락트산 또는 글리콜산과의 폴리에틸렌 글리콜 공중합체를 사용하여 제조되어 왔다. 그러나, 이러한 공중합 공정은, 몇몇의 촉매 및 특정한 화학 조건의 사용을 필요로 한다(Beletsi et al., Int . J. Pharm 1999;182:187-197). 게다가, 유기 합성(메틸렌 클로라이드, 톨루엔 등)에 사용된 독성 유기 용매 잔류물(toxic organic solvent residues)은 문제로 될 수 있다.
폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)[poly (methyl vinyl ether-co-maleic anhydride)](PVM/MA)의 표면 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜로 변형시키는 것 또한 달성되었다. 국제특허 WO2005/104648에서는, 페길화된 나노입자를 수득하기 위한 두 가지의 상이한 공정이 기재되어 있다: (i) 중합체를 탈용매화하기 전에, 유기 용매에서 폴리에틸렌 글리콜 및 중합체 PVM/MA의 동시 배양 및 (ii) 폴리에틸렌 글리콜의 수용액으로 생분해성 중합체 나노입자의 배양. 두 공정 모두 이들의 표면에 회합된 폴리에틸렌 글리콜이 있는 PVM/MA 나노입자를 제조하는데 유효한 것이지만, 단순 흡착의 주요한 결점은, 상호작용의 불안정성(inestability)으로 인하여 생체내에서의 코팅층의 빠른 소실이다(Neal et al., J Pharm Sci 1998;87:242-1248).
WO2005/104648에서는, 폴리에틸렌 글리콜이 결여된 PVM/MA의 나노입자와 비교해, 우수한 장에서의 접착 특성을 가지는 PVM/MA의 페길화된 나노입자를 또한 개시하고 있다. 이러한 나노입자는, 생물학적 활성 분자를 캡슐화하기 위한 높은 다능성(high versatility)을 입증하고 있다. 예를 들어, WO2009/121997에서는, PVM/MA의 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜로 변형 및 코팅시키는 것이 상당한 양의 화학 합성 약물을 캡슐화할 수 있는 페길화된 나노입자를 수득하는 것을 가능하게 하는 것을 개시하고 있다. 그러나, 이 코팅의 안정성은 낮고 코팅층은 시간에 따라 손실될 수도 있다.
생체접착성 약물 전달 시스템이 위장 점막의 표면에 대한 부착을 통해 증진된 위장 체류 시간을 제공할 수도 있을지라도, 좋은 부착 및 지연된 수송(delayed transit)이 개선된 생체이용률로 항상 전환되는 것은 아니다(Davis SS. Drug Discovery Today 2005;10(4):249-257). 만약 약물이, 유출 메커니즘(efflux mechanisms)으로 인하여 상피 막(epithelial membrane)을 쉽게 용해시키지 못하거나 투과할 수 없다면, 흡수 부위에서 시간은 불충분할 수 있다. WO2008/129106에서는, 경구적으로 투여된 경우에, P-당단백질의 기질인 약물의 생체이용률을 증가시킬 수 있는, 시클로덱스트린 및 PVM/MA를 포함하는 약물 투여를 위한 대안적인 나노입자를 개시하고 있다.
그럼에도 불구하고, 경구 투여 후에 몇몇 약물의 생체이용률을 개선할 필요성이 여전히 있다. 따라서, 신규한 중합체로 제조된 나노입자의 개선된 약제학적 특성(분포, 생체부착 및 방출 속도) 및 좋은 물리화학적 특성[분해성, 안정성 및 기계력(mechanic force)]과 함께 몇몇 약물의 친수성/소수성 특성을 일치시키기 위한, 새로운 약물 투여 시스템(예를 들어, 새로운 중합체 및 공-중합체를 합성)을 개발하기 위한 많은 노력이 여전히 필요하다. 이는 약물의 흡수 효율을 증가시켜, 병원의 관류(hospital perfusion)에 대한 대안적인 치료를 가능하게 하고, 이러한 타입의 약물로 치료시의 의료 비용을 감소시키고, 환자의 삶의 질을 개선시킬 것이다.
본 발명의 요약
본 발명의 목적은, 상당한 양의 생물학적 활성 화합물(예를 들어, 약물 또는 활성 성분, 특히 소수성 약물)을 캡슐화할 수 있고, 경구적으로 투여된 약물의 생체이용률을 증가시킬 수 있는, GI 관 내에서 안정한 새로운 약물 투여 시스템을 개발하는 것, 즉, 이전에 언급된 결점을 해결하는 새로운 중합체 컨쥬게이트(polymer conjugates) 및 이로 이루어진 나노입자를 제공하기 위한 것이다.
본 발명으로 이어지는 작업은 승인 합의 n°NMP4-LA-2011-280761 하의, European Union's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013)으로부터 재정 지원을 받았다.
히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 또는 폴리에틸렌 글리콜과 PVM/MA의 새로운 에스테르 중합체 컨쥬게이트는 간단한 반응에 의해 합성될 수 있고, 생물학적 활성 화합물의 투여를 위해 좋은 특성을 가지는 나노입자를 쉽게 생산하기에 적합한 결과를 나타냄이 관찰되었다. 폴리에틸렌 글리콜 또는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체와 PVM/MA의 이러한 새로운 에스테르 중합체 컨쥬게이트에 의해 형성된 나노입자가, i) 상당한 양의 생물학적 활성 화합물[예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 캄프토텍신(campthotecin)]을 캡슐화할 수 있고, 및 ii) 점막 층을 교차할 수 있고, 장세포(enterocyte)의 표면과 밀접한 방식으로 상호작용함(약물의 흡수를 개선함)이 특히 발견되었다.
놀랍게도, 본 발명에 의해 제공된 나노입자는 장의 점막을 통한 상기 생물학적 활성 화합물의 생체이용률을 증가시켜, 매우 장시간(예를 들어, 도세탁셀의 경우에 적어도 72시간) 동안 연장된 및 지속된 플라즈마 레벨을 획득하게 하고, 이는 병원의 관류(hospital perfusion)에 대한 대안적인 투여를 가능하게 하여 이러한 타입의 약물로 치료시의 의료 비용의 감소 및 환자의 삶의 질의 개선을 가능하게 한다.
그러므로, 첫 번째 측면에서, 본 발명은, 히드록시-말단 분자(hydroxyl-terminated molecule)와 PVM/MA의 신규한 에스테르 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이고, 이 때 상기 히드록시-말단 분자는, 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체 중에서 선택된다.
본 발명의 하나의 특정한 변형에서, 상기 히드록시-말단 분자는, 분지되지 않고 치환된 히드록실기를 가지지 않는 폴리에틸렌 글리콜이다(the hydroxyl-terminated molecule is a polyethylene glycol that is not branched and does not have substituted hydroxyl groups). 본 발명의 이러한 변형에서, 사용된 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 400 내지 35,000 Da의 범위에 포함된 분자량을 가지고; 보다 특정한 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜은, 폴리에틸렌 글리콜 1,000 (PEG1), 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PEG2), 폴리에틸렌 글리콜 6,000 (PEG6) 및 폴리에틸렌 글리콜 10,000 (PEG10)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 특정한 변형에서, 폴리에틸렌 글리콜은 하나의 치환된 히드록실기를 가진다. 그러므로, 본 발명의 이러한 변형에서, 상기 히드록시-말단 분자는, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체이고, 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르이다. 보다 특정한 실시형태에서, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르(mPEG)이고, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 1,000 (mPEG1), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000 (mPEG2), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 6,000 (mPEG6) 및 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 10,000 (mPEG10)로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 히드록시-말단 분자와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 생산하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 때 상기 히드록시-말단 분자는 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 유도체 중에서 선택되는 방법에 관한 것이고, 이 방법은,
a) 본 발명의 히드록시-말단 분자와 PVM/MA를 유기 용매 중에서 반응시키는 단계, 및
b) 유기 용매를 제거하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 상기 방법은 산업 규모에서 단순하고 적용가능하다. 본 발명의 하나의 바람직한 변형에서, 상기 방법은, 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 정제하는 추가적인 단계 c)를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 단계 a)의 용액 중의 PVM/MA 및 히드록시-말단 분자 간의 중량비는, 1:0.01-0.25, 바람직하게 1:0.015-0.2, 보다 바람직하게 1:0.05-0.125이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 상기 방법에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 약물 전달; 바람직하게 경구 약물 전달을 위한 중합체 나노입자의 제조에 있어서, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 사용에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 및 ii) 담체;를 포함하는 조성물, 및 약물 전달; 바람직하게 경구 약물 전달에서 사용을 위한 본 발명의 상기 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, i) 본 발명에 따른 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 또는 본 발명의 방법에 따라 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스, 및 ii) 생물학적 활성 화합물을 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 활성 화합물은 항암제이다. 보다 특정한 실시형태에서, 항암제는, 도세탁셀, 캠토테신 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고; 바람직하게 항암제는 도세탁셀이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 나노입자를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 유기 매질에서 생물학적 활성 화합물과 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 혼합하는 단계; 및
b) 2가 금속(divalent metal)의 존재하에 알코올 및 물을 첨가하여 에스테르 중합체를 탈용매화하는 단계.
바람직하게, 단계 a)는, (i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 유기 용액과 (ii) 생물학적 활성 화합물의 유기 용액 또는 분산액(dispersion)을 혼합함으로써 수행된다.
바람직하게, 단계 b)는, 단계 a)에서 수득된 혼합물에 2가 금속을 포함하는 수성알코올성 혼합물(hydroalcoholic mixture)을 첨가함으로써 수행된다.
특정한 실시형태에서, 2가 금속은, 2가 형태인 칼슘, 마그네슘, 아연, 철, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고; 바람직하게 2가 금속은 칼슘이다.
추가적으로 특정한 실시형태에서, 단계 a)의 혼합물에서 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 및 생물학적 활성 화합물 간의 중량비는 1:0.01-0.20이고, 바람직하게 1:0.02-0.15이고, 보다 바람직하게 1:0.03-0.10이다.
본 발명의 하나의 변형에서, 본 발명에 따른 나노입자를 생산하기 위한 상기 방법은, 유기 매질을 제거하고, 및/또는 임의적으로 정제하는 추가의 단계 c)를 포함한다; 예를 들어, 이는, 펠렛이 수득될 때까지 여과 기술 또는 원심분리에 의해 제조될 수 있다. 마찬가지로, 경우에 따라 본 발명에 따른 나노입자를 생산하기 위한 상기 방법은, 임의적으로 보호제의 존재하에, 상기 형성된 나노입자를 건조하는 추가의 단계 d)를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 이러한 추가의 단계 d)는 분무-건조 또는 동결 건조에 의해 수행된다.
이와 관련해, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 상기 방법에 의해 수득된 나노입자에 관한 것이다.
다른 측면으로, 본 발명은, 의약에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 나노입자 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 나노입자에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 약학 조성물 제조에서의 발명에 따른 나노입자의 용도 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 나노입자의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, i) 본 발명에 따른 적어도 하나의 나노입자, 또는 본 발명의 방법에 따라 수득된 적어도 하나의 나노입자, 및 ii) 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 상기 담체 또는 비히클은, 경구 경로에 의한 이의 투여를 위해 허용가능한, 약제학적 부형제(pharmaceutical excipient)를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 의약에서 사용을 위한 본 발명의 상기 약학 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 항암제를 포함한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료의 방법에서 사용을 위한 항암제를 포함하는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이고; 또는 대안적으로, 본 발명은 또한, 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 항암제를 포함하는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은,
a) 폴리에틸렌 글리콜 2,000와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %
c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물;
a) 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %,
c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물; 및
a) 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트30 % 내지 40 %,
b) 캠토테신 0.08 % 내지 1.5 %,
c) 칼슘 0.10 % 내지 0.20 %,
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 상기 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물;
로 이루어진 군에서 선택된다.
도 1. 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PVM/MA-PEG2), 폴리에틸렌 글리콜 6,000 (PVM/MA-PEG6), 폴리에틸렌 글리콜 10,000 (PVM/MA-PEG10), 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PVM/MA-mPEG2)와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 및 PVM/MA의 적외선 스펙트럼.
도 2. A) PVM/MA의 1H-NMR 스펙트럼; B) 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PVM/MA-PEG2), C) 폴리에틸렌 글리콜 6,000 (PVM/MA-PEG6), D) 폴리에틸렌 글리콜 10,000 (PVM/MA-PEG10), 및 E) 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PVM/MA-mPEG2)과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼.
도 3. 폴리(무수물) 나노입자 제형의 주사 전자 현미경(SEM). A) PEG2-CPT trad[캠토테신을 캡슐화하는 PEG2와 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자(traditional PVM/MA nanoparticles pegylated with PEG2 encapsulating campthotecin)]; B) PEG6-CPT trad (캠토테신을 캡슐화하는 PEG6와 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자); C) mPEG2-CPT conj(캠토테신을 캡슐화하는 mPEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자).
도 4. 37 ℃에서 모조의 위액(simulated gastric fluid)(0-2 h) 및 모조의 장의 유체(simulated intestinal fluid)(2-12 h)에서 배양 후에, DTX 나노입자(도세탁셀을 캡슐화하는 통상적인 PVM/MA 나노입자), PEG2-DTX trad(도세탁셀을 캡슐화하는 PEG2와 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자), mPEG2-DTX conj(도세탁셀을 캡슐화하는 mPEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자) 및 PEG2-DTX conj(도세탁셀을 캡슐화하는 PEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자) 제형으로부터의 도세탁셀 방출 프로파일. 데이터는 평균 ± S.D. (n=3)으로서 나타낸 것이다.
도 5. 탁소테레(Taxotere®) 30 mg/kg 용량의 정맥내(i.v.) 투여 후의 혈장 도세탁셀 농도-시간 프로파일. 데이터는 평균 ± S.D.로서 나타낸 것이다(시점 당 n=3).
도 6. 30 mg/kg의 단일 경구 투여량의 투여 후의 혈장 도세탁셀 농도-시간 프로파일. 동물은, 경구용 탁소테레(Taxotere®), DTX 나노입자(도세탁셀을 캡슐화하는 통상적인 PVM/MA 나노입자), PEG2-DTX trad(도세탁셀을 캡슐화하는 PEG2로 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자), mPEG2-DTX conj(도세탁셀을 캡슐화하는 mPEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자) 및 PEG2-DTX conj(도세탁셀을 캡슐화하는 PEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자) 제형을 투여받았다. A)는 최초 8 시간 내에 대한 것이고 B)는 72시간 동안에 대한 것이다. 데이터는 평균 ± S.D.로서 나타내었다(n=5).
도 7. 가라앉은 조건(sink conditions) 하에서, 37 ℃, 60 rpm 하에서 모조의 위액(0-2 h) 및 모조의 장의 유체(2-12 h)에서 배양 후에, PEG2-CPT trad(캠토테신을 캡슐화하는 PEG2로 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자), PEG6-CPT trad(캠토테신을 캡슐화하는 PEG6로 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자) 및 mPEG2-CPT conj(캠토테신을 캡슐화하는 mPEG2와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노입자) 제형으로부터의 캠토테신 방출 프로파일. 데이터는 평균 ± S.D.로서 나타낸 것이다(n=3).
도 8. 현탁액의 1 mg/kg 투여량의 정맥내(i.v.) 투여 후에 혈장 캠토테신 농도-시간 프로파일. 데이터는 평균 ± S.D.로서 나타낸 것이다(시점 당 n=3).
도 9. 경구 현탁액으로서, PEG2-CTP trad (캠토테신을 캡슐화하는 PEG2로 페길화된 전통적인 PVM/MA 나노입자) 및 mPEG2-CPT conj (캠토테신을 캡슐화하는 mPEG2과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이션으로부터의 나노입자) 제형의 단일 투여량(1 mg/kg) 후의 수컷 위스타 래트(rat)에서 캠토테신의 혈장 농도-시간 프로파일. 데이터는 평균 ± S.D.로서 나타낸 것이다(n=6).
도 10. 단일 투여로서 이들의 경구 투여 2시간 후의, 래트의 근위의 회장(proximal ileum)의 종단면도(longitudinal sections)에서, 루모겐 레드로 형광 라벨링된 나노입자(nanoparticles fluorescently labelled with lumogen red)의 형광 현미경의 시각화. (A, B) Lumogen® 레드를 캡슐화하는 종래의 PVM/MA 나노입자; (C, D) Lumogen® red를 캡슐화하는 mPEG2과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 매트릭스를 포함하는 나노입자(mPEG2-LUM conj).
본 발명의 상세한 설명
본 발명은, 상당한 양의 생물학적 활성 화합물을 캡슐화할 수 있고, GI 관 내에서 안정적이고, 경구적으로 투여된 약물의 생체이용률을 증가시키는, 신규한 약물 투여 시스템(새로운 중합체 컨쥬게이트 및 이로 제조된 나노입자)을 제공한다.
폴리에틸렌 글리콜(또는 히드록시-말단 반응성 기를 함유하는 이의 유도체)과 PVM/MA의 신규한 에스테르 중합체 컨쥬게이트가, 간단한 반응에 의해 합성될 수 있고, 생물학적 활성 화합물의 투여에 대한 개선된 특성을 가지는 나노입자를 쉽게 생산하는데 적절한 결과가 발생함을 놀랍게도 발견하였다. 폴리에틸렌 글리콜(또는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체)과 PVM/MA의 이러한 새로운 에스테르 중합체 컨쥬게이터에 의해 형성된 나노입자가, 상당량의 생물학적 활성 화합물을 캡슐화할 수 있고, 이들의 경구 생체이용률을 증가시킬 수 있음을 특히 발견하였다.
정의
본 발명의 이해력을 촉진하기 위한 목적을 위해, 본 발명의 내용에 사용된 몇몇의 용어 및 표현의 의미가 하기에 기재된다.
본원에서 사용된, "폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)[poly (methyl vinyl ether-co-maleic anhydride)]"(PVM/MA)은, 메틸 비닐 에테르 및 말레산 무수물의 공중합체[상표명 Gantrez®AN 하에, 인터내셔털 스페셜티 프러덕츠(International Specialty Products, ISP)에 의해 시판됨]을 나타낸다. 따라서, 표현, "PVM/MA", 폴리(무수물), 또는 Gantrez® AN은 동의어이고, 본 명세서의 기술에서 구별없이 사용된다. Gantrez® AN 공중합체는, 하기의 화학식을 가지는, 메틸비닐에테르 및 말레산 무수물의 교대 단위(alternating units)를 함유한다:
Figure pct00001
이러한 중합의 근본적인 성질은, 말레산 무수물 단위가 메틸비닐에테르 단위와 인접하여야 하고, 그 반대로도 인접해야 하며, 그 결과 정확한 교차 공중합체를 나타낼 것을 요구한다. Gantrez® AN 구조에서 무수물 기는, 친핵성 치환 반응 메커니즘을 통해 히드록실 함유 분자와 이러한 중합체의 화학 상호작용을 가능하게 한다.
Gantrez® AN 공중합체는, 물-불용성 백색 분말로서 제공되고, 경피 패치의 제조를 위한 아쥬반트로서 및 의치용 접착제(denture adhesives), 증점안정제 및 현탁화제(thickening and suspending agents)로서, 약제학적 및 의료 목적을 위해 널리 사용된다. 이러한 공중합체의 경구 독성은 매우 낮고(기니피그에서 LD50은 약 8-9 g/kg이다), 나노미립자 담체의 제조를 위한 물질로 또한 사용되어 왔다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 상기 PVM/MA 공중합체는, 80 내지 2,500 kDa, 바람직하게 85 내지 2,000 kDa, 보다 바람직하게 90 내지 220 kDa의 범위 내에 포함된 분자량을 가진다.
본원에 사용되는, "에스테르"는, 적어도 하나의 에스테르 기를 함유하는 에스테르[PVM/MA에 대한 것(as of a PVM/MA)]를 나타낸다(즉, PVM/MA의 적어도 하나의 무수물 단위가 히드록시-말단 분자로 에스테르화된다). 본 발명에 따르면, PVM/MA의 적어도 하나의 무수물 단위는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 폴리에틸렌 글리콜 중에서 선택된 히드록시-말단 분자로 에스테르화된다. PVM/MA의 에스테르의 설명적인, 비-제한적인 예는, 치환의 정도가 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것들이다.
본원에서 사용되는, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 "에스테르화도(degree of esterification)"(DE) 또는 "치환의 정도(degree of substitution)"(DS)는, 본 발명에 따른 히드록시-말단 분자로 에스테르화되는 무수물 단위의 퍼센트, 즉, 형성된 에스테르 결합의 퍼센트로서 정의된 것이다. 특정한 실시형태에서, 에스테르화도는, 본 분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 표준 방법에 의해 측정될 수 있고, 하기에 기재된 실시예에 부여된 실험 부분에서, 설명을 거쳐, 기재된 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "히드록시-말단 분자"는, 적어도 하나의 주요한 히드록시(-OH) 기를 가지는 분자이다. 본 발명에 따라, 상기 히드록시-말단 분자는, 하기에 정의된 바와 같이, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 폴리에틸렌 글리콜 사이에서 선택된 것이다.
본 명세서의 기재에서, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"(PEG)는, 임의적으로 분지된(branched) 에틸렌 기인, 2개의 탄소 원자에 의해 연결된 에테르 기를 함유하는, 물에서 용해가능한 임의의 친수성 중합체인 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 정의는, 분지된 또는 분지되지 않은 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
PEG는 폴리에틸렌 산화물(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)로서 또한 알려진 것이다(상기 세 가지의 이름은 화학적으로 동의어이고, 에틸렌 산화물의 올리고머 또는 중합체를 나타낸다). 이 용어는 또한, 변형될 수 있는(두 개의 말단 중의 하나) 말단 히드록실기 중 하나의 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 하나의 기본적인 히드록시(-OH) 기를 유지하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 사용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜은, 약물의, 경구, 비경구 및 국소 투여를 위해 승인(FDA)된 수용성 중합체이다. 폴리에틸렌 글리콜은, 알칼리 매질에서 반응 개시제로서 물, 모노에틸렌 글리콜 또는 디에틸렌 글리콜의 존재하에, 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide, EO)의 중합에 의하여 제조된다(1,2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxide Polymers and Copolymers" in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering; Mark, H.F. (Ed.), John Wiley and Sons Inc., 1986, pp. 225-273). 원하는 분자량(일반적으로 제조 과정 중 점도 측정에 의하여 조절됨)에 도달한 경우에, 상기 중합 반응은, 산(락트산, 아세트산 등)으로 촉매를 중화시킴으로써 종결된다. 상기 결과는 매우 단순한 구조를 가지는 선형 중합체이다:
H-(O- CH2-CH2)n-OH
여기서, (n)은 EO 단량체 또는 단위의 수이다. 이러한 용어 폴리에틸렌 글리콜은, 이들 분자의 물리화학적인 특성에 대한 히드록실 말단 기의 현저한 영향을 나타내기 위해 일반적으로 사용된다. 용어 PEG는 수치와 함께 일반적으로 사용된다. 의약품 산업에서, 숫자는 평균 분자량을 나타내는 반면에, 화장품 산업에서, 문자 PEG를 수반하는 숫자는 분자를 형성하는 중합된 EO 단위를 나타낸다(Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowev R.C., Sheskey P. J., Weller P.J. (Eds.), 4th Edition, Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association, London, UK, 2003). PEGs는 명명법이 상이할지라도, 다양한 약전에 포함된다(International Harmonisation: Polyethylene glycol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612-614). 약제학적 부형제의 안내서[Handbook of Pharmaceutical Excipients(Fourth Edition), 2003 Edited by R.C. Rowe, P.J. Sheskey and P.J. Weller Published by the Pharmaceutical Press (London, UK) and the American Pharmaceutical Association (Washington, USA)]에 따르면, 폴리옥시에틸렌 글리콜도 또한 폴리에틸렌 글리콜, 마크로골, 또는 PEG로서 표시된다. 영국 및 유럽 약전은 폴리에틸렌 글리콜 및 마크로골을 사용하는 반면, 미국 약전(USP)은 폴리에틸렌 글리콜을 사용한다.
본 발명의 하나의 변형에서, 바람직하게 사용된 폴리에틸렌 글리콜은, 400 내지 35,000 Da의 범위에 포함된 분자량을 가진다. 본 발명의 하나의 바람직한 변형에서, 사용된 폴리에틸렌 글리콜은, 400 이상, 보다 바람직하게 1,000 이상의 분자량을 가진다; 1,000 내지 20,000 사이에 포함된 수치는 특히 바람직하고, 보다 바람직하게 2,000 내지 10,000 Da이다. 본 발명에 사용될 수 있는 PEG의 설명적인 비-제한적인 예는, 폴리에틸렌 글리콜 1,000, 폴리에틸렌 글리콜 2,000, 폴리에틸렌 글리콜 6,000 또는 폴리에틸렌 글리콜 10,000(각각 PEG1, PEG2, PEG6 또는 PEG10)을 포함한다.
400 보다 적은 분자량을 가지는 PEGs는 실온에서 비-휘발성 액체이다. PEG 600은 17 내지 22 ℃ 사이에 포함된 융점(melting point)을 나타내는 반면에, 800 내지 2000 사이에 포함된 평균 분자량을 가지는 PEGs는 낮은 융점을 가지는 반죽같은 물질(pasty materials)이다. 3,000 Da PEGs의 분자량 이상은 고체이고, 35,000까지는 상업적으로 입수가능하다. 반면에, 분자량이 증가한 경우에, PEGs의 융점이 증가할지라도, 끓는점은 60 ℃의 최대값까지 증가한다. 유사하게, 분자량인 증가하는 경우, 이의 수성 용해도(aqueous solubility)는 감소한다. 어떠한 경우에, PEG 35,000에 대해, 50 % w/v에 가까운 양으로 물에 용해될 수 있다.
독성학적 관점으로부터, PEGs는 상당히 비-독성 및 비-면역원성으로 고려되고 있다(Hermansky S.J et al., Food Chem Toxic., 1995, 33, 139-140; Final Report on the Safety Assessment of PEGs: J.A. C. T., 1993, 12, 429-457; Polyethylene glycol, 21 CFR 172.820, FDA). WHO에 의해 정의된 최대 일일 섭취량은 10 mg/kg이다(Polyethylene glycols; Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives; World Health Organisation, Geneva; Technical Report Series 1980, 648, 17-18).
폴리에틸렌 글리콜 유도체는, 매우 상이한 조건 하에서, 이들의 수성 용해도, 생리학적 비활성(physiological inactivity), 낮은 독성 및 안정성과 같은 전통적인 PEGs와 유사한 유리한 특징을 가진다. 이러한 유도체는 매우 상이한 제품을 포함하고, 기본적인 히드록실을 치환하는 작용기에 의해 특징지어진다. 본 발명에 따라, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르이다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 일반적인 화학식 H(2 m +1)C m (O-CH2-CH2)nOH을 가진다. 그들은, 알킬 사슬에서 탄소의 수를 나타내는 m, 및 친수성 부위에서 에틸렌 옥사이드 단위의 수인 n 을 가지는 CmEn으로서 나타낼 것이다. 설명적인, 비-제한적인 예는: 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)로도 또한 알려진, 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 에틸 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 프로필 에테르; 및 폴리에틸렌 글리콜 부틸 에테르이다.
상기에 언급된 기에 해당하는 몇몇 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 화학 구조는, 설명적인 방식으로 하기에 나타낸 것이다:
a) H3C(O-CH2-CH2)nOH
b) H5C2(O-CH2-CH2)nOH
c) H7C3(O-CH2-CH2)nOH
d) H9C4(O-CH2-CH2)nOH.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 비-제한적인 예는, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 1,000 (mPEG1) 또는 폴리에틸렌 글리콜 1,000의 메틸 에테르; 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000 (mPEG2) 또는 폴리에틸렌 글리콜 2,000의 메틸 에테르; 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 6,000 (mPEG6) 또는 폴리에틸렌 글리콜 6,000의 메틸 에테르; 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 10,000 (mPEG10) 또는 폴리에틸렌 글리콜 10,000의 메틸 에테르;를 포함한다.
하기의 것들은 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 중에서 언급될 수 있다:
- 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트
- 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트
- 폴리(에틸렌 글리콜) 모노라우레이트
- 폴리(에틸렌 글리콜) 모노올레이트
- 폴리(에틸렌 글리콜) (12) 트리데실 에테르
- 폴리(에틸렌 글리콜) 테트라히드로푸르푸릴 에테르.
폴리에틸렌 글리콜 및 유도체의 선택은, 상기 발생된 시스템의 특징을 조절하는 것을 가능하게 하고, 이들의 혼합물의 사용은 하나 이상의 가변성 인자를 첨가한다. 실용적 관점에서, 각각의 활성 분자 및 각각의 투여 경로에 대해 가장 적절한 시스템을 선택하고 조정하는 것이 중요하다.
본원에 사용된 바와 같은, "분자량"은, 분자의 평균 몰 질량으로서 정의된 것이다. 작은 분자와 달리, 중합체의 분자량은 하나의 고유한 수치가 아니다. 더 정확히 말하면, 제공된 중합체는, 예를 들어, 중합체가 생산되는 방식에 따라 분자량의 분포를 가질 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 중합체의 분자량이란 용어는, 분자량의 분포, 또는 평균 분자량의 분포를 나타내는 것이다. 그러나, 평균 분자량을 계산하기 위한 많은 방식이 있다. 하기에 기재된 예에 부여된 실험 부분에서, 예로서 기재된 바와 같이, 본 발명에 따라, 본 발명의 예비-형성된 에스테르 중합체의 평균 분자량은 1H-NMR에 의해 결정되고, 상업적인 PVM/MA의 평균 분자량은 SEC-MALLS에 의해 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "나노입자"는, 1 마이크로미터(μm) 미만, 바람직하게 10 내지 900 나노미터(nm)의 범위의 크기를 가지는 구형 타입 또는 유사한 형상의 콜로이드 시스템(나노캡슐 또는 나노스페어(nanosphere))을 나타낸 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 화합물(biologically active compound)"(BAC)는, 예방적 또는 치료적 목적으로, 대상, 바람직하게 인간에 투여되는 어떠한 작은 분자(예를 들어, 약제의 활성 성분 또는 약물) 또는 이의 유도체; 즉, 인간 및 동물에서 육체 및 정신의 복지를 개선하기 위해 또는 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단에 사용할 수 있는 900 달톤 이하의 분자량을 가지는 임의의 물질 또는 화학적 화합물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 화합물에 적용되는 용어 "유도체"는 상기 생물학적 활성 화합물의 유사체 및 프로드러그(prodrug)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항암제(antitumor agent)", "항암 제제(anticancer agent)" 또는 "항종양성 제제(antineoplastic agent)"(이러한 기재에서 분간할 수 없는 정도로 사용됨)는, 일반적으로, 암 세포의 성장 및 확산을 저해하거나 억제하는 물질을 나타낸다. 항암제는, 세포 분열을 간섭하거나 암 세포를 파괴하는 화합물, 암에서 포함된 특정한 호르몬을 차단하는 화합물, 새로운 혈관의 성장을 저해하거나 예방하는 화합물(예를 들어, 혈관형성 억제제), DNA를 손상하는 제제[예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 및 옥살로플라틴과 같은 알킬화제; 항-대사물질(anti-metabolites); 및 토포이소머라아제 저해제(topoisomerase inhibitors)], 및 항암 특성을 가지는 화합물[예를 들어, 탁산, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 및 식물 알칼로이드(plant alkaloids)]를 또한 포함할 수도 있다. 용어 "항종양 제제"는 또한 방사선 치료를 포함한다. 항종양 제제는, 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinases)의 저해제와 같은, 암 세포의 통제가 해제된 단백질(deregulated proteins)에 대해 구체적인 제제를 또한 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "2가 금속(divalent metal)"은, 원자가가 2인 어떤 금속 성분, 예를 들어, 알칼리-토금속, 예를 드어, 칼슘, 마그네슘, 아연 등, 또는 이러한 것이 약제학적으로 허용가능하다는 단서 하에서, 만약 이러한 것이 몇몇의 원자가를 가진다면, 이들 중의 하나는 3이고, 예를 들어 철 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "평균 크기"는, 수성 매질에서 함께 움직이는 나노입자 집단의 평균 직경을 나타낸다. 이러한 시스템의 평균 크기는, 하기에 기재된 실시예에 부가된 실험 부분에서, 예로서 기재되고, 본 분야의 통상의 기술자에게 알려진 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 상기 입자의 평균 크기는, 본 발명의 히드록시-말단 분자의 성질 및 양에 의해, 본 발명의 나노입자에 존재하는 생물학적 활성 분자의 성질 및 양에 의해(일반적으로, 상기 구성성분의 보다 큰 양 또는 분자량, 상기 나노입자의 보다 큰 평균 크기), 및 상기 나노입자의 생산을 위한 방법의 몇몇 파라미터에 의해, PVM/MA의 분자량 및 양에 의해 주로 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 나노입자는, 전형적으로 1 내지 999 nm, 바람직하게 10 내지 900 nm, 보다 바람직하게 100 내지 500 nm, 여전히 보다 바람직하게 150 내지 400 nm의 범위에 포함되는, 1 μm 미만의 평균 입자 크기를 가짐으로써 특징지어진다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 대략적으로 약 250 nm의 평균 입자 크기를 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 화합물 또는 화합물의 조합이, 제형의 다른 성분과 함께 충분하게 양립하고, 산업 표준에 의해 허용가능한 이러한 레벨까지 대상에 대해 해롭지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담체"는, 활성 성분 또는 약물과 함께 투여되는 희석제를 나타낸다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는, 본 분야에서 알려져 있고, 인산염 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 상이한 타입의 습윤제, 멸균용액 등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체는, "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 1995에 기재된 것이다. 바람직하게, 본 발명의 담체는, 주정부 또는 연방정부의 관리 기관에 의해 승인된 것이거나, United States Pharmacopoeia 또는 동물, 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 일반적으로 알려진 다른 pharmacopeia에 열거된 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는"은, 질병, 질환, 또는 증상과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의, 또는 질병, 질환, 또는 이러한 용어가 적용되는 증상이 발생하지 못하게 하거나, 존재하지 못하게 하거나 또는 이의 시작 또는 재발을 대안적으로 지연시키는 것을 나타낸다. 용어 "예방하는"은, "예방하는"이 상기에 정의된 바와 같이, 예방하는 작용을 나타낸 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은, 질환 또는 이러한 용어가 적용되는 증상, 또는 이러한 질환 또는 증상의 하나 또는 그 이상의 징후(symptom)의 진행을 역전하거나, 완화하거나 또는 저해하는 것을 나타낸다. 용어 "치료"는, "치료하는"이 상기에 정의된 바와 같이, 치료하는 작용을 나타낸 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 동물, 특히 개, 고양이, 소, 말, 양, 거위 및 인간과 같은 포유동물을 의미한다. 특히 바람직한 대상은 둘 다의 성별의 인간이다.
폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)의 에스테르 중합체 컨쥬게이트
본원은 히드록시-말단 분자와 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)의 새로운 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에스테르", "폴리 (메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)" 및 "히드록시-말단 분자"는 이전에 정의된 것이고, 참고자료에 의해 본원에 포함된 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, PVM/MA 중합체의 적어도 하나의 무수물 단위는 폴리에틸렌 글리콜과 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 사이에서 선택된 히드록시-말단 분자(이하, "본 발명의 히드록시-말단 분자"로 언급)로 에스테르화된다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 히드록시-말단 분자와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이고, 이 때 상기 히드록시-말단 분자는 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체 중 선택된 것이다(이하, "본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트").
특정한 실시형태에서, PVM/MA 중합체의 무수물 단위 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 본 발명의 히드록시-말단 분자로 에스테르화 된다. 예를 들어, 적어도 5 %의 에스테르화도는 좋은 결과를 제공한다.
본 발명의 하나의 변형에서, 히드록시-말단 분자는, 분지되지 않고, 치환된 히드록실기를 가지지 않는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 발명의 이러한 변형에서, 사용된 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게, 400 내지 35,000 Da의 범위에 포함된 분자량을 가진다. 본 발명의 하나의 바람직한 변형에서, 사용된 폴리에틸렌 글리콜은, 400 이상, 보다 바람직하게 1,000 이상의 분자량을 가진다; 1,000 내지 20,000의 범위에 포함된 수치는, 특히 바람직하고, 2,000 내지 10,000 Da의 범위에 포함된 수치가 보다 바람직하다. 본 발명의 보다 바람직한 변형에서, 히드록시-말단 분자는, 폴리에틸렌 글리콜 1,000(PEG1), 폴리에틸렌 글리콜 2,000(PEG2), 폴리에틸렌 글리콜 6,000(PEG6) 및 폴리에틸렌 글리콜 10,000(PEG10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리에틸렌 글리콜이다.
다른 변형에서, 본 발명의 히드록시-말단 분자는, 하나의 치환된 히드록실 기를 가지는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 발명의 이러한 변형에서, 상기 히드록시-말단 분자는 따라서, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체이고, 바람직하게, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르이다. 보다 특정한 실시형태에서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르(mPEG)이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르는, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 1,000 (mPEG1), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000 (mPEG2), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 6,000 (mPEG6) 및 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 10,000 (mPEG10)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 상기 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 평균 분자량은 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다; 그러나, 특정한 실시형태에서, 본 발명의 상기 에스테르 중합체 컨쥬게이트는, 85 내지 3,000 kDa, 바람직하게 90 내지 2,500 kDa, 보다 바람직하게 90 내지 2,500 kDa, 보다 바람직하게 95 내지 250 kDa의 범위에 포함된 평균 분자량을 가진다.
본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 수득하기 위한 방법
두 번째 측면에서, 본 발명은, 이하, "본 발명의 방법 [1]"로서 나타낸, 히드록시-말단 분자와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 생산하기 위한 방법에 관한 것이고, 이 때 상기 히드록시-말단 분자는, 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체 중 선택된 것(즉, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트)이고, 하기의 단계를 포함한다:
a) PVM/MA를 본 발명의 히드록시-말단 분자와 유기 용매 중에서 반응시키는 단계, 및
b) 상기 유기 용매를 제거하는 단계.
"본 발명의 방법 [1]"의 단계 a)는, 반응을 일으키기 위해서, 예를 들어 아세톤과 같은, 유기 용매에서 본 발명의 히드록시-말단 분자 및 PVM/MA를 용해시키고 배양하는 것을 포함한다. 상기 혼합물의 배양은 바람직하게, 15 ℃ 내지 80 ℃의 범위에서, 보다 바람직하게 45 ℃ 내지 65 ℃의 범위에서, 가장 바람직하게 55 ℃에 포함하는 온도에서 교반 하에 수행된다. 배양 시간은 1 내지 24 h로 다양할 수도 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 배양은 2 내지 4 h 동안 수행된다. 예를 들어, 3 h 동안 55 ℃에서 혼합물의 배양은 좋은 결과를 제공한다. 대안적으로, 보다 긴 시간 동안(24-48 h) 실온(R/T)에서 교반 하에서 PVM/MA 및 히드록시-말단 분자를 반응시키는 것을 또한 가능하게 한다.
유기 용매는, 진공 하의 원심분리, 또는 실온에서 증발, 감압하에서 증발과 같은 어떠한 적절한 방법에 의해 단계 b)에서 제거된다. 특정한 실시형태에서, 단계 b)는 감압 하에서 증발에 의해 유기 용매를 제거하는 것을 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법 [1]은, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 정제하는 추가적인 단계 c)를 포함한다. 하나의 특정한 변형에서, 추가적인 단계 c)는, 중합체가 불용성인(그러나, 반응하지않은 히드록시-말단 분자가 아님) 액체로 몇 번의 세척; 및 반응하지 않은 히드록시-말단 분자의 어떠한 흔적도 액체에서 검출되지 않을 때까지(예를 들어, 박층 크로마토그래피, TLC에 의해 측정됨) 진공 하에서 여과를 포함한다. 바람직한 변형에서, 세척하는 액체는, 디클로로메탄/메탄올의 혼합물이다. 예를 들어, 이동상으로서 사용된 혼합물 CH2Cl2/CH3OH (9:1), 및 TLC에서 나타내기 위한 요오드(iodine)은 좋은 결과를 제공한다.
본 발명의 히드록시-말단 분자의 자세한 사항은, "정의" 부분에서 언급된 것이고, 또한 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트와 관련된 것이고, 참고자료에 의해 본원에 포함된 것이다. 이들에 따르면, 본 발명의 방법 [1]의 특정한 실시형태에서, 단계 a)에서 PVM/MA와 반응하는 히드록시-말단 분자는 폴리에틸렌 글리콜이고; 바람직하게 폴리에틸렌 글리콜은, 폴리에틸렌 글리콜 1,000 (PEG1), 폴리에틸렌 글리콜 2,000 (PEG2), 폴리에틸렌 글리콜 6,000 (PEG6), 및 폴리에틸렌 글리콜 10,000 (PEG10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 본 발명의 방법 [1]의 또 다른 특정한 실시형태에서, 단계 a)에서 PVM/MA와 반응하는 히드록시-말단 분자는, 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 바람직하게 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 보다 바람직하게 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르(mPEG); 가장 바람직하게 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 1,000 (mPEG1), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000 (mPEG2), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 6,000 (mPEG6) 및 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 10,000 (mPEG10)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르이다.
본 발명의 방법 [1]의 단계 a)의 용액에서, PVM/MA와 본 발명의 히드록시-말단 분자 사이의 중량비는, 넓은 범위 내에서 다양할 수도 있다; 그러나, 특정한 실시형태에서, PVM/MA:히드록시-말단 분자 중량비는, 1:0.01 내지 1:0.25; 바람직하게 1:0.015 내지 1:0.2; 보다 바람직하게 1:0.05 내지 1:0.125의 범위에 포함된다. 비-제한적인 설명적인 방식에서, 상기 히드록시-말단 분자가 폴리에틸렌 글리콜인 경우에, 1:0.05, 1:0.1, 1:0.125, 또는 1:0.25의 중량비 PVM/MA:PEG는 좋은 결과를 제공한다. 유사한 방식에서, 상기 히드록시-말단 분자가 메톡시-폴리에틸렌 글리콜인 경우에, 1:0.01, 1:0.015, 1:0.025, 1:0.05, 1:0.01, 또는 1:0.2의 중량비 PVM/MA:mPEG는 좋은 결과를 제공한다.
다시 말해서, 본 발명의 방법 [1]의 단계 a)의 용액에서 본 발명의 상기 히드록시-말단 분자 및 PVM/MA 사이의 중량비는, 1:4 내지 1:100; 바람직하게 1:5 내지 1:66; 보다 바람직하게 1:8 내지 1:20의 범위에서 포함된다. 비-제한적인 설명적인 방식에서, 상기 히드록시-말단 분자가 폴리에틸렌 글리콜인 경우에, 1:4, 1:8, 1:10, 또는 1:20의 중량비 PEG:PVM/MA는 좋은 결과를 제공한다. 유사하게, 상기 히드록시-말단 분자가 메톡시-폴리에틸렌 글리콜인 경우에, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:66, 또는 1:100의 중량비 mPEG:PVM/MA는 좋은 결과를 제공한다.
상기 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 즉 히드록시-말단 분자와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트는 본 발명의 방법 [1]에 의해 수득된 것이고, 상기 히드록시-말단 분자는, 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 유도체 사이로부터 선택된 것이고, 하기를 포함하는 방법에 의해 생산된 것이다: a) 유기 용매 중에서 본 발명의 히드록시-말단 분자와 PVM/MA를 반응시키는 단계, 및 b) 유기 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법은, 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다.
본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 적용
본 발명의 예비-형성된 에스테르 중합체 컨쥬게이트(Pre-formed ester polymer conjugates)는 좋은 물리화학적 및 약물학적 특성을 나타낸 것이고, 생물학적 활성 화합물의 투여를 위한 나노입자의 형성에 있어서 출발 물질로서 사용될 수도 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 약물 전달; 바람직하게 경구 약물 전달을 위한 중합체 나노입자의 제조에 있어서, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 또는 본 발명의 방법 [1]에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 또는 본 발명의 방법 [1]에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트, 및 ii) 담체를 포함하는 조성물, 이하 "본 발명의 조성물 [1]"에 관한 것이다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 조성물 [1]은, 본 발명의 방법 [1]에 의해 수득된 에스테르 중합체 컨쥬게이트 또는 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 적어도 2 % 농도(w/v)를 포함한다.
설명적인 예로서, 본 발명의 상기 조성물 [1]은, 생물학적 활성 화합물의 투여를 위한 나노입자의 제조를 위한 기초로서 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은, 약물 전달; 바람직하게 경구 약물 전달;에 사용하기 위한 본 발명의 조성물 [1]에 관한 것이다.
나노입자
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는, 생물학적 활성 화합물(BAC)를 캡슐화하기 위한 능력을 가지고, 약물 전달 시스템으로서 사용될 수도 있다.
따라서, 특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 상기 나노입자는 생물학적 활성 화합물을 추가로 포함한다(이하 "본 발명의 나노입자"로서 본 명세서에서 지칭됨).
용어 "생물학적 활성 화합물"(BAC)은 이전에 정의된 것이고, 예방적 또는 치료적 목적으로, 대상, 바람직하게 인간에 투여되는 어떠한 작은 분자(예를 들어, 약제의 활성 성분 또는 약물) 또는 이의 유도체; 즉, 인간 및 동물에서 육체 및 정신의 복지를 개선하기 위해 또는 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단에 사용할 수 있는 900 달톤 이하의 분자량을 가지는 어떠한 물질 또는 화학적 화합물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 화합물에 적용되는, 용어 "유도체"는 상기 생물학적 활성 화합물의 유사체 및 프로드러그(prodrug)를 포함한다.
BAC는, 예를 들어, 항종양 또는 항신생물 제제, 진통제, 마취제, 항염증성 제제, 항부정맥제제, 항고혈압 제제, 항협심증 제제, 항천식 제제, 항생제(페니실린을 포함함), 항혈액응고방지제, 항우울제, 항정신질환 제제(antipsycothic agents), 항당뇨병 제제, 항간질약, 항히스타민제, 기침약, 해독제, 면역 억제제, 면역 자극제, 항 갑상선제, 구충제, 항 바이러스제, 항균제, 항진균제, 항 불안제, 항불안제, 항불안제, 항균제, 항균제, 항균제(최면제 및 신경이완제), 베타-아드레날린 성 수용체 차단제, 혈액 생성물 및 대용품, 기관지 확장제, 완충제, 심장성 강심제, 화학 요법제, 조영제, 코르티코 스테로이드, 기침 억제제[거담약 및 점액용해제(mucolytics)], 진단 제제, 진단 이미징 제제, 이뇨제, 도파민 제제(항파킨슨 증후군 제제) 등을 포함하는, 약물의 알려진 클래스의 다양성으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 하나 또는 그 이상의 상기 BAC를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 BAC의 예는, 도세탁셀, 파클리탁셀, 캄토테신, 액티노 마이신 D, 알벤다졸, 알도스테론, 알프라졸람, 아미오다론, 아미트립틸린, 암프레나비르, 아시마돌린, 아토르바스타틴, 부니트롤롤, 부스피론, 카르바마제핀, 카베딜롤, 셀리 롤롤, 사이클로스포린 A, 시메티딘, 클로트리마졸, 콜히친, 코르티존, 다우노루비신, 데비시아퀸, 덱사메타손, 디아제팜, 디지톡신, 디곡신, 딜티아젬, 돔페리돈, 독소루비신, 에파비렌즈, 에피루비신, 에리스로마이신, 에르고타민, 에스트라디올, 에스트로돕틴 글루쿠로니드, 에를로티닙, 에토포시드, 페니토인, 펜타닐, 펠로디핀, 페노티아진, 펙소페나딘, 플루오로퀴놀론, 플루오로 우라실, FK-506, 겐타마이신, 그리세오풀빈(griseofulvin), 하이드로코르티손, 이마티닙(imatinib), 인디나비르(indinavir), 이트라코나졸, 이버멕틴, 케토코나졸, 케펨페올, 레보플록사신, 리도카인, 로페라미드, 로사르탄, 로바스타틴, 메벤다졸, 메틸프레드니솔론, 메토트렉세이트, 미발라딤, 미다졸람, 니졸디핀, 모르핀, 넬피나비르, 니카디핀, 니트레닌틴, 니페디핀, 온단세트론, 펜타조신, 프라지콴텔, 프레드니솔론, 프레드니손, 케르세틴, 퀴니딘, 라니티딘, 라파마이신, 리파부틴, 리팜피신, 리토나비르, 사퀴나비르, 시롤리무스, 설파메티졸, 타크롤리무스, 타목시펜, 타니놀롤, 테니포시드, 테르페나딘, 테트라 사이클린, 토포테론, 트리암시놀론, 발스포더, 베라파밀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 조피클론(zopiclone), 이의 유도체 및 이의 혼합물이다.
본 발명의 나노입자는, 소수성 BAC(생물약제학 분류 시스템의 클래스 II 및 클래스 IV)의 경구 투여를 위해 특히 유용하다.
본 발명의 하나의 특정한 실시형태에서, 본 발명의 나노입자에 존재하는 BAC는, 항암제(예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 캠토테신, 독소루비신, 에피루부신, 플루오로우라실, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트 등)이다. 보다 특정한 실시형태에서, BAC는 도세탁셀, 캠토테신 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 여전히 보다 특정한 실시형태에서, BAC는 도세탁셀이다.
본 발명의 나노입자는, 이들이 유기체의 어떠한 점막에 대한 접근을 제공하는 경로(예를 들어, 경구 경로 등)에 의해 투여된 경우에, 이들이 함유하는 BAC의 분포를 변경하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 상기 나노입자는, 1 μm 미만, 전형적으로 1 내지 999 nm, 바람직하게 10 내지 900 nm, 보다 바람직하게 50 내지 550 nm, 보다 더 바람직하게 100 내지 500 nm, 보다 더 바람직하게 150 내지 400 nm에 포함되는 입자 크기를 가진다.
나노입자를 수득하기 위한 방법
다른 측면에서 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스 및 생물학적 활성 화합물을 포함하는 나노입자(즉, 본 발명의 나노입자)를 생산하기 위한 방법(이하 "본 발명의 방법 [2]")에 관한 것이다:
a) 생물학적 활성 화합물과 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 유기 매질 중에서 혼합하는 단계, 및
b) 2가 금속(divalent metal)의 존재 하에서 알코올 및 물을 첨가하여 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 탈용매화하는 단계.
특정한 실시형태에서, 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께 임의적으로, 단계 a)에서의 유기 용매는 아세톤이고; 단계 b)에 사용된 알코올은 에탄올이다.
본 발명의 방법 [2]를 실시하기 위해 사용될 수 있는 2가 금속은, 이가 형태로, 칼슘, 마그네슘, 아연, 철 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 바람직한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 상기 2가 금속은 칼슘이고; 예를 들어 칼슘염으로부터 수득될 수도 있다. 칼슘염의 설명적인 비-제한적인 예는, 염화 칼슘, 아세트산 칼슘, 글루콘산 칼슘, 락트산 칼슘, 소르브산 칼슘, 및 이들의 혼합물이다; 바람직하게 상기 칼슘염은 염화 칼슘이다.
본 발명의 방법 [2]의 단계 a)는, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 통상적인 방법, 예를 들어,
- 유기 매질에 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 용해시키고, 생물학적 활성 화합물을 첨가하는 것; 또는 대안적으로,
- (i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 유기 용액 및 (ii) 생물학적 활성 화합물의 유기 용액 또는 분산액을 혼합하는 것;
을 사용하여, 제조된다.
본 발명의 방법 [2]의 단계 b)는, 본 분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 통상적인 방법, 예를 들어,
- (iii) 단계 a)에서 수득된 혼합물에 알코올을 첨가하는 것, 및 (iv) 2가 금속의 수용액을 즉시 첨가하는 것, 또는 대안적으로,
- (v) 단계 a)에서 수득된 혼합물에 2가 금속을 포함하는 수성알코올성 혼합물(hydroalcoholic mixture)을 첨가하는 것,
에 의해, 또한 제조된다.
본 발명의 방법 [2]는, 본원에 기재된 단계 a) 또는 b)의 상기 방법의 모든 가능한 조합을 포함한다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 본 발명의 방법 [2]은,
a) (i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 유기 용액과 (ii) 생물학적 활성 화합물의 유기 용액 또는 분산액을 혼합하는 단계, 및
b) 단계 a)에 수득된 혼합물에 2가 금속을 포함하는 수성알코올성 혼합물을 첨가함으로써 상기 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 탈용매화하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 수성알코올성 혼합물은 1:1 (v/v) (물/알코올)이다. 다른 특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 상기 수성알코올성 혼합물은, 0.5-5 % (v/v); 바람직하게 1-3%의 2가 금속의 공급원(source)을 포함한다. 추가적인 특정한 실시형태에서, 2가 금속의 상기 공급원은, 0.5-1 % (w/v)의 이에 대응하는 염을 포함하는 수용액이다.
추가적인 특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 단계 a)의 혼합물에서 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 및 생물학적 활성 화합물 사이의 중량비는, 1:0.01 내지 1:0.20, 바람직하게 1:0.02 내지 1:0.15, 보다 바람직하게 1:0.03 1:0.10의 범위에 포함된다.
비-제한적인 설명적인 방식에서, BAC가 도세탁셀 또는 파클리탁셀인 경우에, 1:0.05 또는 1:0.10의 중량비 에스테르 중합체 컨쥬게이트:BAC는 좋은 결과를 제공한다. 유사한 방식에서, 상기 BAC가 캠토테신(campthotecin)인 경우에, 1:0.03 또는 1:0.06 중량비의 에스테르 중합체 컨쥬게이트:BAC는 좋은 결과를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, 본 발명의 방법 [2]의 끝에서 수득된 혼합물에서 유기/수성알코올성 비(organic/hydroalcoholic ratio)(v/v)는 1:1-1:4이고, 바람직하게 1:2 이다.
본 발명의 하나의 변형에서, 본 발명에 따른 나노입자를 생산하기 위한 상기 방법은, 유기 매질을 제거하는 것(예를 들어, 환산 압력 하에서 증발에 의해), 및/또는 임의적으로 정제하는 것(예를 들어, 여과 기술, 원심분리 또는 초원심분리에 의해)의 추가적인 단계 c)를 포함한다. 이와 같이, 만약 원한다면, 본 발명의 상기 방법 [2]는, 분말의 형태로 본 발명의 나노입자를 수득하기 위해, 상기 형성된 나노입자를 건조시키는 것의 추가적인 단계 d)를 포함할 수도 있다. 상기 나노입자의 제시(presentation)의 이러한 형태는 이들의 안정성에 기여하고, 약제학적 생산물에서 이들의 최종적인 적용을 위해 추가적으로 특정하게 유용한 것이다.
나노입자를 건조시키기 위해 적합한 사실상 어떠한 통상적인 기술 또는 방법은, 이러한 건조 단계를 실행하기 위해 사용될 수 있다; 그러나, 특정한 실시형태에서, 나노입자를 함유하는 현탁액을 건조시키는 것은, 분무 건조(spray drying) 또는 냉동-건조(freeze-drying)(동결건조)에 의해; 바람직하게 냉동-건조에 의해 수행된 것이다. 이러한 처리는, 나노입자의 현탁액에 대한, 사카라이드, 예를 들어, 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 만니톨, 말토덱스트린, 글루코스, 소르비톨, 말토오스 등 및 이의 혼합물과 같은, 상기 나노입자의 적절한 보호제(protective agent)를 첨가함으로써, 일반적으로 수행된다. 상기 보호제는, 건조 방법 동안에 산화 뿐만 아니라 분해에 대항하여 본 발명의 나노입자를 보호한다.
본 발명의 방법 [2]에 의해 수득가능한 나노입자는, 본 발명의 나노입자의 특징을 가진다. 따라서, 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자, 즉 a) 유기 매질에서 생물학적 활성 화합물과 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 혼합하는 것, 및 b) 2가 금속의 존재에서 알코올 및 물의 첨가에 의해 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 탈용매화하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 매트릭스 및 생물학적 활성 화합물을 포함하는 나노입자는 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다.
특히, a) (i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 유기 용액과 (ii) 생물학적 활성 화합물의 유기 용액 또는 분산액을 혼합하는 것, 및 b) 단계 a)에서 수득된 혼합물에 2가 금속을 포함하는 수성알코올성 혼합물의 첨가에 의해 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 탈용매화하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된 BAC 및 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자는, 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 임의적으로 결합되어, 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다.
나노입자의 적용
본 발명에 의해 제공된 나노입자(즉, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자 뿐만 아니라, 본 발명의 방법 [2]에 의해 직접적으로 수득된 나노입자)는, 상당량의 생물학적 활성 화합물의 캡슐화, 및 약학 조성물에서 이의 포함(incorporation)을 가능하게 한다. 상기 나노입자는, 현탁액의 형태로, 바람직하게 수성 매질로 제공될 수 있거나, 대안적으로, 이들은 건조 분말의 형태로, 예를 들어, 동결보호제(cryoprotective agent)와 함께 동결건조물(lyophilizate)로서 제공하게 할 수 있다.
본 발명의 나노입자는, 장세포(enterocytes)의 표면과 밀접한 방식으로 상호작용하고 점액 층(mucus layer)을 통과할 수 있는 것으로 보이고, 이는 경구 점막을 통한 약물의 흡수를 개선한다. 중요하게, 본 발명에 의해 제공된 나노입자는 BAC의 경구 생체이용률을 증가시켜, 지속된 및 일정한 혈장 레벨을 제공한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 의약에서 사용을 위해 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자 또는 본 발명에 따른 나노입자에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은, 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자, 또는 본 발명의 나노입자를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 질병의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
BAC로 치료를 필요로 하는 대상에 투여될 본 발명의 로딩된 나노입자(loaded nanoparticles)의 용량은, 시간에 따라 환자에서 이로운 치료학적 반응을 촉발하는데 충분하여야 한다. 따라서, 나노입자는, 질병으로부터의 합병증 및/또는 증상을 예방하거나, 완화시키거나, 감소하거나, 치유하게 하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 환자에 투여된다. 이러한 것을 달성하기 위해 적합한 양은, "치료학적 유효량(therapeutically effective dose)"으로서 정의된 것이다. 상기 투여량은 넓은 범위 내에서 다양할 수 있고, BAC의 성질, 이의 활성도 또는 효능, 나노입자 당 BAC의 양 등에 따라 달라질 것이다. 오직 설명의 목적으로, 대상에 투여될 로딩된 나노입자의 투여량은, 예를 들어, 몸무게 kg 당 대략 0.01 내지 대략 10 mg, 바람직하게 몸무게 kg 당 0.1 내지 2 mg을 포함할 수 있다.
BAC의 자세한 사항은, 본 발명의 나노입자와 함께 "정의" 부분에 언급하였고, 참고자료에 의해 본원에 포함된 것이다. 나노입자에 포함된 BAC는, 치료될 질병에 따라 선택된 것이다. 특정한 실시형태에서, 임의적으로 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께, BAC는 항암제이고; 보다 특정한 실시형태에서, BAC는 도세탁셀, 캠토테신 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스 및 BAC를 포함하는 나노입자(즉, 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자)에 관한 것이고, 상기 BAC는, 암의 예방 또는 치료의 방법에서 사용하기 위한 항암제이다; 다시 말해서, 본 발명은 또한, 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스, 및 BAC를 포함하는 나노입자를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, BAC는 항암제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자의 사용, 또는 본 발명의 나노입자의 사용에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, i) 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 적어도 하나의 나노입자 또는 본 발명의 적어도 하나의 나노입자, 및 ii) 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 약학 조성물(이하 "본 발명의 약학 조성물")에 관한 것이다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 다수의 나노입자 및/또는 본 발명의 다수의 나노입자를 포함한다. 상기 나노입자의 자세한 내용은 상기에 정의된 것이고, 참고자료에 의해 본원에 포함된 것이다.
유리하게, 본 발명의 약학 조성물에서의 나노입자는, 10 내지 900 nm, 바람직하게 50 내지 550, 보다 바람직하게 100 내지 500 nm, 보다 더 바람직하게 150 내지 400 nm의 범위에, 여전히 보다 바람직하게 약 250 nm에 포함된 평균 크기를 가진다.
본 발명의 약학 조성물은, 고체(예를 들어, 정제, 캡슐, 코팅된 정제, 과립(granulates), 좌약, 멸균 결정질 또는 액체 형태를 제공하기 위해 재구성될 수 있는 비결정성 고체 등), 액체(예를 들어, 나노입자의 현탁액 또는 분산액 등) 또는 반고체(겔, 포마드, 크림 등) 약제학적 제형으로 제형화될 수 있다. 상기 기재된 약학 조성물은, 각각의 제형에 대한 적합한 담체 또는 비히클을 포함할 것이다. 게다가, 약학 조성물은, 경우에 따라, 안정제, 현탁액, 보존제, 계면활성제 등을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 선택된 약제학적 제형에 따라 선택될 것이다.
특정한 실시형태에서, 상기 약학 조성물은, 점막에 대한 접근의 경로에 의해 이의 투여에 적합한 약제학적 제형으로서 제형화된 것이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물은 경구적으로 투여된 것이다; 따라서 담체 또는 비히클은 경구 경로에 의해 투여를 위해 허용가능한 하나 또는 그 이상의 약제학적 부형제를 포함한다. 경구 제형은, 본 분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 방법에 의해 통상적으로 제조된다. 활성 성분의 상이한 투여 형태, 사용될 부형제, 및 이들을 제조하기 위한 방법에 대한 검토는 책 "Tratado de Farmacia Galenica", by C. Fauli Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones에서 확인할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은, 예를 들어, 동결건조물(lyophilizate)로서, 건조 분말의 형태로 제조된다.
이러한 발명에 따른 약학 조성물은, 0.05 % 내지 50 %, 바람직하게 0.1 % 내지 30 %, 보다 바람직하게 0.5 % 내지 25 %, 보다 더 바람직하게 1 % 내지 20 %의 범위에 있는 양으로 활성 성분 또는 BAC를 함유할 수도 있고, 상기의 퍼센트는 조성물 또는 제형의 전체 중량에 대한 w/w 이다(the foregoing percentages are w/w versus the total weight of the composition or dosage form). 그럼에도 불구하고, 적합한 비율은 포함된 BAC의 각각의 경우에 따라 달라질 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 의약에 사용하기 위한 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은, 본 발명의 약학 조성물을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 질병의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
투여될 약학 조성물의 치료학적 유효량은 개별적인 경우에 따라 달라질 것이고, 관례적으로, 최적의 효과에 대해 개별적인 경우의 조건으로 적용될 것이다. 따라서, 이는, 물론, 치료 또는 예방을 위한 각각의 경우에 사용된 BAC의 작용의 효능 및 지속기간에 따라, 및 투여의 빈도에 따라, 뿐만 아니라 질병 및 증후군의 성질 및 심각성에 따라, 및 치료될 대상의 성별, 나이, 중량, 공동-약물 및 개별적인 반응성에 따라, 및 치료가 급성 또는 예방학적 인지에 따라 달라질 것이다. 투여량은 소아 투여(paediatric administration)에 대해, 및 대상의 중량에 따라 조정될 수도 있다.
특정한 실시형태에서, 상기 또는 하기에 기재된 다양한 실시형태의 하나 또는 그 이상의 특징과 함께 임의적으로, 본 발명의 약학 조성물은, i) 본 발명의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스, 및 BAC를 포함하는 적어도 하나의 나노입자(즉, 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 방법 [2]에 의해 수득된 나노입자), 여기서 BAC는 항암제이고, ii) 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함한다. 바람직하게, 항암제는, 도세탁셀, 캠토테신 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다; 바람직하게 도세탁셀이다.
BAC가 항암제인 이러한 특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은, 암의 예방 또는 치료의 방법에서 사용될 수도 있다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은, 항암제를 포함하는 본 발명의 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및/또는 치료에 대한 방법에 관한 것이다; 대안적으로, 본 발명은 또한 암의 예방 또는 치료에 대한 약물의 제조에서 항암제를 포함하는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은,
a) 폴리에틸렌 글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %
c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물;
a) 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %,
c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물; 및
a) 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트30 % 내지 40 %,
b) 캠토테신 0.08 % 내지 1.5 %,
c) 칼슘 0.10 % 내지 0.20 %,
d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고, 이때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인 것인, 약학 조성물;
로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명은, 본원에 기재된 특정한 및 바람직한 실시형태의 모든 가능한 실시형태를 포함한다.
실시예
다음의 실시예는 폴리(비닐 메틸 에테르 및 말레산 무수물) 공중합체 (PVM / MA 또는 Gantrez® AN)와 폴리에틸렌글리콜 또는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체와의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조 및 특성을 기술한다. 또한, 다음의 실시예는 다른 유형의 폴리에틸렌글리콜 또는 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 및 생물학적 활성 분자를 기초로 하는 나노 입자의 제조 및 특성을 기술한다. 특히 이러한 나노 입자는 i) 상당한 양의 생물학적 활성 화합물 (예, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 및 캠토테신(campthotecin)을 캡슐화하고, ⅱ) 점액층을 가로지르고, 장 세포의 표면과 친밀한 방식으로 상호 작용할 수 있다는 것이 밝혀졌다(약물의 흡수를 향상시킴).
상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 도세탁셀이 생물학적 활성 화합물로서 사용되는 경우, 상기 나노 입자에의 혼입은 적어도 72 시간 동안 상기 약물의 일정하고 지속된 혈장 수준을 유지시키는 것을 허용한다. 마찬가지로, 캠토테신이 생물학적 활성 화합물로서 본 발명의 나노 입자에 포함되면, 혈장 수준은 적어도 48 시간 동안 유지된다.
일반적인 물질이 첫 번째로 기재된다.
물질
폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물) 또는 폴리(무수물)(PVM/MA) [Gantrez® AN 119]는 ISP (Barcelona, Spain)에서 구입했다. 캠토테신 (99.0 %), 파클리탁셀 (USP 26, grade> 99.5%) 및 도세탁셀 (99.0%)은 21CECpharm (London, UK)에 의해 공급되었다. 탁소테레(Taxotere®)은 Aventis-Pharma (Cedex, France)에서 구입했다. 인산 완충 식염수 (PBS), 판크레아틴, 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000 (mPEG2) 및 폴리에틸렌글리콜 2000, 6,000 및 10,000 (PEG2, PEG6 및 PEG10)은 Sigma-Aldrich (스페인)에서 제공한 것이다. 펩신, 아세톤, 에탄올 및 아세토나이트릴은 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입였다. 탈이온화 시약수(deionized reagent water; 18.2MΩ 저항률)는 수 정화 시스템(Wasserlab, Spain)에 의해 준비되었다. 사용된 모든 시약 및 화학 물질은 분석용 등급을 지녔다.
이들 실시예들은 설명을 위해 제공되며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
종래의 PVM /MA 나노입자의 제조
빈(empty) 종래의 PVM /MA 나노입자 (NP)의 제조
100 mg PVM/MA을 5 mL의 아세톤에 용해시키고 에탄올과 물 (1:1, v/v)의 혼합물을 첨가하여 나노 입자를 형성하였다. 그 후, 유기 용매를 감압하에서 증발에 의해서 제거하고 얻어진 현탁액을 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 27,000xg 원심분리에 의해서 20분간 2회 정제하였다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 마지막으로, 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 PVM/MA의 빈 나노입자로서, 이하 NP 제제(NP)이다.
파클리탁셀 (PTX)를 캡슐화하는 종래의 PVM /MA 나노입자의 제조
일부 변경된 용매치환법(solvent displacement method)에 의해서 파클리탁셀-로딩된 PVM/MA 나노입자를 제조했다. 간략히, 10mg의 파클리탁셀을 100 mg의 PVM/MA을 함유하는 아세톤 5 mL에 분산시켰다. 얻어진 혼합물을 자기 교반하에서 실온에서 1시간 동안 유지했다. 이후, 10 mL의 에탄올을 첨가한 후 20 mg 의 디소디움 에데테이트를 함유하는 수용액 10 mL를 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 자기 교반에 의해서 10분간 균질화한 후, 감압하에서 증발(
Figure pct00002
R-144, Switzerland)에 의해 유기 용매를 제거하고 얻어진 현탁액을 Vivaspin 튜브 내에서 3000xg 으로 탄젠트 여과(tangential filtration)에 의해서 20분간 정제하였다. 이러한 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에 재현탁시켰다. 정제 공정을 2회 반복하고, 마지막으로 이러한 제제를 동결보호제로서 수크로오스 (5 %)를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 PVM/MA의 PTX-로딩된 나노입자로서, 이하 PTX 제제이다.
도세탁셀 (DTX)을 캡슐화하는 종래의 PVM /MA 나노입자의 제조
일부 변경된 용매치환법에 의해서 도세탁셀-로딩된 PVM/MA 나노입자를 제조했다. 간략히, 10mg의 도세탁셀을 100 mg의 PVM/MA을 함유하는 아세톤 5 mL에 분산시켰다. 얻어진 혼합물을 자기 교반하에서 실온에서 1시간 동안 유지했다. 이후, 10 mL의 에탄올을 첨가한 후 20 mg 의 디소디움 에데테이트를 함유하는 수용액 10 mL를 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 자기 교반에 의해서 10분간 균질화한 후, 감압하에서 증발(
Figure pct00003
R-144, Switzerland)에 의해 유기 용매를 제거하고 얻어진 현탁액을 Vivaspin 튜브 내에서 20 min 동안 3000xg 으로 탄젠트 여과에 의해서 정제하였다. 이러한 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에 재현탁시켰다. 정제 공정을 2회 반복하고, 마지막으로 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 %) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들 제제는 PVM/MA의 DTX-로딩된 나노입자로서, 이하 DTX 제제이다.
캠토테신 (CPT)을 캡슐화하는 종래의 PVM /MA 나노입자의 제조
100 mg의 PVM/MA 및 10mg의 캠토테신을 아세톤 2 및 3 mL에 각각 용해시키고 분산시켰다. 캠토테신을 1분간 음파처리하고 PVM/MA 용액과 혼합했다. 직후, 에탄올과 물 (1:1, v/v)의 혼합물을 첨가하여 나노 입자를 형성하였다. 그 후, 유기 용매를 감압하에서 증발에 의해서 제거하고 얻어진 현탁액을 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 27,000xg 원심분리에 의해서 20분간 2회 정제하였다. 마지막으로, 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들 제제는 PVM/MA의 CPT-로딩된 나노입자로서, 이하 CPT 제제이다.
실시예 2
전통적인 페길화 PVM /MA 나노입자의 제조
빈 전통적인 페길화 PVM /MA 나노입자 (PEG trad )의 제조
용매치환법에 의해서 페길화 PVM/MA 나노입자를 제조했다. 간략히, 12.5 mg의 폴리에틸렌글리콜 (PEG2, PEG6 또는 PEG10)을 3 mL의 아세톤에 용해시킨 후 동일한 유기 용매 2 mL 중의 100 mg의 PVM/MA의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 자기 교반하에서 실온에서 1시간 동안 유지하였다. 그 후, 10 mL의 에탄올을 첨가한 후 10 mL의 물을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 감압하에서 증발(
Figure pct00004
R-144, Switzerland)에 의해 유기 용매를 제거하고 얻어진 현탁액을 Vivaspin 튜브 내에서 3000xg 으로 탄젠트 여과에 의해서 20분간 정제하였다. 이러한 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에 재현탁시켰다. 정제 공정을 2회 반복하고, 마지막으로 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 %) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 얻어진 PVM/MA의 페길화 나노입자는 EG2 trad, PEG6 trad 및 PEG10 trad 제제이다.
파클리탁셀을 캡슐화하는 전통적인 페길화 PVM /MA 나노입자(PEG- PTX trad )의 제조
일부 변경된 용매 치환법에 의해서 파클리탁셀을 함유하는 페길화 PVM/MA 나노입자를 제조했다. 간략히, 한편, 12.5 mg의 폴리에틸렌글리콜 (PEG2, PEG6 or PEG10) 을 3 mL의 아세톤에 용해시킨 후, 동일한 유기 용매 2 mL 중의 100 mg의 PVM/MA의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 자기 교반하에서 유지하였다. 동시에 10 mg 의 파클리탁셀을 0.5 mL 아세톤에 용해시키고 중합체 혼합물에 첨가하였다. 그 후, (파클리탁셀, PVM/MA 및 PEG을 함유하는)유기 상을 실온에서 1시간 동안 자기 교반하였다. 그 후, 10 mL의 에탄올을 첨가한 후 20 mg 의 디소디움 에데테이트를 함유하는 수용액 10 mL를 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 자기 교반에 의해서 10분간 균질화한 후, 감압하에서 증발(
Figure pct00005
R-144, Switzerland)에 의해 유기 용매를 제거하고 얻어진 현탁액을 Vivaspin 튜브 내에서 3000xg으로 탄젠트 여과에 의해서 20분간 정제하였다. 이러한 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에 재현탁시켰다. 정제 공정을 2회 반복하고, 마지막으로 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 %) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 따라서, PVM/MA의 PTX-로딩된 전통적인 페길화 나노입자가 이용 가능하고, 이후 PEG2-PTX trad, PEG6-PTX trad 및 PEG10-PTX trad 제제이다.
도세탁셀을 캡슐화하는 전통적인 페길화 PVM /MA 나노입자(PEG- DTX trad )의 제조
먼저, 폴리에틸렌글리콜 2,000 (12.5 mg) 을 3 mL 아세톤에 용해시키고 2 mL 의 아세톤 중의 100 mg의 PVM/MA의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 자기 교반하에서 유지하였다. 한편, 도세탁셀을 0.5 mL의 아세톤 중에 용해시키고 이러한 용액에 첨가하였다. 그 후, 도세탁셀, PVM/MA 및 PEG2을 함유하는 유기상을 실온에서 자기교반하에서 약 1시간 동안 배양시켰다. 이어서 10 mL의 에탄올을 첨가한 후 글리신(50mg) 및 디소디움 에데테이트(18mg)을 함유하는 수용액 10 mL를 첨가한 후 10분간 균질화시켜서 나노입자를 형성하였다. 감압하에서 증발에 의해 유기 용매를 제거하고 최종 부피를 글리신 용액으로 10 mL까지 조절하였다. 이러한 현탁액을 Vivaspin 튜브(300,000 MWCO, Sartorius Group, Germany)내에서 4000xg 으로 탄젠트 여과에 의해서 15분간 정제하였다. 펠렛을 물 중에서 재현탁시키고, 정제 공정을 2회 반복하였다. 마지막으로 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 %) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다. 따라서, PVM/MA의 DTX-로딩된 전통적인 페길화 나노입자가 이용 가능하고, 이후 PEG2-DTX trad 제제이다.
캠토테신을 캡슐화하는 전통적인 페길화 PVM /MA 나노입자(PEG-CPT trad )의 제조
1/0.03/0.125의 중합체/CPT/PEG 비율로 페길화 나노입자를 제조하였다. PEG2 또는 PEG6, 및 캠토테신을 아세톤에서 용해시키고 상이한 조건에서 혼합하였다. 직후, 에탄올, 물, 글리신 및 디소디움 에데테이트의 혼합물을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 10분간 균질화 후 유기 용매를 감압하에서 증발에 의해 제거하였다. 그 후, 얻어진 현탁액을 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 Vivaspin 튜브(300,000 MWCO, Sartorius group, Germany) 내에서 3000xg 으로 20분간 2회 정제하였다. 마지막으로 이러한 제제를, 동결보호제로서 수크로오스 (5 %) 를 사용하여 동결 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 따라서, PVM/MA의 CPT-로딩된 전통적인 페길화 나노입자가 이용 가능하고, 이하 PEG2-CPT trad 및 PEG6-CPT trad 제제이다.
실시예 3
PVM /MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조 및 특성
3.1 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조
이 경우, 상이한 분자량 2,000, 6,000 또는 10,000의 폴리에틸렌글리콜 및 메톡시-폴리에틸렌글리콜 2000을 실험하였다.
에스테르 중합체 컨쥬게이트를 제조하기 위해서, 5 g의 PVM/MA를 250 mL의 유기 용매(즉, 아세톤)에 용해시키고 50℃에서 자기 교반하에서 상이한 양의 폴리에틸렌글리콜 또는 그 유도체와 함께 3시간 동안 배양하였다. 실험된 하이드록실-말단 분자:(PVM/MA) 비율은 다음과 같다:
- mPEG2의 경우, mPEG:(PVM/MA) 1:5;
- PEG2, PEG6 및 PEG10의 경우, PEG:(PVM/MA) 1:20; 1:8;
배양 후, 용매를 제거하고 얻어진 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 감압하에서 증발(
Figure pct00006
R210, Switzerland)에 의해서 건조시켰다. 마지막으로, 얻어진 건조된 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 세정하고 진공 하 여과시켜서(all-glass filter, Merck Millipore, German), 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해서 미반응된 하이드록실-말단 분자의 흔적량이 검출되지 않을 때까지 정제하였다. 이러한 목적으로, 디클로로메탄/메탄올 CH2Cl2/CH3OH (9:1)의 혼합물을 이동상으로서 사용하고 검출하기 위해 요오드를 사용했다. 이러한 단계는 유기 용매 중의 새로운 중합체 컨쥬게이트의 용해성을 개선할 것이다.
3.2 PVM /MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 특성
합성 후, PEG2, PEG6 및 PEG10 를 갖는 얻어진 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 (PEG:PVM/MA 1:8) 및 mPEG2를 갖는 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 (mPEG:PVM/MA 1:5)는, 치환도(DS) 및 분자량(Mw)을 평가하고 PVM/MA 골격 변경의 증거를 얻기 위해서 물리화학적으로 특성화되었다.
다음 기술이 사용되었다:
적외선 분광(IR): IR 분광은 반사 기술에 기초해서 Nicolet Avatar 360FT-IR 장비 (Thermo, USA) 로 행해졌다. 이러한 기술에 의해서 하이드록실-말단 분자 (PEG 또는 mPEG)의 -OH 기능기와 PVM/MA의 무수물 기의 결합을 확인하였다.
원소분석( CHN ): 예비 형성된 모든 에스테르 중합체 컨쥬게이트는 CHN-900 Leco 장치 (Leco Corporations, USA)로 분석되었다. 이러한 기술은 중합체의 조성을 결정하고 하이드록실-말단 분자(PEG 또는 mPEG)가 PVM/MA 구조에 포함되는 경우 C/H 함량 관계에서의 차이를 검출하도록 한다.
적정: PVM/MA 또는 그 에스테르 중합체 컨쥬게이트가 먼저 수화되고 전체 가용화될 때까지 물에 분산되었다. 이 때에 중합체의 수용액은, 지시자로 사용되는 페노프탈레인의 존재시 NaOH 0.2 N 용액으로 적정되었다. 적정은 유리된 카르복실산(-COOH)기의 비율을 측정하기 위해서 사용되었다. 변경되지 않은 PVM/MA 중합체에 비해 감소한 에스테르 중합체 컨쥬게이트 중의 유리된 카르복실산에 의해 분자 결합이 입증되었다.
크기 배제 크로마토그래피- 다각도 레이저 광 산란(SEC-MALLS): SEC-MALLS 기술은 용액 중 중합체의 분자량을 결정하는 역할을 한다. 이러한 기술은 크기 배제 칼럼 상의 몰량에 대한 용리 시간의 검량 곡선을 사용하고 분자량을 찾아낼 수 있다.
동적 광 산란(DLS): 본 기술은 중합체의 유체역학 반경(Rh)을 제공하고, 용액 중의 가장 가능성이 높은 중합체 구조를 평가한다. DLS 측정은 248-채널 multi-tau 상관장치 및 펠티어 효과 온도 유닛 (Protein Solutions Inc, USA)을 구비한 DynaPro-MS/X 포논 상관 분광계를 사용하여 90°의 산란각에서 수행되었다. 레이저의 파장은 100% 강도에서 852.2 nm 이었다. 중합체 컨쥬게이트는 용매로서 테트라하이드로푸란을 사용하여 25℃에서 측정되었다.
핵 자기공명 분광( 1 H-NMR): 펄스 (D0) 1 s 사이의 대기 시간과 펄스 프로그램 zg30을 사용하여 400 MHz (Bruker, USA)의 Bruker Avance 400 장치에서 1H-NMR 분광이 기록되었다. 사전에 수행된 에스테르 중합체 컨쥬게이트는 용매로서 중수소 함유 아세톤(아세톤-d6)에 용해되었다.
3.3 결과
사전에 수행된 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 적외선 분광 연구에 따르면, PEGs 또는 mPEG의 하이드록실과 PVM/MA의 무수물기의 반응에 의해서 발생하는 새로운 에스테르 카르보닐기 ν(C=O)의 스트레칭에 따른 ~ 1705 cm-1에서 새로운 결합을 형성하는 것을 나타냈다. 도 1 참조.
IR에 의해서 중합체와 하이드록실-말단 분자 사이에서 결합이 발생하는 것이 입증되면, 중합체의 개질을 입증하기 위한 추가적인 연구가 행하였다.
표 1은 고유의 PVM/MA 중합체 및 그 에스테르 중합체 컨쥬게이트에 대해서 결정된 탄소(C), 수소(H) 및 산소(O)의 조성을 요약한다. 원소 분석에 따르면, % C 감소 및 % O의 증가를 나타냈고, 이에 의해 개질되지 않은 PVM/MA에 비해 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 조성의 현저한 변화가 확인되고, 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 C 대 O 비율 (C/O 비율)이 고유 공중합체보다 낮다.
PVM/MA 및 이의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 원소 분석
중합체 %C %H %O C/O
PVM /MA 53.49 5.18 41.33 1.29
PVM /MA-PEG2 49.78 5.19 45.03 1.11
PVM /MA-PEG6 49.96 5.18 44.89 1.11
PVM /MA-PEG10 49.85 5.68 44.47 1.12
PVM /MA-mPEG2 48.33 6.01 45.66 1.06
한편, 적정에 따르면, 하이드록실-말단 분자 (PEG 또는 mPEG) 결합에 의해서 무수물 고리가 점유되기 때문에 유리된 -COOH 기의 양의 감소가 확인되었다(표 2).
PVM/MA 및 이의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 적정
중합체 % 유리된 COOH
PVM/MA 100
PVM/MA-PEG2 57.67
PVM/MA-PEG6 40.68
PVM/MA-PEG10 54.79
PVM/MA-mPEG2 50.27
DLS에서는, PVM/MA의 유체역학 반경 및 PEGs 또는 mPEG을 갖는 PVM/MA 의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 유체역학 반경을 나타낸다. 모든 경우, 유체역학적 반경은, PVM/MA-메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2,000 컨쥬게이트를 제외하고 출발 PVM/MA에 비해서 증가하고, 이는 개질되지 않은 PVM/MA 중합체에 비해 약간 낮지만 매우 유사한 값을 나타낸다(표 3). 이는, 중합체 컨쥬게이트가 유기 용매에 용해될 때 분자 구조의 변화를 나타낸다. mPEG 분자 내에 메톡시기에서 수소 원자의 부재는 PEG 분자에서 존재하는 하이드록실기보다 낮은 등급에서 분자의 접힘을 촉진한다.
DLS를 사용한 PVM/MA 및 이의 에스테르 컨쥬게이트의 유체역학 반경(Rh)의 측정
중합체 R h
PVM/MA 18.96
PVM/MA-PEG2 1158.68
PVM/MA-PEG6 518.85
PVM/MA-PEG10 114.52
PVM/MA-mPEG2 12.89
마지막으로, 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 1H-NMR 분광은, 모든 경우 분자 (PEG 또는 mPEG) 내에 -O-CH2-CH2- 폴리(에틸렌) 유닛에 대응하는 화학적 시프트의 존재를 나타냈다(도 2).
얻어진 에스테르 중합체 컨쥬게이트 (D.S.)에서 하이드록실-말단 분자의 비율을 측정하기 위해서, PVM/MA 분자 내에 "하나의" 프로톤에 관련된 피크의 영역과 하나의 특징적인 하이드록실-말단 분자 피크의 영역 사이의 비율(도 2b~2e에서 강조된 에스테르 중합체 컨쥬게이트에서 새로운 화학적 시프트)이 계산되었다.
이러한 결과에 의해서, 얻어진 컨쥬게이트의 평균 분자량(Mw)이 또한 측정되고, SEC-MALLS에 의해서 계산되는 바와 같이 95.5 kDa가 Gantrez® AN 119의 분자량인 것으로 고려된다(표 4).
1H-NMR에 의해서 계산된 실험된 상이한 컨쥬게이트에 대해 추정된 분자량(Mw) 및 치환도(DS)
중합체 M w ( KDa ) D.S.
(%)
PVM/MA 95.5 * -
PVM/MA-PEG2 103.11 7.4
PVM/MA-PEG6 107.69 11.3
PVM/MA-PEG10 104.79 8.9
PVM/MA-mPEG2 102.98 7.3
(*) SEC/MALLS에 의해서 얻어진 분자량
에스테르 중합체 컨쥬게이트가 정제되고 특성화되면, 나노입자를 제조하고 이들 특성연구도 수행했다.
실시예 4
PVM /MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자의 제조
PVM /MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 의 매트릭스를 포함하는 빈 나노입자(PEG conj 또는 mPEG conj)의 제조
나노입자는 다음과 같이 제조했다. 폴리에틸렌글리콜 2,000, 폴리에틸렌글리콜 6,000, 폴리에틸렌글리콜 10,000 [사용된 비율 PEG2:(PVM/MA), PEG6:(PVM/MA) 및 PEG10:(PVM/MA) 1:20] 또는 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000 [비율 mPEG2:(PVM/MA) 1:5]와 컨쥬게이팅된 PVM/MA의 사전에 수행된 에스테르 중합체 100 mg은 5 mL 아세톤에 용해시키고 실온에서 자기 교반하에서 CaCl2 0.8 % (w/v) 의 수용액의 1 % (v/v) 을 포함한 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올) 10 mL의 첨가에 의해서 용매화되었다. 유기 용매는 감압하에서 증발(
Figure pct00007
R210, Switzerland)에 의해 제거되었다. 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm 으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 정제 단계는 2회 반복했다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이와 같이 하여 PEG2, PEG6, PEG10 또는 mPEG2을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터 로딩되지 않은 나노입자가 얻어진다: 각각 PEG2 conj, PEG6 conj, PEG10 conj 및 mPEG2 conj 제제.
파클리탁셀을 캡슐화하는 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자(mPEG2-PTX conj)의 제조
메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000 을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 100 mg[mPEG2:(PVM/MA) 비율 1:5]을 4 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 동시에 10 mg의 파클리탁셀을 1 mL의 아세톤 중에 분산시켰다. 컨쥬게이트의 용액 및 파클리탁셀의 분산액을 실온에서 자기 교반하에서 혼합한 후 CaCl2 0.8% (w/v)의 1% (v/v) 수용액을 함유하는 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올) 10 mL 을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 유기 용매를 감압하에서 증발(
Figure pct00008
R210, Switzerland)에 의해 제거하였다. 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm 으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 정제 단계는 2회 반복했다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w) 를 동결 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 mPEG2-PTX conj 나노입자 제제이다.
파클리탁셀을 캡슐화하는 폴리에틸렌글리콜 2,000과 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 매트릭스를 포함하는 나노입자(PEG2-PTX conj)의 제조
폴리에틸렌글리콜 2,000 을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 100 mg[PEG2:(PVM/MA) 비율 1:20]를 4 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 동시에 10 mg의 파클리탁셀을 1 mL의 아세톤 중에 분산시켰다. 컨쥬게이트의 용액 및 파클리탁셀의 분산액을 실온에서 자기 교반하에서 혼합한 후 CaCl2 0.8% (w/v)의 1% (v/v) 수용액을 함유하는 10 mL 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올)을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 유기 용매를 감압하에서 증발(
Figure pct00009
R210, Switzerland)에 의해 제거하였다. 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm 으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 정제 단계는 2회 반복했다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스(5 % w/w)를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 PEG2-PTX conj 나노입자 제제이다.
도세탁셀을 캡슐화하는 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자(mPEG2- DTX conj)의 제조
메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 100 mg[mPEG2:(PVM/MA) 비율 1:5]을 4 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 동시에 10 mg의 도세탁셀을 1 mL의 아세톤 중에 분산시켰다. 컨쥬게이트의 용액 및 도세탁셀의 분산액을 실온에서 자기 교반하에서 혼합한 후 CaCl2 0.8% (w/v)의 1% (v/v) 수용액을 함유하는 10 mL 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올)을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 유기 용매를 감압하에서 증발(
Figure pct00010
R210, Switzerland)에 의해 제거하였다. 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm 으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 정제 단계는 2회 반복했다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w) 를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 mPEG2-DTX conj 나노입자 제제이다.
도세탁셀을 캡슐화하는 폴리에틸렌글리콜 2,000과 PVM /MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자(PEG2-DTX conj)의 제조
폴리에틸렌글리콜 2,000을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 100 mg[PEG2:(PVM/MA) 비 1:20]을 4 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 동시에 10 mg의 도세탁셀을 1 mL의 아세톤 중에 분산시켰다. 컨쥬게이트의 용액 및 도세탁셀의 분산액을 실온에서 자기 교반하에서 혼합한 후 CaCl2 0.8% (w/v)의 1% (v/v) 수용액을 함유하는 10 mL 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올)을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 유기 용매를 감압하에서 증발(
Figure pct00011
R210, Switzerland)에 의해 제거하였다. 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm 으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 정제 단계는 2회 반복했다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스(5 % w/w)를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 PEG2-DTX conj 나노입자 제제이다.
캠토테신을 캡슐화하는 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000과 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노입자(mPEG2-CPT conj)의 제조
메톡시 폴리에틸렌글리콜 2,000 을 갖는 예비 형성된 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 100 mg[mPEG2:(PVM/MA) 비 1:5]을 4 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 동시에 3 mg의 캠토테신을 1 mL의 아세톤 중에 분산시키고, 30 초간 음파처리했다. 컨쥬게이트의 용액 및 캠토테신의 분산액을 실온에서 자기 교반하에서 혼합한 후 CaCl2 0.8% (w/v)의 3% (v/v) 수용액을 함유하는 10 mL 수성알코올성 혼합물 1:1 (v/v) (물/에탄올)을 첨가하여 나노입자를 형성하였다. 유기 용매를 감압하에서 증발(
Figure pct00012
R210, Switzerland)에 의해 제거한 후, 얻어진 현탁액은 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 4℃에서 17,000 rpm으로 20분간 원심분리(Sigma 3 K30, Germany)에 의해서 정제했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 물 중에서 재현탁시켰다. 마지막으로, 제제를 동결보호제로서 수크로오스 (5 % w/w)를 사용하여 냉동 및 동결 건조시켰다(Genesis 12EL, Virtis, USA). 이들은 mPEG2-CPT conj 나노입자 제제이다.
실시예 5
나노 입자의 물리화학적 특성
이 연구를 수행하기 위해, 실시예 1, 2 및 4에 기술된 나노 입자의 제제가 사용되었다.
5.1 재료 및 방법
Zetasizer 분석기 시스템 (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA)을 사용하여 광자 상관법 (PCS) 및 전기 영동 레이저 도플러유속계를 통해 나노 입자의 평균 유체 역학 직경 및 제타 전위를 각각 결정 하였다. 나노 입자의 직경은 초순수(ultrapure water) (1:10)에 분산시킨 후 측정하였으며 90℃ 의 동적 광 산란 각 (dynamic light scattering angle)에 의해 25 ℃에서 측정되었다. 동일한 장비에서 다음과 같이 제타 전위를 측정 하였다: 동일한 시료 200 ㎕를 0.1 mM KCl 용액 2 mL에 희석시켰다.
제제의 표면 형태에 대한 연구는 Zeiss DSM940 디지털 주사 전자 현미경 (Oberkochen, Germany)에서 디지털 이미지 시스템 (Point Electronic GmBh, 독일)과 결합 된 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 수행되었다. 먼저, 나노 입자를 탈 이온수로 희석하고 4 ℃에서 20 분 동안 17,000 rpm (Sigma 3 K30, Germany)에서 원심 분리했다. 펠렛을 건조시키고 Emitech K 550 Sputter-Coater (Ahsford, UK)에서 9nm 금 층으로 음영처리 하였다. 최종적으로, 나노 입자 형성의 수율은 나노 입자를 제조하는데 사용된 중합체의 초기 양과 동결건조 된 샘플의 중량 간의 차이로부터 중량 측정(gravimetry)에 의해 계산되었다.
Figure pct00013
나노 입자의 파클리탁셀 함량
나노 입자에 로딩된 파클리탁셀의 양은 애질런트 모델 1200 시리즈 LC 및 228nm로 설정된 다이오드 어레이 검출기에서 HPLC-UV로 정량화되었다. 크로마토그래피 시스템에는 역상(reversed-phase) 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini 컬럼 (입자 크기 5㎛)과 프리 컬럼 (Phenomenex SecurityGuard C18)이 장착되었다. 0.5 mL / min에서 펌핑 된 이동상은 인산 완충액 (0.01 M, pH 2)과 아세토나이트릴 (50:50, v / v)의 혼합물이었다. 컬럼은 30℃에서 설정되고 주입량은 100 ㎕이었다. 도세탁셀은 내부 표준으로 사용되었다. 검정 곡선은 80 및 7000 ng / mL 범위로 설계되었다 (r2>0.999). 정량화의 한계는 40 ng / mL로 계산되었다. 분석을 위해, 나노 입자를 아세토나이트릴 (1:5 v / v)로 가용화시켰다. 샘플을 오토 샘플러 바이알에 넣고 덮개를 달아 HPLC 오토 샘플러에 넣었다. 각 샘플을 3 번로 분석하였고, 결과는 나노 입자 1mg 당 파클리탁셀(㎍)의 양으로 나타내었다.
나노 입자의 도세탁셀 함량
나노 입자에 로딩된 도세탁셀의 양은 애질런트 모델 1200 시리즈 LC 및 228nm로 설정된 다이오드 어레이 검출기에서 HPLC-UV로 정량화되었다. 크로마토그래피 시스템에는 역상(reversed-phase) 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini 컬럼 (입자 크기 5㎛)과 프리 컬럼 (Phenomenex SecurityGuard C18)이 장착되었다. 0.5 mL / min에서 펌핑 된 이동상은 인산 완충액 (0.01 M, pH 2)과 아세토나이트릴 (50:50, v / v)의 혼합물이었다. 컬럼은 30℃에서 설정되고 주입량은 100 ㎕이었다. 파클리탁셀은 내부 표준으로 사용되었다. 검정 곡선은 1.25 및 320 ㎍ / mL 범위로 설계되었다 (r2>0.999). 정량화의 한계는 60 ng / mL로 계산되었다. 분석을 위해, 나노 입자를 아세토나이트릴 (1:8 v / v)로 가용화시켰다. 샘플을 오토 샘플러 바이알에 넣고 덮개를 달아 HPLC 오토 샘플러에 넣었다. 각 샘플을 3 번 분석하였고, 결과는 나노 입자 1mg 당 도세탁셀(㎍)의 양으로 나타내었다.
나노 입자의 캠토테신 함량
나노 입자에 로딩된 캠토테신의 양은 애질런트 모델 1100 시리즈 LC 에서 HPLC-FLD로 정량화되었고, 형광 검출기는 각각 380 및 418nm의 여기(excitation) 및 방출로 설정되었다. 크로마토그래피 시스템에는 역상(reversed-phase) 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini 컬럼 (입자 크기 5㎛)과 프리 컬럼(precolumn) (Phenomenex SecurityGuard C18)이 장착되었다. 1 mL / min에서 펌핑된 이동상은 아세토나이트릴 및 트리플루오로아세트산 0.01 % (v / v)의 50:50 (v / v) 혼합물로 구성된다. 컬럼은 30℃로 설정되고, 주입량은 20㎕이었다. 검정 곡선은 0.48 및 8000 ng/mL 범위로 설계되었다 (r2>0.999). 정량화의 한계는 1.3 ng/mL로 계산되었다.
분석을 위해, 나노 입자를 아세토나이트릴 (1:10 v / v)로 가용화시켰다. 샘플을 오토 샘플러 바이알에 넣고 덮개를 달아 HPLC 오토 샘플러에 넣었다. 각 샘플을 3 번 분석하였고, 결과는 나노 입자 1mg 당 캠토테신(㎍)의 양으로 나타내었다.
5.2 결과
다른 언로드(unload) 나노 입자 제제들의 주요 물리 화학적 특성은 표 5에 요약되어있다.
합성된 상이한 언로드 PVM / MA 나노 입자의 물리 화학적 성질. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. (n = 3).
크기
(nm) 		다분산성 지수 제타 전위
(mV) 		리간드 함량
(㎍ /mg NP)* 		수율( % )
NP 297±1 0.025±0.015 -40±2 - 74
PEG2 trad 148±2 0.095±0.009 -41±3 59 71
PEG6 trad 131±1 0.104±0.011 -40±0.2 89 66
PEG10 trad 208±1.4 0.081±0.023 -43±0.5 60 82
PEG2 conj 134±1 0.163±0.015 -44±1 27±1 58
PEG6 conj 230±1 0.082±0.008 -35±1 39±1 77
PEG10 conj 322±8 0.231±0.018 -32±1 35±1 64
mPEG2 conj 259±6 0.200±0.040 -33±4 95±1 81
*1H-NMR에 의해 계산된 중합체 컨쥬게이트의 리간드 (히드록시 - 말단 분자) 함량.
mPEG2-conj 나노 입자의 히드록시 - 말단 분자 (리간드) 함량은 나머지 중합체 컨쥬게이트 나노 입자와 비교하여 상당히 높다는 것을 알 수 있다. 이는 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 형성하는데 사용되는 mPEG2의 출발량이 PEG2, PEG6 또는 PEG10에 비해 훨씬 더 높기 때문에 논리적이다.
파클리탁셀 - 로딩된 나노 입자의 특성
파클리탁셀(PEG-PTX)로 로딩된 다른 나노 입자 제제(PEG-PTX)의 주요 물리 화학적 특성을 표 6에 요약하였다. 첫 번째로, PEG2 컨쥬게이트 (PEG2와 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트)를 함유하는 나노 입자는 mPEG2 컨쥬게이트 (PVM / MA와 mPEG2의 에스테르 중합체 컨쥬게이트)를 갖는 나노 입자보다 더 큰 크기를 나타내었다. PEG2 컨쥬게이트의 경우, 크기는 400 nm에 가깝지만, mPEG2 컨쥬게이트 크기를 함유하는 다른 제제는 약 300 nm보다 작다.
제타 전위에 대하여, mPEG2 컨쥬게이트를 함유하는 로딩된 나노 입자는 약 -38 mV 부근에서 약간 더 음의 표면 전하를 나타냈다. PEG2 컨쥬게이트로 제형화 된 나노 입자는 약 -33 mV의 표면 전하를 나타냈다. 또한, 공정의 수율은 두 제제 모두 약 70 %로 계산되었다. 나노 입자에 로딩된 PTX의 양에 초점을 맞추어, mPEG2와 PEG2 컨쥬게이트는 약 160 ㎍ / mg NP로 계산되었다.
다른 PVM / MA 나노 입자들의 물리 화학적 특성. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. (n=3).
제제 크기
(nm) 		다분산성 지수 제타 전위
(mV) 		PTX 로딩
(㎍ PTX /mg NP) 		수율 (%)
NP 297 ±1 0.025 -40 ± 2 - 74
PTX 177±3 0.038 -44.2±7.1 78.1±3.2 62
PEG2 trad 148±2 0.095±0.009 -41±3 - 71
PEG6 trad 131±1 0.104±0.011 -40±0.2 - 66
PEG10 trad 208±1.4 0.081±0.023 -43±0.5 - 82
PEG2 - PTX trad 178±4 0.154 -40.3±1.1 150.1±5.2 60 ±4
PEG6 - PTX trad 180±5 0.173 -39.5±4.2 144.1±3.1 64
PEG10 - PTX trad
188±2 0.136
 -41.1±1.3 144.5±6.4 63
PEG2 conj 134±1 0.163±0.015 -44±1 - 58
mPEG2 conj 259±6 0.200±0.040 -33±4 - 81
PEG2 - PTX conj 430 ±8 0.280 -33 ±6 152 ±8 69 ±8
mPEG2 - PTX conj 318 ±9 0.230 -38 ±4 160 ±9 70 ±4
우리가 PEG2-PTX trad와 PEG2-PTX conj 제형 사이의 나노 입자 수율을 비교하면 PVM / MA와 PEG2의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 사용하는 경우 형성된 나노 입자의 비율이 더 높다.
도세탁셀 - 로딩된 나노 입자의 특성
컨쥬게이트 나노 입자는 용매 치환 방법에 의해 성공적으로 제조되었다. 도세탁셀 (PEG-DTX)이 로딩된 상이한 나노 입자 제제의 주요 물리 화학적 특성은 표 7에 요약되어있다. 첫 째로, PEG2 컨쥬게이트 (PEG2와 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트)를 함유하는 로딩된 나노 입자는 mPEG2 컨쥬게이트 (PVM / MA와 mPEG2의 에스테르 중합체 컨쥬게이트)를 갖는 로딩된 나노 입자보다 더 큰 크기를 나타내었다. PEG2의 경우 크기는 400 nm에 가까웠지만 mPEG2 크기를 포함하는 다른 제제의 경우에는 약 300 nm가 더 작았다.
제타 전위에 관해, mPEG2를 함유하는 나노 입자는 약 -39 mV 부근에서 약간 더 음의 표면 전하를 나타냈다. PEG2 컨쥬게이트로 제형화 된 나노 입자는 약 -33 mV의 표면 전하를 나타냈다.
또한, 공정의 수율은 두 제형 모두 약 60 %로 계산되었다. 나노 입자에 로딩된 도세탁셀의 양에 초점을 맞추어, mPEG2 및 PEG2 컨쥬게이트는 약 100 ㎍ / ㎎ NP로 계산되었다.
다른 PVM / MA 나노입자의 물리 화학적 특성. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. (n = 3).
제제 크기
(nm) 		다분산성 지수 제타 전위
(mV) 		DTX 로딩
(㎍ DTX /mg NP) 		수율 ( % )
NP 297±1 0.025±0.015 -40±2 - 74
DTX 219±2 0.128±0.029 -43±1 60±2 65
PEG2 trad 148±2 0.095±0.009 -41±3 - 71
PEG2 - DTX trad 203±4 0.060±0.010 -36±4 110±3 62±3
PEG2 conj 134±1 0.163±0.015 -44±1 - 58
mPEG2 conj 259±6 0.200±0.040 -33±4 - 81
PEG2 - DTX conj 415 ±4 0.246±0.024 -33 ± 1 94 ± 5 64 ±9
mPEG2 - DTX conj 339 ±7 0.083±0.038 -39 ± 5 100 ± 6 60 ±9
캠토테신 - 로딩된 나노 입자의 특성
캠토테신이 함유된 얻어진 나노 입자의 물리 화학적 특성은 표 8에 요약되어있다. 나노 입자가 캠토테신과 함께 mPEG2 conj (PVM / MA와 mPEG2의 에스테르 중합체 컨쥬게이트) 나노 입자에 로딩되었을 때, 평균 크기는 약 195nm였다. 다분산성 지수(PDI)는 0.3보다 낮았으며 균질한 제제를 의미한다. 나노 입자의 제타 전위와 관련하여, 약 -36 mV의 음전하를 가진 입자에 의해 제제가 형성되었다. 또한, 공정의 수율은 약 70 %였다. 약물 로딩과 관련하여, 컨쥬게이트에서 나노 입자로 캡슐화 된 캠토테신의 양은 11 μg / mg에 달했다. 통상적인 페길화된(pegylated) 나노 입자에 로딩된 캠토테신의 양은 통상적인 PEG6-CPT보다 PEG2-CPT의 경우 약간 더 높았으며, 9 μg / mg의 나노 입자에 달했다.
다른 나노 입자들의 물리 화학적 특성. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. (n=3).
제제 크기
(nm) 		다분산성 지수 제타 전위
(mV) 		CPT 로딩
(㎍ CPT/mg NP) 		수율 ( % )
NP 297±1 0.025±0.015 -40±2 - 74
CPT 150 0.190 -33 2.9 36.5
PEG2 trad 148±2 0.095±0.009 -41±3 - 71
PEG6 trad 131±1 0.104±0.011 -40±0.2 - 66
PEG2 -CPT trad 120±2 0.130±0.020 -42±4 8.9±1.1 61±7
PEG6 -CPT trad 118±5 0.120±0.030 -35±6 8.2±0.9 54±9
mPEG2 conj 259±6 0.200±0.040 -33±4 - 81
mPEG2 -CPT conj 195±2 0.230±0.030 -36±3 10.9±0.2 69±4
주사 전자 현미경에 의한 형태학적 분석(도 3)은 모든 폴리(무수물) 나노 입자 유형이 광자 상관법에 의해 측정된 것과 비슷한 크기의 구형 입자의 균일한 집단으로 구성되었음을 보여주었다. 나노 입자의 표면은 매끈한 것으로 보이고 표면에는 거친 부분이 보이지 않는다.
실시예 6
도세탁셀의 in vitro 및 in vivo 연구
6.1 in vitro 방출 연구에서의 도세탁셀
방출 실험은 가라앉은 상태(sink condition) 하에서 37 ℃에서 0.5 %의 폴리소르베이트 80(Tween® 80)을 포함하는 모조의 위액(SGF; pH 1.2; 펩신 0.32 % w/v) 장의 유체(SIF; pH 6.8; 판크레아틴1 % w/v)를 도세탁셀용 가용화제로 사용하여 수행되었다. 연구는 적절한 매질에 나노 입자가 분산된 후 Vortemp 56TM Shaking incubator (Labnet International Inc., NJ, USA)에서 교반하여 수행되었다.
각 시점에서, 나노 입자로 제형화된 도세탁셀 50 ㎍을 상응하는 모조 유체 2 mL에 재현탁 시켰다. 분석된 제제는 DTX 나노 입자 (도세탁셀을 캡슐화하는 통상적인 PVM / MA 나노 입자), PEG2-DTX trd(도세탁셀을 캡슐화하는 PEG로 페길화된 통상적인 PVM / MA 나노 입자), mPEG2-DTX conj(도세탁셀을 캡슐화하는 mPEG2와 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자) 및 PEG2-DTX conj (도세탁셀을 캡슐화하는 PEG2와 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자) 이었다.
방출 매질에서 나노 입자의 농도는 도세탁셀의 가라앉는 상태(sink conditions)를 평가하기 위해 조정되었다. 다른 제제들은 SGF에서 2 시간 동안 유지되었고 SIF에서 12 시간 동안 유지되었다. 다른 시점에서, 샘플 튜브를 수집하고 27,000xg에서 20 분 동안 원심 분리 하였다. 마지막으로, 상등액을 여과하고, 제제로부터 방출 된 도세탁셀의 양을 HPLC (SGF 및 SIF로부터 수득 한 상등액 중의 유리 도세탁셀의 보정 곡선, r2>0.999)에 의해 정량화 하였다. 방출 프로파일은 누적 방출 백분율로 표현되고 시간에 대해 플롯되었다.
6.2 Balb /c 마우스에서 도세탁셀을 캡슐화한 나노 입자의 in vivo 약동학 연구
마우스에 DTX 로딩된 나노 입자의 투여
Harlan (Barcelona, Spain)에서 얻은 Balb / c 암컷 마우스 (20-22 g)에 대해 약동학 연구를 수행하였다. 동물 실험에 관한 유럽 입법 (86 / 609 / EU)에 따라 기관 동물 실험 윤리위원회 (규약 번호 E21-12)에 의해 승인된 실험동물에서의 조사에 대한 윤리적 가이드라인 및 정책에 따라 연구가 수행되었다. 실험 전에 동물들에게 먹이와 식수에 자유롭게 접근 할 수 있도록 1 주간 적응적으로 먹이를 주었다 (22 ± 2 ℃, 12 시간 빛 및 12 시간 암 주기, 50-60 % 상대 습도). 제제를 경구 투여하기 전에, 흡수에 대한 간섭을 피하기 위해 동물을 밤새 단식시키고, 식수에 대한 접근은 자유롭게 하였다.
약동학 연구를 위해 마우스를 혈액 샘플링 시간에 따라 무작위로 그룹으로 나누었다. 각 시점은 3 마리의 동물에 해당했다. 실험 그룹은 DTX, PEG2-DTX trad, mPEG2-DTX conj 및 PEG2-DTX conj 나노 입자였다. 대조군으로서, 한 그룹의 동물은 Taxotere®를 정맥 내로 (i.v.) 투여받았고 다른 그룹은 상업용 제제로 구강 투여되었다. 각 동물은 동등한 양의 도세탁셀을 30mg / kg 체중의 투여량으로 블런트 니들(blunt needle)로 식도를 통해 복부로 투여받거나 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 경구 투여 받았다.
혈액 샘플을 투여 후 설정된 시간 (0, 10 분, 30 분, 1 시간, 1.5 시간, 3 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간) 에 수집 하였다. EDTA는 항응고제로 사용되었다. 혈액량은 체온에서 예열한 같은 용량의 생리 식염수로 복강 내로 회복되었다. 샘플을 즉시 얼음 위에 놓고 2,500xg에서 10 분 동안 원심 분리시켰다. 혈장을 깨끗한 튜브로 분리하고 HPLC 분석하기까지 -20 ℃에서 동결시켰다.
혈장 샘플에서 DTX의 HPLC 정량
도세탁셀의 양은 HPLC-UV에 의해 혈장에서 측정되었다. 검정 곡선은 DTX / PTX 크로마토그래피의 영역을 농도로 변환하기 위해 사용되었다. 캘리브레이터와 품질 관리 샘플은 에탄올 용액 안의 약물 없는 혈장에 적절한 부피의 표준 도세탁셀을 첨가함으로써 준비했다. 검정 곡선은 100 ~ 6250 ng / mL (r2> 0.999) 범위로 설계되었다. 혈장의 분취액(aliquot)(200 ㎕)을 25 ㎕의 내부 표준 용액 (파클리탁셀, 에탄올 내 10 ㎍/mL, 이전에 증발됨)과 혼합 하였다. 볼텍싱 혼합(votex mixing) 후, 액체 - 액체 추출은 부드러운 소용돌이 교반 (1 분) 후 4 mL의 tert- 부틸 메틸 에테르를 첨가하여 수행 하였다. 혼합물을 3000xg에서 10 분 동안 원심 분리 한 후, 유기층을 깨끗한 튜브로 옮기고 건조 될 때까지 증발시켰다 (Savant, Barcelona, Spain). 마지막으로, 잔류물을 125㎕의 재구성 용액 (아세토나이트릴 - 포스페이트 완충액 0.01M pH = 2; 50:50, v / v)에 용해시키고 오토 샘플러 바이알에 옮기고 캡핑하여 HPLC 자동 샘플러에 넣었다. 각 시료의 100 ㎕ 분취 액을 HPLC 칼럼에 주입 하였다.
약동학 데이터 분석
상이한 DTX 제제의 투여 후에 얻어진 시간 데이터에 대해 플롯된 혈장 농도의 약동학적 분석을 WinNonlin 5.2 소프트웨어 (Pharsight Corporation, USA)로 비구획형 모델을 사용하여 분석 하였다. 다음의 파라미터들이 추정되었다: 최대 혈장 농도 (Cmax), 최대 농도에 도달하는 시간 (Tmax), 시간 0에서 ∞ 까지의 농도 - 시간 곡선 아래 면적 (AUC), 평균 체류 시간 (MRT), 클리어런스 (Cl), 분포 용적 (V) 및 종료 단계의 반감기 (t1/2 z ).
또한, 도세탁셀의 상대적인 경구 생체 이용률, F(%)는 다음 식에 의해 평가되었다.
Figure pct00014
여기서 AUCi .v. 및 AUCoral은 정맥 내 및 구강 투여에 대한 곡선 아래 영역에 각각 대응하였다.
통계학적 분석
데이터는 적어도 세 번의 실험의 평균 ± S.D로 표현된다. 논-파라메트릭(non-parametric) Kruskall-Wallis와 U Mann-Whitney 테스트를 사용하여 통계적 차이를 조사했다. 모든 경우에 p <0.05가 통계적으로 유의하다고 간주되었다. 모든 데이터 처리는 GraphPad Prism 6.0 통계 소프트웨어 프로그램 (GraphPad Software, CA, USA)을 사용하여 수행되었다.
6.3 결과
도세탁셀 in vitro 방출 연구
나노 입자 제제로부터 도세탁셀 방출 프로파일을 두 가지 상이한 배지에서 배양한 후 평가하였다: 용해 보조제로서 0.5 % Tween 80 (w / v)을 함유하는 모조의 위 및 장액. 도 4는 DTX 나노 입자, PEG2-DTX trad, PEG2-DTX conj 및 MPEG2-DTX conj 나노 입자 제제로부터 도세탁셀의 방출 프로파일을 시간의 함수로서 약물 방출의 누적 비율로 나타낸다. 모든 경우에 나노 입자가 SGF에 분산되었을 때 약물 방출이 관찰되지 않았다. 대조적으로, 나노 입자가 SIF에 분산되었을 때, 도세탁셀이 방출되었다.
PEG2-DTX trad의 경우, SIF에서의 방출 패턴은 처음 30 분 동안 로딩된 약물의 약 75 %의 중요한 버스트 효과(burst effect)에 이어 10 시간까지 지속되는 해방 단계에 의해 특징 지어졌다. 반면, DTX 나노 입자의 경우, SIF에서 도세탁셀의 방출 곡선은 PEG2-DTX trad 보다 느린 도세탁셀 방출을 나타내었고 연구가 끝날 때까지 거의 모든 피전달체(cargo)가 방출되는 보다 안정적인 방출이 뒤따랐다.
PEG2-DTX conj와 mPEG2-DTX conj 나노 입자 제제 모두 유사한 방출 프로파일을 나타내었다. SIF의 존재 하에서, 도세탁셀 방출은 로딩된 약물의 90 %까지의 빠른 초기 버스트 방출을 특징으로 하는 이상(biphasic) 방출 패턴을 나타냈고 보다 지속적인 해방 단계가 뒤따랐다. DTX의 완전한 방출은 연구 시작 10-11 시간 후에 모든 샘플에 대해 얻어졌다.
Balb / c 마우스에서 도세탁셀 함유 나노 입자의 약동학 연구
암컷 Balb / c 마우스에 Taxotere® (30mg / Kg의 단일 투여량)를 정맥 내 투여 후 도세탁셀의 혈장 농도 - 시간 프로파일을 도 5에 나타내었다. 약물의 혈장 농도는 이상(biphasic) 방식으로 시간에 따라 급격히 감소하였고, 데이터는 비구획형 모델로 조정되었다. 혈장 내 도세탁셀 레벨은 투여 후 12 시간까지 정량화할 수 있었다.
도 6은 시판되는 Taxotere®로 투여되거나 다른 폴리 (무수물) 나노 입자 제제에 캡슐화된 경우에, Balb / c 마우스에 대한 도세탁셀 (30mg / kg의 단일 투여량)의 경구 투여 후 혈장 농도 대 시간 프로파일을 도시한다: 통상적인 PVM / MA 나노 입자 (DTX 제형)에서 PEG2 (PEG2-DTX trad)로 페길화된 통상적인 PVM/MA 나노 입자 또는 PEG2 (PEG2-DTX conj) 또는 mPEG2 (mPEG2-DTX conj)와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자. 상업용 Taxotere®를 경구 루트로 마우스에 투여했을 때, 도세탁셀 혈장 수준은 항상 크로마토그래피 분석 기술의 정량 한계 이하인 것으로 밝혀졌다. 반대로, 도세탁셀이 나노 입자에 로딩 되었을 때, 이들 제제는 지속된 혈장 수준을 나타내었다. 모든 경우에, 항암제 혈장 농도가 처음 1.5-2 시간 동안 급격히 상승하여 Cmax에 이르렀으며, 뒤이어 DTX 제제의 경우 최소 8 시간, PEG2-DTX trad, PEG2-DTX conj 및 mPEG2-DTX conj 제제 (도 6B 참조)의 경우 약 70 시간 동안 느린 감소가 나타났다(도 6A 참조). PEG2-DTX trad와 PEG2-DTX conj 및 mPEG2-DTX conj를 비교하면, PEG2000과 mPEG2000을 이용한 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트에서 나노 입자가 도달하는 도세탁셀 혈장 수준은 PEG2000로 페길화된 통상적인 PVM / MA 나노 입자보다 높았다. PEG2-DTX trad를 PEG2-DTX conj 및 mPEG2-DTX conj와 비교하면, PEG2000과 mPEG2000을 이용한 PVM / MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트에서 나노 입자가 도달하는 도세탁셀 혈장 레벨은 PEG2000로 페길화된 통상적인 PVM / MA 나노 입자보다 높았다.
표 9는 다른 도세탁셀 제제를 마우스에 투여 한 후에 얻은 실험 데이터의 비구획형 분석으로 계산된 약동학 파라미터를 요약한다. 첫째, 정맥 내 루트에서 AUC의 평균값은 143 ㎍ h / mL였다. 최대 농도 (Cmax)는 198 ㎍/ mL 이고 Tmax 0 시간이었다. MRT는 1.4 시간이었고 곡선의 종결 단계 (t1/2z)의 반감기는 1.5 시간으로 추정되었다.
반면 폴리(무수물) 나노 입자의 도세탁셀의 Cmax 값은 1.3 ~ 2 ㎍ / ml 사이이며, 이 파라미터의 순위는 다음과 같다: mPEG2-DTX conj = PEG2-DTX conj> PEG2-DTX trad> DTX. 또한, Cmax는 Taxotere®의 i.v. 투여 후 0 시간 도달하였고, 정맥 내 DTX 제제의 경우 0.8 시간, mPEG2-DTX 및 PEG2-DTX의 제제 경우 1.5-2 시간이 지연되었다.
PEG2-DTX conj 및 mPEG2-DTX conj에 대한 통상적인 PEG 및 컨쥬게이트된 제형을 비교하면, AUC 값은 PEG2-DTX trad에 대해 수득된 AUC보다 각각 1.3 및 1.8 배 높았으며, 이는 탁센의 경구 흡수 촉진 능력이 더 높음을 입증한다. 또한, 혈장 내 약물의 평균 체류 시간 (MRT)과 종결 단계의 반감기 (t1/2z)는 에스테르 중합체 컨쥬게이트 제제 (mPEG2-DTX conj, PEG2-DTX conj)가 경구 루트로 투여될 때 크게 연장되었다.
상업적인 Taxotere® 및 다른 나노 입자로 제형화된 도세탁셀을, Balb /c 암컷 마우스에게 30mg/kg의 단일 투여량으로 정맥 내 및 경구 투여 후에 얻은 도세탁셀의 약동학적 파라미터. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. (n = 3)
제제 루트 AUC
(㎍ h/mL) 		Cmax
(㎍/mL) 		Tmax
(h) 		t 1/2z
(h) 		Cl
(mL/h) 		V
(mL) 		평균 체류 시간
(h) 		Fr
Taxotere ® 정맥 내. 142.6±0.8 197.9±38 0 1.5± 0.1 3.9±0.3 8.2±0.9 1.4±0.1 100
Taxotere ® 경구 N.D . N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
DTX 경구 6.9±1.8 1.3±0.5 0.8 2.2±0.4 4.9±1.2 15.4±2.3 4.2±0.3 4.9
PEG2 - DTX trad 경구 45.9±3.7 1.5±0.4 2 34.7±9.8 4.2±0.3 192.4±19.4 43.5±9.9 32.2
PEG2 - DTX conj 경구 58.1±7.2 1.7±0.2 2 35.8±9.1 6.0±2.4 225.1±86.1 58.7±79 40.7
mPEG2 - DTX conj 경구 80.6±9.1 1.7±0.1 1.5 43.1±4.4 4.2±0.5 240.1±87.9 61.1±7.7 56.5
AUC : 시간 0에서 ∞까지의 농도 - 시간 곡선 아래 면적; Cmax : 최대 혈장 농도; Tmax : 최대 혈장 농도까지의 시간; t1 /2 z : 종료 단계의 반감기; Cl : 클리어런스(clearance); V : 분포 용적; MRT : 평균 체류 시간; Fr : 상대적인 경구 생체 이용률. N.D .: 검출되지 않음.
같은 방식으로, 항암제가 컨쥬게이트 나노 입자에 로딩된 경우(PEG2-DTX conj의 경우 225 mL 및 mPEG2-DTX conj의 경우 240 mL) 항암제의 분포량(V)은 약물을 Taxotere®의 형태로 정맥 내 투여(8mL) 한 경우보다 높았고, 전형적인 페길화된 PVM/MA 나노 입자(192 mL) 또는 종래의 PVM/VA 나노 입자(15mL)에 캡슐화되어 경구 투여한 경우보다 높았다. 대조적으로, 도세탁셀의 제거(clearance)는 제제와 사용된 투여 루트 모두에서 항상 유사하고 독립적이었다.
마지막으로, 전형적인 페길화된 나노 입자 (PEG2-DTX trad)에서 전달된 도세탁셀의 상대적 경구 생체이용률은 약 32 %로 계산되었다. 비-페길화 된 나노 입자의 경구 생체 이용률은 단지 5 %인 것으로 나타났다. 컨쥬게이트 제형의 경우, PEG2-DTX conj 및 mPEG2-DTX conj에 대해 얻어진 데이터는 40 내지 57 %로 높았다. 놀랍게도, 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터 제조된 제제는 도세탁셀의 상대적 경구 생체이용률을 향상시켰다.
요약하면, 통상적인 PEG 및 컨쥬게이트 나노 입자 제제는 도세탁셀을 로딩 할 수 있었으며 경구 투여에 적합한 특성을 나타냈다. 경구 투여된 경우, 이들 나노 입자는 3일 동안 연장되고 지속적인 도세탁셀의 혈장 수준을 제공하였다. 그러나, "벌거벗은(naked)" 나노 입자의 경우, 도세탁셀 혈장 농도는 초기에는 높았지만 급속히 감소하였고 투여 12시간 후에는 정량화할 수 있는 수준이 발견되지 않았다. 또한, 약동학 연구는 통상적인 페길화 나노 입자보다 1.8 배 높은 57 %에 가까운 경구 생체이용률에 도달한 mPEG2-DTX conj와 같은 도세탁셀의 경구 생체 이용률을 높이기 위한 컨쥬게이트 나노 담체의 높은 능력을 밝혀냈다.
실시예 7
캠토테신의 in vitro 및 in vivo 연구
7.1 캠토테신의 in vitro 방출 연구
방출 실험은 가라앉는 조건 하에서 모조의 위 (SGF, pH 1.2, 펩신 0.32 % w / v) 및 장 (SIF; pH 6.8, pancreatin 1 % w / v) 액을 사용하여 37 ℃에서 수행되었다. 연구는 적절한 배지에 나노 입자를 분산시킨 후 Vortemp 56TM Shaking Incubator (Labnet International Inc., NJ, USA)에서 교반하여 수행했다.
각 시점에 대해, PEG(PEG2-CPT trad) 또는 PEG6 (PEG6-CPT trad) 및 mPEG2 (mPEG2-CPT conj) 와 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자로 페길화 된 통상적인 PVM/MA 나노 입자에 제제화 된 0.8㎍의 캠토테신을 상응하는 모조 유체 1 mL에 재현탁시켰다. 다른 제제들은 SGF에서 2 시간 동안 유지되었고, SIF에서 14 시간 동안 유지되었다. 다른 지점에서 단순 튜브를 수집하고 3,000xg에서 Vivaspin 튜브 (300,000 MWCO, Sartorius group, Germany)에서 5 분간 원심 분리했다. 제제로부터 방출된 캠토테신의 양을 HPLC (SGF 및 SIF로부터 수득된 상등액 중의 프리 캠토테신의 검정 곡선, r2>0.999)에 의해 정량화하였다.
7.2 위스터 래트(Wister rats)에서 캠토테신을 캡슐화하는 나노 입자의 i n vivo 약동학 연구
래트에게 캠토테신이 로딩된 나노 입자의 투여
Harlan (Barcelona, Spain)에서 얻은 수컷 위스터 래트에서 약동학 연구를 수행했다. 동물 실험에 관한 유럽 입법(86 / 609 / EU)에 따라 기관 동물 실험 윤리위원회(규약 번호 058-12)에 의해 승인된 실험동물에서의 조사에 대한 윤리적 가이드 라인 및 정책에 따라 연구가 수행되었다.
실험 전에 동물들에게 먹이와 식수에 자유롭게 접근할 수 있도록 1 주간 적응적으로 먹이를 주었다 (22 ± 2 ℃, 12시간 빛 및 12시간 암 주기, 50-60 % 상대 습도). 제제를 경구 투여하기 전에, 흡수에 대한 간섭을 피하기 위해 동물을 밤새 단식시키고, 식수에 대한 접근은 자유롭게 하였다.
약동학 연구를 위해 래트를 혈액 무작위로 2 그룹으로 나누었다(n=6). 대조군으로, 한 그룹의 동물에게 캠토테신 현탁액을 1 ㎎/㎏ 의 투여량(식도를 통해 복부에 넣은 블런트 니들)으로 투여하고, 다른 그룹에는 캠토테신 현탁액을 (꼬리 정맥을 통해) 정맥 내 투여하였다. 실험군은 mPEG2-CPT conj와 PEG2-CPT trad 나노 입자로 제형화 된 동등한 캠토테신 용량을 경구로 받았다.
혈액 샘플을 투여 후 설정된 시간에 수집하였다(0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30 및 48 시간). EDTA는 항응고제로 사용되었다. 혈액량은 체온에서 예열한 같은 용량의 생리 식염수로 복강 내로 회복되었다. 샘플을 즉시 얼음 위에 놓고 2,500xg에서 10 분 동안 원심 분리시켰다. 혈장을 깨끗한 튜브로 분리하고 HPLC 분석하기까지 -20 ℃에서 동결시켰다.
혈장 샘플에서 캠토테신의 HPLC 정량화
캠토테신의 양은 애질런트 모델 1100 시리즈 LC에서 HPLC-FLD에 의해 혈장에서 결정되었고, 형광 검출기는 여기(excitation) 및 각각 380 및 418 nm의 방출에서 설정되었다. 크로마토그래피 시스템에는 크로마토그래피 시스템에는 역상(reversed-phase) 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini 컬럼 (입자 크기 5㎛)과 프리 컬럼 (Phenomenex Security Guard C18)이 장착되었다. 1 mL / min에서 펌핑 된 이동상은 아세토나이트릴 및 트리플루오로아세트산 0.01 % (v/v)의 50:50 (v/v) 혼합물로 구성된다. 컬럼을 30 ℃에 놓았고 주입 부피는 100 ㎕였다. 약물 없는 혈장 내 디메틸술폭사이드/아세토나이트릴/트리플루오로 아세트산 1:8.9:0.1 (v/v/v)에 표준 캠토테신을 적당량 첨가하여 0.48 및 8000 ng /mL (r2>0.999)의 범위에서 검정 곡선 및 품질 관리가 설계되었다.
분취액(100 ㎕)을 4배량의 아세토나이트릴과 혼합하고 2분간 와동시켜(vortex) 혈장 단백질의 침전을 달성하였다. 원심 분리 (5000xg, 5 분) 후, 상등액을 수집하고 건조될 때까지 증발시켰다 (Savant, Barcelona, Spain). 마지막으로, 잔류물을 120 ㎕의 재구성 용액인 디메틸술폭사이드/아세토나이트릴/트리플루오로 아세트산 1:8.9:0.1 (v/v/v)에 용해시키고 오토 샘플러 바이알에 옮기고 캡핑하여 HPLC 오토 샘플러에 넣었다. 정량 한계는 2.6ng/mL이고 상대 표준 편차는 4.6 %로 계산되었다.
약동학 데이터 분석
다른 캠토테신 제제의 투여 후 얻어진 시간 데이터에 대해 플롯 된 혈장 농도의 약동학적 분석을 WinNonlin 5.2 software (Pharsight Corporation, USA)로 비구획형 모델을 사용하여 분석하였다. 다음의 파라미터들이 추정되었다: 최대 혈장 농도 (Cmax), 최대 농도에 도달하는 시간 (Tmax), 시간 0에서 ∞ 까지의 농도 - 시간 곡선 아래의 면적 (AUC), 평균 체류 시간 (MRT), 클리어런스 (Cl), 분포 용적 (V) 및 종료 단계의 반감기 (t1/2z).
또한, 캠토테신의 상대적인 경구 생체 이용률, Fr 은 분석된 제제의 0 내지 ∞ (AUC)시간의 농도-시간 곡선 아래 면적과 투여된 CPT 경구 현탁액 중 하나 사이의 비율로 나타내었다.
통계적 분석
제제의 물리 화학적 및 약학적 특성화를 위해, 데이터는 적어도 세 번의 실험의 평균 ± 표준 편차 (S.D.)로 표현된다.
약동학적 In vivo 파라미터를 통계적으로 분석하였다. 논파라메트릭 Kruskall-Wallis와 Mann-Whitney U-test를 사용하여 통계적 차이를 조사했다. 모든 경우에서 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 차이로 간주되었다. 모든 데이터 처리는 GraphPad Prism 5.0 통계 소프트웨어 (GraphPad Software, USA)를 사용하여 수행하였다.
7.3 결과
캠토테신 in vitro 방출 연구
나노 입자의 캠토테신 방출 속도는 모조 위액 및 장액 (캄 프토 테 신용 가용 화제로서 폴리소르베이트 80 함유)에서 평가되었다 (도 7). 이 패턴은 나노 입자가 SGF에 분산되었을 때 첫 번째 비-방출 단계와 약물이 처음에 급속하게 방출된 방출 단계 (나노 입자가 SIF에 분산되었을 때)에 의해 특징지어졌으며, 이후 더 지속적인 해방 단계가 나타났다. 통상적인 페길화된 나노 입자 (PEG2-CPT trad 및 PEG6-CPT trad)의 경우 이러한 빠른 방출은 SIF에서 배양 한 후 처음 5 시간 동안 효과를 나타내었고, 지속적인 방출의 마지막 단계는 나노 입자가 그들의 피전달체(cargo)를 100%의 방출을 완료할 때까지 11시간이 걸렸다. mPEG2-CPT conj로부터의 캠토테신 방출의 동역학은 방출 프로파일이 3가지 상이한 단계로 나뉠 수 있다는 점을 나타내었다. 첫 번째 경우, 처음 2 시간 동안 나노 입자가 SGF에 분산되었을 때 방출된 캠토테신의 양은 매우 낮았다 (약 10 %). 그 다음, 나노 입자가 SIF로 이동되었을 때, 버스트 방출 효과가 관찰되었다. 따라서, 로딩된 초기 약물의 약 90 %는 나노 입자 제제로부터 거칠게 방출되었다. 마지막으로, 제 3 단계는 다음 12시간의 실험 (연구 시작 후 14시간) 내에 완전히 방출된 잔류 약물의 느리고 지속적인 방출에 의해 특징 지워진다.
위스터 래트에서 캠토테신 함유 나노 입자의 약동학 연구
1 mg/kg의 투여량으로 정맥 내 1회 투여한 후 캠토테신의 혈장 농도 - 시간 프로파일을 도 8에 나타내었다. 캠토테신은 1,500 ± 144 nm의 입자 크기 및 0.44 ± 0.05의 PDI를 갖는 현탁액으로 투여되었다. 데이터는 비구획형 모델에 의해 분석되었다. 캠토테신의 혈장 농도는 투여 후 급격히 감소하여 6 시간 후에는 검출할 수 없게 되었다. 투여 후 약물 혈장 농도는 430 ng/mL(Cmax)에 도달하였고 AUC 및 t1/ 2z 의 값은 각각 0.39 ㎍h/mL 및 0.69 시간이었다. 약물의 클리어런스 및 분배 용적은 각각 755 mL/h 및 683 mL로 계산되었다 (표 10).
도 9는 현탁액으로 또는 나노 입자에 로딩된 캠토테신을 수컷 위스터 래트에 단일 경구 투여량 (1 mg/kg)을 투여한 후 캠토테신의 혈장 농도 프로파일을 나타낸 것이다. 약물 현탁액을 경구 투여한 경우, 혈장 레벨은 투여 30분 후 급속히 증가하여 Cmax에 도달하였다. 그 후, 약물의 지속된 혈장 레벨은 적어도 4시간 동안 유지되었고, 최종적으로, 캠토테신이 급격히 감소하였다. 따라서, 투여 10시간 후 혈장 내 검출 가능한 수준 캠토테신이 관찰되지 않았다.
나노 입자에 로딩되어 동일한 투여량(1 mg/kg)으로 투여한 캠토테신의 경우, 수성 현탁액 제제와의 주요한 차이점은 약물 레벨이 혈장 내에서 더 긴 기간 동안 정량화될 수 있다는 점이었다. 따라서 통상적인 페길화 나노 입자 (PEG2-CPT trad)에 함유된 캠토테신을 투여한 동물은 처음 1.5시간 동안 혈장 내 약물의 증가를 특징으로 하는 첫 번째 단계를 보여 주었고, 24시간까지는 캠토테신을 정량화 할 수 있는 느리고 연장된 감소 단계가 뒤따랐다. AUC는 약물이 현탁액으로 경구 투여되었을 때보다 약 2 배 더 높은 것으로 밝혀졌다. 또한, 통계적으로 차이는 없지만, 이들 페길화된 나노 입자로 투여된 경우의 약물 분포량은 현탁액으로서 경구 투여된 기본 약물(bare drug)의 분포량의 1.5 배였다.
동일한 투여량(1 mg/kg)으로 투여된 PVM/MA (mPEG2-CPT conj)의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자의 경우, 혈장 곡선의 초기 프로파일은 상당히 유사하였다; 그러나, 약물의 정량화된 양은 종래의 제제보다 높았으며, 보다 중요한 것은 혈장 레벨이 투여 후 48시간까지 유지된다는 것이다. 전반적으로, mPEG2-CPT conj의 경구 투여 후 혈장에서 수득된 캠토테신의 레벨은 수성 현탁액 및 통상적인 페길화 나노 입자 (PEG2-CPTtrad)에 비해 높았는데, AUC가 각각 7.6 배 및 4.2 배 더 높았다.
표 10은 다른 제제들을 래트에게 투여한 후에 얻어진 실험 데이터의 비구획형 분석으로 추정된 주요 약동학 파라미터를 요약한 것이다. mPEG2-CPT conj의 경우, 캠토테신 AUC는 약물의 수성 현탁액보다 현저히 높았다 (p <0.05). 나노 입자와 현탁액의 또 다른 차이점은 약물의 평균 체류 시간 (MRT)이었다. 이 경우 MRT는 노출된 약물과 mPEG2-CPT conj 사이에 유의한 차이 (10 배 이상) 가 있었지만 (p <0.01), 대조군과 PEG2-CPT trad 간에는 유의한 차이가 없었다. 유사하게, 종결 단계의 반감기 (t1/2z)는 캠토테신이 mPEG2-CPT conj에 캡슐화된 경우 PEG2-CPT trad에 제제화된 경우가 아닌, 통상적인 현탁액으로 제제화된 경우보다 유의하게 높았다. 이 결과에 따라 mPEG2-CPT conj에 투여했을 때 약물의 클리어런스는 현탁액으로 투여했을 때 얻은 값보다 약 11 배 낮았다 (p <0.01). 마찬가지로 mPEG2-CPT conj 제제를 PEG2-CPT trad와 비교하였을 때 AUC가 유의하게 높았고 (p <0.05), MRT와 t1/2z(p <0.01)에 대한 통계적 유의성도 발견되었다.
1 mg/kg의 CPT 현탁액, PEG2-CPT trad 및 mPEG2-CPT conj의 단일 경구 투여 후 평가된 약동학 파라미터. 데이터는 평균 (± 표준편차) (n = 6)
제제 루트 AUC
( h/mL) 		Cmax
(/mL) 		Tmax
(h) 		t 1/2z
(h) 		Cl
(mL/h) 		V
(mL) 		MRT
(h) 		Fr
CPT
현탁액 		정맥 내. 0.39±0.12 0.43±0.25 0.01 0.69±0.13 755±289 683±147 1±0.4 -
CPT
현탁액 		경구 0.38±0.21 0.08±0.02 0.5 1.6±0.8 619±357 1545±414 5.9±1.4 1
PEG2 -CPT trad 경구 0.7±0.31 0.07±0.03 3 3.2±1.1 534±221 2383±1003 11.4±5.5 1.8
mPEG2 -CPT conj 경구 2.9±1.2 *† 0.08±0.03 1.5 25.4±10.7 **†† 84±63 **†† 2510±1110 51±20 **†† 7.6
† Man-Whitney U-test mPEG2-CPT conj vs PEG2-CPT trad (p 값 <0.05).
†† Man-Whitney U-test mPEG2-CPT conj vs PEG2-CPT trad (p 값 <0.01).
* Man-Whitney U-test mPEG2-CPT conj vs 캠토테신 경구 현탁액 (p 값 <0.05).
** Man-Whitney U-test mPEG2-CPT conj vs 캠토테신 경구 현탁액 (p 값 <0.01).
AUC : 시간 0에서 ∞까지의 농도 - 시간 곡선 아래 면적; Cmax : 최대 혈장 농도; Tmax : 최대 혈장 농도까지의 시간; t1 /2 z : 종료 단계의 반감기; Cl : 클리어런스; V : 분포 용적; MRT : 평균 체류 시간; Fr : 상대적인 경구 생체 이용률.
요약하면, 캠토테신을 캡슐화하는 두 가지 유형의 나노 입자 (PEG2-CPT trad 및 mPEG2-CPT conj)는 in vitro 분석에서 경구 투여에 적합한 것으로 보였으나 약물 방출은 장내 조건 하에서 배양될 때까지 관찰되지 않았다. 그러나, in vivo 분석에서, mPEG2-CPT conj는 PEG2-CPT trad의 4.3배인 현저하게 높은 생체 이용률을 나타냈다.
실시예 8
나노 입자의 생체 내 분포 연구
소화관 점막과 상호 작용하는 PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 나노 입자의 분포 및 용량을 가시화하고 평가하기 위해 형광 현미경 검사가 수행되었다.
8.1. 루모겐 ( lumogen )- 로딩된 나노 입자의 제조
PVM/MA와 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000 (mPEG2 conj)의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스를 포함하는 비어있는 기존의 PVM/MA 나노 입자 및 나노 입자를 루모겐 레드로 형광 표지하였다.
루모겐-로딩된 나노 입자는 실시예 1 및 4에 기술된 바와 같이 나노 입자의 변형 전에, PVM/MA (Gantrez® AN) 또는 이것의 mPEG2 (mPEG2-LUM conj)와의 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 아세톤 상(phase) (5 mL)에 Lumogen® red 0.5 mg을 첨가하여 준비되었다. LUM 및 mPEG2-LUM conj 제제가 각각 수득 되었다.
8.2 위스터 래트의 내장 점막에서 루모겐 - 로딩된 나노 입자의 생체 내 분포 연구
생체 내 분포 연구는 루모겐 레드를 캡슐화하는 형광 표지된 나노 입자를 이용하여 수행되었다.
동물 실험은 동물 실험에 관한 유럽의 법률 (프로토콜 번호 059-13)과 일치하는 기관의 윤리적 및 생물 안전성위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. 10 mg의 형광 표지된 나노 입자를 함유하는 1 ㎖의 수성 현탁액의 단일 투여량을 수컷 위스터 쥐에게 경구 투여하였다. 2 시간 후, 동물을 희생시키고 내장을 제거했다. 1cm의 정맥 일부를 수집하여 조직 진행 매체 Tissue-Tek® OCT에 저장하고 -80 °C에서 동결시켰다. 각 부분을 저온 유지 장치에서 5 ㎛ 단면으로 절단하고 유리 슬라이드에 부착했다. 마지막으로, 이들 샘플을 포름 알데히드로 고정시키고, 커버 어셈블리(cover assembly) 전에 DAPI (4',6- 디아미디노-2-페닐 인돌)와 함께 15분 동안 배양하였다.
장 점막에서 형광으로 로딩된 나노 입자의 존재는 결합 카메라(Axiocam ICc3, Zeiss) 및 형광 소스(HBO 100, Zeiss)를 사용하여 형광 현미경(Axioimager M1, Zeiss)에서 시각화되었다.
8.3 결과
루모겐-로딩된 나노 입자는 빈 나노 입자에 대해 측정된 것과 유사한 물리 화학적 성질을 나타내었다: LUM 나노 입자에 대해 215 nm, -36 mV 이고 mPEG2-LUM conj 제제에 대해 205 nm, -35 mV.
놀랍게도, mPEG2-LUM conj 나노 입자는 LUM 나노 입자보다 회장 점막 내에 다른 분포를 보였다. 종래의 PVM/MA 나노 입자는 장내 상피를 덮고 있는 점액층에 갇혀있는 것처럼 보이지만(도 10A, 10B), PVM/MA의 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 나노 입자는 점액층을 통과하여 장 세포 표면과 더 친밀한 방식으로 상호 작용할 수 있다(도 10C, 10D). 이러한 발견은 에스테르 중합체 컨쥬게이트로부터의 나노 입자 표면이 원래의 PVM/MA의 것과는 상이하다는 것을 확인시켜 준다. 나노 입자의 형성 동안 컨쥬게이트의 친수성 영역이 수상(aqueous phase)을 통해 배향되어 나노 입자의 표면에 친수성 코로나를 형성하고, 이는 생성되는 나노 입자에 "미끄러운" 성질, 따라서, 점액층을 통과하여 장 세포의 표면에 도달하는 능력을 부여할 수 있다는 가설이 가능하다.

Claims (21)

  1. 히드록시-말단 분자와 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)의 에스테르 중합체 컨쥬게이트로서,
    상기 히드록시-말단 분자는 폴리에틸렌글리콜 및 히드록시-말단 반응기를 함유하는 이의 유도체 중 선택되는 것인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜 1,000 (PEG1), 폴리에틸렌글리콜 2,000 (PEG2), 폴리에틸렌글리콜 6,000 (PEG6) 및 폴리에틸렌글리콜 10,000 (PEG10)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히드록시-말단 반응기를 함유하는 폴리에틸렌글리콜 유도체는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르는 메톡시-폴리에틸렌글리콜 1,000 (mPEG1), 메톡시-폴리에틸렌글리콜 2,000 (mPEG2), 메톡시-폴리에틸렌글리콜 6,000 (mPEG6), 및 메톡시-폴리에틸렌글리콜 10,000 (mPEG10)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  6. a) 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)을 히드록시-말단 분자와 유기 용매 중에서 반응시키는 단계, 및
    b) 유기 용매를 제거하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    c) 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 더 포함하는, 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 단계 a)의 용액 중의 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)과 히드록시-말단 분자 간의 중량비가 1:0.01-0.25이고, 바람직하게는 1:0.015-0.2, 보다 바람직하게는 1:0.05-0.125인 것인, 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 제조방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법으로 얻어진 에스테르 중합체 컨쥬게이트.
  10. 약물 전달용 고분자 나노 입자의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 중합체 컨쥬게이트 용도.
  11. 제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 에스테르 중합체 컨쥬게이트의 매트릭스, 및 생물학적 활성 화합물을 포함하는, 나노 입자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 화합물은 항암제인 것인, 나노 입자.
  13. 하기 단계를 포함하는, 제11항 또는 제12항에 따른 나노 입자의 제조 방법:
    a) 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 생물학적 활성 화합물과 유기 매질에서 혼합하는 단계, 및
    b) 2가 금속의 존재하에서 알코올 및 물을 첨가하여 에스테르 중합체 컨쥬게이트를 탈용매화 하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단계 b)는 단계 a)에서 얻어진 혼합물에, 2가 금속을 포함하는 수성알코올성(hydroalcoholic) 혼합물을 첨가함으로써 수행되는 것인, 제조방법.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서,
    상기 단계 a)의 혼합물 중 에스테르 중합체 컨쥬게이트와 생물학적 활성 화합물 간의 중량비가 1:0.01-0.20이고, 바람직하게는 1:0.02-0.15, 보다 바람직하게는 1: 0.03-0.10인, 제조방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조방법으로 얻어진 나노 입자.
  17. 의약에 사용하기 위한, 제11항, 제12항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자.
  18. i) 제11항, 제12항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 나노 입자, 및 ii) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 항암제를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    a) 폴리에틸렌글리콜 2,000과 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)과의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
    b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %,
    c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
    d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고,
    이 때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인, 약학 조성물;
    a) 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 2,000과 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)과의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 38 % 내지 47 %,
    b) 도세탁셀 3 % 내지 5 %
    c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
    d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고,
    이 때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인, 약학 조성물; 및
    a) 메톡시-폴리에틸렌글리콜 2,000과 폴리(메틸 비닐 에테르-코-말레산 무수물)의 에스테르 중합체 컨쥬게이트 30 % 내지 40 %,
    b) 캠토테신 0.08 % 내지 1.5 %
    c) 칼슘 0.1 % 내지 0.2 %, 및
    d) 사카라이드 15 % 내지 40 %를 포함하고,
    이 때 모든 비율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 기준인, 약학 조성물
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  21. 의약에 사용하기 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
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