BR112017011638B1 - Nanopartículas para encapsular compostos, processo para a produção das mesmas e composição farmacêutica - Google Patents

Nanopartículas para encapsular compostos, processo para a produção das mesmas e composição farmacêutica Download PDF

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Judit HUARTE CIGANDA
Laura INCHAURRAGA CASADAMÓN
Luisa Fernanda Ruiz Gatón
Nekane MARTÍN ARBELLÁ
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Innoup Farma, S.L
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Abstract

nanopartículas para encapsular compostos, preparo e usos das mesmas. a presente invenção se refere à nanopartículas para encapsular compostos biologicamente ativos, compreendendo uma matriz de novos conjugados de polímeros. a invenção também se refere a um processo para a produção de ambos os referidos conjugados e nanopartículas, para composições contendo os referidos conjugados ou nanopartículas, e aplicações dos mesmos. a invenção é aplicável no setor farmacêutico e no setor de nanotecnologia.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:
[1] A presente invenção está inserida no setor farmacêutico e no setor da nanotecnologia e se refere ao encapsulamento de ingrediente ativos usando nanopartículas de novos conjugados de polímeros derivados a partir do copolímero do anidrido metil vinil éter e anidrido maleico. A invenção também se refere a um processo para a produção de ambos os conjugados e nanopartículas, a composições contendo os referidos conjugados ou nanopartículas e às aplicações dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:
[2] Uma variedade de ingredientes ativos (fármacos), incluindo muitos agentes antitumorais, são administrados de forma parenteral, o que causa diversos problemas. O aumento na qualidade de vida dos pacientes, bem como a redução dos custos com cuidados da saúde, deve ser enfatizado dentre as principais vantagens que estariam envolvidas na administração de agentes antitumorais pela via oral. Esta via de administração deve permitir uma exposição contínua das células cancerígenas ao fármaco antitumoral em um nível de concentração adequado e sustentado, o qual pode, então, aumentar o índice terapêutico e reduzir efeitos colaterais.
[3] Quando um fármaco é administrado de forma oral, sua biodisponibilidade é, em geral, baixa devido a uma variedade de fatores, tais como solubilidade, estabilidade dentro do intestino, permeabilidade e metabolismo de primeira passagem: - compostos com baixa solubilidade e baixa permeabilidade apresentam desafios na formulação de formas de dosagem oral. - o trato gastrointestinal tem se mostrado um difícil local de administração devido à rápida formação de muco e tempo de trânsito relativamente constante. - os fármacos devem passar através da parede intestinal e, então, da circulação portal para o fígado; ambos os sítios são sítios comuns de metabolismo de primeira passagem. - a absorção de fármacos pode ainda ser limitada pelos mecanismos de efluxo, especialmente se os compostos são de natureza lipofílica. Por exemplo, a P-glicoproteína transportadora secretora localizada na superfície mucosa das células epiteliais é responsável pela biodisponibilidade baixa e variável de diversos fármacos (por exemplo, paclitaxel, docetaxel ou camptotecina).
[4] Estes fatores, que podem ser agrupados em duas categorias inter-relacionadas, absorção (solubilidade e permeabilidade) e metabolismo, devem ser considerados quando se melhora a biodisponibilidade oral de fármacos (Hayden Thomas et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006; 2 (4): 591 - 608).
[5] Uma estratégia possível para superar as desvantagens acima mencionadas pode ser o uso de nanopartículas poliméricas como carreadores para a distribuição de fármacos orais. O encapsulamento de fármacos em sistemas nanoparticulados os protege contra as difíceis condições do intestino, conduz o fármaco carregado até a superfície das células absortivas e controla a sua liberação. A bioadesão apresenta, ainda, a administração melhorada de fármacos. Existem diversas vantagens em apresentar sistemas de liberação de fármacos bioadesivos: (i) como um resultado da adesão, a formulação permanece mais tempo no sítio de liberação; (ii) pelo uso de moléculas bioadesivas específicas será possível atingir um sítio ou tecido particular, por exemplo, no trato gastrointestinal (GI); e (iii) tempo de residência aumentado, se combinado com a liberação controlada de um fármaco, pode levar a uma frequência de administração mais baixa (Woodley, Clin Pharmacokinet 2001; 40 (2): 77 - 84). No entanto, para propriedades bioadesivas adequadas, as nanopartículas devem mostrar propriedades de permeação de muco a fim de atravessar a camada de muco, logo, estabelece as interações adesivas na superfície do epitélio.
[6] Muitos polímeros têm sido descritos como materiais úteis para preparar nanopartículas bioadesivas para a distribuição de fármacos orais, tais como quitosana, polivinil álcool (PVA), homo- e copolímeros de ácidos lático e glicólico (PLGA) ou diferentes copolímeros entre anidrido metil vinil éter e anidrido maleico (comercializados como Gantrez® da International Specialty Products ISP, USA).
[7] A associação ou revestimento de nanopartículas com compostos hidrofílicos adequados pode modificar suas características físico-químicas e, então, modificar sua distribuição e interação com o meio biológico, promovendo a chegada do fármaco encapsulado no seu sítio ideal para ação ou absorção. Uma possível estratégia é o uso de nanopartículas decoradas com polietileno glicol (PEG), denominadas nanopartículas peguiladas.
[8] Com relação ao seu uso na administração oral, a associação de polietileno glicóis à nanopartículas convencionais minimiza as interações destes carreadores com componentes do lúmen. Este fato está relacionado com a capacidade de PEGs em produzir uma coroa hidrofílica em torno das nanopartículas e oferecer uma superfície escorregadia que evita a interação de proteínas (Gref et al., Science 1994; 263: 1600 - 1603) e facilita a passagem através da camada de muco protetora da mucosa do intestino.
[9] A principal desvantagem desta estratégia é a estabilidade da associação dos polietileno glicóis à superfície das nanopartículas (Peracchia et al., Life Sci 1997; 6: 749 - 761). É conhecido que a habilidade do polietileno glicol para rejeitar proteínas depende da configuração, carga, comprimento e flexibilidade das cadeias do polímero (Torchillin, J Microencapsul 1998; 15: 1 - 19). O processo para modificação da superfície das nanopartículas é, principalmente, realizado por adsorção física (Stolnik et al., Adv Drug Del Rev 1995; 16: 195 - 214) ou pela ligação covalente na forma de diblocos ou triblocos (De Jaeghere et al., J Drug Target 2000; 8: 143 - 153). Dado que a ligação covalente é preferível, a maioria das nanopartículas peguiladas têm sido preparadas usando copolímeros de polietileno glicol com ácido lático ou glicólico. No entanto, este processo de copolimerização requer o uso de diversos catalisadores e condições químicas específicas (Beletsi et al., Int. J. Pharm 1999; 182: 187 - 197). Além disso, os resíduos de solvente tóxico usados na síntese orgânica (cloreto de metileno, tolueno, etc.), podem ser problemáticos.
[10] A modificação da superfície das nanopartículas do anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) (PVM/MA) com polietileno glicóis tem também sido alcançada. A patente WO 2005/104648 descreve dois diferentes processos para a obtenção de nanopartículas peguiladas: (i) incubação simultânea do polímero PVM/MA e o polietileno glicol em um solvente orgânico, antes da dissolução do polímero e (ii) incubação das nanopartículas de polímero biodegradável com uma solução aquosa de polietileno glicol. Ambos os processos são válidos para o preparo de nanopartículas de PVM/MA com polietileno glicol associado à sua superfície, no entanto a principal desvantagem da adsorção simples é a rápida perda da camada de revestimento in vivo (Neal et al., J Pharm Sci 1998; 87: 242 - 1248) devido à instabilidade da interação.
[11] O WO 2005/104648 ainda descreve nanopartículas peguiladas de PVM/MA apresentando características de adesão intestinal superior quando comparadas com nanopartículas de PVM/MA sem polietileno glicol. Estas nanopartículas demonstraram uma alta versatilidade para o encapsulamento de moléculas biologicamente ativas. Por exemplo, o WO 2009/121997 descreve que esta modificação e revestimento das nanopartículas de PVM/MA com um polietileno glicol permite a obtenção de nanopartículas peguiladas capazes de encapsular quantidades consideráveis de fármacos de síntese química. No entanto, a estabilidade do revestimento é baixa e a camada de revestimento pode ser perdida ao longo do tempo.
[12] Embora o sistema de distribuição de fármacos bioadesivos possa fornecer um tempo de trânsito gastrointestinal melhorado através da adesão à superfície da mucosa gastrointestinal, boa adesão e trânsito tardio nem sempre se converte em biodisponibilidade melhorada (Davis SS. Drug Discovery Today 2005; 10(4): 249 - 257). Se o fármaco não se dissolve prontamente ou não pode penetrar a membrana epitelial devido aos mecanismos de efluxo, o tempo no sítio de absorção pode ser insuficiente. O WO 2008/129106 descreve nanopartículas alternativas para a administração de fármacos compreendendo PVM/MA e uma ciclo dextrina que pode aumentar, quando administrada de forma oral, a biodisponibilidade de fármacos que são substratos da P-glicoproteína.
[13] Ainda assim, ainda há a necessidade de melhorar a biodisponibilidade de alguns fármacos após a administração oral. Dessa forma, muito esforço é ainda requerido para desenvolver novos sistemas de administração de fármaco (por exemplo, sintetizar novos polímeros e copolímeros) para combinar as propriedades hidrofílicas / hidrofóbicas de diversos fármacos juntos com boas propriedades físico- químicas (degradabilidade, estabilidade e força mecânica) e características farmacêuticas melhoradas (distribuição, bioadesão e taxa de liberação) de nanopartículas feitas daqueles novos polímeros. Estes permitiriam a eficiência de absorção melhorada de fármacos, permitindo tratamentos alternativos à perfusão hospitalar, permitindo a redução dos custos com cuidados da saúde de tratamentos com este tipo de fármacos e melhorando a qualidade de vida para o paciente.
RESUMO DA INVENÇÃO:
[14] O objeto da presente invenção é desenvolver novos sistemas de administração de fármaco, os quais são estáveis dentro do trato GI, que podem encapsular quantidades consideráveis de compostos biologicamente ativos (por exemplo, fármacos ou ingredientes ativos, particularmente, fármacos hidrofóbicos), e aumentar a biodisponibilidade dos fármacos administrados oralmente, isto é, fornecer novos conjugados de polímeros e nanopartículas feitos dos mesmos as quais resolvem as desvantagens previamente mencionadas.
[15] O trabalho que levou a esta invenção recebeu financiamento do 7° Programa de Enquadramento da União Europeia (do inglês European Union's Seventh Framework Programme - FP7 / 2007-2013) sob acordo de concessão n° NMP4-LA-2011-280761.
[16] Foi observado que novos ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com um polietileno glicol ou um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal pode ser sintetizado por uma reação simples, e resultados adequados para facilmente produzir nanopartículas com boas características para a administração de compostos biologicamente ativos. Foi especialmente descoberto que nanopartículas formadas por estes novos ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com um polietileno glicol ou derivados do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal são capazes de i) encapsular quantidades consideráveis de compostos biologicamente ativos (por exemplo paclitaxel, docetaxel e camptotecina) e ii) atravessar a camada de muco e interagir de forma íntima com a superfície dos enterócitos (melhorando a absorção do fármaco).
[17] De forma surpreendente, as nanopartículas fornecidas por esta invenção permitem uma biodisponibilidade melhorada dos referidos compostos biologicamente ativos através da mucosa intestinal, obtendo níveis de plasma prolongados e sustentados dos mesmos por intervalos de tempo muito longos (por exemplo, pelo menos 72 horas no caso do docetaxel), o qual permite a administração alternativa para perfusão hospitalar, permitindo uma redução dos custos com cuidados da saúde de tratamentos com este tipo de fármaco e um melhoramento na qualidade de vida do paciente.
[18] Dessa forma, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um novo conjugado de polímero de éster de PVM/MA com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionada dentre um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal.
[19] Em uma variedade particular da invenção, a molécula com hidroxila terminal é um polietileno glicol que não é ramificado e não apresenta grupos hidroxila substituídos. Nesta variedade da invenção, os polietileno glicóis usados preferencialmente apresentam um peso molecular compreendido na faixa de 400 a 35,000 Da; em uma modalidade mais particular, o polietileno glicol é selecionado do grupo que consiste de polietileno glicol 1,000 (PEG1), polietileno glicol 2,000 (PEG2), polietileno glicol 6,000 (PEG6) e polietileno glicol 10,000 (PEG10).
[20] Em outra variante particular da invenção, o polietileno glicol apresenta um grupo hidroxila substituído. Nesta variedade da invenção, a molécula com hidroxila terminal é, dessa forma, um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, preferencialmente é um polioxi etileno alquil éter. Em uma modalidade mais particular, o polioxi etileno alquil éter é um polietileno glicol metil éter (mPEG), e pode ser selecionado do grupo que consiste de metoxi- polietileno glicol 1,000 (mPEG1), metoxi-polietileno glicol 2,000 (mPEG2), metoxi-polietileno glicol 6,000 (mPEG6) e metoxi-polietileno glicol 10,000 (mPEG10).
[21] Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionado dentre um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, o qual compreende as etapas de: a) reagir o PVM/MA com a molécula com hidroxila terminal da invenção em um solvente orgânico, e b) remover o solvente orgânico.
[22] O referido processo da invenção é simples e aplicável em uma escala industrial. Em uma variante preferida da invenção, o referido processo compreende uma etapa adicional de c) purificar o conjugado de polímero de éster.
[23] Em uma modalidade particular, a proporção em peso entre o PVM/MA e a molécula com hidroxila terminal na solução da etapa (a) é 1:0.01 - 0.25, preferencialmente 1:0.015 - 0.2, mais preferencialmente 1:0.05 - 0.125.
[24] Em outro aspecto, a invenção se refere a um conjugado de polímero de éster obtido pelo referido processo da invenção.
[25] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um conjugado de polímero de éster da invenção ou obtido pelo processo da invenção, no preparo de nanopartículas poliméricas para a distribuição de fármacos; preferencialmente distribuição de fármaco orais.
[26] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição compreendendo (i) um conjugado de polímero de éster da invenção ou um conjugado de polímero de éster obtido pelo processo da invenção e (ii) um carreador; e a referida composição da invenção para uso na distribuição de fármaco; preferencialmente distribuição de fármaco oral.
[27] Ainda em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula compreendendo (i) uma matriz de um conjugado de polímero de éster de acordo com a invenção ou um conjugado de polímero de éster obtido pelo processo da invenção e (ii) compostos biologicamente ativos. Em uma modalidade particular, os compostos biologicamente ativos são agentes antitumorais. Em uma modalidade mais particular, os agentes antitumorais são selecionados do grupo que consiste de docetaxel, camptotecina e paclitaxel; preferencialmente o agente antitumoral é docetaxel.
[28] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um processo para a produção de uma nanopartícula de acordo com a invenção compreendendo as etapas de: a) misturar um conjugado de polímero de éster da invenção com os compostos biologicamente ativos em um meio orgânico, e b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de álcool e água na presença de um metal divalente.
[29] Preferencialmente, a etapa (a) é realizada por meios de misturar (i) uma solução orgânica contendo o conjugado de polímero de éster da invenção com (ii) uma solução orgânica ou dispersão dos compostos biologicamente ativos.
[30] Preferencialmente, a etapa (b) é realizada por meios de adicionar a mistura hidro alcoólica compreendendo um metal divalente à mistura obtida na etapa (a).
[31] Em uma modalidade particular, o metal divalente é selecionado do grupo que consiste de cálcio, magnésio, zinco, ferro na forma divalente e combinações dos mesmos; preferencialmente, o metal divalente é cálcio.
[32] Ainda em uma modalidade particular, a proporção em peso entre o conjugado de polímero de éster da invenção e os compostos biologicamente ativos na mistura da etapa (a) é 1:0.01 - 0.20, preferencialmente 1:0.02 - 0.15, mais preferencialmente 1:0.03 - 0.10.
[33] Em uma variante da invenção, o referido processo para a produção de uma nanopartícula de acordo com a invenção compreende uma etapa adicional (c) de remover o meio orgânico, e / ou opcionalmente purificar; por exemplo, ele pode ser feito por técnicas de filtração ou centrifugação até que um péletes seja obtido. Da mesma forma, se desejado, o referido processo para a produção de uma nanopartícula de acordo com a invenção pode ainda compreender uma etapa adicional (d) de secagem das nanopartículas formadas, opcionalmente na presença de um agente protetor. Em uma modalidade particular da invenção, esta etapa adicional (d) é feita por meio da secagem por aspersão ou secagem por congelamento.
[34] Relacionado a isso, em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula obtida pelo referido processo da invenção.
[35] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula de acordo com a invenção ou uma nanopartícula obtida por um processo da invenção para uso na medicina.
[36] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso da nanopartícula de acordo com a invenção ou o uso da nanopartícula obtida por um processo da invenção na produção da composição farmacêutica.
[37] Ainda em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo (i) pelo menos uma nanopartícula de acordo com a invenção, ou pelo menos uma nanopartícula obtida por um processo da invenção e (ii) um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particular da invenção, o referido carreador ou veículo compreende um excipiente farmacêutico, aceitável para a administração do mesmo por via oral.
[38] Em outro aspecto, a invenção se refere a referida composição farmacêutica da invenção para uso na medicina.
[39] Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da invenção compreende um agente antitumoral. Dessa forma, em outro aspecto, a invenção se refere à referida composição farmacêutica da invenção compreendendo um agente antitumoral para uso em um método para a prevenção ou tratamento de câncer; ou alternativamente, a invenção também se refere ao uso da composição farmacêutica da invenção compreendendo um agente antitumoral no preparo de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.
[40] Em uma modalidade mais particular, a composição farmacêutica é selecionada do grupo que consiste de: uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi-polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; e uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi-polietileno glicol 2,000 de 30 % a 40 %, b) camptotecina de 0.08 % a 1.5 %, c) cálcio de 0.10 % a 0.20 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[41] FIGURA 1. Espectro infravermelho de PVM/MA e ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 (PVM/MA - PEG2), polietileno glicol 6,000 (PVM/MA - PEG6), polietileno glicol 10,000 (PVM/MA - PEG10), e metoxi polietileno glicol 2,000 (PVM/MA - mPEG2).
[42] FIGURA 2. Espectro 1H-RMN de (A) PVM/MA e de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com (B) polietileno glicol 2,000 (PVM/MA - PEG2), (C) polietileno glicol 6,000 (PVM/MA - PEG6), (D) polietileno glicol 10,000 (PVM/MA - PEG10) e (E) metoxi polietileno glicol 2,000 (PVM/MA - mPEG2).
[43] FIGURA 3. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de formulações de nanopartículas de poli (anidrido). (A) PEG2 - CPT trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG2 tradicionais); (B) PEG6 - CPT trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG6 tradicionais); (C) mPEG2 - CPT conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com mPEG2).
[44] FIGURA 4. Perfil de liberação de docetaxel das formulações de nanopartículas DTX (nanopartículas PVM/MA que encapsulam docetaxel convencionais), PEG2 - DTX trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2 tradicionais), mPEG2 - DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2) e PEG2 - DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2) após incubação em fluido gástrico simulado (0 - 2 horas) e fluido intestinal simulado (2 - 12 horas) a 37 °C. Dados representados como média ± D.P. (n = 3).
[45] FIGURA 5. Perfil de concentração plasmática de docetaxel x tempo após a administração intravenosa (IV) de uma dosagem de Taxotere® de 30 mg/kg. Dados representados como média ± D.P. (n = 3 por ponto de tempo).
[46] FIGURA 6. Perfil de concentração plasmática de docetaxel x tempo após a administração de uma dosagem oral única de 30 mg/kg. Os animais receberam Taxotere® oral, formulações de nanopartículas de DTX (nanopartículas PVM/MA que encapsulam docetaxel convencionais), PEG2 - DTX trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2 tradicionais), mPEG2 - DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2) e PEG2 - DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com docetaxel encapsuladas com PEG2). (A) dentro das primeiras 8 horas e (B) durante 72 horas. Dados são expressos como média ± DP (n = 5).
[47] FIGURA 7. Perfil de liberação de camptotecina de formulações de PEG2 - CPT trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG2 tradicionais), PEG6 - CPT trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG6 tradicionais) e mPEG2 - CPT conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG2), após incubação em fluido gástrico simulado (0 - 2 horas) e fluido intestinal simulado (2 - 14 horas), sob condições de dissipação, 37 °C. Dados expressos como média ± D.P. (n = 3).
[48] FIGURA 8. Perfil de concentração plasmática de camptotecina x tempo após a administração intravenosa (IV) de uma dosagem de 1 mg/kg dosagem de suspensão. Os dados são expressos como média ± D.P. (n = 3 por ponto de tempo).
[49] FIGURA 9. Perfil de concentração plasmática de camptotecina x tempo em ratos machos Wistar após uma única dosagem (1 mg/kg) de uma formulação em suspensão oral de PEG2 - CTP trad (nanopartículas peguiladas de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG2 tradicionais) e mPEG2 - CPT conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com camptotecina encapsuladas com PEG2). Dados expressos como media ± DP (n = 6).
[50] FIGURA 10. Visualização por microscopia de fluorescência de nanopartículas marcadas de forma fluorescente com Lumogen® vermelho, em seções longitudinais do íleo proximal de ratos, duas horas após sua administração oral como uma dosagem única. (A, B) nanopartículas de PVM/MA convencionais que encapsulam Lumogen® vermelho; (C, D) nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2 que encapsula Lumogen® vermelho (mPEG2 - LUM conj).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:
[51] A presente invenção fornece novos sistemas de administração de fármacos (novos conjugados de polímeros e nanopartículas feitas dos mesmos) os quais podem encapsular quantidades consideráveis de compostos biologicamente ativos, são estáveis dentro do trato GI e aumentam a biodisponibilidade de fármacos administrados oralmente.
[52] Foi surpreendentemente descoberto que novos ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com um polietileno glicol (ou derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal) podem ser sintetizados por uma reação simples e resulta na produção adequada e fácil de nanopartículas com características melhoradas para a administração de compostos biologicamente ativos. Foi especialmente descoberto que nanopartículas formadas por esses novos ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com um polietileno glicol (ou derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal) são capazes de encapsular quantidades consideráveis de compostos biologicamente ativos e aumentam sua biodisponibilidade oral.
Definições:
[53] A fim de facilitar a compreensão da presente invenção, o significado de alguns termos e expressões como usadas no contexto da invenção são definidos abaixo.
[54] Como aqui usado, “anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico)” (PVM/MA) se refere ao copolímero de anidrido metil vinil éter e anidrido maleico (comercializado pela International Specialty Products, ISP, sob a marca Gantrez® AN). Dessa forma, as expressões “PVM/MA”, poli (anidrido) ou Gantrez® AN são sinônimas e são indistintamente usadas nesta descrição. O copolímero Gantrez® AN contém unidades alternadas de anidrido metil vinil éter e anidrido maleico, apresentando a fórmula:
[55] A característica fundamental desta polimerização requer que uma unidade de anidrido maleico deve estar adjacente a uma unidade de anidrido metil vinil éter e vice-versa, resultando em um copolímero verdadeiramente alternado. Os grupos anidrido na estrutura do Gantrez® AN permite a interação química deste polímero com moléculas contendo hidroxila através de um mecanismo de reação de substituição nucleofílica.
[56] O copolímero Gantrez® AN é fornecido como um pó branco insolúvel em água e é amplamente empregado para fins farmacêuticos e médicos, como adesivos de dentadura, agente espessante e de suspensão e como adjuvantes no preparo de adesivos transdérmicos. A toxicidade oral deste copolímero é bastante baixa (LD50 em porcos da índia é de cerca de 8 - 9 g/kg) de modo que este também tem sido usado como material para o preparo de carreadores nanoparticulados. Em uma modalidade particular da invenção, o copolímero de PVM/MA apresenta um peso molecular compreendido na faixa de 80 a 2,500 kDa, preferencialmente de 85 a 2,000 kDa, mais preferencialmente de 90 a 220 kDa.
[57] Como é aqui utilizado, “éster” se refere a um éster (como um de PVM/MA) que contém pelo menos um grupo éster (isto é, pelo menos uma unidade de anidrido de PVM/MA é esterificada com uma molécula com hidroxila terminal). De acordo com a presente invenção, pelo menos uma unidade de anidrido de PVM/MA é esterificada com uma molécula com hidroxila terminal selecionada dentre um polietileno glicol e um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal. Exemplos ilustrativos e não limitativos de ésteres de PVM/MA são aqueles em que o grau de substituição é de pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %.
[58] Como é aqui utilizado, “grau de esterificação” (DE) ou “grau de substituição” (DS) do conjugado de polímero de éster da invenção é definido como a porcentagem de unidades de anidrido que são esterificadas com uma molécula com hidroxila terminal de acordo com a presente invenção, isto é, a porcentagem de ligações éster que são formadas. Em uma modalidade particular, o grau de esterificação pode ser medido por processos padrão conhecidos por um técnico no assunto, e os quais são descritos, para fins de ilustração, na parte experimental anexada aos exemplos descritos abaixo.
[59] Como é aqui utilizado, uma “molécula com hidroxila terminal” é uma molécula com pelo menos um grupo hidroxila primário (-OH). De acordo com a presente invenção, a referida molécula com hidroxila terminal é selecionada dentre um polietileno glicol e um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, como definido a seguir.
[60] Na presente descrição, o termo “polietileno glicol” (PEG), é entendido como qualquer polímero hidrofílico solúvel em água contendo grupos éter ligados por 2 átomos de carbono, opcionalmente grupos etileno ramificados. Dessa forma, esta definição inclui polietileno glicóis ramificados e não ramificados.
[61] O PEG é também conhecido como óxido de polietileno (PEO) ou poli oxietileno (POE) (os três nomes são quimicamente sinônimos e se referem a um oligômero ou polímero de óxido de etileno). O termo também inclui derivados de um dos grupos hidroxilas terminais, os quais podem ser modificados (uma das duas extremidades). Logo, de acordo com a presente invenção, os derivados de polietileno glicóis mantendo um grupo hidroxila primário (-OH) podem ser utilizados.
[62] Os polietileno glicóis são polímeros solúveis em água que foram aprovados (FDA, do inglês “Food and Drug Administration”) para administração oral, parenteral e tópica de fármacos. Os polietileno glicóis são produzidos por meio da polimerização do óxido de etileno (EO) na presença de água, monoetileno glicol ou dietileno glicol como iniciadores de reação em um meio alcalino (polímeros 1,2-epóxido: polímeros e copolímeros de óxido de etileno” na Enciclopédia de Ciência e Engenharia dos Polímeros; Mark, H.F. (Ed.), John Wiley e Sons Inc., 1986, pp. 225 - 273). Quando o peso molecular desejado (em geral controlado por meio de medidas de viscosidade ao longo do processo) é alcançado, a reação de polimerização termina pela neutralização do catalisador com um ácido (ácido lático, ácido acético ou similares). O resultado é um polímero linear apresentando uma estrutura muito simples: H-(O-CH2-CH2)n-OH em que (n) é o número de monômeros ou unidades de EO. Este termo “polietileno glicol” é normalmente usado para indicar a influência significativa dos grupos hidroxila terminal nas propriedades físico-químicas destas moléculas. O termo PEG é normalmente usado na combinação com um valor numérico. Na indústria farmacêutica, o número indica o peso molecular médio, enquanto na indústria cosmética o número que acompanha as letras PEG se referem às unidades EO polimerizadas que formam a molécula (Handbook de excipientes farmacêuticos, Rowev R.C., Sheskey P. J., Weller P.J. (Eds.), 4a Edição, Imprensa Farmacêutica e Associação Farmacêutica Americana, Londres, UK, 2003). As PEGs estão incluídas em diversas farmacopeias, embora a nomenclatura difira (Harmonização Internacional: Polietileno glicol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612 - 614). De acordo com o Handbook de excipiente farmacêuticos (Quarta Edição), 2003, editada por R.C. Rowe, P.J. Sheskey e P.J. Weller, publicada pela Imprensa Farmacêutica (Londres, UK) e Associação Farmacêutica Americana (Washington, USA), os polioxietileno glicóis são também referidos como polietileno glicóis, macrogois ou PEG. As Farmacopeias Inglesa e Europeia usam polietileno glicóis e macrogois, enquanto a Farmacopeia Americana (USP) usa polietileno glicóis.
[63] Em uma variante da invenção, os polietileno glicóis usados preferencialmente apresentam um peso molecular compreendido na faixa de 400 a 35,000 Da. Em uma variante preferida da invenção, o polietileno glicol usado apresenta um peso molecular igual ou maior do que 400, mais preferencialmente igual ou maior do que 1,000; valores compreendidos de 1,000 a 20,000 são especialmente preferidos, mais preferencialmente de 2,000 a 10,000 Da. Exemplos ilustrativos não limitativos de PEG os quais podem ser usados na presente invenção incluem polietileno glicol 1,000, polietileno glicol 2,000, polietileno glicol 6,000 ou polietileno glicol 10,000 (PEG1, PEG2, PEG6 ou PEG10 respectivamente).
[64] Os PEGs com peso molecular menor do que 400 são líquidos não voláteis à temperatura ambiente. O PEG 600 mostra um ponto de fusão compreendido entre 17 e 22 °C, em que os PEGs com peso molecular médio compreendido entre 800 e 2,000 são materiais pastosos com baixo ponto de fusão. Acima de um peso molecular de 3,000 Da, os PEGs são sólidos, e até PEG 35,000 são comercialmente disponíveis. Por outro lado, embora o ponto de fusão dos PEGs aumente quando o peso molecular aumenta, o ponto de fusão aumenta até um valor máximo de 60 °C. Da mesma forma, quando o peso molecular aumenta, sua solubilidade aquosa diminui. Em qualquer caso, para PEG 35,000, uma quantidade próxima a 50 % p/v pode ser dissolvida em água.
[65] De um ponto de vista toxicológico, os PEGs são considerados preferencialmente não-tóxicos e não- imunogênicos (Hermansky S.J et al., Food Chem Toxic., 1995, 33, 139 - 140; Relatório Final sobre a Avaliação de Segurança dos PEGs: J.A. C. T., 1993, 12, 429 - 457; Polietileno glicol, 21 CFR 172.820, FDA). A ingestão diária máxima definida pela OMS é de 10 mg/kg (polietileno glicois; Vigésimo Terceiro Relatório da Junção do Comitê de Especialistas em Aditivos Alimentícios FAO/WHO; Organização Mundial de Saúde, Gênova; Série de Relatórios Técnicos 1980, 648, 17 - 18).
[66] Derivados de polietileno glicóis apresentam características vantajosas que são similares aos PEGs tradicionais, tais como sua solubilidade em água, inatividade fisiológica, baixa toxicidade e estabilidade sob condições muito diferentes. Estes derivados incluem muitos produtos diferentes e são caracterizados pelo grupo funcional substituindo a hidroxila primária. De acordo com a presente invenção, derivados de polietileno glicóis contendo um grupo reativo com hidroxila terminal podem ser usados.
[67] Em uma modalidade particular, o referido derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal é um polioxi etileno alquil éter. Compostos de polioxi etileno alquil éteres apresentam a fórmula geral H(2m+i)Cm (O-CH2-CH2)nOH. Eles serão referenciados como CmEn com o “m” indicando o número de carbonos na cadeia alquila e “n” sendo o número de unidade de óxido de etileno na porção hidrofílica. Exemplos ilustrativos e não limitativos são: polietileno glicol metil éteres, também conhecidos como metoxi polietileno glicóis (mPEG); polietileno glicol etil éteres; polietileno glicol propil éteres; e polietileno glicol butil éteres.
[68] As estruturas químicas de alguns polioxi etileno alquil éteres correspondendo aos grupos acima mencionados são indicados abaixo de forma ilustrativa: a)H3C(O-CH2-CH2)nOH b)H5C2(O-CH2-CH2)nOH c)H7C3(O-CH2-CH2)nOH d)H9C4(O-CH2-CH2)nOH.
[69] Exemplos não limitativos de polioxi etileno alquil éteres os quais podem ser usados na presente invenção incluem o metil éter de polietileno glicol 1,000 ou metoxi-polietileno glicol 1,000 (mPEG1); o metil éter de polietileno glicol 2,000 ou metoxi-polietileno glicol 2,000 (mPEG2); o metil éter de polietileno glicol 6,000 ou metoxi-polietileno glicol 6,000 (mPEG6); o metil éter de polietileno glicol 10,000 ou metoxi-polietileno glicol 10,000 (mPEG10).
[70] Os seguintes podem também ser apontados dentre derivados de polietileno glicóis contendo um grupo reativo com hidroxila terminal que pode ser usado na presente invenção: - Poli (etileno glicol) metacrilato - Poli (etileno glicol) acrilato - Poli (etileno glicol) monolaurato - Poli (etileno glicol) monooleato - Poli (etileno glicol) (12) tridecil éter - Poli (etileno glicol) tetrahidrofurfuril éter.
[71] A escolha dos polietileno glicóis e derivados permite modular as características dos sistemas gerados e o uso das suas misturas adiciona mais um fator de variabilidade. De um ponto de vista prático, é importante adaptar e selecionar o sistema mais adequado para cada molécula de ativo e para cada rota de administração.
[72] Como é aqui utilizado, “peso molecular” é definido como a massa molar média de uma molécula. Diferente de pequenas moléculas, o peso molecular de um polímero não é um único valor. Pelo contrário, um determinado polímero irá apresentar uma distribuição de pesos moleculares dependendo por exemplo, da maneira que o polímero é produzido. Dessa forma, como é aqui utilizado, o termo peso molecular para polímeros se refere à distribuição do peso molecular ou ao peso molecular médio. Existem muitas maneiras, no entanto, para calcular o peso molecular médio. De acordo com a presente invenção, o peso molecular médio de polímeros de éster pré-formados da invenção é determinado por 1H-RMN, e o peso molecular médio do PVM/MA comercial é determinado por SEC-MALLS, como descrito, para fins de ilustração, na parte experimental anexada aos exemplos descritos abaixo.
[73] Como é aqui utilizado, “nanopartícula” se refere aos sistemas coloidais de formato tipo esférico ou similares (nanocápsula ou nanoesfera) com um tamanho menor do que 1 micrômetro (μm) , preferencialmente na faixa de 10 a 900 nanômetros (nm).
[74] Como é aqui utilizado, o termo “compostos biologicamente ativos” (BAC) se referem a qualquer molécula pequena (por exemplo, um fármaco ou ingrediente ativo de um medicamento) ou derivado do mesmo o qual é administrado a um indivíduo, preferencialmente um ser humano, com fins profiláticos ou terapêuticos; isto é, qualquer substância ou composto químico com um peso molecular com menos de 900 Daltons os quais podem ser usados no tratamento, cura, prevenção ou diagnose de uma doença ou para melhoria do bem estar físico e mental de humanos e animais. Como é aqui utilizado, o termo “derivado”, aplicado aos compostos biologicamente ativos, incluem pró-fármacos e análogos dos referidos compostos biologicamente ativos.
[75] Como é aqui utilizado, os termos “agente antitumoral”, “agente anticâncer” ou “agente antineoplásico” (indistintamente usados nesta descrição), em geral se referem a substâncias as quais inibem ou suprimem o crescimento e proliferação de células cancerígenas. Os agentes antitumorais podem ainda incluir compostos que destroem células cancerígenas ou interferem nas divisões celulares, compostos que bloqueiam determinados hormônios envolvidos no câncer, compostos que inibem ou evitam o crescimento de novos vasos sanguíneos (por exemplo, inibidores da angiogênese), agentes que danificam o DNA (por exemplo, agentes alquilantes, tais como cisplatina, carboplatina e oxaloplatina; anti- metabólitos e inibidores da topoisomerase) e compostos com propriedades anticancerígena (por exemplo, taxanos, alcaloides da vinca e alcaloides vegetais). O termo “agente antitumoral” também inclui terapia de radiação. Um agente antitumoral pode ainda incluir um agente específico para as proteínas desreguladas das células cancerígenas, tais como um inibidor de receptor de tirosina quinase.
[76] Como é aqui utilizado, um “metal divalente” inclui qualquer elemento metálico cuja valência é 2, por exemplo, um metal alcalino terroso, por exemplo, cálcio, magnésio, zinco, etc., ou se ele apresentar diversas valências, sendo uma delas 2, por exemplo, ferro, etc., desde que seja farmaceuticamente aceitável.
[77] Como é aqui utilizado, “tamanho médio” se refere ao diâmetro médio da população de nanopartículas que se movimentam juntas em um meio aquoso. O tamanho médio destes sistemas pode ser medido por processos padrões conhecidos por um técnico no assunto e os quais são descritos, para fins de ilustração, na parte experimental anexada aos exemplos descritos abaixo. O tamanho médio das partículas pode ser preferencialmente afetado pela quantidade e peso molecular do PVM/MA, pela natureza e quantidade da molécula com hidroxila terminal da invenção, pela natureza e quantidade de moléculas biologicamente ativas presente nas nanopartículas da invenção (em geral, quanto maior a quantidade ou peso molecular dos referidos componentes, maior o tamanho médio da nanopartícula) e, por alguns parâmetros do processo, para a produção das referidas nanopartículas. As nanopartículas da invenção são caracterizadas por apresentar um tamanho de partícula médio menor do que 1 μm, tipicamente compreendido na faixa de 1 a 999 nm, preferencialmente de 10 a 900 nm, mais preferencialmente de 100 a 500 nm, ainda mais preferencialmente de 150 a 400 nm. Em uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção apresentam um tamanho médio de partícula de cerca de 250 nm aproximadamente.
[78] Como é aqui utilizado, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa que um composto ou combinação de compostos é suficientemente compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletério ao indivíduo até aqueles níveis aceitáveis pelos padrões da indústria.
[79] Como é aqui utilizado, o termo “carreador” se refere a um diluente com o qual o ingrediente ativo ou fármaco é administrado. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos no estado da técnica e incluem soluções de salina tamponada com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões óleo / água, diferentes tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Carreadores farmacêuticos adequados estão descritos em “Ciências Farmacêuticas de Remington” por E.W. Martin, 1995. Preferencialmente, os carreadores da invenção são aprovados por uma agência regulatória do governo federal ou estadual listado na Farmacopeia Americana ou outra farmacopeia reconhecida em geral para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.
[80] Como é aqui utilizado, o termo “prevenção” se refere a evitar de acontecer, existir ou, alternativamente, atrasam o início ou recorrência de uma doença, desordem ou condição para a qual tal termo se aplica, ou de um ou mais sintomas associados com uma doença, desordem ou condição. O termo “prevenção” se refere ao ato de prevenir, como “prevenção” está definido imediatamente acima.
[81] Como é aqui utilizado, o termo “tratamento” se refere a reverter, aliviar ou inibir o progresso da desordem ou condição na qual este termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tais desordens ou condição. O termo “tratamento” se refere ao ato de tratar, como “tratamento” está definido imediatamente acima.
[82] Como é aqui utilizado, o termo “indivíduo” significa animais, em particular mamíferos tais como cães, gatos, vacas, cavalos, ovelhas, ganso e humanos. Em particular, indivíduos preferidos são humanos de ambos os sexos.
Ésteres de conjugados de polímeros de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico)
[83] A presente invenção fornece novos ésteres de conjugados de polímeros de anidrido poli (metil vinil éter- co-maleico) (PVM/MA) com moléculas com hidroxila terminal. Os termos “éster”, “anidrido poli (metil vinil éter-co- maleico)” e “molécula com hidroxila terminal”, tal como aqui usado, foram previamente definidos e estão aqui incorporados por referência. Dessa forma, de acordo com a presente invenção, pelo menos uma unidade de anidrido de polímero PVM/MA é esterificada com uma molécula com hidroxila terminal selecionada dentre: um polietileno glicol e um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, aqui chamado “molécula com hidroxila terminal da invenção”.
[84] Dessa forma, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionado dentre um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, aqui chamado “conjugado de polímero de éster da invenção”.
[85] Em uma modalidade particular, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % de unidades de anidrido de polímero PVM/MA são esterificadas com a molécula com hidroxila terminal da invenção. Por exemplo, um grau de esterificação de pelo menos 5 % fornece bons resultados.
[86] Em uma variante da invenção, a molécula com hidroxila terminal é um polietileno glicol que não é ramificado e não apresenta grupos hidroxila substituídos. Nesta variedade da invenção, os polietileno glicóis usados preferencialmente apresentam um peso molecular compreendido na faixa de 400 a 35,000 Da. Em uma variante preferida da invenção, o polietileno glicol usado apresenta um peso molecular igual ou maior do que 400, mais preferencialmente igual ou maior do que 1,000; valores compreendidos na faixa de 1,000 a 20,000 são especialmente preferidos, mais preferencialmente de 2,000 a 10,000 Da. Em uma variante mais preferida da invenção, a molécula com hidroxila terminal é um polietileno glicol selecionada do grupo que consiste de polietileno glicol 1,000 (PEG1), polietileno glicol 2,000 (PEG2), polietileno glicol 6,000 (PEG6) e polietileno glicol 10,000 (PEG10).
[87] Em outra variante, a molécula com hidroxila terminal da invenção é um polietileno glicol com um grupo hidroxila substituído. Nesta variedade da invenção, a molécula com hidroxila terminal é, dessa forma, um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, preferencialmente é um polioxi etileno alquil éter. Em uma modalidade mais particular, o polioxi etileno alquil éter é um polietileno glicol metil éter (mPEG). Em uma modalidade ainda mais preferida, o polietileno glicol metil éter é selecionado do grupo que consiste de metoxi-polietileno glicol 1,000 (mPEG1), metoxi-polietileno glicol 2,000 (mPEG2), metoxi-polietileno glicol 6,000 (mPEG6) e metoxi-polietileno glicol 10,000 (mPEG10).
[88] O peso molecular médio do conjugado de polímero de éster da invenção pode variar dentro de uma faixa ampla; no entanto, em uma modalidade particular, o conjugado de polímero de éster da invenção apresenta um peso molecular médio compreendido na faixa de 85 a 3,000 kDa, preferencialmente de 90 a 2,500 kDa, mais preferencialmente de 95 a 250 kDa.
Processo para a obtenção de um conjugado de polímero de éster da invenção
[89] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionada dentre um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal (isto é, o conjugado de polímero de éster da invenção), aqui referido como “processo [l] da invenção”, o qual compreende as etapas de: a) reagir o PVM/MA com a molécula com hidroxila terminal da invenção em um solvente orgânico, e b) remover o solvente orgânico.
[90] Esta etapa (a) do “processo [l] da invenção” inclui dissolver e incubar o PVM/MA e a molécula com hidroxila terminal da invenção em um solvente orgânico tal como, por exemplo, acetona, para que a reação ocorra. A incubação da mistura é preferencialmente realizada sob agitação a uma temperatura compreendida na faixa de 15 °C a 80 °C, mais preferencialmente na faixa de 45 °C a 65 °C, mais preferencialmente a 55 °C. O tempo de incubação pode variar de 1 a 24 horas. Em uma modalidade particular preferida, a incubação é realizada por 2 - 4 horas. Por exemplo, uma incubação da mistura a 55 °C por 3 horas fornece bons resultados. Alternativamente, é também possível reagir o PVM/MA e a molécula com hidroxila terminal sob agitação à temperatura ambiente (TA) por longos intervalos de tempo (24 - 48 horas).
[91] O solvente orgânico é removido na etapa (b) por qualquer processo adequado, tal como evaporação sob pressão reduzida, evaporação à temperatura ambiente ou centrifugação sob vácuo. Em uma modalidade particular, a etapa (b) compreende a remoção do solvente orgânico por evaporação sob pressão reduzida.
[92] Em uma modalidade preferida, o processo [1] da invenção compreende uma etapa adicional (c) de purificação do conjugado de polímero de éster da invenção. Em uma variante particular, a etapa adicional (c) compreende diversas lavagens com um líquido no qual o polímero é insolúvel (porém não a molécula com hidroxila terminal não reagida); e filtração sob vácuo até que nenhum traço de molécula com hidroxila terminal não reagida seja detectado no líquido (por exemplo, medida por cromatografia em camada fina, CCF). Em uma variante preferida, o líquido de lavagem é uma mistura de diclorometano / metanol. Por exemplo, uma mistura CH2Cl2 / CH3OH (9:1) usada como fase móvel e iodo para revelação no CCF, fornecendo bons resultados.
[93] As particularidades da molécula com hidroxila terminal da invenção foram previamente mencionadas na seção “Definições”, e também em conexão com o conjugado de polímero de éster da invenção e são aqui incorporados por referência. De acordo com estes, em uma modalidade particular do processo [1] da invenção, a molécula com hidroxila terminal reage com o PVM/MA na etapa (a) é um polietileno glicol; preferencialmente um polietileno glicol selecionado dentre o grupo que consiste de polietileno glicol 1,000 (PEG1), polietileno glicol 2,000 (PEG2), polietileno glicol 6,000 (PEG6), e polietileno glicol 10,000 (PEG10). Em outra modalidade particular do processo [1] da invenção, a molécula com hidroxila terminal reage com PVM/MA na etapa (a) é um derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, preferencialmente um polioxi etileno alquil éter; mais preferencialmente um polietileno glicol metil éter (mPEG); mais preferencialmente um polietileno glicol metil éter selecionado do grupo que consiste de metoxi-polietileno glicol 1,000 (mPEG1), metoxi-polietileno glicol 2,000 (mPEG2), metoxi-polietileno glicol 6,000 (mPEG6) e metoxi- polietileno glicol 10,000 (mPEG10).
[94] A proporção em peso entre o PVM/MA e a molécula com hidroxila terminal da invenção na solução da etapa (a) do processo [1] da invenção, pode variar dentro de uma ampla faixa; no entanto, em uma modalidade particular, a proporção PVM/MA:molécula com hidroxila terminal em peso está compreendida na faixa de 1:0.01 a 1:0.25; preferencialmente de 1:0.015 a 1:0.2; mais preferencialmente de 1:0.05 a 1:0.125. Em uma maneira ilustrativa não limitativa, quando a molécula com hidroxila terminal é um polietileno glicol, uma proporção em peso PVM/MA:PEG de 1:0.05, 1:0.1, 1:0.125, ou 1:0.25 fornece bons resultados. De maneira similar, quando a molécula com hidroxila terminal é um metoxi-polietileno glicol, uma proporção em peso PVM/MA:mPEG de 1:0.01, 1:0.015, 1:0.025, 1:0.05, 1:0.01 ou 1:0.2 fornece bons resultados.
[95] Em outras palavras, a proporção em peso entre a molécula com hidroxila terminal da invenção e o PVM/MA na solução da etapa (a) do processo [1] da invenção, está compreendido na faixa de 1:4 a 1:100; preferencialmente de 1:5 a 1:66; mais preferencialmente de 1:8 a 1:20. Em uma maneira ilustrativa não limitativa, quando a molécula com hidroxila terminal é um polietileno glicol, uma proporção em peso PEG:PVM/MA de 1:4, 1:8, 1:10 ou 1:20 fornece bons resultados. De forma similar, quando a molécula com hidroxila terminal é um metoxi-polietileno glicol, uma proporção em peso mPEG:PVM/MA de 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:66 ou 1:100 fornece bons resultados.
[96] O conjugado de polímero de éster obtido pelo processo [1] da invenção, isto é, o conjugado de polímero de éster de PVM/MA com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionado dentre um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, produzido por meio do processo que compreende: (a) reagir o PVM/MA com a molécula com hidroxila terminal da invenção em um solvente orgânico e (b) remoção do solvente orgânico, forma um aspecto adicional da presente invenção.
Aplicações do conjugado de polímero de éster da invenção
[97] Ést eres pré-formados de conjugados de polímeros da invenção mostraram boas propriedades físico-químicas e farmacológicas e podem ser usados como materiais de partida na formação de nanopartículas para a administração de compostos biologicamente ativos. Dessa forma, em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um conjugado de polímero de éster da invenção ou um conjugado de polímero de éster obtido pelo processo [1] da invenção, no preparo das nanopartículas poliméricas para a distribuição do fármaco; preferencialmente distribuição de fármaco oral.
[98] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição compreendendo (i) um conjugado de polímero de éster da invenção ou um conjugado de polímero de éster obtidos pelo processo [1] da invenção e (ii) um carreador, aqui chamado “composição [1] da invenção”. Em uma modalidade particular, a composição [1] da invenção compreende pelo menos uma concentração de 2 % (p/v) de um conjugado de polímero de éster da invenção ou de um conjugado de polímero de éster obtidos pelo processo [1] da invenção.
[99] Como exemplo ilustrativo, a referida composição [1] da invenção pode ser usada como uma base para a produção das nanopartículas para a administração de compostos biologicamente ativos. Dessa forma, ainda em outro aspecto, a invenção se refere à referida composição [1] da invenção para uso na distribuição de fármacos; preferencialmente na distribuição oral de fármacos.
Nanopartícula
[100] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção. As nanopartículas da invenção apresentam a capacidade de encapsular os compostos biologicamente ativos (BAC), e podem ser usados como sistema de distribuição de fármacos.
[101] Dessa forma, em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades acima ou abaixo descritas, as nanopartícula ainda compreendem compostos biologicamente ativos, aqui identificados nesta descrição como “nanopartícula da invenção”.
[102] O termo “compostos biologicamente ativos” (BAC) foi previamente definido e se refere a qualquer molécula pequena (por exemplo, um fármaco ou ingrediente ativo do medicamento) ou derivado do mesmo o qual é administrado a um indivíduo, preferencialmente a um ser humano, com fins profiláticos ou terapêuticos; isto é, qualquer substância ou composto químico com um peso molecular menor do que 900 Daltons o qual pode ser usado no tratamento, cura, prevenção ou diagnose de uma doença ou para melhorar o bem estar físico e mental de humanos e animais. Como é aqui utilizado, o termo “derivado”, aplicado a uma molécula pequena, inclui pró-fármacos e análogos da referida molécula.
[103] Os BAC podem ser selecionados dentre uma variedade de classes de fármacos conhecidas, incluindo, por exemplo: agentes antitumoral ou antineoplásicos, agentes analgésicos, agentes anestésicos, agentes anti- inflamatórios, agentes antiarrítmicos, agentes anti- hipertensivos, agentes anti-angina, agentes anti-asma, antibióticos (incluindo penicilinas), agentes anticoagulantes, agentes antidepressivos, agentes antipsicóticos, agentes antidiabéticos, agentes antiepilépticos, agentes antihistamínicos, agentes antitussígenos, agentes antimuscarínicos, agentes antimicobacterianos, agentes antioxidantes, agentes antipiréticos, agentes imunossupressores, agentes imunoestimulantes, agentes antihelmínticos, agentes antivirais, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes sedativos ansiolíticos (hipnóticos e neurolépticos), agentes adstringentes, agentes bacteriostáticos, agentes bloqueadores beta-adrenoceptores, produtos e substitutos do sangue, broncodilatadores, agentes tamponantes, agentes cardíacos inotrópicos, quimioterápicos, meios de contraste, corticosteroides, supressores da tosse (expectorantes e mucolíticos), agentes de diagnóstico, agentes de imagem de diagnóstico, diuréticos, dopaminérgicos (agentes antiparkinsonianos), etc. As nanopartículas da invenção podem incorporar um ou mais dos referidos BAC.
[104] Exemplos de BAC de acordo com a presente invenção são docetaxel, paclitaxel, camptotecina, actinomicina D, albendazol, aldosterona, alprazolam, amiodarona, amitriptilina, amprenavir, asimadolina, atorvastatina, bunitrolol, buspirona, carbamazepina, carvedilol, celiprolol, ciclosporina A, cimetidina, clotrimazol, colchicina, cortisona, daunorubicina, debrisoquina, dexametasona, diazepam, digitoxina, digoxina, diltiazem, domperidona, doxorubicina, efavirenz, epirubicina, eritromicina, ergotamina, estradiol, estradiol glicuronídeo, erlotinib, etopósido, fenitoína, fentanil, felodipina, fenotiazinas, fexofenadina, fluoroquinolonas, fluorouracil, FK-506, gentamicina, griseofulvina, hidrocortisona, imatinib, indinavir, itraconazol, ivermectina, cetoconazol, kaempferol, levofloxacina, lidocaína, loperamida, losartan, lovastatina, mebendazol, metilprednisolona, metotrexato, mibefradil, midazolam, nisoldipina, morfina, nelfinavir, nicardipina, nitrendipina, nifedipina, ondansetron, pentazocina, praziquantel, prednisolona, prednisona, quercetina, quinidina, ranitidina, rapamicina, rifabutina, rifampicina, ritonavir, saquinavir, sirolimus, sulfametizol, tacrolimus, tamoxifeno, talinolol, teniposide, terfenadina, tetraciclina, topotecan, triamcinolona, valspodar, verapamil, vinblastina, vincristina, vindesina, zopiclone, derivados dos mesmos, e misturas dos mesmos.
[105] As nanopartículas da invenção são, em particular, útil para a administração pela via oral dos BAC hidrofóbicos (classe II e classe IV do Sistema de Classificação Biofarmacêutica).
[106] Em uma modalidade particular da invenção, os BAC presentes nas nanopartículas da invenção é um agente antitumoral (por exemplo docetaxel, paclitaxel, camptotecina, doxorubicina, epirubicina, fluorouracil, ciclofosfamida, metotrexato, etc). Em uma modalidade mais particular, o BAC é selecionado do grupo que consiste de docetaxel, camptotecina e paclitaxel. Ainda em mais uma modalidade particular, o BAC é docetaxel.
[107] As nanopartículas da invenção permitem modificar a distribuição do BAC que eles contêm quando eles são administrados por uma rota que fornece acesso a qualquer mucosa do organismo (por exemplo, via oral, etc.).
[108] As referidas nanopartículas da invenção apresentam um tamanho de partícula menor do que 1 μm, tipicamente compreendido entre 1 e 999 nm, preferencialmente entre 10 e 900 nm, mais preferencialmente entre 50 e 550 nm, ainda mais preferencialmente entre 100 e 500 nm, ainda mais preferencialmente entre 150 e 400 nm.
Processo para a obtenção de nanopartículas
[109] Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção e compostos biologicamente ativos (isto é, as nanopartículas da invenção), aqui chamadas “processo [2] da invenção”, o qual compreende as etapas de: a) misturar um conjugado de polímero de éster da invenção com compostos biologicamente ativos em um meio orgânico, e b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de álcool e água na presença de um metal divalente.
[110] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, o meio orgânico na etapa (a) é acetona e o álcool usado na etapa (b) é etanol.
[111] O metal divalente que pode ser usado para colocar o processo [2] da invenção em prática é selecionado do grupo que consiste de cálcio, magnésio, zinco, ferro na forma divalente e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, o metal divalente é cálcio e pode ser obtido, por exemplo, a partir de um sal de cálcio. Exemplos ilustrativos e não limitativos dos sais de cálcio são cloreto de cálcio, acetato de cálcio, gliconato de cálcio, lactato de cálcio, sorbato de cálcio e misturas dos mesmos; preferencialmente, o sal de cálcio é cloreto de cálcio.
[112] A etapa (a) do processo [2] da invenção é realizada por métodos convencionais conhecidos por técnicos no assunto, por exemplo por meio de: - dissolver o conjugado de polímero de éster da invenção em um meio orgânico e adicionar os compostos biologicamente ativos; ou alternativamente, - misturar (i) uma solução orgânica contendo o conjugado de polímero de éster da invenção com (ii) uma solução orgânica ou dispersão dos compostos biologicamente ativos.
[113] A etapa (b) do processo [2] da invenção é também realizada por métodos convencionais conhecidos por técnicos no assunto, por exemplo por meio de: - adicionar (iii) um álcool à mistura obtida na etapa (a) e imediatamente adicionar uma (iv) solução aquosa do metal divalente ou alternativamente, - adicionar uma (v) mistura hidro alcoólica compreendendo um metal divalente à mistura obtida na etapa (a).
[114] O processo [2] da invenção cobre todas as possíveis combinações dos métodos acima das etapas (a) ou (b) aqui descritas. No entanto, em uma modalidade preferida, opcionalmente na combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, o processo [2] da invenção compreende as etapas de: a) misturar (i) uma solução orgânica contendo o conjugado de polímero de éster da invenção com (ii) uma solução orgânica ou dispersão dos compostos biologicamente ativos, e b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de uma mistura hidro alcoólica compreendendo um metal divalente à mistura obtida na etapa (a).
[115] Em uma modalidade particular da invenção, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, a mistura hidro alcoólica é 1:1 (v/v) (água / álcool). Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, a referida mistura hidro alcoólica compreende 0.5 - 5 % (v/v) de uma fonte de um metal divalente; preferencialmente 1 - 3 %. Em uma modalidade mais particular, a referida fonte de um metal divalente é uma solução aquosa compreendendo 0.5 - 1 % (p/v) do sal correspondente.
[116] Ainda em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, a proporção em peso entre o conjugado de polímero de éster da invenção e os compostos biologicamente ativos na mistura da etapa (a) está compreendida na faixa de 1:0.01 a 1:0.20, preferencialmente de 1:0.02 a 1:0.15, mais preferencialmente de 1:0.03 a 1:0.10.
[117] Em uma maneira ilustrativa não limitativa, quando o BAC é docetaxel ou paclitaxel, uma proporção em peso conjugado de polímero de éster:BAC de 1:0.05 ou 1:0.10 fornece bons resultados. De maneira similar, quando o BAC é camptotecina, uma proporção em peso conjugado de polímero de éster:BAC de 1:0.03 ou 1:0.06 fornece bons resultados.
[118] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, a proporção orgânica / hidro alcoólica (v/v) na mistura obtida no final do processo [2] da invenção é 1:1 - 1:4, preferencialmente é 1:2.
[119] Em uma variante da invenção, o referido processo para a produção de uma nanopartícula de acordo com a invenção compreende uma etapa adicional (c) de remoção do meio orgânico (por exemplo, por meio da evaporação sob pressão reduzida), e / ou opcionalmente purificação (por exemplo, por meio das técnicas de filtração, centrifugação ou ultra centrifugação). Da mesma forma, se desejado, o referido processo [2] da invenção pode incluir uma etapa adicional (d) de secagem das nanopartículas formadas a fim de obter as nanopartículas da invenção na forma de um pó. Esta forma de apresentação das referidas nanopartículas contribui para a sua estabilidade e é ainda, em particular, útil para sua eventual aplicação em produtos farmacêuticos.
[120] Virtualmente, qualquer técnica ou método convencional adequado ou para a secagem das nanopartículas pode ser usado para realizar esta etapa de secagem; no entanto, em uma modalidade particular, a secagem da suspensão contendo nanopartículas é realizada por meio de secagem por aspersão ou por meio de secagem por congelamento (liofilização); preferencialmente por meio de secagem por congelamento. Este tratamento é, em geral, realizado pela adição de um agente protetor adequado das referidas nanopartículas, tais como um sacarídeo, por exemplo, sacarose, lactose, trealose, manitol, maltodextrina, glicose, sorbitol, maltose, etc., e misturas dos mesmos para a suspensão das nanopartículas. O referido agente protetor protege as nanopartículas da invenção contra a degradação, bem como oxidação durante o processo de secagem.
[121] As nanopartículas capazes de serem obtidas por meio de processo [2] da invenção apresentam as características das nanopartículas da invenção. Dessa forma, as nanopartículas obtidas pelo processo [2] da invenção, isto é, as nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção e compostos biologicamente ativos produzidos por meio de um processo, o qual compreende: (a) misturar um conjugado de polímero de éster da invenção com compostos biologicamente ativos em um meio orgânico e (b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de álcool e água na presença de um metal divalente formam um aspecto adicional da presente invenção.
[122] Em particular, as nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção e um BAC obtido por meio de um processo, o qual compreende: (a) misturar (i) uma solução orgânica contendo o conjugado de polímero de éster da invenção com (ii) uma solução orgânica ou dispersão dos compostos biologicamente ativos e (b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de uma mistura hidro alcoólica compreendendo um metal divalente à mistura obtida na etapa (a), forma um aspecto adicional da presente invenção, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo.
Aplicações das nanopartículas
[123] As nanopartículas fornecidas na presente invenção (isto é, nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção, bem como nanopartículas diretamente obtidas pelo processo [2] da invenção) permitem o encapsulamento de quantidades consideráveis dos compostos biologicamente ativos, e sua incorporação nas composições farmacêuticas. As referidas nanopartículas podem ser apresentadas na forma de uma suspensão, preferencialmente em meio aquoso ou, alternativamente, elas podem ser apresentadas na forma de pó seco, por exemplo, como um liofilizado junto com um agente crioprotetor, mantendo o BAC em condições estáveis e permitindo seu armazenamento por longos intervalos de tempo.
[124] As nanopartículas da invenção parecem ser capazes de cruzar a camada de muco e interagir de forma íntima com a superfície dos enterócitos, melhorando a absorção do fármaco através da mucosa oral. De forma importante, as nanopartículas fornecidas pela presente invenção aumentam a biodisponibilidade oral do BAC, fornecendo níveis de plasma sustentados e constantes. Dessa forma, em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula de acordo com a invenção ou uma nanopartícula obtida pelo processo [2] da invenção para uso na medicina. Alternativamente, a invenção se refere a um método para a prevenção ou tratamento da doença o qual compreende a administração da nanopartícula da invenção a um indivíduo na necessidade da mesma, ou uma nanopartícula obtida por um processo [2] da invenção.
[125] A dosagem de nanopartículas carregadas da invenção para ser administrada a um indivíduo na necessidade de tratamento com o BAC deve ser suficiente para desencadear uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo. Dessa forma, as nanopartículas são administradas a um paciente em uma quantidade suficiente para evitar, aliviar, reduzir, curar ou pelo menos parcialmente parar os sintomas e / ou complicações da doença. Uma quantidade adequada para alcançar isto é definida como uma “dosagem terapeuticamente eficaz”. A dosagem pode variar dentro de uma faixa ampla e irá depender, dentre outras características, da natureza do BAC, sua atividade ou potência, a quantidade de BAC por nanopartículas, etc. Apenas para fins ilustrativos, a dosagem das nanopartículas carregadas para serem administradas a um indivíduo podem ser compreendidas, por exemplo, entre aproximadamente 0.01 e aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferencialmente, entre 0.1 e 2 mg per kg de peso corporal.
[126] As particularidades do BAC foram mencionadas na seção “Definições”, e também em conexão com as nanopartículas da invenção e são aqui incorporadas por referência. O BAC que está compreendido nas nanopartículas é escolhido dependendo da doença a ser tratada. Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, o BAC é um agente antitumoral; em uma modalidade mais particular, o BAC é selecionado do grupo que consiste de docetaxel, camptotecina e paclitaxel. Dessa forma, em outro aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção, e um BAC (isto é, uma nanopartícula da invenção ou uma nanopartícula obtida pelo processo [2] da invenção), em que o BAC é um agente antitumoral, para uso em um método para a prevenção ou tratamento de câncer; em outras palavras, a invenção também se refere a um método para a prevenção ou tratamento de câncer, o qual compreende a administração da nanopartícula compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção a um indivíduo na necessidade da mesma, e um BAC, em que o BAC é um agente antitumoral.
[127] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso da nanopartícula da invenção, ou o uso da nanopartícula obtida pelo processo [2] da invenção na produção de uma composição farmacêutica.
[128] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica, aqui chamada “composição farmacêutica da invenção”, compreendendo (i) pelo menos uma nanopartícula da invenção ou pelo menos uma nanopartícula obtida pelo processo [2] da invenção e (ii) um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particular, a referida composição farmacêutica da invenção compreende uma pluralidade de nanopartículas da invenção e / ou uma pluralidade de nanopartículas obtidas por um processo [2] da invenção. As particularidades das nanopartículas já foram definidas acima e são aqui incorporadas por referência.
[129] Vantajosamente, as nanopartículas na composição farmacêutica da invenção apresentam um tamanho médio compreendido na faixa de 10 a 900 nm, preferencialmente de 50 a 550, mais preferencialmente de 100 a 500 nm, ainda mais preferencialmente de 150 a 400 nm, ainda mais preferencialmente cerca de 250 nm.
[130] A composição farmacêutica da invenção pode ser formulada em uma forma de dosagem farmacêutica sólida (por exemplo, comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos, granulados, supositórios, sólidos estéreis cristalinos ou amorfos os quais podem ser reconstituídos para fornecer formas líquidas, etc.), líquidas (por exemplo suspensão ou dispersão das nanopartículas, etc.) ou semissólidas (géis, pomadas, cremes e similares). As composições farmacêuticas descritas compreenderão carreadores ou veículos adequados para cada formulação. Além disso, a composição farmacêutica pode conter, como apropriado, estabilizantes, suspensões, preservativos, surfactantes e similares. Estes excipientes serão escolhidos de acordo com a forma de dosagem farmacêutica.
[131] Em uma modalidade específica, a referida composição farmacêutica é formulada como forma de dosagem farmacêutica adequada para a sua administração por uma via de acesso às mucosas. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica fornecida por esta invenção é oralmente administrado; dessa forma, o carreador ou veículo compreende um ou mais excipientes farmacêuticos aceitáveis para a administração por via oral. Formulações orais são convencionalmente preparadas por métodos conhecidos por técnicos no assunto. Uma revisão das diferentes formas de administração de ingrediente ativos, dos excipientes a serem usados e do processos para a produção dos mesmos pode ser encontrado no livro “Tratado de Farmácia Galênica”, por C. Faulí i Trillo, 10a edição, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
[132] Em outra modalidade específica, a composição farmacêutica da invenção é preparada na forma de um pó seco, por exemplo, como um liofilizado.
[133] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode conter o BAC ou ingrediente ativo em uma quantidade que está na faixa de 0.05 % a 50 %, preferencialmente de 0.1 % a 30 %, mais preferencialmente 0.5 % a 25 %, ainda mais preferencialmente 1 % a 20 %, em que as porcentagens acima são p/p versus o peso total da composição ou forma de dosagem. Mesmo assim, a proporção adequada irá depender de cada caso do BAC incorporado.
[134] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica da invenção para uso na medicina. Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso da composição farmacêutica da invenção no preparo de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença. Alternativamente, a invenção se refere a um método para a prevenção ou tratamento da doença, o qual compreende a administração a um indivíduo na necessidade dos mesmos a composição farmacêutica da invenção.
[135] A dosagem terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica a ser administrada depende do caso individual e, como de costume, deve ser adaptado às condições do caso individual para um efeito ótimo. Dessa forma, este depende, é claro, da frequência da administração e da potência e duração da ação do BAC empregado em cada caso para a terapia ou profilaxia, porém também da natureza e severidade da doença e sintomas, e do sexo, idade, peso, co-medicação e resposta individual do indivíduo a ser tratado e se a terapia é aguda ou profilática. As dosagens podem ser adaptadas dependendo do peso do indivíduo e para administração pediátrica.
[136] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com uma ou mais características das diversas modalidades descritas acima ou abaixo, a composição farmacêutica da invenção compreende (i) pelo menos uma nanopartícula compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster da invenção, e um BAC (isto é, uma nanopartícula da invenção ou uma nanopartícula obtida pelo processo [2] da invenção), em que o BAC é um agente antitumoral e (ii) um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, o agente antitumoral é selecionado do grupo que consiste em docetaxel, camptotecina e paclitaxel; preferencialmente é docetaxel.
[137] Nesta modalidade particular, na qual o BAC é um agente antitumoral, a composição farmacêutica da invenção pode ser usada em um método para a prevenção ou tratamento de câncer.
[138] Dessa forma, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para a prevenção e / ou o tratamento de câncer, o qual compreende a administração a um indivíduo na necessidade dos mesmos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção compreendendo um agente antitumoral; alternativamente, a invenção ainda se refere ao uso da composição farmacêutica da invenção compreendendo um agente antitumoral no preparo de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.
[139] Em uma modalidade mais particular, a composição farmacêutica da invenção é selecionada do grupo que consiste de: uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi-polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; e uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi-polietileno glicol 2,000 de 30 % a 40 %, b) camptotecina de 0.08 % a 1.5 %, c) cálcio de 0.10 % a 0.20 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição.
[140] A presente invenção cobre todas as possíveis combinações de modalidades particulares e preferidas aqui descritas.
EXEMPLOS:
[141] Os exemplos que seguem descrevem a produção e caracterização de ésteres de conjugados de polímeros de copolímero de poli (anidrido vinil metil éter e anidrido maleico) (PVM/MA ou Gantrez® AN) com um polietileno glicol ou derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal. Adicionalmente, os exemplos que seguem descrevem a produção e caracterização de nanopartículas com base nos referidos ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com diferentes tipos de polietileno glicóis ou derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal, e moléculas biologicamente ativas. Foi especialmente descoberto que estas nanopartículas são capazes de (i) encapsular quantidades consideráveis de compostos biologicamente ativos (por exemplo paclitaxel, docetaxel e camptotecina) e (ii) atravessar a camada de muco e interagir de forma íntima com a superfície dos enterócitos (melhorando a absorção do fármaco).
[142] Como pode ser observado nos referidos exemplos, quando o docetaxel é usado como compostos biologicamente ativos, sua incorporação nas referidas nanopartículas permite manter níveis plasmáticos constantes e sustentados dos referidos fármacos por pelo menos 72 horas. Da mesma forma, com camptotecina incluída nas nanopartículas da invenção, os compostos biologicamente ativos, os níveis de plasma são mantidos por pelo menos 48 horas.
[143] Os materiais, em geral, são primeiramente descritos.
MATERIAIS
[144] O anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) ou poli (anidrido) (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] foi adquirido de ISP (Barcelona, Espanha). A camptotecina (99.0 %), paclitaxel (USP 26, grau > 99.5 %) e docetaxel (99.0 %) foram fornecidas por 21CECpharm (Londres, Reino Unido). Taxotere® foi obtido de Aventis-Pharma (Cedex, França). Tampão salino com fosfato (PBS), pancreatina, metoxi polietileno glicol 2,000 (mPEG2) e polietileno glicois 2,000, 6,000 e 10,000 (PEG2, PEG6 e PEG10) foram fornecidos por Sigma-Aldrich (Espanha). Pepsina, acetona, etanol e acetonitrila foram obtidos de Merck (Darmstadt, Alemanha). O reagente água deionizada (18.2 MQ de resistividade) foi preparado por um sistema de purificação de água (Wasserlab, Espanha). Todos os reagentes e químicos usados foram de grau analítico.
[145] Estes exemplos foram fornecidos para fins ilustrativos e eles não tem a intenção de serem limitativos da presente invenção.
EXEMPLO 1 Preparo de nanopartículas de PVM/MA convencionais Preparo de nanopartículas de PVM/MA convencionais (NP) vazias
[146] 100 mg de PVM/MA foram dissolvidos em 5 mL de acetona e as nanopartículas foram formadas pela adição de uma mistura de etanol e água (1:1, v/v). Em seguida, os solventes orgânicos foram eliminados por evaporação sob pressão reduzida e a suspensão resultante foi filtrada através de uma membrana de 0.45 μm e purificada duas vezes por centrifugação 27,000 xg por 20 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete é ressuspendido em água. Por fim, a formulação foi congelada e secada por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/p) como crioprotetor. Estas são nanopartículas de PVM/MA vazias, aqui chamadas formulações NP (NP).
Preparo de nanopartículas de PVM/MA convencionais que encapsulam paclitaxel (PTX)
[147] Nanopartículas de PVM/MA carregadas com paclitaxel foram preparadas por um método de deslocamento de solvente com algumas modificações. Brevemente, 10 mg de paclitaxel foram dispersos em 5 mL de acetona contendo 100 mg de PVM/MA. A mistura resultante foi mantida sob agitação magnética por 1 hora à temperatura ambiente. Após este tempo, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de etanol seguida da adição de 10 mL de uma solução aquosa contendo 20 mg de edetato de dissódio. Após a homogeneização pela agitação magnética por 10 minutos, os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R-144, Suíça) e as suspensões resultantes purificadas por filtração tangencial em tubos Vivaspin a 3000xg por 20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. O processo de purificação foi repetidos duas vezes e, por fim, as formulações foram congeladas e secados por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %) como crioprotetor. Estas formulações são nanopartículas de PVM/MA carregadas com PTX, aqui chamadas formulações PTX.
Preparo de nanopartículas de PVM/MA convencionais que encapsulam docetaxel (DTX)
[148] Nanopartículas de PVM/MA carregadas com docetaxel foram preparadas por um método de deslocamento de solvente com algumas modificações. Brevemente, 10 mg de docetaxel foram dispersas em 5 mL de acetona contendo 100 mg de PVM/MA. A mistura resultante foi mantida sob agitação magnética por 1 hora à temperatura ambiente. Após este tempo, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de etanol seguida da adição de 10 mL de uma solução aquosa contendo 20 mg de edetato de dissódio. Após a homogeneização por agitação magnética por 10 minutos, os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R-144, Suíça) e as suspensões resultantes foram purificadas por filtração tangencial em tubos Vivaspin a 3000xg por 20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes ressuspendidos em água. O processo de purificação foi repetido duas vezes e, por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %) como crioprotetor. Estas formulações são nanopartículas de PVM/MA carregadas com DTX, aqui chamadas formulações DTX.
Preparo de nanopartículas de PVM/MA convencionais que encapsulam camptotecina (CPT)
[149] 100 mg de PVM/MA e 10 mg de camptotecina foram dissolvidos e dispersos em 2 e 3 mL de acetona, respectivamente. A camptotecina foi sonicada por 1 minuto e misturado com a solução de PVM/MA. Imediatamente, as nanopartículas foram formadas pela adição de uma mistura de etanol e água (1:1, v/v). Em seguida, solvente orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida e a suspensão resultante foi filtrada através de uma membrana de 0.45 μm e purificada duas vezes por centrifugação 27,000xg por 20 minutos. Por fim, a formulação foi congelada e secada por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %, p/p) como crioprotetor. Estas formulações são nanopartículas de PVM/MA carregadas com CPT, aqui chamadas formulações CPT.
EXEMPLO 2 Preparo de nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais Preparo de nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais vazias (PEG trad)
[150] Nanopartículas de PVM/MA peguiladas foram preparadas por um método de deslocamento de solvente. Brevemente, 12.5 mg de polietileno glicol (PEG2, PEG6 ou PEG10) foram dissolvidos em 3 mL de acetona e, em seguida, adicionado a uma solução de 100 mg de PVM/MA em 2 mL do mesmo solvente orgânico. A mistura resultante foi mantida sob agitação magnética por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de etanol seguida pela adição de 10 mL de água. Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R-144, Suíça) e as suspensões resultantes foram purificadas por filtração tangencial em tubos Vivaspin a 3000xg por 20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. O processo de purificação foi repetido duas vezes e por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %) como crioprotetor. As nanopartículas peguiladas de PVM/MA resultantes são: formulações PEG2 trad, PEG6 trad e PEG10 trad.
Preparo de nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais que encapsulam paclitaxel (PEG-PTX trad)
[151] Nanopartículas de PVM/MA peguiladas contendo paclitaxel foram preparadas por um método de deslocamento de solvente com algumas modificações. Brevemente, por um lado, 12.5 mg de polietileno glicol (PEG2, PEG6 ou PEG10) foram dissolvidos em 3 mL de acetona e, em seguida, foi adicionada uma solução de 100 mg de PVM/MA em 2 mL do mesmo solvente orgânico. A mistura resultante foi mantida sob agitação magnética. Em paralelo, 10 mg de paclitaxel foi dissolvida em 0.5 mL de acetona e adicionada a uma mistura de polímeros. Em seguida, a fase orgânica (contendo paclitaxel, PVM/MA e PEG) foi magneticamente agitada por 1 hora à temperatura ambiente. Após este tempo, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de etanol seguida pela adição de 10 mL de uma solução aquosa contendo 20 mg de edetato de dissódio. Após a homogeneização pela agitação magnética por 10 minutos, os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R-144, Suíça) e as suspensões resultantes foram purificadas por filtração tangencial em tubos Vivaspin a 3000xg por 20 minutos. O sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. O processo de purificação foi repetido duas vezes e por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %) como crioprotetor. Dessa forma, nanopartículas peguiladas de PVM/MA carregadas com PTX tradicionais estão disponíveis, aqui chamadas formulações PEG2-PTX trad, PEG6- PTX trad e PEG10-PTX trad.
Preparo de nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais que encapsulam docetaxel (PEG-DTX trad)
[152] Polietilenoglicol 2,000 (12.5 mg) foi primeiramente dissolvido em 3 mL de acetona e adicionado a uma solução de 100 mg de PVM/MA também em 2 mL de acetona. A mistura resultante foi mantida sob agitação magnética. Por outro lado, o docetaxel foi dissolvido em 0.5 mL de acetona e adicionado à solução. Em seguida, a fase orgânica contendo docetaxel, PVM/MA e PEG2 foi incubada por um período de cerca de 1 hora sob agitação magnética à temperatura ambiente. A seguir, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de etanol seguida pela adição de 10 mL de uma solução aquosa contendo glicina (50 mg) e edetato de dissódio (18 mg) e permitiu a homogeneização por 10 minutos. Os solventes orgânicos foram eliminados por evaporação sob pressão reduzida e o volume final foi ajustado com solução de glicina para 10 mL. A suspensão foi purificada pela filtração tangencial em tubos Vivaspin (300,000 MWCO, Grupo Sartorius, Alemanha) a 4,000xg por 15 minutos. Os péletes foram ressuspendidos em água e a etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e em seguida secadas por congelamento usando sacarose (5 %) como crioprotetor. Dessa forma, nanopartículas peguiladas de PVM/MA carregadas com DTX tradicionais estão disponíveis, aqui chamadas formulações PEG2-DTX trad.
Preparo de nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais que encapsulam camptotecina (PEG-CPT trad)
[153] Nanopartículas peguiladas foram preparadas em uma proporção polímero / CPT / PEG de 1 / 0.03 / 0.125. O PEG2 ou PEG6 e camptotecina foram dissolvidos em acetona e misturados em diferentes condições. Imediatamente, as nanopartículas foram formadas pela adição de uma mistura de etanol, água, glicina e edetato de dissódio. Após a homogeneização por 10 minutos, os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida. Em seguida, as suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificadas duas vezes através de tubos Vivaspin (300,000 MWCO, Grupo Sartorius, Alemanha) a 3000xg por 20 minutos. Por fim, as formulações foram congeladas e em seguida secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 %, w/w) como crioprotetor. Dessa forma, nanopartículas peguiladas de PVM/MA carregadas com CPT tradicionais estão disponíveis, aqui chamadas formulações PEG2-CPT trad e PEG6-CPT trad.
EXEMPLO 3 Preparo e caracterização de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA Preparo de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA
[154] Neste caso, foram testados polietileno glicóis de diferentes pesos moleculares 2,000, 6,000 ou 10,000 e metoxi-polietileno glicol 2000.
[155] Para preparar os ésteres de conjugados de polímeros, 5 g de PVM/MA foram dissolvidos em 250 ml de um solvente orgânico (isto é, acetona) e incubados com diferentes quantidades de polietileno glicol ou derivado dos mesmos por 3 horas sob agitação magnética a 50 °C. As proporções de moléculas com hidroxila terminal:(PVM/MA) testadas foram: - mPEG:(PVM/MA) 1:5; para mPEG2 - PEG:(PVM/MA) 1:20; 1:8; para PEG2, PEG6 e PEG10
[156] Após incubação, o solvente foi removido e o conjugado de polímero de éster resultante foi secado por evaporação em pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). Por fim, os ésteres de conjugados de polímeros secos obtidos foram purificados por lavagem com diclorometano (CH2Cl2) e filtração sob vácuo (filtro de vidro, Merck Millipore, Alemanha) até que nenhum traço de molécula com hidroxila terminal não tratada seja detectado no líquido pela cromatografia em camada fina (CCF). Por este motivo, uma mistura de diclorometano / metanol CH2Cl2 / CH3OH (9:1) foi usada como fase móvel e iodo para revelação. Esta etapa irá melhorar a solubilidade do novo conjugado de polímero em um solvente orgânico.
Caracterização de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA
[157] Após a síntese, os ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com PEG2, PEG6 e PEG10 (em uma proporção de PEG:PVM/MA de 1:8) e conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2 (em uma proporção de mPEG:PVM/MA de 1:5) resultantes foram caracterizados físico- quimicamente a fim de obter evidências das modificações na estrutura do PVM/MA, bem como para estimar o grau de substituição (DS) e o peso molecular (Mw).
[158] As seguintes técnicas foram empregadas: - Espectroscopia infravermelha (IV): Espectroscopia IV foi realizada em um equipamento Nicolet Avatar 360FT-IR (Thermo, USA) com base na tecnologia de refletância. Esta técnica permitiu identificar a ligação do grupo funcional - OH da molécula com hidroxila terminal (PEG ou mPEG) com os grupos anidridos de PVM/MA. - Análise elementar (CHN): Todos os ésteres de conjugados de polímeros pré-formados foram analisados em um aparelho CHN-900 Leco (Leco Corporations, USA). Esta técnica auxilia na determinação da composição dos polímeros e detecção das diferenças na relação do teor de C / H quando a molécula com hidroxila terminal (PEG ou mPEG) é incorporada na estrutura do PVM/MA. Titulação: O PVM/MA ou seus ésteres de conjugados de polímeros foram primeiramente hidratados e dispersos em água até sua total solubilização. Neste momento, as soluções aquosas dos polímeros foram tituladas com solução de NaOH 0.2 N na presença de fenolftaleína, usada como indicador. A titulação foi usada para medir a porcentagem dos grupos carboxílicos (-COOH) livres. A diminuição dos grupos carboxílicos livres nos ésteres de conjugados de polímeros em comparação com polímeros PVM/MA não modificados evidenciou a ligação da molécula. Cromatografia de exclusão de tamanhos - Espalhamento de luz a laser multi-ângulo (SEC-MALLS): A técnica SEC-MALLS é a chave para determinar a massa molecular de um polímero em solução. Esta técnica utiliza uma curva de calibração de tempos de eluição contra a massa molar nas colunas de exclusão de tamanhos e uma única medida de um polímero permite conhecer seu peso molecular. Espalhamento de luz dinâmica (DLS): Esta técnica fornece o raio hidrodinâmico (Rh) dos polímeros, fornecendo uma estimativa da conformação mais provável do polímero na solução. As medidas de DLS foram realizadas em um ângulo de espalhamento de 90° usando um espectrômetro de correlação de fóton DynaPro-MS/X equipado com um correlator multi-tau de 248-canais e uma unidade de temperatura de efeito Peltier (Protein Solutions Inc, USA). O comprimento de onda do laser foi de 852.2 nm a 100 % de intensidade. Os polímeros conjugados foram medidos a 25 °C usando tetrahidrofurano como solvente. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (1H- RMN) : O espectro de 1H-RMN foi gravado em um aparelho Bruker Avance 400 de 400 MHz (Bruker, USA) usando um programa de pulso zg30 e um tempo de espera entre pulsos (D0) de 1 segundo. Ésteres de conjugados de polímeros pré- formados foram dissolvidos em acetona deuterada (acetona- d6), como solvente.
Resultados
[159] O estudo de espectroscopia infravermelha de ésteres de conjugados de polímeros pré formados mostrou a formação de uma nova ligação a ~ 1705 cm-1 associado ao alongamento do novo grupo carbonila do éster v (C=O) originado como o resultado da reação da hidroxila dos PEGs ou mPEG com os grupos anidrido do PVM/MA, vide Figura 1.
[160] Uma vez que foi evidenciado por IV que a ligação tinha se desenvolvido entre o polímero e a molécula com hidroxila terminal, estudos adicionais para evidenciar a modificação do polímero foram realizados.
[161] A Tabela 1 resume a composição de carbono (C), hidrogênio (H) e oxigênio (O) determinada para o polímero PVM/MA original e seus ésteres de conjugados de polímeros. A análise elementar mostrou uma diminuição no % C e um aumento no % O, confirmando uma mudança marcada na composição de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA quando comparado ao PVM/MA não modificado, sendo a proporção de C para O (proporção C/O) inferior para os ésteres de conjugados de polímeros do que para o copolímero original. Tabela 1. Análise elementar do PVM/MA e seus ésteres de conjugados de polímeros.
[162] Por outro lado, a titulação confirmou uma redução na quantidade de grupos -COOH livres, devido à ocupação do anel do anidrido pela ligação com a molécula com hidroxila terminal (PEG ou mPEG) (tabela 2). Tabela 2. Titulação do PVM/MA e seus ésteres de conjugados de polímeros.
[163] O DLS mostrou os valores de raio hidrodinâmico de PVM/MA e de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com PEGs ou mPEG. Em todos os casos, o raio hidrodinâmico aumenta em relação ao PVM/MA inicial, exceto para o conjugado PVM/MA - metoxi polietileno glicol 2,000, que apresenta um valor levemente inferior porém bastante similar ao valor comparado ao polímero PVM/MA não modificado (tabela 3). Isto poderia indicar uma mudança na conformação molecular quando os conjugados de polímeros são dissolvidos em um solvente orgânico. A ausência de átomos de hidrogênio no grupo metoxi nas moléculas de mPEG iria promover o dobramento da molécula em um grau inferior quando os grupos hidroxila estão presentes nas moléculas de PEG. Tabela 3. Determinação do raio hidrodinâmico (Rh) de PVM/MA e seus ésteres de conjugados usando DLS.
[164] Por fim, o espectro de 1H-RMN dos ésteres de conjugados de polímeros mostrou, em todos os casos, a presença de uma modificação química correspondente a unidades de poli(etileno) -O-CH2-CH2- nas moléculas (PEG ou mPEG) (Figura 2).
[165] A fim de estimar o percentual de moléculas com hidroxila terminal nos ésteres de conjugados de polímeros resultantes (DS), a razão entre a área do pico associada aos prótons “a” na molécula de PVM/MA (vide Figura 2A) e a área de uma característica do pico da molécula com hidroxila terminal (nova modificação química no conjugado de polímero de éster destacado nas Figuras 2B-2E) foi calculada.
[166] Com estes resultados, o peso molecular médio (Mw) dos conjugados resultantes foi também estimado, considerando 95.5 kDa do peso molecular de Gantrez® AN 119, como calculado por SEC-MALLS (tabela 4). Tabela 4. Peso molecular estimado (Mw) e grau de substituição (DS) para os diferentes conjugados testados calculados por 1H-RMN. (*) Peso molecular obtido por SEC/MALLS
[167] Uma vez que os ésteres de conjugados de polímeros foram purificados e caracterizados, o preparo das nanopartículas foi realizado e o estudo de suas propriedades foi também executado.
EXEMPLO 4 Preparo de nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA Preparo de nanopartículas vazias compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA (PEG conj ou mPEG conj)
[168] O preparo das nanopartículas foi realizado como se segue. 100 mg de polímeros de éster de PVM/MA pré- formados conjugados com polietileno glicol 2,000, polietileno glicol 6,000, polietileno glicol 10,000 [proporções PEG2:(PVM/MA), PEG6:(PVM/MA) e PEG10:(PVM/MA) usadas foram 1:20] ou metoxi polietileno glicol 2,000 [proporção mPEG2:(PVM/MA) foi de 1:5] foram dissolvidos em 5 mL de acetona e dissolvidos pela adição de 10 mL da mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 1 % (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8 % (p/v) sob agitação magnética à temperatura ambiente. Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). As suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificados por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. A etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Neste sentido, nanopartículas pré formadas não carregadas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com PEG2, PEG6, PEG10 ou mPEG2 foram obtidas: formulações PEG2 conj, PEG6 conj, PEG10 conj e mPEG2 conj, respectivamente.
Preparo das nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 que encapsulam paclitaxel (mPEG2- PTX conj)
[169] 100 mg de conjugado pré-formado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 [mPEG2:(PVM/MA) na proporção de 1:5] foram dissolvidos em 4 mL de acetona. Em paralelo, 10 mg de paclitaxel foram dispersos em 1 mL de acetona. A solução do conjugado e a dispersão de paclitaxel foram misturados sob agitação magnética à temperatura ambiente e, em seguida, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL da mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 1% (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8% (p/v). Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). As suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificadas por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. A etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Estas são formulações de nanopartículas de mPEG2-PTX conj.
Preparo de nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 que encapsulam paclitaxel (PEG2-PTX conj)
[170] 100 mg de conjugado pré-formado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 [PEG2:(PVM/MA) proporção de 1:20] foram dissolvidos em 4 mL de acetona. Em paralelo, 10 mg de paclitaxel foram dispersos em 1 mL de acetona. A solução do conjugado e a dispersão de paclitaxel foram misturados sob agitação magnética à temperatura ambiente e, em seguida, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL da mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 1 % (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8 % (p/v). Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). A suspensão resultantes foram filtrados através de uma membrana de 0.45 μm e purificado por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. A etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Estas são formulações de nanopartículas de PEG2-PTX conj.
Preparo de nanopartículas compreendendo a matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 que encapsulam docetaxel (mPEG2- DTX conj)
[171] 100 mg de conjugado pré-formado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 [mPEG2:(PVM/MA) proporção de 1:5] foram dissolvidos em 4 mL de acetona. Em paralelo, 10 mg de docetaxel foram dispersos em 1 mL de acetona. A solução do conjugado e a dispersão de docetaxel foram misturadas sob agitação magnética à temperatura ambiente e, em seguida, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL da mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 1 % (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8 % (p/v). Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). As suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificadas por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. A etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Estas são formulações de nanopartículas de mPEG2-DTX conj.
Preparo de nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 que encapsulam docetaxel (PEG2- DTX conj)
[172] 100 mg de conjugado pré-formado de polímero de éster de PVM/MA com polietileno glicol 2,000 [PEG2:(PVM/MA) na proporção de 1:20] foram dissolvidos em 4 mL de acetona. Em paralelo, 10 mg de docetaxel foram dispersos em 1 mL de acetona. A solução do conjugado e a dispersão de docetaxel foram, em seguida, misturadas sob agitação magnética a temperatura ambiente e as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 mL de uma mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 1 % (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8 % (p/v). Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça). As suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificadas por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. A etapa de purificação foi repetida duas vezes. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Estas são formulações de nanopartículas de PEG2-DTX conj.
Preparo de nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 que encapsulam camptotecina (mPEG2-CPT conj)
[173] 100 mg de conjugado pré-formado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 [mPEG2:(PVM/MA) na proporção de 1:5] foram dissolvidos em 4 mL de acetona. Em paralelo, 3 mg de camptotecina foram dispersos em 1 mL de acetona e sonicados por 30 segundos. A solução do conjugado e a dispersão de camptotecina foram misturados sob agitação magnética à temperatura ambiente e, em seguida, as nanopartículas foram formadas pela adição de 10 ml de uma mistura hidro alcoólica 1:1 (v/v) (água / etanol) contendo 3% (v/v) de uma solução aquosa de CaCl2 0.8% (p/v). Após a eliminação do solvente orgânico sob pressão reduzida (Büchi R210, Suíça), as suspensões resultantes foram filtradas através de uma membrana de 0.45 μm e purificadas por centrifugação (Sigma 3 K30, Alemanha) a 17,000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram ressuspendidos em água. Por fim, as formulações foram congeladas e secadas por congelamento (Genesis 12EL, Virtis, USA) usando sacarose (5 % p/v) como crioprotetor. Estas são formulações de nanopartículas de mPEG2-CPT conj.
EXEMPLO 5 Caracterização físico-química das nanopartículas
[174] A fim de executar esses estudos, as formulações de nanopartículas descritas no Exemplos 1, 2 e 4 foram usadas.
Materiais e Métodos
[175] O diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartículas e o potencial zeta foram determinados por espectroscopia de correlação de fóton (PCS) e anemometria eletroforética a laser Doppler, respectivamente, usando um sistema analisador de tamanho zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA). O diâmetro das nanopartículas for determinado após a dispersão em água ultrapura (1:10) e medido a 25 °C pelo ângulo de espalhamento de luz dinâmica de 90 °C. O potencial zeta foi determinado no mesmo equipamento como segue: 200 μL das mesmas amostras foram diluídas em 2 mL de uma solução de KCl 0.1 mM.
[176] O estudo da morfologia da superfície das formulações foi também realizado por microscopia eletrônica de varredura(SEM) em um microscópio eletrônico de varredura digital Zeiss DSM940 (Oberkochen, Alemanha) acoplado com um sistema de imagem digital (Point Electronic GmBh, Alemanha). Previamente, as nanopartículas foram diluídas com água deionizada e centrifugadas a 17,000 rpm (Sigma 3 K30, Alemanha) por 20 min a 4 °C. Os péletes foram secados e sombreados com uma camada de ouro de 9 nm em um aparelho de revestimento a quente Emitech K 550 (Ahsford, UK). Por fim, o rendimento da formação das nanopartículas foi calculado por gravimetria da diferença entre a quantidade inicial do polímero usado para preparar as nanopartículas e o peso das amostras secadas por congelamento. Rendimento (%) = (NP final / polímero inicial) x 100
Teor de Paclitaxel das nanopartículas
[177] A quantidade de paclitaxel carregada nas nanopartículas foi quantificada por HPLC-UV em um detector de ensaio em diodos da série Agilent modelo 1200 LC definido a 228 nm. O sistema de cromatografia foi equipado com uma coluna de fase reversa de 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini (tamanho de partícula de 5 μm) e uma pré- coluna (Phenomenex Security Guard C18). A fase móvel, bombeada a 0.5 mL / min, foi uma mistura de tampão fosfato (0.01 M, pH 2) e acetonitrila (50:50, v/v). A coluna foi definida a 30 oC e o volume de injeção foi de 100 μL. O docetaxel foi usado como padrão interno. As curvas de calibração foram projetadas sobre a faixa de 80 e 7000 ng/mL (r2 > 0.999) . O limite de quantificação foi calculado para ser 40 ng/mL. Para a análise, as nanopartículas foram solubilizadas com acetonitrila (1:5 v/v). As amostras foram transferidas em frascos de auto-amostrador, cobertas e posicionadas no auto-amostrador HPLC. Cada amostra foi ensaiada em triplicata e os resultados foram expressos como uma quantidade de paclitaxel (em μg) per mg de nanopartículas.
Teor de docetaxel das nanopartículas
[178] A quantidade de docetaxel carregada nas nanopartículas foi quantificada por HPLC-UV em um detector de ensaio em diodos da série Agilent modelo 1200 LC definido a 228 nm. O sistema cromatográfico foi equipado com uma coluna de fase reversa de Phenomenex Gemini 150 mm x 3 mm C18 (tamanho de partícula 5 μm) e uma pré-coluna (Phenomenex Security Guard C18). A fase móvel, bombeada a 0.5 mL / min, foi uma mistura de tampão fosfato (0.01 M, pH 2) e acetonitrila (50:50, v/v). A coluna foi posicionada a 30 oC e o volume de injeção foi de 100 μL. O paclitaxel foi usado como padrão interno. As curvas de calibração foram projetadas ao longo da faixa de 1.25 e 320 μg/mL (r2 > 0.999). O limite de quantificação foi calculado para ser 60 ng/mL. Para a análise, as nanopartículas foram solubilizadas com acetonitrila (1:8 v/v). As amostras foram transferidas para dentro de frascos de auto-amostrador, cobertas e posicionadas no auto-amostrador do HPLC. Cada amostra foi testada em triplicata e os resultados foram expressos como uma quantidade de docetaxel (em μg) por mg de nanopartículas.
Teor de camptotecina das nanopartículas
[179] A quantidade de camptotecina carregada nas nanopartículas foi quantificada por HPLC-FLD em um detector de fluorescência da série Agilent modelo 1100 LC definido a excitação e emissão de 380 e 418 nm, respectivamente. O sistema cromatográfico foi equipado com uma coluna de fase reversa de 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini (tamanho de partícula 5 μm) e uma pré coluna (Phenomenex SecurityGuard C18). A fase móvel, bombeada a 1 mL/min, consistiu em uma mistura 50:50 (v/v) de acetonitrila e ácido trifluoroacético 0.01 % (v/v). A coluna foi posicionada a 3 0 oC e o volume de injeção foi de 2 0 μL. As curvas de calibração foram projetadas ao longo da faixa de 0.48 e 8000 ng/mL (r2 > 0.999) . O limite de quantificação foi calculado para ser 1.3 ng/mL.
[180] Para a análise, as nanopartículas foram solubilizadas com acetonitrila (1:10, v/v). As amostras foram transferidas para dentro de frascos de auto- amostrador, cobertas e posicionadas no auto-amostrador do HPLC. Cada amostra foi testada em triplicata e os resultados foram expressos como uma quantidade de camptotecina (in μg) por mg de nanopartículas.
Resultados
[181] As principais características físico-químicas das diferentes formulações de nanopartícula não carregadas estão resumidas na 5. Tabela 5. Propriedades físico-químicas das nanopartículas sintetizadas com diferentes cargas de PVM/MA. Dados expressos como média ± DP (n = 3). * Teor de ligante (molécula com hidroxila terminal) nos conjugados de polímeros calculados por 1H-RMN.
[182] Pode ser notado que o teor da molécula com hidroxila terminal (ligante) nas nanopartículas de mPEG2- conj é significativamente mais alto se comparado ao resto dos conjugados de polímeros de nanopartículas. Isto é lógico devido ao fato de a quantidade inicial de mPEG2 usada para formar o conjugado de polímero de éster de PVM/MA ser muito mais em relação a PEG2, PEG6 ou PEG10.
Caracterização das nanopartículas carregadas com paclitaxel
[183] As principais características físico-químicas das diferentes formulações de nanopartícula carregadas com paclitaxel (PEG-PTX) estão resumidas na tabela 6. Em primeiro lugar, as nanopartículas contendo o PEG2 conjugado (conjugado de polímero de éster de PVM/MA com PEG2) mostrou tamanhos maiores do que as nanopartículas com mPEG2 conjugado (conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2). Para o conjugado PEG2, os tamanhos foram próximos a 400 nm enquanto para as outras formulações contendo mPEG2 conjugado, os tamanhos foram menores, em torno de 300 nm.
[184] Com relação ao potencial zeta, as nanopartículas carregadas contendo mPEG2 conjugado apresentaram uma carga de superfície levemente mais negativa, de cerca de -38 mV. As nanopartículas formuladas com conjugado de PEG2 mostraram uma carga de superfície de cerca de -33 mV.
[185] Além disso, o rendimento do processo foi calculado para ser de cerca de 70 % para ambas as formulações. Com foco na quantidade de PTX carregada nas nanopartículas, para conjugados de mPEG2 e PEG2, foi calculado para ser de cerca de 160 μg/mg de NP. Tabela 6. Caracterização físico-química das diferentes nanopartículas de PVM/MA. Dados expressos como média ± DP (n = 3).
[186] Se compararmos o rendimento das nanopartículas entre as formulações de PEG2-PTX trad e PEG2-PTX conj, a porcentagem de nanopartículas formada é maior quando se utiliza o conjugado de polímero de éster de PVM/MA com PEG2.
Caracterização das nanopartículas carregadas com docetaxel
[187] As nanopartículas de conjugado foram preparadas de forma bem sucedida pelo método de deslocamento de solvente. As principais características físico-químicas das diferentes formulações de nanopartícula carregadas com docetaxel (PEG-DTX) estão resumidas na tabela 7. Em primeiro lugar, as nanopartículas carregadas contendo o PEG2 conjugado (conjugado de polímero de éster de PVM/MA com PEG2) mostraram tamanhos maiores do que as nanopartículas carregadas com mPEG2 conjugado (conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2). Para o PEG2, os tamanhos foram próximos a 400 nm enquanto para as outras formulações contendo mPEG2, os tamanhos foram menores, em torno de 300 nm.
[188] Com relação ao potencial zeta, as nanopartículas contendo mPEG2 apresentaram uma carga de superfície levemente mais negativa, de cerca de -39 mV. As nanopartículas formuladas com PEG2 conjugado mostraram uma carga de superfície de cerca de -33 mV.
[189] Além disso, o rendimento do processo foi calculado para ser de cerca de 60 % para ambas as formulações. Com foco na quantidade de docetaxel carregada nas nanopartículas, para mPEG2 e PEG2 conjugado, foi calculado para ser de cerca de 100 μg/mg de NP. Tabela 7. Caracterização físico-química das diferentes nanopartículas de PVM/MA. Dados expressos como média ± DP (n = 3).
Caracterização das nanopartículas carregadas com camptotecina
[190] As características físico-químicas das nanopartículas contendo camptotecina resultantes estão resumidas na tabela 8. Quando as nanopartículas foram carregadas com camptotecina nas nanopartículas mPEG2 conj (conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2), o tamanho médio foi de aproximadamente 195 nm. O índice de poli dispersividade (PDI) foi menor do que 0.3, o qual implica em formulações homogêneas. Com relação ao potencial zeta das nanopartículas, as formulações foram formadas por partículas com carga de superfície negativa, de cerca de - 36 mV. Além disso, o rendimento do processo foi de aproximadamente 70 %. Com relação ao carregamento do fármaco, a quantidade de camptotecina encapsulada nas nanopartículas de conjugados alcançou 11 μg/mg. A quantidade de camptotecina carregada nas nanopartículas peguiladas tradicionais foi levemente mais alta para as PEG2-CPT tradicionais do que PEG6-CPT tradicionais, alcançando 9 μg/mg de nanopartículas. Tabela 8. Caracterização físico-química das diferentes nanopartículas. Dados expressos como média ± DP (n = 3).
[191] A análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (FIGURA 3) mostrou que todos os tipos de nanopartículas de poli (anidrido) consistiram de uma população homogênea de partículas esféricas de um tamanho similar àquele medido por espectroscopia de correlação de fóton. A superfície das nanopartículas pareceu ser lisa, sem áreas rugosas visíveis em sua superfície.
EXEMPLO 6 Estudos in vitro e in vivo de docetaxel Estudo de liberação de docetaxel in vitro
[192] Experimentos de liberação foram conduzidos, sob condições de dissipação, a 37 °C, usando fluidos gástrico (SGF; pH 1.2; pepsina 0.32 % p/v) e intestinal (SIF; pH 6.8; pancreatina 1 % p/v) simulados contendo 0.5 % de polisorbato 80 (Tween® 80) como agente solubilizante para o docetaxel. Os estudos foram realizados sob agitação em uma incubadora Vortemp 56TM Shaking (Labnet International Inc., NJ, USA) após a dispersão das nanopartículas no meio adequado.
[193] Para cada ponto no tempo, 50 μg de docetaxel formulados nas nanopartículas foram ressuspendidos em 2 mL do fluido simulado correspondente. As formulações testadas foram nanopartículas de DTX (nanopartículas de PVM/MA convencionais que encapsulam docetaxel), PEG2-DTX trad (nanopartículas tradicionais de PVM/MA peguiladas com PEG2 que encapsulam docetaxel), mPEG2-DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com mPEG2 que encapsulam docetaxel) e PEG2-DTX conj (nanopartículas de conjugado de polímero de éster de PVM/MA com PEG2 que encapsulam docetaxel).
[194] A concentração das nanopartículas no meio de liberação foi ajustado a fim de alcançar as condições de dissipação para o docetaxel. As diferentes formulações foram mantidas em SGF por 2 horas e por 12 horas em SIF. Em diferentes pontos no tempo, tubos de amostras foram coletados e centrifugados a 27,000xg for 20 minutos. Por fim, os sobrenadantes foram filtrados e a quantidade de docetaxel liberada das formulações foi quantificada por HPLC (curvas de calibração de docetaxel livre nos sobrenadantes obtidos em SGF e SIF, r2 > 0.999) . O perfil de liberação foi expresso em termos de porcentagem de liberação cumulativa e plotados ao longo do tempo.
Estudos de farmacocinética in vivo de nanopartículas que encapsulam docetaxel em camundongos Balb/c Administração de nanopartículas carregadas com DTX em camundongos
[195] Estudos de farmacocinética foram realizados em camundongos fêmeas Balb/c (20 - 22 g) obtidos de Harlan (Barcelona, Espanha). Os estudos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas de ética para investigações em animais de laboratório aprovado pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal da Instituição (número do protocolo E21-12) em acordo com a Legislação Europeia de experimentos animais (86/609/EU). Antes do experimento, os animais foram, de forma adaptativa, alimentados por 1 semana com acesso livre a comida e água potável (22 ± 2 °C; ciclos de luz por 12 horas e 12 horas de escuridão; umidade relativa de 50 - 60 %). Antes da administração oral das formulações, os animais ficaram em jejum ao longo da noite para evitar interferência com a absorção, permitindo livre acesso à água.
[196] Para o estudo de farmacocinética, os camundongos foram aleatoriamente divididos em grupos com base no tempo de amostragem de sangue. Cada ponto no tempo correspondeu a 3 animais. Os grupos experimentais foram de nanopartículas de DTX, PEG2-DTX trad, mPEG2-DTX conj e PEG2-DTX conj. Como controles, um grupo de animais recebeu Taxotere® por via intravenosa (IV) e outro grupo foi tratado com a formulação comercial de forma oral. Cada animal recebeu uma quantidade equivalente de docetaxel a uma dosagem de 30 mg/kg de peso corporal, tanto de forma oral com uma agulha sem ponta por meio do esôfago até o estômago ou por via intravenosa pela veia caudal.
[197] Amostras de sangue foram coletadas em tempos definidos após a administração (0, 10 min, 30 min, 1 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 8 h, 24 h, 48 h e 72 h). O EDTA foi usado como agente anticoagulante. O volume de sangue foi recuperado intraperitonealmente com um igual volume de solução salina normal pré-aquecida na temperatura corporal. As amostras foram imediatamente posicionadas no gelo e centrifugadas em 2,500xg por 10 minutos. O plasma foi separado em tubos limpos e mantido congelado a -20 °C até a análise por HPLC.
Quantificação de DTX em amostras de plasma por HPLC
[198] A quantidade de docetaxel foi determinada no plasma por HPLC-UV. As curvas de calibração foram usadas para a conversão da área cromatográfica de DTX / PTX para a concentração. O calibrador e as amostras de controle de qualidade foram preparadas pela adição de volumes adequados de docetaxel padrão em solução de etanol para o plasma livre de fármaco. As curvas de calibração foram projetadas ao longo da faixa de 100 a 6250 ng/mL (r2 > 0.999). Uma alíquota (200 μL) de plasma foi misturada com 25 μL de solução de padrão interno (paclitaxel, 10 μg/mL em etanol, previamente evaporado). Após mistura por vórtex, a extração líquido-líquido foi alcançada pela adição de 4 mL de terc- butil metil éter seguida de agitação leve por vórtex (1 min). A mistura foi centrifugada por 10 min a 3000xg e, em seguida, a camada orgânica foi transferida para um tubo limpo e evaporada até a secagem (Savant, Barcelona, Espanha). Por fim, o resíduo foi dissolvido em 125 μL de solução de reconstituição (acetonitrila - tampão fosfato 0.01 M pH = 2; 50:50, v/v) e transferido para frascos de auto-amostrador, cobertos e posicionados no auto-amostrador do HPLC. Uma alíquota de 100 μL de cada amostra foi injetada na coluna do HPLC.
Análise dos dados de farmacocinética
[199] A análise farmacocinética da concentração plasmática plotada ao longo dos dados do tempo, obtida após a administração das diferentes formulações de DTX, foi analisada usando um modelo não compartimental com o software WinNonlin 5.2 (Pharsight Corporation, USA). Os seguintes parâmetros foram estimados: concentração plasmática máxima (Cmax), tempo no qual a concentração máxima é alcançada (Tmax), área sob a curva de concentração x tempo do tempo 0 a “ (AUC) , tempo de residência médio (MRT), clearance (Cl), volume de distribuição (V) e meia vida na fase terminal (t1/2z).
[200] Além disso, a biodisponibilidade oral relativa, F (%), do docetaxel foi estimada pela seguinte equação: em que a AUC IV e a AUC oral corresponderam às áreas sob a curva para a administração intravenosa e oral, respectivamente.
Análise estatística
[201] Os dados são expressos como média ± DP de pelo menos três experimentos. O teste não paramétrico Kruskall- Wallis seguido pelo U-teste de Mann-Whitney foi usado para investigar diferenças estatísticas. Em todos os casos, p < 0.05 foi considerado como estatisticamente significativo. Todo o processamento dos dados foi realizado usando o programa de software estatístico GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, CA, USA).
Resultados Estudo de liberação de docetaxel in vitro
[202] O perfil de liberação das formulações de nanopartícula de docetaxel foi avaliado após a incubação em dois meios diferentes: fluidos gástrico e intestinal simulado contendo 0.5 % de Tween 80 (p/v) como agente solubilizante. A FIGURA 4 ilustra o perfil de liberação das formulações de nanopartículas de docetaxel DTX, PEG2-DTX trad, PEG2-DTX conj e mPEG2-DTX conj como porcentagem cumulativa do fármaco liberado como uma função do tempo. Em todos os casos, quando as nanopartículas foram dispersas em SGF, nenhuma liberação de fármaco foi observada. Por outro lado, quando as nanopartículas foram dispersas em SIF, o docetaxel foi liberado.
[203] Para PEG2-DTX trad, o padrão de liberação em SIF foi caracterizado por um importante efeito de descarga de cerca de 75 % do fármaco carregado nos primeiros 30 min, seguido de uma fase de libertação mais sustentada por até 10 horas. Por outro lado, para as nanopartículas DTX, a curva de liberação do docetaxel em SIF exibiu uma descarga mais lenta de docetaxel do que as PEG2-DTX trad, seguida por uma liberação mais contínua até o final do estudo, no qual a maior parte da carga foi liberada.
[204] Ambas as formulações de nanopartícula PEG2-DTX conj e mPEG2-DTX conj mostraram um perfil de liberação similar. Na presença de SIF, a liberação de docetaxel exibiu um padrão de liberação bifásico caracterizado por uma descarga de liberação inicial rápida de até 90 % do fármaco carregado, seguida de uma fase de libertação mais sustentada. A liberação completa do DTX foi obtida para todas as amostras em 10-11 horas após o começo do estudo.
Estudos de farmacocinética das nanopartículas contendo docetaxel em camundongos Balb/c
[205] O perfil de concentração plasmática x tempo do docetaxel após a administração IV do Taxotere® (única de 30 mg/Kg) em camundongos fêmea Balb/c é mostrado na FIGURA 5. A concentração plasmática do fármaco rapidamente diminuiu com o tempo de forma bifásica e os dados foram ajustados para um modelo não compartimental. Os níveis de docetaxel no plasma foram quantificáveis por até 12 horas após a administração.
[206] A FIGURA 6 mostra os perfis de concentração plasmática versus tempo após a administração oral do docetaxel (única dosagem de 30 mg/kg) em camundongos Balb/c quando administrada como o Taxotere® comercial ou encapsulada nas diferentes formulações de nanopartícula de poli (anidrido): em nanopartículas de PVM/MA convencionais (formulação DTX), nanopartículas de PVM/MA tradicionais peguiladas com PEG2 (PEG2-DTX trad) ou nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com PEG2 (PEG2-DTX conj) ou com mPEG2 (mPEG2-DTX conj). Quando o Taxotere® comercial foi administrado aos camundongos por via oral, os níveis de no plasma mostraram-se sempre abaixo do limite de quantificação da técnica cromatográfica analítica. Pelo contrário, quando o docetaxel foi carregado nas nanopartículas, estas formulações mostraram níveis plasmáticos sustentados. Em todos os casos, houve um aumento inicial rápido nos níveis plasmáticos do agente anticâncer pelas primeiras 1.5-2 horas, alcançando a Cmax, seguida pelo lento declínio o qual foi prolongado por pelo menos 8 horas para a formulação DTX (vide FIGURA 6A) e cerca de 70 horas para as formulações PEG2-DTX trad, PEG2- DTX conj e mPEG2-DTX conj (vide FIGURA 6B). Comparando PEG2-DTX trad com PEG2-DTX conj e mPEG2-DTX conj, os níveis plasmáticos de docetaxel alcançado com as nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com PEG2000 e mPEG2000 foram mais altos do que aqueles com nanopartículas PVM/MA tradicionais peguiladas com PEG2000.
[207] A Tabela 9 resume os parâmetros farmacocinéticos calculados com uma análise não compartimental dos dados experimentais obtidos após a administração das diferentes formulações de docetaxel a camundongos. Primeiramente, para a formulação comercial administrada por meio da via IV, o valor médio da AUC foi de 143 μg h/mL. A concentração máxima (Cmax) foi de 198 μg/mL e Tmax 0 h. O MRT foi de 1.4 h e a meia vida da fase terminal (t1/2z) da curva foi estimada para ser 1.5 h.
[208] Por outro lado, os valores de Cmax do docetaxel nas nanopartículas de poli (anidrido) foi entre 1.3 e 2 μg/ml, a ordem de classificação deste parâmetro sendo: mPEG2-DTX conj = PEG2-DTX conj > PEG2-DTX trad > DTX. Além disso, a Cmax foi alcançada a 0 h após a administração IV de Taxotere® e ele foi retardado para 0.8 h para a formulação DTX e 1.5 -2 h para as formulações mPEG2-DTX conj e PEG2- DTX conj.
[209] Comparando as formulações de PEG tradicional e conjugado, para a PEG2-DTX conj e mPEG2-DTX conj, os valores da AUC foram de 1.3 e 1.8 vezes, respectivamente, mais altos do que a AUC obtida para a PEG2-DTX trad, demonstrando uma capacidade mais alta para promover a absorção oral do taxano. Além disso, o tempo de residência médio (MRT) do fármaco no plasma e sua meia vida da fase terminal (t1/2z) foram grandemente estendidos quando administrada nas formulações de conjugado de polímero de éster (mPEG2-DTX conj, PEG2-DTX conj) pela via oral. Tabela 9. Parâmetros farmacocinéticos do docetaxel obtido após a administração intravenosa e oral do Taxotere® comercial e formulado em diferentes nanopartículas em uma única dosagem de 30 mg/kg a camundongos fêmeas Balb/c. Dados expressos como média ± DP (n = 3) AUC: área sob a curva de concentração x tempo do time 0 a ∞; Cmax: pico de concentração plasmática; Tmax: tempo no pico de concentração plasmática; t1/2z: meia vida da fase terminal; Cl: clearance; V: volume de distribuição; MRT: tempo de residência médio; Fr: biodisponibilidade oral relativa. N.D.: não detectado.
[210] Da mesma forma, o volume de distribuição (V) do fármaco anticancerígeno, quando carregado nas nanopartículas de conjugado (225 mL para PEG2-DTX conj e 240 mL para mPEG2-DTX conj) foi mais alto do que quando o fármaco foi administrada por via IV na forma de Taxotere® (8 mL), e mais alto do que quando o fármaco foi administrado de forma oral encapsulado em nanopartículas de PVM/MA convencionais (15 mL) ou nanopartículas de PVM/MA peguiladas tradicionais (192 mL). Por outro lado, o clearance do docetaxel foi sempre similar e independente em ambas as formulações e a via de administração utilizada.
[211] Por fim, a biodisponibilidade relativa oral de docetaxel liberada em nanopartículas peguiladas tradicionais (PEG2-DTX trad) foi calculado para ser de cerca de 32 %. Para as nanopartículas não peguiladas, a biodisponibilidade oral mostrou-se ser de apenas 5 %. Para as formulações de conjugado, os dados obtidos foram altos, variando de 40 a 57 % para PEG2-DTX conj e mPEG2-DTX conj. De forma surpreendente, as formulações preparadas de ésteres de conjugados de polímeros melhorou a biodisponibilidade oral relativa do docetaxel.
[212] Em resumo, as formulações de nanopartículas de PEG tradicional e conjugado foram capazes de carregar docetaxel, apresentando características adequadas para a sua administração oral. Quando administrada de forma oral, estas nanopartículas ofereceram níveis plasmáticos de docetaxel prolongados e sustentados por 3 dias. No entanto, para nanopartículas “nuas”, a concentração plasmática do docetaxel foi inicialmente alto, porém diminuiu rapidamente e níveis quantificáveis foram encontrados 12 h após a administração. Em adição, os estudos de farmacocinética revelaram uma capacidade mais alta capacidade dos nanocarreadores conjugado para melhorar a biodisponibilidade oral do docetaxel, especialmente para mPEG2-DTX conj, o qual alcançou uma biodisponibilidade oral próxima a 57 %, 1.8-vezes mais alto do que para as nanopartículas peguiladas tradicionais.
EXEMPLO 7 Estudo de camptotecina in vitro e in vivo Estudo de liberação de camptotecina in vitro
[213] Experimentos de liberação foram conduzidos sob condições de dissipação a 37 oC usando fluidos gástrico (SGF; pH 1.2; pepsina 0.32 % p/v) e intestinal (SIF; pH 6.8; pancreatina 1 % p/v) simulados. Os estudos foram realizados sob agitação em uma incubadora Vortemp 56TM Shaking (Labnet International Inc., NJ, USA) após a dispersão das nanopartículas em meio adequado.
[214] Para cada ponto no tempo, 0.8 μg de camptotecina formuladas como nanopartículas peguiladas de PVM/MA tradicionais com PEG2 (PEG2-CPT trad) ou PEG6 (PEG6-CPT trad) e em nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA com mPEG2 (mPEG2-CPT conj) foram ressuspendidas em 1 mL do fluido correspondente simulado. As diferentes formulações foram mantidas em SGF por 2 h e por 14 h em SIF. Em diferentes pontos, tubos simples foram coletados e centrifugados em Tubos Vivaspin (300,000 MWCO, Grupo Sartorius, Alemanha) a 3,000xg por 5 minutos. A quantidade de camptotecina liberada das formulações foi quantificada por HPLC (curvas de calibração de camptotecina livre no sobrenadante obtido de SGF e SIF, r2 > 0.999) .
Estudos in vivo de farmacocinética das nanopartículas que encapsulam camptotecina em ratos Wistar Administração de nanopartículas carregadas com camptotecina em ratos
[215] Estudos de farmacocinética foram realizados em ratos machos Wistar obtidos de Harlan (Barcelona, Espanha). Os estudos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas éticas para investigações em animais de laboratório aprovada pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal da Instituição (número de protocolo 058-12) de acordo com a legislação Europeia em experimentos com animais (86/609/EU).
[216] Antes do experimento, os animais foram, de forma adaptativa, alimentados por 1 semana com acesso livre a comida e água potável (22 ± 2 °C; ciclos de luz por 12 horas e 12 horas de escuridão; umidade relativa de 50 - 60 %). Antes da administração oral das formulações, os animais ficaram em jejum ao longo da noite para evitar interferência com a absorção, permitindo livre acesso à água.
[217] Para o estudo de farmacocinética, os ratos foram aleatoriamente divididos em 2 grupos (n = 6). Como controles, um grupo de animais recebeu uma dosagem de 1 mg/kg de suspensão de camptotecina de forma oral (com uma agulha sem ponta por meio do esôfago até o estômago) e outro grupo recebeu a suspensão de camptotecina de forma intravenosa (por meio da veia caudal). Os grupos experimentais receberam de forma oral a dosagem de camptotecina equivalente formuladas em nanopartículas mPEG2-CPT conj e PEG2-CPT trad.
[218] As amostras de sangue foram coletadas em tempos definidos após a administração (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30 e 48 h). O EDTA foi usado como agente anticoagulante. O volume de sangue foi recuperado intraperitonealmente com um volume igual de solução de salina normal pré-aquecida na temperatura corporal. As amostras foram imediatamente posicionadas no gelo e centrifugadas a 2,500xg por 10 minutos. O plasma foi separado em tubos limpos e mantidas congeladas a -20 oC até a análise por HPLC.
Quantificação de camptotecina nas amostras de plasma por HPLC
[219] A quantidade de camptotecina foi determinada no plasma por HPLC-FLD em um detector de fluorescência da série Agilent modelo 1100 LC definido a excitação e emissão de 380 e 418 nm, respectivamente. O sistema cromatográfico foi equipado com uma coluna de fase reversa 150 mm x 3 mm C18 Phenomenex Gemini (tamanho de partícula 5 μm) e pré- coluna (Phenomenex Security Guard C18). A fase móvel, bombeada a 1 mL/min, consistiu de uma mistura 50:50 (v/v) de acetonitrila e uma solução de ácido trifluoroacético 0.01 % (v/v). A coluna foi posicionada a 30 oC e o volume de injeção foi de 100 μL. Curvas de calibração e controles de qualidade foram projetados ao longo da faixa de 0.48 e 8000 ng/mL (r2 > 0.999) pela adição de volumes adequados de camptotecina padrão em dimetilsulfóxido / acetonitrila / ácido trifluoroacético 1:8.9:0.1 (v/v/v) para o plasma livre de fármaco.
[220] Uma alíquota (100 μL) de plasma foi misturada com 4 volumes de acetonitrila e misturada por vórtex por 2 minuto a fim de alcançar a precipitação das proteínas do plasma. Após a centrifugação (5000xg, 5 minutos), o sobrenadante foi coletado e evaporado até a secagem (Savant, Barcelona, Espanha). Por fim, o resíduo foi dissolvido em 120 μL de solução de reconstituição com dimetilsulfóxido / acetonitrila / ácido trifluoroacético 1:8.9:0.1 (v/v/v) e transferido para frascos de auto- amostrador, cobertos e posicionados no auto-amostrador do HPLC. O limite de quantificação foi calculado para ser 2.6 ng/mL com um desvio padrão relativo de 4.6 %.
Análise dos dados farmacocinéticos
[221] A análise farmacocinética da concentração plasmática plotada ao longo dos dados do tempo, obtidos após a administração das diferentes formulações de camptotecina, foi analisada usando um modelo não compartimental com o software WinNonlin 5.2 (Pharsight Corporation, USA). Os parâmetros que seguem foram estimados: concentração plasmática máxima (Cmax), tempo no qual a concentração máxima é alcançada (Tmax), área sob a curva concentração x tempo do tempo 0 a w (AUC) , tempo de residência médio (MRT), clearance (Cl), volume de distribuição (V) e meia vida na fase terminal (t1/2z).
[222] Além disso, a biodisponibilidade oral relativa, Fr, de camptotecina foi expressa como a proporção entre a área sob a curva concentração x tempo do tempo 0 a w (AUC) das formulações testadas e aquela da suspensão oral de CPT administrada.
Análise estatística
[223] Para as caracterizações físico-químicas e farmacêuticas das formulações, os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três experimentos.
[224] Os parâmetros de farmacocinética in vivo foram analisados estatisticamente. O teste não paramétrico Kruskall-Wallis seguido pelo U-teste de Mann-Whitney foi usado para investigar diferenças estatísticas. Em todos os casos, os p-valores menores do que 0.05 foram considerados como diferença estatisticamente significativa. Todos os dados de processamento foram realizados usando o software estatístico GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, USA).
Resultados Estudo de liberação de camptotecina in vitro
[225] A cinética de liberação das nanopartículas de camptotecina foi avaliada em fluidos gástrico e intestinal simulados (contendo polisorbato 80 como agente solubilizante para a camptotecina) (FIGURA 7). Este padrão foi caracterizado por uma primeira etapa de não liberação quando as nanopartículas foram dispersas em SGF e uma etapa de liberação (quando as nanopartículas foram dispersas em SIF), na qual o fármaco foi inicialmente liberado de forma rápida seguida de uma fase de libertação mais sustentada. Para as nanopartículas peguiladas tradicionais (PEG2-CPT trad e PEG6-CPT trad), esta liberação mais rápida teve efeito nas primeiras 5 horas (após a incubação em SIF) e a última etapa de liberação sustentada levou 11 horas até que as nanopartículas completassem a liberação de 100 % de sua carga. A cinética de liberação da camptotecina das mPEG2- CPT conj mostrou um perfil de liberação que pode ser dividido em três diferentes fases. Na primeira, quando as nanopartículas foram dispersas em SGF durante as primeiras 2 h, a quantidade de camptotecina liberada foi muito baixa (cerca de 10 %). Em seguida, quando as nanopartículas foram deslocadas para o SIF, um efeito de liberação disparada foi observado. Dessa forma, cerca de 90 % do fármaco inicialmente carregado foi bruscamente liberado da formulação de nanopartículas. Por fim, a Terceira etapa foi caracterizada pela liberação lenta e sustentada do fármaco remanescente que foi completamente liberado dentro das próximas 12 horas de experimento (14 horas após o começo do estudo).
Estudos de farmacocinética de nanopartículas contendo camptotecina em ratos Wistar
[226] O perfil de concentração plasmática x tempo da camptotecina após uma única administração intravenosa em uma dosagem de 1 mg/kg é mostrado na FIGURA 8. A camptotecina foi administrada como uma suspensão com um tamanho de partícula de 1,500 ± 144 nm e um PDI de 0.44 ± 0.05. Os dados foram analisados por um modelo não compartimental. A concentração plasmática de camptotecina diminuiu rapidamente após a administração, não sendo detectável 6 horas após a administração. Após a administração, a concentração plasmática do fármaco alcançou 430 ng/mL (Cmax) e os valores da AUC e t1/2z foram 0.39 μg h/mL e 0.69 horas, respectivamente. O clearance e o volume de distribuição do fármaco foram calculados para ser 755 mL/h e 683 mL, respectivamente (Tabela 10).
[227] A FIGURA 9 mostra os perfis de concentração plasmática de camptotecina após a administração de uma única dosagem oral (1 mg/kg) em ratos Wistar machos, tanto em suspensão quanto em nanopartículas carregadas. Quando a suspensão do fármaco foi administrada de forma oral, os níveis plasmáticos aumentaram rapidamente, alcançando a Cmax 30 minutos após a administração. Em seguida, níveis plasmáticos sustentados do fármaco foram mantidos por pelo menos 4 horas e, por fim, os níveis de camptotecina diminuíram rapidamente. Dessa forma, 10 horas após a administração, níveis não detectáveis de camptotecina no plasma foi observado.
[228] Para a camptotecina carregada em nanopartículas e administrada na mesma dosagem (1 mg/kg), a principal diferença em relação a formulação de suspensão aquosa foi que os níveis de fármaco foram quantificados no plasma por um intervalo de tempo mais longo. Dessa forma, os animais que receberam a camptotecina inclusa em nanopartículas peguiladas tradicionais (PEG2-CPT trad) mostraram uma primeira fase caracterizada pelo aumento dos níveis de fármaco no plasma para as primeiras 1.5 horas, seguida de um fase de decréscimo baixa e prolongada com níveis quantificáveis de camptotecina até 24 horas. A AUC mostrou- se cerca de 2 vezes mais alta do que quando o fármaco foi administrado de forma oral como uma suspensão. Além disso, embora nenhuma diferença estatística tenha sido encontrada, o volume de distribuição do fármaco quando administrado nestas nanopartículas peguiladas foi 1.5 vezes aquele do fármaco vazio administrado de forma oral como uma suspensão.
[229] Para as nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA (mPEG2-CPT conj) administradas na mesma dosagem (1 mg/kg), o perfil inicial da curva plasmática foi bastante similar; no entanto, a quantidade quantificada de fármaco foi mais alta do que para a formulação convencional e, mais importante, os níveis de plasma foram sustentados ao longo do tempo até 48 h após a administração. Em geral, os níveis de camptotecina obtidos no plasma após a administração oral de mPEG2-CPT conj foram mais altos do que para a suspensão aquosa e para nanopartículas peguiladas tradicionais (PEG2-CPT trad), sendo a AUC 7.6 vezes e 4.2 vezes mais alta, respectivamente.
[230] A Tabela 10 resume os principais parâmetros farmacocinéticos estimados com uma análise não compartimental dos dados experimentais obtidos após a administração das diferentes formulações aos ratos. Para mPEG2-CPT conj, a AUC da camptotecina mostrou-se significativamente mais alta (p < 0.05) do que para a suspensão aquosa do fármaco. Outra diferença entre as nanopartículas e a suspensão foi o tempo médio de residência do fármaco (MRT). Neste caso, o MRT foi significativamente diferente (p < 0.01) entre o fármaco vazio e mPEG2-CPT conj (10 vezes mais alto) porém nenhuma diferença significativa foi encontrada entre o controle e PEG2-CPT trad. De forma similar, a meia vida do fase terminal da curva (t1/2z) foi também significativamente mais alta quando a camptotecina foi encapsulada em mPEG2-CPT conj do que quando formulada como uma suspensão tradicional, porém não quando formulada em PEG2-CPT trad. De acordo com este resultado, o clearance do fármaco, quando administrado em mPEG2-CPT conj, foi cerca de 11 vezes mais baixo do que o valor obtido quando administrado como uma suspensão (p < 0.01). Da mesma forma, quando a formulação mPEG2-CPT conj foi comparada ao PEG2-CPT trad, a AUC foi descoberta por ser significativamente mais alta (p < 0.05), e significâncias estatística foram ainda descobertas em relação a MRT e t1/2z (p < 0.01). Tabela 10. Parâmetros farmacocinéticos estimados após uma única dosagem oral de 1 mg/kg de suspensão de CPT, PEG2-CPT trad e mPEG2-CPT conj. Dados expressos como média (± DP) (n = 6) † Teste U de Mann-Whitney mPEG2-CPT conj vs PEG2-CPT trad (p-valor < 0.05). †† Teste U de Mann-Whitney mPEG2-CPT conj vs PEG2-CPT trad (p-valor < 0.01). * Teste U de Mann-Whitney mPEG2-CPT conj vs suspensão oral de camptotecina (p-valor < 0.05). ** Teste U de Mann-Whitney mPEG2-CPT conj vs suspensão oral de camptotecina (p-valor < 0.01). AUC: área sob a curva de concentração x tempo, do tempo 0 ao TC; Cmax: pico de concentração plasmática; Tmax: tempo no pico de concentração plasmática; t1/2z: meia-vida da fase terminal; Cl: clearance; V: volume de distribuição; MRT: tempo de residência média; Fr: biodisponibilidade oral relativa.
[231] Em resumo, ambos os tipos de nanopartículas (PEG2-CPT trad e mPEG2-CPT conj) que encapsulam camptotecina pareceram ser adequadas para a administração oral no ensaio in vitro, dado que nenhuma liberação de fármaco foi observada até que os mesmos estivessem incubados sob condições intestinal. No entanto, no ensaio in vivo, mPEG2-CPT conj mostrou uma biodisponibilidade notavelmente mais alta, 4.3 vezes daquela de PEG2-CPT trad.
EXEMPLO 8 Estudos de biodistribuição de nanopartículas
[232] A fim de visualizar e avaliar a distribuição e a capacidade das nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA para interagir com a mucosa do intestino, estudos de microscopia de fluorescência foram realizados.
Preparo de nanopartículas carregadas com lumogen
[233] As nanopartículas de PVM/MA convencionais vazias e as nanopartículas compreendendo uma matriz de um conjugado de polímero de éster de PVM/MA com metoxi polietileno glicol 2,000 (mPEG2 conj) forma marcadas de forma fluorescente com lumogen vermelho.
[234] Nanopartículas carregadas com Lumogen foram preparadas pela adição de 0.5 mg de Lumogen® vermelho na fase de acetona (5 mL) contendo o PVM/MA (Gantrez® AN) ou seu conjugado de polímero de éster com mPEG2 (mPEG2-LUM conj) antes da formação das nanopartículas como descrito nos exemplos 1 e 4. As formulações LUM e mPEG2-LUM conj foram respectivamente obtidas.
Estudos de distribuição in vivo de nanopartículas carregadas com lumogen na mucosa do intestino em ratos Wistar
[235] Estudos de biodistribuição foram realizados usando nanopartículas marcadas de forma fluorescente que encapsulam lumogen vermelho.
[236] Experimentos animais foram realizados seguindo um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética e Biossegurança da Instituição em acordo com a Legislação Europeia de experimentos animais (número do protocolo 059-13). Uma única dosagem de 1 mL de uma suspensão aquosa contendo 10 mg de nanopartículas marcadas de forma fluorescente foi oralmente administrada a ratos Wistar machos. Duas horas depois, os animais foram sacrificados e os intestinos foram removidos. Porções de 1 cm do íleo foram coletadas, armazenadas no meio de procedimentos com tecidos Tissue- Tek® OCT e congelados a -80 °C. Cada porção foi, em seguida, cortadas em seções de 5 μm em um criostato e colocadas em lâminas de vidro. Por fim, estas amostras foram fixadas com formaldeído e incubadas com DAPI (4’,6- diamidino-2-fenilindol) por 15 minutos antes do conjunto de cobertura.
[237] A presença de nanopartículas carregadas com fluorescência na mucosa intestinal foi visualizada em um microscópio de fluorescência (Axioimager M1, Zeiss) com uma câmera acoplada (Axiocam ICc3, Zeiss) e fonte fluorescente (HBO 100, Zeiss).
Resultados
[238] Nanopartículas carregadas com Lumogen exibiram propriedades físico-químicas similares àquelas determinadas para as nanopartículas vazias: 215 nm, -36 mV para nanopartículas LUM e 205 nm, -35 mV para formulações mPEG2- LUM conj.
[239] De forma surpreendente, as nanopartículas mPEG2-LUM conj exibiram uma diferente distribuição dentro da mucosa do íleo do que as nanopartículas LUM. As nanopartículas de PVM/MA convencionais parecem ficar presas na camada de muco que cobre o epitélio intestinal (FIGURA 10A, 10B), em que as nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros de PVM/MA foram capazes de atravessar a camada de muco e interagir de maneira mais íntima com a superfície dos enterócitos (FIGURA 10C, 10D). Esta descoberta confirma que a superfície de nanopartículas de ésteres de conjugados de polímeros são diferentes daquelas de PVM/MA originais. É possível que, hipoteticamente, durante a formação das nanopartículas, as áreas hidrofílicas dos conjugados seriam orientadas através da fase aquosa formando uma coroa hidrofílica na superfície das nanopartículas, a qual poderia conferir propriedades “escorregadias” às nanopartículas resultantes e, dessa forma, a capacidade de cruzar a camada de muco e alcançar a superfície dos enterócitos.

Claims (17)

1. Processo para a produção de uma nanopartícula, o referido processo CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: a) misturar um conjugado de polímero de éster com um composto biologicamente ativo em um meio orgânico, e b) dissolver o conjugado de polímero de éster por meio da adição de álcool e água, na presença de um metal divalente, em que o conjugado de polímero de éster é um conjugado de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionada a partir de polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a etapa (b) ser realizada por meio da adição de uma mistura hidro alcoólica compreendendo um metal divalente à mistura obtida na etapa (a).
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de uma proporção em peso entre o conjugado de polímero de éster e o composto biologicamente ativo na mistura da etapa (a) ser 1:0.01-0.20, preferencialmente 1:0.02-0.15, mais preferencialmente 1:0.03-0.10.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARAC TERI ZADO pelo fato de o conjugado de polímero de éster ser obtido por um processo compreendendo as etapas de: a) reagir o anidrido poli (metil vinil éter-co- maleico) com a molécula com hidroxila terminal em um solvente orgânico, e b) remover o solvente orgânico.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARAC TERIZADO pelo fato de ainda compreender purificar o conjugado de polímero de éster.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARAC TERI ZADO pelo fato de a proporção em peso entre o anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) e a molécula com hidroxila terminal na solução da etapa (a) ser 1:0.010.25, preferencialmente 1:0.015-0.2, mais preferencialmente 1:0.05-0.125.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de a molécula com hidroxila terminal ser um polietileno glicol selecionado do grupo que consiste em polietileno glicol 1,000 (PEG1), polietileno glicol 2,000 (PEG2), polietileno glicol 6,000 (PEG6) e polietileno glicol 10,000 (PEG10).
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de o derivado de polietileno glicol contendo um grupo reativo com hidroxila terminal ser um polioxietileno alquil éter.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de o polioxietileno alquil éter ser um polietileno glicol metil éter.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de o polietileno glicol metil éter ser selecionado a partir do grupo que consiste em metoxi polietileno glicol 1,000 (mPEG1), metoxi polietileno glicol 2,000 (mPEG2), metoxi polietileno glicol 6,000 (mPEG6) e metoxi polietileno glicol 10,000 (mPEG10).
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARAC TERIZADO pelo fato de o composto biologicamente ativo ser um agente antitumoral.
12. Nanopartícula obtida por um processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA por compreender uma matriz de um conjugado de polímero de éster e um composto biologicamente ativo, em que o conjugado de polímero de éster é um conjugado de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) com uma molécula com hidroxila terminal, em que a referida molécula com hidroxila terminal é selecionada a partir de um polietileno glicol e um derivado do mesmo contendo um grupo reativo com hidroxila terminal.
13. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso na medicina.
14. Composição farmacêutica CARAC TERIZADA pelo fato de compreender (i) pelo menos uma nanopartícula conforme definida na reivindicação 12 e (ii) um carreador ou um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um agente antitumoral.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, CARAC TERI ZADA pelo fato de ser selecionada do grupo que consiste em: uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) com polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) com metoxi polietileno glicol 2,000 de 38 % a 47 %, b) docetaxel de 3 % a 5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição; e uma composição farmacêutica compreendendo: a) um conjugado de polímero de éster de anidrido poli (metil vinil éter-co-maleico) com metoxi polietileno glicol 2,000 de 30 % a 40 %, b) camptotecina de 0.08 % a 1.5 %, c) cálcio de 0.1 % a 0.2 %, e d) um sacarídeo de 15 % a 40 %, em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total da composição.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso na medicina.
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