KR20170114597A - 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스 - Google Patents

세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세리포리아 락세라타 배양물의 유효성분의 생산성을 향상시키는 배양방법과, 균사체 배양물 추출물 유래의 세포 외 다당체(Exopolysaccharide) 및 베타글루칸을 함유하는, 모발 개선과 항균 미 항진균 활성을 나타내는 샴푸와 린스에 관한 것이다. 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500으로 조절하며 생성된 세리포리아 락세라타 배양물가 함유된 샴푸와 린스에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타 균사체 배양물 제조 방법과 그의 추출물 및 유래의 천연물질을 유효성분으로 함유하여 모발 개선, 항균, 흑 모 등의 효과를 나타내는 샴푸와 린스를 세계인에게 널리 제공하는 것이다.

Description

세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스{The shampoo or rinse comprosing Ceriporia lacerata}
두피 및 모발의 땀샘이나 피지선에서의 분비물로 세균이 증식하고 피지와 유기물의 분해가 촉진되며 그 대사 부산물에 의해 탈모와 불쾌한 냄새와 가려움증이 나타나며 두피와 모발의 오염에는 분비 배설된 피지 땀 죽은 각질세포 두발화장품의 잔류물 등이 있다. 두피의 오염이 심해지면 모낭이 막혀 모유두의 기능이 저하되어 모발의 정상적인 발육이 방해되어 탈모를 일으키게 된다,
이러한 물질 등을 제거하여 모발을 청결하게 하고 모공을 막고 있는 물질을 없애줌으로써 혈행을 좋게 하며 산소 공급으로 모발과 두피를 건강하게 해 주기 위하여 샴푸를 사용한다. 샴푸는 그 기능성으로 천연샴푸, 탈모 샴푸, 탈모방지샴푸, 탈모예방샴푸, 비듬샴푸, 지루성두피 샴푸등으로 나뉘게된다.
1930년 중반까지는 머리를 주로 비누로만 씻었다. 이때 사용한 물이 경수(輕水, 센물)일 때에는 비누와 결합해서 찌기(Scum)가 만들어져서 머리털의 광택이 없어지고 지저분하여 만족스럽지 못하였다.
그 후 비누보다 거품이 잘 일고, 잘 씻겨나가는 코코넛 오일(Coconut oil)이 들어있는 물비누가 사용되었는데 이것이 샴푸의 시초이다.
한편, 1940년대에 미국에서 지방산을 이용한 알킬설페이트 (Alkyl sulfate)의 상업화가 이루어지고 구연산을 이용한 산성 린스가 개발되었다.
1960년대에 들어서 합성세제의 발달과 함께 고급 알코올계 음 이온성 계면활성제를 주원료로 한 액체형태의 세정제 즉, 샴푸가 본격적으로 개발되기 시작하였다.
1970년대는 기능성 샴푸의 시대라고 할 수 있다. 즉, 모 소피(毛小皮, Hair cuticle)가 손상되지 않게 예방하거나, 손상된 모 소피를 보호할 수 있는 물질을 첨가하기도 하고, 머리를 감은 후에 부드러우면서, 흩날리지 않게 하며, 윤기나게 하는 기술이 발달하였다.
1990년은 소비자의 요구가 다양해지면서 다기능 샴푸가 등장하였다. 2 in 1(샴푸와 린스의 혼합형) 샴푸의 등장이 그 좋은 예이다. 실리콘 코팅을 하는 샴푸, 자극성이 적은 양(兩)쪽 이온성 계면활성제(Amphoteric surfactant)의 개발로 하루에 한 번씩 머리를 감는 습관이 정착되기도 하였다.
그 외에도 향수샴푸와 컬러 린스가 등장하기도 하였다. 1990년 이후는 고기능 샴푸가 요구되고 있는 시대라 할 수 있다. 따라서 샴푸 제조 기술도 고도로 발달하고 있는 추세이며, 샴푸의 기능도 세분화되어가고 있다.
비타민이나 아미노산 등이 첨가되어 모발에 영양을 공급하는 샴푸와 린스가 생산되고 있고, 모발의 타입, 성별, 연령별, 머리감는 습관에 따라 세분화하여 머리카락 멋 내기, 육모, 탈모방지 등을 고려한 샴푸나 린스가 등장하고 있고 자외선 차단을 하여야 한다는 개념도 도입되고 있다.
본 발명은 이러한 샴푸나 린스를 개선하여 화학물질이 다량 포함된 계면 활성제가 아닌 자연 친화적 물질인 세리포리아 락세라타(Criteria lace rata)가 함유된 샴푸 및 린스에 관한 것으로 더욱 자세하게는 세포 외 다당체(Exopolysaccharide) 또는 베타-글루칸(β-glucan) 등 유효성분이 포함된 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 농축물 및 이의 건조물을 함유하여, 모발 및 두피 상태 개선 또는 흑모 생성 촉진, 항균 및 항진균 등의 특징을 갖는 샴푸 및 린스에 관한 것이다.
일반적으로 널리 사용되고 있는 샴푸와 린스는 세발 과정에서 노폐물과 더불어 각종 두피의 유용한 성분마저 세척되어 세발 후 두피가 건조해지고 거칠어지며 비듬을 촉진하는 경우가 종종 발생한다는 문제점이 있었다. 대부분의 정상 두피는 샴푸나 린스사용 후 2시간 이내에 두피가 pH가 정상화되지만, 두피는 약산성, 비누는 강 알칼리성이므로 샴푸 후 상승한 pH 수치는 두피자극을 유발할 수 있다.
시중에 판매되고 있는 샴푸와 린스는 대부분 유지와 알칼리 및 화학약품을 혼합하여 만들어진 것으로, 두피의 세정에 사용할 경우 알칼리성을 나타내어 피부의 피지 성분이 과다하게 제거되고, 각질층을 연화시켜 두피의 건조 및 자극을 유발하는 문제점이 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 식물에서 추출한 생약성분을 샴푸나 린스에 함유시키고 있으나 실질적으로 두피 개선효과는 크지 않은 실정이다.
본원은 종래의 이러한 문제점을 개선하여 천연 물질을 이용한 샴푸 및 린스를 개발하기 위하여 세리포리아 락세라타의 다양한 효능을 연구하였다.
그 결과물로 세리포리아 락세라타 배양액 및 농축액과 이의 건조물, 그리고 세리포리아 락세라타 배양액 유래의 베타글루칸과 세포 외 다당체를 포함한 물질을 이용하여 샴푸와 린스로 제조하여 모발 및 두피 상태 개선 또는 흑모 생성 촉진, 항균 및 항진균 등의 특징을 갖는 샴푸 및 린스에 대한 것이다.
지금까지 개발된 생약제를 이용한 샴푸나 린스에 관한 종래기술로는, 먼저 대한민국 등록특허: 제10-1555354호 발효식물을 이용한 화장료 조성물과 이의 제조방법 그리고 이를 이용한 헤어 샴푸가 있는데 이는 가막사리와 댕댕이 덩굴을 혼합하여 발효시킨 혼합 발효물을 이용하여 샴푸의 제조를 꽤 하였다. 더불어 출원번호 10-2014-0142739호 모유두 세포 및 모모 세포의 활성화 기능을 갖는 펩톤 발효 물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물, 및 이의 제형이 선행기술된 바 있으며 이는 펩톤 발효 물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물 및 이의 제형에 관한 것으로, 펩톤 발효 물을 포함하는 탈모 방지 또는 육모, 발모 촉진을 위한 화장료 조성물, 또는 모발 건강 증진용 화장료 조성물 및 이의 제형에 관한 것이기술된 바있다. 또 다른 선행기술로는 대한민국 등록특허 제10-0760649호 천연물 재료의 추출물을 포함하는 두발 세정제（샴푸 또는 린스 조성물） 및 그 제조방법이 선행 기술되었으며 더불어 제10-0640220호에서는 오비채 천연 한방 두피 클리닉샴푸 조성물이 기술되었으나 본원에서처럼 모발 개선, 흑모 생성, 항균, 피부 보습, 세척력 강화 등의 탁월한 효과를 갖는 것은 발견할 수 없었으며 본원 완성하게 되었다.
본 발명의 비특허 문헌으로도 다수의 관련문헌을 엿볼 수 있는데 먼저 천연 염생생물 유래 소재 기반 기능성 바이오 조성물(박태규 동향/연구보고서 건국대학교 2013년)이 이루어진바 있다. 또 다른 문헌으로는 세리포리아 락세라타 버섯의 균사체 액체 배양을 통한 세포 외 다당체 생산 및 항 당뇨 효과(김지은 계명대학교 박사학위논문, 2013)와 특성을 토대로 진행하였다. 또한, 흰 목이버섯 (Tremella fuciformis)의 균사체 액체배양을 통한 세포 외 다당체를 배양하는 방법(조은재 대구대학교 2007)이 선행되었다. 더불어 버섯 균사체로 발효시킨 복령과 후박의 항산화 및 항암 효과(손미예 경상대학교, 한국전통발효식품연구소, 2207) 논문과 같이 버섯 유효 성분으로 생산되는 고분자 다당체 및 베타-글루칸 등 다양한 기능성 물질이 액체배양을 통한 대량생산으로 식품, 화장품 및 기능성 소재로 활용할 수 있다. 특히, 버섯 균사체 액체배양은 생물전환기술을 최적화함으로써 단시간에 효과적으로 유용물질을 생산할 수 있어서 경제성이 높다. 따라서 식용, 약용을 포함한 다양한 버섯 균사체 배양에 관한 연구 및 다양한 기능성 물질의 생산에 따른 우수한 종균의 선별을 하며, 이를 이용한 생물전환기술의 최적화기술은 산업적으로 매우 유용하다. 이에 본 발명자들은 위와 같은 세리포리아 락세라타의 액체배양을 생산 최적화 및 기능성 물질들을 개발함으로써 천연 물질을 통한 두피에 자극이 없고 흑모 생성과 모발생성 기능을 갖는 세리포리아 락세라타가 함유된 샴푸와 린스의 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명은 전술한바 대로 세리포리아 락세라타의 배지 조성 및 배양방법으로 개선하여 세포외다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물의 생산성을 향상시켜 산업적으로 신속하고 대량으로 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타 균사체 배양물 제조 방법과 그의 추출물 및 유래의 천연물질을 유효성분으로 함유하여 모발 개선, 항균, 흑모 등의 효과를 나타내는 샴푸와 린스를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체 배양물 제조방법과 그의 건조물 및 추출물 유래의 베타글루칸과 세포 외 다당체를 함유하는 모발 개선효과를 나타내는 샴푸와 린스를 제공한다.
또한, 본 발명은 배양방법으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물 제조 시 초기 및 배양 중의 pH, 공기 주입량, 배양 중에 산소 공급 및 배지 성분의 균일하게 하기 위해 배양물을 교반할 수 있는 임펠러(Impeller) 속도에 따라 적정한 용존 산소(D O, Dissolved oxygen)유지 및 배지 성분을 균일하게 확산시키는 방법을 최적화하여 산업적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 개시하였고 이를 이용하여 품질 좋은 샴푸와 린스를 제조하고자 하는 것이다.
본 발명에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양물 제조방법은 균사체량, 유효물질의 함량은 증가시키며, 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 건조물 및 추출물 유래의 베타글루칸과 세포 외 다당체를 함유하는 샴푸와 린스는 모발 개선, 항균 등에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 배지 조성으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물 제조 시 탄소원, 질소원, 무기염류를 최적화하여 산업적으로 대량 배양할 수 있다.
또한, 본 발명은 배양방법으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물에 의하여 제조가 가능하다.
또한, 초기 및 배양 중 pH, 공기 주입량, 산소 공급 및 배지 성분을 균일하게 하기 위해 최적화된 임펠러 속도 조절로 산업적으로 대량 배양할 수 있다.
더불어 배양중에 영양성분을 첨가함으로써 균사체 량을 향상시켜 세리포리아 락세라타 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 증가시킬 수 있다.
본원의 샴푸와 린스에 사용되는 균사체를 배양하는 방법으로는 고체 배양법과 액체 배양법을 사용할 수 있는데 고체배양법은 재배시간이 길고, 오염이 발생할 확률이 높고, 배양이 완료된 후 균사체만을 회수하는 작업을 자동화하기가 어렵다는 단점이 있는 반면에 균사체의 액체 배양법은 고체 배양법에 비하여 오염가능성이 작고, 비교적 조밀한 공간에서 짧은 시간 동안에 대량 배양할 수 있다는 장점이 있다.
버섯의 균사체와 유용성분을 포함하는 액체 배양물을 대량으로 단기간에 생산하기 위해서는 배지 성분의 최적화 및 경제성이 있는 원료들의 사용이 요구된다.
버섯의 액체배양을 위한 영양성분으로 옥수수 침지액(Corn steep liquor), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone) 등의 부산물 유래 탄소원과 고가의 질소원 등이 사용되고 있다.
대부분의 균류는 진탕 배양 시 펠릿(Pellet) 또는 필라멘트(Filament) 균사를 형성하며, 특히 담자균류들은 다양한 크기의 균사응집체를 형성한다. 상기 균사응집체로 인하여 벽면 생육(Wall growth)이 발생하며, 이로 인해 교반 및 통기에 의한 물질 전달이 어려워져 균사 생육 및 생성물의 생산도 저해된다. 그동안 상기 문제점으로 인해 에어-리프트 발효조(Air-lift fermenter)가 일부 사용하여 왔으나, 현재 산업적인 생산을 위한 대규모 에어-리프트 발효조의 이용은 미흡한 실정이다.
따라서 발효조에서의 배양이 불가피하며, 또한 벽면 생육의 방지수단이 강구되어야 한다. 기존 세리포리아 락세라타에 대한 배양방법은 에어 리프트(Air lift) 방식의 배양기에서 온도, pH, CO2 농도, 조사되는 빛의 양, 배지 성분에 대한 보고는 있지만, 교반기가 부착되어 있는 생물반응기(Bioreactor)의적용이 거의 없으며, 특히 최적 배양 조건으로 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 증가시키기 위해 일정 농도 이상의 용존산소량을 유지하는 방법인 교반기의 교반속도, 통기량 등을 이용한 배양 방법은 전무한 상태이다.
따라서, 천연 소재인 세리포리아 락세라타의 배양 방법의 최적화를 통해 산업적 생산이 가능한 배양방법을 이용하여 생산을 향상시킬 수 있는 개발 방법이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 세리포리아 락세라타 균사체 배양물 추출물을 대상으로 예의 연구를 계속한 결과, 세리포리아 락세라타 배양에 있어 배양조건에 따라 개선되며, 세리포리아 락세라타 배양물 추출물 및 유래의 베타글루칸과 세포 외 다당체가 모발 개선, 흑모생성, 항균, 피부 보습 등의 탁월한 효과를 갖는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
도 1은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양 시 초기 pH에 따른 균사체의 생장성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양 시 배양시간에 따른 균사체 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 배양기 종류에 따른 세리포리아 락세라타 배양물의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 700 L 공기 부양식 배양기에서의 배양과 5,000 L 교반형 생물반응기의 최적 조건에서 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세포 외 다당체(EPS)의 분자량을 측정한 그래프이다.
도 6은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물 처리량에 따른 SK-MEL-2 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물 처리량에 따른 SK-MEL-2 세포의 타이로시레이즈 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물 처리량에 따른 SK-MEL-2 세포의 멜라닌 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물 처리량에 따는 카탈레이즈 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물, 세리포리아 락세라타 배양물 추출물인 세포 외 다당체와 베타-글루칸 처리에 따른 클리어존(Clear zone)을 나타낸 그림이다.
도 11은 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물을 이용하여 2개월간 두피에 바른 후 머리카락색 변화를 나타내는 사진이다.
도 12는 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스의 일실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양물 농축액을 이용하여 2개월간 두피에 바른 후 머리카락색 변화를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명의 실시 예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원은 상기한바 대로 세발이나 모발관리시 사용하는 샴푸 및 린스에 세리포리아 락세라타 배양물을 투입하는 것을 본원의 특징으로 한다.
본원의 샴푸와 린스는 일정 농도 이상의 용존산소량(Dissolved oxygen)농도하에서 교반 및 통기 변화에 따른 세리포리아 락세라타의 액체배양 시 균사체 양, 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 향상시키게 된다.
더불어 교반 속도를 조절하여 일정 농도 이상의 용존산소량을 유지하며, 교반속도에 의해 용존산소량이 조절되지 않을 경우 2단계로 통기를 조절하여 자 발효조(Jar fermenter) 시스템에서 세리포리아 락세라타의 효율적으로 균사체와 건조물, 세포 외 다당체 및 베타글루칸을 생산한다.
본 발명은 이처럼 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 함유하는, 모발 및 두피 상태 개선, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 샴푸와 린스를 제공한다.
상기 균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus subsp.aureus), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 대장균(Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 구성된 균으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 진균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 미크로스포룸 오두앵 (Microsporum audouinii) 및 트리코피톤 루브럼(Trichophyton rubrum)로 구성된 진균으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸의 함량은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.05 내지 5중량% 또는
가 바람직하며 더욱 바람직하게는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량% 또는 0.1 내지 10중량% 또한 아무 문제없이 가능하다. 0.1% 이하이면 그 효과를 느낄 수 없고 10중량 %이면 제조비가 높아 단가가 증가하는 문제점이 있었다.
본 발명의 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있으며, 또한, 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 생산하기 위한 배지조성 및 배양조건을 제공한다.
본 발명자들은 샴푸와 린스의 핵심물질인 세리포리아 락세라타 배양물의 대량생산을 위한 액체배양법을 확립하기 위하여, 균사체의 최적화된 배지 조성 및 배양조건을 결정하였다.
본 발명의 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 생산방법은 세리포리아 락세라타의 생산방법에서, 세리포리아 락세라타로부터 액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체를 얻는 단계, 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하는 단계, 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함한다.
(1) 세리포리아 락세라타로부터 액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체를 얻는 단계.
액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체는 세리포리아 락세라타로부터 얻을 수 있다. 세리포리아 락세라타를 PDA(Potato dextrose agar) 배지(Culture medium 100 플라스틱 배양 구. Difco, Becton Dickinson and Company)에서 7~11일 정치 배양하였다. 500㎖ 배플(Baffle])이 있는 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지(Difco) 200㎖를 조성한 후, PDA 배양 균주 1개를 넣고 7~11일간 진탕 배양하였다. 이때 접종원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.3%(w/v) 정도인 것이 바람직하다.
(2) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하는 단계.
상기 (1) 단계에 의해 얻은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양용 배양물에 접종하여 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 얻을 수 있다.
액체 배양용 배양물은 물에 탄소원, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.0 ~ 6.5로 조정할 수 있다. 그런 다음 pH가 조절된 배양물에 세리포리아 락세라타 균사체를 배양물 부피 대비 0.1∼10％으로 배양물에 첨가하고, 20∼25℃에서 7∼11일 동안 액체 배양할 수 있다.
상기에서 탄소원은 말토오스(Maltose), 글루코오스(Glucose), 락토오스(Lactose), 전분(Starch), 덱스트린(Dextrin), 수크로스(Sucrose), 프럭토스(Fructose), 갈락토오스(Galactose), 만노오스(Mannose), 올리고당(Oligosaccharide) 및 탄소원 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산(Amino acid), 펩톤(Peptone),
콘 스티프 리쿼 및 다양한 질소원 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 무기물은 일인산칼륨(KH2PO4), 이인산칼륨(K2HPO4), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 황산 마그네슘(MgSO4), 염화나트륨(NaCl), 황산 망간 (Mn SO4) 및 무기염류 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하기 위한 다양한 구성성분의 배양물을 제조하여 사용할 수 있으며 바람직한 하나의 일 실시한 예로서, 상기 배지는, 0.2~5% 포도당, 0.2~1% 펩톤, 0.05~0.25% 일인산칼륨(KH2PO4), 0.02~0.1% 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산 마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%가 바람직하다.
(3) 생물반응기를 이용해 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체를 배양시키는 단계.
상기 (2) 단계에 의해 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체는 생물반응기 내의 배양물에 접종하고 배양하여 세리포리아 락세라타 배양물을 제조할 수 도 있다.
그리고 생물반응기 내부의 배양물은 정제 수에 탄소원, 효모추출물, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.0 ~ 6.5으로 조정할 수 있다.
그런 다음 액체 배양된 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체를 배양물 부피 대비 0.1∼10％으로 생물반응기 내의 배양물에 접종한 후, 0.02∼2vvm(volume of air added to liquid volume per minute)의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 20∼25℃의 온도에서 7∼11일 동안 배양하여 세리포리아 락세라타 배양물을 제조할 수 있다.
상기 생물반응기 내부의 배양물에서, 탄소원은 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스, 갈락토오스, 만노오스 및 탄소원 중에서 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 생물반응기 내부의 배양물에서, 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산, 펩톤, CSL 및 질소원 중에서 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 무기물은 일인산칼륨(KH2PO4), 이인산칼륨(K2HPO4), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 황산 마그네슘(MgSO4), 염화나트륨(NaCl), 황산 망간(MnSO4) 및 무기염류 중에서 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하기 위한 다양한 구성성분의 배양물을 제조하여 사용할 수 있다.
바람직한 하나의 일 실시 예로서, 상기 배지는, 0.2~5% 포도당, 0.2~1% 펩톤, 0.05~0.25% 일인산칼륨(KH2PO4), 0.02~0.1% 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.05 중량% 이다.
본 발명에서 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 배양용 생물반응기로는 본원 관련 분야에서 통상적으로 사용하며, 공기를 주입할 수 있는 생물반응기라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 생물반응기의 일례로서 순환형(기포 통기형) 공기 부양식 생물반응기, 풍선형 공기 부양식 생물반응기, 칼럼형 공기부양식 생물반응기, 교반식 생물반응기 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기에서 언급한 세리포리아 락세라타 균사체를 대량으로 생산하는 방법에 의해 얻은 세리포리아 락세라타 배양물. 세리포리아 락세라타 배양물의 추출물 혹은 건조물을 포함한다.
(4) 세리포리아 락세라타배양물로부터 건조물, 추출물, 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 제조하는 단계.
본 발명의 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 (a) 세리포리아 락세라타를 액체 배지에서 배양하여 균사체 배양물을 제조하는 단계, (b) 세리포리아 락세라타 균사체 및 배양물을 건조해 분말 화하는 단계, 및 (c) 균사체 배양물 분말을 용매로 추출하여 이로부터 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 수득하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양물을 진공건조 또는 동결건조시켜 분말화 할 수 있다. 상기의 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40℃ 이하의 온도, 보다 구체적으로는 30℃ 이하의 온도에서 48 내지 96시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
그리고 (b) 단계에서의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공 동결 건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화됨이 바람직하다.
본 발명의 균사체 배양물의 추출물은, 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물을 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온 추출, 초음파추출, 초 임계추출 등의 방법으로 제조될 수 있다.
이때 각 원료 유기농 식물을 추출 용매를 사용하여 각각 추출한 후 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 6의 글리콜, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다.
더욱 바람직하게는 35 내지 45%(v/v) 1,3-부틸렌 글리콜을 추출 용매로 사용하여 추출한다. 이때 추출 용매의 사용량은 원료 중량의 10 내지 30배 부피량이며, 보다 바람직하게는 20배이다.
추출온도와 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며 40 내지 100℃에서 3 내지 100시간 동안 가열하여 추출하거나, 50 내지 70℃에서 1일 내지 5일간 실시하는 것이 바람직하며 추출결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.
또한, 본 발명의 균사체 배양물의 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 얻은 균사체 배양물 건조물을 용매로 추출한 후 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 분리, 제조한다.
세포 외 다당체를 얻기 위해 건조 분말 1~10g에 증류수 100㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이의 상등액에 그 양의 2 ~ 4배에 해당하는 95% 이상의 순도를 갖는 용매를 첨가하고 2 ~ 6℃의 냉장고에 넣어 12 ~ 18시간 정치시킬 수 있다.
상기의 정치 물을 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수 및 동결건조하여 조(Crude) 세포 외 다당체를 제조할 수 있다.
상기 세포 외 다당체는 40 ~ 60 중량%의 당과 30 ~ 40 중량%의 단백질, 40 ~ 50 중량%의 당과 32 ~ 38 중량%의 단백질, 또는 43 ~ 47 중량%의 당과 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 더 포함할 수도 있다.
베타-글루칸은 건조 분말 10g에 증류수 50㎖를 가하여 현탁시킨 다음 실온에서 20% 탄산나트륨(Sodium carbonate)을 이용하여 pH를 10.0으로 조정한 후 10시간 정도를 방치하여 분말 시료가 충분히 연화되도록 한다. 이 연화된 시료액에 고온에 안정한 알파아밀레이즈(α-amylase)를 가하여 60℃의 항온수조 내에서 2시간 동안 교반하여 효소처리를 한 후 실온으로 냉각한다. 이 액을 pH 5로 맞춘 다음 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 60℃의 항온수조에서 2시간 동안 교반한다.
그 다음 효소를 불활성화시키기 위해서 pH를 4.5로 맞춘 후, 5℃의 항온수조에서 30분간 교반한 후 냉각한다. 냉각한 추출액을 원심분리(30 min, ×8000 rpm)하여 상등액만을 취한 후 40℃의 온도에서 감압 농축하게 되고 이 농축물에 4배량의 에탄올을 가하여 4시간 정도 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 다시 물에 용해한 후 pH를 4.5로 맞춘 다음, 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 58℃에서 2시간 동안 효소를 재처리한다. 처리 후 95℃에서 30분 동안 효소를 불활성 시킨 다음 냉각하고 원심분리하여 상등액을 취한 후 에탄올로 재침전시켜 조(Crude) 베타-글루칸(β-glucan)을 제조할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시한 예 및 시험 예를 통하여 구체적으로 설명한다.
그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
세리포리아 락세라타 균사체의 고체배양에서 배지 및 생장조건 결정.
세리포리아 락세라타 균사체의 생장성이 가장 우수한 배지를 결정하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 다양한 종류의 배지를 이용하여 균사생장과 밀도를 측정함으로써 최적의 생장 배지를 결정하였다. 구체적으로 각각의 종류의 배지는 살균 전 pH 5.5로 조절되어 살균되었다. 정치배양을 위해서 24±2℃로 고정된 배양기에서 세리포리아 락세라타 균사체를 10일간 배양한 후, 그에 따른 세리포리아 락세라타 균사체의 지름 및 균사밀도를 측정하여 생장성을 조사하였고 아래의 표로 나타내었다.
배지 종류에 따른 균사체 생장성 조사.
배지 PDA YM NU YMG LB MYP MCM
지름/mm 76 67 54 70 61 71 67
균사밀도 *** ** * *** ** ** *
균사밀도 : 우수(***), 양호(**), 보통(*)
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
PDA : Potato 200g, Dextrose 20g, Agar 15g/L
Y M: Yeast extract 3g, Malt extract 3g, Peptone 5g, Dextrose 10g, Agar 15g/L
NU : Peptone 5g, Beef extract 3g, Agar 15g/L
YMG : Yeast extract 4g, Malt extract 10g, Glucose 4g, Agar 15g/L
LB : NaCl 10g, Yeast extract 5g, Tryptone 10g, Agar 15g/L
MYP : Malt extract 30g, Yeast extract 2g, Peptone 1g, Agar 15g/L
MCM : Glucose 20g, Yeast extract 2g, Peptone 3g, MgSO42O 0.5 g, K2HPO4 1g, KH2PO4 0.46 g, Agar 20 g/L
그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 PDA, YMG, MYP 배지에서 대체로 우수한 생장성을 보였으며, 특히 PDA 배지를 사용하였을 때, 균사체의 생장성이 가장 우수하였다.
세리포리아 락세라타 균사체의 온도에 따른 생장성 측정.
본원의 핵심물진인 세리포리아 락세라타 균사체의 고체 배지 배양온도에 따른 생장성 측정을 위하여, 가장 우수한 생장성을 나타낸 PDA 배지를 사용하여 배양온도를 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃으로 설정한 후, 10일간 배양하여 각 온도에 따른 균사체의 생장성을 조사하였다.
배양 온도에 따른 균사체 생장성 조사.
온도() 18 20 22 24 26
지름(mm) 38 64 80 75 70
균사밀도 * ** *** *** ***
균사밀도 : 우수(***), 양호(**), 보통(*)
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
그 결과, 위 표 2에서 보는 바와 같이 22℃의 온도까지는 생장성이 증가하였지만, 그 이상의 온도에서는 감소하는 결과를 나타내어, 가장 생장성이 우수한 온도는 22℃로 측정되었다.
세리포리아 락세라타 균사체의 액체 종 배양과 세리포리아 락세라타 균사체의 초기 pH에 따른 생장성 조사.
세리포리아 락세라타 균사체의 생장성이 가장 우수한 배지를 결정하기 위하여, 하기 표 1에 생장성이 우수한 PDA 배지로 이것에 대한 액체배지인 PDB(Potato dextrose broth)에서 초기 pH에 따른 균사체량을 조사하였다.
그 결과 도 1에서 보는 바와 같이 pH 5에서 6 사이에서는 거의 유사한 균사체량을 나타내었으며, pH 5.5에서 가장 우수한 균체 성장을 나타내었다.
세리포리아 락세라타 균사체의 배양시간에 따른 생장성 조사.
세리포리아 락세라타 균사체의 본 배양완료 시점을 조사하기 위하여 배양시간에 따른 균사체량을 조사하였다. 배양을 위해 PDA 고체 배지에서 12일 배양한 균사체를 믹서로 갈아 균질화시킨 후 종 배양 액체배지에 접종하였다. 배양조건은 초기 pH 5.5와 22℃, 그리고 진탕배양기에서 120 rpm으로 배양하였다.
그 결과 도 2에서 보는 바와 같이 배양 3일 차까지는 균체 성장이 거의 이루어지지 않았지만, 4일 차부터는 급격한 균체가 성장하여 배양 9일 차부터 12일 차까지는 균체량이 유사하였지만 13일 차 이후에는 현저히 감소하였다. 따라서 최적 종 배양 시간은 9일부터 12일까지로 조사되었다.
세리포리아 락세라타 균사체의 액상배양으로 생리활성물질 제조법.
세리포리아 락세라타를 PDA, 배지(100 플라스틱 배양구. Difco, Becton Dickinson and Company)에서 10일 정치 배양하였다. 500㎖ 배플이 있는 삼각플라스크에 PDB,배지(Difco) 200㎖를 조성한 후, PDA 배양 균주 1개를 넣고 10일간 진탕 배양하였다. 그리고 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산 마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%, 실리콘 거품제 0.2 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 2ℓ 액체 배양 배지를 5ℓ 배양기에서 살균한 후, 25℃로 냉각한 상태에서 접종액으로 사용할 PDB 배양 균주 200㎖를 접종하고, 교반속도 300 rpm, 공기를 0.5 vvm으로 통기 시키면서 25℃의 항온에서 7~11일간 액체 배양함으로써 세리포리아 락세라타, 균사체 배양물을 제조하였다.
세리포리아 락세라타 배양물 건조분말( Dried Powder )의 제조.
상기 실시예 5에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양물을 진공동결건조기를 이용하여 35℃ 이하의 저온에서 48 시간 동안 동결건조시켜 분말화합으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 건조분말을 제조하였다.
세리포리아 락세라타 배양물로부터 세포 외 다당체( EPS )의 제조.
상기 실시예 6에서 제조된 건조 분말 2 g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 교반한 후, 원심분리(10,000 rpm, 20분)한 다음 상등액에 그 양의 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 냉장조건(2~8℃)에서 16시간 정치하였다. 상기의 정치 물에서 침전물을 취해 동결건조하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양물로부터 세포 외 다당체를 제조하였다.
세리포리아 락세라타 배양물로부터 베타-글루칸의 제조.
상기 실시예 6에서 제조된 건조 분말 10 g에 증류수 50 ㎖를 가하여 현탁시킨 다음 실온에서 20% 탄산나트륨(Sodium carbonate)을 이용하여 pH를 10.0으로 조정한 후 10시간 정도를 방치하여 분말 시료가 충분히 연화되도록 하였다. 이 연화된 시료액에 고온에 안정한 알파아밀레이즈(α-amylase)를 가하여 60℃의 항온수조 내에서 2시간 동안 교반하여 효소처리를 한 후 실온으로 냉각하였다. 이 액을 pH 5로 맞춘 다음 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 60℃의 항온수조에서 2시간 동안 교반을 행하였다. 그 다음 효소를 불활성화시키기 위해서 pH를 4.5로 맞춘 후, 95℃의 항온수조에서 30분간 교반 한 후 냉각하였다.
냉각한 추출액을 원심분리(30 min ×8000 rpm)하여 상등액만을 취한 후 40℃의 온도에서 감압 농축하였다. 이 농축물에 4배량의 에탄올을 가하여 4시간 정도 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 다시 물에 용해한 후 pH를 4.5로 맞춘 다음, 아밀로글루코시데이즈로 58℃에서 2시간 동안 효소를 재처리하였다. 처리 후 95℃에서 30분 동안 효소를 불활성 시킨 다음 냉각하고 원심분리하여 상등액을 취한 후 에탄올로 재침전시켜 조(crude) 베타글루칸(β-glucan)을 제조하였다.
생물반응기 형태에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
상기 생물반응기를 이용한 균사체 배양은 생물반응기 형태에 따라 균사체의 생장량에 차이가 있으므로 세리포리아 락세라타 균사체를 대상으로 배양에 적합한 배양기 형태를 선발하기 위하여 교반형과 기포 통기형을 대상으로 균사체의 생장량과 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸, 함량을 비교하였다. 실시예 5에 나와 있는 배지 조성 및 온도로 수행하였으며, 배양조건은 기포 통기형 컬럼형은 0.5vvm, 교반형은 300 rpm과 0.5 vvm이며 배양온도는 25℃로 수행하였다. 균사체의 생장량 측정하기 위하여 배양물을 8000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 증류수로 세척과 원심분리를 2회 반복하였다. 원심분리한 후 침전된 균사체를 105℃에서 건조한 후 건조된 균사체량(DCW, dry cell weight)를 측정하였다. 또한, 세포 외 다당체와 베타글루칸은 각각 제조된 건조물에 대한 함량으로 측정하였다.
각각의 배양기에서 생성된 균사체, 건조물, 세포 외 다당체, 베타글루칸은 도 3에 나와 있다. 도 3에서 보는 바와 같이 균사체랑 및 건조물량은 교반형에서 가장 높게 나타났으나, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 공기 부양 식의 칼럼형과 교반형에서 유사하게 나타났다.
따라서 세포 외 다당체와 베타글루칸의 생성량은 공기 부양 식의 칼럼형과 교반형이 유사하지만 균사체량 및 건조물의 양이 높은 교반형 배양기가 유리하다.
교반형 생물반응기에서의 세리포리아 락세라타 배양 최적화.
상기 실시예 5의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 rpm에 따른 배양물 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물(Powder)의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 측정 하였다.
배양기 교반 속도는 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 rpm으로 배양 초기부터 배양완료 시점까지 유지하면서 배양하였다.
rpm에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
rpm 생육정체기
(일)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
0 4 4.7 15.9 2.42 14.1
50 5 6.7 26.5 3.78 20.1
100 7 7.9 29.9 4.55 25.5
200 9 8.8 34.2 5.01 29.2
300 10 8.5 31.0 4.97 28.6
400 8 8.3 30.7 4.95 28.7
500 5 3.9 12.8 1.72 11.4
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 3에서 보는 바와 같이 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물의 농도 및 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 낮은 rpm 인 100 이하에서는 낮게 나타났지만 높은 rpm 인 200부터 400까지는 다소 높게 측정되었다.
그러나 높은 rpm 인 500에서는 현저히 감소하였다. 생육정체기 측면에서 낮은 rpm은 시기가 빠르게 나타났지만 배양 기간에 비해서는 균사체 농도, 건조물의 농도, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 높게 조사되었다. 그러나 200부터 400까지의 rpm에서는 생육정체기 시점이 8일 이상으로 배양 후기까지 지속하는 경향을 나타내었지만, 배양기간을 고려할 경우 낮은 rpm보다는 효율성이 낮게 측정되었다. 따라서 초기 rpm 조절에 따라 세리포리아 락세라타의 배양 성이 변하는 것을 알 수 있었다. 또한, 초기 교반을 하지 않거나, 낮은 rpm으로 시작하여 점차 상승시킬 경우 배양 성이 향상될 것으로 추정되었다.
공기 공급량(Aeration)에 따른 배양.
상기 실시예 5의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 공기 공급량에 따른 배양물 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물(Powder)의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 배양기 교반 속도는 가장 유리한 조건으로 조사된 rpm 200으로 수행하였으며, 공기 공급량은 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 vvm으로 배양 초기부터 완료시점까지 유지하면서 배양하였다.
공기 공급량에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
공기
공급량
(vvm)		 생육
정체기 (일)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
0 2 1.9 5.4 1.12 5.2
0.01 8 8.3 29.7 4.78 27.5
0.02 10 8.6 30.8 4.89 28.8
0.05 10 8.5 31.1 5.02 29.1
0.1 10 8.5 30.9 5.01 29.0
0.2 10 8.6 31.4 5.10 30.1
0.5 10 8.4 30.6 4.98 29.4
1 9 8.4 30.8 5.01 28.1
2 3 3.7 8.9 1.89 9.5
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 4에서 보는 바와 같이 공기가 공급되지 않을 경우 배양이 이루어지지 않았다. 그리고 공기 공급량이 0.01 vvm부터 1 vvm까지는 공기 공급량이 증가함에 따라 배양 결과에 큰 차이를 나타내지 않았지만 2 vvm에서는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 현저히 감소하였다. 따라서 교반형 생물반응기에서 공기 공급량은 0.01 vvm부터 1 vvm까지가 배양에 유리함을 알 수 있었다.
내압에 따른 배양.
실시 예 5의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 내압에 따른 배양물 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 배양기 교반 속도는 상기 실시 예에서 가장 바람직한 조건으로 조사된 rpm 200으로 수행하였으며, 공기 공급량은 상기 실시 예에서 가장 바람직한 조건인 0.2 vvm으로 하여 내압을 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 1.5 kg/cm2으로 배양 초기부터 완료시점까지 유지하면서 배양하였다.
내압에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
내압
(kg/cm2)		 생육
정체기
(일)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
0.05 10 8.5 28.9 4.95 28.1
0.1 10 8.6 28.5 4.88 29.1
0.2 10 8.5 29.1 4.89 28.7
0.5 10 8.4 30.1 4.91 29.2
1 10 8.5 29.5 4.94 29.4
1.5 10 8.6 29.9 4.92 29.3
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 5에서 보는 바와 같이 교반형 생물반응기의 내압이 증가하거나 감소하더라도 배양 성에 거의 영향이 없었다. 따라서 세리포리아 락세라타 균사체 배양에 있어 내압은 거의 영향이 없음을 알 수 있었다.
용존산소량 조절에 따른 배양성 조사.
상기 실시예 등에서 나타난 것과 같이 세리포리아 락세라타 배양에 있어 중요한 요소로 교반형 생물반응기 배양 시 공기 공급량 혹은 내압보다는 rpm에 의한 영향이 높음을 알 수 있었다.
따라서 rpm에 의한 영향으로 나타나는 것으로 대표적인 것은 균사체에 대한 전단 응력(Shear strees)과 배양물에 대한 용존산소량이 있다.
전단 응력 측면에서는 rpm이 증가함에 따라 균사체의 모양에는 큰 변화를 나타내지 않았기 때문에 영향이 클 것으로 추정되는 용존 산소량에 따른 세리포리아 락세라타 배양 시 균사체 농도, 건조물의 농도, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 조사하였다.
초기 배양 조건은 rpm 50, 공기 공급량 0.2 vvm, 내압 0.5kg/cm2이며, 실험에 적용되는 용존산소량은 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 70%로 수행하였다. 배양이 진행됨에 따라 목적으로 하는 용존산소량에 도달되었을 때부터 1차적으로 rpm을 조절하였으며, 목적으로 하는 용존 산소량이 유지되지 않을 경우 공기 공급량과 내압을 조절하여 일정하게 유지하였다.
용존산소량에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
DO
(%)		 생육정체기
(일)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
No control 4 4.3 12.6 2.13 13.3
5 10 12.6 39.1 6.91 40.2
10 11 12.7 40.2 7.15 39.7
20 12 15.2 45.3 8.22 46.1
30 11 13.6 41.1 7.45 42.3
40 11 13.2 41.3 7.27 40.9
50 9 8.9 30.2 5.23 31.1
70 7 6.3 25.4 4.11 23.2
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 6에서 보는 바와 같이 균체 성장 측면에서 용존산소량 40%까지는 약간의 차이만 보일 뿐 큰 차이를 나타내지 않았으나, 배양에 따른 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량은 현저히 상승하였다.
그리고 용존산소량 20% 유지 시에는 생육정체기는 12일, 균사체 량은 15.2 g/L, 건조물의 양은 45.3 g/L, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 각각 8.22 mg/g Powder와 46.1 mg/g Powder로 조사되었다.
용존산소량을 고려하지 않은 경우보다 50% 이상 배양 성이 향상되었다.
따라서 세리포리아 락세라타 배양에 있어 일정농도의 용존산소량을 유지하기 위해 rpm, 공기 공급량, 내압을 조절하는 것이 유리함을 알 수 있었다.
배양중 영양성분 첨가에 의한 배양성 조사.
아울러 생물반응기를 이용하여 균사체를 배양할 경우 유용물질의 생산성을 높이기 위해 배양 중에 영양성분을 첨가하기 때문에 균체 성장 및 유용물질의 생산성에 영향을 주는 질소원과 탄소원을 첨가하여 수행하였다.
그 결과 질소원의 첨가는 균체 성장에는 유리하였지만, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸 함량은 감소하였다.
따라서 유용물질의 생산성을 높이는 방법인 탄소원의 첨가를 수행하였으며, 상기 실시한 예에서 나와 있는 조건에 따라 초기 조건 및 배지 조성과 배양중에 유지되는 용존 산소량을 20% 이상으로 하여 배양을 12일까지 수행하였다.
첨가되는 탄소원 종류에 따른 배양성 조사.
배양중에 첨가되는 탄소원으로 포도당(Glucose), 과당(Fructose), 만노오스(Mannose), 설탕(Sucrose), 엿당(Maltose), 전분(Soluble starch)을 배양 5일 차에 배양물 부피에 대해 3%가 되도록 일시 첨가하였으며, 전분은 20%, 나머지 탄소원은 70%로 조제되었다.
배양중에 첨가되는 탄소원 종류에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
탄소원 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
포도당
(Glucose)		 17.7 52.1 9.12 50.9
과당
(Fructose)		 16.4 51.9 8.30 50.7
만노오스
(Mannose)		 18.1 55.2 9.25 54.8
설탕
(Sucrose)		 18.0 57.1 9.51 59.2
엿당
(Maltose)		 16.7 49.7 8.66 47.3
전분
(Starch)		 15.2 45.8 8.18 44.9
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 7에서 보는 바와 같이 전체적으로 탄소원을 첨가할 경우 세리포리아 락세라타 배양에 의한 배양성이 향상되었다. 특히, 만노오스 혹은 설탕을 첨가할 경우 높은 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 증가하였다.
따라서 배양중에 탄소원을 첨가할 경우 균사체 및 여러 유용물질의 생산성이 향상되며, 특히 만노오스와 설탕을 첨가할 경우 더욱 향상됨을 알 수 있었다.
배양중 유지되는 설탕 농도에 따른 배양 성 조사.
상기 실시예 결과에서 보는 바와 같이 배양중에 첨가되는 탄소원으로 설탕을 첨가할 경우 배양 성이 향상되었다. 따라서 첨가되는 최적 설탕의 농도를 조사하기 위해 배양 5일 차에 배양물 부피에 대비 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5%를 일 실시 예로 첨가하였다.
배양중에 첨가되는 탄소원 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
첨가농도
(%)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
0 14.7 44.2 8.16 45.1
0.1 15.4 47.6 8.91 48.2
0.2 15.9 48.2 9.11 47.9
0.5 16.7 50.7 9.23 51.5
1 17.6 53.2 9.39 58.7
2 18.2 59.2 9.78 61.3
3 17.9 57.4 9.56 60.1
5 15.1 48.1 8.92 50.8
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실
그 결과, 위 표 8에서 보는 바와 같이 설탕이 첨가되지 않은 경우보다는 첨가될 경우 배양성이 향상되었으며, 첨가되는 설탕의 농도가 2%까지는 증가하다가 그 이상의 농도에서는 감소하는 경향을 나타내었다.
따라서 설탕 2%를 첨가할 경우 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸 함량이 증가함을 알 수 있었다.
배양기 크기에 따른 배양성 조사.
상기 실시 예에서 수행한 교반형 생물반응기의 크기는 5 L로 산업적인 용도로는 적합하지 않다. 추후 산업적 생산을 위한 세리포리아 락세라타 대량배양을 수행하기 위해서는 배양기 크기에 따른 배양성 조사가 필요하다.
따라서 상기 실시 예에서 조사된 결과를 토대로 배양기 크기를 5, 10, 30, 100, 500, 5,000 L에서 배양을 수행하였다. 초기 배양 조건은 rpm 0, 공기 공급량 0.2 vvm, 내압 0.5 kg/cm2이며, 용존산소량 20%를 유지하기 위해 1차적으로 rpm을 상승시킨 후, rpm이 최대치까지 도달하였을 때 2차적으로 공기 공급량과 내압을 상승시켜 조절하였다. 배양 5일 차에 설탕을 2%가 되도록 첨가하여 12일까지 배양하였다.
배양기 크기에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양.
배양기 크기
(L)		 균사체량
(g/L)		 건조물의 양
(g/L)		 세포 외 다당체 함량
(mg/g Powder)		 베타글루칸 함량
(mg/g Powder)
5 18.3 59.5 9.53 60.2
10 18.5 60.1 9.51 59.3
30 17.9 60.3 9.47 60.7
100 18.2 58.9 9.60 60.7
500 18.5 60.5 9.52 61.5
5,000 18.4 60.7 9.61 61.7
실험장소 : 경북 바이오 산업연구원
그 결과, 표 9에서 보는 바와 같이 배양기 크기에 따라 세리포리아 락세라타의 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량은 큰 차이를 보이지 않았다.
따라서 세리포리아 락세라타 배양에 있어 배양기의 크기에 거의 영향이 없음을 알 수 있었다.
기존 배양과 최적화된 배양 비교.
대한민국 등록특허 10-1031605호에서는 공기 부양식 칼럼형 700 L 배양기를 사용하여 생산을 수행한 바가 있다. 본 발명에서 교반형 배양기에서의 최적화된 배양조건을 비교하는 실험을 수행하였다.
실험조건은 공기 부양식 칼럼형 700 L은 특허상에 나와 있는 조건 3 vvm, 25℃이며, 5,000 L 교반형 배양기에서는 25℃, 0 rpm, 공기 공급량 0.5 vvm, 내압 0.5 kg/cm2의 초기 조건과 배양중에 용존산소량은 20% 이상 유지하고 배양 5일 차에 탄소원을 2% 첨가하였다.
그 결과 도 4에서처럼 보는 바와 같이 기존 배양 방식인 공기 부양식 700 L에서 보다 세리포리아 락세라타의 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 100% 이상 증가하였으며, 특히 균사체의 양은 150%까지 증가하였다.
따라서 공기 부양 식과 비교하여 rpm 등의 조절에 의한 용존 산소량 유지와 배양중에 탄소원 첨가에 의한 교반형 생물반응기에서 배양 성이 향상됨을 알 수 있다.
세포 생존율 측정.
SK-MEL-2 세포 부유액(Cell suspension)을 1×105 cells/㎖의 농도로 96-웰 플레이트의 웰에 100 ㎕씩 가하여 배양기에서 24시간 동안 안정화시킨 후, 상기 실시예 6의 건조물을 5~100 mg 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 2.5 mg/㎖ MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5- Diphenyltetrazolium bromide 용액을 웰당 50 ㎕씩 넣어 4시간 동안 배양기에 방치한다. 이후 상층 액을 제거하고 DMSO를 웰당 100 ㎕씩 가하여 1분간 진탕(Shaking)하여 포르마잔(Formazan)을 완전히 용해한 후 ELISA 플레이트 리더(Plate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 배양 기간은 2일로 고정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 도 5을 참조하면, 실시예 6의 건조물 10 mg까지는 세포 생존율에 크게 영향을 미치지 못하였으나 건조물 첨가량이 증가함에 따라 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하여 건조물이 100 mg에서는 세포 생존율이 135%로 나타났다. 따라서 모발과 관련이 있는 멜라노마 세포인 SK-MEL-2 세포의 생존율을 증가시킴을 알 수 있었다.
티로시나아제( Tyrosinase ) 효소의 활성 측정 및 멜라닌(Melanin) 정량.
티로시나아제 활성(Tyrosinase activity) 측정은 0.5×106 cell/㎖의 SK-MEL-2 세포 용액을 60 π 배양 접시(Tissue culture dish)에 가하여 배양기에서 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그 후 상기 실시예 6의 건조물을 5~100 mg 첨가하여 48시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하였다. 1% (w/v) Triton X-100을 10 mM Sodium phosphate buffer pH 6.8로 만들어 150 ㎕로 세포를 모은 다음에 2000 rpm에서 5분간 원심분리(Centrifuge)해서 각각의 상층액 40 ㎕에 기질인 도파(L-DOPA) 200 ㎕을 가해 37℃에서 1시간 배양하였다. 여기에서 생성된 Dopa chrome의 양을 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 정량은 원심 분리한 Pellet을 이용하여 농도별로 1 N NaOH 100 ㎕에 증류수 200 ㎕를 가해서 60℃에서 1시간 배양한 다음 완전히 녹인 후 405 nm에서 멜라닌의 양을 측정하였다. 위 실험은 첨가하지 않은 것을 기준(Control)으로 비교하였다. 그 결과는 도 6및 도 7에 나타내었다. 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 티로시아나제 활성 및 멜라닌의 생성은 첨가되는 건조물의 양이 증가할수록 증가하였으며, 건조물 100 mg 첨가 시에는 첨가하지 않은 경우에 비하여 각각 121%, 115%로 나타났다. 따라서 세리포리아 락세라타 건조물은 흑모 발생에 중요한 역할을 하는 티로시나아제의 활성을 증가시킴과 동시에 멜라닌의 생성량 또한 증가시키는 것을 알 수 있었다.
카탈레이즈 활성 측정.
카탈레이즈 활성 측정은 시험관(13 mm 지름, 높이 100 mm)에 0.1 ㎖ 1% Tritone X-100과 0.1 ㎖ 30% 과산화수소수(Hydrogen peroxide)를 넣고 상온에서 적당히 섞어준다. 그런 다음 실시예 6의 세리포리아 락세라타 건조물을 5~100 mg 첨가하여 생성되는 산소 거품의 양을 측정하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다. 도 4를 참조하면, 첨가되는 건조물의 양이 증가할수록 생성되는 거품의 양은 증가하였다. 따라서 세리포리아 락세라타 건조물은 카탈레이즈 활성을 나타내어 나이가 들면서 감소하는 카탈레이즈를 보충할 수 있음을 알 수 있었다.
디스크 확산(Paper disk diffusion)법에 의한 항균 또는 항진균 활성 조사.
상기 실시예 6 시료 5.0 g을 95 g의 정제 수에 녹인 후에 사용하였으며, 배양 후 디스크 주위에 생성된 저해환의 반경(mm)의 크기로 항균력을 측정하였다.
항균 및 항진균 활성은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균, 구체적으로 그람 양성균(Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 6538, Propionibacterium acnes ATCC 6919) 과 그람 음성균(Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9017) 을 포함한 세균 5종, 효모(Candida albicans ATCC 11006, Saccharomyces cerevisiae KCTC 17299) 2종 및 무좀의 원인인 곰팡이(Microsporum audouinii ATCC 12332, Trichophyton rubrum ATCC 28188) 2종을 대상으로 조사하였다.
항균 활성 측정을 위한 감수성 세균은 Nutrient 아가(Beef extract 3g, Peptone 5g, agar 15g) 평판배지, 감수성 곰팡이는 Sabourauds 아가(Peptone 10 g, Glucose 40 g, agar 20 g) 평판배지, 감수성 효모는 YPD 아가(Yeast extract 10 g, Peptone 20 g, Dextrose 20 g, agar 15 g) 평판배지에 1 106 cfu/ml로 도말하였다.
상기 디스크 확산법은 감수성 균주가 도말 된 평판배지 위에 8 mm 지름의 paper disk(ADVANTEC, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 저항균 물질을 30 ㎕씩 일정하게 가하는 방법으로 수행하였다. 상기 디스크 확산법에 의한 항균 실험은, 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes ATCC 6919)는 혐기적 조건인 CO2 배양기에서 배양한 것을 제외하고 나머지 세균은 호기적 조건에서 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.
항진균 실험(효모와 곰팡이)의 경우 25℃에서 24시간 내지 72시간 동안 배양하여 분리 균주가 생산하는 항균물질에 의한 감수성 균주의 생육저지환 생성 여부를 관찰하는 방법으로 수행하였다. 그 결과는 도 9 및 아래 표 10 내지 표 12에 나타내었다.
그람음성균에 대한 항균활성 결과 1.

그람음성균에 대한 항균활성 결과/
균주		 항균력(mm)
실시예 6
(건조물)		 실시예 7
(세포 외 다당체)		 실시예 8
(베타-글루칸)
Bacillus subtilis ATCC 6633 1.3 1.6 1.7
Escherichia coli ATCC 8739 0.8 0.3 0.9
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9017 1.2 0.5 1.5
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
그람 음성균에 대한 항균활성 결과 2.
그람양성균에 대한 항균활성 결과/균주 항균력(mm)
실시예 6
(건조물)		 실시예 7
(세포 외 다당체)		 실시예 8
(베타-글루칸)
Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC 6538		 1.8 2.2 2.1
Propionibacterium acnes ATCC 6919 0.3 0.1 0.5
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
상기 표 11과 표 12에서 보는 바와 같이, 모두 그람음성균인 Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9017에 대해 높은 저해 활성을 나타내었고, 또한 그람양성균인 Staphylococcus aureus subsp . aureus ATCC 6538, Propionibacterium acnes ATCC 6919에 대해서도 그람 음성균에 대한 항균 활성과 비교하여 높은 저해 활성을 나타내었다.
진균류에 대한 항진균 활성 결과.

진균류에 대한 항진균 활성 결과/균주		 항균력(mm)
실시예 6
(건조물)		 실시예 7
(세포 외 다당체)		 실시예 8
(베타-글루칸)
Candida albicans ATCC 11006 0.7 0.8 1.1
Saccharomyces cerevisiae
KCTC 17299		 0.5 0.7 1.0
Microsporum audouinii
ATCC 12332		 0.3 0.7 1.1
Trichophyton rubrum ATCC 28188 0.6 1.1 1.7
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
상기 표 14를 참조하면, 효모에 대한 실험에서는 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물, 세리포리아 락세라타 배양물로부터 제조된 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 Candida albicans ATCC 11006, Saccharomyces cerevisiae KCTC 17299에 대해 생육 저해활성을 나타내었다. 무좀의 원인균인 Microsporum audouinii ATCC 12332, Trichophyton rubrum ATCC 28188에 대해서도 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물, 세리포리아 락세라타 배양물로부터 제조된 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 생육 저해활성을 나타내었다.
상기 실험결과에서 세균, 효모, 그리고 곰팡이에 대해 생육저해에 대한 활성은 베타-글루칸, 건조물, 세포 외 다당체 순으로 높게 나타났다.
청결 효과 시험.
상기 실시예 6의 건조물을 시험 균주가 포함되어 있는 균체액에 첨가하여 항균력과 항진균력을 조사하였다. 실시예 6에서 제조된 시료 4.0 g을 96 g의 정제 수에 녹인 후에 조제액으로 사용하였으며, 항균력에 사용한 시험 균주는 Staphylococcus aureus subsp . aureus ATCC 6538이며 항진균력에 사용한 시험 균주는 Candida albicans ATCC 11006와 Trichophyton rubrum ATCC 28188였다.
시험 방법은 항균력에 사용하기 위한 시험 균주를 액체배지(Nutrient broth)에 37℃에서 24시간 배양하여 배양된 균체를 생리 식염수로 희석하여 시험 균주 희석액(1×107 CFU/㎖)을 만든다. 시험 균주 희석액 0.5 ㎖에 0.5 ㎖의 실시예 2의 조제액을 첨가하였다. 1분, 5분, 10분 후에 현탁액 0.2 ㎖를 Nutrient 아가 평판배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니를 계수하여 살균력을 관찰하였다.
항 진균력에 사용한 시험 균주로 효모인 Candida albicans ATCC 11006의 생육은 YPD 액체배지에 25℃에서 48시간 배양하여 배양된 균체를 생리 식염수 희석하여 시험 균주 희석액(1×107 CFU/㎖)을 만든다. 시험 균주 희석액 0.5 ㎖에 0.5 ㎖의 실시예 3의 조제액을 첨가하였다. 1분, 5분, 10분 후에 현탁액 0.2 ㎖를 YPD 아가 평판배지에 도말하여 25℃에서 48시간 배양한 후 콜로니를 계수하여 살균력을 관찰하였다. 항 진균력에 사용한 시험 균주로 곰팡이인 Trichophyton rubrum ATCC 28188의 생육은 Sabourauds 액체배지에 25℃에서 72시간 배양하여 5㎖에 현탁하고, 원심분리(3,500 rpm) 하여 포자를 회수하였다. 회수된 포자를 멸균된 증류수와 트윈 20(Tween 20) 을 첨가하여 약 1×106 cell/㎖이 되도록 조정된 포자용액 0.5 ㎖에 실시예 2의 조제액 0.5 ㎖를 혼합하여, 1분, 5분, 10분 후에 현탁액 0.2 ㎖를 Sabourauds 아가 평판배지에 도말하여 25℃에서 96시간 배양한 후 콜로니를 계수하여 살균력을 관찰하였다. 대조구로는 식염수를 사용하였다. 그 결과는 아래 표 13, 14 내지 15에 나타내었다.
항균력 실험 결과.
항균력 실험 결과/균주 균체 수(CFU/㎖)
1분 5분 10분
식염수 7.5 ×106 3.5 × 106 2.8 ×106
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 6538 1.5 ×105 2.7 × 103 100 이하
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
효모에 대한 항진균력 실험 결과.
효모에 대한 항진균력 실험 결과/균주 균체 수(CFU/㎖)
1분 5분 10분
식염수 7.5 × 106 3.5 × 106 2.8 ×106
Candida albicans ATCC 11006 2.5 ×105 3.4 × 102 100 이하
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
곰팡이에 대한 항진균력 실험 결과.
곰팡이에 대한 항진균력 실험 결과/균주 균체 수(CFU/㎖)
1분 5분 10분
식염수 5.2 ×105 5.1 × 105 4.9 × 105
Trichophyton rubrum ATCC 28188 1.5 × 105 2.7 × 104 2.1 × 102
실험장소 : CL 바이오 기업 부설연구소.
상기 표 13, 14 내지 15에서 보는 바와 같이, 식염수를 사용한 대조구에서는 균체 수가 약간의 감소를 제외하고는 일정하게 나타났으나, 실시예 액체을 첨가한 경우에는 모든 시험 균주에서 균체 수가 감소하였다.
비듬 제거 및 모발 상태 개선용 샴푸와 린스 제조.
총 100명(남: 50명, 여: 50명)으로 구성된 대상자에 대하여 1일 2회, 매일 2개월간 동일한 양으로 상기 실시예 3에서 수득한 세리포리아 락세라타 배양물, 건조물, 추출물, 세포 외 다당체, 베타글루칸을 함유한 샴푸를 다음과 같은 조성으로 제조하였다. 상기 실시예 3에서 수득한 세리포리아 락세라타 배양물, 건조물, 추출물, 세포 외 다당체, 베타글루칸, 글루카메이트, 양이온화구아검, 한방액, 판테논, 글리세린, DLES, 코코베타인, 실크아미노산, 마린엘라스틴, 콜라겐 중 선택된 적어도 어느 하나 이상의 물질에 정제 수를 첨가하여 가열 및 블랜딩을 통해 전체 100 wt%가 되도록 하여 제조된 샴푸의 효과를 확인하였다.
또한, 상기 실시예 3에서 수득한 세리포리아 락세라타 배양물, 건조물, 추출물, 세포 외 다당체, 베타글루칸, 정제수, EDTA-2Na, cetrimonium chloride, propylene glycol, Raraffin wax, 올리브왁스, 녹차추출물, 감초추출물, 판테놀, 글리세린, 한방방부제 중 선택된 적어도 어느 하나 이상의 물질에 정제 수를 첨가하여 가열 및 블랜딩을 통해 전체 100 wt%가 되도록 하여 제조된 린스의 효과를 확인하였다.
대상자에 대한 효능 결과.
하기 표 18에 나타난 바와 같이 비듬 감소, 모발 두께, 모발 볼륨감 향상은 성분별로 차이를 나타내었으나, 탈모 방지, 발모 촉진, 백발 발생이 억제되어 원래의 흑발 색으로 환원되는 경우는 모든 성분에서 효과가 나타났다.
비듬 제거 및 모발 상태 개선용 샴푸 테스트 결과.
비듬 감소 모발 두께 모발 볼륨감 탈모 방지 발모 촉진 백발 발생 억제
배양물 1개월 후 - - - + + ++
2개월 후 + + + ++ ++ ++
농축물 1개월 후 + + ++ ++ ++ ++
2개월 후 ++ ++ ++ ++ ++ ++
건조물 1개월 후 + ++ + ++ + ++
2개월 후 ++ ++ + ++ + ++
세포 외 다당체 1개월 후 - - - ++ ++ ++
2개월 후 - - - ++ ++ ++
베타글루칸 1개월 후 ++ - - + + +
2개월 후 ++ - - ++ ++ +
(+++ : 매우 좋음, ++ : 좋음, + : 개선효과, - : 변화없음)
비듬 제거 및 모발 상태 개선용 린스 테스트 결과.
비듬 감소 모발 두께 모발 볼륨감 탈모 방지 발모 촉진 백발 발생 억제
배양물 1개월 후 - - - + + ++
2개월 후 + + + ++ ++ ++
농축물 1개월 후 + + ++ ++ ++ ++
2개월 후 ++ ++ ++ ++ ++ ++
건조물 1개월 후 + ++ + ++ + ++
2개월 후 ++ ++ + ++ + ++
세포 외 다당체 1개월 후 - - - ++ ++ ++
2개월 후 - - - ++ ++ ++
베타글루칸 1개월 후 ++ - - + + +
2개월 후 ++ - - ++ ++ +
(+++ : 매우 좋음, ++ : 좋음, + : 개선효과, - : 변화없음)
구체적인 임상례 .
1) 연령, 성별 및 직업: 65세, 남, 자영업
사용 기간 : 실시예 에서 제조된 수용액을 1일 2회 2개월간 두피에 바르게 하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이 상기 임상 대상자는 두피에 바르기 시작한 날부터 10일이 지나면서 효과가 나타나기 시작하여, 3개월 후에는 70% 이상이 흑발로 변화되는 현상을 볼 수가 있었다.
2) 연령, 성별 및 직업: 49세, 남, 회사원
사용 시간 : 실시예 에서 제조된 농축액을 1일 2회 2개월간 두피에 바르게 하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이 상기 임상 대상자는 두피에 바르기 시작한 날부터 7일이 지나면서 효과가 나타나기 시작하여, 1개월 후에는 90% 이상이 흑발로 변화되었다.
본원은 이와 같이 샴푸와 린스에 있어 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸이 상기 샴푸와 린스에 함유된 것을 구성으로 한다.
본원의 세리포리아 락세라타 배양법은 고체배양과 액체 종 배양을 거친 후 대량 본 배양하는 단계를 포함하며 배양법은 교반형 생물반응기를 사용하며 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물이 상기 샴푸와 린스에 함유되되.
상기 세리포리아 락세라타를 배양물, 농축물, 이의 건조물, 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500 rpm으로 조절하는 것을 구성으로 한다.
더불어 상기 세리포리아 락세라타를 배양물, 농축물, 이의 건조물, 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물의 배양 단계에서 공기 공급량을 0.01~2 vvm으로 조절하며 상기 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스는 본 배양 단계에서 내압을 0.5~1.5 kg/cm2으로 조절하며 상기 본 배양 단계에서 배양 중 탄소원을 첨가하여 배양하는 하는 것을 특징으로 한다.
아울러 상기 본 배양 단계에서 탄소원 첨가시 배양물에 1 L 당 탄소원을 0.1 ~ 10% 첨가하여 배양하며 상기 샴푸와 린스는 액체 배양한 세리포리아 락세라타 배양물. 세리포리아 락세라타 배양물의 농축물. 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물. 상기 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 또는 베타글루칸 함량을 증가시키게 된다.
상기 샴푸와 린스는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 추출물, 농축물, 건조물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하게된다.
더불어 상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량% 또는 0.05~ 5중량 % 가 함유되는 것을 구성으로 하며 본원에서는 수치에 대한 한계나 제어를 본원에서는 받지 않음을 밝혀둔다.
상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 농축물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 1 ~ 50중량 %가 함유하며, 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물, 건조물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20 중량 %가 함유되며, 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 0.05 ~ 5 중량 %가 함유되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스를 제조하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 샴푸와 린스는 그람-양성 및 그람-음성균, 진균에 대하여 항균력 및 항진균력을 갖고 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 추출물, 농축물, 건조물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고 상기 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물 배양에 있어서, 탄소원은 말토오스글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스, 갈락토오스, 만노오스, 당분 중에서 선택된 적어도 어느 하나이며 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산, 펩톤, 콘 스티프 리쿼 중에서 선택된 적어도 어느 하나가 투입되는 것을 본원의 구성으로 하게 되는 것이다.
이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
본원은 특히, 버섯 곰팡이의 액체배양은 생물 전환기술을 최적화함으로써 단시간에 효과적으로 유용물질을 생산할 수 있어서 경제성이 높다. 따라서 식용, 약용을 포함한 다양한 버섯 곰팡이 배양에 관한 연구, 특히 차별화된 다양한 물질의 생산 등이 우수한 종균의 선별 및 이를 이용한 생물전환기술의 최적화기술은 산업적으로 매우 유용하다는 것이다.
본 발명자들은 균사체 배양물을 샴푸와 린스에 함유시켜, 모발 및 두피 상태 개선 또는 흑모 생성 촉진, 항균 및 항진균 등의 특징을 갖는 샴푸와 린스에 관한 것으로 불특정 다수가 매일같이 사용하는 샴푸와 린스에 다양한 기능을 부가함으로 국민보건에 이바지함은 물론 특히 탈모를 예방하고 흑모를 촉진하도록 하여 많은 사람이 탈모나 염색 등의 머리 관리로부터의 스트레스 없는 생활을 하는데 본원의 목적이 있고 제품의 출시시에는 단 시간대에 세계 샴푸와 린스 시장을 선점할 수 있는 장점이 있다.

Claims (16)

  1. 샴푸와 린스에 있어 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸이 상기 샴푸와 린스에 함유된 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  2. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타 배양법은 고체배양과 액체 종 배양을 거친 후 대량 본 배양하는 단계를 포함하여 완성되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  3. 청구항 제1항 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타를 배양한 배양법은 교반형 생물반응기를 사용하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  4. 샴푸와 린스에 있어 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물이 상기 샴푸와 린스에 함유되되;
    상기 세리포리아 락세라타를 배양물, 농축물, 이의 건조물, 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500 rpm으로 조절하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  5. 청구항 제1항 또는 제4항 어느 한 항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타를 배양물, 농축물, 이의 건조물, 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물의 배양 단계에서 공기 공급량을 0.01~2 vvm으로 조절하는 것을 특징으로 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  6. 청구항 제5항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스는 본 배양 단계에서 내압을 0.5~1.5 kg/cm2으로 조절하되: 상기 본 배양 단계에서 배양 중 탄소원을 첨가하여 배양하는 하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  7. 청구항 제6항에 있어서,
    상기 본 배양 단계에서 탄소원 첨가시 배양물에 1 L 당 탄소원을 0.1 ~ 10% 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샴푸와 린스는 액체 배양한 세리포리아 락세라타 배양물. 세리포리아 락세라타 배양물의 농축물. 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물. 상기 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 또는 베타글루칸 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  9. 청구항 제8항에 있어서,
    상기 샴푸와 린스는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 추출물, 농축물, 건조물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  10. 청구항 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량% 또는 0.05 내지 5 중량%가 함유되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  11. 청구항 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샴푸와 린스는 그람-양성 및 그람-음성균, 진균에 대하여 항균력 및 항진균력을 갖는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  12. 청구항 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물, 농축물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 1 ~ 50중량 %가 함유되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  13. 청구항 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물, 건조물 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20중량 %가 함유되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  14. 청구항 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸 중 적어도 하나 또는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 총 중량에 대하여 0.05 ~ 5중량 %가 함유되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  15. 청구항 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샴푸와 린스는 모발 및 두피 상태 개선 또는 흑 모 생성 촉진, 항균 및 항진균 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
  16. 청구항 제1항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세리포리아 락세라타 배양물, 농축물, 이의 건조물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 추출물 배양에 있어서, 탄소원은 말토오스글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스, 갈락토오스, 만노오스, 당분 중에서 선택된 적어도 어느 하나이며 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산, 펩톤, 콘 스티프 리쿼 중에서 선택된 적어도 어느 하나가 투입되는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타를 함유하는 샴푸 또는 린스.
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