KR20170105113A

KR20170105113A - 바이러스 감염을 억제하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170105113A
Application number: KR1020177023926A
Authority: KR
Inventors: 래리 슐레진저; 제이콥 욘트; 알렉산더 즈키브스키; 스테판 프로니크; 마리아 지저스 투넌; 케이반 잔디
Original assignee: 아르노 테라퓨틱스 인코포레이티드; 오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2017-09-18
Also published as: EP3250553A1; WO2016123259A9; WO2016123259A1; JP2018506529A; CN107922343A; EP3250553A4; AU2016211546A1; RU2017130031A; MX2017009812A; US20160213647A1; CA2974288A1

Abstract

AR-12 및 AR-12 유사체를 투여함에 의해 바이러스(예컨대, 인플루엔자, 후닌, 치쿤구니야, 뎅기, HIV, RHDV)에 감염된 숙주 또는 숙주 세포에서 바이러스 단백질 생산, 바이러스 감염, 및 바이러스 복제를 억제하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

바이러스 감염을 억제하기 위한 조성물 및 방법

우선권 주장

본 출원은 2015년 1월 28일 출원된 미국 가특허출원 번호 62/108,960, 2015년 2월 20일 출원된 미국 가특허출원 번호 62/118,766, 2015년 5월 8일 출원된 미국 가특허출원 번호 62/159,129, 및 2015년 7월 9일 출원된 미국 가특허출원 번호 62/190,706에 대한 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원은 빠짐없이 재진술된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다.

배경

어떠한 주어진 해에 인구의 5 내지 20%는 인플루엔자 바이러스에 감염되어 있고, 이러한 바이러스 및 그 합병증은 미국에서 인간 사망률의 상위 10개의 원인 중 하나로 남아 있다[1, 2]. 현재, 백신은 질병의 감소를 위한 가장 일반적인 방법이다. 그러나, 바이러스 단백질의 돌연변이에 의해 야기된 항원 변위는 기존의 적응 면역이 있는 환자조차도 감염되기 쉽게 만들 수 있다. 마찬가지로, 백신은 긴급한 인플루엔자 바이러스를 거의 예방하지 못해, 1918년 스페인 인플루엔자 범유행 및 2009년 H1N1 범유행과 같은 범유행에 대한 가능성을 발생시켰다[1]. 최근에, 병독성 H5N1 및 H7N9 바이러스는 또한 소규모 발병을 일으켜, 이러한 바이러스가 인간 사이에서 쉽게 전염될 수 있게 진화할 경우 광범위한 질병에 대한 우려로 이어졌다[3-7]. 따라서, 인플루엔자 바이러스는 항상 존재하는 건강 문제이며, 일반적인 방어 전략이 필요하다.

인플루엔자 바이러스 감염을 치료하기 위해 현재 이용되는 약물은 2개 부류로 제한된다: 뉴라미니다제 억제제 및 아다만탄[8]. 두 부류 모두는 바이러스 단백질을 표적으로 한다. 뉴라미니다제 억제제는 바이러스 복제의 최종 단계로서 바이러스가 세포로부터 분리되는 것을 일반적으로 허용하는 바이러스 뉴라미니다제를 표적으로 한다. 따라서 뉴라미니다제 억제제는 현저한 영향을 미치려면 감염 초기에 이용되어야 한다. 약물 아만타딘과 같은 약물 아다만탄은 세포 감염 동안 바이러스 탈외피에 필요한 이온 채널인 바이러스 M2 단백질을 억제한다. 인플루엔자 바이러스는 매우 돌연변이되기 쉬우므로, 이들 약물 부류 중 하나 또는 둘 모두에 대한 내성이 관찰되었고, 현재 순환되는 균주는 아만타딘에 대한 완벽한 내성을 나타내어, 이 약물을 더 이상 임상적으로 유용하지 않게 만들었다[8]. 따라서, 새로운 약물이 요구된다. 포유동물 세포는 바이러스보다 훨씬 덜 돌연변이되는 경향이 있기 때문에, 내성의 문제를 해결하는 한 가지 방법은 바이러스 복제에 필수적인 숙주 세포 경로를 표적으로 하는 약물을 이용하는 것이다.

AR-12는 오하이오 주립 대학에서 발견된 경구 생체이용가능한 소분자 셀레콕시브 유도체(이전에 OSU-03012로서 알려짐)이다. 이 화합물은 종양학 환경에서 처음 개발되었고 I상 연구는 장기간 구강 노출에 최대 33주까지 허용가능한 안전성 프로파일을 입증하였다. 종양학 연구에서 연구된 AR-12 용량은 감염병 환경에서 필요한 노출을 실질적으로 초과할 가능성이 크다. AR-12는 항-종양, 항-진균, 및 항-박테리아 활성을 나타내는 것으로 이전에 밝혀졌다. AR-12는 세포내 박테리아를 보유한 세포의 자가포식현상을 유도하는 것으로 여겨지며 특정 박테리아에 대해 직접적인 활성을 지님이 입증되었다. 뒷받침하는 전임상 연구는 AR-12가 신속한 혈액뇌 장벽 침투 및 조직에서의 상당한 축적을 가져, 혈중 농도의 몇 배를 초과함을 입증하였다[1].

AR-12는 자가포식현상의 유도를 포함하여 세포에서 많은 생물학적 활성을 갖는 것으로 나타났다[9-16]. AR-12에 대해 제안된 다양한 세포 표적은 이것이 인플루엔자 바이러스 감염에 어떤 효과를 미칠지 선험적으로 불명확하게 하였다. 마찬가지로, 인플루엔자 바이러스 감염 및 복제에 대한 자가포식현상의 효과는 명확하지 않다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질은 세포의 자가포식현상을 억제한다고 기재되었으며, 이는 이러한 세포 과정이 바이러스에 유해함을 시사한다[17]. 그러나, 다른 연구들은 인플루엔자 바이러스 단백질이 세포의 자가포식현상을 유도하고, 자가포식현상이 바이러스 복제에 유익함을 역으로 보여 주었다[18, 19]. 따라서 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 감염 동안 급성 폐 손상에 기여하는 염증성 사이토카인, 반응성 산소 종, 및 기타 인자의 중요한 공급원인 대식세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 AR-12 전처리의 효과를 실험적으로 조사하였다[20, 21].

인플루엔자 바이러스 외에, 다른 바이러스가 인간 및 동물 둘 모두에 상당한 정도의 질병을 일으킨다. 예를 들어, 후닌(Junin), 뎅기(Dengue), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스, 및 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스는 사망 및 장기간의 질병으로 이어질 수 있는 장기 및 단기 둘 모두의 감염을 인류에 안겨 주었다. 효과적인 백신 및 치료법은 많은 바이러스 감염에 대해 확인되기 어려우며 바이러스 변이체 및 현재 치료법에 대한 내성의 발생으로 제한적인 효능을 갖는다.

바이러스 분류

볼티모어(Baltimore) 분류는 핵산(DNA 또는 RNA), 가닥(strandedness)(단일 또는 이중-가닥), 센스, 및 복제 방법을 포함하는 기준에 따라 다음과 같이 바이러스를 그룹으로 체계화한다:

표 1

정확한 항바이러스 작용 메커니즘이 계속하여 평가되고 있으나, 확립된 증거 자료는 AR-12(OSU-03012)가 숙주 이펙터 세포 자가포식현상의 유도인자이고 이에 따라 세포 면역 반응을 강화시킴을 나타낸다. AR-12는 GRP78(BiP, HSPA5로도 알려짐)을 억제하여, PERK의 상향 조절을 일으키고, 이는 결국 자가포식소체의 형성 및 후속적으로 숙주 세포 자가포식현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. AR-12는 또한 샤페론 단백질 HSP70, HSP27 및 HSP90을 하향 조절한다. 숙주 샤페론 단백질의 활용 또는 "하이재킹(highjacking)"은 바이러스 복제, 어셈블리 및 항상성에 중요하다. GRP78의 하향 조절은 숙주 세포 자가포식현상의 유도인자로서 공지된 PERK의 상향 조절을 일으키므로, 상기 개요된 두 작용 메커니즘은 관련이 있거나 의존적일 수 있다.

바이러스 복제에서 분자 샤페론의 역할

폴딩되지 않은 단백질 반응

분자 또는 단백질 샤페론은 단백질 품질 관리에 필수적인 이펙터이며, 폴리펩티드가 이들의 3차원 입체 구조로 적절히 폴딩되는 것을 체계화/보조하기 위한 주된 체크포인트로서 기능하고, 미스폴딩된 단백질이 변성 및 응집되는 것을 방지하며 또한 종말에 미스폴딩된 단백질을 분해를 위한 단백분해 시스템으로 유도하는 기능을 할 수 있다. Xiao 2010[61]은 폴딩에 있어서 단백질 샤페론의 관련성, 및 바이러스 단백질 폴딩 및 바이러스 단백질 및 바이런(viron)의 세포내 기능적 입체형태로의 어셈블리의 품질 관리를 설명한다.

바이러스는 생존가능한 바이러스 복제를 위해 근본적인 숙주 세포 기계에 의존적이다. 다수의 바이러스 병원체는 대량의 바이러스 단백질을 생산하기 위해 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR)과 같은 숙주 단백질 품질 관리 기계를 활용(예컨대, 단백질 폴딩의 향상)하고 와해시켜, 바이러스 생명 주기의 완료를 가능하게 하는 메커니즘을 진화시켜 왔다. 또한, 최근 연구는 일부 바이러스가 그 자신의 바이러스 샤페론-유사 단백질을 인코딩하여 감염성을 향상시킴을 나타낸다[61].

UPR 및 단백질 어셈블리를 포함하는 숙주 세포 단백질 품질 관리 요소의 조절은 바이러스 복제에 중요하다. 번역 후 조절을 요구하는 단백질은 세포질세망(ER)에서 처리되고 다수의 세포 "스트레스"는 ER의 기능장애로 이어져 폴딩되지 않은 폴리펩티드 부하/미스폴딩된 단백질 부하 및 세포의 단백질-폴딩 용량의 왜곡을 발생시킬 수 있다. 세포는 ER 및 골지(Golgi) 장치 둘 모두를 포함하는 단백질 폴딩을 모니터하는 고유의 품질 관리 시스템을 갖는다. 폴딩되지 않은 또는 미스폴딩된 단백질은 분해를 위해 태깅되거나(tagged) 폴딩 사이클을 통해 반송된다. 폴딩되지 않은 폴리펩티드 또는 부정확하게 폴딩된 단백질의 지속적인 축적은 UPR을 촉발시킬 수 있다. UPR은 3개의 막관통 ER 수용체: (1) 활성화 전사 인자 6(ATF6), (2) 이노시톨 요구 키나제 1(IRE1) 및 (3) 이중-가닥 RNA-활성화된 단백질 키나제(PKR)-유사 세포질세망 키나제(PERK)에 의해 매개되는 신호절단 프로그램이다. 포유동물 세포에서, 고도로 보존된 ER 잔류 샤페론, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP)(글루코스-조절된 단백질 78(GRP78)로도 공지됨) 및 열 충격 70 kDa 단백질 5(HSPA5)는 신생 단백질의 폴딩 및 어셈블리에 관여하고 UPR의 주된 관리자로서 작용하여, 3개의 매개체: PERK, ATF6 및 IRE1과 상호작용한다. Reid 2014[57], He 2006[41], Lee 2005[48].

UPR은 세 가지 기능을 수행한다; 적응, 경보 및 아폽토시스. UPR 적응 단계 동안, 세포는 단백질 폴딩을 향상시키는 샤페론의 발현을 유도함에 의해 폴딩 항상성을 재확립하려는 시도를 한다. 동시에, 세포 번역은 ER 단백질 폴딩 부하를 감소시키기 위해 감소하고 폴딩되지 않은 단백질의 분해는 증가한다. 이러한 두 단계가 실패하면, UPR은 미토콘드리아 매개된 아폽토시스의 유도와 함께 세포 경보를 유도한다. Chakrabarti 2011[27]. He 2006[41]은 바이러스 감염 동안 UPR의 조절을 설명한다.

인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 항바이러스 약물에 대한 내성 메커니즘의 발생 다음을 치료하기가 매우 어렵다고 입증된 질병인 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 물질로 확인된 그룹 VI 레트로바이러스이다. HIV는 렌티바이러스로서 분류된 단일-가닥 RNA 레트로바이러스이다. 렌티바이러스는 또한 SIV(원숭이 면역결핍 바이러스), FIV(고양이 면역결핍 바이러스), 비스나(Visna), 및 CAEV(염소 관절염 뇌염 바이러스)를 포함한다.

HIV는 당단백질인 CD4(분화 4의 클러스터) 및 세포 표면 상의 다른 수용체에 결합하고 세포 막과 융합하여 세포로 진입함에 의해 대식세포 및 CD4+ T 세포를 감염시킨다. 바이러스 감염에 요구되는 바이러스 단백질(예컨대, 역전사효소, 인테그라제, 리보뉴클레아제, 및 인테그라제)이 전사되고 생산된다. HIV RNA는 숙주 세포 DNA로 통합되는 이중-가닥 DNA로 역전사된다. 활성 바이러스 복제 동안, 통합된 DNA 프로바이러스는 바이러스 단백질로 전사되고 새로운 바이러스 입자로 패키징되는 mRNA로 전사된다. 새로운 바이러스 입자는 세포를 빠져 나온 다음 추가 숙주 세포를 감염시키거나 또 다른 숙주에 전염될 수 있다. 역전사효소 과정은 매우 오류가 발생하기 쉬워서, 항-바이러스 약물 내성의 발달로 이어질 수 있는 돌연변이를 발생시킨다.

현행 요법은 뉴클레오시드 유사체, 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 융합 또는 진입 억제제, 및 인테그라제 억제제를 포함한다. 그러나, 이러한 요법의 장기간 사용은 치료 효과를 감소시키는 바이러스 내성의 발달 또는 내성 HIV 균주의 선택을 초래할 수 있고 수반되는 부작용 및 약물-약물 상호작용의 가능성과 함께 약물의 조합물의 사용이 필요할 수 있다.

토끼 출혈성 질병 바이러스(RHDV)는 칼리시바이러스과의 그룹 IV 바이러스이고 토끼 출혈성 질병(RHD)의 원인 물질이다. 간 손상 및 상해는 RHD에서 중심적인 병원체 역할을 하고 RHD 간 손상의 조직병리학은 인간에서 전격성 간 부전을 일으키는 일반적으로 바이러스 간염이라고 불리는 바이러스 감염과 유사하다. RHDV 모델은 전격성 간 부전의 동물 모델의 많은 요건을 충족한다. (Vallejo 2014)[64].

뎅기열 감염은 세계의 열대 및 아열대 지역에서 심각한 바이러스 질환이다. 이는 연간 적어도 500,000건의 병원 입원을 차지하며 대규모 병원 자원을 소비한다. 뎅기열은 세계의 많은 열대 및 아열대 지역의 풍토병이며 모기 벡터인 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) 및 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)가 발견되는 다른 국가로 빠르게 확산되고 있다. 이러한 모기-매개 질환은 열대 및 아열대 지역의 풍토적인 지역에 살고 있는 적어도 25억 인구에게 건강상 위협을 가하는 것으로 추정된다. 이것은 현재 가장 빠르게 확산되는 모기-매개 질환 중 하나이다.

뎅기 바이러스(DENV)는 외피보유 바이러스이며 네 개의 별개 유전형(DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4)을 갖는 플라비바이러스과의 구성원이다. 현재, 이용가능한 특정 항-뎅기 약물치료는 없으며 치료 절차는 단지 지지적 치료일 뿐이다. 또한, 이용가능한 승인된 뎅기열 백신이 없다. 따라서, 뎅기 바이러스에 대한 항바이러스 치료법을 찾아야 할 시급한 필요성이 있다.

필요한 것은 바이러스 복제, 자가-어셈블리, 및 특정 바이러스에 특이적인 과정으로부터 "업스트림" 증식에 필수적인 메커니즘을 방해하는 광범위한 스펙트럼의 항-바이러스 화합물이다. 그러한 화합물은 내성 바이러스를 발생시킬 위험이 감소되고 부작용이 적을 것이다.

개요

본원에 기재된 양태는 AR-12에 의해 바이러스 감염을 억제하고/거나 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

AR-12는 다양한 제안된 세포 표적을 갖는 생물학적 활성 분자이다. 본 발명자들은 AR-12가 인플루엔자 바이러스 감염에서 급성 폐 손상을 매개하는 중요한 세포 유형인 대식세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 결과는 AR-12가 인플루엔자 바이러스 및 유사한 진입 또는 복제 전략을 활용하는 다른 바이러스에 의해 야기된 질환의 예방 또는 치료에 유익한 약물일 수 있음을 보여 준다. 또한, 본 발명자들은 AR-12가 비제한적으로 라싸(Lassa), HIV-1, HIV-2, 약물 내성 HIV, 뎅기, 타입 5 아데노바이러스, 홍역, 볼거리, 콕사키(coxsackie), 거대세포바이러스(CMV) 및 치쿤구니야(ChikV)를 포함하는 많은 바이러스 병원체에 걸쳐 실질적인 항-바이러스 활성을 지님을 발견하였다.

AR-12에 의한 숙주 단백질 샤페론의 억제는 AR-12의 광범위한 스펙트럼의 항바이러스 활성 및 특정 항바이러스 약물 내성 메커니즘을 극복할 수 있는 능력을 발생시키는 것으로 여겨진다. 이론에 구속되지 않으며, AR-12의 항-바이러스 효과는 GRP78 및 다른 단백질 샤페론의 하향 조절/억제와 함께 자가포식현상의 향상 때문인 것으로 여겨진다.

본원에 기재된 양태는 AR-12를 숙주에 투여함에 의해 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 단백질 생산을 억제하는 방법을 제공하고, 바이러스 단백질 생산은 미처리된 숙주에 비해 적어도 약 50%만큼 감소한다.

본원에 기재된 양태는 또한 AR-12를 숙주 세포에 투여함에 의해 숙주 세포의 바이러스 감염을 감소시키는 방법을 제공하고, 감염된 세포의 퍼센트는 미처리된 세포에 비해 적어도 약 50%만큼 감소한다.

추가로 본원에 기재된 양태는 AR-12를 숙주에서의 바이러스 복제를 적어도 약 50%만큼 감소시키기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 복제를 억제하는 방법을 제공한다.

본원에 기재된 양태는 AR-12를 약 1 μM 내지 100 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 치쿤구니야 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법을 제공한다.

본원에 기재된 양태는 또한 AR-12를 약 0.15 μM 내지 0.55 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 후닌 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법을 제공한다.

AR-12(OSU-03012로도 공지됨)는 항-종양, 항-진균, 및 항-박테리아 활성을 나타내는 것으로 이전에 밝혀졌다. AR-12는 세포내 박테리아를 보유한 세포의 자가포식현상을 유도하는 것으로 여겨진다. 그러나, 지금까지 인플루엔자 및 다른 바이러스와 관련하여 AR-12 활성의 이러한 메커니즘은 제시된 바 없다.

추가로 본원에 기재된 양태는 AR-12에 의해 레트로바이러스 복제 및/또는 증식을 억제 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 또 다른 양태에서, 렌티바이러스는 HIV-1, 약물 내성(DR)을 갖는 HIV-1, 및 HIV-2로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, AR-12는 적어도 약 0.30 μM의 혈액 또는 조직 농도를 달성하기에 충분한 양으로 HIV DR 균주에 감염된 숙주에 제공된다.

추가 양태는 AR-12를 적어도 약 25 mg/kg의 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 바이러스-유도된 전격성 간 부전을 갖는 숙주의 생존율을 증가시키는 방법을 제공한다.

추가 양태는 AR-12를 적어도 약 1 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 뎅기 바이러스에 감염된 숙주에서 뎅기 바이러스 감염을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 개시 내용의 특징 및 본질은 첨부된 도면과 관련하여 하기 기술된 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1은 AR-12가 RAW264.7 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 단백질(핵산단백질 및 기질 단백질 1)의 생산을 억제하는 것을 보여주는 예시적인 웨스턴 블롯을 도시한다;
도 2는 AR-12가 RAW264.7 세포의 인플루엔자 바이러스 A 감염을 예방하는 것을 보여준다;
도 3은 HEK293T 리포터 세포주(ELVIRA®)에서 인플루엔자 A H3N2 균주의 발현 및 세포 생존력에 대한 AR-12의 예시적인 효과를 도시한다;
도 4는 HEK293T 리포터 세포주(ELVIRA®)에서 인플루엔자 A H1N1 균주의 발현 및 세포 생존력에 대한 AR-12의 예시적인 효과를 도시한다;
도 5는 AR-12로 처리된 Vero 및 A549 세포의 세포독성에 대한 예시적인 용량-반응 곡선을 도시한다;
도 6은 AR-12로 처리 후 후닌 바이러스의 3개 균주에서 Vero(상부 패널) 및 A549 세포(하부 패널)에서의 예시적인 바이러스 역가 결과를 도시한다;
도 7은 치쿤구니야 바이러스에 감염된 Vero A 세포에서 AR-12의 예시적인 항바이러스 및 항대사 효과를 도시한다;
도 8은 치쿤구니야 바이러스의 야생형(WT) 및 T-705(파비피라버(favipiravir)) 내성(RES) 균주에 감염된 Vero A 세포에서 AR-12의 예시적인 항바이러스 효과를 도시한다;
도 9는 PBMC 세포에서 AR-12에 의한 HIV-1 91US001 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 10은 PBMC 세포에서 AR-12에 의한 HIV-1 92HT599 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 11은 PBMC 세포에서 AR-12에 의한 HIV-2 CBL20 H9 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 12는 PBMC 세포에서 AR-12에 의한 HIV-2 CDC 310319 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 13은 PBMC 세포에서 AR-12에 의한 HIV-1 MDR769 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 14는 PBMC 세포에서 AZT에 의한 HIV-1 91US001 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 15는 PBMC 세포에서 AZT에 의한 HIV-1 92HT599 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 16은 PBMC 세포에서 AZT에 의한 HIV-2 CBL20 H9 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 17은 PBMC 세포에서 AZT에 의한 HIV-2 CDC 310319 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 18은 PBMC 세포에서 AZT에 의한 HIV-1 MDR769 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 19는 PBMC 세포에서 에파비렌즈(Efavirenz)에 의한 HIV-1 MDR769 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다;
도 20은 PBMC 세포에서 로피나버(Lopinavir)에 의한 HIV-1 MDR769 복제의 억제에 대한 예시적인 연구 결과를 도시한다; 및
도 21은 RHDV 감염 후 생존율의 예시적인 연구 결과를 도시하고, RHDV 감염 및 AR-12 또는 비히클 치료 후 생존 토끼의 백분율을 제공한다;
도 22는 혈액 생화학에 대한 RHDV 감염 및 AR-12 치료 효과의 예시적인 연구 결과를 도시한다; 및
도 23은 뎅기 바이러스에 감염된 세포에 대한 바이러스 수율 감소의 예시적인 연구 결과를 도시한다.

상세한 설명

하기 기재되는 방법, 조성물, 및 디바이스는 일반적으로 또한 구체적으로 기술될 수 있다. 설명이 어떤 측면에 특이적일 때, 그 측면은 결코 방법의 범위를 제한하지 않음이 주목되어야 한다.

AR-12는 여러 세포 경로를 표적화함이 제안되었다. 포유동물 세포는 복제 동안 돌연변이를 덜 일으키므로 바이러스 감염을 억제하기 위해 숙주 경로를 표적화하는 것은 약물 내성의 가능성을 감소시킨다. 추가로, AR-12가 대식세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시킨 본 발명자들의 실험은 아만타딘-내성인 균주를 활용하였다. AR-12가 치쿤구니야 바이러스를 억제시킨 본 발명자들의 실험은 T-705(파비피라버) 내성인 균주를 활용하였다. 따라서, AR-12는 다른 치료제에 내성인 바이러스 균주에 대해 활성일 수 있다.

AR-12는 항박테리아제인 것으로 밝혀졌으나, 항바이러스 활성은 이 화합물에 대해 아직까지 이전에 보고된 바 없다. 본 발명자들의 결과는 AR-12에 의한 인플루엔자 바이러스 감염의 억제를 처음으로 보여준다.

본원에서 사용되는 용어 "AR-12"는 하기 구조를 갖는 (C₂₆H₁₉F₃N₄O 및 2-아미노-N-(4-(5-(페난트렌-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)아세트아미드))를 나타낸다:

용어 "AR-12"는 또한 염, 및 예를 들어, AR-12의 유사체를 포함한다(예컨대, 전문이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 7,576,116, 8,546,441, 8,541,460, 8,039,502, 및 8,080,574에 기재된 화합물).

본원에 기재된 양태는 AR-12를 숙주에 투여함에 의해 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 단백질 생산을 억제하는 방법을 입증하고, 바이러스 단백질 생산은 미처리된 숙주에 비해 약 50%만큼 감소한다. 본원에서 사용되는 용어 "투여하다" 또는 "투여된"은 치료가 필요한 숙주 또는 환자를 치료하기 위해 활성 성분을 적용, 섭취, 흡입 또는 주입, 또는 처방하는 것을 의미한다. 숙주는 포유동물(예컨대, 인간, 개, 고양이, 말, 또는 소)일 수 있다. "미처리된 숙주"는 AR-12 또는 또 다른 항바이러스 치료를 수용하지 않은 숙주이다.

또 다른 양태에서, 바이러스 단백질은 인플루엔자 또는 인플루엔자 A에 의해 생산된다. 추가 양태에서, 바이러스 단백질은 구조적 또는 비-구조적 단백질(예컨대, 각각 기질 단백질 및 핵산단백질)이다.

또한 추가 양태는 AR-12를 숙주 세포에 투여함에 의해, 바이러스 단백질 생산을 포함하는 숙주 세포의 바이러스 감염을 감소시키는 방법을 제공하고, 감염된 세포의 퍼센트는 미처리된 세포에 비해 약 50%만큼 감소한다. 이러한 양태에서, 바이러스 단백질은 인플루엔자 또는 인플루엔자 A에 의해 생산된다. 또한, 이러한 양태에서, 바이러스 단백질은 구조적 또는 비-구조적 단백질(예컨대, 각각 기질 단백질 또는 핵산단백질)일 수 있다.

또 다른 양태는 AR-12를 숙주에서의 바이러스 복제를 약 50%만큼 감소시키기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 복제를 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 양태에서, 바이러스는 그룹 I 바이러스, 그룹 IV 바이러스, 그룹 V 바이러스, 및 그룹 VII 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.

이러한 양태에서, 바이러스는 인플루엔자 균주(예컨대, H3N2 및 H1N1), 후닌 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, HIV(약물 내성 HIV 포함), 토끼 출혈열 바이러스(RHDV), 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 피친데(Pichinde) 바이러스, 홍역 바이러스, 푼타 토로 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 계곡 바이러스, SARS 코로나바이러스, 타카라이브 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

한 양태에서, AR-12는 약 0.1 μM 내지 약 7 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 제공된다.

또 다른 양태에서, AR-12는 숙주 세포에서 약 1 μM 내지 100 μM의 농도를 달성하기에 충분한 양으로 치쿤구니야 바이러스에 감염된 숙주에 제공될 수 있다. 또한 다른 양태에서, 치쿤구니야 바이러스는 치쿤구니야 바이러스의 파비피라버-내성 균주이다. 이러한 양태에서, AR-12는 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에서 유일한 돌연변이(K291R)의 다음에 파비피라버(T-705)에 내성인 CHIKV(치쿤구니야 바이러스 - 그룹 IV) 균주의 복제에 대한 활성을 갖는 것으로 나타났다. 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에서 매칭된 291번 위치의 리신은 그룹 IV(양성 단일 가닥 RNA) 바이러스에서 고도로 보존되고 파비피라버(T-705)의 표적을 부여한다. 파비피라버(T-705) 및 그룹 IV 바이러스의 다른 바이러스 RNA 폴리머라제 억제제에 대한 이러한 내성의 메커니즘은 AR-12에 대해 내성을 부여하지 않는다.

도 1에 도시된 대로, AR-12는 바이러스 단백질 생산을 억제한다. 이러한 양태에서, RAW264.7 세포는 5 μM AR-12 또는 DMSO로 1시간 동안 전처리되었다. 세포를 배지 +/- 약물에서 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 균주 PR8(H1N1)로 감염시키고, 감염시킨지 24시간 후에 회수하고, 웨스턴 블롯팅을 위해 용해시켰다. 또한, 이러한 양태에서, 바이러스 단백질 생산은 적어도 약 50%만큼 감소한다. 웨스턴 블롯은 핵산단백질(α-NP), 기질 단백질(α-M1) 및 α-GAPDH(글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 - 대조군)의 수준을 보여준다.

도 2에 도시된 대로, AR-12는 바이러스 감염을 예방한다. 이러한 양태에서, RAW264.7 세포를 5 μM AR-12 또는 DMSO로 1시간 동안 전처리하고, 배지 +/- 약물에서 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 균주 PR8(H1N1)로 감염시키고, 감염시킨지 24시간 후에 회수하고, 파라포름알데하이드에 고정시키고, 인플루엔자 바이러스 NP 발현에 대해 염색하였다. 세포를 유세포계수법에 의해 분석하여 감염 %를 결정하였다. 패널 "A"는 감염된 세포에 대한 대표적인 유세포계수법 데이터를 도시한다. 패널 "B"는 삼중 샘플 정량 +/- 표준 편차의 대표적인 정량이다.

하기 표 2는 표시된 바이러스에 관해 AR-12의 EC50 및 EC90을 측정하는 예시적인 시험관내 연구 결과를 제공한다.

표 2

또 다른 양태에서, AR-12는 상기 열거된 바이러스에 의해 야기된 질병 및/또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다.

한 양태에서, AR-12는 본원에 기재된 그룹 VII 바이러스의 바이러스 복제를 억제한다.

AR-12는 바이러스 복제가 억제되는 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 레트로바이러스(예컨대, 렌티바이러스)에 감염된 숙주에 투여될 수 있다.

본원에 기재된 양태는 AR-12를 약 0.1 μM 내지 약 20 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스에 감염된 숙주에서 레트로바이러스 복제를 억제하는 방법을 제공한다.

한 양태에서, AR-12는 적어도 약 0.30 μM의 혈액 또는 조직 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여된다.

추가 양태는 적어도 제2 화합물을 숙주에 투여하는 것을 포함한다(예컨대, 아지도티미딘(AZT), 에파비렌즈, 및 로피나버).

또한 다른 양태는 AR-12를 적어도 약 0.30 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여함에 의해 HIV DR에 감염된 숙주에서 HIV DR의 복제를 억제하는 방법을 제공한다.

용어 "IC50"은 바이러스 복제가 50%만큼 억제되는 AR-12의 억제 농도를 의미한다. 한 양태에서, AR-12에 대한 IC50은 약 0.5 μM 미만이다. 또 다른 양태에서, IC50은 약 0.2 μM 초과이다. 또한 다른 양태에서, IC50은 약 0.24 μM, 약 0.27 μM, 약 0.37 μM, 또는 약 0.31 μM이다.

용어 "TC50"은 독성 농도(시험 세포의 50%가 사멸되는 농도)를 의미한다. "TC50/IC50 비"(선택 지수로도 공지됨)는 실험에서 시험되는 세포의 50%에 독성을 일으키는 약물 수준을 바이러스가 복제하는 능력을 50% 감소시키는 약물 수준으로 나눈 척도이다. 한 양태에서, AR-12에 대한 TC50/IC50 비는 약 30 미만이다. 또 다른 양태에서, AR-12에 대한 TC50/IC50 비는 약 25.6, 약 22.6, 약 19.9, 약 16.4, 또는 약 12이다.

하기 표 3은 표시된 HIV 단리물로 감염된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서 AR-12, AZT(아지도티미딘), 에파비렌즈, 및 로피나버에 대한 IC50, TC50을 측정하고, TC50/IC50 비를 제공하는 예시적인 시험관내 연구 결과를 제공한다.

표 3

표 3에 제시된 대로, 모든 시험된 HIV 균주에 관한 IC50은 마이크로몰 범위이다(예컨대, 0.24 내지 0.51 μM). 10 초과의 항바이러스 지수는 잠재적인 효과 대 내약성의 양호한 경계를 제공한다.

또 다른 양태에서, AR-12는 단독으로 사용되거나 HIV-1, 약물 내성 HIV-1 및 HIV-2에 의해 야기된 질병 및/또는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 프로테아제 억제제(예컨대, 티프라나버(tipranavir), 인디나버(indinavir), 아타자나버(atazanavir), 사퀴나버(saquinavir), 로피나버, 리토나버(ritonavir), 다루나버(darunavir), 아타자나버, 넬피나버(nelfinavir)), 뉴클레오시드/뉴클레오티드 역전사효소 억제제(예컨대, 엠트리시타빈(emtricitabine), 라미부딘(lamivudine){3TC}, 지도부딘(zidovudine){AZT}, 디다노신(didanosine), 테노포버(tenofovir), 스타부딘(stavudine), 아바카버(abacavir)), 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제(예컨대, 릴피비린(rilpivirine), 에트라비린(etravirine), 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine), 에파비렌즈), 진입 억제제/융합 억제제(T-20, 마라비록(maraviroc)), 및 인테그라제 억제제 (랄테그라버(raltegravir), 돌루테그라버(dolutegravir))를 포함하는 다른 항-바이러스 약물과 함께 사용될 수 있다. 숙주 생물학에 의존하는 그러한 바이러스 복제 과정을 표적화하는 것은 바이러스 유전체(예컨대 돌연변이된 바이러스 RNA 폴리머라제)에서의 돌연변이에 부수적인 내성 메커니즘을 우회하거나 숙주 단백질 샤페론이 표적화되고 폴딩되지 않은 단백질 반응 경로가 진화적으로 보존됨에 따라 내성이 발생하지 못하게 할 가능성을 허용한다.

본원에 기재된 양태는 AR-12를 적어도 약 25 mg/kg의 양으로 숙주에 투여함에 의해 바이러스-유도된 전격성 간 부전을 갖는 숙주의 생존율을 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 25 mg/kg의 용량이 적어도 4회(예컨대, 감염시킨지 0, 24, 36, 48시간 후) 투여된다. 이러한 양태에서, 숙주의 생존율은 적어도 약 20%만큼 증가한다.

본원에 기재된 AR-12는 경구, 비경구(IV, IM, 데포-IM, SQ, 및 데포-SQ), 설하, 비내, 흡입, 경막내, 국소, 안과 경로에 의해, 또는 직장으로 투여될 수 있다. 당업자에게 공지된 투여 형태는 본원에 기재된 AR-12의 전달에 적합하다.

AR-12는 적합한 약학적 제조물, 예컨대 크림, 젤, 현탁액, 안과 제조물, 정제, 캡슐, 흡입기, 또는 경구 투여용 엘릭서 또는 비경구 투여용 멸균 용액 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. AR-12는 당 분야에 널리 공지된 기술 및 절차를 사용하여 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.

한 양태에서, 약 0.1 내지 1000 mg, 약 5 내지 약 200 mg, 또는 약 10 내지 약 50 mg의 AR-12, 또는 생리학적으로 허용되는 염 또는 에스테르는 생리학적으로 허용되는 비히클, 담체, 부형제, 결합제, 보존제, 통증 완화제, 안정화제, 향료 등과 허용된 약학적 실시에 요구되는 단위 투여 형태로 혼합될 수 있다. AR-12를 포함하는 조성물 또는 제조물 중의 활성 물질의 양은 지시된 범위의 적합한 투여량이 얻어지도록 한다.

또 다른 양태에서, 조성물은 단위 투여 형태로 제형화될 수 있고, 각 투여량은 약 1 내지 약 1000 mg, 약 1 내지 약 500 mg, 또는 약 10 내지 약 200 mg의 활성 성분을 함유한다. 용어 "단위 투여 형태"는 인간 대상체 및 다른 포유동물에 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적합한 약학적 부형제와 함께, 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.

한 양태에서, AR-12 중 하나 이상은 조성물을 형성하기 위해 적합한 약학적으로 허용되는 담체와 혼합된다. 화합물(들)의 혼합 또는 첨가시, 생성된 혼합물은 크림, 젤, 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있다. 리포솜 현탁액이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 이용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 생성된 혼합물의 형태는 의도하는 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클 중 화합물의 용해도를 포함하는 다수의 요인에 의존적이다. 한 양태에서, 효과적인 농도는 치료되는 질환, 질병 또는 병태의 적어도 한 증상을 경감시키거나 완화시키기에 충분하고 경험적으로 결정될 수 있다.

본원에 기재된 AR-12의 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 임의의 그러한 담체를 포함한다. 또한, 활성 물질은 또한 요망되는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질 또는 요망되는 작용을 보충하는 물질과 혼합될 수 있거나, 또 다른 작용을 가질 수 있다. 화합물은 조성물 중 유일한 약학적 활성 성분으로서 제형화될 수 있거나 다른 활성 성분과 조합될 수 있다.

또 다른 양태에서, AR-12가 불충분한 용해도를 나타내는 경우, 가용화 방법을 이용할 수 있다. 그러한 방법은 공지되어 있고, 비제한적으로 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 공-용매 이용, 계면활성제(예컨대, TWEEN, 폴록사머) 이용 및 수성 소듐 바이카르보네이트에서의 용해를 포함한다. 염 또는 프로드럭과 같은 화합물의 유도체가 또한 효과적인 약학적 조성물을 제형화하는데 이용될 수 있다.

화합물의 농도는 투여시 화합물이 투여된 질병의 적어도 한 증상을 경감 또는 완화시키는 양의 전달에 효과적이다. 전형적으로, 조성물은 단일 투여량 투여를 위해 제형화된다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 AR-12는 시간-방출 제형 또는 코팅제와 같이, 신체로부터의 신속한 제거로부터 이들을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 그러한 담체는 비제한적으로 미세캡슐화된 전달 시스템과 같은 제어된 방출 제형을 포함한다. 활성 화합물은 치료되는 환자에 대해 바람직하지 않은 부작용이 없으면서 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약학적으로 허용되는 담체에 포함될 수 있다. 치료 유효 농도는 치료되는 질병에 대한 시험관내 및 생체내 모델 시스템에서 공지된 화합물을 시험함에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 AR-12 및 조성물은 다중 또는 단일 용량 컨테이너에 넣어질 수 있다. 넣어진 화합물 및 조성물은, 예를 들어, 사용을 위해 어셈블링될 수 있는 성분 일부를 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 형태의 AR-12 및 적합한 희석제는 사용 전에 조합을 위한 분리된 성분으로서 제공될 수 있다. 키트는 AR-12 및 공-투여를 위한 제2 치료제를 포함할 수 있다. AR-12 및 제2 치료제는 별도의 성분 일부로서 제공될 수 있다. 키트는 복수의 컨테이너를 포함할 수 있고, 각 컨테이너는 본원에 기재된 AR-12의 하나 이상의 단위 용량을 보유한다. 한 양태에서, 컨테이너는, 비제한적으로 경구 투여용 현탁액, 용액, 정제, 젤 캡슐, 지속-방출 캡슐 등; 비경구 투여용 데포 생성물, 미리-충전된 주사기, 앰풀, 바이알 등; 및 국소 투여용 패치, 메디패드(medipad), 젤, 현탁액, 크림 등을 포함하여, 요망되는 투여 방식을 위해 적합화될 수 있다.

약학적 조성물 중 AR-12의 농도는 활성 화합물의 흡수, 불활성화, 및 배설 속도, 투여 스케줄, 및 투여되는 양 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 인자에 의존할 것이다.

또 다른 양태에서, 활성 성분은 한번에 투여될 수 있거나, 시간 간격을 두고 투여되는 다수의 더 적은 용량으로 나뉠 수 있다. 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료되는 질환의 함수이며, 공지된 시험 프로토콜을 사용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽하여 경험적으로 결정될 수 있음이 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 경감되는 병태의 중증도에 따라 달라질 수 있음을 유의해야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여 요법은 개인의 요구 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 따라 조정되어야 하며, 본원에 개시된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것은 아님이 추가로 이해되어야 한다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 것이며 정제로 압축되거나 젤라틴 캡슐에 넣어질 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 활성 화합물 또는 화합물들은 부형제에 혼입될 수 있고 정제, 캡슐 또는 트로키의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 상용성인 결합제 및 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.

정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 임의의 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 비제한적으로, 검 트래거칸트, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제(예컨대, 임의의 적합한 충전제/증량제(bulking agent)), 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 전분, 또는 락토스; 붕해제, 예컨대, 비제한적으로, 알긴산 및 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 비제한적으로, 마그네슘 스테아레이트; 활택제, 예컨대, 비제한적으로, 콜로이드 실리콘 디옥사이드; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 및 착향제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 과일향.

투여 단위 형태가 캡슐일 때, 이는 상기 유형의 물질 외에 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 투여 단위 형태는 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 다른 물질, 예를 들어, 당의 코팅제 및 다른 장용 작용제를 함유할 수 있다. 화합물은 또한 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉 검 등의 성분으로서 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물 외에 감미제로서 수크로스 및 특정 보존제, 염료 및 착색제, 및 착향제를 함유할 수 있다.

활성 물질은 또한 요망되는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 요망되는 작용을 보충하는 물질과 혼합되거나 공동-투여될 수 있다. AR-12는, 예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 통증 완화제, 또는 코스메틱(예컨대, 항-인플루엔자 약물, 예컨대 오셀타미버(Oseltamivir)(Tamiflu®) 및 자나미버(zanamivir)(Relenza®) 또는 다른 적합한 항-HIV 약물)과 함께 이용될 수 있다.

한 양태에서, 비경구, 피내, 피하, 흡입, 또는 국소 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 임의의 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정유, 자연 발생 식물성유, 예컨대 참기름, 코코넛유, 땅콩유, 면실유 등, 또는 합성 지방 비히클, 예컨대 에틸 올레에이트 등, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 및 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 및 포스페이트; 및 긴장성 조정용 작용제, 예컨대 소듐 클로라이드 및 덱스트로스. 비경구 제조물은 앰풀, 일회용 주사기, 또는 유리, 플라스틱, 또는 다른 적합한 재료로 제조된 다중 용량 바이알에 넣어질 수 있다. 완충제, 보존제, 항산화제 등은 필요에 따라 혼입될 수 있다.

정맥내 투여되는 경우, 적합한 담체는, 비제한적으로, 생리 식염수, 포스페이트 완충된 염수(PBS), 및 증점제 및 용해제, 예컨대, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에탄올, N-메틸피롤리돈, 계면활성제 및 이의 혼합물을 함유하는 용액을 포함한다. 조직-표적화된 리포솜을 포함하는 리포솜 현탁액이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 적합할 수 있다. 이들은 당 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

또 다른 양태에서, AR-12는 시간-방출 제형 또는 코팅제와 같이 신체로부터의 신속한 제거로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 그러한 담체는, 비제한적으로, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템, 및 생물분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 콜라겐, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 등과 같은 제어된 방출 제형을 포함한다. 그러한 제형을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

또한 다른 양태에서, 본 개시 내용의 방법에 이용된 화합물은 장으로 또는 비경구로 투여될 수 있다. 경구 투여될 때, 본 개시 내용의 방법에 이용된 화합물은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 경구 투여를 위한 일반적인 투여 형태로 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태는 정제 및 캡슐의 일반적인 고체 단위 투여 형태 뿐만 아니라 용액, 현탁액, 및 엘릭서와 같은 액체 투여 형태를 포함한다. 고체 투여 형태가 사용되는 경우, 이들은 본원에 기재된 방법에 사용된 화합물이 매일 단 1회 또는 2회 투여되도록 하는 지속적인 방출형일 수 있다.

투여 형태는 매일 1, 2, 3 또는 4회 환자에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 AR-12는 매일 3회 이하, 또는 심지어 1회 또는 2회, 또는 하루 걸러 투여될 수 있다.

용어 "치료적 유효량" 및 "치료적으로 효과적인 기간"은 바이러스 감염, 바이러스 복제, 및/또는 바이러스 수준을 감소시키는데 효과적인 투여량 및 기간의 치료를 나타내는데 사용된다. 상기 언급된 바와 같이, 그러한 투여는 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비내, 또는 직장내 투여일 수 있다. 한 양태에서, 전신적으로 투여될 때, 치료 조성물은 약 0.1 μM 내지 약 20 μM의 화합물의 혈중 농도를 달성하기에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 국부 투여의 경우, 이보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있으며, 훨씬 더 높은 농도가 용인될 수 있다. 당업자는 AR-12의 보다 낮은 유효 농도를 발생시키는 그러한 치료 효과가 조직, 기관, 또는 치료되는 특정 동물 또는 환자에 따라 상당히 변할 수 있음을 인지할 것이다. 환자는 한 용량에서 시작될 수 있지만, 그 용량은 환자의 상태가 변함에 따라 경시적으로 달라질 수 있음이 또한 이해된다.

정확한 투여량 및 투여 빈도는 본 개시 내용의 방법에 사용된 투여되는 특정 화합물, 치료할 특정 병태, 치료할 병태의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중, 일반적인 신체 상태, 및 당 분야의 숙련된 투약 의사에게 잘 알려진 바와 같이 개인이 복용할 수 있는 다른 약물에 좌우될 것임이 당업자에게 자명할 것이다.

실시예

본원에 기재된 모든 요소가 필요한 것은 아니다. 실제로, 당업자는 본원에 기재된 방법에 대한 많은 부가적인 사용 및 변형을 발견할 것이며, 본 발명자들은 이를 청구범위에 의해서만 제한하고자 한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다. 본원에 기재된 특정 실시예에 기재된 작업은, 본 발명자들이 총괄한 대로, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health로부터 연방 기금을 사용하여 "In Vitro Testing Resources for HIV Therapeutics and Topical Microbicides"라는 명칭으로 계약서 HHSN272201400010I 하에 Southern Research Institute에 의해 수행되었다.

실시예 1

RAW264.7 세포를 37℃에서 5% CO₂ 수준으로 유지된 가습 인큐베이터에서 10% 우태아 혈청이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지에서 성장시켰다. 표시된 바이러스에 감염되기 1시간 전에, 세포를 DMSO에 용해된 원액으로부터 세포 성장 배지로 희석된 5 μM AR-12로 처리하거나, 성장 배지 중 동등한 부피의 DMSO로 처리하였다.

실시예 2

인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(H1N1) 스톡을 37℃에서 48시간 동안 10일 발육란에서 성장시키고, Madin Darby 개 신장 세포에서 적정하였다. 세포를 약물 또는 DMSO로 1시간 전처리 후, 바이러스를 DMSO 또는 AR-12를 함유하는 배지에서 5의 감염 다중도로 세포에 첨가하였다. 유세포계수법 또는 웨스턴 블롯팅을 위해 세포를 수집하기 전 24시간 동안 37℃에서 감염이 진행되게 하였다.

실시예 3

웨스턴 블롯팅을 위해, 세포를 1% Brij97 및 프로테아제 억제제를 함유하는 완충제로 용해시켰다. 인플루엔자 바이러스 핵산단백질(NP로 공지됨) 및 기질 단백질 1(M1으로 공지됨)에 대한 항체를 블롯팅에 이용하여 감염된 세포에서 생산된 이러한 단백질의 수준을 조사하였다. GAPDH에 대한 항체를 이용하여 상이한 레인에서 비교가능한 단백질 부하를 입증하였다. 유세포계수법을 위해, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, PBS 중 0.1% Triton X-100으로 투과시키고, 형광 염료 Alexafluor-647에 직접 컨쥬게이션된 인플루엔자 NP에 대한 항체로 염색하였다. 세포를 Beckton Dickinson FACSCanto II 유세포계수기 상에서 분석하고 원 데이터를 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

실시예 4 - 수율 감소 검정에 의한 일차 EBOV 항바이러스 시험

수율 감소 검정을 위해, 10% 우태아 혈청(FBS), 및 1X GlutaMax를 지닌 변형된 이글 배지(MEM)에 유지된 HepG2 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅한다. 컨플루언트(confluent) 단층을 15분마다 흔들어 주면서 37℃에서 1시간 동안 0.1의 MOI로 EBOV에 의해 감염시킨다. 감염 후, 바이러스를 함유하는 배지를 제거하고, 플레이트를 PBS로 4회 세척하여 잔여 바이러스를 제거한다. 세척 후, AR-12를 6개 농도의 배지에 이중으로(in duplicate) 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션시킬 것이다. 실시간 RT-PCR에 의한 평가를 위해 감염시킨지 72시간 후에 배지를 수집하여 바이러스 RNA 표준에 비해 EBOV 유전체 당량을 결정한다. 카르보사이클릭 3-데아자아데노신 또는 파비피라버(T-705)를 양성 대조군으로서 이용하고 배지 단독 음성 대조군(바이러스 없음) 및 바이러스 단독 대조군(화합물 없음)을 포함시킨다. 항바이러스 활성은 EBOV RNA 수준의 감소(결정된 EC50 및 EC90 값)로부터 계산될 수 있다(유효 농도; EC). 화합물 세포독성(CC50)은 Promega's CellTiter Glo 또는 CellTiter96(MTS)에 의해 감염되지 않은 세포에서 결정될 수 있다. 선택 지수(SI50)는 CC50/EC50로서 계산될 수 있다.

실시예 5 - 수율 감소 검정에 의한 이차 EBOV 항바이러스 시험

이차 검정은 표준 플라크 검정에 의한 EBOV 수율 감소의 평가를 포함할 수 있다. 플라크 검정은 실시간 RT-PCR 보다 더 힘들다. 결과적으로 플라크 검정은 일차 스크리닝에 적합하지 않지만, RT-PCR 종말점까지 생성된 수율 감소 결과를 확인하기 위한 이차 방법으로서 이용될 수 있다. 이차 검정은 상기 기재된 일차 검정과 유사한 방식으로 수행될 수 있다; 그러나, 검정의 끝에 검정 플레이트로부터 수집된 샘플은 실시간 RT-PCR 대신 플라크 검정에 의해 EBOV 역가에 대해 평가된다. 플라크 검정은 6-웰 플레이트에서 90-100% 컨플루언트 Vero E6 세포를 이용하여 완료될 수 있다. 적정을 위한 샘플은 연속하여 10배 희석될 수 있고 200 μL를 각 웰에 첨가할 수 있다. 플레이트를 15분마다 흔들어 주면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 1X EMEM, 5% FBS, 및 0.9% 아가로스를 함유하는 일차 오버레이를 각 웰에 첨가할 수 있다. 플레이트를 37℃에서 4-7일 동안 인큐베이션시킨 다음 5% 뉴트럴 레드가 첨가된 일차 오버레이와 동일한 이차 오버레이와 인큐베이션시킨다. PFU는 감염 후 7-10일에 계수될 것이다.

실시예 6 - 인플루엔자 A 바이러스

한 양태에서, 검정은 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 감염에 대한 AR-12의 효과를 평가하기 위해 HEK293T 리포터 세포주(ELVIRA®)에서 수행될 수 있다. 이러한 세포는 인플루엔자 A 바이러스 프로모터에 의해 유도된 개똥벌레 루시퍼라제(ffLuc) 발현 카세트에 의해 안정하게 트랜스펙션되었다. IAV에 의한 감염시, IAV 폴리머라제가 세포에서 발현되어 ffLuc의 발현을 유도한다. ffLuc의 활성은 세포 집단에서의 감염 정도에 직접적으로 상응한다. 이러한 양태에서, AR-12에 의한 세포의 처리는 용량 의존적인 방식으로 IAV 감염을 억제하고, 예를 들어, 인플루엔자 균주 H3N2에 관한 도 1 및 인플루엔자 균주 H1N1에 관한 도 2에 도시된 대로, ffLuc 활성의 감소로 이어진다. 화합물 SRI35204는 AR-12를 나타낸다.

표 4 - 인플루엔자 균주 H3N2 및 H1N1에 대한 EC50/CC50

도 3 및 도 4에 도시된 대로, IAV 폴리머라제의 발현(잔류 발광의 퍼센트에 의해 측정됨)은 AR-12의 농도가 인플루엔자 균주 H3N2 및 H1N1 균주에서 각각 약 0.15 nm에서 약 1.25 nm로 증가함에 따라 용량-의존적인 방식으로 감소한다. 약 1.25 nm 이상의 농도에서, 발광 및 세포 생존력 퍼센트는 0에 근접한다.

표 3에 제시된 대로, 인플루엔자 균주 H3N2 및 H1N1에 대한 EC50(반 최대 유효 농도)은 각각 0.33 μM 및 0.37 μM이다. AR-12 및 리바비린(Ribavirin)에 대한 EC50 및 CC50(세포증식억제 농도 - 세포 성장을 50%만큼 감소시키는데 요구되는 농도) 값이 비교를 위해 제시된다.

실시예 7 - 후닌 바이러스

세포독성 검정

AR-12의 세포독성을 비색 MTS 방법에 의해 Vero 및 A549 세포의 배양액에서 시험하였다.

세포주 Vero(아프리카 사바나 원숭이 신장) 및 A549(폐 암종 인간 세포)를 5% 우태아 혈청이 보충된 이글 최소 필수 배지(MEM)에서 성장시켰다. 혈청 농도는 생물학적 검정에서 유지 배지(MM)에 대해 1.5%로 감소되었다.

AR-12를 디메틸-설폭사이드(DMSO)에 10 mM로 용해시켰다. 세포 시험을 위한 희석을 MM에서 추가로 수행하였다. 세포 생존력을 MTS[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내 염(inner salt); CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent Promega] 방법에 의해 측정하였다. 96-웰 플레이트에서 Vero 및 A549 세포의 컨플루언트 배양액을 항바이러스 검정에 이용된 것과 동등한 인큐베이션 조건을 이용하여 일련의 AR-12의 농도에 노출시켰다(하기 참조). MTS를 함유하는 10 μl의 MM을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 인큐베이션한지 2시간 후에, 흡광도를 마이크로플레이트 판독기에서 490 nm로 측정하였다. 세포독성 농도 50%(CC50)를 세포 생존력을 50%만큼 감소시키는데 필요한 화합물 농도로서 계산하였다. 모든 측정은 각각 삼중으로 2회 수행되었다.

도 5에 도시된 대로, AR-12의 존재 하에 Vero 및 A549 세포 둘 모두의 생존력은 12.5 μM 보다 낮은 농도에서 80-90% 보다 높은 수준으로 유지되었다. 보다 높은 농도에서, 세포 생존력은 용량-의존적인 방식으로 감소하였다. 용량-반응 곡선으로부터, Vero 및 A549 세포에 대한 AR-12의 CC50은 각각 28.2 ± 2.1 및 19.3 ± 0.1 μM였다.

항바이러스 활성 검정

AR-12의 항바이러스 활성을 Vero 및 A549 세포에서 바이러스 수율 억제 검정에 의해 시험하였다.

본 실시예에서, 하기 약독화된 후닌 바이러스의 바이러스 균주(JUNV)를 이용하였다: 백신 균주 Candid-1[Maiztegui et al., J. Infect. Dis. 177, 277-83, 1998]; 원형 균주 XJ로부터 유래된 비병원성 XJCl3 균주[de Guerrero et al., Medicina (Bs.As.) 29, 1-5, 1969]; 및 경증 인간 병증으로부터 수득된 자연 약독화된 IV4454 균주[Contigiani et al., Medicina (Bs.As.) 37, 244-51, 1977]. 아레나바이러스 타카라이브(TCRV), 균주 TRLV11573[Downs et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 12, 640-46, 1963]이 또한 검정되었다.

바이러스 수율 억제 검정을 위해, 24-웰 플레이트에서 성장시킨 Vero 및 A549 세포의 컨플루언트 단층을 0.1 PFU/세포의 감염 다중도로 각 바이러스 균주로 감염시켰다. 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 후, 세포를 MM로 세척하고 AR-12의 일련의 비-세포독성 농도를 함유하는 MM을 재공급하였다. 37℃에서 인큐베이션시킨지 48시간 후에, 상청 배양액을 회수하고, 세포외 바이러스 수율을 Vero 세포에서 플라크 검정에 의해 결정하였다. 유효 농도 50%(EC50)를 용량-반응 곡선으로부터 미처리된 것에 비해 화합물-처리된 배양액에서 바이러스 수율을 50%만큼 감소시키는데 필요한 화합물 농도로서 계산하였다.

도 6에 도시된 대로, 3개 JUNV 균주의 복제는 농도-의존적인 방식으로 AR-12에 의해 억제되었다. 용량-반응 곡선으로부터 계산된 EC50 값은, 바이러스 균주 및 숙주 세포에 따라, 0.15-0.55 μM의 범위였고, 선택 지수(비 CC50/EC50)는 35.1에서 128.7 사이에서 다양하였다. JUNV와 항원적으로 밀접하게 관련된, TCRV에 대한 활성을 또한 시험하였다. Vero 및 A549 세포에서 TCRV에 대한 EC50은 각각 0.35 ± 0.03 및 0.84 ± 0.02 μM였고, 상응하는 선택 지수는 80.6 및 23.0이었다.

표 5 - 후닌 바이러스에 대한 AR-12의 항-바이러스 활성

^aEC₅₀(유효 농도 50%): 감염시킨지 48 h 후에 바이러스 수율을 50%만큼 감소시키는데 필요한 농도

^bSI(선택 지수): 비 CC₅₀/EC₅₀. AR-12의 CC₅₀ 값은 Vero 및 A549 세포에서 각각 28.2 및 19.3 μM였다.

실시예 8 -치쿤구니야 바이러스

약 4 mg의 화합물을 유리 바이알로 옮기고 DMSO를 첨가하여 10mg/m의 최종 농도의 원액을 수득하였다. DMSO 스톡을 사용하지 않을 때 -20℃에 저장하였다. 각 실험 전에, 해동된 DMSO 스톡을 침전물의 존재에 대해 확인하고 침전물이 보이지 않을 때에만 사용하였다.

1일째에, Vero A 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트(Becton Dickinson)의 100 μl의 검정 배지[2%의 우태아 혈청(Gibco), 1% 소듐 바이카르보네이트(Gibco, 25080060) 및 1%의 L-글루타민(25030024)이 보충된 MEM Rega 3 배지(Cat. N°19993013; Invitrogen)]에 2.5x10⁴개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 37℃ 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 밤새 부착되게 하였다.

2일째에, AR-12 및 T-705의 2x 연속 희석액(1-대-3의 희석 계수)을 세포의 상부에서 검정 배지에서 제조하였고, 직후 100 μl의 CHIKV 899(야생형 또는 T-705-내성)의 2x 희석액을 각 웰에 첨가하였다(세포 대조군 웰을 제외하고). 화합물의 최종 출발 농도는 AR-12 및 T-705에 대해 각각 100 μM 및 200 μM였고, 최종 감염 다중도(MOI)는 0.001이었다. 화합물의 세포독성을 평가하기 위해, 유사한 프로토콜에 따랐으나, 바이러스 접종물 대신 검정 배지를 세포에 첨가하였다. 항바이러스 검정을 설정할 때 캐리-오버(carry-over) 효과를 방지하기 위해, 각 희석 단계 사이에 팁 교체(tip change)를 수행하였다. 팁 교체는 세포독성 실험에 필요없는 것으로 간주되었다. 설정 후, 검정 플레이트를 미처리된 감염된 대조군 조건에서 최대 세포변성 효과가 관찰되는 시간인 5일 동안 인큐베이터(37℃)로 돌려 보냈다.

항바이러스 효과의 정량을 위해, 미처리된 감염된 대조군이 100%에 가까운 바이러스-유도된 세포 사멸(또는 세포변성 효과, 현미경 검사로 평가됨)을 나타내었을 때 검정 배지를 흡인시킨 다음, 페놀 레드비함유 배지 중 100μl의 10% MTS/PMS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨/페나진 메토설페이트, Promega) 용액을 첨가하고 0.6 - 0.8 범위의 광학 밀도(OD 값)가 수득될 때까지 1.5시간(37℃, 5% CO₂, 95-99% 상대 습도) 동안 인큐베이션시켰다. 흡광도를 498nm(Infinite F50, Tecan)의 파장에서 측정하고 미처리된 대조군의 백분율로 전환시켰다.

맞춤형(custom-made) 데이터 처리 소프트웨어 패키지(Accelrys)를 이용하여 원 데이터의 분석, 품질 관리 및 EC50 값의 계산을 수행하였다. EC50(용량-반응 곡선으로부터 도출된 값)은 바이러스-유도된 세포 사멸의 50% 억제가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 모든 검정 웰은 화합물에 의해 초래된 바이러스-유도된 세포변성 효과(CPE)의 사소한 징후 또는 세포에 대한 변동에 대해 현미경으로 검사되었다. 화합물은, 적어도 한 농도에서, 바이러스-유도된 세포변성 효과의 임의의 징후로부터 세포의 완전한 보호가 숙주 세포 및 단층 형태학에 대한 큰 변동 없이 관찰되는 경우, 히트 선택(hit selection) 기준에 매칭되는 것으로 간주된다. CC50(용량-반응 곡선으로부터 도출된 값)은 화합물이 감염되지 않은 세포의 전체 숙주 세포 대사를 50%만큼 감소시키는 화합물의 농도를 나타낸다. 선택 지수(SI=CC50/ EC50)는 이러한 바이러스세포-기반 검정에서 화합물의 치료 윈도우의 표시를 제공한다. 표준 편차의 계산을 제외하고, 추가의 통계적 분석은 수행되지 않았다.

도 7에 도시된 대로, AR-12의 경우, 1 μM 미만의 농도에서, 바이러스-유도된 세포 사멸은 억제되지 않았고(항바이러스 활성 ■은 관찰되지 않음), 한편 화합물은 이러한 농도에서 또한 숙주 세포 대사에 현저한 영향을 미치지 않았다(항-대사 효과가 관찰되지 않거나 단지 사소하게 관찰됨

). 0.14 내지 3.7 μM의 AR-12의 농도에서, 세포 생존의 급격한 증가가 관찰되었고, 이는 명백한 세포 보호(항바이러스) 효과를 시사한다. 3.7 μM 초과의 농도에서, AR-12의 항-대사 효과는 세포의 전반적인 대사 활성의 손실에 책임이 있다(숙주 세포 대사 및/또는 세포증식억제 및/또는 세포독성 효과에 대해 화합물이 유도할 수 있는 직접적인 항-대사 효과의 조합으로부터 관찰된 결과인 항-대사 효과).

병행 실험에서, AR-12 및 T-705의 항바이러스 효과가 야생형 및 T-705-내성 치쿤구니야 바이러스의 복제에 대해 평가되었다(도 8).

표 6 - ChikV

예상대로, T-705의 항바이러스 활성은 더 높은 농도로 이동하였다(7.4에서 138 μM으로, 이는 T-705의 항바이러스 효과에 대한 19배의 민감성 감소임). AR-12의 항바이러스 활성은 변하지 않고 유지되었다.

세포 배양액에서 평가할 때, AR-12는 1.1 ± 0.5 μM의 EC50으로 치쿤구니야 바이러스-유도된 세포 사멸을 억제한다. 동일한 환경에서, 화합물은 6.6 ± 0.3 μM의 CC50으로 숙주 세포 대사에 불리한 영향을 미치고, 이는 이러한 검정에서 5.8의 선택 지수를 발생시킨다.

T-705-내성 치쿤구니야 바이러스에 의한 병행 실험에서(도 8), AR-12의 항바이러스 효능은 영향을 받지 않았다. 이로부터, 바이러스가 T-705의 항바이러스 효과에 대해 덜 민감하게 되는 돌연변이는 AR-12의 항바이러스 효능에 영향을 미치지 않는다고 결론내릴 수 있다. 현미경 관찰을 고려하면(도 7 및 8), 이러한 바이러스-세포-기반 검정에서 AR-12의 항바이러스 활성은 화합물의 역효과가 우세해지기 시작하는 가장자리에 놓여 있다(한 검정에서, 한 농도에서 부분적인 보호 및 다음 농도에서 세포독성 효과가 있는 한편, 다른 검정에서는, 이전 검정에서 부분적인 보호가 관찰된 동일한 농도에서 완전한 보호가 존재한다).

실시예 9 - 시험관내 바이러스 스크린

다양한 바이러스에 대한 AR-12의 활성의 예시적인 시험관내 스크린의 결과를 하기에 요약한다.

표 7

도 8은 치쿤구니야 바이러스의 야생형(WT) 및 T-705(파비피라버) 내성(RES) 균주에 감염된 Vero A 세포에서 AR-12의 예시적인 항바이러스 효과를 도시한다. 도시된 대로, AR-12는 2개의 세포 유형에서 치쿤구니야 바이러스의 야생형 및 파비피라버 내성 균주 둘 모두에 대해 이의 항바이러스 효과를 유지한다.

실시예 10 - 신선한 인간 PBMC에서 항-HIV 효능 평가

스크리닝된 공여체로부터 HIV 및 HBV에 혈청음성인 신선한 인간 PBMC를 분리한다(Biological Specialty Corporation, Colmar, PA). 세포를 저속 원심분리 및 PBS에서의 재현탁에 의해 2-3회 펠렛화/세척하여 오염 혈소판을 제거한다. 그 후 류코포어시드(Leukophoresed) 혈액을 둘베코의 포스페이트 완충된 염수(DPBS)에서 1:1로 희석시키고 50 mL 원심분리 튜브에서 14 mL의 림프구 분리 배지 상에 쌓고(LSM; Cellgro® by Mediatech, Inc.; 밀도 1.078+/-0.002 g/ml; Cat.# 85-072-CL), 이어서 30분 동안 600 X g로 원심분리시킨다. 밴딩된 PBMC를 생성된 계면으로부터 부드럽게 흡인시키고 후속하여 저속 원심분리에 의해 PBS로 2X 세척한다.

최종 세척 후, 세포를 트립판 블루 배제에 의해 열거하고 15% 우태아 혈청 (FBS), 및 2 mM L 글루타민, 4 μg/mL 식물적혈구응집소(PHA, Sigma)가 보충된 RPMI 1640에 1 x 10⁶개 세포/mL로 재현탁시킨다. 세포가 37℃에서 48-72시간 동안 인큐베이션되게 한다. 인큐베이션 후, PBMC를 원심분리시키고 15% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 약 100-150 U/mL의 재조합 인간 IL-2(R&D Systems, Inc)가 보충된 RPMI 1640에 재현탁시킨다. IL-2는 PHA 분열촉진 자극에 의해 개시된 세포 분열을 유지하기 위해 세포 배지에 포함된다. PBMC는 검정 프로토콜에 사용될 때까지 2주마다 배지를 교환하면서 1-2 x 10⁶개 세포/mL의 농도로 이 배지에 유지된다. 세포는 검정에 사용하기에 너무 오래되었다고 간주되기 전에 최대 2주 동안 배양액에 유지되고 폐기된다. MDM은 조직 배양 플라스크에 대한 부착 결과로서 배양액으로부터 고갈된다.

표준 PBMC 검정을 위해, 적어도 두 정상 공여체로부터의 PHA 자극된 세포를 풀링시키고(함께 혼합됨), 신선한 배지에 1 x 10⁶개 세포/mL의 최종 농도로 희석시키고, Infectious Disease Research department of Southern Research Institute에 의해 개발된 표준 포맷으로 96웰 둥근 바닥 미세플레이트의 내부 벽에 50 μL/웰(5 x 10⁴개 세포/웰)로 플레이팅한다.

하나를 초과하는 공여체로부터의 단핵 세포의 풀링(혼합)을 이용하여 일차 림프구 집단의 IL-2 및 PHA에 대한 HIV 감염 및 전체 반응의 정량적 및 정성적 차이에 기인한 개개 공여체 간에 관찰되는 변동성을 최소화한다. 각 플레이트는 바이러스/세포 대조군 웰(세포 플러스 바이러스), 실험 웰(약물 플러스 세포 플러스 바이러스) 및 화합물 대조군 웰(세포가 없는 약물 플러스 배지, 세포독성의 MTS 모니터링에 필요함)을 함유한다. 이러한 시험관내 검정에서, PBMC 생존력은 인큐베이션 지속 기간을 통틀어 높게 유지된다. 따라서, 감염된 웰은 항바이러스 활성 및 세포독성 둘 모두의 평가에 이용된다. 미세역가 튜브에서 2X 농도로 시험 약물 희석액을 제조하고 각 농도의 100 μL(총 9개 농도)를 표준 포맷을 이용하여 적절한 웰에 놓는다. 바이러스 스톡의 50 μL의 소정의 희석액을 각 시험 웰에 놓는다(최종 MOI

0.1).

PBMC 배양액을 37℃, 5% CO₂에서의 감염 후 7일 동안 유지시킨다. 이 기간 후에, 세포-비함유 상청액 샘플을 역전사효소 활성 및/또는 p24 항원 함량의 분석을 위해 수집한다. 상청액 샘플의 제거 후, 세포 생존력의 결정을 위해 MTS를 플레이트에 첨가함에 의해 화합물 세포독성을 측정한다. 웰을 또한 현미경으로 검사하고 임의의 이상을 기록한다.

실시예 11 - 역전사효소 활성 검정

미세역가 플레이트-기반 역전사효소(RT) 반응을 활용한다(Buckheit et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:295-302, 1991). 삼중수소의 티미딘 트리포스페이트(3H-TTP, 80 Ci/mmol, NEN)를 1:1 dH₂O:에탄올 중에 1 mCi/mL로 받는다. 150 μL의 폴리 rA(20 mg/mL)를 0.5 mL의 올리고 dT(20 단위/mL) 및 5.35 mL의 멸균 dH₂O와 조합시킨 다음 분취시켜(1.0 mL) -20℃에 저장함에 의해 폴리 rA:올리고 dT 주형:프라이머(GE Healthcare)를 원액으로서 제조한다. RT 반응 완충제를 매일 신선하게 제조하며 이는 125 μL 1.0 M EGTA, 125 μL dH₂O, 125 μL 20% Triton X100, 50 μL 1.0 M Tris(pH 7.4), 50 μL 1.0 M DTT, 및 40 μL 1.0 M MgCl₂로 구성된다. 1부의 3H-TTP, 4부의 dH₂O, 2.5부의 폴리 rA:올리고 dT 스톡 및 2.5부의 반응 완충제를 조합시킴에 의해 최종 반응 혼합물을 제조한다. 10 마이크로리터의 이 반응 혼합물을 둥근 바닥 미세역가 플레이트에 놓고 15 μL의 바이러스 함유 상청액을 첨가하여 혼합시킨다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 반응 부피를 DE81 필터-매트(Wallac) 상에 스폿팅하고, 5% 소듐 포스페이트 완충제 또는 2X SSC(Life Technologies)에서 각각 5분 동안 5회 세척한다. 그 다음, 이들을 증류수에서 각각 1분 동안 2회 세척하고, 70% 에탄올에서 각각 1분 동안 2회 세척한 다음 건조시킨다. 혼입된 방사능(분당 계수, CPM)을 표준 액체 섬광 기술을 이용하여 정량한다.

실시예 12 - 세포독성을 측정하기 위해 PBMC 생존력에 대한 MTS 염색

검정 종료시, 검정 플레이트를 용해성 테트라졸륨-기반 염료 MTS(CellTiter 96 Reagent, Promega)로 염색하여 세포 생존력을 결정하고 화합물 독성을 정량한다. 대사적으로 활성인 세포의 미토콘드리아 효소는 MTS를 대사하여 용해성 포르마잔 생성물을 산출한다. 이것은 세포 생존력 및 화합물 세포독성의 신속한 정량 분석을 가능하게 한다. MTS는 사용하기 전에 준비가 필요없는 안정한 용액이다. 검정 종료시, 20 μL의 MTS 시약을 웰마다 첨가한다. 그 후 미세역가 플레이트를 37℃에서 4-6시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 간격은 최적의 염료 감소를 위해 경험적으로 결정된 시간에 기반하여 선택되었다. 점착성 플레이트 밀봉기가 뚜껑 대신에 사용되며, 용해성 포르마잔 생성물을 혼합하기 위해 밀봉된 플레이트를 여러 번 뒤집고, 플레이트를 Molecular Devices에 의해 490/650 nm에서 분광광도적으로 판독한다.

Vmax 또는 SpectraMaxPlus 플레이트 판독기

데이터 분석

컴퓨터 프로그램을 이용하여, IC50(바이러스 복제의 50% 억제), IC90(바이러스 복제의 90% 억제), IC95(바이러스 복제의 95% 억제), TC50(50% 세포독성), TC90(90% 세포독성), TC95(95% 세포독성) 및 치료 지수 값(TI = TC/IC; 항바이러스 지수 또는 AI로도 언급됨)을 제공한다. 항바이러스 활성 및 독성 둘 모두에 대한 원 데이터는 데이터의 그래픽 묘사로 개개 화합물 활성을 요약한 인쇄물에 제공된다.

실시예 13 - RHDV에 감염된 토끼의 치료

표 9

9주령 뉴질랜드 흰 토끼를 표 9에 제시된 실험 설계에 따라 12 h 광 주기로 21℃의 기후 조건에 맞춘 룸에 두고 표준 건조 토끼 사료 및 물을 임의로 제공하였다. 생존 연구를 위해, 감염(일 당 50 mg/kg) 후 0, 12, 24 및 36시간에 14마리의 동물에 2 x 10⁴ 적혈구응집반응 단위의 RHDV 단리물 Ast/89를 근내 주입하고 이들 중 6마리를 AR-12(25 mg/체중 Kg)로 치료하였다. 그 그룹의 동물들이 자연적으로 죽게 두었다.

도 21에 도시된 대로, 감염된 토끼의 생존율은 감염시킨지 적어도 약 24시간 후에 현저하게 증가하였다(예컨대, 약 20%)(그룹 당 초기 수 n=7. Fisher 시험에 의해 *p < 0.05).

도 22에 도시된 대로, AR-12는 감염시킨지 약 36시간 후에 간 독성의 마커(ALT(알라닌 트랜스아미나제), AST(아스파르테이트 트랜스아미나제), LDH(락테이트 데하이드로게나제), 및 GGT(감마-글루타밀 트랜스퍼라제)) 수준을 감소시켰다(12 hpi에 비해 *p< 0.05. RHDV에 비해 #p < 0.05). 이러한 결과는 AR-12가 바이러스-유도된 전격성 간 부전과 관련된 증상을 치료, 개선, 또는 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 14 - 표준 PBMC 세포-기반 미세역가 항-HIV 검정에서 AR-12의 항-바이러스 활성 및 세포독성

AR-12의 항바이러스 활성 및 세포독성은 상이한 HIV 약물 내성 프로파일을 나타내는 여섯(6)개 단리물에 대해 표준 PBMC 세포-기반 미세역가 항-HIV 검정으로 시험되었다.

AR-12는 건조 분말로 공급되었고 표 10에 기재된 대로 용해되었다. 검정 당일까지 스톡을 4℃에 저장하였다. 각 검정 설정일에 화합물 원액을 이용하여 검정에 사용되는 작업 약물 희석액을 생성하였다. 작업 용액은 각 실험을 위해 신선하게 만들어졌고 다른 날에 수행되는 후속 실험에서의 재사용을 위해 저장되지 않았다. 화합물을 8번의 추가 연속 1:2 희석(농도 범위 = 39.1 nM 내지 10 μM)에 의해 10 μM(10,000 nM)의 높은-시험 농도를 이용하여 검정에서 평가하였다.

유사하게, 지도부딘(AZT; 뉴클레오시드 역전사효소 억제제; NRTI)을 하프-로그 희석 및 100 pM 내지 1.0 μM(1,000 nM)의 농도 범위를 이용하여 양성 대조군 항바이러스 화합물로서 포함시켰다. 바이러스의 내성 프로파일에 따라 다양한 추가 대조군을 또한 검정을 위해 포함시켰다. 네비라핀(비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제; NNRTI) 및 리토나버(프로테아제 억제제; PI)를 1.0 nM 내지 10 μM(10,000 nM)의 농도 범위를 이용하여 시험하였다. 델라비르딘(NNRTI) 및 T-20(융합 억제제)을 200 pM 내지 2.0 μM(2,000 nM)의 농도 범위를 이용하여 시험하였다. 엘비테그라버(Elvitegravir)(인테그라제 억제제; INI)를 100 pM 내지 1.0 μM(1,000 nM)의 농도 범위를 이용하여 시험하였다. 마지막으로, 랄테그라버(INI)를 10 pM 내지 100 nM의 농도 범위를 이용하여 시험하였다.

표 10

인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서의 효능 평가

바이러스 단리물 정보

여섯(6)개의 HIV-1 단리물을 본 실험에 이용하기 위해 선택하였다. 이러한 바이러스는 AR-12의 잠재적인 교차-내성을 평가하기 위한 다양한 약물 내성 HIV-1 단리물을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 이러한 바이러스 단리물은 NIAID AIDS Research and Reference Reagent Program으로부터 수득되었다. 바이러스 단리물 1022-48은 Dr. William A Schief of Merck Research Laboratories로부터 수득되었다. MDR769 및 MDR807은 Dr. Thomas C. Merigan of Stanford University로부터 수득되었다. 각 바이러스의 낮은 계대 스톡을 신선한 인간 PBMC를 이용하여 제조하고 액체 질소에 저장하였다. 표 11은 바이러스 각각에 대한 추가의 이용가능한 정보를 열거한다. 바이러스의 사전-적정된 분취량을 냉동고에서 제거하고 사용 직전에 생물학적 안전 캐비닛에서 실온으로 빠르게 해동시켰다.

표 11

신선한 인간 PBMC에서 항-HIV 효능 평가

HIV 및 HBV에 혈청음성인 스크리닝된 공여체로부터 신선한 인간 PBMC를 분리하였다(Biological Specialty Corporation, Colmar, PA). 세포를 저속 원심분리 및 둘베코의 포스페이트 완충된 염수(PBS)에서의 재현탁에 의해 2-3회 펠렛화/세척하여 오염 혈소판을 제거하였다. 그 후 류코포어시드 혈액을 PBS에서 1:1로 희석시키고 50 mL 원심분리 튜브에서 14 mL의 Ficoll-Hypaque 밀도 구배(림프구 분리 배지, Cell Grow #85-072-CL, 밀도 1.078+/-0.002 gm/mL) 상에 쌓고, 이어서 10분 동안 600 Xg로 원심분리시켰다.

밴딩된 PBMC를 생성된 계면으로부터 부드럽게 흡인시키고 후속하여 저속 원심분리에 의해 PBS로 2X 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 트립판 블루 배제에 의해 열거하고 15% 우태아 혈청 (FBS), 2 mM L 글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 4 μg/mL 식물적혈구응집소(PHA; Sigma, St. Louis, MO; catalog #L1668)가 보충된 RPMI 1640에 1 x 10⁶개 세포/mL로 재현탁시켰다. 세포가 37℃에서 48-72시간 동안 인큐베이션되게 하였다.

인큐베이션 후, PBMC를 원심분리시키고 15% FBS, L-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, 비필수 아미노산(MEM/NEAA; Hyclone; catalog #SH3023.01), 및 20 U/mL의 재조합 인간 IL-2(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN: catalog #202IL)가 보충된 RPMI 1640에 재현탁시켰다. PBMC는 검정 프로토콜에 사용될 때까지 매주 2번 배지를 교환하면서 1-2 x 10⁶개 세포/mL의 농도로 이 배지에 유지되었다. 단핵구-유래된 대식세포는 조직 배양 플라스크에 대한 부착 결과로서 배양액으로부터 고갈되었다.

표준 PBMC 검정을 위해, 적어도 두 정상 공여체로부터의 PHA 자극된 세포를 풀링시키고(함께 혼합됨), 신선한 배지에 1 x 10⁶개 세포/mL의 최종 농도로 희석시키고, Infectious Disease Research department of Southern Research Institute에 의해 개발된 표준 포맷으로 96웰 둥근 바닥 미세플레이트의 내부 벽에 100 μL/웰(5 x 10⁴개 세포/웰)로 플레이팅하였다. 하나를 초과하는 공여체로부터의 단핵 세포의 풀링(혼합)을 이용하여 일차 림프구 집단의 IL-2 및 PHA에 대한 HIV 감염 및 전체 반응의 정량적 및 정성적 차이에 기인한 개개 공여체 간에 관찰되는 변동성을 최소화한다. 각 플레이트는 바이러스 대조군 웰(세포 플러스 바이러스) 및 실험 웰(약물 플러스 세포 플러스 바이러스)을 함유한다. 미세역가 튜브에서 4X 농도로 시험 약물 희석액을 제조하고 각 농도의 50 μL를 표준 포맷을 이용하여 적절한 웰에 놓았다. 바이러스 스톡의 오십(50) μL의 소정의 희석액을 각 시험 웰에 놓았다(최종 MOI

0.1). MTS 검정 시스템을 사용한 약물 세포독성 연구를 위해 바이러스 없이 동일하게 별도의 플레이트를 제조하였다(하기 기재됨; 세포독성 플레이트는 또한 MTS 검정에 영향을 미치는 착색된 화합물을 제어하기 위해 세포 없이 약물 플러스 배지를 함유한 화합물 대조군 웰을 포함한다). PBMC 배양액을 감염 후 6일 동안 37℃, 5% CO₂에서 유지시켰다. 이 기간 후에, 세포-비함유 상청액 샘플을 역전사효소 활성의 분석을 위해 수집하고 세포 생존력의 결정을 위해 MTS를 분리된 세포독성 플레이트에 첨가함에 의해 화합물 세포독성을 측정하였다. 웰을 또한 현미경으로 검사하고 임의의 이상을 기록하였다.

역전사효소 활성 검정

미세역가 플레이트-기반 역전사효소(RT) 반응을 활용하였다(Buckheit et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:295-302, 1991). 삼중수소의 티미딘 트리포스페이트(3H-TTP, 80 Ci/mmol, PerkinElmer)를 1:1 dH₂O:에탄올 중에 1 mCi/mL로 받았다. 150 μL의 폴리 rA(20 mg/mL)를 0.5 mL의 올리고 dT(20 단위/mL) 및 5.35 mL의 멸균 dH₂O와 조합시킨 다음 분취시켜(1.0 mL) -20℃에 저장함에 의해 폴리 rA:올리고 dT 주형:프라이머(GE Healthcare)를 원액으로서 제조하였다. RT 반응 완충제를 매일 신선하게 제조하였고 이는 125 μL 1.0 M EGTA, 125 μL dH₂O, 125 μL 20% Triton X100, 50 μL 1.0 M Tris(pH 7.4), 50 μL 1.0 M DTT, 및 40 μL 1.0 M MgCl₂로 구성되었다. 1부의 3H-TTP, 4부의 dH₂O, 2.5부의 폴리 rA:올리고 dT 스톡 및 2.5부의 반응 완충제를 조합시킴에 의해 최종 반응 혼합물을 제조하였다. 10 마이크로리터의 이 반응 혼합물을 둥근 바닥 미세역가 플레이트에 놓고 15 μL의 바이러스-함유 상청액을 첨가하여 혼합시켰다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 반응 부피를 DE81 필터-매트(Wallac) 상에 스폿팅하고, 5% 소듐 포스페이트 완충제 또는 2X SSC(Life Technologies)에서 각각 5분 동안 5회, 증류수에서 각각 1분 동안 2회, 70% 에탄올에서 각각 1분 동안 2회 세척한 다음 건조시켰다. 혼입된 방사능(분당 계수, CPM)을 표준 액체 섬광 기술을 이용하여 정량하였다.

세포 생존력에 대한 MTS 염색

검정 종료시, 감염되지 않은 검정 플레이트를 용해성 테트라졸륨-기반 염료 MTS(CellTiter 96 Reagent, Promega)로 염색하여 세포 생존력을 결정하고 화합물 독성을 정량하였다. MTS는 대사적으로 활성인 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 대사되어 용해성 포르마잔 생성물을 산출하며, 이는 세포 생존력 및 화합물 세포독성의 신속한 정량 분석을 가능하게 한다. 이 시약은 사용하기 전에 준비가 필요없는 안정한 단일 용액이다. 검정 종료시, 20-25 μL의 MTS 시약을 웰마다 첨가한 다음 미세역가 플레이트를 37℃/5% CO₂에서 4-6시간 동안 인큐베이션시켜 세포 생존력을 평가하였다. 점착성 플레이트 밀봉기가 뚜껑 대신에 사용되었고, 밀봉된 플레이트를 용해성 포르마잔 생성물을 혼합하기 위해 여러 번 뒤집고, 플레이트를 Molecular Devices SpectraMax i3 플레이트 판독기에 의해 490/650 nm에서 분광광도적으로 판독하였다.

데이터 분석

인-하우스 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PBMC 데이터 분석은 IC50(바이러스 복제의 50% 억제), IC90(바이러스 복제의 90% 억제), IC95(바이러스 복제의 95% 억제), TC50(50% 세포독성), TC90(90% 세포독성), TC95(95% 세포독성) 및 치료 지수 값(TI = TC/IC; 항바이러스 지수 또는 AI로도 언급됨)의 계산을 포함한다. 항바이러스 활성 및 독성 둘 모두에 대한 원 데이터는 데이터의 그래픽 묘사로 개개 화합물 활성을 요약한 인쇄물에 제공된다.

결과

PBMC에서 HIV-1에 대한 AR-12의 시험으로부터의 결과는 하기 표 12 및 하기 설명된 도면에 요약된다.

표 12

표 12 (2부)

도 9에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 검정색 원으로 표시된 것처럼 바이러스 복제의 감소를 나타낸다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.24 μM의 AR-12 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AR-12의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 6.12 μM의 AR-12 농도가 요구된다.

도 10에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.27 μM의 AR-12 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AR-12의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 6.12 μM의 AR-12 농도가 요구된다.

도 11에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.51 μM의 AR-12 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AR-12의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 6.12 μM의 AR-12 농도가 요구된다.

도 12에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.37 μM의 AR-12 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AR-12의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 6.12 μM의 AR-12 농도가 요구된다.

도 13에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.31 μM의 AR-12 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AR-12의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 6.12 μM의 AR-12 농도가 요구된다.

도 14에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 17.4 nM의 AZT 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AZT의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다.

도 15에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 11.9 nM의 AZT 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AZT의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다.

도 16에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시되고, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 발생시키는데 <0.10 nM의 AZT 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AZT의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다.

도 17에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 5.73 nM의 AZT 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AZT의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다.

도 18에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 AZT의 세포독성)는 흰색(사각형)으로 표시되며, PBMC의 50%(CC50) 독성을 발생시키는데 >1000 nM의 AZT 농도가 요구된다.

도 19에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 0.66 nM의 에파비렌즈 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 에파비렌즈의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 에파비렌즈 농도가 요구된다.

도 20에 도시된 바와 같이, 바이러스 대조군의 퍼센트는 바이러스 복제의 감소를 나타내며 검정색 원으로 표시된다. 이러한 실시예에서, 바이러스 복제의 50%(TC50) 억제를 달성하는데 877 nM의 로피나버 농도가 요구된다. 세포 대조군의 퍼센트(예컨대 로피나버의 세포독성)는 흰색 사각형으로 표시된다. 이러한 실시예에서, PBMC의 50%(CC50) 독성을 달성하는데 >1000 nM의 로피나버 농도가 요구된다.

AR-12는 시험된 모든 바이러스 단리물에 대해 바이러스 복제의 용량-의존적인 감소를 나타내었고, 평균 IC50 값은 812 nM이다(IC50 범위 = 489 nM 내지 1,016 nM). 중등도의 세포독성이 관찰되었고(TC50 = 5,532 nM), 이는 6.8의 평균 치료 지수를 발생시킨다(TI 범위 = 5.45 내지 11.3). 이 연구에서 평가된 HIV 약물 내성 단리물 중 어느 것에 대해서도 AR-12에 대한 명백한 내성은 없었고, 이는 AR-12가 NRTI, NNRTI, PI, INI 및 진입 억제제(이러한 단리물은 이에 대해 내성임)와 상이한 메커니즘을 통해 HIV를 억제함을 시사한다.

전반적인 검정 성능을 각각의 검정에서 예상되는 수준의 항바이러스 활성을 나타낸 대조 화합물(AZT, 리토나버, 랄테그라버, 엘비테그라버, 네비라핀, 델라비르딘 및 T-20)에 의해 확인하였다. 미세역가 플레이트의 각 웰에서 세포의 육안 관찰은 MTS 대사 염료에 의한 세포의 염색 후 수득된 세포독성 결과를 확인시켜 주었다.

실시예 15 - 뎅기 바이러스

DMSO를 이용하여 동결건조된 추출물 AR-12를 용해시키고 제조된 원액을 -20℃에 저장하였다. 원액을 세포 배양 배지를 이용하여 희석시키고 각 실험 직전에 0.2 마이크론 기공 크기를 갖는 주사기 필터(Millipore, MA, USA)로 멸균시켰다.

세포 및 바이러스

조사에 사용된 모든 DENV 단리물의 증식을 위해 C6/36 모기 세포주를 이용하였다. 항바이러스 활성의 평가에 Vero 세포주를 이용하였다. 세포주를 10% 우태아 혈청을 함유하는 EMEM(Gibco, NY, USA)에 유지하고 증식시켰다. C6/36 및 Vero 세포를 각각 3% 및 5% CO₂의 존재하에 28℃ 및 37℃에서 인큐베이션시켰다. 바이러스 접종 및 항바이러스 검정시에, FBS의 농도를 2%로 감소시켰다. DENV의 4개 혈청형(DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4)을 나타내는 4개의 상이한 임상적 DENV 단리물을 분석에 이용하였다. 혈청형은 University of Malaya Medical Center(UMMC)에 있는 환자의 샘플로부터 TIDREC(Tropical Infectious Diseases Research & Education Centre, Malaysia)에서 확인되었다. 4개 모두의 임상적 단리물은 완전 유전체 서열화 방법을 이용하여 유전형이 밝혀졌다. 4개 모두의 임상적 단리물을 C6/36 세포주에서 증식시켰다. 바이러스 단리물의 적정 후, 스톡을 실험에 추가로 이용할 때까지 -80℃에 저장하였다.

시험관내 세포독성 검정

Vero 세포에 대한 AR-12의 독성을 결정하기 위해 MTS 검정을 수행하였다. 간단히 말해, 96-웰 미세플레이트의 컨플루언트 Vero 세포를 상이한 농도의 AR-12에 의해 삼중으로(in triplicates) 처리하였다. 처리된 세포를 항바이러스 검정 시험에 대한 기간과 동일한 2일 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 다음 15 μl의 MTS 용액(Promega, WI, USA)을 각 웰에 첨가하였다. 미세플레이트를 37℃에서 4시간 더 인큐베이션시켰다. 그 후, 100 μl의 용해/정지 용액을 각 웰에 첨가하였다. 미처리된 세포를 포함하는 모든 웰의 광학 밀도(OD)를 플레이트 판독기(TECAN, Mannendorf, Switzerland)에 의해 570 nm 파장 필터를 이용하여 판독하였다. AR-12의 세포독성을 이의 용량-반응 곡선 플롯팅과 함께 Graph Pad Prism 5(Graph Pad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 계산하였다.

항바이러스 활성 검정

시험관내 DENV에 대한 AR-12의 효과를 결정하기 위해, Vero 세포주의 컨플루언트 단층을 200 FFU의 각 DENV 혈청형으로 감염시키고 1시간 동안 37℃에서 바이러스 흡착 후, 감염된 단층을 멸균 PBS로 2회 세정하고 상이한 농도의 AR-12를 갖는 2% FBS 함유 EMEM으로 보충하였다. 그 후, 플레이트를 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 2일 동안 인큐베이션시켰다. DENV 수율을 정량적 RT-PCR에 의해 평가하였다.

정량적 RT-PCR

처리한지 2일 후에 DENV RNA 복사체 수를 측정함에 의해 q RT-PCR을 이용한 바이러스 수율 감소 검정에 의해 AR-12의 항바이러스 효과를 확인하였다. 각 원스텝 qRT-PCR을 5μl의 희석된 RNA, 1μl의 프로브/프라이머 믹스, 10μl의 실시간 마스터 믹스 및 4μ의 뉴클레아제-비함유 물(PrimerDesign, Southampton, UK)을 함유하는 20μl의 최종 부피로 수행하였다. 정량적 PCR 측정을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. Ct.에 대한 기준선 및 임계값을 결정하기 위해 원 데이터를 StepOne™ Software v2.2.1에 의해 분석하였다(부록 A를 참조하세요).

통계적 분석

반 최대 세포독성 농도(CC50) 및 반 최대 억제 농도(IC50)를 이 조사에서 주요 파라메터로서 이용하였다. 윈도우용 GraphPad PRISM, version 5(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, 2005)를 모든 통계적 분석에 이용하였다.

결과

AR-12의 세포독성 활성

Vero 세포에 대한 AR-12의 세포독성을 MTS 검정을 이용하여 평가하였다. MNTD는 >10 μM였다. 따라서, 본 발명자들은 그 농도를 나중에 항바이러스 검정을 위한 가장 높은 농도로서 선택하였다.

DENV에 대한 AR-12의 항바이러스 검정

4개 모두의 DENV 혈청형에 대해 특이적 qRT-PCR을 이용한 바이러스 수율 감소 검정을 이용하여 AR-12의 시험관내 항-뎅기 활성을 평가하였다(도 1).

AR-12는 Vero 세포에서 4개 모두의 DENV 유전형 복제에 대해 용량-의존성 억제 효과를 나타내었고 반 최대 억제 농도(IC50) 값은 하기 표 13에 도시된 대로 제공된다. AR-12는 DENV의 상이한 유전형에 대해 현저한 항바이러스 활성을 갖는다.

표 13

표 13. DENV 혈청형에 대한 AR-12의 IC50 값. 모든 결과는 3번의 독립적인 실험으로부터 수득되었다.

도 23은 표시된 DENV 혈청형에 대한 바이러스 수율 감소 퍼센트를 보여준다. 모든 경우에 바이러스 수율 감소 퍼센트는 적어도 약 1 μM의 농도에서 감소하며 AR-12 농도가 약 4 μM를 초과한 후에 100%로 증가한다. q-RT-PCR을 이용한 바이러스 수율 감소 검정을 이용하여 AR-12의 시험관내 항-뎅기 바이러스 활성을 평가하였다. 세포를 바이러스 감염 1 h 후에 AR-12로 처리하고 연속하여 감염 후 2일까지 처리하였다. 개개 DENV RNA 복사체 수(감염시킨지 2일 후)를 qRT-PCR을 이용하여 정량하였다. 병행하여 유지된 미처리된 대조군과 비교하여 DENV 수율 억제 백분율을 수득하였다. 삼중 실험으로부터의 데이터를 Graph Pad Prism Version 5(Graph Pad Software Inc., San Diego, CA.)를 이용하여 플롯팅하였다.

참고문헌

본원에 기재된 모든 요소가 필요한 것은 아니다. 살제로, 당업자는 본 발명자들이 청구범위에 의해서만 제한하고자 한 본원에 기재된 방법의 수많은 부가적인 이용 및 변형을 발견할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다.

Claims

AR-12를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 단백질 생산을 억제하는 방법으로서, 바이러스 단백질 생산이 미처리된 숙주에 비해 적어도 약 50%만큼 감소하는, 방법.
제 1항에 있어서, 바이러스 단백질이 인플루엔자에 의해 생산되는 방법.
제 2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A인 방법.
제 2항에 있어서, 바이러스 단백질이 구조적 단백질인 방법.
제 2항에 있어서, 바이러스 단백질이 비-구조적 단백질인 방법.
AR-12를 숙주에서의 바이러스 복제를 적어도 약 50%만큼 감소시키기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 복제를 억제하는 방법.
제 6항에 있어서, 바이러스가 그룹 I 바이러스, 그룹 IV 바이러스, 그룹 V 바이러스, 및 그룹 VII 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 6항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자, HIV, HIV-1, HIV-2, 약물-내성 HIV, 후닌 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 피친데 바이러스, 라싸 바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스, 푼타 토로 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리프트 계곡 바이러스, RHDV, SARS 코로나바이러스, 타카라이브 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 6항에 있어서, AR-12가 약 0.1 μM 내지 약 7 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 제공되는 방법.
AR-12를 약 1 μM 내지 100 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 치쿤구니야 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법.
제 10항에 있어서, 바이러스가 치쿤구니야 바이러스의 파비피라버-내성 균주인 방법.
AR-12를 약 0.15 μM 내지 0.55 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 후닌 바이러스에 감염된 숙주에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법.
AR-12를 약 0.1 μM 내지 약 20 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스에 감염된 숙주에서 레트로바이러스 복제를 억제하는 방법.
제 13항에 있어서, AR-12가 약 0.30 μM의 혈액 또는 조직 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여되는 방법.
제 13항에 있어서, 적어도 제2 화합물을 숙주에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 15항에 있어서, 제2 화합물이 티프라나버, 인디나버, 아타자나버, 사퀴나버, 로피나버, 리토나버, 다루나버, 아타자나버, 넬피나버, 엠트리시타빈, 라미부딘{3TC}, 지도부딘{AZT}, 디다노신, 테노포버, 스타부딘, 아바카버, 릴피비린, 에트라비린, 네비라핀, 델라비르딘, 에파비렌즈, T-20, 마라비록, 랄테그라버, 및 돌루테그라버로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
AR-12를 적어도 약 0.30 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, HIV DR에 감염된 숙주에서 HIV DR의 복제를 억제하는 방법.
AR-12를 적어도 약 25 mg/kg의 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 바이러스-유도된 전격성 간 부전을 갖는 숙주의 생존율을 증가시키는 방법.
제 18항에 있어서, AR-12가 25 mg/kg의 적어도 4회 용량의 양으로 숙주에 투여되는 방법.
제 19항에 있어서, 숙주의 생존율이 적어도 약 20%만큼 증가하는 방법.
AR-12를 적어도 약 1 μM의 혈액, 조직, 또는 기관 농도를 달성하기에 충분한 양으로 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스에 감염된 숙주에서 뎅기 바이러스 감염을 감소시키는 방법.
제 21항에 있어서, 혈액, 조직, 또는 기관 농도가 적어도 약 4 μM인 방법.