KR20170098206A - 항-egfr 항체를 포함하는 약학 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR)에 대한 항체를 포함하는 약학 제제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학 제제는 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 안정하여 암 등과 같은 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제{PHARMACEUTICAL FORMULATION COMPRISING ANTI-EGFR ANTIBODY}

본 발명은 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.

항-EGFR 항체는 표피성장인자 수용체(EGFR)와 결합하는 항체로서, 예를 들어 변이부가 마우스 유래이고 불변부가 인간 유래인 키메라 항체인 세툭시맙(cetuximab)(Naramura 등, Cancer lmmunol . Immunotherapy, 1993, 37: 343-349 및 국제특허공개 제 WO 96/40210호), EGFR에 대한 원조 마우스 항체인 MAB 425 등이 있다(Kettleborough 등, Protein Engineering, 1991, 4: 773-783).

항-EGFR 항체를 이용한 시험관 내 및 생체 내의 다양한 연구 결과에 따르면, 상기 항-EGFR 항체는 암세포 증식을 저해하고, 종양 매개의 혈관신생을 감소시키고, 암세포 세포자멸사(apoptosis)를 유도하며, 방사선 및 전통적인 화학요법의 독성 효과를 증가시킴으로써, 다양한 수준에서의 종양을 억제할 수 있다.

그러나 항-EGFR 항체를 치료 목적을 위해 액상 제제 등으로 제제화하면, 이들 항체의 응집하려는 성질로 인하여 단백질 다량체(multimer)가 형성될 뿐만 아니라, 단백질 분해 반응에 의해 탈아미노 반응이 발생한다는 문제가 있다. 이러한 변성 반응은 예를 들어, 운송(transport)되는 동안 상승된 온도에서 저장하거나 전단 응력(shear stress)에 의해 발생된다. 항-EGFR 항체를 포함하는 액상 제제가 이와 같이 변성 반응이 일어나 응집되면, 생성물이 침전되고 입자를 형성할 수 있는데 이로 인해 색전증 등이 유발될 수 있다.

한편, 상기 액상 제제가 응집이 되는 것을 방지하기 위해서는 상기 액상 제제를 주사 등을 통해 환자에게 투여하기 전에 여과하는 방법이 있는데, 이러한 방법은 추가의 단계를 포함하게 되어 복잡하므로 임상 시험에 매우 부적합하며 여과하고 난 후에도 입자 형성이 지속되어 안정성이 떨어질 수 있다.

따라서, 가혹 보관 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 안정한 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제의 개발에 대한 요구가 지속되고 있다.

한편, 기존의 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는 상기 약학 제제를 투여할 때 삼투압으로 인한 체내 통증 반응을 절감시키기 위하여 등장화제로 NaCl을 포함시킨다. 하지만, 단백질 성분의 약학제제는 각 제품마다 적합한 성분을 포함하여야 하며, NaCl 역시 적합한지 여부를 확인해야 한다.

[특허문헌 1] 국제특허공개 제 WO 96/40210호

[비특허문헌 1] Naramura 등, Cancer lmmunol . Immunotherapy, 1993, 37: 343-349

[비특허문헌 2] Kettleborough 등, Protein Engineering, 1991, 4: 773-783

본 발명의 목적은 우수한 안정성을 갖는 항-EGFR 항체 함유 약학 제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 염화나트륨(NaCl)을 포함하지 않고, 항-EGFR 항체, 무수아세트산 나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 약학 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는, 기존의 대부분의 항-EGFR 항체 함유 약학 제제에서 염화나트륨을 포함시키는 것과는 달리, 상기 염화나트륨을 포함하지 않음으로써 오히려 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 보다 안정한 효과를 나타내므로 암 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 A 내지 C는 계면활성제 및 긴장제의 종류를 선별하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 2의 A 및 B는 응집 및 입자 생성 요소를 선정하기 위하여 제조한 시료의 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이고; 도 3의 A 및 B는 이들 시료의 SE-HPLC 및 IE-HPLC 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 4의 A 내지 C는 긴장제의 종류를 스크리닝하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 5의 A 내지 C는 폴리소르베이트 80의 농도를 결정하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 본 발명의 제조예 및 비교예에 따른 약학 제제의 고온 보관 시 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 제조예 1 내지 3(제형 3 내지 5)의 온도별 제형 혼탁도 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8의 A 및 B는 본 발명의 제조예 및 비교예에 따른 약학 제제를 37℃에서 보관시 비-환원 및 환원 상태별 SDS-PAGE 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 9 내지 14는 RSM(Response Surface Methodolgy) 디자인으로 제조한 시료의 37℃에서 2주 보관 조건에 따른 육안 분석 결과, 단백 농도 분석 결과, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF(Isoelectric focusing) 및 SDS-PAGE 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 15 내지 18은 RSM 디자인으로 제조한 시료의 60℃에서 1일 보관 조건에 따른 육안 분석 결과, 혼탁도 분석 결과, DLS 분석 결과 및 역가 1(binding assay) 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 19는 RSM 디자인으로 제조한 시료의 최적화된 플롯(plot) 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 염화나트륨을 포함하지 않고, 항-표피성장인자 수용체(EGFR) 항체, 무수아세트산 나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 액상의 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 약학 제제는 사용자의 편의성을 고려하여 액상 제제의 형태가 바람직하다.

본 발명의 약학 제제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는 상기 약학 제제를 투여할 때 삼투압으로 인한 체내 통증 반응을 절감시키기 위하여 등장화제로 NaCl을 포함시킨다. 하지만 본 발명에서는 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 보다 안정한 항-EGFR 항체 함유 약학 제제를 제조하기 위하여, 기존의 약학 제제들과는 다르게 염화나트륨을 포함하지 않는다. 본 발명에 사용되는 항-EGFR 항체는 NaCl과의 적합성을 고려하면 NaCl을 첨가하지 않는 것이 응집 및 입자 발생을 최소화하며 보다 안정한 제품을 유통하는 데 도움이 된다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 항체 제제의 혼탁도, 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인을 선정한 결과, 혼탁도에 영향을 미치는 주요한 요인은 염화나트륨, 염화나트륨, 완충제의 농도 및 pH인 것으로 확인되었고(도 2의 A), DLS 분석을 통해 확인된 단량체 강도의 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH와 염화나트륨인 것으로 확인되었다(도 2의 B). 또한, SE-HPLC 분석을 통해 확인된 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH 및 염화나트륨이었으며(도 3의 A), IE-HPLC 분석을 통해 확인된 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH 및 완충제의 농도인 것으로 확인되었다(도 3의 B).

따라서, 상기 결과를 토대로 항체 제제에 있어 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 억제하기 위해서는 염화나트륨을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 제제는 항-EGFR 항체를 포함한다.

상기 항-EGFR 항체는 1 내지 16 mg/ml, 바람직하게는 2 내지 10 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어 10 mg/ml로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 항-EGFR 항체는 공지되거나 시판중인 일반적인 항-EGFR 항체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,217,866호 또는 대한민국 등록특허 제1108642호에 기재된 항-EGFR 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 제제는 완충제로서, 무수아세트산 나트륨을 포함한다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 혼탁도, 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인 중 하나는 완충제의 농도 및 pH이다. 따라서, 본 발명의 약학 제제에 포함되는 완충제의 종류, 이의 농도 및 pH는 중요한 요소이다.

상기 무수아세트산 나트륨은 본 발명의 약학 제제의 pH를 유지하기 위해 사용되며, 외부 변화로 인한 pH 변동을 최소화하는 역할을 한다.

상기 무수아세트산 나트륨은, 인산나트륨, 글루타메이트, 히스티딘 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 완충제로 대체될 수도 있으나, 약학 제제의 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 억제시키기 위해서는 적절한 pH 범위가 선정되어야 한다. 본 발명에 따르면 pH 5 내지 6 부근에서는 완충제로 무수아세트산 나트륨을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

상기 무수아세트산 나트륨은 10 내지 200 mM, 바람직하게는 10 내지 100 mM의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어 50 mM의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

이에 따라, 본 발명의 약학 제제의 pH는 5 내지 7, 바람직하게는 5.3 내지 6.1일 수 있다.

본 발명의 약학 제제는 계면활성제로서 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일반적으로 항체를 포함하는 용액은 공기-물 계면에서 높은 표면장력을 갖는다. 이러한 표면장력을 감소시키기 위해, 항체는 공기-물 계면에서 응집하려는 경향이 있다. 계면활성제는 공기-물 계면에서 항체 응집을 최소화함으로써 용액 중의 항체의 생물학적 활성을 유지하도록 돕는다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 계면활성제로 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188을 포함하는 항체 제제의 기계적 자극 시험을 수행한 결과, 계면활성제로 폴리소르베이트 80을 사용하는 것이 항체 제제의 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 저해시키는 효과를 달성하기 위해 보다 바람직함을 확인할 수 있었다(실시예 1 참고).

또한, 본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 다양한 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 항체 제제에 있어, 0.05 내지 2.0 mg/ml의 농도로 포함된 항체 제제가 혼탁도 저해 효과가 있었으며 응집 생성을 저해하는 효과를 확인할 수 있었으며, 특히 0.2 mg/ml의 농도로 포함되는 것이 응집 생성 정도가 가장 낮게 나타났다(실시예 4 참고).

따라서, 상기 폴리소르베이트 80의 농도는 0.05 내지 2.0 mg/ml, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/ml일 수 있으며, 예를 들어 0.2 mg/ml인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 제제는 긴장제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 긴장제는 약학 제제의 응집 및 분해 방지 역할을 한다.

특히 본 발명에서는 긴장제로 만니톨, 글라이신 또는 이의 조합을 사용하는 것이 항체 제제의 혼탁도를 감소, 응집 및 입자 생성을 저해 면에서 보다 바람직하다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 긴장제로서 만니톨 또는 글라이신을 포함하는 항체 제제가 혼탁도 증가를 크게 억제하는 것을 확인할 수 있다(실시예 3 참고).

상기 긴장제가 만니톨인 경우, 1 내지 20%(w/v), 바람직하게는 2 내지 10%(w/v)의 농도, 예를 들어 5%(w/v)로 포함될 수 있다.

상기 긴장제가 글라이신인 경우 1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 2 내지 5%(w/v)의 농도, 예를 들어 3%(w/v)로 포함될 수 있다.

상기 긴장제가 만니톨 및 글라이신의 조합인 경우, 상기 긴장제는 5:1 내지 1:5의 중량비로 만니톨 및 글라이신을 혼합한 혼합물일 수 있으며, 1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 2 내지 5%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 및 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80으로 이루어진 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 5%(w/v) 만니톨로 이루어진 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 3%(w/v) 글라이신으로 이루어진 약학 제제를 제공한다.

상기 구성으로 이루어진 본 발명에 따른 약학 제제는 가혹 조건 하에서 측정된 안정성 분석 결과에서, 염화나트륨을 포함하는 약학 제제에 비해 무색 투명한 상태로 유지되고 혼탁도 증가율이 낮게 나타났으며, 장기 보관 시에도 응집이 발생되지 않아 순도 감소량 또한 낮게 나타났다. 이를 통해 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 있어 염화나트륨을 포함하지 않는 것이 우수한 안정성을 나타냄을 알 수 있었다(시험예 참고).

한편, 본 발명에 따른 약학 제제는, 필요에 따라 희석제, 담체, 안정화제, 산화방지제, 보존제 등의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수도 있다.

상기 희석제로는 식염수, 글루코스, 링거(Ringer) 및 수성 완충 용액을 들 수 있으며, 상기 담체로는 완충된 식염수 용액, 에탄올, 폴리올(예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 등을 들 수 있으며, 상기 안정화제로는 아미노산, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 알부민(예를 들면 인간 혈청 알부민(HSA) 및 소 혈청 알부민(BSA)), 염(예를 들면 염화나트륨, 염화마그네슘 및 염화칼슘), 킬레이터(예를 들면 EDTA) 등을 들 수 있으며, 상기 산화방지제로는 아스코르브산, 글루타티온 등을 들 수 있으며, 상기 보존제로는 페놀, m-크레졸, 메틸- 또는 프로필파라벤, 클로로부탄올, 벤즈알코늄클로라이드 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 제제는, 당해 분야에 공지된 다양한 방식, 예를 들면 경구 또는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있으며, 상기 비경구 투여 방식으로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 피하층내, 관절내, 피막하, 지주막하강, 척추강내, 경막외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하되 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 제제는, 통상적인 1일 투여량은 0.01 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 약학 제제의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 사용된 시약의 입수처는 다음과 같다.

시약 및 시액

무수 아세트산 나트륨(Scharlau, Cat. No. SO0032)

인산수소나트륨(Sodium phosphate monobaic; Scharlau, Cat. No. SO0333)

인산이수소나트륨(Sodium phosphate dibasic; JT Baker, Cat. No. 3817-05)

폴리소르베이트 20 (Tween 20, Merck, Cat. No. 8.17072.1000)

폴리소르베이트 80 (Tween 80, Fluka, Cat. No. 59924)

폴록사머 188 (Pluronic F68, Sigma, Cat. No. P-1300)

염화 나트륨 (Scharlau, Cat. No. SO0225)

만니톨 (JT Baker, Cat. No. 238506)

소르비톨 (Sigma, Cat. No. S7547)

글라이신 (Sigma, Cat. No. 15527)

트레할로스 디하이드레이트 (Sigma, Cat. No. T5251)

아르기닌 염산염(Arg-HCl, Scharlau, Cat. No. AR0125)

하기 실시예에서 제조한 시료는 각 디자인(design) 조건에 맞추어 혼합을 통해 조제한 후, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 이어, 클린 벤치(clean bench)에서 3 ml 글래스 바이알(glass vial)에 소분한 후, 고무 마개로 스토퍼링(stoppering)하고 검체를 보관한 후 실험에 사용하였다.

또한, 본 발명에서 수행된 시험 방법은 다음과 같다.

(1) 기계적 자극(Mechanical stress): 볼텍스 혼합기(Vortex-Genie 2, Scientific Industries)에 바이알을 고정한 후, 3000 rpm으로 상온에서 4시간 동안 볼텍스하였다.

(2) 열적 자극: 바이알을 37℃ 항온 항습기(LHD-2250C, Labtech) 또는 60℃ 항온기(DX7, Hanyoung)에 넣었다.

(3) 육안 분석(Appearance): 응집물이 보이는지 여부를 육안(naked eye)으로 관찰하였다.

(4) 혼탁도(Turbidity): 각각의 검액을 희석 없이 1 mL 준비한 후, UV 분광광도계 (LibraS32, Biochem)를 이용하여 350 nm에서 흡광도를 측정한 후 혼탁도를 분석하였다.

(5) 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS): 각각의 검액을 희석 없이 최소 1 mL 준비하여 DLS 기기(Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument)를 이용하여 검액의 사이즈 분포 차트(size distribution chart) 결과를 확인하였다.

(6) SDS-PAGE: 전기영동장치를 이용하여 통상적인 SDS-PAGE 분석 방법에 따라 수행하였다.

(7) IEF(Isoelectric focusing): 전기영동장치를 이용하여 통상적인 IEF 분석 방법에 따라 수행하였다.

(8) UV 단백 정량: 분광 광도계를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하고 단백 정량을 분석하였다.

(9) SE-HPLC: SE-HPLC 분석 컬럼(TSKgel G3000SW_XL,Cat. No. 08541, Tosoh corporation)을 사용하여 분석하였다.

(10) IE-HPLC: IE-HPLC 분석 컬럼(Propac WCX-10 analytical, Cat. No. 054993, Dionex)을 사용하여 분석하였다.

(11) 역가 1 (Binding assay): ELISA 리더(Spectra Max 190, Molecular Devices)를 이용하여 역가 1 분석에 사용하였다.

(12) 역가 2 (Cell based assay): 96-웰 플레이트에 세포 카운팅(cell counting)을 통해 계산된 동일한 세포를 분주하였다. 24시간 배양 후 배양액을 제거한 다음, 검체 희석액을 웰당 100 μL 넣고, 희석된 표준품 및 희석된 검체를 웰당 100 μL 넣은 후 5일간 배양하였다. 각 웰에 MTS 시약을 40 μL 씩 넣은 후 호일에 싸서 37℃에서 3시간 반응시켰다. ELISA 리더(Spectra Max 190, Molecular Devices)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<최적화 항체 제제를 제조하기 위한 스크리닝>

실시예 1: 계면활성제 및 긴장제의 종류 선별

응집 및 입자 생성을 저해하는 계면활성제 및 긴장제의 종류를 선별하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 성분 및 함량을 혼합하여 시료를 제조하였다.

상기에서 제조한 시료를 대상으로 기계적 자극 시험을 수행하였고 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 1의 A 내지 C에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 육안 혼탁도는 #1, #5, #8 >#7, #9 > #6> #2, #3, #4 순으로 나타났다. 또한 혼탁도를 측정한 결과에서는 계면활성제를 첨가한 시료는 혼탁도 증가가 없었으며, 긴장제를 첨가한 경우 첨가하기 전과 비교하여 Arg-HCl을 첨가한 #6 시료는 46%가 감소하고, 트레할로스를 첨가한 #9는 12%가 감소하였다. DLS 분석 결과에서는 계면활성제가 응집 생성을 저해하고, 긴장제가 응집 강도(aggregation intensity)가 증가시킴을 알 수 있었다.

따라서 계면 활성제의 경우 혼탁도, 응집 생성 및 경쟁 약물 제형 고려 시 폴리소프베이트 20(PS20) 또는 폴록사머 188(P-188)에 비해 폴리소르베이트 80(PS80)이 바람직하고, 긴장제의 경우 혼탁도 결과 고려 시 Arg-HCl가 바람직하였다.

실시예 2: 응집 및 입자 생성 요소 선정

항-EGFR 항체(GC1118A, (재)목암생명공학연구소)를 포함하는 약학 제제에서 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인을 확인하기 위하여, 하기 표 2에 기재된 성분 및 함량을 혼합하여 시료를 각각 제조하였다.

상기에서 제조한 시료를 대상으로 열적 자극 시험을 수행하였다. 열적 자극시험(37℃에서 2주 동안 보관) 후 혼탁도를 육안으로 분석하고, 혼탁도 측정, DLS, SE-HPLC 및 IE-HPLC 분석을 통해 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 가장 주요한 요인 3가지를 선정하였다.

주요한 요인 선정 방법은 미니탭 소프트웨어(minitab software)를 이용하여 파레토 차트(pareto chart, alpha=0.15)를 통해 결과를 분석하는 방식으로 수행되었으며, 그 결과를 도 2의 A 및 B, 및 3의 A 및 B에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 혼탁도에 미치는 주요한 요소는 NaCl, 버퍼 농도 및 pH이었으며(도 2의 A), DLS 분석 결과에서는 단량체 강도(Monomer intensity)의 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH와 NaCl인 것으로 나타났다(도 2의 B).

또한, 도 3에서 보는 바와 같이, SE-HPLC 분석결과에서는 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주요 요인은 pH 및 NaCl인 것으로 나타났으며(도 3의 A), IE-HPLC 분석결과에서는 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주요 요인이 pH 및 버퍼 농도인 것으로 나타났다(도 3의 B).

상기 결과를 통해 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인으로서 pH, NaCl 및 버퍼 농도를 선정하였으며, 추후 실험에서는 미니탭(Minitab) 프로그램으로 RSM (Response Surface Methodology) 디자인을 수행하였다.

실시예 3: RSM 디자인을 통한 약학 제제의 조건 선정

상기 실시예 2에서 선정된 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인들을 대상으로 열적 자극에 안정한 액상 제제를 구현할 수 있는 최적화된 조건을 스크리닝하기 위하여, 미니탭 프로그램으로 RSM 디자인(CCI, 5 수준)하여 pH(4-8), NaCl(0-300 mM) 및 버퍼 농도(10-100mM)에 따른 다양한 시료를 제조하였다.

제조한 시료의 구체적인 성분은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.

먼저, 상기 표 3에 개시된 성분 및 함량을 갖는 각각의 시료를 제조하였다. 이어 제조한 시료를 열적 자극 시험, (i) 37℃에서 2주 동안 보관 조건; 및 (ii) 60℃에서 1일 동안 보관 조건에 각각 적용하였다.

37℃에서 2주 동안 보관 조건에 따른 각 시료별 육안 분석 결과, 단백 농도 분석 결과, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF 및 SDS-PAGE 결과를 도 9 내지 14에 나타내었다. 육안 분석 결과에서는 #9 시료만 불투명, 이외의 모든 시료는 무색 투명한 것으로 나타났으며, IEF 결과에서 #9 시료가 입자 생성으로 인해 밴드 끌림 현상이 발생하는 것으로 확인되었다.

또한, 60℃에서 1일 동안 보관 조건에 따른 각 시료별 육안 분석 결과, 혼탁도 분석 결과, DLS 분석 결과 및 역가(binding assay) 1 결과를 도 15 내지 18에 나타내었다. 육안 분석 결과에서는 #9>#5>#7>#1 및 #3순으로 불투명한 것으로 나타났고(이외의 모든 시료는 무색 투명), 역가 1 결과에서는 #15 검체가 대조군 대비 EC₅₀%가 114 ~ 121%인 것으로 확인되었다.

또한, 상기 결과들을 토대로 최적화된 플롯(plot) 결과를 도 19 및 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4의 결과를 토대로 통계적으로 분석하여 제안된 바람직한 약학 제제의 조건은 하기 표 5와 같다.

	단백농도	완충액	pH	긴장제
최적화 플롯 기준	10 mg/mL	10-94 mM 아세트산나트륨	5.94	w/o NaCl
등고선 기준	10 mg/mL	10-100 mM 아세트산나트륨	5.3-6.1	0 mM NaCl

구체적으로 상기 열적 자극 조건에서 응집, 입자 생성 및 전위 변이를 최소화하며 역가를 만족시키는 조건은 단백(항-EGFR 항체) 농도가 10 mg/mL 일 때, 10 내지 100 mM 아세트산나트륨, pH 5.3 내지 6.1 및 0 mM NaCl을 포함하는 제제임을 확인되었다(등고선 기준). 또한, 상기 조건에서의 최적 안정성 조건은 pH 5.94, 50mM 아세트산나트륨 및 w/o NaCl(즉 0 mM NaCl)을 포함하는 제제임을 알 수 있었다(최적화 플롯 기준).

실시예 3: 긴장제의 종류 스크리닝

본 발명에 따른 약학 제제에서 사용할 긴장제의 종류를 선별하기 위하여, 하기 표 6에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 시료를 제조하였다. 이어, 상기 시료들을 60℃에서 1일 동안 보관한 후 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 4의 A 내지 C에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 육안 시험 결과 모든 시료가 무색 투명한 것으로 나타났으며(도 4의 A), 혼탁도 및 DLS 분석 결과는 임시 제형(Control) 대비 3% 글라이신 및 5% 만니톨을 각각 포함하는 제제가 혼탁도 증가를 크게 억제하는 것으로 나타났다(도 4의 B 및 C).

실시예 4: 폴리소르베이트 80의 농도 결정

본 발명에 따른 약학 제제에서 사용할 폴리소르베이트 80의 농도를 결정하기 위하여, 하기 표 7에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 시료를 제조하였다. 이어, 상기 시료들을 대상으로 기계적 자극 시험을 수행한 후, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 5의 A 내지 C에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이 #1 시료만 불투명하였고 그 외 시료 모두 무색 투명하게 나타났다(도 5의 A). 또한, 혼탁도 면에서도 #1 시료를 제외하고 유의할 만한 혼탁도 변화는 없었으며, 0.05 내지 2.0 mg/ml 농도 범위 모두에서 혼탁도 저해 효과가 있음을 알 수 있었다(도 5의 B). 한편, DLS 분석 결과에서도 0.05 내지 2.0 mg/mL의 모든 농도 범위에서 응집 생성을 저해하는 것을 알 수 있었다(도 5의 C).

그 중 폴리소르베이트 80의 0.2 mg/mL 농도가 응집 정도가 가장 낮게 나타나 최적 농도로 선택하였다.

제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1 및 2: 약학 제제의 제조

하기 표 8에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 통상적인 방식에 따라 액상의 약학 제제를 제조하였다.

	단백농도	버퍼	pH	계면활성제	긴장제
비교 제조예 1 (#1 임시제형)	10.0 mg/ml	50mM 아세테이트나트륨	5.8	-	110mM NaCl
비교 제조예 2 (#2 임시제형)				0.2 mg/ml 폴리소르베이트80 (PS80)	110mM NaCl
제조예 1 (#3 w/o NaCl 및 PS80)	10.0 mg/ml	50mM 아세테이트나트륨	5.7 (0.4)	0.2 mg/ml PS80	w/o NaCl
제조예 2 (#4 글라이신 및 PS80)				0.2 mg/ml PS80	3% 글라이신
제조예 3 (#5 만니톨 및 PS80)				0.2 mg/ml PS80	5% 만니톨

시험예: 약학 제제의 안정성 분석

상기 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1 및 2에서 제조한 약학 제제를 하기 기재된 가혹 조건에 보관한 후, 육안 분석, 혼탁도, DLS, 단백함량, SE-HPLC, IE-HPLC, SDS-PAGE, IEF 및 역가 1 및 2를 분석하였다.

가혹 조건

(1) 60℃에서 2주 동안 보관(1일, 3일, 1주 및 2주)

(2) 5℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 내지 12개월 동안 보관(최초, 2주, 4 주, 6주, 8주, 3개월 내지 12개월)

결과

60℃에서 2주 동안 보관하는 조건에서는, 육안 검사 결과 비교 제조예 1 및 2는 불투명한 것으로 나타났으며, 제조예 3의 제제는 60℃에서 2주 동안 보관하여도 무색 투명하게 유지됨을 알 수 있었다. 혼탁도 및 DLS 분석 결과에서는 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 제조예 3의 제제가 혼탁도 증가율이 가장 낮음을 알 수 있었다(도 6의 A 및 B).

5℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 내지 12개월 동안 보관하는 조건에서는, 육안 검사 결과 모든 약학 제제가 모든 온도 및 보관 조건에서 무색 투명한 것으로 나타났다. 온도에 따른 제형별 혼탁도 변화를 살펴보면, 5℃ 및 25℃에서 보관한 시료의 경우 제형 종류에 상관없이 혼탁도의 변화가 없었으나, 37℃ 보관 시료 중에서는 제조예 2에 따른 제형 #4가 처음 대비 8주 보관 시의 혼탁도가 2.3배 높음을 알 수 있었다(도 7).

한편, UV 단백정량 분석 결과에서는 모든 제형들이 모든 온도 보관 조건에서 처음 대비 95 내지 105% 범위 안에 위치함으로써 유의할 만한 변화 없었다.

SDS-PAGE 분석 결과에서는, 보관 온도에 따른 제조예와 비교 제조예간의 밴드 패턴 차이는 없었다. 하지만 도 8의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 처음 및 37℃에서 8주 보관한 시료의 비-환원(Non-reducing) 및 환원 상태에서의 결과에서는 처음 대비 고온 보관 시료의 밴드 패턴 차이를 확인할 수 있었다. 비-환원 조건에서 비교 제조예 및 제조예에 따른 #1 내지 #5 모두 37℃ 보관 시에 250 kD 크기의 밴드 및 37 내지 50 kD 크기의 밴드 강도가 진해지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 환원 조건에서는 처음 대비 37℃ 보관 시료에서 75 kD 크기의 밴드 강도가 진해지고, 25 내지 50 kD 크기의 여러 밴드들이 새롭게 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, IEF 분석 결과, 모든 보관 조건에서 제형 간 그리고 온도 간 IEF 밴드 패턴 차이 없었으며 pI 7.8-8.3 사이에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.

SE-HPLC 분석 결과, 비교 제조예 및 제조예에 따른 #1 내지 #5 모두 5℃ 및 25℃ 보관 조건에서는 유의할 만한 순도 변화가 없었으나, 37℃에서는 8주 보관 결과, 제제 #1은 95.66%, 제제 #2는 95.15%, 제제 #3은 96.46%, 제제 #4는 96.42%, 그리고 제제 #5는 96.56%로 처음 대비 3.14 내지 4.55%의 순도 감소 발생하였다. 즉, 본 발명에 따른 제조예의 안정성이 비교 제조예보다 우수한 것을 알 수 있었으며, 특히 비교 제조예들의 제형에서는 순도 감소량이 큰데 이것은 메인 피크 앞의 프리-피크(pre-peak) 부분(응집 추정) 증가로 인한 결과로 확인되었다.

역가 2의 분석(세포에 근거한 에세이 분석) 결과에서는 상기 모든 제제가 보관 온도에 상관없이 대조군 대비 EC₅₀가 70 내지 130% 사이로 유의할 만한 변화가 없었다.

이상의 결과를 통해, 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 있어서, 열적 자극 조건에서 응집 및 입자 생성을 억제하는 긴장제로는 NaCl, 글라이신 및 만니톨 등을 들 수 있고 NaCl 또는 만니톨이 바람직하며, 기계적 자극 조건에서 혼탁도, 응집 및 입자 생성을 억제하는 폴리소르베이트 80의 바람직한 농도는 0.2 mg/mL임을 확인하였다.

또한, 60℃의 고온에서 보관한 후 약학 제제의 안정성을 분석한 결과, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체를 포함하는 제제는 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.7±0.4, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 5% 만니톨을 포함하는 것이 기계적/열적 자극에서 안정화시킬 수 있음을 확인하였다.

아울러, 5℃, 25℃ 및 37℃에서 8주 동안 보관한 후 약학 제제의 안정성을 분석한 결과에서는, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체를 포함하는 제제가 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.7±0.4, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 w/o NaCl을 포함하는 것이 물리/화학적 안정성면에서 바람직한 제형임을 알 수 있다.

Claims (9)

1. 염화나트륨(NaCl)을 포함하지 않고,
   항-표피성장인자 수용체(EGFR) 항체, 무수아세트산 나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 약학 제제.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 약학 제제가 만니톨, 글라이신 또는 이의 조합에서 선택된 긴장제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 약학 제제가 5.3 내지 6.1의 범위의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 항-EGFR 항체가 2 내지 10 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 무수아세트산 나트륨이 10 내지 100 mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 폴리소르베이트 80이 0.05 내지 2.0 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
7. 제2항에 있어서,
   상기 긴장제가 만니톨이고, 1 내지 20%(w/v)의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
8. 제2항에 있어서,
   상기 긴장제가 글라이신이고, 1 내지 10%(w/v)의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   
9. 제2항에 있어서,
   상기 긴장제가 5:1 내지 1:5의 중량비로 혼합된 만니톨 및 글라이신의 혼합물이고, 1 내지 10%(w/v)의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 제제.
   

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