KR20170092678A

KR20170092678A - 최적화된 치료 분자를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20170092678A
Application number: KR1020177018778A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 에드워즈; 유민 텡
Original assignee: 크레센도 바이오로직스 리미티드
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2017-08-11
Also published as: AU2016207872A1; SG11201704444YA; GB2552900B; GB201500464D0; GB201713008D0; EP3245226B1; GB2552900A; IL252518A0; EP3245226A1; US20180002403A1; CN107207581A; US10400030B2; IL252518B; JP6817944B2; WO2016113556A1; CA2970775A1; CN107207581B; JP2018502584A

Abstract

본 발명은 제1 선도 면역글로불린의 생물학적 특성의 최적화를 위한 면역글로불린 라이브러리를 디자인하는 방법 및 상기 방법에 의해서 제조된 최적화된 면역글로불린의 라이브러리에 관한 것이다.

Description

최적화된 치료 분자를 제조하는 방법{METHODS FOR PRODUCING OPTIMISED THERAPEUTIC MOLECULES}

본 발명은 제1 선도 면역글로불린에 기반한 표적 최적화 (target optimisation)를 위해 면역글로불린 라이브러리 (immunoglobulin library), 바람직하게 항체 라이브러리 (antibody library)를 디자인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 양태는 또한 상기 방법에 의해서 디자인된 면역글로불린 라이브러리, 및 상기 라이브러리로부터 선택된 면역글로불린에 관한 것이다.

항체 치료제 (antibody therapeutics)가, 예컨대 결합 친화도 (binding affinity), Kd, 또는 면역원성 (immunogenicity)의 결여와 같은 원하는 특성을 선택하기 위해서 초기 선도 항체 (lead antibody)를 최적화함으로써, 종종 디자인된다. 종종 인간의 항체가 인간의 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 마우스 (transgenic mice)와 같은 동물에서 생성된다.

선도 후보 항체의 생성 및 분리 후에, 상기 항체가 다양한 방법으로 최적화될 수 있다. 통상적으로, 상기 선도 항체가 시퀀싱 (sequencing)되고, 부가의 스크리닝 (screening)을 위해 변이체의 항체 라이브러리를 생성하기 위해서 상기 서열이 사용된다. 상기 코딩 영역 (예를 들면, 하나 이상의 CDRs을 코딩하는 영역)으로 축퇴 (degeneracy)를 도입하기 위해서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 변이체가 제조될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 항체를 코딩하는 핵산의 영역의 PCR 증폭을 위해 사용될 수 있다. 이는 통상적으로 다수의 변이체를 포함하는 대형 라이브러리를 생성할 것이고, 여기서 상기 선도 중 각 아미노산 잔기가 다수의 가능한 치환체로 대체된다. 상기 라이브러리가 그 후에 상기 항체 자체를 생성하기 위해 발현 벡터로 클로닝될 수 있고, 리보좀 (ribosome), 파아지 (phage) 또는 이스트 (yeast) 디스플레이 시스템과 같은 디스플레이 시스템 (display systems)이 사용될 수 있다. 그로 인해 생성된 항체가 그 후에 상기 원하는 특성의 향상을 위해서 스크리닝될 수 있다.

이러한 알려진 방법의 단점은 원하는 특성을 나타내는 것보다 훨씬 더 많은 변이체가 생성될 수 있다는 것이다. 이는 상기 라이브러리를 생성하고, 원하는 특성을 갖는 변이체 항체를 선택하는데 필요한 시간과 자원을 증가시킨다. 또한, 전장의 인간의 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 최적화하는 것은 필요한 일부하량 (workload)을 증가시킬 뿐만 아니라, 상기 항체, 특히 조립될 때 중쇄 면역글로불린 및 경쇄 면역글로불린 둘 다를 갖는 항체의 특성에 대한 부가의 불확실성 (uncertainty)을 도입한다.

본 발명은 이러한 단점들의 적어도 일부를 다루고, 면역글로불린 라이브러리를 생성하기 위한 부가의 방법을 제공하는자 한다. 상기는 체세포 과돌연변이 (somatic hypermutation)의 과정에 의해서 면역화된 동물 (immunised animal) 자체에 의한 특정 변이체의 효과적인 사전-선택을 통해서 일부 달성된다. 네이티브 (native) 항체의 생성 중에, 필요한 항체 다양성 (antibody diversity)을 생성하는 상기 B 세포 수용체 유전자좌 (locus)에서 체세포 돌연변이의 매우 높은 비율에 의해서 B 세포의 증식 (proliferation)이 동반된다. 상기 돌연변이가 특정 체세포 과돌연변이 호발부위 (hotspots)에서 주로 집중된다. 본 발명은 상기 면역글로불린 라이브러리의 디자인을 알리기 위해 이러한 다양성의 네이티브 생성을 이용한다.

본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 제1 선도 면역글로불린의 생물학적 특성의 최적화를 위해 면역글로불린 라이브러리를 디자인하는 방법을 제공한다:

a) 하나 이상의 관련된 면역글로불린을 확인하는 단계로서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 상기 제1 선도 면역글로불린과 관련되고, 각 면역글로불린은 표적 항원과 함께 인간의 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 비-인간의 포유류 (transgenic non-human mammal)의 면역화에 의해서 상기 표적 항원에 대해 증가되는 것인 단계;

b) 상기 제1 선도 면역글로불린 및 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린의 아미노산 서열들을 비교하는 단계;

c) 상기 서열 비교에 기반하여,

(i) 상기 제1 선도 면역글로불린과 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린 사이에, 및/또는

(ii) 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린이 복수의 면역글로불린인 경우, 상기 복수의 면역글로불린 사이에, 변이체 아미노산 잔기가 있는 하나 이상의 부위를 확인하는 단계로서,

상기 변이체 아미노산 잔기가 있는 하나 이상의 부위는 상기 제1 선도 면역글로불린의 변형을 위한 잠재적 부위를 포함하는 것인 단계;

d) 상기 서열 비교에 기반하여, 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린의 해당하는 변이체 아미노산으로 대체하기 위한 변형을 위한 하나 이상의 부위를 선택하는 단계; 및

e) 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 변형된, 상기 제1 선도 면역글로불린의 서열에 기반한 라이브러리에 대한 면역글로불린 서열을 생성하는 단계.

바람직하게, 상기 면역글로불린은 CDR3을 포함한다. 상기 면역글로불린은 CDRs: CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트, 바람직하게 중쇄 CDRs: HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함할 수 있다. 상기 면역글로불린은 중쇄-유일 항체 (heavy-chain-only antibodies)로 이루어지거나 또는 이를 포함할 수 있다. 상기 면역글로불린은 V_H 도메인 (domains)으로 이루어지거나 또는 이를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 공통 계통 (common lineage)을 갖고, 또한 상기 제1 선도 면역글로불린과 동일한 표적 항원에 결합하며, 바람직하게 상기 선도 면역글로불린과 비교하여, 적어도 하나의 CDR 영역에서 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 상동성 (homology)을 갖는다.

공통 계통이란 상기 면역글로불린이 동일한 생식세포 서열 (germline sequence)로부터 유래되고, 예컨대 상기 면역글로불린이, 특히 표적 항원에 의한 비-인간 포유류의 면역화 이후에, 비-인간의 포유류에서 생식세포 서열의 체세포 과돌연변이에 의해 수득될 수 있다는 것을 의미한다. 선도 면역글로불린 서열, 예컨대 선도 V_H 서열을, 상기 동일한 계통의 다른 면역글로불린 서열, 예컨대 V_H 서열과 정렬시킴으로써, 상기 면역 반응 중에 표적된 체세포 과돌연변이 호발 부위가 확인될 수 있다.

상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 일반적으로 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR3에서 적어도 70%의 상동성, 바람직하게 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR3에서 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 상동성을 갖는다.

상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 일반적으로 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR1 및/또는 CDR2에서 적어도 70%의 상동성, 바람직하게 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR1 및/또는 CDR2에서 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 상동성을 갖는다.

상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 일반적으로 상기 선도 면역글로불린에 대해 상기 프레임워크 영역 (framework regions)에서 적어도 70%의 상동성, 바람직하게 상기 선도 면역글로불린에 대해 상기 프레임워크 영역에서 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 상동성을 갖는다.

상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개의 면역글로불린을 포함하는 복수의 관련된 면역글로불린을 포함할 수 있다.

단계 c)는 상기 면역글로불린 서열의 CDR내 변형을 위한 부위를 확인하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 CDR내 부위는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상기 관련된 면역글로불린에 존재하는 변이체 아미노산 잔기가 존재하는 경우 변형을 위한 부위로 간주된다.

단계 c)는 상기 면역글로불린 서열의 CDR 외부의 변형을 위한 부위를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 CDR 외부의 부위는 상기 관련된 면역글로불린의 적어도 20% 중에 존재하는 변이체 아미노산 잔기가 있다면 변형을 위한 부위로 간주된다.

잠재적 변형을 위한 부위, 특히 변형을 위한 부위로서 확인되어질 수 있는 CDR 외부의 변형을 위한 부위에 대한 잠재적 부위가, 상기 부위를 변형시켜서 상기 변형된 면역글로불린으로 하나 이상의 하기의 특성들의 도입을 유도할 수 있다면, 변형을 위한 부위로서 확인되지 않는다: (i) 언페어드 시스테인 (unpaired cysteines), (ii) 산화 부위 (oxidation sites) (유리 메티오닌 (free methionines)), (iii) 글리코실화 부위 (glycosylation sites), (iv) 탈아미드화 부위 (deamidation sites), 및 (v) 이성화 부위 (isomerisation sites).

단계 d)에서 선택된 상기 서열은 변형을 위한 상기 부위에서 각 가능한 변형들의 조합을 반영하는 변이체 서열을 포함할 수 있다.

선택된 변형을 위한 상기 부위에서의 변형들은 보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)만을 포함할 수 있다.

상기 변이체 면역글로불린은 선택된 변형을 위한 상기 부위 외부의 변형을 포함하지 않을 수 있다.

단계 e)는 부가의 변이체 면역글로불린의 서열을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 해당하는 변이체 아미노산에 대한 보존적 아미노산 대체물로 대체하기 위해서, 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 상기 서열이 더 변형된다.

단계 e)는 부가의 변이체 면역글로불린의 서열을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 관련된 면역글로불린의 상기 해당하는 잔기에서 발견되지 않는 아미노산으로 대체하기 위해서, 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 상기 서열이 더 변형된다.

본원에 개시된 방법은 단계 e)에서 생성된 서열을 갖는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 라이브러리를 생성하는 단계 f)를 더 포함할 수 있다.

라이브러리가 당 분야에서 종래의 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다.

본 발명의 방법은 원하는 생물학적 특성을 갖는 하나 이상의 면역글로불린을 확인하기 위해 상기 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하는 (screening) 단계 g)를 더 포함할 수 있다.

원하는 생물학적 특성은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 결합 친화도, IC₅₀, 양호한 발현 특성, 용해도, 안정성, 면역원성 결여 / 항-약물 항체 (anti-drug antibody: ADA)의 생성에 대한 가능성을 포함한다.

본 발명의 방법은 단계 a) 전에, 제1 선도 면역글로불린 및 하나 이상의 관련된 면역글로불린을 포함하는 복수의 면역글로불린을 생성 및 시퀀싱하는 단계 (α)를 포함할 수 있다.

상기 복수의 면역글로불린이, 비-인간 포유류, 바람직하게 마우스 (mouse) 또는 래트 (rat), 바람직하게 인간의 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 마우스 또는 래트를, 표적 항원 (target antigen)으로 면역화 (immunising)함으로써 생성될 수 있다.

본 발명의 방법은 단계 a) 전에, 제1 선도 면역글로불린을 확인하는 단계 (β)를 포함할 수 있다.

상기 제1 선도 면역글로불린이, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 표적 항원에 대한 적당하게 높은 결합 친화도, 상기 표적 항원에 대한 특이성 (specificity), 상기 표적 항원에 대한 선택성 (selectivity), 상기 표적 항원의 효과를 중화시키는 능력, 다른 종 (species)으로부터 해당하는 표적 항원과 원하는 교차 반응성 (cross reactivity), IC₅₀, 양호한 발현 특성, 용해도, 안정성, 면역원성의 결여 / ADA에 대한 가능성을 포함하는 하나 이상의 원하는 생물학적 특성에 기반하여 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 면역글로불린은 항체, 또는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다.

상기 면역글로불린은 중쇄-유일 항체를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.

상기 면역글로불린은 항체의 V_H 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.

본 발명은 선도 면역글로불린을 최적화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

a) 전술한 본 발명의 방법을 수행하는 단계; 및

b) 상기 최적화된 면역글로불린의 원하는 생물학적 특성에 기반하여 상기 라이브러리로부터 하나 이상의 최적화된 면역글로불린을 선택하는 단계를 포함한다.

본 발명은 복수의 면역글로불린을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제공하고, 여기서 상기 복수의 면역글로불린의 서열이 전술한 본 발명의 방법에 따라 디자인된다.

본 발명은 복수의 면역글로불린을 포함하는 라이브러리를 제공하고, 여기서 상기 복수의 면역글로불린의 서열이 전술한 본 발명의 방법에 따라 디자인된다.

본 발명은, 전술한 본 발명의 방법에 따라 디자인 또는 선택된, 분리된 면역글로불린을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 면역글로불린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 면역글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터 (vector)를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 포함하는 복수의 벡터를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포 (host cell)를 제공한다.

상기 숙주 세포는 박테리아, 예컨대 이. 콜리 (E. coli); 이스트, 분리된 포유류 세포 또는 세포주, 예컨대, CHO 또는 NS0 세포주일 수 있다.

본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 면역글로불린을 수득하는 방법을 제공한다: 본 발명에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계; 상기 숙주 세포가 벡터에 포함된 핵산 분자에 의해서 인코딩된 면역글로불린을 발현시키는 단계; 및 상기 면역글로불린을 정제하는 (purifying) 단계.

본 발명은 수득된 면역글로불린을 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조제 (pharmaceutical formulation)를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 면역글로불린을 포함하는 키메라 (chimeric) 또는 융합 (fusion) 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은, 부가의 모이어티 (moiety)에 콘쥬게이트되거나 또는 융합된, 본 발명의 면역글로불린 또는 본 발명의 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트 (conjugate)를 제공한다.

상기 부가의 모이어티는 동일 또는 상이한 표적 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 V_H 도메인, 바람직하게 인간의 V_H 도메인, 사이토톡신 (cytotoxin), 방사선핵종 (radionuclide), 반감기 연장 모이어티 (half-life extending moiety), 예컨대, HSA 또는 그 변이체, Fc, PEG 또는 항-HSA 결합 분자, 예컨대, 항-HSA V_H 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 면역글로불린을 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조제, 본 발명의 키메라 폴리펩티드, 또는 본 발명의 콘쥬게이트를 제공한다.

도 1은 관련 항체의 서열과 함께, 선도 중쇄-유일 항체 후보체, 클론 1.1 (탑 라인)의 V_H 도메인의 서열을 갖는, 항-IL-17A 클론 1.1 V_H 패밀리를 나타낸다. 상기 CDR 부분이 음영 처리되었다.
도 2는 표적 인간의 IL-17A 및 IL-17RA 각각에 대해 증가된 (a) 클론 1.1 및 (b) 클론 2.1 V_H 의 결합 키네틱스 (binding kinetics)를 나타내는 BIAcore 데이터를 나타낸다.
도 3은 마커 (M) 퍼멘타스 (Fermentas) 1K+ 래더 (ladder)에 대해 실행된 클론 1.1에 기반한 변이체 라이브러리의 제조를 위한 핵산 세그먼트의 PCR 산물의 아가로스 겔 분석 (agarose gel analysis)을 나타낸다.
도 4는 관련 항체의 서열과 함께, 선도 중쇄-유일 항체 후보체, 클론 2.1 (탑 라인)의 V_H 도메인의 서열을 나타낸다. 상기 CDR 부분이 음영 처리되었다.
도 5는 마커 (M) 제네룰러 (generuler) 100bp 래더 (ThermoSM0243)에 대해 실행된 클론 2.1에 기반한 변이체 라이브러리의 제조를 위한 핵산 세그먼트의 PCR 산물의 아가로스 겔 분석을 나타낸다.
도 6은 상기 클론 1.1 및 클론 2.1 V_H의 최적화된 변이체의 결합 키네틱스를 나타내는 BIAcore 데이터를 나타낸다: (a) 모 (parent) V_H 1.1, 최적화된 V_H 클론 1.10 및 1.6; (b) 모 V_H 2.1 및 최적화된 V_H 2.2.

본 발명은 특정 구현예를 참조하여 더 서술될 것이다. 이러한 구현예들은 단지 본 발명을 예시하는 것이고, 본 발명은 청구범위에서 정의된 바와 같다는 것을 이해할 것이다. 또한, 개시된 구현예들에서 수정 및 변형이 당분야에 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 나타날 것이다.

일반적으로, 본원에 개시된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 당분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 명세서의 방법 및 기술은 당분야에 잘 알려져 있는 종래 방법 및 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서를 통해 인용 및 토의된 다양한 일반적이고, 더 특별한 참조문에 개시된 바와 같이 일반적으로 수행된다. 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조. 효소 반응 및 정제 기술이, 당분야에서 통상적으로 교시되거나 또는 본원에 개시된 바와 같이, 제조자의 명세서에 따라서 수행된다. 본원에 개시된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 의약품 제조, 조제, 및 전달, 환자의 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.

용어 "항체 (antibody)"는, 4개의 폴리펩티드 사슬인, 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 이루어진, 임의의 면역글로불린 (Ig) 분자, 또는 그 항원-결합 부분, 또는, Ig 분자의 필수적인 에피토프-결합 특성 (epitope-binding features)을 보유하는, 그 임의의 기능적 단편 (fragment), 돌연변이체 (mutant), 변이체 (variant), 또는 유도체 (derivative)를 나타낸다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷 (antibody formats)이 당분야에 알려져 있다. 전장 (full-length) 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region, 본원에서 HCVR 또는 V_H로 약칭) 및 중쇄 불변 영역 (heavy chain constant region)으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 V_L로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 이루어진다. 상기 V_H 및 V_L 영역들이, 프레임워크 영역 (framework regions: FR)으로 불리는 더 보존성이 높은 영역에 배치된 (interspersed), 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions: CDR)으로 불리는 과변이 (hypervariability) 영역으로 더 세분될 수 있다. 각 V_H 및 V_L은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 이루어지고, 아미노-말단 (amino-terminus)으로부터 카르복시-말단 (carboxy-terminus)까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 타입 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스 (subclass)를 가질 수 있다.

본원에 개시된 항체는 또한 단일 도메인 항체 (single domain antibody)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 여기서 상기 도메인은 V_H 면역글로불린 도메인이다. 그러므로, 상기 항체는 하나 이상의 V_H 도메인을 갖지만, VL 도메인은 존재하지 않는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 (sVD, sdAb 또는 ISV)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 단일 도메인 항체가 당분야에 개시되어 있으며; 이는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이다. 바람직하게, 상기 하나 이상의 V_H 도메인은 인간의 V_H 도메인이다.

본원에서 사용되는, 용어 VH 또는 "가변 중쇄 도메인 (variable heavy domain)"은, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5^th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)에서 정의된 바와 같이 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 상기 가변 도메인 내에 CDR 아미노산 잔기의 번호매김 (numbering) 및 위치결정 (positioning)은 잘 알려져 있는 Kabat numbering convention에 따른다.

본원에 개시된 항체는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직한 서열 및/또는 그 일부, 예컨대 CDRs가 본원에서 정의된다.

용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내에 상보성 결정 영역을 나타낸다. 상기 중쇄 (및 존재하는 경우, 경쇄)의 각 가변 영역 중 3개의 CDRs가 있으며, 이는 상기 각 가변 영역에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 나타낸다. 용어 "CDR 세트"는 상기 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 나타나는 3개의 CDRs의 그룹을 나타낸다. 이러한 CDRs의 정확한 경계는 상이한 시스템들에 따라 다르게 정의되었다. Kabat에 의해 개시된 시스템이 바람직하다. 용어 "Kabat 번호매김 (numbering)", "Kabat 정의 (definitions)" 및 "Kabat 라벨링 (labeling)"이 본원에서 상호교환하여 사용된다. 당분야에 인지된 이러한 용어들은, 항체 또는 그 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들보다 더 많이 가변하는 (예컨대, 과변이) 아미노산 잔기를 번호매기는 시스템을 나타낸다 (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 비교와 관련하여 "상동성 (homology)"은 일반적으로, 서열들을 정렬시킨 후 및 일부 구현예에서, 최대 비율의 상동성을 수득하기 위해서, 필요하다면, 갭(gap)을 도입한 후에, 제1 서열 중 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 잔기가 해당하는 제2 폴리펩티드 (또는 폴리뉴클레오티드)의 잔기와 동일한 비율을 나타내며, 상기 서열 동일성 (identity)의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않았다. N- 또는 C-말단 연장 (extensions), 또는 삽입 (insertions) 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 당분야에 잘 알려져 있다.

"보존적 아미노산 치환"은 하기 표에 개시된 것이다:

보존적 아미노산 치환

잔기	보존적 치환	잔기	보존적 치환
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu; Val

용어 "Kd"는 "평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant)"를 나타내고, 평형에서 적정 측정 (titration measurement)에서 수득된 값 또는 상기 해리 속도 상수 (dissociation rate constant, Koff)를 상기 결합 속도 상수 (association rate constant, Kon)로 나눔으로써 수득된 값을 나타낸다. "KA"는 친화도 상수를 나타낸다. 상기 결합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 평형 해리 상수가, 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 나타내기 위해 사용된다. 결합 및 해리 속도 상수들을 결정하는 방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 형광-기반 기술을 사용하여, 평형에서 생리학적 완충제에서 시료들을 검사하기 위한 높은 감도 및 능력을 제공한다. 다른 실험 접근법 및 장치, 예컨대 BIAcore® (생체분자간 상호작용 분석) 분석이 사용될 수 있다.

상기 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 고려한, 면역글로불린을 제조하는 방법이 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 알려져 있다. 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝을 용이하게 하는데 특정 기술이 사용될 수 있고; 예를 들면, 아미노산 서열의 라이브러리가, 가령 스크리닝을 용이하게 하기 위해서, 파아지 (phage), 파지미드 (phagemid), 리보좀 (ribosome) 또는 적당한 미생물 (예컨대, 이스트) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열(의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)을 디스플레이 및 스크리닝하기 위한 적당한 방법, 기술 및 숙주 생물체가 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 명확할 것이다 (예를 들면 Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty 참조).

본원에서 나타낸 면역글로불린이 유전자이식 설치류 (transgenic rodent)에서 발현될 수 있다. 상기 유전자이식 설치류, 예를 들면 마우스가 내인성 항체 유전자를 발현하는데 감소된 능력을 갖는다. 일 구현예에서, 상기 설치류는 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자를 발현하는데 감소된 능력을 갖는다. 그러므로, 상기 설치류는, 기능적 내인성 경쇄 및/또는 중쇄가 생성되지 않도록, 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자의 발현을 방해하는 부가의 변형을 포함할 수 있다.

상기 설치류는 마우스일 수 있다. 상기 마우스는 비기능적 람다 경쇄 유전자좌 (non-functional lambda light chain locus)를 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 마우스는 기능적 내인성 람다 경쇄를 만들지 못한다. 상기 람다 경쇄 유전자좌가 일부 또는 전부 결실될 수 있거나, 또는 삽입을 통해 비-기능적으로 만들 수 있다. 예를 들면, 적어도 상기 불변 영역 유전자들인 C1, C2 및 C3가 결실될 수 있거나 또는 삽입을 통해서 비-기능적으로 만들어질 수 있다. 상기 유전자좌가 기능적으로 사일런스 (silence)되어, 상기 마우스가 기능적 람다 경쇄를 만들지 못할 수 있다. 또한, 상기 마우스는 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌 (non-functional kappa light chain locus)를 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 마우스는 기능적 내인성 카파 경쇄를 만들지 못한다. 상기 카파 경쇄 유전자좌가 일부 또는 전부 결실될 수 있거나, 또는 삽입을 통해 비-기능적으로 만들어 질 수 있다.

기능적으로 사일런스된 내인성 람다 및 카파 경쇄 유전자좌들을 갖는 마우스가 예를 들면 WO 2003/000737에 개시된 바와 같이 만들어질 수 있고, 이는 본원에 참조로 그 전문이 포함된다.

또한, 상기 마우스는 비기능적 중쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 마우스는 기능적 내인성 중쇄를 만들지 못한다. 예를 들면, WO 2004/076618에 개시된 바와 같이 (본원에 참조로 그 전문이 포함됨), 모두 8개의 내인성 중쇄 불변 영역 면역글로불린 유전자들 (μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε 및 α)이 상기 마우스에서 부재하거나, 또는 이들이 비-기능적인 정도로 일부 부재하거나, 또는 유전자들 δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b 및 ε이 부재하고 또한 플랭킹 유전자 (flanking genes) μ 및 α가 비-기능적으로 되는 정도로 이들이 일부 부재하거나, 또는 유전자들 μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b 및 ε이 부재하고 또한 α가 비-기능적으로 되는 정도로 α가 일부 부재하거나, 또는 δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε 및 α가 부재하고 또한 μ가 비-기능적으로 되는 정도로 μ가 일부 부재한다. 상기에서 결실 (deletion)은, 기능적 내인성 유전자 산물이 상기 유전자좌에 의해서 인코딩되지 않는 정도, 즉 기능적 산물이 상기 유전자좌로부터 발현되지 않는 정도로, 상기 내인성 유전자좌 유전자 서열이 예를 들면 삽입에 의해서 결실 또는 방해되어지는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 사일런스되었다.

일 구현예에서, 상기 마우스는 비-기능적 중쇄 유전자좌, 비-기능적 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다. 그러므로, 상기 마우스는 임의의 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 생성하지 않는다. 그러므로, 상기 마우스는 삼중 녹아웃 (triple knockout: TKO) 마우스이다.

상기 유전자이식 마우스는 이종 중쇄 유전자좌를 인코딩 및 발현하는 벡터를 포함한다. YACs는 이스트에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해서 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 이스트 크로모좀과 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 cis-작용 구조적 요소 (cis-acting structural elements) (자율 복제 서열 (autonomously replicating sequence: ARS), 동원체 (centromere: CEN) 및 2개의 텔로미어 (telomeres: TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용하는 그 능력은, 이스트 세포에서 전달의 신뢰도 및 크로모좀-과 같은 안정성을 위해 필요로 하는 최소 크기 (150 kb)로 이들이 도달되도록 할 수 있다. YACs의 제조 및 사용이 당분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group).

유전자이식 마우스가 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 유전자이식 마우스를 제조하기 위한 2가지 가장 특징적인 경로는, 새롭게 수정된 난자 (freshly fertilised oocytes)로 유전 물질의 전핵 미세주입 (pronuclear microinjection)을 통해서 또는 상실배 (morula) 또는 배포 (blastocyst) 단계 배아 (embryos)로 안정하게 유전자감염된 배아 줄기 세포 (transfected embryonic stem cells)의 도입을 통한다. 상기 유전 물질이 어떻게 도입되는지와 관계없이, 임신이 지속되고, 후보 유전자이식 후손이 태어나는 암컷 대리모 (pseudo-pregnant female recipients)로 상기 조작된 배아가 전달된다. 상기 광범위한 방법들 사이의 주요 차이점은 유전자이식 동물을 제조하기 위해 이들을 사용하기 전에 ES 클론이 광범위하게 스크리닝될 수 있다는 것이다. 그에 반해서, 전핵 미세주입은 그 도입 후에 상기 숙주 게놈으로 통합되는 상기 유전 물질에 의존하고, 다시 말하면, 상기 이식유전자 (transgene)의 성공적인 혼입은 후손이 태어날 때까지 확인될 수 없다.

이식유전자의 성공적인 통합이 실시되었는지 여부를 도와주고 결정하는데는 당분야에 다수의 방법이 알려져 있다. 상기 게놈으로 상기 구조체의 무작위적 통합 (random integration), 부위-특이적 통합 (site-specific integration), 또는 동종 재조합 (homologous recombination)을 포함하는 다수의 수단에 의해서 유전자이식 동물이 생성될 수 있다. 재조합의 효율을 향상시키기 위해서, 약물 내성 마커 (포지티브 선택), 재조합효소 (recombinases), 재조합-매개 카세트 교환 (recombination-mediated cassette exchange), 네가티브 선택 기술 (negative selection techniques), 및 뉴클레아제 (nucleases)의 사용을 포함하는 이식유전자 통합 및 후속하는 변형을 유도 및 선택하는데 사용될 수 있는 다양한 수단 및 기술이 있다. 대부분의 상기 방법들이 ES 세포의 변형에서 통상적으로 사용된다. 그러나, 상기 기술들 중 일부는 전핵 주입을 통해 매개된 유전자이식 (transgenesis)을 향상시키기 위한 유틸리티를 포함할 수 있다.

원하는 배경내에서 상기 유전자이식 주의 더 효과적인 생성을 제공하기 위해서 부가의 개선이 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 약물 개발을 탐색할 수 있는 중쇄-유일 레퍼토리 (repertoire)의 발현을 위해서 상기 도입된 이식유전자만을 단독으로 사용하기 위해서 상기 내인성 마우스 면역글로불린 발현이 사일런스된다. 유전자-조작된 마우스 (genetically-manipulated mice), 예를 들면 모든 내인성 면역글로불린 유전자좌 (마우스 중쇄, 마우스 카파 사슬 및 마우스 람다 사슬)에 대해 사일런스된 TKO 마우스가 전술한 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 TKO 배경으로 임의의 도입된 이식유전자의 전달이 교배 (breeding)를 통해서 달성될 수 있다 (종래 방법 또는 상기 공정의 효과적인 스케일링을 제공하기 위해서 IVF 단계가 포함됨). 그러나, 유전자이식 과정 중에 상기 TKO 배경을 포함할 수 있다. 예를 들면, 미세주입을 위해서, 상기 난자가 TKO 공여체 (donors)로부터 유도될 수 있다. 유사하게, TKO 배아로부터 ES 세포가 유전자이식에 사용하기 위해 유도될 수 있다.

본원에 개시된 면역글로불린이 다른 모이어티에 콘쥬게이트될 수 있다. 상기 모이어티가 독소 (toxin), 효소 (enzyme) 또는 방사성동위원소 (radioisotope); 또는 반감기 연장 모이어티 (half-life extending moiety), 예컨대 HSA 또는 PEG 또는 항-HSA Ig, 예컨대 항-HSA V_H로부터 선택될 수 있다. 상기 모이어티가 세포독성 분자, 예컨대 화학치료제 (chemotherapeutic drugs), 박테리아 및 식물 독소 (plant toxins) 및 방사성핵종 (radionuclides)으로부터 선택될 수 있다. 종양 세포 사멸 (tumor cell killing)이 종양 세포로 상기 결합 분자의 결합 및 상기 약물 모이어티의 세포독성 활성의 방출 및/또는 활성화 시에 나타난다. 약물 콘쥬게이트에 의해서 제공된 선택성은 독성을 정상 세포로 최소화시킴으로써, 환자에서 약물 치료의 내약성 (tolerability)을 향상시켰다.

면역글로불린을 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물이 본원에 개시된다. 약학적 조성물은 통상적으로 하나 이상의 활성제 (이 경우에, 면역글로불린) 및 약학적-허용가능한 담체를 포함한다. 상기 조성물이 원하는 투여 경로에 따라 조제될 수 있다. 투여 경로의 예는 한정되지 않고, 피부로 또는 이를 통한 피부 투여, 피하 (subcutaneous) 또는 정맥내 (intravenous) 투여를 포함하는 국소, 경구 (oral), 국소 (topical), 비경구 (parenteral), 설하 (sublingual), 직장 (rectal), 질 (vaginal), 눈 (ocular) 및 비강내 (intranasal) 투여를 포함한다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥내, 근육내 (intramuscular), 흉골내 (intrasternal) 주사 (injection) 또는 인퓨젼 (infusion) 기술을 포함한다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위 (dosage units)의 형태를 취할 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 약학적 조제를 제조하는 적당한 방법을 알 수 있을 것이다.

상기 약학적-허용가능한 담체는 입자체 (particulate)일 수 있으므로, 상기 조성물은 예를 들면 사용 전에 재구성을 위해서 동결건조된, 예를 들면 정제 또는 분말 형태이다. 상기 담체(들)은 상기 조성물이 예를 들면 주사가능한 액체 (injectable liquid)이면, 액체일 수 있다. 또한, 상기 담체(들)은 기체여서, 예를 들면 흡입 투여 (inhalatory administration)에 사용하기 위한 에어로졸 조성물 (aerosol composition)을 제공할 수 있다. 용어 "담체 (carrier)"는 희석제 (diluent), 아쥬반트 (adjuvant) 또는 부형제 (excipient)를 나타내고, 여기서 상기 조성물의 활성제와 같이 투여된다. 상기 약학적 담체는 액제 (liquids)이고, 본원에 개시된 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때, 물 또는 생리식염수가 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액으로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 원한다면 소량의 습윤제 (wetting agent) 또는 유화제 (emulsifying agent), pH 완충제 (buffering agents), 또는 상기 조제의 안정성 및 용해도를 향상시키는 제제를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 액체, 예컨대, 용액 (solution), 에멀젼 (emulsion) 또는 현탁액 (suspension)의 형태일 수 있다. 상기 액체가 주사 또는 i.v. 인퓨젼에 의한 전달에 유용할 수 있다. 피부에 국소로 또는 주사 또는 인퓨젼에 의한 투여를 위한 조성물에서, 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 (isotonic agent)가 또한 포함될 수 있다.

본원에 개시된 액체 조성물이 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태일 수 있고, 상기는 또한 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 (sterile diluents) 예컨대, 주사용수 (water for injection), 식염수 (saline solution), 바람직하게 생리 식염수, 링거액 (Ringer's solution), 등장 소듐 클로리드 (isotonic sodium chloride), 고정유 (fixed oils), 예컨대 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 또는 다른 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 및 긴장 (tonicity)의 조절을 위한 제제, 예컨대 소듐 클로리드 또는 덱스트로스. 비경구 조성물이 앰플 (ampoule), 일회용 시린지 (disposable syringe) 또는 유리, 플라스틱 또는 다른 재료로 제조된 다중-투여 바이알 (multiple-dose vial)내에 봉입될 수 있다.

특정 질환 또는 상태의 치료에 효과적/활성인 본원에 개시된 면역글로불린의 양이 상기 질환 또는 상태의 특성에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해서 결정될 수 있다. 또한, 인 비트로 (in vitro) 또는 인 비보 (in vivo) 분석이 최적의 투여량 범위 (dosage ranges)를 확인하는데 도움을 주기 위해서 선택적으로 사용될 수 있다. 상기 조성물에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 상기 질병 또는 장애의 중증도에 의존할 것이고, 임상의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 상기 정확한 투여량은 또한, 상기 특정 조제, 적용 형태, 및 그 특정 부위, 숙주 및 치료될 질병에 따라 가변할 것이다. 연령, 체중, 성별, 식단, 투여 시간, 배출 속도, 상기 숙주의 상태, 약물 조합, 반응 민감성 및 상기 질환의 중증도와 같은 기타 요인들이 고려되어야 한다. 상기 최대 허용된 투여량안에서 연속적 또는 주기적으로 투여가 실시될 수 있다.

실시예

내인성 중쇄 및 경쇄 생성에 대해 사일런스되었지만, 그러나 외인성 인간의 중쇄를 발현하는 유전자이식 삼중 녹아웃 마우스에서 항원 IL-17A 및 IL-17RA에 대해 V_H를 포함하는 중쇄-유일 항체가 증가되었다. 2개의 선도 항체인, 클론 1.1 및 클론 2.1이 수득되었고, 후속하는 최적화 단계에서 사용되었다. 하기 물질 및 방법 섹션에서 사용된 상기 마우스 플랫폼 (mouse platform) 및 상기 선도 항체의 생성의 간단한 상세를 제공한다. 상기 최적화 단계 및 분석이 실시예에서 개시된다.

물질 및 방법

면역화를 위한 Tg /TKO 마우스

내인성 중쇄 및 경쇄 항체 발현에 대해 사일런스된 배경안에서 생식세포 형태로 중쇄 항체 유전자이식 유전자좌를 운반하는 마우스 (삼중 녹-아웃, 또는 TKO)가 이전에 개시된 바와 같이 제조되었다 (WO2004/076618 및 WO2003/000737, Ren et al. Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003).

유전자이식 (Tg) 마우스가 CH1 도메인, 마우스 인헨서 (enhancer) 및 조절 영역 (regulatory regions)이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합된, 과잉의 인간의 V_H, D 및 J 유전자를 포함하는 이스트 인공 크로모좀 (yeast artificial chromosome: YAC)에 의한 새롭게 수정된 난자의 전핵 미세주입에 의해서 유도되었다. 이스트 인공 크로모좀 (YACs)은 이스트에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해서 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 이스트 크로모좀과 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 cis-작용 구조적 요소 (자율 복제 서열 (ARS), 동원체 (CEN) 및 2개의 텔로미어 (TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용하는 그 능력은, 이스트 세포에서 전달의 신뢰도 및 크로모좀-과 같은 안정성을 위해 필요로 하는 최소 크기 (150 kb)로 이들이 도달되도록 할 수 있다. YACs의 제조 및 사용이 당분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002, Macmillan Publishers Ltd., Nature Publishing Group / www.els.net).

사용된 YAC는 그 천연의 형태로 10명의 인간 또는 23개의 중쇄 V 유전자, 인간의 중쇄 D 및 J 유전자, 쥐과 (murine) Cγ1 유전자 및 쥐과 3' 인헨서 유전자를 포함하는 약 340 kb 또는 572 kb이었다. 이는 C_H1 엑손 (exon)이 결여되었다.

개시된 면역 연구에 사용되는 Tg/TKO 주를 제조하기 위해, 상기 유전자이식 제조자 마우스 (transgenic founder mice)가 내인성 면역글로불린 발현이 결여된 동물과 역교배 (back cross)되었다.

면역화를 위한 항원

상기 면역화는 재조합 정제된 단백질을 사용하였다. 재조합 인간의 IL-17A가 Peprotech (Peprotech, cat# AF-200-17)로부터 구입되었다. 재조합 인간의 IL-17A가 또한 사용되었다. 다른 면역원 (immunogens)이 또한 사용될 수 있고, DNA, 조 단백질 (crude protein) 및 유전자감염된 세포 (transfected cells)와 같은 물질을 포함한다.

면역화 프로토콜

재조합 단백질이 상기 Tg/TKO로 투여되었다. 간단하게, 초기 프라이밍 (initial priming) 후에 다양한 간격들을 고려하여, 연령이 8 - 12 주령인 마우스 각각에, Complete Freund의 아쥬반트에 유화된 전체 10μg의 재조합 단백질을 제공하고, 피하로 전달된 후에, Incomplete Freund 아쥬반트에 유화된 1 - 10 μg의 재조합 단백질로 추가접종 (boost)시키고, 피하로 투여되었다. 아쥬반트의 부재하에, 포스페이트-완충된 식염수 중 항원의 최종 투여량이 복강내로 투여되었다.

대안의 면역화 경로 및 절차들이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 상이한 아쥬반트 또는 면역 강화 절차 (immune potentiating procedures)가 Freund 아쥬반트를 대신하여 사용될 수 있다. DNA 면역화가 종종 근육내로 또는 Genegun을 통해서 전달된다. 유전자감염된 세포 또는 이러한 세포로부터 멤브레인 조제가, 비록 제외되는 것은 아니지만, 복강내로 투여된다.

면역화된 마우스로부터 라이브러리의 생성 및 항체 V _H 의 클로닝

a) 조직 처리, RNA 추출 및 cDNA 제조

비장 (spleen), 서혜 (inguinal) 및 상완 림프절 (brachial lymph nodes)이, 각 면역화된 동물로부터 RNAlater™로 수집되었다. 각 동물에 있어서, 상기 비장의 1/3 및 4개의 림프절이 개별적으로 처리되었다. 처음에, 상기 조직이 균질화되었고; Lysing matrix D 비드 튜브 (bead tubes) (MP Bio cat# 116913100)로 조직을 전달하고, 6m/s 40 초 사이클을 사용하여 MP Bio Fastprep 균질화기 (homogeniser) (cat # 116004500)에서 균질화 전에 β-메르캅토에탄올을 포함하는 600μl의 RLT 완충액 (Qiagen RNeasy kit cat# 74104로부터 입수)이 첨가되었다. 상기 균질화된 조직을 포함하는 튜브가 얼음으로 전달되고, 데브리스 (debris)가 5분 동안 10 g으로 미세원심분리 (microcentrifugation)에 의해서 펠렛화 (pellet)되었다. 상층액 400 μl의 시료가 제거되고, RT-PCR에 사용되었다.

초기에, RNA가 제조자의 프로토콜에 따라서 Qiagen RNeasy 키트 cat# 74104를 사용하여 추출되었다. Superscript III RT-PCR high-fidelity 키트 (Invitrogen cat # 12574-035)를 사용하여 cDNA를 제조하기 위하여, 각 RNA 시료가 그 후에 사용되었다. 각 비장 및 LN RNA 시료에 있어서, V_H1, V_H2, V_H3, V_H4 또는 VH6 패밀리에 대한 프라이머와 조합된 VH_J/F (long) 프라이머로 5회의 RT-PCR 반응이 수행되었다. 상기 프라이머들에 대한 상세는 하기와 같다.

마스터믹스 (Mastermixes)가, 하기의 튜브 반응 성분들에 기반하여, RT-PCR 반응을 위해서 제조되었다.

12.5μl 2x 반응 믹스 (reaction mix)

0.5μl 포워드 프라이머 (forward primer) (10μM)

0.5μl 리버스 프라이머 (reverse primer) (10μM)

0.5μl 효소 믹스 (enzyme mix)

500ng - 1μg RNA

최대 25μl 물

상기 RT-PCR 반응이 하기의 조건들을 사용하여 서멀 사이클러 (thermal cycler)에서 수행되었다:

50℃ 20분

94℃ 2분

하기의 35 사이클: 94℃ 15초

58℃ 30초

68℃ 30초

68℃ 5분

4℃로 유지

370bp 범위로 생성물이 겔 전기영동 (gel electrophoresis)에 의해서 확인되었다.

각 마우스에 있어서, 상기 1/3의 비장 및 각 4개의 림프절로부터 주어진 패밀리에 대해 증폭된 상기 V_H 산물이 그 후에 제조자의 지시에 따라 사용되는 Thermo/Fermentas GeneJet PCR 정제 키트 (cat #K0702)를 사용하여 정제를 위해서 모았고 (pooled), 상기 산물이 50μl의 물로 용출되었다.

b. 파지미드 벡터로 클로닝

상기 파지미드 벡터인 pUCG3이 상기 연구들에 사용되었다. 지시된 바와 같이, NcoI 및 XhoI에 의한 제한 효소 분해 (restriction enzyme digestions), 결찰 (ligation) 및 형질전환 (transformation)을 포함하는 종래의 방법을 사용하여, V_H가 pUCG3으로 클로닝될 수 있다. 대안으로서, PCR 기반 방법이 상기 V_H 파지미드 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 절차들 모두가 증폭된 V_H 서열로부터 라이브러리를 생성하기 위해 사용되었다. 전자의 방법이 당분야에서 널리 사용되고, 상세를 찾을 수 있다. 상기 PCR 기반 방법에 있어서, 하기 절차가 사용되었다:

pUCG3의 선형화 버젼 (linearised version)이 PCR을 사용하여 제조되었다;

프라이머:

하기 시약을 포함하는 PCR 반응을 위해, GC 완충액과 Phusion High fidelity PCR 마스터 믹스 (cat # F532L, NEB)가 사용되었다;

Phusion GC 2x 믹스 25μl

pUCG3 5-10ng

프라이머 (10μM) 각 1.25μl

DMSO 1.5μl

뉴클레아제-프리 (Nuclease-free) H₂O 최종 부피 50μl

사용된 사이클링 조건은 하기와 같다

98℃ 30초

하기의 10 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

68℃ 2분, 30초

하기의 20 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

68℃ 3분

68℃ 5분

4℃로 유지

상기 PCR 산물 (3152bp)이, 제조자의 지시에 따라서, Fermentas GeneJet Gel 정제 키트 (cat # K0691)를 사용하여 겔 정제되었고, 40μl의 용출 완충액으로 최종 용출시켰다.

상기 정제된 V_H RT-PCR 산물이, 하기의 반응에 기반하여, 형질전환 및 라이브러리 형성을 위한 파지미드 산물을 제공하기 위해서 선형화 pUCG3을 갖는 메가프라이머 (megaprimers)로 사용되었다:

Phusion GC 2x 믹스 25μl

선형화 pUCG3 700ng

VH PCR 산물 250ng

DMSO 1.5μl

뉴클레아제-프리 H2O 최종 부피 50μl까지

PCR이 하기와 같이 수행되었다;

98℃ 30초

하기의 10 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

72℃ 2분

72℃ 5분

10℃로 유지

PCR의 산물이 1% 아가로스 겔 (agarose gel)에서 분석되었다.

상기 다양한 패밀리 V_H/파지미드 산물이, 제조자의 지시에 따라서, Fermentas PCR 정제 키트 (cat #K0702)를 사용하여 최종 용출이 25μl H₂O로 정제되고, BioRad 10 x 1 mm 큐벳 (cuvettes) (BioRad cat # 165-2089), 에펜도르프 에포레이터 (Eppendorf Eporator) 및 예열된 (pre-warmed) 회복 배지 (recovery medium) (Lucigen, proprietary mix)를 사용하여 전기영동에 의해서 TG1 이 . 콜리 (Lucigen, Cat: 60502-2)의 형질전환을 위해서 사용되었다. 2μl의 상기 정제된 산물이 상기 전기영동을 위해서 25μl의 세포로 첨가되고, 최대 10회의 전기영동이 각 V_H/파지미드 산물에 대해 1800v로 수행되었다. 전기영동된 세포를 모으고, 150 rpm으로 진탕하면서, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 50ml의 Falcon 튜브에서 회복되었다. 상기 형질전환의 분취량의 10배 희석 시리즈가 수행되었고, 2% (w/v) 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린 (ampicillin)이 보충된 2xTY 아가 (agar)를 포함하는 페트리 디시에 도말되었다 (plate). 상기 디시에 수득된 콜로니가 상기 라이브러리 크기를 추정하는데 사용되었다. 상기 형질전환의 나머지가, 2% (w/v)의 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린이 보충된 2xTY 아가를 포함하는 대형 포맷 생물학적분석 (large format Bioassay) 디시 상에 도말되었다. 모든 아가 플레이트가 30℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 10ml의 2xTY 액체배지 (broth)가 대형 포맷 생물학적분석 디시에 첨가되었고, 콜로니들이 스크레이프되고 (scraped), OD₆₀₀이 측정되었다 (1.0의 OD = 5 x 10⁸ 세포/ml). 분취량이 50% v/v의 글리세롤 용액 (50%)의 첨가 후에 냉동바이알 (cryovials) 중에 -80℃로 보관되거나 또는 파지 선택 과정 (phage selection process)에서 직접 사용되었다.

항체의 선택

수 개의 중쇄-유일 항체가 면역화된 마우스로부터 수득되었고, 상기 면역원 (IL-17A 또는 IL-17RA)에 대한 결합 친화도, IL-17A / IL-17RA 상호작용을 억제하는 능력, 및 결합 키네틱스에 대해서, 결합 ELISA, 생화학적 억제 분석, 세포 기반 억제 분석 및 BIAcore® 분석의 조합에 의해서, 표준 기술을 사용하여 스크리닝되었다. 상기 스크린으로부터, 선도 항체로서, IL-17A에 대해 증가된 클론 1.1 및 IL-17RA에 대해 증가된 클론 2.1의 2개의 항체가 선택되었다.

BIAcore 분석.

V_H 항체의 결합 키네틱스가 BIAcore T200 장치에서 측정되었다. 표적 (재조합 IL-17A 또는 IL-17RA)이 pH 5.5의 아세테이트 완충액 중 1μg/ml로 희석되었고 (BIAcore, cat# BR-100-52), 아민-커플링 화학 (NHS-EDC amine-coupling kit, cat# BR-1000-50) 및 상기 BIAcore 고정 Wizard 소프트웨어를 사용하여 CM5 시리즈 S 칩 (cat # BR-1006-68)으로 커플링되었다. 상기 방법으로, 100RU의 표적이 고정되고, 또한 검정 표면 (blank surface) (표적 없음)이 표준 공제 (reference subtraction)를 위해 제조되었다.

V_H 항체의 결합 키네틱스가 단일-사이클 키네틱스 (single-cycle kinetics)에 의해서 결정되었다. V_H 항체가 희석 시리즈로 제조되었고 (통상적으로 최고 농도에서 100nM의 V_H 로 시작하여 1:3의 희석 시리즈), 그 후 상기 항원-코팅된 표면 및 검정 표면 위에 주입되었고, V_H의 최저 농도로 시작하여, 그 후 작업을 최대 농도까지 점진적으로 진행시켰다. V_H 결합 키네틱스가 그 후에 1:1의 결합 모델 및 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 상기 (검정 공제된) 센서그램 트레이스 (sensorgram traces)로부터 결정되었다.

실시예 1. 체세포 과돌연변이의 조합을 포함하는 돌연변이된 V _H 의 생성

a. 체세포 과돌연변이의 조합을 포함하는 클론 1.1 V _H (항-IL-17A V _H ) 변이체의 생성

신규한 최적화 전략이 면역화된 마우스로부터 분리된 V_H의 결합 친화도를 증가시키는데 사용되었다. 선도 V_H가 면역 반응 중에 표적인 체세포 과돌연변이 호발부위를 확인하기 위해서 동일한 계통의 다른 멤버와 정렬되었다 (도 1). 상기 위치에서 아미노산의 선택은 신규한 재조합 라이브러리 접근법을 기반으로 형성되었고, 각 돌연변이 호발 부위에서 최적의 아미노산을 가진 더 높은 친화도 V_H를 선택하는 것을 목적으로 하는 신규한 라이브러리의 디자인을 이끌었다.

IL-17A에 대한 예로서, 클론 1.1이 전술한 바와 같이 면역화된 Tg/TKO 마우스로부터 직접 분리되었다. 상기 V_H가 높은 친화도로 IL-17A를 결합시키는 것을 보여주었다 (도 2). 동일한 계통의 다른 멤버와 V_H 클론 1.1의 정렬이 면역 반응 중에 돌연변이되어진 다수의 아미노산 위치를 확인하였고, V_H -CDRs 및 V_H -프레임워크 영역 둘다가 영향을 받는다 (도 1). 그 후에, V_H 클론 1.1의 더 높은 친화도 변이체를 확인하기 위한 목적으로 신규한 클론 1.1 재조합 라이브러리를 디자인하는데 상기 정보가 사용되었다.

HF 완충액을 갖는 Phusion High fidelity PCR 마스터 믹스 (cat # F531L, Thermo)가 하기와 같이 각 프라이머 페어링 (primer pairing)에 대해 설정된 상기 PCR 반응을 위해 사용되었다:

Phusion HF 2x 믹스 25μl

프라이머 (10μM) 각 1.25μl (표에서와 같이 페어링)

클론 1.1 플라스미드 DNA (34ng/μl) 0.5μl

뉴클레아제-프리 H₂O 50μl 최종 부피

PCR이 하기와 같이 수행되었다;

98℃ 30초

하기의 31 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

72℃ 20초

72℃ 10분

10℃로 유지

각 PCR의 산물이 1% 아가로스 겔에서 분석되었다 (도 3a). 각 산물이 그 후에 Fermentas PCR 정제 키트 (K0701)를 사용하여 40μl 용출 완충액으로 정제되었다. 그 후 조립 PCRs이 전장 V_H 서열을 재수립하기 위해 설정되었다:

Phusion HF 2x 믹스 25μl

정제된 PCR 산물 1 5μl

정제된 PCR 산물 2 5μl

정제된 PCR 산물 3 5μl

정제된 PCR 산물 4 5μl

정제된 PCR 산물 5 5μl

PCR이 하기와 같이 수행되었다;

98℃ 30초

하기의 5 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

72℃ 20초

0.5μl의 프라이머 V3/pelB(long) 및 V_H _J/F(long) (둘 다 10μM)가 상기 반응으로 첨가되었고, 그 후 상기 조건에서 부가의 10번의 PCR 사이클이 계속되었다. 상기 PCR 산물이 1% 아가로스 겔에서 분석되었고 (도 3b), Fermentas PCR 정제 키트를 사용하여 40μl 용출 완충액으로 정제되었다. 그 후에 상기 PCR 산물이 실시예 2에 개시되는 라이브러리 제조에 대한 메가프라이머로 사용되었다.

b. 체세포 과돌연변이의 조합을 포함하는 클론 2.1 V _H (항-IL- 17RA ) 변이체의 생성

유사한 재조합 라이브러리 접근법이 V_H 클론 2.1에 의해서 향하는 항-IL-17RA 계통에 대해 사용되었다. 상기 V_H가 높은 친화도로 IL-17RA를 결합시키는 것으로 개시되었다 (도 2). 상기 동일한 계통의 다른 멤버와 클론 2.1의 정렬로 면역 반응 중에 돌연변이되어진 다수의 아미노산 위치가 확인되었다 (도 4). 그 후에 클론 2.1의 더 높은 친화도 변이체를 확인하는 것을 목적으로 하는 신규한 클론 2.1 재조합 라이브러리를 디자인하는데 상기 정보가 사용되었다.

Phusion High fidelity DNA 폴리머라제 (cat # F518, Thermo)가 하기와 같이 각 프라이머 페어링을 위해서 설정된 상기 PCR 반응에 대해 사용되었다:

Phusion HF 5x 완충액 10μl

25mM dNTPs (cat # R0182, Thermo) 1μl

프라이머 (10μM) 각 1μl (표에서 페어링)

클론 2.1 플라스미드 DNA 20ng

뉴클레아제-프리 H₂O 50μl 최종 부피

PCR이 하기와 같이 수행되었다;

94℃ 60초

하기의 30 사이클: 94℃ 30초

58℃ 30초

72℃ 30초

72℃ 5분

10℃로 유지

각 PCR의 산물이 1% 아가로스 겔에서 분석되었다 (도 5a). 그 후, 각 산물이 Fermentas PCR 정제 키트 (K0701)를 사용하여 정제되었다. 조립 PCRs이 전장 VH 서열을 재수립하기 위해서 설정되었다:

Phusion HF 5x 완충액 10μl

25mM dNTPs (cat # R0182, Thermo) 1μl

pUCG3-VH-F 프라이머 (10μM) 1μl

pUCG3-VH-R 프라이머 (10μM) 1μl

정제된 PCR 산물 1 5μl

정제된 PCR 산물 2 5μl

정제된 PCR 산물 3 5μl

정제된 PCR 산물 4 5μl

뉴클레아제-프리 H₂O 50μl 최종 부피

94℃ 60초

하기의 30 사이클: 94℃ 30초

58℃ 30초

72℃ 30초

72℃ 5분

10℃로 유지

상기 PCR 산물이 1% 아가로스 겔에서 분석되었고 (도 5b), Fermentas PCR 정제 키트를 사용하여 40μl 용출 완충액으로 정제되었다. 상기 PCR 산물이 그 후에 실시예 2에서 개시되는 라이브러리 제조를 위해 메가프라이머로 사용되었다.

실시예 2. 돌연변이된 클론 1.1 및 클론 2.1 V _H 의 파아지 디스플레이 라이브러리의 생성

PCR-기반 방법이, 클론 1.1 및 클론 2.1 돌연변이된 서열을 포함하는 V_H 파지미드 라이브러리를 제조하기 위해 사용되었다. 상기 정제된 V_H 조립체 PCR 산물 (실시예 1)이 선형화 pUCG3 파지미드 벡터를 갖는 메가프라이머로서 사용되어서, 하기 반응에 기반하여, 형질전환 및 라이브러리 형성을 위한 산물을 제공하였다;

Phusion GC 2x 믹스 25μl

선형화 pUCG3 700ng

V_H PCR 산물 250ng

DMSO 1.5μl

뉴클레아제-프리 H₂O 50μl 최종 부피

PCR이 하기와 같이 수행되었다;

98℃ 30초

하기의 10 사이클: 98℃ 10초

58℃ 20초

72℃ 2분

72℃ 5분

10℃로 유지

상기 V_H/파지미드 PCR 산물이 제조자의 지시에 따라 Fermentas PCR 정제 키트 (cat #K0702)를 사용하여 최종 용출이 25μl H₂O가 되도록 정제되었다. 상기 정제된 V_H/파지미드 PCR 산물이, BioRad 10 x 1 mm 큐벳 (BioRad cat # 165-2089), 에펜도르프 에포레이터 및 예열된 회복 배지 (Lucigen, proprietary mix)를 사용하는 전기영동에 의해서 TG1 이 . 콜리 (Lucigen, Cat: 60502-2)의 형질전환을 위해서 사용되었다. 2μl의 상기 정제된 산물이 상기 전기영동을 위해서 25μl의 세포에 첨가되었고, 최대 10회의 전기영동이 각 V_H/파지미드 산물에 대해 1800v로 수행되었다. 전기영동된 세포를 모으고, 150 rpm으로 진탕하면서, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 50ml의 Falcon 튜브에서 회복되었다. 상기 형질전환의 분취량의 10배 희석 시리즈가 수행되었고, 2% (w/v) 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린이 보충된 2xTY 아가를 포함하는 페트리 디시에 도말되었다. 상기 디시 상에 수득된 콜로니가 상기 라이브러리 크기를 추정하는데 사용되었다. 상기 형질전환의 나머지가, 2% (w/v)의 글루코스 및 100μg/ml의 암피실린이 보충된 2xTY 아가를 포함하는 대형 포맷 생물학적분석 디시 상에 도말되었다. 모든 아가 플레이트가 30℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 10ml의 2xTY 액체배지가 대형 포맷 생물학적분석 디시에 첨가되었고, 콜로니들이 스크레이프되고, OD₆₀₀이 측정되었다 (1.0의 OD = 5 x 10⁸ 세포/ml). 분취량이 50% v/v의 글리세롤 용액 (50%)의 첨가 후에 냉동바이알 중에 -80℃로 보관되거나 또는 파지 디스플레이 선택에서 직접 사용되었다.

몇가지 경우에서, 클론이 직접 수집되었고, 상기 라이브러리의 다양성의 추정을 제공하기 위해서 서열이 결정되었다. 클론 1.1 및 클론 2.1 둘 다에 있어서, 1e8 (1x10⁸) 초과의 재조합체를 갖는 파이지 디스플레이 라이브러리가, 돌연변이성 PCR 반응에 의해서 생성된 V_H 다양성을 완전히 캡쳐하기 위해서 제조되었다.

실시예 3. 돌연변이된 클론 1.1 및 클론 2.1 V _H 라이브러리의 파아지 디스플레이 선택

라이브러리 파아지 원료 (library phage stocks)의 준비 및 파아지 디스플레이 선택이 공개된 방법에 따라 수행되었다 (Antibody Engineering, edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004). 대부분의 경우에, 패닝 접근법 (panning approach)과 조합된 파아지 디스플레이가 결합 V_H 도메인을 분리하기 위해 사용되었다. 그러나, 용해성 선택 (soluble selections), 응력하에 수행된 선택 (예컨대, 가열) 및 경쟁적 선택 (competitive selections)을 포함하는 다양한 상이한 선택 방법이 당분야에 잘 개시되었고, 과량의 항원 또는 항원-반응성 V_H 도메인이 높은 친화도 V_H 도메인의 회복을 위해서 또는 특정 에피토프와 떨어지는 선택을 왜곡하기 위해서 경쟁 (competition)으로서 첨가된다.

클론 1.1 및 클론 2.1 재조합 라이브러리 둘 다에 있어서, 1 라운드의 패닝 선택이 수행되었고 (PBS 중 10ug/ml로 50μl 부피 중 맥시소브 플레이트 (maxisorb plates) (Nunc 443404) 상에 고정된 항원), 이후 연속되는 라운드의 선택에서 감소된 양의 항원을 사용하여 2-3 라운드의 용해성 선택이 수행되었다 (1nm 내지 100pM의 바이오티닐레이트 항원 (biotinylated antigen)).

실시예 4. 향상된 결합 친화도를 갖는 V _H 의 확인

향상된 결합 친화도를 갖는 V_H를 확인하기 위해서 BIAcore T200 장치를 사용하여, 상기 상이한 선택으로부터 V_H가 스크리닝되었다.

재조합 IL-17A (Peprotech AF-200-17)가 pH 5.5의 아세테이트 완충액에서 1μg/ml로 희석되고 (BIAcore, cat# BR-100-52), 아민-커플링 화학 (NHS-EDC amine-coupling kit, cat # BR-1000-50) 및 BIAcore 고정 Wizard 소프트웨어를 사용하여 CM5 시리즈 S 칩 (cat # BR-1006-68)으로 커플링되었다. 이러한 방법에서, 100RU의 IL-17A가 고정되고, 또한 검정 표면 (IL-17A 없음)이 표준 공제를 위해서 또한 제조되었다. IL-17RA에 있어서, 먼저 단백질 G 칩이 단백질 G를 pH 4의 아세테이트 완충액 중 20μg/ml로 희석시킴으로써 제조되고 (BIAcore, cat# BR-100-49), 그 후 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 시리즈 S 칩으로 1200 RU를 커플링시켰다. 상기 표면이 그 후에 용액으로부터 IL-17RA Fc 융합 단백질을 캡쳐하기 위해서 사용되었고: 30μl/분 유속으로 10초 동안 주입된 HBS 중 10μg/ml의 IL-17RA가, 상기 단백질 G 표면 상에 IL-17RA의 약 100-150 RU를 캡쳐할 것이다.

최적화된 클론 1.1 (항-IL-17A) 및 클론 2.1 (항-IL-17RA) V_H의 결합 키네틱스가 단일-사이클 키네틱스에 의해서 결정되었다. V_H가 희석 시리즈로 제조되었고 (통상적으로, 최고 농도에서 100nM의 V_H로 시작하여 1:3 희석 시리즈), 그 후 항원-코팅된 표면 및 검정 표면 위에 주입되어서, V_H의 최저 농도로 시작하여, 그 후에 최고 농도까지 점진적으로 작업을 진행시켰다. 그 후 V_H 결합 키네틱스가 1:1 결합 모델 및 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 상기 (검정 공제된) 센서그램 트레이스로부터 결정되었다.

BIAcore 분석 이후에, IL-17A에 대해 최대 10-배 향상된 친화도를 갖는 클론 1.1의 변이체가 상기 재조합 라이브러리로부터 분리되었다 (예컨대, 클론들인 클론 1.10 및 클론 1.6, 도 6a). 유사하게, 클론 2.1에 있어서, IL-17RA에 대한 친화도가 5배 만큼 향상된 신규한 변이체가 분리되었다 (클론 2.2) (도 6b).

서열목록 정보

V_H 핵산 서열

SEQUENCE LISTING <110> Crescendo Biologics Limited <120> Methods for Producing Optimised Therapeutic Molecules <130> PC927560WO <150> GB 1500464.1 <151> 2015-01-12 <160> 66 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggattgttat tactcgcggc ccag 24 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> /note="n = a, c, t or g" <400> 2 ctggtgaagg ngtatccaga agccttgc 28 <210> 3 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> /note="n = a, c, t or g" <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> /note="G or C" <220> <221> misc_feature <222> 31 <223> /note="A or T" <220> <221> misc_feature <222> 64 <223> /note="A or G" <400> 3 gcaaggcttc tggatacncc ttcaccantt ntgatatcaa ttgggtgcga caggccacag 60 gacnaagcct tgagtggatg ggatggatga acc 93 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> /note="C or T" <220> <221> misc_feature <222> 41 <223> /note="A or C or T" <220> <221> misc_feature <222> 44 <223> /note="C or T" <220> <221> misc_feature <222> 46 <223> /note="C or G or T" <220> <221> misc_feature <222> 47 <223> /note="C or G or T" <220> <221> misc_feature <222> 48 <223> /note="C or T" <400> 4 cctggtcatg gtgactctgn cctggaattt ctgtgcatag ncantnnnag ggttcatcca 60 tcccatccac 70 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcagagtca ccatgaccag gaa 23 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> /note="C or T" <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> /note="A or C" <400> 6 gttcttccag tnatcccttn tgcctctcgc ac 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> /note="G or T" <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> /note="A or G" <400> 7 gtgcgagagg canaagggat nactggaaga ac 32 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgtggtgat ggtggtgatg 20 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttattcga tgtactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300 atactacccc tccactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 10 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaagcaag atggaagtga gcaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300 atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 11 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatcgca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc atagaacaag atggaagtga ggaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgttt 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300 atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357 <210> 12 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata ccccttcacc agttatgata tcaattgggt gcgacaggcc 120 acaggacaaa gccttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacagtctat 180 gcacagaaat tccagggcag agtcaccatg accaggaata cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt atttttgtgc gagaggcaga 300 agggatgact ggaagaacaa ttattggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 13 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata ccccttcacc agttatgata tcaattgggt gcgacaggcc 120 acaggacgaa gccttgagtg gatgggatgg atgaacccta ccaatggtaa cacagtctat 180 gcacagaaat tccaggacag agtcaccatg accaggaata cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt atttttgtgc gagaggcaga 300 agggatgact ggaagaacaa ttattggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 14 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtbca gctggtgcag 60 tctggggctg agg 73 <210> 15 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccagatcac cttgaaggag 60 tctgg 65 <210> 16 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccsaggtgca gctggtggag 60 tctgggggag g 71 <210> 17 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctgcaggag 60 tcggg 65 <210> 18 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtaca gctgcagcag 60 tcagg 65 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccgtggtgat ggtggtgatg gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 54 <210> 20 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccsaggtgca gctggtggag 60 tctgggggag g 71 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> /note="any base" <220> <221> misc_feature <222> 19 <223> /note="C or T" <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> /note="C or G or T" <400> 21 tggcggaccc agtacatnnn ataactacta aaggtg 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> /note="A or C or 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ccctcgagtg angagacngt gacc 54 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ser Tyr Ser Met Tyr 1 5 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Glu Ile Leu Pro Leu His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser Tyr Ser Met Tyr 1 5 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Tyr Arg Met Tyr 1 5 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ser Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 20 25 30 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gly Arg Arg Asp Asp Trp Lys Asn Asn Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 58 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 20 25 30 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Ser Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Trp Met Asn Pro Thr Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 62 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Arg Arg Asp Asp Trp Lys Asn Asn Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ctcgagggtg gcggtagcca tcaccaccat c 31 <210> 66 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 tccatggcca tcgccggctg ggccgcgag 29

Claims

하기 단계를 포함하는, 제1 선도 면역글로불린 (lead immunoglobulin)의 생물학적 특성의 최적화 (optimisation)를 위해 면역글로불린 라이브러리 (library)를 디자인하는 (designing) 방법:
a) 하나 이상의 관련된 면역글로불린을 확인하는 단계로서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 상기 제1 선도 면역글로불린과 관련되고, 각 면역글로불린은 표적 항원과 함께 인간의 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 비-인간의 포유류 (transgenic non-human mammal)의 면역화에 의해서 상기 표적 항원에 대해 증가되는 것인 단계;
b) 상기 제1 선도 면역글로불린 및 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린의 아미노산 서열들을 비교하는 단계;
c) 상기 서열 비교에 기반하여,
(i) 상기 제1 선도 면역글로불린과 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린 사이에, 및/또는
(ii) 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린이 복수의 면역글로불린인 경우, 상기 복수의 면역글로불린 사이에, 변이체 아미노산 잔기가 있는 하나 이상의 부위를 확인하는 단계로서,
상기 변이체 아미노산 잔기가 있는 하나 이상의 부위는 상기 제1 선도 면역글로불린의 변형을 위한 잠재적 부위를 포함하는 것인 단계;
d) 상기 서열 비교에 기반하여, 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린의 해당하는 변이체 아미노산으로 대체하기 위한 변형을 위한 하나 이상의 부위를 선택하는 단계; 및
e) 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 변형된, 상기 제1 선도 면역글로불린의 서열에 기반한 라이브러리에 대한 면역글로불린 서열을 생성하는 단계.
청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 공통 계통 (common lineage)을 가지며, 또한 상기 제1 선도 면역글로불린과 동일한 표적 항원에 결합하고, 바람직하게 상기 선도 면역글로불린에 대해 적어도 하나의 CDR 영역에서 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%의 상동성을 갖는 것인 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR3에서 적어도 70%의 상동성을 갖는 것인 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 항에 있어서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 상기 선도 면역글로불린에 대해 CDR1 및/또는 CDR2에서 적어도 70%의 상동성을 갖는 것인 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 항에 있어서, 상기 하나 이상의 관련된 면역글로불린은 상기 선도 면역글로불린에 대해 상기 프레임워크 영역 (framework regions)에서 적어도 70%의 상동성을 갖는 것인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 항에 있어서, 상기 복수의 관련된 면역글로불린은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개의 면역글로불린을 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 항에 있어서, 단계 c)는 상기 면역글로불린 서열의 CDRs내 변형을 위한 부위를 확인하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 CDRs내 부위는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상기 관련된 면역글로불린 내에 존재하는 변이체 아미노산 잔기가 있다면 변형을 위한 부위로 간주되는 것인 방법.
청구항 1 내지 7 중 어느 항에 있어서, 단계 c)는 상기 면역글로불린 서열의 CDRs 외부의 변형을 위한 부위를 확인하는 단계를 더 포함하고, 여기서 상기 CDRs 외부의 부위는 상기 관련된 면역글로불린의 적어도 20% 중에 존재하는 변이체 아미노산 잔기가 있다면 변형을 위한 부위로 간주되는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 변형을 위한 부위로서 확인되어질 수 있는 상기 CDRs 외부의 부위가, 상기 부위를 변형시켜서 상기 변형된 면역글로불린으로 하나 이상의 하기의 특성들의 도입을 유도할 수 있다면, 변형을 위한 부위로서 확인되지 않는 것인 방법: (i) 언페어드 시스테인 (unpaired cysteines), (ii) 산화 부위 (oxidation sites) (유리 메티오닌 (free methionines)), (iii) 글리코실화 부위 (glycosylation sites), (iv) 탈아미드화 부위 (deamidation sites), 및 (v) 이성화 부위 (isomerisation sites).
청구항 1 내지 9 중 어느 항에 있어서, 단계 d)에서 선택된 상기 서열은 변형을 위한 상기 부위에서 변형들의 각 가능한 조합을 반영하는 변이체 서열을 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 10 중 어느 항에 있어서, 변형을 위한 상기 부위에서의 변형들은 보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)만을 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 항에 있어서, 상기 변이체 면역글로불린은 변형을 위한 상기 부위 외부의 변형을 포함하지 않는 것인 방법.
청구항 1 내지 12 중 어느 항에 있어서, 단계 e)는 부가의 변이체 면역글로불린의 서열을 생성하는 단계를 더 포함하고, 여기서 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 해당하는 변이체 아미노산에 대한 보존적 아미노산 대체물로 대체하기 위해서, 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 상기 서열이 더 변형되는 것인 방법.
청구항 1 내지 13 중 어느 항에 있어서, 단계 e)는 부가의 변이체 면역글로불린의 서열을 생성하는 단계를 더 포함하고, 여기서 상기 제1 선도 면역글로불린의 아미노산을 상기 관련된 면역글로불린의 상기 해당하는 잔기에서 발견되지 않는 아미노산으로 대체하기 위해서, 변형을 위한 하나 이상의 상기 선택된 부위에서 상기 서열이 더 변형되는 것인 방법.
청구항 1 내지 14 중 어느 항에 있어서, 단계 e)에서 생성된 서열을 갖는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 라이브러리를 생성하는 단계 f)를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 원하는 생물학적 특성을 갖는 하나 이상의 면역글로불린을 확인하기 위해 상기 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하는 (screening) 단계 g)를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 16 중 어느 항에 있어서, 단계 a) 전에, 제1 선도 면역글로불린 및 하나 이상의 관련된 면역글로불린을 포함하는 복수의 면역글로불린을 생성 및 시퀀싱하는 (sequencing) 단계 (α)를 포함하는 것인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 복수의 면역글로불린이, 비-인간 포유류 (non-human mammal), 바람직하게 마우스 (mouse) 또는 래트 (rat), 바람직하게 인간의 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 마우스 또는 래트를, 표적 항원 (target antigen)으로 면역화 (immunising)시킴으로써 생성되는 것인 방법.
청구항 1 내지 18 중 어느 항에 있어서, 단계 (a) 전에, 제1 선도 면역글로불린을 확인하는 단계 (β)를 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 19 중 어느 항에 있어서, 상기 면역글로불린은 항체, 또는 항체의 항원-결합 단편인 것인 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 면역글로불린은 중쇄 유일 항체 (heavy chain only antibodies)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 면역글로불린은 항체의 V_H 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 선도 면역글로불린을 최적화하는 방법:
A) 청구항 1 내지 22 중 어느 항의 방법을 수행하는 단계; 및
B) 상기 최적화된 면역글로불린의 원하는 특성에 기반하여, 상기 라이브러리로부터 하나 이상의 최적화된 면역글로불린을 선택하는 단계.
복수의 면역글로불린을 인코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드의 라이브러리로서, 상기 복수의 면역글로불린의 서열이 청구항 1 내지 22 중 어느 항의 방법에 따라 디자인되는 것인 라이브러리.
복수의 면역글로불린을 포함하는 라이브러리로서, 상기 복수의 면역글로불린의 서열이 청구항 1 내지 22 중 어느 항의 방법에 따라 디자인되는 것인 라이브러리.
청구항 1 내지 22 중 어느 항의 방법에 따라 디자인되거나; 또는 청구항 23의 방법에 따라 선택되는 분리된 면역글로불린.
청구항 26에 따른 면역글로불린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
청구항 26에 따른 면역글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
청구항 27에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 (vector).
청구항 24에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 포함하는 복수의 벡터.
청구항 29 또는 30의 상기 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포 (host cell).
청구항 31에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계; 상기 숙주 세포가 상기 벡터 중 포함된 상기 핵산 분자에 의해서 인코딩된 면역글로불린을 발현시키도록 하는 단계; 및 상기 면역글로불린을 정제하는 단계를 포함하는, 청구항 26의 면역글로불린을 수득하는 방법.
청구항 32에 있어서, 상기 면역글로불린을 포함하는 약학적 조제 (pharmaceutical formulation)를 제조하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 26의 면역글로불린을 포함하는 키메라 폴리펩티드 (chimeric polypeptide).
부가의 모이어티 (moiety)에 콘쥬게이트된, 청구항 26의 상기 면역글로불린 또는 청구항 34의 상기 키메라 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트 (conjugate).
청구항 26의 상기 면역글로불린, 청구항 34의 상기 키메라 폴리펩티드, 또는 청구항 35의 상기 콘쥬게이트를 포함하는 약학적 조제.