KR20170083310A - 항암제 내성 진단 마커로서의 miR-30a 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물 - Google Patents

항암제 내성 진단 마커로서의 miR-30a 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암제 내성 진단 마커로서의 miR-30a 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항암제 내성 암세포에서 miR-30a의 발현이 증가하는 것을 이용하여 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유함으로써 miR-30a의 발현을 억제하거나 miR-30a와 miR-217의 결합을 방해하여 항암제에 대한 내성을 억제시키는 효과를 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 miR-30a의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 암 환자의 항암제에 대한 내성 여부에 관한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, miR-30a의 억제제를 함유하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용하면 이러한 항암제에 대한 내성을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 miR-30a의 발현을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 항암제 내성 억제제를 효과적으로 탐색할 수 있다.

Description

항암제 내성 진단 마커로서의 miR-30a 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물{miR-30a as a marker for diagnosing of anti-cancer drug resistance and composition for overcoming anti-cancer drug resistance comprising it's inhibitor}
본 발명은 항암제 내성 진단 마커로서의 miR-30a 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항암제 내성 암세포에서 miR-30a의 발현이 증가하는 것을 이용하여 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유함으로써 miR-30a의 발현을 억제하거나 miR-30a와 miR-217의 결합을 방해하여 항암제에 대한 내성을 억제시키는 효과를 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
암은 우리나라 성인의 사망 원인 중 제1위 또는 제2위를 다투는 중요한 질환으로서, 많은 연구에도 불구하고 암환자의 약 과반수 이상이 결국에는 암으로 사망하는 실정이다. 항암제 치료에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 WHO에서 제정한 기준에 따라 4가지로 분류되는데, (1) 종양이 모두 소실되고 4주 이상 지속되는 경우(완전 반응, complete response); (2) 종양의 크기가 50% 이상 감소하는 경우(부분 반응, partial response); (3) 종양의 크기가 50% 미만 감소하는 경우(불변, stable disease); 및 (4) 종양의 크기가 25% 이상 증가하는 경우(진행, progressive disease)이다[류 백렬 등, 1998, 대한혈액학회지 33: 54-64].
일반적으로 '항암제에 대한 내성' 이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 즉, 상기 WHO의 기준을 토대로 하면, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나[상기 (3)및 (4)의 경우], 초기에는 암 치료 효과가 있으나[상기 (1) 및 (2)의 경우] 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것[상기 (3) 및 (4)의 경우]을 의미한다.
항암제 치료에 대한 내성과 관련하여, 암 환자가 한 종류의 항암제에 대해서만 내성을 갖는 경우라도 그 환자의 암 세포는 다른 항암제에 대해서도 교차 내성 (cross-resistance)을 보이는 경우가 빈번한데, 이로 인해 항암제치료가 실패하는 경우가 많다. 이를 '다약제 내성(multidrug resistance)'이라고 한다[Stavrovskaya A., 2005, Biochemistry (Moscow), 65, 95-106]. 따라서 효과적인 항암제 치료를 위해서는 상기와 같은 항암제에 대한 암세포의 내성을 극복하여야 하며, 이를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성에 관련된 유전자를 우선적으로 규명할 필요가 있다.
암/정소 항원 CAGE는 위암 세포 주들과 정소조직 등에서 제작된 cDNA expression library 에 대해 SEREX(serologiacal analysis of recombiant cDNA library expression) 기법을 이용하여 위암 환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 신규 C/T 항원으로 발견되었다[Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726]. 또한 CAGE 유전자 메틸화 여부 연구를 통해 CAGE 유전자 프로모터 CpG 섬(CpG island)의 DNA 탈메틸화(DNA demethylation) 정도와 CAGE 발현의 연관성이 밝혀진 바 있다[Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63]. 이는 CAGE 유전자의 메틸화 패턴 분석을 통해 새로운 암 진단법 개발 가능성을 시사한다. CAGE 유전자의 과잉 발현이 세포 이동성을 증가시키며 ERK, p38 MAPK, FAK등의 인산화가 CAGE에 의한 세포 이동성을 증가시킨다는 것이 보고되었고[Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375], CAGE 및 CAGE 유래 펩타이드들이 세포독성 T 림프구의 활성을 증가시킨다는 것이 보고되었으며[Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515??522], Celastrol 기반 내성 쥐 흑색종 세포주에서 CAGE가 cFLIP (c-Flice inhibiory proein)과 snail 발현을 유도하여 세포 이동성 및 항암제에 대한 내성을 증가시킨다는 것이 보고되었다[Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945- 952]. 그리고 CAGE가 NF-kB / AP-1의 활성을 통하여 MMP-2의 발현을 유도한다는 것이 보고되었으며[Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763], Celastrol 기반 항암제 내성 세포주(간암 SNU387R, 흑색종 Malme3MR)에서 CAGE는 HDAC2와 상호 작용을 통해 p53의 발현을 억제함으로써 항암제에 대한 내성을 부여한다는 것이 보고되었고[Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968], CAGE는 miR-200b와 negative feedback loop(음성적 되먹임 제어)를 이루어 항암제 내성을 조절한다는 것이 보고된 바 있다[Kim Y., 2013, J. Biol. Chem., 288, 36502-36518].
최근 CAGE의 과발현이 AP-1/E2F 의존적으로 Cyclin D1/-E의 발현 유도 및 cdk2/4 활성에 영향을 미치는 것으로 보고되었으며[Por E., 2010, J. Biol. Chem., 285, 14475-14485], 췌장암 세포주에서 Cyclin D1의 과발현은 암 세포의 성장을 촉진하며 cisplatin에 의한 세포사멸에 대한 저항성을 부여하는 것으로 보고되었고[Hector B., 2005, Clin. Cancer Res., 11, 6075-6086], G1/S phase 전이의 조절자인 Cyclin D1은 proto-oncogene으로 GSK3β의 불활성화로 핵에서 세포질로의 유입이 억제되며 이때 핵 내에 축적되는 Cyclin D1은 여러 암 세포주에서 주요한 전사 인자들의 보조자로 작용한다고 보고된 바 있다[John P. A., 2006, Molecular Cancer, 5, 7-18].
본 발명에서는 항암제 저항성 암 세포주에서 발현이 증가하는 miR-30a가 항암제에 대한 내성을 유도하고 암/정소 항원인 CAGE 의존적으로 항암제 내성, 침윤성, 세포 이동성, 종양생성력, 암 전이력 등을 조절한다는 것을 규명하였다. 따라서 miR-30a는 CAGE를 과발현하는 암 환자들에 대한 항암 치료제 개발의 표적이 될 수 있고 항암제 내성 여부를 판단하는 표지자가 될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-1369336호
류 백렬 등, 1998, 대한혈액학회지 33: 54-64. Stavrovskaya A., 2005, Biochemistry (Moscow), 65, 95-106. Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726. Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63. Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375. Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515-522. Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945-952. Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763. Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968. Kim Y., 2013, J. Biol. Chem., 288, 36502-36518. Por E., 2010, J. Biol. Chem., 285, 14475-14485. Hector B., 2005, Clin. Cancer Res., 11, 6075-6086. John P. A., 2006, Molecular Cancer, 5, 7-18.
본 발명의 주된 목적은 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항암제에 대한 내성을 효과적으로 억제할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제 내성 억제제를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-30a의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다. 측정된 miR-30a의 발현수준이 대조군에 비해 높을 경우 항암제에 대한 내성을 나타낼 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 암은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 간암 및 흑색종 중에서 선택된 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 보다 효과적으로 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 검체는 miR-30a의 발현수준을 측정할 수 있는 것이라면 어떠한 생물학적 검체도 사용할 수 있다. 예를 들어, 암 환자의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 및 복수 등을 검체로 사용할 수 있으며, 이중에서도 조직이나 세포를 사용하면 보다 효과적으로 miR-30a의 발현수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, miR-30a의 발현수준은 정량적 실시간 PCR(quentitative real-time PCR)을 수행하여 측정할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며 통상의 마이크로RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다. 예를 들어, 정량적 실시간 PCR을 포함하여, 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 PCR(RT-PCR), 역전사 실시간 PCR, 노던블롯(northern blot), 질량분석법, 핵산시퀀싱 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 항암제는 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 셀라스트롤, 택솔 및 트라스투주맵 중에서 선택된 항암제에 대한 내성 진단에 필요한 정보를 보다 효과적으로 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 억제제는 miR-30a의 발현을 억제하는 발현억제제, 또는 miR-30a에 결합하여 miR-30a가 기능하지 못하게 하는 작용억제제일 수 있다. 이러한 억제제에는 miR-30a에 대한 안타고미르(antagomir), 안티센스 올리고뉴클레오티드(anti-sense oligonucleotide), miR-30a에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 발현하는 벡터, RNA 억제 분자(inhibitory RNA molecule) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 안타고미르 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-30a의 서열에 상보적인 서열을 포함하여 이루어짐으로써 miR-30a에 상보적으로 결합하여 miR-30a의 작용을 억제할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1, 2 또는 3에 상보적인 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한 상기 안타고미르 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA, DNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 DNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 항암제는 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 셀라스트롤, 택솔 및 트라스투주맵 중에서 선택된 항암제에 대한 내성을 억제하는데 효과적이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) miR-30a를 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-30a의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. miR-30a의 발현수준을 감소시키는 피검화합물은 항암제에 대한 내성을 억제할 수 있는 효과가 있을 가능성이 높고, 따라서 새로운 항암제 내성 억제제로 개발될 가능성이 높다.
miR-30a(마이크로RNA-30a, microRNA-30a, miRNA-30a)는 서열번호 1의 pre-miRNA 서열(스템-루프 서열, stem-loop sequence)을 갖는 작은 크기의 RNA 분자로, 마이크로RNA 데이터베이스인 miRBase(http://www.mirbase.org) 등을 통해 잘 알려져 있다. miR-30a-3p와 miR-30a-5p의 두 가지 성숙한 형태가 존재하며, 이들의 서열은 각각 서열번호 2 및 3과 같다.
본 발명자들은 이러한 miR-30a가 암세포의 항암제에 대한 내성에 관여한다는 것을 연구를 통해 확인하였다. 본 발명은 이러한 연구결과에 따른 것으로, 연구결과를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
1) 항암제에 내성을 보이는 암 세포주에서 miR-30a의 발현수준이 증가한다.
2) 암/정소 항원 CAGE의 발현을 감소시키는 miR-217에 의해 miR-30a의 발현수준이 감소한다.
3) miR-30a는 miR-217의 발현수준을 음성적으로 조절한다.
4) 항암제 민감성 암 세포주에서 miR-30a의 과발현은 항암제에 대한 저항성을 유도한다.
5) 항암제 민감성 암 세포주에서 miR-30a의 과발현은 암/정소 항원 CAGE의 발현을 증가시킨다.
6) 항암제 민감성 암 세포주에서 miR-30a의 과발현은 항암제에 의한 세포괴사(apoptosis)를 억제한다.
7) miR-30a는 암 세포주의 침윤(invasion), 이동성(migration)을 증가시킨다.
8) miR-30a는 암 세포주의 침윤 혈관신생능력(angiogenic potential)을 증가시킨다.
9) miR-30a는 CAGE를 표적으로 하여 항암제 내성, 세포 괴사를 조절한다.
10) miR-30a는 CAGE를 표적으로 하여 암 세포주의 종양생성력, 암 전이력을 조절한다.
11) miR-30a는 암 세포주에서 CAGE의 발현을 증가시키고 암 억제 유전자인 p53의 발현수준을 감소시킨다.
12) 암 세포주에서 p53은 miR-30a 유전자의 프로모터에 결합하여 miR-30a의 발현을 직접적으로 감소시킨다.
13) 항암제 내성 암 세포주에서 CAGE는 miR-30a 유전자의 프로모터에 결합하여 miR-30a의 발현을 증가시킨다.
본 발명에 따른 miR-30a의 억제제는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.
miR-30a의 억제제는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있다. 그리고 miR-30a의 억제제 및 이들의 염 형태를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있다. 예를 들어 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명에 따르면 miR-30a의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 암 환자의 항암제에 대한 내성 여부에 관한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, miR-30a의 억제제를 함유하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용하면 이러한 항암제에 대한 내성을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 miR-30a의 발현을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 항암제 내성 억제제를 효과적으로 탐색할 수 있다.
도 1A 는 miR-30a의 발현수준이 Malme3MR 세포주에서 증가하고 miR-217에 의해 miR-30a 발현수준이 감소됨을 나타낸 것이다.
도 1B는 기지의 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 방법을 이용하여 도1A에 나타난 결과들을 입증한 것이다.
도 1C는 miR-30a가 miR-217의 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 1D는 miR-30a가 miR-217의 발현을 감소시킴을 luciferase 활성분석을 통해 나타낸 것이다.
도 1E는 miR-30a가 Malme3M 세포주에서 CAGE 발현을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 1F는 MalmeM 세포주에 항암제인 택솔을 농도별로 처리할 경우 miR-30a의 발현이 증가함을 기지의 qRT-PCR을 통해 나타낸 것이다.
도 2A는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimc 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 대한 저항성이 유도됨을 기지의 MTT 분석법을 통해 나타낸 것이다.
도 2B는 miR-30a(miR-30a mimc 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의해 증가하는 Caspase-3 활성증가가 억제됨을 나타낸 것이다.
도 2C는 miR-30a(miR-30a mimc 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의해 증가하는 PARP cleavage가 억제됨을 나타낸 것이다.
도 2D는 miR-30a(miR-30a mimic)를 과발현하는 경우 Malme3M 세포주의 침윤성(invasion)을 증가시킴을 기지의 chemoinvasion 분석법을 통해 나타낸 것이다.
도 2E는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimic)를 과발현하는 경우 세포 이동성(migration)을 증가시킴을 기지의 wound migration 분석법을 통해 나타낸 것이다.
도 2F는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 혈관 신생력을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 3A는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 대한 저항성을 유도하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 항암제 저항성 유도 효과를 억제함을 나타낸 것이다.
도 3B는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주에서 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의한 PARP cleavage 유도를 억제하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 나타낸 것이다.
도 3C는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주에서 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의한 Caspase-3 활성 증가 유도를 억제하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 Caspase-3 활성 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 3D는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 침윤성(invasion)을 증가시키고 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 나타낸 것이며, miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 이동성(migration)을 증가시키고 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 wound migration 분석법을 통해 나타낸 것이다.
도 3E는 miR-30a의 과발현은 Malme3M 세포주의 혈관 신생력을 증가시키고 이는 CAGE에 의존적임을 기지의 intravital microscopy 분석법을 이용하여 나타낸 것이다.
도 4A는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 종양생성력을 증가시킴을 입증한 것이다.
도 4B는 종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시키고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 miR-30a 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 4C는 종양조직을 이용한 면역화학염색 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시키고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 4D는 miR-30a mimic이 Malme3M 세포주의 암 전이력을 증가시키고 이는 CAGE 의존적으로 일어남을 nude mice를 이용하여 입증한 것이다.
도 4E는 종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시키고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 miR-30a 발현을 감소시키며, 종양조직을 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시키고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 4F는 종양조직을 이용한 면역화학염색 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시키고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 5A는 Malme3MR 세포주에서 암 억제유전자인 p53의 발현이 감소됨을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다.
도 5B는 Malme3M 세포주에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시키고 p53의 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 5C는 Malme3M 세포주에서 miR-30a의 과발현이 p53 발현을 억제함을 기지의 luciferase 활성 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 5D는 Malme3MR 세포주에서 CAGE가 miR-30a 프로모터에 결합함을 기지의 크로마틴면력 침강(chromatin immunoprecipitation)법을 이용하여 나타낸 것이다.
도 5E는 Malme3M 세포주에서 p53이 CAGE 프로모터에 결합함을 기지의 크로마틴면력 침강(chromatin immunoprecipitation)법을 이용하여 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< 용어설명 >
Malme3M 세포주 : 셀라스트롤, 택솔 등의 항암제에 민감성을 보이는 인간 흑색종 세포주
Malme3MR 세포주 : 셀라스트롤, 택솔 등의 항암제에 저항성을 보이는 인간 흑색종 세포주
CAGE(cancer associated gene, DDX53) : 암/정소 항원의 일종으로서 항암제 내성을 유도
세포 괴사(apoptosis) : 에너지를 필요로 하는 세포사멸의 일종으로서 PARP cleavage, caspase-3 활성 증가 등을 수반
수동적 면역(passive immunity) : 이미 생성된 항체를 이용하는 면역의 일종
MTT : 세포 생장 정도를 측정하는 방법
qRT-PCR(quantitative real time PCR) : PCR 방법의 일종으로서 RNA 발현 수준을 실시간으로 측정
웨스턴 블롯 : 항체를 이용하여 단백질 발현수준을 측정하는 방법
면역침강(immunoprecipitation) : 항체를 이용하여 단백질간의 결합을 측정하는 방법
크로마틴면역침강(chromatin immunoprecipitation) : 표적유전자의 프로모터에 특정 단백질이 결합하는 지의 여부를 알아보는 방법으로서 immunoprecipitation과 PCR이 결합된 방법
Caspase-3 : 효소의 일종으로서 세포괴사에 따라 그 활성이 증가
p53 : 암 억제 유전자
UTR : 유전자의 영역으로서 유전자의 5'혹은 3' 말단에 위치하며 발현되지 않는 부위
PCR(poymerase chain reaction) : DNA 증폭 방법
Negative feedback loop(음성적 되먹임 제어 고리) : 두 개의 서로 다른 유전자가 서로의 발현을 음성적으로 조절
miR-217 : 마이크로 RNA의 일종으로서 암/정소 항원 CAGE의 발현을 음성적으로 조절
miRNA mimic : 마이크로 RNA 염기서열의 일부로서 해당 마이크로 RNA의 발현을 증가시킴
SiRNA(small interfering RNA) : 작은 크기의 RNA로서 표적 RNA에 100% 결합하여 단백질 발현을 억제
Scrambled RNA : siRNA의 일종으로서 단백질 발현 억제 기능이 없음
Intravital microscopy : 혈관 신생정도를 알아보는 방법으로서 FITC(fluorescein isothiocyanate-dextran)를 쥐의 꼬리 정맥에 주사함
실시예 1. miR-30a에 의한 CAGE, miR-217 발현 수준 조절
miR-30a가 암/정소 항원 CAGE와 이것의 발현을 억제하는 miR-217의 발현수준에 수준에 미치는 영향을 조사하였다.
도 1A는 miR-30a의 발현수준이 Malme3MR 세포주에서 증가하고 miR-217에 의해 miR-30a 발현수준이 감소됨을 나타낸다. 본 실험에서는 마이크로 RNA 어레이 기법을 사용하여 miR-30a의 발현이 Malme3MR 세포주에서 Malme3M 세포주보다 높음을 입증하였다. 도 1A에서의 Malme3MR-miR-217 세포주는 miR-217을 안정적으로 과발현 하는 Malme3MR 세포주이다. 도 1B는 기지의 quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 방법을 이용하여 도 1A에 나타난 결과들을 입증한 것이다. 도 1B에서는 miR-30a의 발현이 Malme3MR 세포주에서 Malme3M 세포주보다 높음을 나타낸다. 도 1C는 miR-30a 가 miR-217의 발현을 감소시킴을 기지의 transfection에 이은 qRT-PCR 분석을 통해 나타낸 것이다. 도 1C에서는 miR-30a 벡터(1㎍)를 항암제 민감성 세포주인 Malme3M 세포주에 기지의 방법에 따라 transfection한 결과 miR-217의 발현 수준이 감소함을 나타낸 것이다. 도 1D는 miR-30a가 miR-217의 발현을 감소시킴을 tranfection에 이은 luciferase 활성분석을 통해 나타낸 것이다. 도 1D에서 pGL3-miR-217이라 함은 miR-217의 3'-UTR(untranslated region)이 luciferase에 연결된 벡터를 나타낸다. Transfection에 이용된 벡터(miR-30, pGL3-miR-217 등)의 양은 1㎍이다. Luciferase 활성 분석은 transfection 48시간 후에 수행하였다. 도 1E는 miR-30a가 Malme3M 세포주에서 CAGE 발현을 증가시킴을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다. 도 1E에서는 전술한 miR-30a 벡터 1㎍을 Malme3M 세포주에 기지의 방법에 따라 transfection하고 48시간 후에 웨스턴 블롯을 수행한 것이다. 도 1F는 MalmeM 세포주에 항암제인 택솔을 농도별로 처리할 때 miR-30a의 발현이 증가함을 기지의 qRT-PCR을 통해 보여준 것이다. 이는 miR-30a의 과발현이 택솔에 대한 저항성을 유도함을 의미한다.
실시예 2. miR-30a에 의한 항암제 내성, 침윤, 세포 이동성, 혈관 신생능력 조절
도 2A는 항암제 민감성 세포주인 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimic 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 대한 저항성이 유도됨을 기지의 MTT 분석법을 통해 나타낸 것이다. miR-30a mimic은 표적인 miR-217에 결합하는 염기서열들을 포함하며 10nM 농도로 전술한 세포주에 transfection하였다. miR-30a 발현 벡터는 1㎍의 농도로 transfection하였다. 도 2B는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimc 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의해 증가하는 Caspase-3 활성증가가 억제됨을 기지의 Caspase-3 활성 분석을 동해 나타낸 것이다. Caspase-3 활성 분석은 기지의 키트를 사용하여 수행하였으며 광학밀도를 측정함으로써 caspase-3의 기질인 펩티드의 cleavage 정도를 측정하였다. 광학밀도 측정은 기존의 스펙트로포토미터를 통해 수행하였다. 도 2C는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimc 혹은 miR-30a 발현 벡터 사용)를 과발현할 경우 항암제인 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의해 증가하는 PARP cleavage가 억제됨을 기지의 웨스턴 블롯 분석을 동해 나타낸 것이다. miR-30a mimic은 10nM, miR-30a 벡터는 1㎍의 농도로 24시간 동안 transfection하였다. 택솔은 1μM, 트라스투주맵은 10㎍/㎖의 농도로 24시간 처리하였다. 웨스턴 블롯은 상기 항암제 처리 24시간 후 기지의 방법에 따라 수행하였다. 도 2D는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimic)를 과발현하는 경우 세포 침윤성(invasion)을 증가시킴을 transwell을 이용하는 기지의 chemoinvasion 분석법을 통해 나타낸 것이다. miR-30a mimic은 10nM 농도로 Malme3M 세포주에 transfection하고 기지의 방법에 따라 키트(CoSTAR, Acton, MA)를 사용하여 수행하였다. 도 2E는 Malme3M 세포주에 miR-30a(miR-30a mimic)를 과발현하는 경우 세포 이동성(migration)을 증가시킴을 기지의 wound migration 분석법을 통해 나타낸 것이다. Wound migration 분석은 miR-30a mimic(10nM)을 transfection하고 48시간 후에 수행하였다. 도 2F는 공 벡터(miR-30a를 포함하지 않는 벡터) 혹은 miR-30a 벡터를 Malme3M 세포주에 transfection한 후 수득한 조건 배지를 기지의 방법에 따라 BALB/C 쥐에 처리하여 혈관 신생력을 관찰한 것으로 miR-30a의 과발현은 Malme3M 세포주의 혈관 신생력을 증가시킴을 나타낸 것이다. 공 벡터와 miR-30a 벡터는 1㎍의 농도로 transfection하였다. 조건 배지는 전술한 벡터를 transfection하고 48시간 후에 수득하였다. 혈관신생력은 기지의 intravital microscopy를 이용하여 결정하였다. Intravital microscopy는 FITC(fluorescein isothiocyanate; 녹색형광물질)-dextran을 쥐의 꼬리 정맥에 주사하여 형광의 세기 정도를 통해 혈관 신생 정도를 정량화하는 방법으로서 널리 이용되고 있는 방법의 하나이며 관련 논문들에서 상세히 언급되어 있다.
실시예 3. miR-30a는 CAGE를 표적으로 하여 항암제 내성과 혈관신생능력을 조절
도 3A는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 대한 저항성을 유도하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 항암제 저항성 유도 효과를 억제함을 나타냄을 기지의 MTT 분석법을 통해 보여주는 것이다. miR-30a의 과발현을 위해 miR-30a mimic(10nM)을 Malme3M 세포주에 transfection하고 24시간 후에 택솔과 트라스투주맵은 다양한 농도로 24시간 처리하였다. 상기 항암제를 24시간 동안 처리한 후 기지의 MTT 분석법을 수행하였다. 도 3B는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주에서 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의한 PARP cleavage 유도를 억제하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다. Malme3M 세포주에 control mimic(10nM), miR-30 mimic(10nM), scrambled siRNA(10nM), SiCAGE(10nM) 등을 다양한 조합으로 하여 transfection하고 24시간 후에 taxol(1μM), 트라스투주맵(10㎍/㎖)을 처리하고 24시간 후에 기지의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 3C는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주에서 트라스투주맵(trastuzumab)과 택솔에 의한 Caspase-3 활성 증가 유도를 억제하며 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 Caspase-3 활성 분석을 통해 나타낸 것이다. 도 3C는 도 3B와 동일한 조건에서 실험을 수행하였다. 도 3D는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 침윤성(invasion)을 증가시키고 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 chemoinvasion 분석법을 통해 나타낸 것이다. Malme3M 세포주에 control mimic(10nM), miR-30a mimic(10nM), scrambled siRNA(10nM), SiCAGE(10nM)등을 적절한 조합으로 transfection하였다. 48시간 후에 기지의 방법에 따라 invasion(침윤) 분석을 수행히였다. 도 3D는 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 이동성(migration)을 증가시키고 RNA 간섭(siRNA)에 의한 CAGE 발현 감소는 miR-30a의 이러한 효과를 억제함을 기지의 wound migration 분석법을 통해 나타낸 것이다. Invasion 분석과 동일한 조건으로 수행하였다. 도 3E는 miR-30a mimic을 Malme3M 세포 주에 transfection한 후 수득한 조건 배지를 기지의 방법에 따라 BALB/C 쥐에 처리하여 혈관 신생력을 관찰한 것으로 miR-30a의 과발현은 Malme3M 세포주의 혈관 신생력을 증가시킴을 나타내고 이는 CAGE에 의존적임을 기지의 intravital microscopy 분석법을 이용하여 나타낸 것이다. Malme3M 세포주에 miR-30 mimic을 10nM 농도로 transfection하고 48 시간 후에 조건 배지를 수득하였다.
실시예 4. miR-30a는 CAGE를 표적으로하여 종양생성력과 암 전이력을 조절
도 4A는 miR-30a mimic에 의한 miR-30a의 과발현이 Malme3M 세포주의 종양생성력을 증가시킴을 기지의 방법에 따라 nude mice를 이용하여 입증한 것이다. 도 4A는 miR-30a mimic에 의한 Malme3M 세포주의 종양 생성력 증가가 CAGE 의존적으로 일어남을 나타낸다. 106개의 Malme3M 세포주를 nude mouse의 측복부에 주사하고 mimic(50μM/kg)과 siRNA(50μM/kg)은 정맥 주사하였다. mimic과 siRNA는 실험기간(28일) 중 4회 정맥 주사하였다. 종양 volume은 기지의 공식을 이용하여 digital gauge로 측정하였다. 도 4B는 종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 miR-30a 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 도 4B는 종양조직을 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1(multi drug resistance 1) 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 종양조직에서의 단백질 추출은 기지의 방법에 따라 액체 질소를 이용하여 추출하였다. 웨스턴 블롯 수행 시 각 레인에 넣는 단백질의 양은 20㎍으로 하였고 액틴(actin)의 발현 양으로 관련 단백질들의 양을 비교하였다. MDR1은 항암제 내성의 표지 단백질로서 항암제 내성과 더불어 그 발현이 증가한다. 도 4C는 종양조직을 이용한 면역화학염색 분석(immunohistochemistry)에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 면역조직화학 염색은 Vecta stain ABC Elite 키트(Vector Laboratories)을 사용하여 수행하였다. 염색에 사용한 종양조직은 xylene 을 통해 파라핀(paraffine)을 제거하였고 내생적인 퍼옥시다제(peroxidase) 활성은 과산화수소(H2O2)를 통해 차단하였다. CAGE 항체와 MDR1 항체는 1:100의 비율로 희석하여 염색을 수행하였다. 종양조직은 4㎛ 두께로 하여 염색을 수행하였다. 조직에서의 핵 염색을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)이 사용되었다. 도 4D는 miR-30a mimic이 Malme3M 세포주의 암 전이력을 증가시키고 이는 CAGE 의존적으로 일어남을 nude mice를 이용하여 입증한 것이다. 폐로의 암 전이는 Malme3M 세포주를 nude mice의 꼬리정맥에 주사함으로써 이루어졌다. 106개의 Malme3M 세포주는 nude mice의 꼬리정맥으로 주사되었고 miR-30a mimic(50μM/kg)과 siRNA(50μM/kg)는 21일의 실험기간 중에 6회 꼬리정맥으로 주사되었다. 폐로의 암 전이 정도를 측정하기 위하여 폐 조직을 PBS 완충용액으로 세척하고 Bouin 용액으로 고정하고 염색함으로써 암전이력을 측정하였다. 도 4E는 종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 miR-30a 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 도 4E는 종양조직을 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 도 4F는 종양조직을 이용한 면역조직화학염색(immunohistochemistry) 분석에서 miR-30a mimic이 CAGE, MDR1 발현을 증가시킴을 나타낸 것이고 RNA 간섭에 따른 CAGE 발현 감소는 MDR1 발현을 감소시킴을 나타낸 것이다. 면역조직화학 염색은 Vecta stain ABC Elite 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 수행하였다. 염색에 사용한 종양조직은 xylene을 통해 파라핀(paraffine)을 제거하였고 내생적인 퍼옥시다제(peroxidase) 활성은 과산화수소(H2O2)를 통해 차단하였다. CAGE 항체와 MDR1 항체는 1:100의 비율로 희석하여 염색을 수행하였다. 종양조직은 4㎛ 두께로 하여 염색을 수행하였다. 조직에서의 핵 염색을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하였다.
실시예 5. miR-30a와 p53은 음성적으로 상호 발현을 조절
도 5A는 항암제 저항성 세포주인 Malme3MR 세포주에서 암 억제유전자인 p53의 발현이 감소됨을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다. 각 레인에 넣은 단백질의 양은 20㎍이다. Malme3MR 세포주는 항암제인 셀라스트롤에 저항성을 갖도록 유도된 흑색종(melanoma) 세포주로서 다양한 항암제들에 대한 저항성을 보임을 이전 연구를 통해 확인한 바 있다. 도 5B는 Malme3M 세포주에서 miR-30a mimic이 CAGE 발현을 증가시티고 p53의 발현을 감소시킴을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다. Control mimic과 miR-30a mimic은 10nM 농도로 Malme3M 세포주에 transfection하였고 48시간 후에 기지의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 5C는 Malme3M 세포주에서 miR-30a의 과발현이 p53 발현을 억제함을 기지의 luciferase 활성 분석을 통해 나타낸 것이다. miR-30a 벡터(vector)는 1㎍, miR-30a mimic은 10nM의 농도로 Malme3M 세포주에 transfection하였다. Luciferase 활성은 키트(Promega)를 사용하여 수행하였다. pGL3-p53 3'-UTR은 p53 3'-UTR(untranslated region)이 luciferase(pGL3) 벡터에 연결된 construct로서 pGL3-p53 3'-UTR은 miR-30a의 결합 부위가 존재한다. 도 5D는 Malme3M 세포주에서 p53이 miR-30a 프로모터에 결합함을 기지의 크로마틴면역 침강(chromatin immunoprecipitation)법을 이용하여 나타낸 것이다. 도 5D는 Malme3MR 세포주에서 CAGE가 miR-30a 프로모터에 결합함을 기지의 크로마틴면력 침강(chromatin immunoprecipitation)법을 이용하여 나타낸 것이다. ChIP assay 수행에 사용된 miR-30a 프로모터의 프라이머 염기서열은 다음과 같다.
miR-30a promoter-1 서열[5'- AAAAATATCCGCCATAAGAAAAAT -3'(sense), 5'- CTGTTTCCATTTGGTTGAACTT -3'(antisense)], miR-30a promoter-2 서열[5'- TGAAACTGCAGAAAGGGCAG -3'(sense), 5'- TTTAGAGGGCTTCAGCAGGG -3'(antisense)].
도 5E는 Malme3M 세포주에서 p53이 CAGE 프로모터에 결합함을 기지의 크로마틴면력 침강(chromatin immunoprecipitation)법을 이용하여 나타낸 것이다. ChIP assay 수행에 사용된 CAGE 프로모터의 프라이머 염기서열은 다음과 같다.
CAGE promoter-1 서열[5'- CCTGACAAAGTACTGTATTCACTCCA -3'(sense), 5'- TGGCTCAGCTTGAGAGCAAC -3'(antisense)], CAGE promoter-2 서열[5'- CGCAGAAGTTAAGGAGGCAG -3'(sense), 5'- AAGTTGCCCCAGAAACCAGT -3'(antisense)], CAGE promoter-3 sequences[5'- ATGTGACTAGCACCCGGAAA -3'(sense), 5'- GGGATAGTGGGAGTATCGGC -3'(antisense)].
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> miR-30a as a marker for diagnosing of anti-cancer drug resistance and composition for overcoming anti-cancer drug resistance comprising it's inhibitor <130> PA-D15315 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcgacuguaa acauccucga cuggaagcug ugaagccaca gaugggcuuu cagucggaug 60 uuugcagcug c 71 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 cuuucagucg gauguuugca gc 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uguaaacauc cucgacugga ag 22

Claims (11)

  1. 암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-30a의 발현수준을 측정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 간암 및 흑색종 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 검체는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 및 복수 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 측정은 miR-30a에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항암제는 셀라스트롤, 택솔 및 트라스투주맵 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. miR-30a의 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 억제제는 안타고미르(antagomir), 안티센스 올리고뉴클레오티드(anti-sense oligonucleotide) 및 RNA 억제 분자(inhibitory RNA molecule) 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 안타고미르 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는
    miR-30a의 서열에 상보적인 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 안타고미르 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는
    서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택된 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 항암제는 셀라스트롤, 택솔 및 트라스투주맵 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. a) miR-30a를 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    b) 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-30a의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    c) 대조군과 비교하여 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제제 스크리닝 방법.
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