KR20170065510A - 폴리페놀의 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 출발 재료로부터 폴리페놀이 부화된 분획을 제공하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은, (i) 출발 재료를 수성 용매 중에 가용화하는 단계; (ii) pH를 pH 3 미만(바람직하게는 약 pH 1)으로 조절하는 단계; (iii) 출발 재료를 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계; (iv) 크로마토그래피 수지로부터 폴리페놀을 탈착시켜 폴리페놀을 포함하는 용출액을 제공하는 단계; (v) 용출액의 pH를 pH 3.5 초과(바람직하게는 pH 4)로 조절하는 단계; 및 (vi) 용출된 폴리페놀로부터 용출액을 분리시켜 폴리페놀이 부화된 분획을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 그러한 폴리페놀 부화된 분획을 포함하는 제품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 출발 재료로부터의 폴리페놀의 정제를 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물 재료로부터 수득 가능한 폴리페놀, 특히 클로로겐산(CGA)이 부화된(enriched) 분획에 관한 것으로서, 부화된 분획의 이성질체 밸런스는 출발 재료와 비교하여 실질적으로 유지된다.
커피와 같은 음료의 중요한 특성은 "크레마(crema)"라고도 지칭되는 지속적인 거품 및 강한 향기(intense aroma)인데, 이들은 중요한 품질 기준으로 간주된다. 크레마의 양, 질감, 피네스(finesse), 색상 및 안정성은 소비자에게 매력적인 독특한 특성이다. 크레마는 표면 활성 커피 성분의 추출로부터 생성되는데, 표면 활성 커피 성분은 탬핑된(tamped) 에스프레소 커피 매트릭스를 가압 온수로 블라스팅함으로써 생성되는 기포를 코팅하고 안정화시킨다.
커피 향기는, 커피 향기의 세기가 소비자를 충족시키는 최초의 감각적 경험이기 때문에 또한 중요한 특성이다. 커피 냄새를 맡을 때, 향기는 커피 향미 및 커피의 산뜻함(brightness)을 평가하는 데 도움이 될 수 있다. 로스팅 동안, 커피 콩 매트릭스로부터 많은 방향족 화합물이 형성되거나 유리되고 커피의 경험(향기 및 향미)에 영향을 미친다. 방향족 화합물의 가장 중요한 전구체 중 하나는 클로로겐산, 특히 카페오일 퀸산이다.
따라서, 많은 상이한 종류의 식물 재료, 예컨대, 장과류, 포도, 감귤류, 채소류, 곡류, 초류, 차, 커피, 코코아로부터 폴리페놀 부화된 분획을 단리시키는 것에 관심이 있어 왔다. 특히, 식품 및 음료 제품에, 예컨대 향기 및 향미를 섞기 위하여, 원래의 식물 재료와 유사한 클로로겐산 화합물의 이성질체 밸런스를 갖고 클로로겐산 화합물이 부화된 폴리페놀 분획을 단리시키는 것에 관심이 있어 왔다.
또한, 폴리페놀은 항미생물, 항바이러스, 항돌연변이원, 항발암, 항증식 및 혈관 확장 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다. 폴리페놀은 스트렙토콕쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)에 의해 야기되는 충치의 퇴치에 유용할 수 있는 항세균 활성을 가질 수 있다. 폴리페놀은 인지, 기억, 지능, 동기 부여, 주의 및 집중과 같은 정신 기능을 개선시키는 것으로 알려진 항정신제(nootropic)로서 열거되어 있다.
그러나, 식품 관련법에서 건강기능표시(health claim)에 대한 규칙을 강화함으로써, 활성 성분의 일관된 수준을 보장하는 것뿐만 아니라 제조된 제품에서 획득된 과학적 증거를 언급하는 것이 의무화된다.
따라서, 폴리페놀 부화된 분획, 특히 클로로겐산(CGA)을 포함하며, 클로로겐산 밸런스가 식물 재료에 원래 존재하는 클로로겐산 밸런스와 유사한 폴리페놀 부화된 분획을 제공하는 방법이 필요하다. 후속하여, 부화된 분획은 식품 제품의 활성 성분의 일정한 수준을 보장하는 데 사용될 뿐만 아니라, 예컨대 커피로부터의 폴리페놀의 섭취와 주어진 주장된 효과 사이의 인과관계를 증명하기 위한 중재 연구에서도 사용될 수 있다.
따라서, 업계에서는, 식품 제품 또는 음료의 특성을 향상시키는 데 사용될 수 있는, 기원이 되는 식물 재료와 가장 유사한(authentic) 특성을 갖는 폴리페놀, 특히 클로로겐산이 부화된 분획을 제공하기 위한 방법을 제공할 필요가 있다.
따라서, 본 발명은 폴리페놀 밸런스가 유지되거나 실질적으로 유지되는 폴리페놀의 정제를 위한 신규한 방법을 설명한다. 또한, 본 발명의 방법은, 공정 동안 형성되는 유도체, 예컨대, 폴리페놀의 에틸에스테르가 제한적으로 형성되거나 또는 전혀 형성되지 않도록 할 수 있다. 에틸에스테르는, 식물 재료에서 자연적으로 발생하는 천연 폴리페놀과 동일한 특성을 갖지 않기 때문에 바람직하지 않다. 추가적으로, 에틸에스테르는 원래 생성물에 대해 부화된 분획의 폴리페놀 밸런스를 변화시킨다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 출발 재료로부터 폴리페놀이 부화된 분획을 제공하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은,
(i)
출발 재료를 수성 용매 중에 가용화하는 단계;
(ii)
pH를 pH 3 미만으로 조절하는 단계;
(iii)
출발 재료를 크로마토그래피 수지(chromatographic resin)와 접촉시키는 단계;
(iv)
크로마토그래피 수지로부터 폴리페놀을 탈착시켜 폴리페놀을 포함하는 용출액(eluate)을 제공하는 단계;
(v)
용출액의 pH를 pH 3.5 초과로 조절하는 단계; 및
(vi)
용출된 폴리페놀로부터 용출액을 분리시켜 폴리페놀이 부화된 분획을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득 가능한 폴리페놀이 부화된 분획에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획을 포함하는 식품 성분을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 본 발명에 따른 식품 성분을 포함하는 식품 제품을 제공하는 것이다.
추가 태양은 향기, 향미 및/또는 거품을 발생시키기 위한 전구체로서의 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 본 발명에 따른 식품 성분의 용도에 관한 것이다.
또 다른 태양은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 폴리페놀의 비제한적 예를 도시한다. 도면에서의 (*) 표시는 R1의 연결점을 나타낸다.
도 2는 CQA, FQA, diCQA 및 카페인에 대한 90% 에탄올을 이용한 탈착 속도론을 도시한다.
도 3은 실험실 규모(labscale)에서의 본 발명에 따른 정제 공정에 관한 특정 실시 형태를 도시한다.
도 4는 초기 커피와 비교하여 폴리페놀 부화된 그린(green) 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 5는 초기 커피와 비교하여 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 CGA 조성을 도시한다.
도 6은 pH 1, 2, 7.4 및 12에서 2시간 후에 75% 에탄올에서의 5-CQA의 분해를 도시한다.
도 7은 t=RT, 50℃ 및 80℃에서의 5-CQA의 그의 에틸에스테르로의 변환을 도시한다.
도 8은 (a) 50℃에서 3시간 내에서의 그리고 (b) RT에서 36시간 내에서의 5-CQA 에스테르의 형성을 도시한다.
도 9는 제조 규모에 대한 개선된 정제 프로토콜을 도시한다.
도 10은 임상 연구를 위해 초기 커피와 비교하여 카페인이 제거된(decaffeinated) 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 11은 초기 커피와 비교하여 부화된 카페인이 제거된 분획의 상세한 CGA 조성을 도시한다.
도 12는 임상 연구를 위해 초기 커피와 비교하여 카페인이 함유된(caffeinated) 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 13은 초기 커피와 비교하여 부화된 카페인이 함유된 분획의 상세한 CGA 조성을 도시한다.
도 14는 탈착 혼합물에서의 증가하는 에탄올 비 (1) 20%, (2) 50% (3) 80%에 의한 연속 탈착 단계를 이용한 클로로겐산에 대한 정제 프로토콜을 도시한다.
도 15는 초기 커피, 및 에탄올 구배(gradient) 탈착에 의해 수득되는 3개의 분획에서의 CGA의 상대 조성을 도시한다.
도 16은 3개의 상이한 에탄올 구배 탈착 분획의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
이제, 하기에서 본 발명이 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 2는 CQA, FQA, diCQA 및 카페인에 대한 90% 에탄올을 이용한 탈착 속도론을 도시한다.
도 3은 실험실 규모(labscale)에서의 본 발명에 따른 정제 공정에 관한 특정 실시 형태를 도시한다.
도 4는 초기 커피와 비교하여 폴리페놀 부화된 그린(green) 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 5는 초기 커피와 비교하여 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 CGA 조성을 도시한다.
도 6은 pH 1, 2, 7.4 및 12에서 2시간 후에 75% 에탄올에서의 5-CQA의 분해를 도시한다.
도 7은 t=RT, 50℃ 및 80℃에서의 5-CQA의 그의 에틸에스테르로의 변환을 도시한다.
도 8은 (a) 50℃에서 3시간 내에서의 그리고 (b) RT에서 36시간 내에서의 5-CQA 에스테르의 형성을 도시한다.
도 9는 제조 규모에 대한 개선된 정제 프로토콜을 도시한다.
도 10은 임상 연구를 위해 초기 커피와 비교하여 카페인이 제거된(decaffeinated) 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 11은 초기 커피와 비교하여 부화된 카페인이 제거된 분획의 상세한 CGA 조성을 도시한다.
도 12는 임상 연구를 위해 초기 커피와 비교하여 카페인이 함유된(caffeinated) 폴리페놀 부화된 그린 커피 분획의 전체 조성을 도시한다.
도 13은 초기 커피와 비교하여 부화된 카페인이 함유된 분획의 상세한 CGA 조성을 도시한다.
도 14는 탈착 혼합물에서의 증가하는 에탄올 비 (1) 20%, (2) 50% (3) 80%에 의한 연속 탈착 단계를 이용한 클로로겐산에 대한 정제 프로토콜을 도시한다.
도 15는 초기 커피, 및 에탄올 구배(gradient) 탈착에 의해 수득되는 3개의 분획에서의 CGA의 상대 조성을 도시한다.
도 16은 3개의 상이한 에탄올 구배 탈착 분획의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
이제, 하기에서 본 발명이 보다 상세하게 설명될 것이다.
본 발명은 크로마토그래피 수지를 사용하여 폴리페놀이 부화된 분획을 제공하기 위한 신규한 방법을 설명한다. 본 발명으로부터 수득되는 부화된 분획은 개선된 특성, 특히 향기, 향미 및 거품 특성을 제공할 수 있는데, 이는 부화된 분획에 존재하는 (클로로겐산 화합물과 같은) 폴리페놀의 이성질체 밸런스가 실질적으로 유지되고 식물 재료에 원래 존재하는 (클로로겐산 화합물과 같은) 폴리페놀의 이성질체 밸런스와 유사하기 때문이다. 또한, 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획을 제공하기 위한 방법은 또한 고순도 및/또는 양호한 특성(제품 성능)을 갖는 부화된 분획을 제공한다.
본 발명의 실시 형태에서, 부화된 분획은 클로로겐산 화합물의 함량이 적어도 40%(w/w), 예컨대 적어도 50%(w/w), 예컨대 적어도 60%(w/w), 예컨대 적어도 70%(w/w)이다.
제시된 방법은 다른 정제 공정과 비교하여 여러 이점들을 가질 수 있다. 본 발명의 하나의 이점은, 부화된 분획의 폴리페놀, 특히 클로로겐산 화합물의 이성질체 밸런스가 유지될 수 있다는 것일 수 있다. 다른 이점은, 이 방법이 폴리페놀의 에틸에스테르를 제한적으로 생성하거나 전혀 생성하지 않는다는 것일 수 있다. 본 발명의 추가 이점은, 고수준의 순도(즉, 60% 초과)가 획득될 수 있다는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 개략적인 상세사항이 도 3, 도 9 및 도 14에 제시되어 있다. 각각의 도식은 본 발명에 따른 방법의 특정 실시 형태를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 태양은 출발 재료로부터 폴리페놀이 부화된 분획을 제공하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은,
(i)
출발 재료를 수성 용매 중에 가용화하는 단계;
(ii)
pH를 pH 3 미만으로 조절하는 단계;
(iii)
출발 재료를 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계;
(iv)
크로마토그래피 수지로부터 폴리페놀을 탈착시켜 폴리페놀을 포함하는 용출액을 제공하는 단계;
(v)
용출액의 pH를 pH 3.5 초과로 조절하는 단계; 및
(vi)
용출된 폴리페놀로부터 용출액을 분리시켜 폴리페놀이 부화된 분획을 수득하는 단계를 포함한다.
이 방법은, 폴리페놀 화합물, 예를 들어 도 1에 설명된 바와 같은 폴리페놀 화합물의 화학적 그리고 물리적 특성에 기초하여 개발되었다. 가장 중요한 폴리페놀 중 하나는 클로로겐산(CGA)인데, 이는 커피뿐만 아니라 많은 다른 식물 재료에서 발견되는 가장 우세한 폴리페놀이다. 클로로겐산(CGA)의 특정(비제한적) 예에는 3-카페오일 퀸산(3CQA), 4-카페오일 퀸산(4CQA), 5-카페오일 퀸산(5CQA), 3,4-다이카페오일-퀸산(3,4diCQA), 3,5-다이카페오일-퀸산(3,5diCQA), 4,5-다이카페오일-퀸산(4,5diCQA), 3-페룰로일 퀸산(3FQA), 4-페룰로일 퀸산(4FQA), 5-페룰로일 퀸산(5FQA), 및 카페산이 있다.
클로로겐산은, 전체적으로 600 g/mol 미만인 저분자량 화합물이다. 클로로겐산은 하나 또는 여러 방향족 기(즉, 페놀성 모이어티(moiety))를 갖고 있다. 이러한 방향족 모이어티들을 포함하는 화합물들 사이에는 π-π 스태킹 상호작용(stacking interaction)으로도 불리는 비공유 방향족 상호작용이 확립될 수 있다. 이러한 특성은 방향족 기를 갖는 매트릭스에 클로로겐산을 특이적으로 흡착시키는 데 이용된다.
클로로겐산은 퀸산 기를 갖고 있으며, 퀸산 기는 산-염기 특성을 부여한다(pKa = 3.2). pKa 미만의 pH에서, 클로로겐산은 양성자화된다. 분자는 비하전 상태이므로, 그것은 오히려 소수성이다. pKa 초과의 pH에서는, 산 기능이 카르복실레이트 형태 하에서 존재하는데, 이는 전체 분자가 전하로 인해 더 친수성임을 의미한다. 이러한 특성은 정제 목적을 위해 분자의 소수성을 조절하는 데 이용될 수 있다.
폴리페놀을 포함하는 출발 재료는 상이한 기원의 것일 수 있다. 실시 형태에서, 출발 재료는 식물 재료이다. 다른 실시 형태에서, 식물 재료는 커피, 예컨대 그린 커피, 카페인이 함유된 커피, 카페인이 제거된 커피 및 카페인이 제거된 그린 커피, 맥아, 코코아, 차, 장과류, 포도, 채소류, 감귤류, 초류 및 곡류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 출발 재료는 초기에, 예컨대 비등수 중에 가용화될 수 있다. 단백질, 멜라노이딘 및 다당류, 예컨대 아라비노갈락탄과 같은 고분자량(HMW) 화합물을 제거하기 위하여, 전술된 정제 공정을 시작하기 전에, 가용화된 출발 재료의 초기 침전 단계를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, 단계 (i)에서 수득된 가용화된 출발 재료는 단계 (ii)에서의 pH 조절 이전에, 예컨대 알코올(바람직하게는 에탄올)을 이용한 침전을 거쳐서, 고체상 및 액체상을 제공할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 고체상은 단계 (ii)에서의 pH 조절 이전에, 여과, 원심분리 및/또는 경사분리(decantation)에 의해 액체상으로부터 분리될 수 있다. 선택적인 분리 단계 후에, 액체상은 단계 (ii)에서의 pH 조절 이전에, 증발 처리를 거쳐서 액체상으로부터 HMW를 침전시키는 데 사용된 알코올을 제거할 수 있다.
폴리페놀이 부화된 분획은 상이한 형태의 것일 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 액체 형태 또는 건조된 형태일 수 있다. 추가 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 동결 건조된다.
아래의 실시예 1은, 가용화된 출발 재료가 80% 알코올로 침전되는 특정 실시예를 개시한다. 따라서, 실시 형태에서 알코올은 에탄올이다. 추가 실시 형태에서, 알코올, 예컨대 에탄올은 농도가 50 내지 99%(w/w), 예컨대 60 내지 99%(w/w), 예컨대 60 내지 90%(w/w), 예컨대 70 내지 90%(w/w), 예컨대 75 내지 85%(w/w)의 범위이다.
본 발명에 따른 방법은 출발 재료가 수지 컬럼 상으로 로딩되기 전에 출발 재료를 pH 3 미만으로 산성화하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시 형태에서, 단계 (ii)에서의 pH 조절은 pH 2.5 미만, 바람직하게는 pH 2 미만, 더 바람직하게는 pH 1.5 미만, 또는 더욱 더 바람직하게는 약 pH 1로의 조절이다. 다른 실시 형태에서, 사용되는 산은 강산, 예컨대 염산, 황산 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비교적 낮은 pH에 대한 이유는, 순수(pure water) 및/또는 더 높은 pH 값의 사용이 수지로부터의 CGA의 탈착을 야기할 수 있기 때문이다. 한편, 산성 조건 하에서, 클로로겐산은 그의 양성자화된 소수성 형태로 유지되기 때문에, 수지와의 상호작용이 유지된다.
아래에 제시되는 실시예 2는, 출발 재료를 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하기 전에 pH를 pH 1로 낮춘 효과를 증명한다. pH 조절 후에 그리고 출발 재료를 크로마토그래피 수지 상으로 로딩하기 전에, 재료는 더 큰 잔해(debris)를 제거하기 위해 여과될 수 있다. 크로마토그래피 수지는 또한 정제하고자 하는 출발 재료를 적용하기 전에 산으로 사전 컨디셔닝될 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 3 미만의 pH, 바람직하게는 pH 2 미만, 더 바람직하게는 pH 1.5 미만으로, 또는 더욱 더 바람직하게는 약 pH 1로, 산으로 사전 컨디셔닝된다. 다른 실시 형태에서, 컬럼을 사전 컨디셔닝하는 데 사용된 산은 염산, 황산 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 산의 정확한 농도는 다양할 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, 산의 농도는 0.001 M 내지 1 M, 바람직하게는 0.001 M 내지 0.5 M의 범위, 또는 더욱 더 바람직하게는 0.05 M 내지 0.3 M의 범위이다.
출발 재료를 크로마토그래피 수지 상으로 로딩한 후에, 결합되지 않은 재료를 제거하기 위해 크로마토그래피 수지를 헹구는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 폴리페놀이 탈착되기 전에 헹굼 용액으로 처리될 수 있다. 바람직하게는, 헹굼 용액은 pH 값이 pH 3 미만, 바람직하게는 pH 2 미만, 더 바람직하게는 pH 1.5 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 pH 1이다. 실시 형태에서, 세척 용액은 염산, 황산 또는 인산과 같은 산을 포함한다. 산의 정확한 농도는 다양할 수 있기 때문에, 헹굼 용액에서의 산의 농도가 0.001 M 내지 1 M, 바람직하게는 0.001 M 내지 0.5 M의 범위, 또는 더욱 더 바람직하게는 0.05 M 내지 0.3 M의 범위일 수 있다는 것은 본 발명의 일 실시 형태이다.
실시예 3은 0.1 M HCl로 컬럼을 헹군 효과를 나타내는데, 헹굼 단계를 포함하지 않을 때와 비교하여 최종 분획의 순도가 50%로부터 66%로 증가하게 된다. 따라서, 탈착 이전에 컬럼을 헹구는 것이 최종 분획의 순도를 추가로 개선시킬 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
출발 재료와 크로마토그래피 재료 사이의 비는 정제된 생성물의 양에 영향을 미칠 수 있다. 컬럼의 오버로딩은 컬럼의 포화를 야기할 수 있으며, 이는 가용화된 출발 재료의 분획이 컬럼에 흡착되지 않을 수 있기 때문에 고가치 폴리페놀성 화합물의 불충분한 단리를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 출발 재료와 크로마토그래피 재료의 비는 2:1 내지 1:4(중량:중량 기준으로), 예컨대 1:1 내지 1:3(중량:중량 기준으로), 예컨대 약 1:2(중량:중량 기준으로)일 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "크로마토그래피 수지"는, 크로마토그래피 컬럼에 존재하여 출발 재료의 분리를 담당하는 크로마토그래피 매체에 관한 것이다. 본 발명의 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 충전층(packed bed) 내에 또는 팽창층(expanded bed) 내에 패킹될 수 있다. 상이한 유형의 크로마토그래피 수지가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 단계 (iii)은 중합체 수지 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 크로마토그래피 매체 상에서의 흡착 크로마토그래피를 수반할 수 있다.
탈착을 위해, 크로마토그래피 수지와 폴리페놀의 페놀 화합물 사이의 상호작용이 약화되어야 한다. 상이한 파라미터가 본 발명의 탈착 단계에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 발명자들은, 온도가, 하이드록실 성분, 예컨대 에탄올의 존재 하에서 폴리페놀의 에틸에스테르의 바람직하지 않은 형성에 유의한 영향을 미치는 파라미터일 수 있다는 것을 알아내었다.
따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 탈착 동안의 온도는 70℃ 미만, 예컨대 60℃ 미만, 예컨대 50℃ 미만, 예컨대 40℃ 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 온도는 10 내지 40℃의 범위, 예컨대, 25 내지 35℃의 범위, 예컨대 약 30℃이다. 실시예 7은 CGA의 에틸에스테르 형성을 피하기 위해 온도를 낮게 유지하는 이점을 증명한다. 따라서, 공정의 모든 단계 동안 온도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 일반적으로 유리할 수 있다. 그러나, (예컨대, 증발 및/또는 탈착 단계 동안) 분석의 속도와 에틸에스테르의 생성을 피하는 것 사이에는 트레이드오프(tradeoff)가 항상 존재한다.
탈착 공정에 영향을 미칠 수 있는 다른 파라미터는 탈착 용리액(desorption eluent)의 조성이다. 탈착 용리액은 폴리페놀의 탈착을 개선시킬 수 있는 상이한 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 탈착 용리액은 하이드록실 성분을 포함할 수 있는데, 바람직하게는 하이드록실 성분은 에탄올이다. 다른 알코올 또는 알코올들의 조합이 또한 탈착 용리액으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한, 용출액 및 탈착 용리액의 pH가 하이드록실 화합물, 예컨대 에탄올의 존재 하에서 공정 동안 폴리페놀의 에틸에스테르의 바람직하지 않은 형성에 유의한 영향을 미칠 수 있다는 것을 알아내었다. 본 발명의 실시 형태에서, 용출액 및/또는 탈착 용리액의 pH는 pH 3 초과, 예컨대 pH 3.5 초과, 바람직하게는 약 pH 4, 또는 더욱 더 바람직하게는 4 내지 5의 pH 범위일 수 있다. 높은 pH 값, 예컨대 pH 12와 같은 강한 알칼리성 조건에서는, 클로로겐산의 에틸에스테르의 원치 않는 형성이 감소될 수 있지만, 폴리페놀의 다른 바람직하지 않은 반응을 야기할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 탈착 용리액은 수성 염기와 조합된, 하이드록실 성분, 바람직하게는 에탄올을 포함할 수 있는데, 수성 염기는 바람직하게는 KOH일 수 있다.
본 발명의 실시 형태에서, 탈착 용리액은 적어도 20%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 30%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 40%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 50%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 60%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 70%의 하이드록실 성분, 예컨대 적어도 80%의 하이드록실 성분 및 최대 20%의 수성 염기, 예컨대 적어도 90%의 하이드록실 성분 및 최대 10%의 수성 염기, 또는 이들의 단계적 조합을 포함할 수 있다.
폴리페놀이 부화된 분획이 많은 상이한 폴리페놀성 화합물 및 클로로겐산 화합물을 포함할 수 있기 때문에, 단계적 용출이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 탈착 용리액은
(i)
10 내지 30%, 예컨대 15 내지 25%, 예컨대 17 내지 23% 또는 예컨대 19 내지 21% 범위의 하이드록실 성분, 또는
(ii)
40 내지 60%, 예컨대 45 내지 55%, 예컨대 47 내지 53% 또는 예컨대 49 내지 51% 범위의 하이드록실 성분, 또는
(iii)
70 내지 90%, 예컨대 75 내지 85%, 예컨대 77 내지 83% 또는 예컨대 79 내지 81% 범위의 하이드록실 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, 탈착 단계는 (i), (ii) 또는 (iii)에서 언급된 바와 같은 탈착 용리액에서의 하이드록실 성분의 농도 중 2개 이상의 농도의 조합, 예컨대 3개 모두의 단계적 조합을 포함하는 단계적 용출일 수 있다. 탈착 동안 하이드록실 성분의 농도의 구배를 부가하여, 이에 의해 상이한 폴리페놀성 화합물을 포함하는 탈착 용리액을 수득함으로써 용출시키는 것이 또한 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 하이드록실 성분은, 탈착 동안 최대 100%로부터 최소 1%로, 예컨대 최대 90%로부터 최소 15%로, 예컨대 최대 90%로부터 최소 70%로, 예컨대 최대 60%로부터 최소 40%로, 예컨대 최대 30%로부터 최소 10%로 진행하는 구배로서 제공될 수 있다. 상기 실시 형태에서, 하이드록실 성분은 초기에 고농도이지만, 저농도로부터 고농도로 진행하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시 형태에서, 하이드록실 성분은, 탈착 동안 적어도 1%로부터 최대 100%로, 예컨대 적어도 15%로부터 최대 90%로, 예컨대 적어도 10%로부터 최대 30%로, 예컨대 적어도 40%로부터 최대 60%로, 예컨대 적어도 70%로부터 최대 90%로 진행하는 구배로서 제공될 수 있다. 추가 실시 형태에서, 탈착 단계는 본 발명에 따른 구배 범위 중 임의의 것의 단계적 조합으로서 제공된다. 다수의 용출액이 수집되는 단계적 용출을 가짐으로써(각각은 상이한 함량의 상이한 폴리페놀을 가짐), 후속하여, 수집된 용출액 중 2개 이상의 용출액을 혼합하여, 더 정확하게는 출발 재료에 존재하는 폴리페놀, 특히 클로로겐산의 이성질체 밸런스와 유사한, 폴리페놀, 특히 클로로겐산의 이성질체 밸런스를 갖는 최종 생성물을 수득하는 것이 가능할 수 있다. 하나의 용출액만이 수집되는 경우, 이것은 불가능할 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 온도가 에틸에스테르의 형성에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 탈착은 80℃ 미만, 예컨대 75℃ 미만, 예컨대 50℃ 미만, 예컨대 35℃ 미만, 또는 예컨대 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 그러나, 더 높은 온도에서 탈착의 속도가 더 빠르기 때문에, 이 또한 트레이드오프이다.
탈착 이후에, 에틸에스테르 형성을 피하기 위해 용출액의 pH를 추가로 조절하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, pH는 탈착 이후에 3.5 내지 6, 예컨대 3.5 내지 5, 예컨대 3.5 내지 4.5, 예컨대 4 내지 5의 범위, 또는 예컨대 약 4 또는 5의 pH로 조절된다.
수득되는 용출액은 하이드록실 성분을 포함하고, 용출액 중 폴리페놀의 농도를 추가로 높이기 위하여 하이드록실 성분이 폴리페놀로부터 분리될 수 있다.
용출 이후의 분리 단계, 및 선택적 pH 조절은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 단계 (vi)에서의 분리는 증발에 의해 수행될 수 있다. 온도가 또한 에틸에스테르 형성에 영향을 미치기 때문에, 용출액의 증발은 80℃ 미만, 예컨대 75℃ 미만, 60℃ 미만, 예컨대 40 내지 60℃의 범위, 또는 예컨대 45 내지 5℃의 범위, 바람직하게는 약 50℃의 온도에서 수행된다. 그러나, 승온에서 탈착의 속도가 훨씬 더 빠르기 때문에, 이 또한 트레이드오프이다. 증발 이후에, 하이드록실 성분을 포함하는 증발된 상 및 폴리페놀을 포함하는 응축물 상이 제공된다.
바람직하게는, 잔류물 상에 존재하는 하이드록실 성분의 함량은 5%(w/w) 미만, 더 바람직하게는 1%(w/w) 미만, 더욱 더 바람직하게는 0.1%(w/w) 미만, 더욱 더 바람직하게는 0.01%(w/w) 미만이다.
하이드록실 성분의 분리(예컨대 증발) 이전에 또는 하이드록실 성분의 분리(예컨대 증발) 이후에 pH 조절이 일어날 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 추가적으로, pH 조절은 하이드록실 성분의 분리 전과 후 둘 모두에서 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 탈착 용리액의 pH는 3.5 내지 6, 예컨대 3.5 내지 5, 예컨대 3.5 내지 4.5, 예컨대 4 내지 5의 범위, 또는 예컨대 약 4 또는 5의 pH로 조절될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 분리 단계, 예컨대 증발은 분리 이전에, 분리 이후에, 또는 분리 전과 후 둘 모두에서 일어난다. 분리 단계 이후에, 탈착 용리액은 산성 용액으로 존재할 수 있는데, 산성 용액에서 폴리페놀은 그의 소수성 및 주로 불용성 형태로 존재할 수 있다. 폴리페놀을 더 양호하게 가용화하기 위하여, 전술된 바와 같은 pH 조절이 유리할 수 있다.
정제 프로토콜을 산업적으로 적용 가능하도록 하기 위하여, 처리 시간이 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 처리 시간은 36시간 이하, 예컨대 30시간 이하, 예컨대 25시간 이하, 예컨대 20시간 이하, 예컨대 18시간 이하, 예컨대 15시간 이하, 예컨대 12시간 이하, 예컨대 10시간 이하, 예컨대 5시간 이하일 수 있다. 본 맥락에서, 처리 시간은, 출발 재료의 가용화로부터, 용출액이 하이드록실 성분을 포함하는 상 및 폴리페놀을 포함하는 잔류물 상으로 분리됨으로써 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획을 수득할 때까지의 기간에 관한 것이다.
폴리페놀이 부화된 분획은 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 크로마토그래피, 한외여과, 나노여과, 미세여과, 역삼투 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 정제될 수 있다. 최종 생성물은 또한 동결 건조될 수 있다.
게다가, 정제 공정에 관하여, 본 발명은 또한 그러한 공정에 의해 수득 가능한 생성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득 가능한 폴리페놀이 부화된 분획에 관한 것이다. 그러한 생성물은 출발 재료에서 원래 발견되는 밸런스와 유사한 폴리페놀의 밸런스, 특히 클로로겐산의 밸런스를 포함하기 때문에 매우 독특할 수 있다.
본 발명의 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 폴리페놀의 함량이 건조 물질 기준으로 적어도 35%(w/w), 예컨대 적어도 45%, 예컨대 적어도 55%, 예컨대 적어도 65%, 또는 예컨대 적어도 75%일 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 폴리페놀의 에틸에스테르의 함량이 건조 물질 기준으로 그리고 폴리페놀의 총 함량에 대해 20%(w/w) 미만, 예컨대 15%(w/w) 미만, 예컨대 10%(w/w) 미만, 예컨대 5%(w/w) 미만, 예컨대 1 (w/w) 미만, 예컨대 0.1 내지 20%(w/w)의 범위, 예컨대 0.1 내지 10% 범위, 예컨대 0.1 내지 5%의 범위, 예컨대 0.1 내지 4%의 범위, 예컨대 0.1 내지 3%의 범위, 예컨대 0.1 내지 2%의 범위, 또는 예컨대 0.1 내지 1%의 범위일 수 있다. 본 발명의 더 특정한 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 폴리페놀의 함량이 건조 물질 기준으로 적어도 35%(w/w)일 수 있고, 폴리페놀의 에틸에스테르가 건조 물질 기준으로 그리고 폴리페놀의 총 함량에 대해 20%(w/w) 미만, 예컨대 0.1 내지 20%(w/w)일 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시 형태에서, 폴리페놀은 클로로겐산(CGA), 카페산 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 클로로겐산(CGA)은 3-카페오일 퀸산(3CQA), 4-카페오일 퀸산(4CQA), 5-카페오일 퀸산(5CQA), 3,4-다이카페오일-퀸산(3,4diCQA), 3,5-다이카페오일-퀸산(3,5diCQA), 4,5-다이카페오일-퀸산(4,5diCQA), 3-페룰로일 퀸산(3FQA), 4-페룰로일 퀸산(4FQA), 5-페룰로일 퀸산(5FQA), 카페산 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 3-카페오일 퀸산(3CQA), 4-카페오일 퀸산(4CQA), 5-카페오일 퀸산(5CQA), 3,4-다이카페오일-퀸산(3,4diCQA), 3,5-다이카페오일-퀸산(3,5diCQA), 4,5-다이카페오일-퀸산(4,5diCQA), 3-페룰로일 퀸산(3FQA), 4-페룰로일 퀸산(4FQA), 5-페룰로일 퀸산(5FQA), 및 카페산을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 부화된 분획은, 3-카페오일 퀸산(3CQA), 4-카페오일 퀸산(4CQA), 5-카페오일 퀸산(5CQA), 3,4-다이카페오일-퀸산(3,4diCQA), 3,5-다이카페오일-퀸산(3,5diCQA), 4,5-다이카페오일-퀸산(4,5diCQA), 3-페룰로일 퀸산(3FQA), 4-페룰로일 퀸산(4FQA) 및 5-페룰로일 퀸산(5FQA) 각각의 함량이, 출발 재료에 존재하는 함량에 대해 최대 30%(w/w), 예컨대 최대 25%(w/w); 예컨대 최대 20%(w/w), 예컨대 최대 15%(w/w); 예컨대 최대 10%(w/w)만큼 벗어나 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 클로로겐산(CGA)은 적어도 50%(w/w)의 모노-카페오일 퀸산 및/또는 최대 25%(w/w)의 다이-카페오일 퀸산을 포함할 수 있다. 다른 유사한 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 건조 물질 기준으로 적어도 12%(w/w)의 3-카페오일 퀸산(3CQA), 4-카페오일 퀸산(4CQA) 또는 5-카페오일 퀸산(5CQA) 각각 중 적어도 하나, 예컨대, 상기 화합물들 중 적어도 2개, 바람직하게는 상기 화합물들 3개 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 건조 물질 기준으로 12%(w/w) 미만의 3,4-다이카페오일-퀸산(3,4diCQA), 3,5-다이카페오일-퀸산(3,5diCQA) 또는 4,5-다이카페오일-퀸산(4,5diCQA) 각각 중 적어도 하나, 예컨대, 상기 화합물들 중 적어도 2개, 바람직하게는 상기 화합물들 3개 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시 형태에서, 폴리페놀이 부화된 분획은 건조 물질 기준으로 12%(w/w) 미만의 3-페룰로일 퀸산(3FQA), 4-페룰로일 퀸산(4FQA) 또는 5-페룰로일 퀸산(5FQA) 각각 중 적어도 하나, 바람직하게는 3개 모두를 포함할 수 있다.
폴리페놀이 부화된 분획은 직접 식품 성분으로서 사용되거나 식품 성분의 일부를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 태양은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획을 포함하는 식품 성분에 관한 것이다. 본 발명의 실시 형태에서, 식품 성분은, 식품 성분 중의 폴리페놀의 총량에 대해 0.1 내지 20%(w/w), 예컨대 0.1 내지 10% 범위, 예컨대 0.1 내지 5% 범위, 예컨대 0.1 내지 4% 범위, 예컨대 0.1 내지 3% 범위, 예컨대 0.1 내지 2% 범위, 또는 예컨대 0.1 내지 1% 범위의 폴리페놀의 에틸에스테르를 포함할 수 있다.
폴리페놀이 부화된 분획 또는 식품 성분은 식품 제품에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 식품 성분을 포함하는 식품 제품에 관한 것이다. 실시 형태에서, 식품 제품은, 식품 제품 중의 폴리페놀의 총량에 대해 0.1 내지 20%(w/w), 예컨대 0.1 내지 10% 범위, 예컨대 0.1 내지 5% 범위, 예컨대 0.1 내지 4% 범위, 예컨대 0.1 내지 3% 범위, 예컨대 0.1 내지 2% 범위, 또는 예컨대 0.1 내지 1% 범위의 폴리페놀의 에틸에스테르를 포함한다.
폴리페놀은 상이한 목적을 위해 식품 제품을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 태양은 향기, 향미 및/또는 거품을 발생시키기 위한 전구체로서의 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 본 발명에 따른 식품 성분의 용도에 관한 것이다.
추가 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 폴리페놀은 생체내(in vivo)에서 생물학적 활성, 예컨대 항산화제, 효소의 활성화제/억제제 및 수용체를 발현할 수 있기 때문에, 이것은 약제학적 조성물에서의 관련 성분으로 간주될 수 있다.
본 발명의 태양들 중 하나와 관련하여 설명된 실시 형태들 및 특징들이 또한 본 발명의 다른 태양들에 적용됨에 유의해야 한다.
이제, 본 발명은 하기의 비제한적 실시예들에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.
방법
분획
플레인(plain) 또는 카페인이 제거된 그린 로부스타(Robusta) 콩으로부터 그린 커피 분획을 제조하였다.
수지
Amberlite FPX66(CAS N° 9003-69-4)은 화학 구조가 거대 망상 방향족 중합체, 즉 스티렌으로 이루어진 시판 식품 등급 수지이다. 스티렌 고리가 작용화되어 있지 않기 때문에, 매트릭스는 오히려 소수성이다.
실험실 규모 실험을 위한 정제 셋업
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컬럼: 서모 재킷(thermo jacket)(GE Healthchare)을 갖는 XK 50/30 유리 컬럼
벤치 규모(bench scale)를 위한 정제
셋업
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컬럼: 서모 재킷(GE healthcare)을 갖는 XK 50/100 유리 컬럼
HPLC-UV에 의한 클로로겐산 분석
하기 셋업으로 HPLC-UV에 의해 클로로겐산(CGA) 분석을 수행하였다:
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시스템 - HPLC는 Dionex®에 의해 공급되는 Ultimate 3000이다. 그것에는 쿼터너리 펌프, 샘플 주입기, UV 검출기 및 Chromeleon 소프트웨어가 구비되어 있다.
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샘플 제조 - 샘플은 분말 또는 분획이었다. 분말은 메탄올:물(80:20) 중에 2 mg/mL의 농도로 가용화하였다. 분획은 분석물이 0.2 mg/mL 미만의 범위가 되도록 메탄올:물(80:20) 중에 희석시켰다.
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HPLC 방법 - 주위 온도에서 Spherisorb ODS-1 컬럼, 5 μm, 250x4.6 mm(Waters) 상에서 크로마토그래피 분리를 달성하였다. A/B(A: 92% 물/8% 아세토니트릴/1 mL/L 오르토-인산, B: 50% 물/50% 아세토니트릴/2 mL/L 오르토-인산)의 바이너리 구배(binary gradient)를 적용하였다. 주입 부피는 20 μL였다. 파장은, 클로로겐산에 대해서는 325 nm로, 그리고 카페인 분석을 위해서는 275 nm로 설정하였다.
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클로로겐산 이성질체 - 이용된 방법은 45분 내에, 카페인 및 9개의 주요 클로로겐산: 3개의 카페오일 퀸산(CQA), 3개의 페룰로일 퀸산(FQA) 및 3개의 다이-카페오일 퀸산(di-CQA)에 대한 농도를 결정할 수 있었다.
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교정(calibration) - 교정은 외부 표준물을 이용하여 수행된다. 2개의 표준물이 메탄올:물(80:20) 중 0.2 mg/mL의 농도로 이용된다(5-CQA 및 카페인). Biopurify로부터의 순수 표준물을 이용하여 클로로겐산 이성질체의 변환 인자를 결정하였다.
다른 CQA의, 100 그램당 그램으로 표현되는 농도는 5-CQA의 농도로부터 이 식에 의해 결정된다:
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여기서:
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W는 신규 생성물의 100 그램당 그램 단위의 분석물 농도이다.
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AS는 시험 샘플 용액 내의 분석물의 피크 면적이다.
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C0는 밀리리터당 밀리그램 단위의 표준물 내의 분석물(분석물이 표준 용액 내에 있지 않은 경우 5-CQA)의 농도이다.
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P는 순도가 0.95 미만일 때 표준물 내의 분석물의 순도이다(순도 ≥ 0.95인 경우, P=1).
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Vs는 밀리리터 단위의 시험 용액의 부피이다.
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D는 희석 인자이다(10 또는 1).
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F는 5-CQA 표준물로부터의 다른 클로로겐산 이성질체의 계산을 허용하는 보정 인자이다.
탈착 연구 및 분획 조성에 대한 LC-MS 분석
커피 분획을 하기와 같이 LC-UV-MS/MS에 의해 특성화하였다:
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시스템: 1200SL, DAD 검출기(Agilent) 및 QToF 6520(Agilent)을 사용하여 분석을 수행하였다.
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샘플 제조: 직접 주입
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HPLC 방법: QToF 6520(Agilent)에 결합된 Kinetex C18 컬럼, 2.6 μm, 100x2.1 mm(Phenomenex) 상에서 크로마토그래피 분리를 달성하였다. A/B(A: 0.1% 포름산, B: MeOH 중 0.1% 포름산)의 바이너리 구배를 적용하였다.
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컬럼 온도를 30℃로 유지하였다. 샘플 농도는 물에서 대략 10 mg/mL였다. 주입 부피는 3 μL였다. 파장은 325 nm로 설정하였고, 기준은 385 nm로 고정하였고, 둘 모두에 대해 대역폭은 2 nm였다.
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MS 파라미터: 질량 분석계 QTOF 6520(Agilent)을 포지티브 및 네거티브 ESI-모드에서 사용하였고, 클로로겐산의 탈착을 추적하기 위해서는 MS 모드에서 작동시키고, 화합물 확인을 위해서는 자동 MS/MS 모드에서 작동시켰다.
실시예 1 ― 침전
그린 커피 추출물(즉, 카페인이 함유된 상태/카페인이 제거된 상태)을 비등수 중에서 50% TC(건조 물질 함량)로 문제 없이 준비하였다.
미처리 추출물은 컬럼의 막힘을 초래할 수 있기 때문에, 그린 커피 추출물의 고분자량(HMW) 화합물(즉, 단백질, 멜라노이딘, 아라비노갈락탄)을 80% 에탄올(V/V) 중에 침전시킴으로써 그들을 제거하였다. 
필터(다공성 등급 1) 상에서의 여과에 의해 침전물을 제거하였다. 에탄올을 추가로 증발시켰다. 그 후에, CGA의 농도를 처리 전과 후에 HPLC-UV에 의해 평가하였다. 주요 결과는 하기와 같았다:
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HMW 화합물의 침전 이후에 컬럼의 막힘은 관찰되지 않았다.
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80% 에탄올 처리는 클로로겐산 용해성에 영향을 미치지 않았다.
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CGA의 손실은 낮았고, 침전물에 주로 내포되었다.
결론으로서, 알코올, 예컨대 에탄올이 본 발명에 따른 방법에서 특히 유용하다.
실시예 2 - 흡착
실시예 1로부터 수득된 바와 같은 커피 용액 그대로 흡착을 먼저 평가하였다. 이것은 불량한 흡착 속도를 나타내었다. 다음으로, 실시예 1로부터 수득된 바와 같은 커피 용액을 pH 1로 산성화하여, 수지의 방향족 중합체와 CGA 화학종 사이의 소수성 상호작용의 강도를 강화시켰다. HPLC-UV에 의한 CGA의 분석은 하기를 나타내었다:
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산성화 없는 추출물은 불량하게 체류되었다(11%).
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pH 1로의 산성화는 폴리페놀의 체류를 유의하게 개선시켰다. 흡착 속도는 커피 추출물의 자연 pH, 즉, pH 4 내지 7과 비교하여 산성화 단계에 의해 거의 2배가 되었다. 최종 흡착 속도는 약 19%로 증가되었다. 그 값은 나중에 커피/수지 비의 최적화에 의해 추가로 개선되었다.
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산성 조건 하에서 단지 CGA 및 다른 소수성 화합물만이 컬럼에 의해 체류되며, 한편 친수성 분자(예컨대, 무기질 및 당류)는 통과된다.
결론으로서, 산성 환경은 본 개시된 프로토콜의 흡착 단계를 개선시킨다.
실시예
3 -
컬럼
헹굼
체류되지 않고 컬럼의 불용 부피(dead volume) 내에 여전히 존재하는 화합물을 제거하기 위해, 물 및 0.1 M HCl을 이용한 헹굼을 수행하였다. 그 후에, 세척수를 CGA에 대해 검사하였다. 주요 결과로서, 하기를 알아내었다:
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순수는 CGA를 탈착시키는 경향이 있다.
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산성 조건 하에서, 클로로겐산은 그의 양성자화된 소수성 형태로 유지되기 때문에, 수지와의 상호작용이 유지되었다. CGA는 0.1 M HCl을 이용한 컬럼 헹굼 시에 탈착되지 않았다.
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최종 부화된 분획의 순도는 세척 단계를 포함할 때 50%로부터 66%로 증가된다.
결론으로서, 세척 단계는 최종 생성물의 순도를 증가시킨다.
실시예 4 ― 탈착
CGA 탈착을 위해, 수지와 페놀성 화합물 사이의 소수성 상호작용이 약화되어야 했다. 식품 등급 정제된 분획을 목적으로, 에탄올을 유기 용매로서 선택하였다. 탈착 용액의 pH를 증가시키기 위하여 KOH(10-4 M)를 첨가하였다. 이러한 에탄올/KOH 혼합물(90/10 V/V)을 탈착 용매로서 사용하였고, 순수한 에탄올 또는 에탄올/물 혼합물과 비교하였다. 결과는 하기와 같았다:
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에탄올/물을 사용할 때에는, CGA가 완전히 탈착되지는 않는다.
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탈착 매체의 pH를 5로 증가시킴으로써 탈착 효율이 유의하게 개선될 수 있다. 에탄올/KOH의 사용에 의해, CGA는 부분적으로 탈양성자화되는데, 즉, 이것은 수지에 대한 더 적은 친화성을 가지므로 100% 탈착이 관찰된다.
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온도를 70℃로 증가시키면, 탈착 지속기간이 30%만큼 줄어든다.
정제된 분획에서의 CGA의 조성이 초기 커피에서와 동일하게 유지되는 것을 보장하기 위하여, 상이한 이성질체들의 탈착 속도론을 알고, 카페인이 함유된 샘플에 대해서는 카페인의 탈착 속도론 역시 아는 것이 중요하다. 따라서, 탈착 시에 일련의 분획을 수집하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이러한 연구는 하기를 나타내었다:
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90% 에탄올을 이용하면, CQA, FQA 및 Di-CQA가 동일한 시간 간격 내에 용출되어, 한꺼번에 모든 이성질체의 탈착을 허용한다.
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단일 이성질체의 경우, 최대의 탈착이 또한 작은 시간 범위 내에 있다(데이터는 나타나 있지 않음).
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카페인은 CGA와 함께 용출되기 시작하지만 CGA보다 더 천천히 탈착된다.
실시예 5 ― 커피/수지 비
커피/수지 비를 최적화하기 위하여, 흡착 단계(adsorption phase) 동안 컬럼의 출구(output)에서 분획 수집을 수행하였다. 각각의 분획을 325 nm(CGA의 고유 파장)에서 UV에 의해 분석하였다. 최적의 비는 CGA가 컬럼에서 다시 용출되기 시작하는 커피 용액의 부피에 대응한다. 용액의 이 부피로부터, 컬럼을 통과하는 커피 고형물의 대응하는 질량을 계산하였다. 최적의 커피/수지 비는 1 g의 수지에 대해 대략 0.55 g의 커피인 것으로 결정되었다. 그러나, 클로로겐산의 함량이 커피의 유형에 따라 그리고 동일한 종류의 커피 내에서 상당히 다를 수 있기 때문에, 이러한 비는 변화될 수 있다.
실시예 6 ― 정제 전과 후의 조성 - 실험실 규모
도 3에 따른 정제 프로토콜을 완료한 후에, 성분들을 출발 재료의 함량과 비교하였다. CGA의 정제 동안 발생하는 다른 화합물들의 변화를 평가하기 위하여 동결 건조된 분말을 그의 조성에 대해 분석하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 주요 변화는 하기와 같다:
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주요 변화는 CGA에 관련된다. 그의 수준이 부화된 정제된 분획에서 약 2배 더 높다.
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탄수화물 및 유기산은 그들의 높은 극성으로 인해 유의하게 감소된다(각각 12 및 10으로 나눈 양).
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아미노산 역시 감소되지만 탄수화물 및 유기산보다 더 적게 감소된다.
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초기 커피가 카페인이 제거된 커피일지라도 카페인이 존재하고 최대 1.2%(3배 초과) 부화(enrichment)를 겪는다.
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"기타" 카테고리에 열거된, 확인되지 않은 화합물의 비율은 2.2를 곱한다. 이러한 증가의 원인이 되는 화합물은 CGA와 동일한 소수성을 가질 수 있으므로 공정 동안 또한 흡착된다.
부화된 폴리페놀 분획의 상세한 조성을 추가로 평가하였다. CGA 프로파일의 분석은 도 5에 도시된 바와 같이 하기의 결과를 나타내었다.
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CGA 수준은 실험실 규모 정제 프로토콜 하에서 33%로부터 56%로 증가된다. CGA 이성질체에서의 초기 밸런스는 부화된 정제된 분획에서 오히려 유지된다.
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FQA 밸런스는 동일하게 유지된다.
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CQA에서의 상대 함량, 특히 3-CQA의 상대 함량은 약간 감소된다. 이러한 이성질체의 더 높은 극성은 수지에 대한 그의 더 불량한 흡착을 설명할 수 있다.
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di-CQA, 주로 3,5 및 4,5-di-CQA의 함량은 증가된다. 2개의 카페산 잔기는 수지에 대한 이러한 이성질체의 더 높은 친화성을 부여하여(FQA 및 CQA에 대한 하나의 상호작용 대신에 2개의 상호작용), 더 효율적인 정제를 가능하게 할 수 있다.
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유리 카페산에서의 비율은 유의하게 증가되는데(5를 곱한 양), 이는 아마도 정제 공정 동안의 CQA의 가수분해에 기인할 것이다.
전체적으로, 이성질체 밸런스는 초기 추출물의 이성질체 밸런스에 가까운 것으로 간주될 수 있다.
모든 정제 단계의 연속 최적화 이후에, 약 70%의 순도 및 보존된 CGA 밸런스를 갖는 CGA 분획이 수득될 수 있다. 부화 인자는 전체적으로 약 2였다. 공정의 중요 단계는 하기와 같다:
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에탄올 80% 중에서 고분자량 화합물의 침전에 의한 사전 정제.
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흡수 이전에 pH 1에서의 추출물의 산성화에 의해 최적화되는, 소수성 수지(즉, Amberlite FPX66) 상에서의 흡착 단계.
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70℃에서 에탄올/KOH 10-4 M(90/10)을 이용하여 수행된 탈착 단계(desorption phase).
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증발 동안 CGA의 용해성을 유지시키고 동결 건조 시에 분획의 성능을 개선시키기 위해 5에서의 pH 조절.
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부화된 분획은 또한 방향족 모이어티를 포함하는 다른 소수성 화합물, 예컨대 미량의 CGA, NPPA, DKP, 및 카페인이 유사하게 부화되어 있었다.
실시예 7 ― 정제 전과 후의 순수한 가용성 커피 조성 ― 실험실 규모
실시예 6에서의 실험실 규모 연구의 결과로부터, 도 9에 도시된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 순수한 가용성 커피에 대해 적용하였다. 본 실시예에서는, 하기 조건을 적용하였다:
-
순수한 가용성 커피를 출발 재료로서 사용하였다
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실험실 규모 컬럼을 이용하여 폴리페놀 부화된 분획 제조를 수행하였다.
결과는 하기와 같다:
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부화된 분획에 대해, CGA 함량은 실험실 규모 정제 프로토콜 하에서 10%로부터 24%로 증가된다. CGA 이성질체에서의 초기 밸런스는 부화된 정제된 분획에서 오히려 유지된다.
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CGA 수준은 실험실 규모 정제 프로토콜 하에서 33%로부터 56%로 증가된다. CGA 이성질체에서의 초기 밸런스는 부화된 정제된 분획에서 오히려 유지된다.
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최적화된 프로토콜은 순수한 가용성 커피에 대해 적용될 수 있다.
실시예 8 ― CGA로부터의 에틸에스테르의 형성을 회피함
CGA로부터의 에틸에스테르의 바람직하지 않은 형성에 유리한 공정 조건을 조사하였다. 모델 연구에서는 CGA의 분해 및 각각 CGA 에스테르의 형성의 속도론을 따랐다. 공정 동안, CGA의 에틸에스테르가 형성될 수 있다. 그러나, 이는 그것이 CGA 밸런스 및 부화된 분획의 특성에 유의하게 영향을 미칠 수 있기 때문에 바람직하지 않다.
아래의 반응도식은 에틸에스테르를 생성하는 에스테르화의 일반적 반응 메커니즘을 나타낸다. 산과 알코올 사이의 반응은 양성자 이동에 의해 촉매되어, 반응 속도를 pH-의존적이게 한다. 제2 중요 파라미터로서, 온도는 화학 반응에 대한 통상적인 경우인 바와 같이, 분해 속도에 영향을 줄 것이다. CGA의 에틸화를 피하기 위한 이상적 조건을 결정하기 위하여 두 파라미터 모두를 평가하였다.
실험 동안, 에탄올(75% 에탄올성 용액)의 존재 하에서 하기 파라미터 pH, 온도 및 시간을 가변시킴으로써 5-CQA를 저장하였다.
모델로서 5-CQA 에스테르화를 이용하여 하기 조건 하에서 공정을 행하였다.
각각의 시험에 대해, 10 mg의 5-CQA를 40 mL의 75% 에탄올 용액 중에 용해시켰다.
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pH 연구: pH를 염산(32%)을 이용하여 pH 1, pH 2.7 및 pH 4로 조절하고 NaOH 용액(4 N)을 이용하여 pH 12로 조절하고, 모든 샘플을 80℃의 온도에서 실험실 오븐 내에 2시간 동안 유지시켰다.
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온도 연구: CQA 용액을 염산(32%)을 이용하여 pH 1로 조절하고, 실온, 50℃ 또는 80℃ 중 어느 하나에서 실험실 오븐 내에 2시간 동안 유지시켰다.
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시간 연구: 5-CQA 용액을 pH 1로 조절하고, 실온 또는 50℃에서 1시간, 2시간, 3시간 및 36시간(RT에서만) 동안 유지시켰다.
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시스템: DAD 검출기(Thermo Finnigan) 및 Rheos HPLC 시스템(Thermo Finnigan)과 함께, LCQ Deca 질량 분석계(Thermo Finnigan)를 사용하여 LC-DAD-MS 시스템 상에서 분석을 수행하였다.
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샘플 제조: 각각의 파라미터에 대해, 용액의 분취물(aliquot)을 1:10으로 희석시키고, LC/MS-DAD 분석을 위해 직접 사용하였다.
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HPLC 방법: 주위 온도에서 Zorbax Eclipse C18 컬럼, 5 μm, 150*3 mm(Agilent) 상에서 분리를 수행하였다. A/B(A: 0.1% 포름산, B: 메탄올)의 바이너리 구배를 적용하였다.
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MS 파라미터: 사용된 질량 분석계는 화합물 확인을 위해 풀스캔(FullScan) 및 데이터 의존적 MS/MS 모드(m/z 100-1000)에서 작동되는 LCQ-Deca이다.
pH
5-CQA의 분해 및 대응하는 에틸-에스테르의 형성을 LC/MS-DAD에 의해 모니터링하였다. 도 6은 75% 에탄올 용액 중에 상이한 pH에서 2시간 동안 저장된 5-CQA의 크로마토그램을 도시한다. pH에 대한 연구를 하기를 나타낸다:
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pH 1에서는, 5-CQA가 그의 에스테르로 빠르게 변환하는 것이 2시간 내에 관찰된다.
-
pH 2.7에서는, 5-CQA 에스테르화가 유의하게 감소된다.
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pH 4에서는, 5-CQA가 2시간 후에 거의 분해되지 않는다.
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강한 알칼리성 조건(pH 12)은, 카페산 및 퀸산을 산출하는 5-CQA의 가수분해를 포함하는 완전한 상이한 반응도식을 유발한다. 추가적으로, 알칼리성 조건은 3-CQA 및 4-CQA의 출현에 의해 관찰되는 바와 같이 5-CQA의 이성질화에 유리하다.
결론으로서, 에탄올의 존재 하에서, 부화된 분획의 pH는 약 4, 예컨대 4 내지 5이어야 한다. 따라서, 약 4 내지 5의 pH는 도 6에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 방법에서의 단계 (v)에 대해 최적일 수 있는데, 이 도면에서 더 낮은 pH(pH 2.7 및 그 미만)에서는 에틸에스테르 형성이 일어나는 반면, 더 높은 pH(pH 12)에서는 카페산 및 퀸산을 산출하는 5-CQA의 가수분해가 일어나는 것을 알 수 있다. 추가적으로, 알칼리성 조건은 3-CQA 및 4-CQA의 출현에 의해 관찰되는 바와 같이 5-CQA의 이성질화에 유리하다.
온도
다음 단계로는, 온도의 영향을 평가하였다. 최악의 시나리오를 시뮬레이션하기 위해, pH 1을 선택하였다. 사실상, 그것은 이전 실험에서의 가장 임계적인 pH에 대응하였고, 그것은 현재 정제 프로토콜의 조건을 반영한다. 2시간 후에, 3가지 온도, 즉, 주위 온도(RT), 50℃ 및 80℃로 유지된 5-CQA의 분해를 LC/MS-DAD에 의해 모니터링하였다(도 7). 온도에 대한 연구는 하기를 나타낸다:
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RT에서는, 단지 소량의 5-CQA가 그의 에틸에스테르로 변환된다.
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50℃에서는, 에스테르화 속도가 증가된다. 천연 5-CQA와 비교하여 최대 40%의 에스테르가 검출 가능하다.
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80℃에서는, 5-CQA의 그의 에틸에스테르로의 에스테르화가 추가로 가속되어, 5-CQA와 비교하여 동일량의 에스테르를 생성한다.
결론으로서, 에탄올의 존재 하에서, 커피 추출물 및 부화된 분획의 온도는 낮아야 하며, 이는 특히 산성 조건 하에서 그러하다.
시간
pH 및 온도가 정제 셋업의 크기로부터 독립적이지만, 체류 시간은 규모 확대에 따라 분명히 증가된다. 따라서, 다음 연구는 주어진 pH 및 온도에서 5-CQA의 그의 에틸에스테르로의 에스테르화 속도론을 평가하였다. 이 연구는 실온과 50℃ 둘 모두에 대해 pH 1에서 수행하였다(도 8). 시간에 대한 연구는 하기를 나타낸다:
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50°에서는, 5-CQA가 최초 3시간 내에 그의 에틸에스테르로 꾸준히 변환된다. 규모 확대된 프로토콜의 현재 탈착 지속기간에 대응하는 기간 이후에 30%의 에스테르가 형성된다.
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실온에서는, 5-CQA의 안정성이 훨씬 더 높다. 3시간 후에 단지 3%의 에스테르가 형성된다. 그것은 36시간 후에 최대 14% 증가된다.
결론으로서, 에틸에스테르의 형성은 탈착 단계의 pH 및 온도에 좌우된다.
실시예 9 - 정제 전과 후의 카페인이 제거된 커피 조성 ― 대규모
실시예 6에서의 실험실 규모 연구의 결과로부터, CGA의 분해 없이 부화된 분획의 더 많은 생산을 위해 최적화된 프로토콜(도 9)을 규모 확대하였다. 본 실시예에서는, 하기 조건을 적용하였다:
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카페인이 제거된 그린 커피 추출물을 출발 재료로서 사용하였다
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1 m-컬럼을 이용하여 폴리페놀 부화된 분획 제조를 수행하였다.
정제 공정의 반복성을 평가하기 위하여 5개의 배치(batch)를 제조하였다.
카페인이 제거된 분획의 완전한 특성화를 수행하였고, 그 결과가 도 10에 나타나 있다.
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카페인이 제거된 부화된 분획에 대해, CGA 함량이 33%로부터 63%로 증가된다.
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정제 시에 조성의 변화는 실험실 규모 제조(실시예 6 참조) 동안 관찰된 변화와 유사하다.
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실험실 규모 제조와 비교하여, 다른 화합물들의 군이 덜 부화된다(9.4% 대 18.8%).
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카페인의 부화는 실험실 규모와 비교하여 더 낮다(0.8% 대 1.2%).
CGA의 상세한 조성은 도 11에 나타나 있다.
실험실 규모 조건 하에서 이미 관찰된 바와 같이, CGA 밸런스는 매우 잘 유지된다(실시예 6).
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주요 변화는 정제 이후에 덜 풍부한 CGA 중에서 가장 극성인 화합물로서의 3-CQA에 관련된다.
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대조적으로, 더 비극성인 di-CQA 및 FQA가 정제 시에 부화된다.
또한, 업데이트된 프로토콜(도 9)을 그의 성능에 대해 평가하였다.
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전체 회수율은 24%였다.
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CGA의 회수율은 46%였다.
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CGA는 초기량과 비교하여 1.9배만큼 부화되었다.
추가적으로, HPLC-UV/MS를 이용한 최종 생성물에서의 CGA 및 그의 에스테르의 분석은 하기를 나타내었다:
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에틸에스테르의 변환을 대폭 감소시켰다.
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에스테르의 최종 농도는 천연 CGA의 1%를 초과하지 않았다.
따라서, 사실상, 폴리페놀 밸런스에 대폭 영향을 미치거나 다량의 에틸에스테르를 생성하거나 하지 않고서, 산업적으로 적용 가능한 규모로 카페인이 제거된 조성물에 대해 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있다.
실시예 10 - 정제 전과 후의 카페인이 함유된 커피 조성 ― 대규모
카페인이 함유된 폴리페놀 부화된 분획에 대해, 업데이트된 프로토콜(도 9)을 또한 하기 조건으로 적용하였다:
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카페인이 함유된 그린 커피 추출물을 출발 재료로서 사용하였다
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체류 시간을 감소시키기 위해 병렬로 사용된 2개의 60 cm 컬럼을 이용하여 폴리페놀 부화된 분획 제조를 수행하였다.
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정제 공정의 반복성을 평가하기 위하여 10개의 배치를 제조하였다.
카페인이 함유된 분획의 완전한 특성화를 수행하였고, 그 결과가 도 12에서 이용가능하다.
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카페인이 함유된 부화된 분획에 대해, CGA 함량이 33%로부터 53%로 증가된다.
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카페인의 양은 9.7%로부터 19.9%로 2배 초과된다.
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탄수화물 및 유기산은 그들의 높은 극성으로 인해 대폭 감소된다.
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다른 화합물들은 약간 증가된다.
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변화는 카페인이 제거된 부화된 분획에 대해 관찰된 변화와 유사하다.
부화된 카페인이 함유된 분획에서의 CGA의 상세한 조성은 도 13에 나타나 있다.
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카페인이 제거된 부화된 분획과는 대조적으로, 3-CQA 농도는 거의 변화없이 유지된다.
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주요 변화는 정제 이후에 덜 풍부한 5-CQA에 관련된다.
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전체적으로, 조성의 변화가 카페인이 제거된 부화된 분획에 대한 것보다 덜 분명하고, 프로파일은 초기 커피의 프로파일과 매우 유사하게 유지된다.
카페인이 함유된 부화된 분획의 경우, 배치-투-배치(batch-to-batch) 성능을 평가하여 위해 10개의 배치를 따로따로 분석하였다.
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전체 회수율은 34%인 것으로 확인되었고, 따라서 카페인이 제거된 부화된 분획(24%)에 대한 것보다 더 높았다.
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CGA의 회수율은 55%였는데, 이는 카페인이 제거된 부화된 분획에 대한 46%와 비교된다.
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CGA는 1.6배만큼 부화되었는데, 이는 카페인이 제거된 것에 대한 1.9배와 비교된다.
부화된 카페인이 함유된 분획에서의 CGA 및 그의 에스테르에 대한 함량을 제어하기 위해 HPLC-UV/MS를 또한 수행하였다. 데이터는 나타나 있지 않다.
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에스테르의 최종 농도는 천연 CGA의 1%를 초과하지 않았다.
-
카페인이 제거된 부화된 분획에 대해 이미 관찰된 바와 같이, 그 형성을 완전히 피할 수는 없다.
따라서, 사실상, 폴리페놀 밸런스에 대폭 영향을 미치거나 다량의 에틸에스테르를 생성하거나 하지 않고서, 산업적으로 적용 가능한 규모로 카페인이 함유된 조성물에 대해 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있다.
실시예 11 ― 부화된 카페인이 제거된 분획 및 카페인이 함유된 분획의 제조에 대한 성능의 비교
결론:
-
카페인이 제거된 커피에 대해서는 도 9에 나타낸 프로토콜을 이용하여 63% 순도의 분획을, 그리고 카페인이 함유된 커피에 대해서는 53% 순도의 분획을 수득할 수 있다.
-
카페인이 제거된 분획의 더 양호한 성능은 카페인의 존재/부재에 기인할 수 있다. 카페인이 2배만큼 부화될 때, 그것은 카페인이 함유된 분획에 대해서는 거의 20%의 농도에 도달하는데, 이는 동시에 CGA의 상대 농도를 감소시킨다.
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다른 화합물들의 경우에는, 정제 시에 카페인이 제거된 분획과 카페인이 함유된 분획 사이에 어떠한 특정한 차이도 관찰되지 않는다.
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3-CQA, 4-CQA 및 5-CQA의 비는 카페인이 제거된 분획과 카페인이 함유된 분획 사이에 상이하다. 이는 카페인 제거 공정 동안 이미 발생된 이성질화에 기인한다. 정제 공정은 초기 분포와 비교하여 부화된 분획에서 CGA의 조성에 단지 약간만 영향을 주며, 따라서 폴리페놀의 이성질체 밸런스는 공정 전체에 걸쳐 유지된다.
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두 경우 모두, 에스테르의 농도는 천연 CGA의 1%를 초과하지 않는다.
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공정 동안 존재하는 다량의 CGA 및 에탄올로 인해 프로토콜을 완전히 변경하지 않고서 에스테르 형성을 완전히 피할 수는 없다. 따라서, 1% 미만의 에스테르의 양은 CGA 부화된 분획의 식품 등급 제조를 위해 기술적으로 불가피한 것으로 간주되어야 한다.
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배치-투-배치로부터의 재현성은 10% 미만의 상대 표준 편차로 매우 양호하다. 따라서, 이 프로토콜은 단일 이성질체의 잘 알려진 밸런스 및 특정량의 CGA를 갖는 CGA가 부화된 분획을 하나의 배치로부터 다른 하나의 배치로 전달하는 데 적합하다.
실시예 12 ― 에탄올 농도의 최적화
커피 폴리페놀을 정제하기 위한 식품 등급 프로토콜이 이전 실시예들에서 설명되었는데, 이때 소수성 수지 상으로의 커피 폴리페놀의 흡착을 이용하였다. 90% 수성 에탄올을 사용하여 등용매 조건 하에서 탈착을 수행하였으며, 최종 부화된 분획에서 폴리페놀 순도는 60 내지 70%였다.
더 특정한 폴리페놀 생성물을 생성할 목적으로, 정제된 커피 폴리페놀 이성질체의 제조를 조사하였다. 이러한 목적을 위해, 감소하는 극성의 용매(즉, 수성 에탄올 20/80, 50/50, 80/20)를 이용한 연속 탈착 단계를 적용하였다.
탈착 혼합물에서의 증가하는 에탄올 비를 사용하여 3개의 연속 단계로 탈착을 수행하였다. 프로토콜은 도 14에 나타나 있다. 3개의 정제된 부화된 분획을 하기와 같이 수득하였다:
단계 1 -
에탄올/물/KOH 20/70/10(v/v/v)을 이용한 탈착;
단계 2 -
에탄올/물/KOH 50/40/10(v/v/v)을 이용한 탈착;
단계 3 -
에탄올/물/KOH 80/10/10(v/v/v)을 이용한 탈착.
식품 등급 수지로부터의 탈착에 대해 구배를 적용함으로써, 3개의 상이한 부화된 분획을 수득하였다. 이어서, 이들 부화된 분획의 클로로겐산 조성을 HPLC-UV에 의해 평가하였다. 도 15는 CGA의 3개의 주요 부류에 대한 상대 기여를 도시한다. 도 16은 3개의 상이한 부화된 분획의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
주요 결과는 하기와 같다:
-
모든 부화된 분획은 이전에 나타낸 바와 같은 초기 추출물과 비교하여 약 2배 초과의 폴리페놀을 함유한다(즉, 65 내지 85% 대 33%).
-
20% 에탄올을 이용한 탈착은 70.7% 클로로겐산을 함유하는 부화된 분획을 야기하는데, 이때 클로로겐산 중 97%는 모노 CQA이고 2.4%는 모노 FQA이다. 따라서, 낮은 에탄올 비(즉, 20/80)에서는 거의 오직 CQA만을 함유하는 부화된 분획이 수득된다.
-
50% 에탄올을 이용한 탈착은, 초기 그린 커피 추출물의 프로파일에 가까운 프로파일을 갖는 85.7% 클로로겐산을 함유하는 부화된 분획을 야기한다. 따라서, 중간 에탄올 비(즉, 50/50)에서는 CQA, FQA 및 diCQA의 혼합된 조성을 갖는 부화된 분획이 수득된다.
-
80% 에탄올을 이용한 탈착은 65.1% 클로로겐산을 함유하는 부화된 분획을 야기하는데, 이때 클로로겐산 중 65%는 더 낮은 극성의 di-CQA이다. 따라서, 높은 에탄올 비(즉, 80/20)에서는 비극성 di-CGA가 부화된 분획이 수득된다.
이러한 구배 적용은 다양한 형태의 클로로겐산 화합물의 탈착을 개선시키는 것이 요구되는 상황에서 도움이 될 수 있고, 부화된 분획은 그 후에 커피 내의 원래의 CGA의 이성질체 밸런스와 유사한 CGA의 이성질체 밸런스를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 구배 탈착은 또한 더 특정한 조성이 필요한 경우에 유용할 수 있다.
Claims (15)
- 출발 재료로부터 폴리페놀이 부화된(enriched) 분획을 제공하기 위한 방법으로서,
(i) 상기 출발 재료를 수성 용매 중에 가용화하는 단계;
(ii) pH를 pH 3 미만(바람직하게는 약 pH 1)으로 조절하는 단계;
(iii) 상기 출발 재료를 크로마토그래피 수지(chromatographic resin)와 접촉시키는 단계;
(iv) 상기 크로마토그래피 수지로부터 폴리페놀을 탈착시켜 상기 폴리페놀을 포함하는 용출액(eluate)을 제공하는 단계;
(v) 상기 용출액의 pH를 pH 3.5 초과로 조절하는 단계; 및
(vi) 용출된 폴리페놀로부터 상기 용출액을 분리시켜 상기 폴리페놀이 부화된 분획을 수득하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 수득된 상기 가용화된 출발 재료는 단계 (ii)에서의 pH 조절 이전에, 알코올을 이용한 침전을 거쳐서 고체상 및 액체상을 제공하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 액체상은 단계 (ii)에서의 pH 조절 이전에, 증발 처리를 거쳐서 상기 액체상으로부터 상기 알코올을 제거하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 탈착 동안의 온도는 70℃ 미만인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 탈착 용리액(desorption eluent)은 수성 염기와 조합된 하이드록실 성분을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 재료는 식물 재료인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로부터 수득 가능한, 폴리페놀이 부화된 분획.
- 제7항에 있어서, 폴리페놀의 함량이 건조 물질 기준으로 그의 초기 수준과 비교하여 적어도 70%만큼 증가된, 폴리페놀이 부화된 분획.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 폴리페놀의 에틸에스테르의 함량이 폴리페놀의 총 함량에 대해 건조 물질 기준으로 20%(w/w) 미만인, 폴리페놀이 부화된 분획.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리페놀은 클로로겐산(CGA), 카페산 또는 이들의 조합인, 폴리페놀이 부화된 분획.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 추출물의 클로로겐산(CGA)에서의 초기 밸런스가 정제 이후에 실질적으로 유지되는, 폴리페놀이 부화된 분획.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리페놀이 부화된 분획을 포함하는, 식품 성분.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 제12항에 따른 식품 성분을 포함하는, 식품 제품.
- 향기, 향미 및/또는 거품을 발생시키기 위한 전구체로서의 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및/또는 제12항에 따른 식품 성분의 용도.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 폴리페놀이 부화된 분획 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
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